ES2294786T3 - Secuencias de adn que codifican enzimas que sintetizan polimeros carbohidratos y metodo para producir plantas transgenicas. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBE UN FRAGMENTO DE ADN CON UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS SEQ ID N (GRADOS) 1, COMO SE INDICA EN LA FIGURA 4 A O UNA SECUENCIA HOMOLOGA CON UNA SIMILITUD DE AL MENOS EL 70 % DE UNA 1 - SUCROSA: SUCROSA FRUCTOSILTRANSFEREASA CODIFICADORA. ASIMISMO SE DESCRIBE UN FRAGMENTO DE ADN CON UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS SEQ ID N (GRADOS) 2, COMO SE INDICA EN LA FIGURA 4B O UNA SECUENCIA HOMOLOGA CON UNA SIMILITUD DE AL MENOS EL 70 % DE UNA 1 FRUCTANO:FRUCTANO FRUCTOSILTRANSFERASA CODIFICANTE. ESTA INVENCION PRESENTA TAMBIEN UN ADN RECOMBINANTE QUE INCLUYE UNO O MAS DE DICHOS FRAGMENTOS DE ADN, O DICHOS FRAGMENTOS DE ADN CON LA ORIENTACION INVERTIDA. UTILIZANDO DICHOS FRAGMENTOS SE PUEDEN PRODUCIR ORGANISMOS TRANSFORMADOS QUE PRESENTAN UN PERFIL DE FRUCTANO MODIFICADO.
Description
Secuencias de ADN que codifican enzimas que
sintetizan polímeros carbohidratos y método para producir plantas
transgénicas.
Esta invención se refiere a secuencias de
nucleótidos que codifican enzimas que sintetizan fructano, a una
secuencia de ADN recombinante que comprende una o más de dichas
secuencias de nucleótidos, a un método para producir un organismo
hospedador transformado genéticamente que muestra un perfil de
fructano modificado y a plantas o partes de plantas transformadas
que muestran dicho perfil de fructano modificado.
Los fructanos son un grupo de compuestos de
carbohidrato en los que la mayoría de los enlaces están constituidos
por uno o más enlaces fructosil-fructosa. Los
fructanos son polímeros de fructosa que normalmente, pero no
necesariamente, tienen una unidad de glucosilo terminal
[G-(F)_{n}, G = opcional, n\geq2]. Los enlaces
fructosil-fructosa de los fructanos son enlaces de
tipo \beta-2,6 o \beta-2,1. Los
fructanos con enlaces fructosil-fructosa
predominantemente de tipo \beta-2,6 normalmente se
denominan levanos. Los fructanos con enlaces
fructosil-fructosa predominantemente de tipo
\beta-2,1 normalmente se denominan inulinas.
La biosíntesis de fructano es común en varias
familias de bacterias, hongos y algas y también en familias
vegetales específicas tales como las familias Liliaceae (por
ejemplo, Allium cepa), Poaceae (por ejemplo, Lolium
perenne) y Asteraceae (por ejemplo, Helianthus
tuberosus). Se entiende poco la función de los fructanos en
bacterias y hongos. Se ha sugerido que los fructanos actúan como
almacenes extracelulares de carbohidratos que pueden movilizarse
durante periodos de estrés de carbohidratos (Jacques, 1993). En las
plantas, los fructanos pueden funcionar como carbohidratos de
reserva que sirven como fuente de carbono para el (nuevo)
crecimiento (Meier y Reid, 1982). En cultivos de almacenamiento de
fructanos, la síntesis de fructanos no sólo está restringida a
órganos específicos (por ejemplo, los tallos o tubérculos de H.
tuberosus, los bulbos de Allium spp, las bases de las
hojas y los tallos de hierbas) sino también a tipos celulares
específicos dentro de estos órganos (normalmente las células
parenquimáticas). En estos tipos celulares específicos,
probablemente la vacuola es el sitio donde tienen lugar tanto la
biosíntesis como el almacenamiento de fructano (Darwen y John,
1989; ``Wagner et al., 1983).
En bacterias, siendo ejemplos de bacterias que
sintetizan fructanos Streptococcus mutans y Bacillus
subtilus, la biosíntesis de fructanos a partir de sacarosa se
cataliza sólo por una enzima: la levansacarasa (EC 2.4.1.10) en
B. subtilus (Dedonder 1966) y la levansacarasa, pero también
denominada fructosiltransferasa (FTF, EC 2.4.1.10) en S.
mutans (Carlsson, 1970). La síntesis de fructanos en bacterias
transcurre por medio de la transferencia directa de fructosa desde
una sacarosa donadora (G-F) a moléculas de sacarosa
u otras moléculas aceptoras de acuerdo con la siguiente reacción
reversible:
(1)n(G-F) +
aceptor \rightarrow n(G) +
aceptor-(F)_{n},
donde n puede ser mayor de
10.000.
El agua, las hexosas, la sacarosa, los
oligosacáridos y el levano pueden actuar como moléculas aceptoras
para unidades de fructosilo procedentes de sacarosa (donador de
fructosilo).
Ya se han descrito en la bibliografía (Sato y
Kuramitsu, 1986; Steinmetz et al. 1985) secuencias de ADN
bacteriano que codifican FTF en S. mutans y levansacarasa en
B. subtilus. Se usaron genes bacterianos de varias fuentes
para transformar plantas hospedadoras específicas que normalmente no
pueden sintetizar fructanos, induciendo de esta manera la síntesis
de fructano (véase por ejemplo: Van der Meer et al., 1994;
Ebskamp et al., 1994). En la solicitud de patente WO
89/12386 se describe un método para aumentar el contenido sólido de
frutos de tomate usando el gen de la levansacarasa de B.
subtilus y el gen de la dextransacarasa de Leuconostoc
masenteroides. En las solicitudes NL A 9300646 y WO 94/14970 se
describe un método para modificar el modelo de fructano en plantas
que normalmente no pueden sintetizar fructanos, usando el gen
ftf que codifica levansacarasa de S. mutans y el gen
SacB que codifica levansacarasa de B. subtilus. En el
documento DE 4227061 A1 y WO A 9404692 se describe el uso de una
secuencia de ADN que codifica levansacarasa de Erwinia
amylovora, que después de la integración en el genoma de la
planta hospedadora conduce a la síntesis de levanos. En todas
dichas solicitudes se describen plantas transgénicas que se
transforman con genes de levansacarasa procedentes de bacterias.
Por consiguiente, estas plantas transgénicas sintetizan y acumulan
fructanos estructuralmente comparables a los sintetizados por las
bacterias donadoras (Van der Meer et al., 1994; Ebskamp et
al., 1994).
La presente solicitud difiere de dichas
solicitudes en que está relacionada con secuencias de ADN que
codifican fructosiltransferasa derivadas de plantas. Estas enzimas
son estructuralmente diferentes de las enzimas bacterianas ya que
no hay una homología significativa a nivel de los aminoácidos y a
nivel del ADN. Además, el mecanismo de la biosíntesis de fructano
en las plantas es esencialmente diferente del que tiene lugar en las
bacterias. A diferencia de lo que ocurre en la biosíntesis de
fructano en las bacterias, la formación de fructanos en las plantas
está mediada por más de una enzima. Por ejemplo, en Helianthus
tuberosus (la aguaturma), la biosíntesis de fructanos se
cataliza por dos enzimas: la sacarosa:sacarosa fructosiltransferasa
(SST, EC 2.4.1.99) y la fructano:fructano fructosiltransferasa
(FFT, EC 2.4.1.100). La SST y la FFT de H. tuberosus están
implicadas en la síntesis de fructanos unidos por enlaces
\beta-2,1 (inulina) y, por lo tanto, también se
denominan 1-SST y 1-FFT. La
1-FFT se ha purificado a partir de tubérculos de
H. tuberosus (Lüscher et al., 1993, Koops y Jonker,
1994). La purificación de SST ha resultado ser más difícil de
conseguir. Se ha purificado una supuesta SST a un rendimiento muy
bajo a partir de varias fuentes vegetales (Shiomi e Izawa, 1980;
Praznik et al., 1990; Angenent et al., 1993). Sin
embargo, en ninguno de estos estudios se ha demostrado de manera
convincente la pureza de la enzima. Además, en estos estudios no se
ha demostrado de forma concluyente que la enzima aislada no
represente una invertasa.
Ahora se han purificado grandes cantidades de
1-SST y 1-FFT hasta la homogeneidad
a partir de tubérculos de H. tuberosus
(1-FFT: Koops y Jonker 1994) y se han investigado
extensivamente sus mecanismos de reacción. La 1-SST
de H. tuberosus cataliza la etapa inicial de la biosíntesis
de fructano, la síntesis del trisacárido 1-kestosa
(1-[G-(F)_{2}]) a partir de dos moléculas de sacarosa
(G-F), de acuerdo con la siguiente reacción:
(2)G-F +
G-F \rightarrow 1-[G-(F)_{2}] +
G,
donde G-F =
sacarosa, -F = unidad de fructosilo, -G = unidad de glucosilo, G =
glucosa.
La 1-SST también puede catalizar
la formación del trisacárido 1,1-[G-(F)_{3}] y el
pentasacárido 1,1,1-[G-(F)_{4}] (Fig. 3A). Por lo tanto,
la actividad de 1-SST puede describirse por la
siguiente reacción general:
(3)G-(F)_{n} +
G-(F)_{m} \rightarrow
G-(F)_{n-1} + G-(F)_{m+1},
1\leqn\leq3,
1\leqm\leq3
También se ha descubierto que la
1-SST de H. tuberosus en alguna medida puede
catalizar la transferencia de una unidad de fructosilo desde
G-(F)_{n}, 1\leqn\leq3, al agua.
La segunda enzima, 1-FFT,
cataliza la formación de fructanos con un mayor grado de
polimerización. Esta enzima cataliza una reacción de polimerización
por la transferencia de unidades de fructosilo entre trisacáridos,
tetrasacáridos y polímeros de fructosa superiores de acuerdo con la
siguiente reacción general:
(4)G-(F)_{n} +
G-(F)_{m} \rightarrow
G-(F)_{n-1} + G-(F)_{m+1},
n\geq2,
m\geq2
También se ha descubierto que la
1-FFT cataliza la transferencia de unidades de
fructosilo entre carbohidratos que contienen sacarosa
(G-F) y galactosa (Gal)
[(Gal)_{3}-G-F], también
denominados galactanos. Por ejemplo, la 1-FFT puede
catalizar la transferencia de una unidad de fructosilo desde
G-(F)_{2} a rafinosa
(Gal-G-F), dando como resultado la
formación de [Gal-G-(F)_{2}]. No puede
excluirse que tanto la 1-SST como la
1-FFT procedentes de H. tuberosus puedan
usar otros sustratos como aceptores de fructosilo.
Aunque la 1-SST y la
1-FFT tienen alguna actividad coincidente - las dos
enzimas pueden catalizar la formación de tetra y pentasacáridos
(reacciones 3 ó 4) - la 1-SST y la
1-FFT son enzimas muy diferentes. Las proteínas
1-SST y 1-FFT tienen diferentes
propiedades físicas y se codifican por diferentes genes. La
1-SST y la 1-FFT tienen propiedades
enzimáticas esencialmente diferentes. La 1-FFT no
puede catalizar la etapa inicial de la síntesis de fructano
(reacción 2), mientras que la 1-SST no puede
catalizar la formación de polímeros de fructano con un grado de
polimerización mayor de 5 [G-(F)_{n}, n>4]. En
conclusión, con la actividad de la 1-SST sola,
únicamente es posible sintetizar oligofructanos a partir de sacarosa
con un grado de polimerización de hasta 5 [G-(F)_{n},
2\leqn\leq4]. Para sintetizar fructanos con un mayor grado de
polimerización usando sacarosa como sustrato, se necesita tanto la
1-SST como la 1-FFT. Con la
actividad de la 1-FFT sola, no es posible
sintetizar fructanos a partir de sacarosa. Los presentes inventores
descubrieron que fracciones de proteína que contenían
1-SST así como 1-FFT purificada
podían usar sacarosa como único sustrato para la síntesis de
fructanos con un grado de polimerización de al menos 15
[G-(F)_{14}, Fig. 3B].
Los fructanos bacterianos difieren de los
fructanos de las plantas en el grado de polimerización y el tipo de
ramificación y, por consiguiente, en propiedades químicas y físicas.
En general, los fructanos de las plantas se ensamblan a partir de
menos de 1000 unidades de fructosilo. Los fructanos de H.
tuberosus se ensamblan a partir de menos de100 unidades de
fructosilo. Los fructanos sintetizados por bacterias pueden
comprender más de 10.000 unidades de fructosilo. Por lo tanto, los
fructanos vegetales y bacterianos difieren en sus posibles
aplicaciones. Para los fructanos con un grado relativamente bajo de
polimerización, tales como los aislados a partir de Asteraceae (por
ejemplo, aguaturma, achicoria o dalia), ya se ha encontrado una
aplicación como sustitutos de fosfatos en agentes de unión a calcio
y en detergentes (documento W091/17189). Otras aplicaciones están
relacionadas con las propiedades organolépticas de los fructanos. El
poder edulcorante de los fructanos G-(F)_{n} se reduce al
aumentar el grado de polimerización (al aumentar el valor de n). El
poder edulcorante de los oligofructanos G-(F)_{2} y
G-(F)_{3} se aproxima al de la sacarosa
(G-F). Los fructanos de cadena muy larga tales como
los que se producen en bacterias no son dulces en absoluto. Por lo
tanto, los fructanos de cadena muy corta, tales como los
sintetizados por la sacarosa:sacarosa fructosiltransferasa, pueden
usarse como edulcorantes con la ventaja adicional de que estos
fructanos de sabor dulce no producen caries y pueden soportar la
digestión en el tracto digestivo de los seres humanos, lo cual abre
posibilidades de uso como edulcorante de bajo contenido calórico.
Los fructanos de cadena corta, y también los fructanos de cadena más
larga, pueden usarse como resto hidrófilo de biosurfactantes.
\newpage
A diferencia de los genes bacterianos que
codifican levansacarasa, que ya se han clonado, los genes que
codifican SST y FFT no se han aislado previamente a partir de
plantas. Se descubrió que los genes que codifican SST y FFT
procedentes de plantas, a nivel de los aminoácidos, no tienen una
similitud significativa con las levansacarasas conocidas y, a nivel
del ADN, no tienen un grado significativo de homología con los genes
de la levansacarasa. Por esta razón, no ha sido posible aislar los
genes de la fructosiltransferasa a partir de plantas usando sondas
de levansacarasa heterólogas procedentes de bacterias. Tampoco ha
sido posible aislar genes que codifican SST y FFT a partir de
plantas usando las secuencias de aminoácidos de las enzimas FFT y
SST purificadas y sus cebadores oligonucleotídicos deducidos.
Con respecto a la enzima SST, la razón de esto
es que, aunque se han descrito métodos para la purificación de
fructosiltransferasas a partir de plantas, no ha sido posible hasta
ahora obtener la enzima SST en cantidades suficientemente grandes y
con un grado suficientemente elevado de pureza. Con respeto a la
enzima FFT, se conoce su purificación por Koops y Jonker, 1994.
El objeto de esta invención es proporcionar
secuencias de nucleótidos que codifican SST.
Otro objeto de esta invención es proporcionar
secuencias de nucleótidos obtenidas por recombinación o mutagénesis
de secuencias de nucleótidos que codifican SST, que codifican
enzimas que tienen actividad fructosiltransferasa.
Otro objeto más de esta invención es
proporcionar un método para transformar cultivos que no sintetizan
fructano en cultivos que sintetizan fructano por medio de la
introducción de los genes que codifican SST.
Otro objeto más de esta invención es interrumpir
(parcialmente) la síntesis de fructano en cultivos que normalmente
sintetizan fructanos.
Por consiguiente, esta invención proporciona un
fragmento de ADN que tiene una secuencia de nucleótidos de la SEC
ID Nº: 1 como se muestra en la Fig. 4A, o una secuencia homóloga que
tiene una identidad de al menos 70%, que codifica una proteína que
tiene actividad 1-sacarosa:sacarosa
fructosiltransferasa que cataliza la reacción general:
G-(F)_{n} +
G-(F)_{m} \rightarrow G(F)_{n -1}+
G-(F)_{m+1}, 1\leq n\leq3, 1\leq
m\leq3
donde -G representa una unidad de
glucosilo y -F representa una unidad de
fructosilo.
Además, esta invención proporciona una secuencia
de ADN recombinante que comprende uno o más de estos fragmentos de
ADN. Además, esta invención proporciona una secuencia de ADN
recombinante que comprende uno o más de los fragmentos de ADN
definidos anteriormente y que comprende además un fragmento de ADN
que tiene una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 2 como se
muestra en la Fig. 4B, o una secuencia homóloga que tiene una
identidad de al menos 70%, que codifica una proteína que tiene
actividad 1-fructano:fructano fructosiltransferasa
que cataliza la reacción general:
G-(F)_{n} +
G-(F)_{m} \rightarrow G(F)_{n -1}+
G-(F)_{m+1}, n\geq2,
m\geq2
donde -G y -F son como se han
definido
anteriormente.
Se purificaron
1-sacarosa:sacarosa fructosiltransferasa
(1-SST) y 1-fructano:fructano
fructosiltransferasa (1-FFT) a partir de tubérculos
de Helianthus tuberosus. Las enzimas purificadas se
escindieron en péptidos por digestión tríptica y la mezcla de
péptidos resultante se sometió a separación por HPLC. Se realizó una
secuenciación de aminoácidos N-terminal para
péptidos seleccionados. Se usaron secuencias de aminoácidos
específicas para 1-SST y 1-FFT para
diseñar cebadores oligonucleotídicos degenerados específicos para
1-SST y 1-FFT, respectivamente,
para uso en RT-PCR. La PCR se realizó usando ADNc
como plantilla, un cebador con especificidad de cola y los
cebadores degenerados específicos para 1-SST o
1-FFT. Se sintetizó ADNc monocatenario a partir de
ARN poli(A)^{+} aislado a partir de tubérculos de
H. tuberosus. Con el cebador específico de
1-SST, la RT-PCR produjo un
fragmento específico de 450 pb. Con el cebador específico de
1-FFT, la RT-PCR produjo un
fragmento específico de 800 pb. Los fragmentos de PCR de 450 y 800
pb posteriormente se usaron para realizar una selección en una
biblioteca de ADNc preparada a partir de tubérculos de H.
tuberosus para aislar las secuencias de ADNc de longitud
completa que codifican 1-SST y
1-FFT, respectivamente.
Las secuencias codificantes de SST y FFT
procedentes de plantas de la presente invención inducen, después de
la inserción en el genoma de un organismo hospedador, por ejemplo
una planta, cambios en las concentraciones de carbohidratos que
contienen al menos una unidad de fructosilo (sacarosa,
oligofructanos, fructanos o galactanos), o producen un cambio en el
grado de polimerización de oligofructanos, fructanos o galactanos.
La presente invención se refiere a dichos carbohidratos, ya que la
sacarosa es el sustrato para la SST, los oligofructanos son
productos de la SST, y los oligofructanos y los fructanos con un
mayor grado de polimerización son sustratos y productos de la FFT.
Además dichas enzimas fructosiltransferasas también pueden realizar
reacciones de transfructosilación con galactanos de la serie de la
rafinosa como aceptores de fructosilo.
\newpage
La presente invención incluye secuencias de ADN
que tienen una identidad de al menos 70% con la secuencia
codificante de 1-SST de H. tuberosus,
independientemente de si las secuencias homólogas proceden de otras
fuentes vegetales o se obtienen por mutagénesis de secuencias
codificantes de fructosiltransferasa de origen vegetal o de
microorganismos. Se prefiere que el grado de homología sea de al
menos 80%, es más preferido que el grado de homología sea de al
menos 85% y es aún más preferido que el grado de homología sea de al
menos 90%. Particularmente, lo más preferido es que el grado de
homología sea de al menos 95%.
La presente invención incluye secuencias de ADN
que tienen una identidad de al menos 70% con la secuencia
codificante de 1-FFT de H. tuberosus,
independientemente de si las secuencias homólogas proceden de otras
fuentes vegetales o se obtienen por mutagénesis de secuencias
codificantes de fructosiltransferasa procedentes de
microorganismos. Se prefiere que el grado de homología sea de al
menos 80%, es más preferido que el grado de homología sea de al
menos 85% y es aún más preferido que el grado de homología sea de al
menos 90%. Particularmente, lo más preferido es que el grado de
homología sea de al menos 95%.
La presente invención incluye también secuencias
de ADN obtenidas por recombinación in vivo e in vitro
usando secuencias codificantes de SST y opcionalmente de FFT
procedentes de plantas y secuencias codificantes de
fructosiltransferasa de otras fuentes procariotas o eucariotas,
incluyendo bacterias y hongos.
La presente invención se refiere a secuencias de
ADN que codifican SST procedentes de plantas que, después de la
inserción en el genoma de un organismo hospedador, inducen la
síntesis de oligofructanos que comprenden 2, 3 y/o 4 unidades de
fructosilo [G-(F)_{n}, 2\leq n\leq4]. La presente
invención también se refiere a secuencias de ADN que codifican FFT
de plantas que, después de la inserción en el genoma de un organismo
hospedador junto con secuencias de ADN que codifican SST, inducen
la síntesis de fructanos con un mayor grado de polimerización
[G-(F)_{n}, n>4).
La presente invención también se refiere a
construcciones génicas quiméricas que comprenden secuencias que
codifican SST y opcionalmente FFT, o parte de las secuencias,
estando presentes las secuencias en la orientación antisentido. La
introducción de estas construcciones antisentido en plantas que
pueden sintetizar fructanos producirá la inhibición de reacciones
catalizadas por SST o FFT o producirá la inhibición de la expresión
SST o FFT.
La presente invención se refiere a
construcciones de genes quiméricos que codifican SST, o parte de la
secuencia, estando presente la secuencia codificante en la
orientación antisentido. La introducción de estas construcciones
antisentido en el genoma de plantas hospedadoras que pueden
sintetizar fructanos, tales como especies de las familias
Asteraceae, Liliaceae y Poaceae, reducen o bloquean la conversión de
la sacarosa en oligofructanos [G-(F)_{n}, 2\leq
n\leq4]. Como sólo SST puede catalizar la primera etapa de la
síntesis de fructano (reacción 2), en estas plantas transgénicas
también se reducirá o bloqueará la síntesis de fructanos con un
mayor grado de polimerización, [G-(F)_{n}, n>4], y estas
plantas acumularán sacarosa en lugar de fructanos.
La presente invención se refiere a
construcciones de genes quiméricos que codifican FFT o parte de la
secuencia, estando la presente la secuencia codificante en la
orientación antisentido. La introducción de estas construcciones
antisentido en el genoma de plantas hospedadoras que pueden
sintetizar fructanos, reduce o bloquea la conversión de
oligofructanos [G-(F)_{n}, 2\leq n\leq4] en fructanos
con un mayor grado de polimerización [G-(F)_{n}, n>4].
Las plantas transgénicas
obtenidas de esta manera acumularán oligofructanos en lugar de fructanos con un mayor grado de polimerización.
obtenidas de esta manera acumularán oligofructanos en lugar de fructanos con un mayor grado de polimerización.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un método para producir una planta transformada
genéticamente que muestra un perfil de fructano modificado, que
comprende las etapas de:
- i)
- preparar una construcción de genes quiméricos que comprende uno o más fragmentos de ADN como se han definido anteriormente, o dichos fragmentos de ADN en la orientación invertida, unidos operativamente a una secuencia promotor activa en dicha planta y una secuencia terminadora activa en dicha planta,
- ii)
- introducir la construcción de genes quiméricos en el genoma de la planta, y
- iii)
- regenerar plantas transgénicas a partir de las células vegetales transformadas.
Más específicamente, el método de la invención
comprende las siguientes etapas:
- a.
- construcción de un gen quimérico que comprende esencialmente las siguientes secuencias:
- un promotor que asegura la formación de un ARN o proteína funcional en el organismo, órganos, tejidos o células diana deseadas,
- una secuencia de ADN que codifica SST y opcionalmente FFT,
- un terminador de la transcripción conectado de forma operativa a la secuencia de ADN, estando la secuencia de ADN que codifica SST y opcionalmente FFT funcionalmente conectada a un promotor,
- una secuencia de ADN que codifica una señal de dirección o un péptido de tránsito que asegura la dirección de SST y opcionalmente FFT a un compartimento subcelular específico;
- b.
- introducción del gen quimérico en el genoma de un organismo hospedador para obtener material genético que comprende la secuencia de ADN y
- c.
- regeneración del material genético en un organismo hospedador transformado.
En el ADN recombinante de la presente invención,
la secuencia de ADN que codifica SST y opcionalmente FFT
preferiblemente se une a una secuencia reguladora que asegura la
expresión apropiada de la secuencia de ADN en un organismo
hospedador, tal como una bacteria, una levadura, una alga o una
planta, a un nivel de expresión suficientemente alto. Las
secuencias reguladoras son un promotor, una señal de terminación y
un potenciador de la transcripción o de la traducción. Un promotor
puede ser el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor
(CaMV), un promotor inducible por azúcar tal como el promotor de la
patatina, o un promotor con especificidad de órgano, tal como el
promotor del inhibidor II de la proteinasa de la patata específica
de tubérculo o cualquier otro promotor inducible o con
especificidad de tejido.
En el ADN recombinante de la presente invención,
la secuencia de ADN que codifica SST y opcionalmente FFT
preferiblemente está unida a secuencias reguladoras que son
operativas en plantas y que aseguran la expresión apropiada de la
secuencia de ADN en los diferentes órganos, tejidos o células
vegetales. Un promotor muy preferido es un promotor que es activo
en órganos y tipos celulares que normalmente acumulan sacarosa (el
sustrato primario para la síntesis de fructano). La producción de
fructanos es particularmente ventajosa en órganos que almacenan
grandes cantidades de sacarosa tales como las raíces pivotantes de
la remolacha azucarera o los tallos de la caña de azúcar. Además de
las raíces, otros órganos o tipos celulares están implicados en la
síntesis, procesamiento, transporte y acumulación de sacarosa. Por
lo tanto, también se expresan convenientemente secuencias
codificantes de SST o FFT en hojas, tallos, raíces, tubérculos,
órganos reproductores y semillas.
En el ADN recombinante de la presente invención,
la secuencia de ADN que codifica SST y opcionalmente FFT contiene,
o está unida a una secuencia que codifica un péptido de tránsito que
dirige la proteína madura SST y opcionalmente FFT a un
compartimento subcelular que contiene sacarosa. La producción de
fructanos es particularmente ventajosa en la vacuola, que puede
acumular concentraciones muy altas de sacarosa (de hasta 900 mol
m^{-3}). Además de la vacuola, otros compartimentos subcelulares
están implicados en la síntesis (citoplasma), procesamiento
(citoplasma, mitocondria, plastidios) y transporte (pared celular,
citoplasma) de la sacarosa. Por lo tanto, la presente invención se
refiere al uso de secuencias que permiten la dirección del producto
de SST y opcionalmente FFT a compartimentos subcelulares
específicos tales como la vacuola, la pared celular, las
mitocondrias, los plastidios y el citoplasma.
La presente invención también se refiere a
construcciones génicas que comprenden una secuencia que codifica
SST y opcionalmente FFT, o una parte de las secuencias, estando
presente la secuencia codificante en la orientación antisentido. En
estas construcciones génicas, la secuencia codificante de SST y
opcionalmente FFT preferiblemente está unida a un promotor que
asegura la formación de un ARN antisentido en los tipos celulares
que normalmente pueden sintetizar fructanos.
Los ADN recombinantes de la presente invención
también pueden codificar proteínas que tienen propiedades de
resistencia a herbicidas, propiedades de promoción del crecimiento
de las plantas, propiedades inhibidoras del crecimiento de las
plantas, antifúngicas, antibacterianas, antivirales y/o
antinematodos o que confieren resistencia a condiciones de estrés.
Los ADN recombinantes de la presente invención además pueden
codificar proteínas que inducen esterilidad. En caso de que el ADN
se vaya a introducir en un organismo heterólogo, puede modificarse
para retirar los motivos de inestabilidad del ARNm conocidos (tales
como regiones ricas en AT); y se usan señales de poliadenilación
y/o codones que son preferidos por el organismo en los que se va a
insertar el ADN recombinante, de forma que la expresión del ADN
modificado de esta manera en el organismo hospedador sea mayor que
la obtenida por la expresión del ADN recombinante no modificado en
el mismo organismo hospedador.
La presente invención también proporciona una
planta transformada que muestra un perfil de fructano modificado, o
una célula vegetal, semilla, fruto, plántula o cualquier parte de la
planta transformada que lleva una construcción de genes quiméricos
que comprende uno o más fragmentos de ADN como se han definido
anteriormente, o dichos fragmentos de ADN en la orientación
invertida, unida operativamente a una secuencia promotora activa en
dicha planta y una secuencia terminadora activa en dicha planta. La
invención preferiblemente incluye cultivos agrícolas, de forraje,
hortalizas, ornamentales y frutos, más preferiblemente remolacha
azucarera, caña de azúcar, patata, petunia alfalfa, soja, arroz,
césped inglés, hierba Timotea, trigo, cebada, sorgo, maíz,
achicoria, aguaturma, tulipán, melón, cebolla, ajo, tomate, fresa,
manzana y peras. Además, esta invención incluye la descendencia de
las plantas transformadas que contienen el ADN incorporado de forma
estable y heredable de una manera mendeliana y/o las semillas de
estas plantas y de dicha descendencia.
Para la extracción de 1-SST y
1-FFT se usaron tubérculos de Helianthus
tuberosus "Colombia". Los tubérculos se recogieron en
agosto-septiembre, durante el período de crecimiento
rápido de los tubérculos y la acumulación masiva de fructano. Los
tubérculos se lavaron y se congelaron en nitrógeno líquido. Se
pulverizaron cuatrocientos gramos de tubérculos congelados (-80ºC)
e inmediatamente después se homogeneizaron en un mezclador Waring
en 900 cm^{3} de tampón fosfato (P) a una concentración de 50 mol
m^{-3}, pH 6,5, que contenía 10% (p/v) de glicerol, 1 mol
m^{-3} de MgSO_{4},1 mol m^{-3} de Na_{2}EDTA, 1 mol
m^{-3} de PMSF (Sigma, USA),1 mol m^{-3} de DTT, 1,5% (p/v) de
PVPP y 20 mol m^{-3} de Na_{2}S_{2}O_{5}. El homogeneizado
se filtró a través de tres capas de Miracloth y se centrifugó a
17.000 g durante 1 hora.
El extracto de proteína se mantuvo a 4ºC y se
ajustó a una saturación de 45% con (NH_{4})_{2}SO_{4}.
Las proteínas insolubles se sedimentaron por centrifugación (10.000
g, 30 min) y se desecharon. El sobrenadante al 45% de saturación se
llevó a una saturación de 70% por medio de la adición de más
(NH_{4})_{2}SO_{4}. El sedimento, obtenido después de
una segunda etapa de centrifugación, se redisolvió en 60 cm^{3} de
de tampón fosfato (P) a una concentración de 50 mol m^{-3}, pH
6,5, 1 mol m^{-3} de DTT y 1 mol m^{-3} de PMSF (Sigma, Estados
Unidos), y se desalificó por diálisis frente a 10 mol m^{-3} de
tampón P, pH 6,5, 1 mol m^{-3} de PMSF y 1 mol m^{-3} de DTT,
durante 16 horas. Después del reemplazo del tampón, se continuó la
diálisis durante otras 3 horas. El procedimiento entero se realizó a
temperaturas comprendidas entre 0 y 4ºC. El dializado centrifugado
(30.000 g, 30 min) se aplicó en una columna Q Sepharose Phast Flow
de 25x120 mm (4ºC), que se había prelavado con 10 mol m^{-3} de
bis Tris, pH 6,5, 1 mol m^{-3} de DTT, 1 mol m^{-3} de PMSF y 5
mol m^{-3} de EDTA en agua Milli Q. Las proteínas unidas se
eluyeron con un gradiente de NaCl (0-300 mol
m^{-3}) en el mismo tampón a un caudal de 5 cm^{3} min^{-1}.
La 1-SST eluyó a una concentración de NaCl de
200-250 mol m^{-3}.
Las fracciones de Q Sepharose se ajustaron a 400
mol m^{-3} con (NH_{4})_{2}SO_{4} sólido. Se
introdujeron fracciones de 20 cm^{3} en una columna de 15 x 50 mm
de Phenyl Sepharose High Performance o Phenyl Sepharose High
Substitution, que se había preequilibrado con 10 mol m^{-3} de
tampón bis Tris, pH 6,5, que contenía 500 mol m^{-3}
de(NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 mol m^{-3} deDTT, 1
mol m^{-3} de PMSF, 2 mol m^{-3} de EDTA y 0,1% de CHAPS
(tampón A) a 12ºC. La elución de las proteínas unidas se realizó
usando un gradiente lineal de tampón A (100-0%) sin
(NH_{4})_{2}SO_{4}, que contenía 25% (v/v) de
etilglicol, a un caudal de 1 cm^{3} min^{-1}. La
1-SST eluyó a una concentración de
(NH_{4})_{2}SO_{4} de 100 mol m^{-3}.
Se inyectaron fracciones de Phenyl Sepharose de
hasta 10 cm^{3} en una columna de Concanavalin A Sepharose de 5 x
50 mm, prelavada en 20 mol m^{-3} de bis-Tris, pH
6,5, 250 mol m^{-3} de NaCl, 0,5 mol m^{-3} de CaCl_{2}, 0,5
mol m^{-3} de MnCl_{2}, 1 mol m^{-3} de DTT y 1mol m^{-3} de
PMSF. La 1-SST unida se eluyó con una concentración
de \alpha-CH_{3}-manopiranósido
de 500 mol m^{-3} en el mismo tampón.
Se reunieron las fracciones activas de un ensayo
de concanavalina A y se aplicaron a una columna de 5x200 rellena
con hidroxilapatita esférica (15 \mum) (Merck, Alemania). La
columna se preequilibró en 2 mol m^{-3} de CaCl_{2}, 10 mol
m^{-3} de NaCl, 1 mol m^{-3} de DTT, 1 mol m^{-3} de PMSF y
0,1% de CHAPS (tampón A). Las proteínas unidas a la columna se
eluyeron con el gradiente escalonado de tampón A y 500 mol m^{-3}
de tampón fosfato potásico, pH 6,5, a un caudal de 0,5 ml
min^{-1}. La 1-SST eluyó a una concentración de
fosfato potásico de 75-100 mol m^{-3}.
Se reunieron las fracciones activas de un ensayo
de hidroxilapatita y se aplicaron en una columna de Mono Q de 5x50
mm que se había preequilibrado con 10 mol m^{-3} de tampón P, pH
6,5, 1 mol m^{-3} de DTT, 1 mol m^{-3} de EDTA y 0,1% de CHAPS.
Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente de NaCl
(0-500 mol m^{-3}) a un caudal de 0,5 cm^{3}
min^{-1}. La 1-SST eluyó a una concentración de
NaCl de 250 mol m^{-3}.
Todas las columnas, rellenos de columna y
equipos de cromatografía se obtuvieron en Pharmacia (Suecia), a
menos que se indique otra cosa.
Se obtuvo un extracto de proteína bruta a partir
de tubérculos de H. tuberosus como se describe para la
purificación de 1-SST. El sobrenadante del extracto
de proteína bruta, obtenido después de la centrifugación, se ajustó
a una saturación de 45% con (NH_{4})_{2}SO_{4} y se
agitó durante 1 hora. Las proteínas insolubles se sedimentaron por
centrifugación a 10.000 g durante 30 min. El sedimento se redisolvió
en 60 cm^{3} de tampón P a una concentración de 50 mol m^{-3},
pH 6,5, 1 mol m^{-3} de DTT y 1 mol m^{-3} de PMSF, y se
dializó durante una noche frente a 10 mol m^{-3} de tampón
citrato/fosfato (C/P), pH 4,5, que contenía 1 mol m^{-3} de PMSF
y 1 mol m^{-3} de DTT. El contenido del tubo de diálisis se volvió
a ajustar a pH 6,5 con Na_{2}HPO_{4} 0,2 M y las proteínas
insolubles se retiraron por centrifugación a 30.000 g durante 1
hora. El sobrenadante se introdujo en una columna de 25 x 120 mm de
Q Sepharose Phast Flow (Pharmacia) preequilibrada con 10 mol
m^{-3} de tampón P, pH 6,5, 1 mol m^{-3} de DTT y 1 mol m^{-3}
de PMSF en agua Milli Q (Millipore B.V., Los Países Bajos). La
columna se enfrió a 4ºC. Las proteínas unidas se eluyeron con un
gradiente positivo de NaCl a un caudal de 5 cm^{3} min^{-1}. La
1-FFT eluyó a una concentración de NaCl de
200-250 mol m^{-3}.
Se añadió (NH_{4})_{2}SO_{4} sólido
a las fracciones de Q Sepharose para dar una concentración final de
750 mol m^{-3}. Se introdujeron fracciones de 5 cm^{3} en una
columna de 15 x 50 mm de Phenyl Sepharose High Performance
(Pharmacia), preequilibrada con 10 mol m^{-3} de tampón P, pH 6,5,
que contenía 750 mol m^{-3} de (NH_{4})_{2}SO_{4} y
1 mol m^{-3} de DTT. Las proteínas unidas se eluyeron con un
gradiente negativo de (NH_{4})_{2}SO_{4} a un caudal
de 1 cm^{3} min^{-1} a 12ºC. La 1-FFT eluyó a
una concentración de (NH_{4})_{2}SO_{4} de
450-400 mol m^{-3}.
Se inyectaron fracciones de Phenyl Sepharose (de
hasta 4 cm^{3}) en una columna de calidad preparativa Hiload 16 x
600 mm Superdex 75 (Pharmacia) prelavada en 10 mol m^{-3} de
tampón P, pH 6,5, y 1 mol m^{-3} de DTT. Las proteínas se
eluyeron en el mismo tampón a un caudal de 0,5 cm^{3} min^{-1} a
20ºC. La 1-FFT eluyó 95-105 min
después de la inyección.
La actividad de la 1-FFT de las
fracciones de la columna se ensayó rutinariamente a 35ºC. Se
mezclaron alícuotas de 25 mm^{3} con 25 mm^{3} de Neosugar P a
0,3 g (Meiji Seika Kaisha, Led, Tokio, Japón; Neosugar consiste en
1% de hexosas, 4% de sacarosa, 42% de G-(F)_{2}, 44% de
G-(F)_{3} y 7% de G-(F)_{4}) por cm^{3} de
tampón C/P a una concentración de 100 mol m^{-3}, pH 6,5. Después
de 3 horas, la reacción se detuvo hirviendo la mezcla de incubación
en un baño de agua durante 5 minutos. Un aumento neto de GF_{4} se
consideró una medida de la actividad de 1-FFT.
Para la actividad de 1-SST, se
mezclaron fracciones de la columna 15 mm^{3} con 15 mm^{3} de GF
a una concentración de 500 mol m^{-3} en 100 mol m^{-3} de
tampón C/P, pH 5,0, y se incubaron durante 3 horas a 35ºC. La
síntesis de GF_{2} se consideró una medida de la actividad de
1-SST.
La sacarosa y los oligofructanos se analizaron
por RP-HPLC usando una columna
Speri-5 RP 18 de 2,1 x 220 mm (Brownlee Labs, Santa
Clara, Estados Unidos). Como eluyente se usó agua Milli Q a un
caudal de 0,3 cm^{3} min^{-1} a 37ºC. La glucosa y la fructosa
se cuantificaron en una columna Shodex SC-1011 de
6,5 x 300 mm (Millipore 3.v., Waters Chromatography Division, Los
Países Bajos) procesada a 85ºC con agua Milli Q a 0,75 cm^{3}
min^{-1}. Los azúcares se detectaron con un detector del índice de
refracción 2142 (RID, Pharmacia).
La identificación de los oligofructanos se
realizó por comparación de sus tiempos de retención con los de los
oligofructanos purificados a partir de Neosugar P o a partir de
H. tuberosus y por las relaciones de glucosa/fructosa de los
oligofructanos individuales (Koops y Jonker, 1994).
Los análisis de HPAEC de los oligofructanos y
fructanos con un mayor grado de polimerización se realizaron en un
cromatógrafo iónico Dionex Series 4000 equipado con una columna de
intercambio aniónico CarboPac PA1 de 250 x 4 mm y una columna
auxiliar CarboPac PA de 25 x 3 mm. Los fructanos se separaron con un
gradiente lineal de 60 min de 0,25 a 0,4 mol m^{-3} de NaAc en
0,1 mol m^{-3} de NaOH a un caudal de 1 ml min^{-1}. La
detección se realizó por amperometría de pulsos (PAD) con un
electrodo de trabajo de oro. El potencial aplicado de un pulso se
mantuvo a 0,1, 0,6 y -0,6 V durante 0,5, 0,1 y 0,05 segundos
respectivamente. Como patrón interno se usó ramnosa. Los fructanos
se identificaron por comparación de sus tiempos de retención con
los de los patrones de fructano aislados y purificados a partir de
H. tuberosus de acuerdo con el método de Heinze y Praznik
(1991).
Se desalificaron fracciones de Mono Q de
1-SST o fracciones de Superdex 75 de
1-FFT y se concentraron por centrifugación en
dispositivos de ultrafiltración Centricon-10 (2
cm^{3}) (Grace B. V., Amicon división, Los Países Bajos) y
posteriormente se recogieron por precipitación en acetona acuosa al
80% (v/v) a -20ºC. Se disolvieron 1-SST y
1-FFT (50 \mug de cada una) en tampón SDS
(Laemmli, 1970) y se separaron en ExcelGel SDS fundido previamente,
con un gradiente 8-18. Las proteínas se tiñeron con
azul brillante de Coomassie de acuerdo con Rosenfeld et al.
(1992). Las bandas teñidas de 1-SST (2 bandas,
debido a su labilidad intrínseca, 1-SST se escinde
por el tratamiento con SDS) y 1-FFT se escindieron
con un escalpelo y se lavaron, se secaron y se rehidrataron
parcialmente de acuerdo con el procedimiento de Rosenfeld et
al. (1992). Se añadió tripsina de calidad de secuenciación (0,5
\mug;Boehringer, Alemania) al corte de gel y se realizó una
digestión en gel de las proteínas durante 4 horas a 30ºC. Los
péptidos resultantes se recuperaron por dos extracciones de 20
minutos cada una, con 50 \mul deacetonitrilo, agua, ácido
trifluoroacético y Tween 20 (60:40:0,001:0,0002, v/v). La mezcla de
péptidos resultante se separó por RP-HPLC
preparativa en una columna SuperPac Pep-S de 9,3 x
250 mm (Pharmacia) eluida con un gradiente lineal de TFA al 0,1% en
acetonitrilo acuoso al 0-60% a un caudal de 4 ml
min^{-1}. Las fracciones peptídicas individuales se recogieron
manualmente y se almacenaron a -80ºC. Las secuencias de aminoácidos
de los péptidos seleccionados se determinaron por degradación de
Edman, usando un secuenciador de líquidos por pulsos modelo 477A
conectado en línea a una unidad de RP-HPLC modelo
120A (Applied Biosystems). Las secuencias de aminoácidos específicas
para 1-SST o FTT se tradujeron en las
corres-
pondientes secuencias de ADN degeneradas (Ejemplo 1, Tabla 1) que, a su vez, se usaron como cebadores para PCR.
pondientes secuencias de ADN degeneradas (Ejemplo 1, Tabla 1) que, a su vez, se usaron como cebadores para PCR.
El aislamiento de ADN y ARN, la subclonación, el
análisis de restricción y la secuenciación se realizaron usando
métodos convencionales descritos en manuales de biología molecular
(Sambrook et al. 1989, Ausubel et al. 1994).
Se aisló ARN Poli(A)^{+} a
partir de tubérculos de H. tuberosus "Colombia". Se
sintetizó ADNc monocatenario por transcriptasa inversa a partir de
10 \mug de ARN poli(A)^{+} por cebado del ARN
poli(A)^{+} con el siguiente cebador con
especificidad de cola:
5'-CCGAATTCAATACGACTCACTATAGCG (T)_{15}-
3'
Para la amplificación del ADNc monocatenario se
usaron oligonucleótidos degenerados específicos para
1-SST o 1-FFT y el cebador con
especificidad de cola
5'-CCGAATTCAATACGACTCACTATAGCG-3'.
La PCR se realizó en 50 \mul de tampón de PCR (Life Technologies)
que contenía 100 pmol de plantilla de ADNc, 100 pmol del cebador
con especificidad de cola y 100 pmol de cebadores específicos para
1-SST o 1-FFT. La amplificación
incluyó 30 ciclos de desnaturalización (1 min, 92ºC), templado (1
min, 42ºC) y amplificación (1 min, 72ºC). Los fragmentos
resultantes se sometieron a electroforesis en agarosa al 0,7%, se
escindieron del gel, se aislaron de la matriz de agarosa y se
subclonaron en el vector pMOSBlue (Amersham). Para seleccionar una
biblioteca de ADNc Uni-ZAP XR se usaron fragmentos
específicos de 1-SST y 1-FFT
generados por PCR.
Como material de partida para la construcción de
una biblioteca de ADNc de Uni ZAP XR se usaron 10 \mug de ARN
poli(A)^{+} aislado a partir de tubérculos de H.
tuberosus "Colombia". La construcción, el cultivo en
placas y la selección de la biblioteca se realizaron de acuerdo con
los protocolos desarrollados por Stratagene (La Jolla, California,
nº de catálogo 237211). Se prepararon sondas de ADN marcadas con
^{32}P específicas para 1-SST o
1-FFT por cebado aleatorio con oligonucleótidos y se
usaron para seleccionar aproximadamente 100.000 placas. La
hibridación y lavado de la membrana Hybond-N se
realizaron en condiciones de alta rigurosidad (hibridación a 65ºC,
la etapa de lavado final con 0,1 x SSC, SDS al 0,1%, 65ºC). Se
purificaron los clones positivos, los fagémidos de pBluescript se
escindieron del vector Uni-ZAP usando el sistema
Exassist/Solr (Stratagene) y los insertos se analizaron por
análisis con enzimas de restricción, hibridación y
secuenciación.
Se congelaron 50 mg de tejido de hoja en N_{2}
líquido y se homogeneizaron en 0,1 cm^{3} de agua Milli Q en un
tubo Eppendorf. El homogeneizado se calentó a 90ºC durante 5 minutos
y después se centrifugó a 14.000 g durante 10 minutos. El
sobrenadante transparente se analizó por TLC: se salpicaron 2 \mul
del sobrenadante sobre una placa de gel de sílice G 1500
(Schleicher & Schuell). Las placas de TLC se revelaron dos veces
con acetona y agua (9:1, v/v), o
butan-1-ol,
propan-2-ol y agua (3:12:4, v/v).
Los carbohidratos se visualizaron rociando las placas de TLC con
urea-ácido fosfórico (Wise et al., 1955).
Se congeló tejido de hoja (50 mg) en N_{2}
líquido y se homogeneizó en un tubo Eppendorf en 0,1 cm^{3} de
tampón fosfato (P) a una concentración de 25 mol m^{-3}, pH 6,5,
que contenía 2 mol m^{-3} de MgSO_{4}, 2 mol m^{-3} de
Na_{2}EDTA, 2 mol m^{-3} de PMSF (Sigma, Estados Unidos), 2 mol
m^{-3} de DTT, 1,5% (p/v) de PVPP soluble (Merck) y 20 mol
m^{-3} de Na_{2}S_{2}O_{5}. El homogeneizado se centrifugó
a 14.000 g durante 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante transparente se
usó para el ensayo de 1-FFT. Se mezclaron 50 \mul
del sobrenadante con 50 \mul de una mezcla de ensayo que contenía
2 mol m^{-3} de G-(F)_{3}, 80 mol m^{-3} de
G-(F)_{4}, 50 mol m^{-3} de tampón citrato/fosfato, pH
5,5, y 0,02% (p/v) de NaN_{3}. La mezcla de ensayo se incubó en
la oscuridad a 28ºC. Se tomaron muestras de 15 \mul después de 4,
20, 44 y 63 horas de incubación y se analizaron por TLC.
Se purificaron 1-SST y
1-FFT a partir de tubérculos de Helianthus
tuberosus usando técnicas de precipitación, varios
procedimientos de cromatografía sucesivos y electroforesis. Las
fracciones con actividad de 1-SST que eluían de la
columna Mono Q dieron una banda después de una PAGE nativa. La
1-SST se escinde por SDS, por lo tanto el análisis
por SDS PAGE produjo dos bandas de 27 y 55 kDa (Fig. 1, calle 2).
Las fracciones con actividad de 1-FFT que eluyeron
de la columna de exclusión molecular Superdex 75 dieron, tras la SDS
PAGE, una banda con un peso molecular estimado de 70 kDa (Fig. 1,
calle 3). La 1-SST sola puedo sintetizar
oligofructanos a partir de sacarosa como único substrato (Fig. 3A,
80 h de incubación). Por medio de la recombinación de la
1-SST purificada con la 1-FFT
purificada, la sacarosa pudo convertirse en fructanos con un grado
de polimerización de al menos 15 [G-(F)_{14}, Fig. 3B, 80
h de incubación].
Para la secuenciación de aminoácidos por el
método de degradación de Edman (fenilisotiocianato), se escindieron
las bandas de proteína de 27 kDa (1-SST), 55 kDa
(1-SST) y 70 kDa (1-FFT) del gel de
SDS PAGE y se sometieron a digestión proteolítica por tripsina. Las
mezclas peptídicas resultantes se separaron por
RP-HPLC en ensayos separados (Figs.
2A-C). Se recogieron manualmente los péptidos que
eluyeron después de 26 min y 37 min (ambos a partir del fragmento
de 25 kDa de 1-SST, Fig. 2A), 27 min, 34 min y 37
min (a partir del fragmento de 55 kDa de 1-SST,
Fig. 2B), 28 min y 32 min (a partir de 1-FFT, Fig.
2C, la fracción que eluyó a los 32 min contenía los péptidos 7 y 8)
y se sometieron a secuenciación de aminoácidos
N-terminal (Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron las secuencias de aminoácidos 2
(1-SST, 25 kDa), 6 y 7 (1-FFT) para
diseñar cebadores de ADN específicos para 1-SST o
1-FFT que se usaron para la PCR. La PCR usando los
cebadores 2, 6 ó 7 produjo ADN de aproximadamente 450, 800 pb y 300
pb respectivamente. La PCR anidada, usando el oligonucleótido 7 como
cebador específico y el fragmento de PCR de 800 pb como plantilla,
produjo de nuevo el fragmento de PCR de 300 pb, lo cual indicaba
que el fragmento de 300 pb está incluido en el fragmento de 300
pb.
Se seleccionó una biblioteca de ADNc
Uni-ZAP construida a partir de ARNm aislado de
tubérculos de H. tuberosus con el fragmento de
1-SST de 450 pb o con el fragmento de
1-FFT de 800 pb. La selección de aproximadamente
100.000 clones de ADNc produjo aproximadamente 20 clones positivos
que hibridaban con el fragmento de 450 pb y 25 clones que
hibridaban con el fragmento de 800 pb. El ADN de los clones que
hibridaban con el fragmento de 450 pb no hibridaba con el fragmento
de 800 pb y viceversa. Se purificaron los clones positivos, los
fagémidos de pBluescript se escindieron del vector
uni-ZAP y el inserto se caracterizó por análisis de
enzimas de restricción, hibridación y secuenciación.
Las secuencias de ADN de 1-SST y
1-FFT y sus secuencias de aminoácidos
correspondientes se presentan en la Fig. 4A y en la Fig. 4B,
respectivamente. La secuencia con el número de identificación 1, que
codifica 1-SST, tiene una fase de lectura abierta
de 1890 pares de bases y codifica una proteína de 630 restos
aminoacídicos. A nivel del ADN, la 1-SST muestra
una identidad de 68% con el ADNc de la
\beta-fructofuranosidasa ácida soluble
(=invertasa ácida) de la zanahoria (Daucus carota). A nivel
de los aminoácidos, la 1-SST muestra una similitud
de 66% con la \beta-fructofuranosidasa ácida
soluble de zanahoria.
La secuencia con el número de identificación 2,
que codifica 1-FFT, tiene una fase de lectura
abierta de 1845 pares de bases y codifica una proteína de 615
restos aminoacídicos y un peso molecular de aproximadamente 69 kDA.
Esto corresponde al peso molecular de la proteína
1-FFT purificada establecido por
SDS-PAGE (Koops y Jonker, 1994). A nivel del ADN,
la 1-FFT muestra una identidad de 65% con el ADNc de
la \beta-fructofuranosidasa ácida soluble (=
invertasa ácida) de la zanahoria. A nivel de los aminoácidos, la
1-FFT muestra una similitud de 60% con la
\beta-fructofuranosidasa ácida soluble de
zanahoria.
Aunque 1-SST y
1-FFT tienen un grado relativamente alto de
homología con la invertasa ácida, se ha demostrado que
1-SST o 1-FFT y la invertasa son
enzimas muy diferentes. Se ha demostrado que la
1-SST y la 1-FFT no pueden
catalizar la hidrólisis de la sacarosa (actividad invertasa). La
actividad hidrolítica de la 1-FFT y la
1-SST purificada contra la sacarosa se ha ensayado
a un intervalo de valores de pH y concentraciones de sacarosa. No
había una actividad invertasa significativa en ninguna de estas
condiciones (Koops y Jonker 1994). No se observó ninguna homología
mayor de 68% entre la secuencia de ADN que codificaba
1-SST y ninguna secuencia de ADN conocida dentro de
las bases de datos de secuencias de nucleótidos PDB, GENBANK,
actualizaciones de GENBANK, EMBL y actualizaciones de EMBL. No se
observó ninguna homología mayor de 65% para la secuencia de ADN que
codificaba 1-FFT con ninguna secuencia de ADN
conocida dentro de las bases de datos de secuencias de nucleótidos
PDB, GENBANK, actualizaciones de GENBANK, EMBL y actualizaciones de
EMBL.
\newpage
Se usó el clon de ADNc de sst de longitud
completa, denominado pSST 103, para la introducción de un sitio
NcoI en el codón ATG (posición 34) y un sitio EcoRV cadena abajo del
codón de parada (en la posición 1924) usando PCR. A partir del
plásmido pMOG18 (Pen et al., 1992) que contiene el promotor
35S de CaMV potenciado, la secuencia líder de ALMV, el gen
uidA y la secuencia terminadora de nos, la secuencia
codificante uidA se reemplazó por el ADNc de sst.
pMOG18 se digirió con BamHI, se rellenó con la ADN polimerasa de
Klenow y se digirió con NcoI. El fragmento de PCR de sst,
cortado con NcoI y EcoRI, se unió a este vector dando como
resultado el clon pSST217. El fragmento EcoRI/HindII de pSST217 que
contenía la construcción quimérica completa
(enh.35S+ALMV-sst-nos) se clonó en el sitio
EcoRI y HindIII de pBINPLUS (Van Engelen et al., 1995), un
vector de transformación de plantas binario derivado de pBIN19
(Sevan, 1984) dando como resultado el plásmido pVS1 (Fig. 5A).
Se usó el clon de ADNc de fft de longitud
completa, denominado pFFT 111 para la introducción de un sitio NcoI
en el codón ATG (posición 29), y un sitio BamHI cadena abajo del
codón de parada (en la posición 1874) usando PCR. A partir del
plásmido pMOG18 (Pen et al., 1992) que contiene el promotor
35S de CaMV potenciado, la secuencia líder de ALMV, el gen
uidA y la secuencia terminadora nos, la secuencia
codificante uidA se reemplazó por el ADNc de fft. El
fragmento de PCR digerido con NcoI y BamHI se unió al vector pMOG18
digerido con NcoI y BamHI, dando como resultado el clon pFFT209. El
fragmento HindIII/EcoRI de pFFT209 que contenía la construcción
quimérica completa (enh. 35S+ALMV-fft-nos) se
clonó en el sitio HindIII y EcoRI de pBlNPLUS (Van Engelen et
al., 1995), un vector de transformación vegetal binario derivado
de pBIN19 (Bevan, 1984) dando como resultado el plásmido pVF1 (Fig.
5B).
Los vectores binarios pVS1 y pVF1 (Fig. 5) se
conjugaron desde E. coli XL1-Blue con la cepa
AGLO de Agrobacterium tumefaciens por acoplamiento
triparental (Ditta et al., 1980). Los exconjugantes se usaron
para transformar discos de hoja de Petunia hybrida como se
describe por Horsch et al. (1985). Se prepararon discos de
hoja a partir de las hojas superiores de plantas sin floración
jóvenes. Para los experimentos de transformación se usó P.
hybrida de la variedad W115. También se usaron exconjugantes
para transformar explantes de tallo de patata diploides (Solanum
tuberosum, variedad Kardal) como se ha descrito
previamente (Visser, 1991). Después de la regeneración de los
brotes y las raíces en medio que contenía kanamicina, las plantas
se pusieron en un sustrato y se transfirieron al invernadero. Las
plantas regeneradas (en medio sin kanamicina) a partir de discos de
hoja y explantes de tallo tratados con la cepa AGLO de Agrobacterium
que carecía de un vector binario sirvieron como control.
Se generaron aproximadamente 25 plantas
transgénicas de petunia y 25 plantas transgénicas de patata
que llevaban la construcción pVS1 y 25 plantas transgénicas de
petunia y de patata que llevaban la construcción pVF1. Diez
plantas de petunia y diez plantas de patata se transformaron
con la cepa AGLO de Agrobacterium que carecía de un vector binario.
Estas plantas se usaron como control. El análisis de transferencia
de Southern del ADN genómico aislado a partir de las plantas
transformadas demostró que se integraba una media de
1-5 copias de los genes quiméricos introducidos
(datos no mostrados).
La composición de carbohidratos de las plantas
transgénicas se analizó por dos técnicas esencialmente diferentes:
cromatografía de capa fina (TLC), que separa los carbohidratos
basándose en el reparto líquido-líquido (después de
la TLC, los fructanos se detectaron por una reacción de color
específica de la fructosa) y HPAEC, que separa los carbohidratos en
condiciones alcalinas (pH 13) basándose en la carga, y detecta los
carbohidratos por oxidación con un electrodo de trabajo de oro. El
análisis de los extractos de hojas procedentes de las plantas de
patata y Petunia que llevan la construcción pVS1 demostró que
las dos especies de plantas transgénicas contienen productos que
son el resultado de la actividad de SST. La TLC demostró la
presencia de al menos el trisacárido G-(F)_{2} y, con
mucha probabilidad, también el tetrasacárido G-(F)_{3} y el
pentasacárido G-(F)_{4} en extractos de hojas de patata,
mientras que estos oligofructanos estaban ausentes en la planta de
control (Fig. 6). La presencia de G-(F)_{2} y
G-(F)_{3} en extractos de hoja de patata, pero también de
plantas transgénicas de P. hybrida se demostró por análisis
de HPAE (Figs. 7 y 8). La HPAEC, que es más sensible y más
específica que la TLC, también reveló una pequeña cantidad de
G-(F)_{4} en la patata transgénica (Fig. 8). Los
resultados de las Figs. 6-8 indican claramente que
el gen sst se expresa en una proteína SST enzimáticamente
activa tanto en P. hybrida como en patata.
\newpage
Las plantas transgénicas que llevaban la
construcción pVF1 no contenían fructanos porque FFT necesita
oligofructanos (tales como G-(F)_{2} o G-(F)_{3})
como sustratos iniciales para la síntesis de fructanos. Los
oligofructanos no están presentes en plantas que carecen de
actividad SST tales como patata o Petunia de tipo silvestre,
o en plantas transgénicas que sólo contienen la construcción pVF1.
Por lo tanto, la presencia de actividad de FFT en plantas
transgénicas que llevan la construcción pVF1 se verifica por las
mediciones de la actividad de FFT. El ensayo de FFT usado para
evaluar la presencia de una FFT activa en patata transgénica se basó
en la capacidad de FFT de catalizar la síntesis de
G-(F)_{n}, n>4, a expensas de G-(F)_{4}. El
extracto de proteína de hoja total procedente de plantas de patata
que llevaban la construcción pVF1 se mezcló con una mezcla de
ensayo que contenía G-(F)_{4} y la presencia de fructanos
con un mayor grado de polimerización (G-(F)_{n}, n>4)
se examinó porTLC. Ya después de 4 horas de incubación pudieron
detectarse G-(F)_{5} y G-(F)_{6}. Después de 44
horas de incubación, pudieron detectarse fructanos con un grado de
polimerización mayor de 4, incluyendo G-(F)_{4},
G-(F)_{5}, G-(F)_{6}, G-(F)_{7} y
G-(F)_{8}, mientras que estos fructanos estaban ausentes
en las mezclas de control (Fig. 9). Esto indica que también el gen
fft se expresa dando lugar a una proteína FFT
enzimáticamente activa.
Fig. 1. Análisis de fracciones de Mono Q de
purificación de 1-SST y de fracciones de Superdex HR
75 de purificación de 1-FFT
enSDS-PAGE. Calle 1, marcador de peso molecular (el
PM se proporciona en kDa); calle 2, fracción de Mono Q con
actividad de 1-SST; calle 3, fracciones de Superdex
HR 75 con actividad de 1-FFT.
Fig. 2. Separaciones por RP-HPLC
de productos de digestión tríptica: a. el polipéptido de 25 kDa de
1-SST (A); b. el polipéptido de 55 kDa de
1-SST (B); c. el polipéptido 1-FFT
de 70 kDa (C). Las fracciones sin elución de péptido indicadas con
flechas se recogieron manualmente y se sometieron a secuenciación de
aminoácidos.
Fig. 3. Separaciones por HPAEC de oligofructanos
sintetizados a partir de sacarosa por 1-SST
purificada (A) y por una mezcla de 1-SST purificada
y 1-FFT purificada (B). La reacciones se realizaron
en 100 mol m^{-3} de sacarosa, 2 mol m^{-3} de DTT, 10 mol
m^{-3} de tampón citrato/fosfato, pH 5,0 y 0,01% de
Na-azida a 25ºC. El tiempo de reacción fue de 80 h.
La reacción se detuvo hirviendo la mezcla de reacción durante 5
minutos. Como patrón interno se uso ramnosa.
Fig. 4. Secuencia de nucleótidos y secuencia de
aminoácidos deducida del ADNc de 1-SST aislada (A) y
1-FFT (B). Los aminoácidos determinados por
secuenciación de aminoácidos (véase también la Tabla 1) de las
proteínas 1-SST purificada y 1-FFT
están subrayados.
Fig. 5. Construcciones génicas pVS1 (A) y pVF1
(B). Las construcciones quiméricas consisten en el promotor 35S de
CaMV potenciado con el potenciador de la traducción de ALMV (X), la
secuencia codificante de sst (Y) o fft (W), y la
señal de terminación de nos (Z). Están indicados los sitios
de restricción que se usaron en el procedimiento de clonación.
Fig. 6. Análisis de TLC de fructanos en plantas
de patata transgénicas que llevan la construcción pSF1. Se
revelaron placas de TLC dos veces en acetona acuosa al 90%. S =
patrón de sacarosa, G = patrón de glucosa, F = patrón de fructosa,
H = mezcla convencional de fructano de tubérculos de H.
tuberosus, N = patrón de Neosugar, K = patrón de
G-(F)_{2}. Los números 1-6 representan
plantas de patata individuales que llevan la construcción pVS1. C
es una planta de control que lleva la construcción AGLO.
Fig. 7. Separaciones por HPAEC de carbohidratos
extraídos a partir de hojas de Petunia hybrida que llevan la
construcción pVS1 (a), una mezcla de fructano convencional extraída
de tubérculos de H. tuberosus (b), y carbohidratos de hojas
de la Petunia de control que lleva la construcción AGLO
(c).
Fig. 8. Separaciones por HPAEC de carbohidratos
extraídos a partir de hojas de patata (Solanum tuberosum)
que llevan la construcción pVS1 (a), una mezcla de fructano
convencional extraída de tubérculos de H. tuberosus (b), y
carbohidratos de hojas de la patata de control que lleva la
construcción AGLO (c).
Fig. 9. Análisis de TLC de fructanos
sintetizados a partir de G-(F)_{4} por extractos de
proteína procedentes de hojas de plantas de patata transgénica que
llevan la construcción pVF1. Las placas de TLC se revelaron dos
veces en butan-1-ol,
propan-2-ol y agua (3:12:4, v/v). S
= patrón de sacarosa; N = patrón de Neosugar, H = mezcla de
fructano convencional de tubérculos de H. tuberosus. Los
números 1-8 representan diferentes plantas de
patata transgénicas individuales que llevan la construcción pVF1.
C_{1} y C_{2} son plantas de control que llevan la construcción
AGLO.
La nomenclatura del fructano está de acuerdo con
Lewis (1993).
Unidad de fructosilo: una molécula de
fructosa unida a otra molécula de azúcar (por ejemplo, glucosa,
fructosa o galactosa). Abreviado como -F (por ejemplo,
G-F) o -F- (por ejemplo,
G-F-F). En el caso de moléculas que
consisten en más de una unidad de fructosilo (por ejemplo,
G-F-F-F-F-F-F),
se usa una notación condensada [G-(F)_{6}] o GF_{6}].
G-(F)_{6} consiste en una unidad de glucosilo y 6 unidades
de fructosilo. G-(F)_{6} consiste en un enlace
fructosil-glucosa y 5 enlaces
fructosil-fructosa.
Oligofructano: cualquier compuesto con
uno, dos o tres enlaces fructosil-fructosa (puede
estar presente una glucosa pero no es necesario). En la presente
solicitud, el término oligofructano se usó para indicar los
productos de actividad SST [G-(F)_{2}, G-(F)_{3} y
G-(F)_{4}]. El término oligofructanos significa más
generalmente fructanos de cadena corta o fructanos con un bajo grado
de polimerización. En la presente solicitud, los oligofructanos
también incluyen compuestos consistentes en dos, tres o cuatro
unidades de fructosilo, pero que carecen de la unidad de
glucosilo.
Fructanos: cualquier compuesto en el que
la mayoría de los enlaces están constituidos por uno o más enlaces
fructosil-fructosa (puede estar presente una glucosa
pero no es necesario). El fructano se usa como un nombre numerativo
cuando los materiales a los que se hace referencia son químicamente
distintos (por ejemplo, los fructanos G-(F)_{2} y
G-(F)_{13}). En la presente solicitud, los fructanos se
definen como los productos de actividad FFT
(G-F_{n}, 2\leqn<\pm60). A menos que se
indique otra cosa, los fructanos también incluyen oligofructanos.
Para indicar un grupo restringido de fructanos, se usa la notación
"G-F_{n}, n = ..". En la presente solicitud,
los fructanos también incluyen compuestos consistentes en más de una
unidad de fructosilo, pero que carecen de la unidad de
glucosilo.
Inulina: fructano que tiene
principalmente el enlace
\beta-2,1-fructosil-fructosa
(puede estar presente una glucosa, pero no es necesario). El uso
acumulativo frente al uso numerativo como nombre es igual que en el
caso del fructano explicado anteriormente.
Levano: fructano que tiene principalmente
el enlace
\beta-2,1-fructosil-fructosa
(se permite una glucosa, pero no es necesario). Levano también se
usa para indicar fructanos de origen bacteriano, aunque los
fructanos bacterianos no siempre consisten en enlaces
predominantemente
\beta-2,6-fructosil-fructosa.
Por ejemplo, los fructanos sintetizados por la levansacarasa de
Bacillus subtilus tienen predominantemente enlaces
\beta-2,1-fructosil-fructosa
(inulina). El uso acumulativo frente al uso numerativo del levano
como nombre es igual que en el caso del fructano.
Levansacarasa: enzimas de origen
bacteriano que están implicadas en la síntesis de fructano.
Sacarosa:sacarosa-fructosiltransferasa
(SST): enzima de origen vegetal que cataliza la etapa inicial de la
síntesis de fructano (reacción 2). La enzima también puede estar
implicada en la síntesis de oligofructanos [G-(F)_{n},
2\leqn\leq4] (reacción 3). En la presente solicitud, la
denominación SST puede incluir 1-SST, una forma de
SST implicada en la biosíntesis de oligofructanos que tiene
principalmente el enlace
\beta-2,1-fructosil-fructosa;
o 6-SST, una forma de SST implicada en la
biosíntesis de oligofructanos que tiene principalmente el enlace
\beta-2,6-fructosil-fructosa;
o 1-SST y 6-SST.
Fructano:fructano fructosiltransferasa
(FFT): enzima de origen vegetal implicada en la síntesis de
fructanos. Enzima capaz de catalizar la síntesis de oligofructanos
y fructanos de un mayor grado de polimerización. La FFT de H.
tuberosus tiene alguna actividad coincidente con la SST de H.
tuberosus (reacción 3), pero no puede catalizar la etapa
inicial de la síntesis de fructano (reacción 2). En la presente
solicitud, la denominación FFT puede incluir 1-FFT,
una forma de FFT implicada en la biosíntesis de oligofructanos que
tiene principalmente el enlace
\beta-2,1-fructosil-fructosa;
o 6-FFT, una forma de FFT implicada en la
biosíntesis de fructanos que tiene principalmente el enlace
\beta-2,6-fructosil-fructosa;
o 1-FFT y 6-FFT.
Invertasa:
\beta-fructosidasa o
\beta-fructofuranosidasa.
Grado de polimerización (DP): expresión
que indica la cantidad total de restos de fructosilo y glicosilo;
por ejemplo, G-(F)_{3} tiene un DP de 3. El valor de n en
G-(F)_{n} aumenta al aumentar el grado de
polimerización.
Perfil de fructano: expresión para
describir el patrón de tamaño/distribución de fructano o, como
alternativa, las cantidades relativas y tipos de fructanos en un
extracto derivado, por ejemplo, de una planta, un órgano de una
planta o una célula vegetal. El método más fiable actualmente para
analizar un patrón de fructano de un extracto es por croma-
tografía de intercambio aniónico de alta resolución y detección amperométrica de pulsos (Chatterton et al., 1990).
tografía de intercambio aniónico de alta resolución y detección amperométrica de pulsos (Chatterton et al., 1990).
Helianthus tuberosus: aguaturma.
Cichorium intybus: achicoria.
HPLC: Cromatografía líquida de alta
resolución. Técnica para la separación de mezclas complejas de
compuestos. Son variantes de esta técnica la cromatografía de fase
inversa de alta resolución (RP HPLC) o la cromatografía de
intercambio aniónico de alta resolución en combinación con la
detección amperométrica de pulsos (HPAEC-PAD, véase
por ejemplo la Fig. 3).
- Angenent GC, Ebskamp MJM,
Weisbeek PJ and Smeekens SCM. (1993).
Purification and properties of;
-sucrose-sucrose fructosyltransferases in barley leaves and onion seeds, in: Fuchs A, ed. Inulin ans inulin containing crops. Elsevier, Amsterdam, the Netherlands, pp. 173-184.
-sucrose-sucrose fructosyltransferases in barley leaves and onion seeds, in: Fuchs A, ed. Inulin ans inulin containing crops. Elsevier, Amsterdam, the Netherlands, pp. 173-184.
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- Wise CS, Dimler RJ, Davis
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hydrolysable fructose units in dextran preparations. Analytical
Chemistry 27, 33-6.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Dr. Andries Jurriaan Koops
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Droevendaalsesteeg 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Wageningen
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Los Países Bajos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 6708 PB
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 0317 477055
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 0317 418094
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Dr. Ingrid Maria van der Meer
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Droevendaalsesteeg 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Wageningen
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Los Países Bajos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 6708 PB
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 0317 477142
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 0317 418094
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Dr. Arjen Johannus van Tunen
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Droevendaalsesteeg 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Wageningen
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Los Países Bajos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 6708 PB
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 0317 477058
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 0317 418094
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Secuencias de ADN que codifican enzimas que sintetizan polímeros de carbohidratos y método para producir plantas transgénicas.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 16
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SORFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/NL96/00012
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2.116 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: Doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Helianthus tuberosus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Columbia
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- FASE DEL DESARROLLO: Adulto
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Tubérculo
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: Parénquima de almacenamiento
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, Estados Unidos)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pSST103
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 34..1923
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 89/12386 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 21-JUNIO-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 28-DICIEMBRE-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 1: DE 1 A 4.100
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/04692 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-AGOSTO-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 03-MARZO-1994
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 1: DE 1 A 1.438
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/14970 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-DICIEMBRE-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 07-JULIO-1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2.116 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: Doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Helianthus tuberosus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Columbia
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- FASE DEL DESARROLLO: Adulto
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Tubérculo
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: Parénquima de almacenamiento
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, Estados Unidos)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pSST103
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 34..1923
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 89/12386 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 21-JUNIO-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 28-DICIEMBRE-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 1: DE 1 A 4.100
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/04692 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-AGOSTO-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 03-MARZO-1994
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 1: DE 1 A 1.438
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/14970 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-DICIEMBRE-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 07-JULIO-1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 630 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2.003 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: Doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Helianthus tuberosus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Columbia
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- FASE DEL DESARROLLO: Adulto
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Tubérculo
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: Parénquima de almacenamiento
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, Estados Unidos)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pSST111
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 29..1873
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 89/12386 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 21-JUNIO-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 28-DICIEMBRE-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 3: DE 1 A 4.100
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/04692 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-AGOSTO-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 03-MARZO-1994
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 3: DE 1 A 1.438
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/14970 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-DICIEMBRE-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 07-JULIO-1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 615 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: Doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Helianthus tuberosus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Columbia
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- FASE DEL DESARROLLO: Adulto
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Tubérculo
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: Parénquima de almacenamiento
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, Estados Unidos)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pSST103
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 89/12386 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 21-JUNIO-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 28-DICIEMBRE-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 5: DE 1 A 4.100
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/04692 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-AGOSTO-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 03-MARZO-1994
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 5: DE 1 A 1.438
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/14970 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-DICIEMBRE-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 07-JULIO-1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: Doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Helianthus tuberosus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Columbia
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- FASE DEL DESARROLLO: Adulto
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Tubérculo
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: Parénquima de almacenamiento
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, Estados Unidos)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pSST111
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 89/12386 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 21-JUNIO-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 28-DICIEMBRE-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 6: DE 1 A 4.100
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/04692 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-AGOSTO-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 03-MARZO-1994
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 6: DE 1 A 1.438
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/14970 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-DICIEMBRE-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 07-JULIO-1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: Doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Helianthus tuberosus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Columbia
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- FASE DEL DESARROLLO: Adulto
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Tubérculo
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: Parénquima de almacenamiento
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, Estados Unidos)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pSST111
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 89/12386 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 21-JUNIO-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 28-DICIEMBRE-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 7: DE 1 A 4.100
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/04692 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-AGOSTO-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 03-MARZO-1994
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 7: DE 1 A 1.438
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/14970 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-DICIEMBRE-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 07-JULIO-1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: Doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Helianthus tuberosus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Columbia
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- FASE DEL DESARROLLO: Adulto
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Tubérculo
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: Parénquima de almacenamiento
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, Estados Unidos)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pSST111
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 89/12386 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 21-JUNIO-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 28-DICIEMBRE-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 8: DE 1 A 4.100
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/04692 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-AGOSTO-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 03-MARZO-1994
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 8: DE 1 A 1.438
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/14970 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-DICIEMBRE-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 07-JULIO-1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: Doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Helianthus tuberosus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Columbia
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- FASE DEL DESARROLLO: Adulto
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Tubérculo
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: Parénquima de almacenamiento
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, Estados Unidos)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pSST103
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 89/12386 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 21-JUNIO-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 28-DICIEMBRE-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 9: DE 1 A 4.100
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/04692 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-AGOSTO-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 03-MARZO-1994
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 9: DE 1 A 1.438
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/14970 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-DICIEMBRE-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 07-JULIO-1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: Doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Helianthus tuberosus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Columbia
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- FASE DEL DESARROLLO: Adulto
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Tubérculo
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: Parénquima de almacenamiento
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, Estados Unidos)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pSST103
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 89/12386 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 21-JUNIO-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 28-DICIEMBRE-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 10: DE 1 A 4.100
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/04692 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-AGOSTO-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 03-MARZO-1994
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 10: DE 1 A 1.438
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/14970 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-DICIEMBRE-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 07-JULIO-1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: Doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Helianthus tuberosus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Columbia
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- FASE DEL DESARROLLO: Adulto
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Tubérculo
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: Parénquima de almacenamiento
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, Estados Unidos)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pSST111
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 89/12386 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 21-JUNIO-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 28-DICIEMBRE-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 11: DE 1 A 4.100
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/04692 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-AGOSTO-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 03-MARZO-1994
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 11: DE 1 A 1.438
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/14970 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-DICIEMBRE-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 07-JULIO-1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: Doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Helianthus tuberosus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Columbia
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- FASE DEL DESARROLLO: Adulto
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Tubérculo
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: Parénquima de almacenamiento
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, Estados Unidos)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pSST103
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 89/12386 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 21-JUNIO-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 28-DICIEMBRE-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 12: DE 1 A 4.100
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/04692 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-AGOSTO-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 03-MARZO-1994
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 12: DE 1 A 1.438
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/14970 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-DICIEMBRE-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 07-JULIO-1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: Doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Helianthus tuberosus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Columbia
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- FASE DEL DESARROLLO: Adulto
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Tubérculo
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: Parénquima de almacenamiento
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, Estados Unidos)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pSST103
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 89/12386 A1
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- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 21-JUNIO-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 28-DICIEMBRE-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 13: DE 1 A 4.100
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/04692 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-AGOSTO-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 03-MARZO-1994
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 13: DE 1 A 1.438
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/14970 A1
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- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-DICIEMBRE-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 07-JULIO-1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: Doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Helianthus tuberosus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Columbia
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- FASE DEL DESARROLLO: Adulto
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Tubérculo
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: Parénquima de almacenamiento
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, Estados Unidos)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pFFT111
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 89/12386 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 21-JUNIO-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 28-DICIEMBRE-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 14: DE 1 A 4.100
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/04692 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-AGOSTO-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 03-MARZO-1994
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 14: DE 1 A 1.438
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/14970 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-DICIEMBRE-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 07-JULIO-1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: Doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Helianthus tuberosus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Columbia
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- FASE DEL DESARROLLO: Adulto
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Tubérculo
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: Parénquima de almacenamiento
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, Estados Unidos)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pFFT111
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 89/12386 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 21-JUNIO-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 28-DICIEMBRE-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 15: DE 1 A 4.100
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/04692 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-AGOSTO-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 03-MARZO-1994
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 15: DE 1 A 1.438
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/14970 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-DICIEMBRE-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 07-JULIO-1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: Doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Helianthus tuberosus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Columbia
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- FASE DEL DESARROLLO: Adulto
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Tubérculo
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: Parénquima de almacenamiento
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, Estados Unidos)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pSST111
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 89/12386 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 21-JUNIO-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 28-DICIEMBRE-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 16: DE 1 A 4.100
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/04692 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-AGOSTO-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 03-MARZO-1994
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESTOS RELEVANTES EN LA SEC ID Nº: 16: DE 1 A 1.438
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- NÚMERO DE DOCUMENTO: WO 94/14970 A1
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-DICIEMBRE-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- FECHA DE PUBLICACIÓN: 07-JULIO-1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (9)
1. Un fragmento de ADN que tiene una secuencia
de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 como se muestra en la Fig. 4A o
una secuencia homóloga que tiene una identidad de al menos 70% que
codifica una proteína que tiene actividad
1-sacarosa:sacarosa fructosiltransferasa, que
cataliza la reacción general:
G-
(F)_{n} + G-(F)_{m} \rightarrow
G-(F)_{n-1}+ G-(F)_{m+1},
1\leqn\leq 3, 1\leqm\leq
3
donde -G representa una unidad de
glucosilo, y -F representa una unidad de
fructosilo.
2. Un fragmento de ADN de acuerdo con la
reivindicación 1, que tiene una identidad de al menos 85%.
3. Una secuencia de ADN recombinante que
comprende uno o más fragmentos de ADN como se definen en las
reivindicaciones 1 ó 2.
4. Una secuencia de ADN recombinante de acuerdo
con la reivindicación 3, que comprende además un fragmento de ADN
que tiene una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 2 como se
muestra en la Fig. 4B o una secuencia homóloga que tiene una
identidad de al menos 70% que codifica una proteína que tiene
actividad 1-fructano:fructano fructosiltransferasa,
que cataliza la reacción general:
G-(F)_{n} +
G-(F)_{m} \rightarrow
G-(F)_{n-1}+ G-(F)_{m+1},
n\geq2,
m\geq2
donde -G y -F son como se han
definido en la reivindicación
1.
5. Una secuencia de ADN recombinante de acuerdo
con la reivindicación 3 ó 4, donde dicho fragmento o fragmentos
están presentes en la orientación invertida.
6. Un método para producir una planta
transformada genéticamente que muestra un perfil de fructano
modificado, que comprende las etapas de:
i) preparar una construcción de genes quiméricos
que comprende uno o más fragmentos de ADN como se define en las
reivindicaciones 1 ó 2, o dichos fragmentos de ADN en la orientación
invertida, unida operativamente a una secuencia promotora activa en
dicha planta y una secuencia terminadora activa en dicha planta,
ii) introducir la construcción de genes
quiméricos en el genoma de la planta y
iii) regenerar plantas transgénicas a partir de
las células vegetales transformadas.
7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6,
donde la construcción de genes quiméricos preparada en la etapa i)
comprende además un fragmento de ADN que tiene una secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº: 2 como se muestra en la Fig. 4B o una
secuencia homóloga que tiene una identidad de al menos 70% que
codifica una proteína que tiene actividad
1-fructano:fructano fructosiltransferasa, que
cataliza la reacción general:
G-(F)_{n} +
G-(F)_{m} \rightarrow
G-(F)_{n-1}+ G-(F)_{m+1},
n\geq2,
m\geq2
donde -G y -F son como se definen
en la reivindicación
1.
8. Una planta transformada que muestra un perfil
de fructano modificado o una célula vegetal, semilla, fruto,
plántula o cualquier parte de la planta transformada que lleva una
construcción de genes quiméricos que comprende uno o más fragmentos
de ADN como se definen en la reivindicaciones 1 ó 2, o dichos
fragmentos de ADN en la orientación invertida, unidos
operativamente a una secuencia promotora activa en dicha planta y
una secuencia terminadora activa en dicha planta.
9. Una planta transformada de acuerdo con la
reivindicación 8, donde la construcción de genes quiméricos
comprende además un fragmento de ADN que tiene una secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº: 2 como se muestra en la Fig. 4B o una
secuencia homologa que tiene una identidad de al menos 70% que
codifica una proteína que tiene actividad
1-fructano:fructano fructosiltransferasa, que
cataliza la reacción general:
G-
(F)_{n} + G-(F)_{m} \rightarrow
G-(F)_{n-1}+ G-(F)_{m+1},
n\geq2,
m\geq2
donde -G y -F son como se definen
en la reivindicación
1.
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|---|---|---|---|
| EP95200015 | 1995-01-06 | ||
| EP95200015 | 1995-01-06 | ||
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| EP95200762 | 1995-03-27 |
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| AU777455B2 (en) * | 1997-03-04 | 2004-10-14 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Nucleic acid molecules from artichoke (cynara scolymus) encoding enzymes having fructosyl polymerase activity |
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