JPH11500608A - 炭水化物ポリマー合成酵素をコードするｄｎａ配列及びトランスジェニック植物を製造するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 図４Ａに示されるようなヌクレオチド配列：配列番号１、又は１−スクロース：スクロース フルクトシルトランスフェラーゼをコードする、少なくとも70％の類似性を有する相同配列を有するDNAフラグメントが開示される。また、図４Ａに示されるようなヌクレオチド配列：配列番号２、又は１−フルクタン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼをコードする、少なくとも70％の類似性を有する相同配列を有するDNAフラグメントが開示されている。さらに、本発明は、１又は複数の前記DNAフラグメント、又は逆の配向での前記DNAフラグメントを含んで成る組換えDNAを開示する。変性されたフルクタンプロフィールを示す、前記フラグメントを用いて形質転換された生物が生成され得る。

Description

【発明の詳細な説明】 炭水化物ポリマー合成酵素をコードするDNA配列及びトランスジェニック植物を 製造するための方法 本発明は、フルクタン(fructan)合成酵素をコードするヌクレオチド、１又は 複数の前記ヌクレオチド配列を含んで成る組換えDNA配列、変性された（modifie d）フルクタンプロフィールを示す遺伝子的に形質転換された宿主生物を製造す るための方法、及び前記変性されたフルクタンプロフィールを示す形質転換され た植物又は植物部分に関する。 フルクタンは、１又は複数のフルクトシル−フルクトース結合が結合の大多数 を構成している炭水化物化合物のグループを意味する。フルクタンは、但し必ず ではないが、通常、１つの末端グルコシル単位を有するフルクトースポリマーで ある〔Ｇ−（Ｆ）_n，Ｇ＝場合によっては存在する、ｎ≧２〕。フルクタンにお けるフルクトシル−フルクトース結合は、β−２，６又はβ−２，１結合型のも のである。β−２，６フルクトシル−フルクトース結合を主に有するフルクタン は通常、レバンと呼ばれる。β−２，１フルクトシル−フルクトース結合を主に 有するフルクタンは通常、イヌリンと呼ばれる。 フルクタン生合成は、通常、いくつかの細菌、真菌類及び藻類において存在し 、そしてまた、特定の植物ファミリー、たとえば、ユリ科（たとえばアリウム・ セパ(Allium cepa)）、イネ科（たとえばロリウム・ペレネ(Lolium perenne)） 及びキク科（たとえばヘリアンタス・ツベロサス(Helianthus tuberosus)）にお いて存在する。細菌及び菌類におけるフルクタンの機能は、ほとんど理解さ れていない。フルクタンは、炭水化物ストレスの期間の間、移動され得る炭水化 物の細胞外貯蔵として作用することが示唆されている(Jacques，1993)。植物に おいては、フルクタンは、成長のための炭素源として作用する保存炭水化物とし て機能することができる（Meier and Reid，1982）。フルクタン−貯蔵穀物にお いては、フルクタン合成は、特定の器官（たとえば、Ｈ．ツベロサスの茎又は塊 茎、アリウムsppの球茎、草の葉基部及び茎）のみならず、また、それらの器官 内の特定の細胞型（通常、柔組織細胞）に制限される。それらの特定の細胞型に おいては、液胞がたぶん、フルクタン生合成及び貯蔵の位置である(Darwen and John，1989；Wagnerなど.，1983)。 細菌においては、フルクタン合成細菌の例は、ストレプトコッカス・ムタンス （Streptococcus mutans）及びバシラス・サブチラス(Bacillus subtilus)であ り、スクロースからのフルクタンの生合成は、わずか１種の酵素：Ｂ．サブチラ スにおけるレバンスクラーゼ（EC２．４．１．10）（Dedonder 1996）及びＳ． ムタンスにおけるレバンスクラーゼ（但し、またフルクトシルトランスフェラー ゼとも呼ばれる；FTF，（EC２．４．１．10））により触媒される。細菌性フル クタン合成は、次の可逆反応に従ってスクロース又は他のレセプター分子へのド ナースクロース（Ｇ−Ｆ）からのフルクトースの直接的な移行を通して進行する ： ｎ（Ｇ−Ｆ）＋受容体→ｎ（Ｇ）＋受容体−（Ｆ）ａ’ （１） （ここで、ｎは10,000よりも大きい）。 水、ヘキソース、スクロース、オリゴ糖及びレバンは、スクロースからのフル クトシル単位のための受容体分子として作用することができる（フルクトシルド ナー）。 Ｓ．ムタンスにおけるFTF及びＢ．サブチラスにおけるレバンス クラーゼををコードする細菌性DNA配列は、文献にすでに記載されている（Sato and Kuramitsu，1986；Steinmetzなど．1985）。いくつかの源からの細菌性遺伝 子は、通常、フルクタンを合成することができない特定の宿主植物を形質転換す るために使用され、それにより、フルクタン合成を誘発する（たとえば、Van de r Meerなど.，1994；Ebskampなど.，1994を参照のこと）。Ｂ．サブチラスから のレバンスクラーゼ遺伝子及びレウコノストク・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)からのデキストランスクラーゼ遺伝子を用いてのトマト果実の 固形分を増強する方法は、WO89/12386号出願に記載されている。通常、フルクタ ンを合成することができない植物におけるフルクタンパターンを、Ｓ．ムタンス からのレバンスクラーゼをコードするftf遺伝子及びＢ．サブチラスからのレバ ンスクラーゼをコードするSacB遺伝子を用いて変性するための方法は、NL A9300 646号及びWO94/14970号出願に記載されている。宿主植物ゲノムへの組込みの後 、レバンの合成を導びくエルウイニア アミロボラ(Erwinia amylovora)からの レバンスクラーゼ−コードのDNA配列の使用が、DE4227061 A1及びWO A9404692号 に記載されている。すべての前記出願においては、細菌からのレバンスクラーゼ 遺伝子により形質転換されるトランスジェニック植物が記載されている。従って 、それらのトランスジェニック植物は、ドナー細菌により合成されるフルクタン に構造的に匹敵するフルクタンを合成し、そして蓄積する(Van der Meerなど.， 1994；Ebskampなど.，1994)。 本出願は、それが植物由来のフルクトシルトランスフェラーゼをコードするDN A配列に関連していることにおいて前記出願とは異なる。それらの酵素は、アミ ノ酸レベル及びDNAレベルで有意な相同性は存在しないので、細菌性酵素とは構 造的に異なる。さらに、植 物におけるフルクタン生合成の機構は、細菌における機構とは実質的に異なる。 細菌におけるフルクタン生合成に比較して、植物におけるフルクタンの形成は１ つ以上の酵素により介在される。たとえば、ヘリアンタス・ツベロサス(the Jer usalem Artichoke)においては、フルクタン生合成は次の２種の酵素により触媒 される：スクロース：スクロース フルクトシルトランスフェラーゼ(SST，EC２ ．４．１．99)及びフルクタン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ( FFT，EC２．４．１．100)。Ｈ．ツベロサスからのSST及びFFTは、β−２，１結 合のフルクタン（イヌリン）の合成に包含され、そして従って、また１−SST及 び１−FFTとしても企画される。１−FFTは、Ｈ．ツベロサスの塊茎から精製され た(Lascherなど.，1993，Koops and Jonker，1994)。SSTの精製は、達成するに は一層困難であることがわかっている。推定上のSSTは、いくつかの植物源から 、非常に低い収率で精製されている(Shiomi and lzawa，1980；Praznikなど.，1 990；Angenentなど.，1993)。しかしながら、それらの研究のどれにおいても、 酵素の純度は、納得のゆくようには示されていない。さらに、単離された酵素が インバーターゼを表わさないことが、それらの研究において結論的には示されて いない。 多量の１−SST及び１−FFTがＨ．ツベロサスの塊茎から均質にまで精製されて おり（１−FFT：Koops and Jonke 1994）、そしてそれらの反応機構は広範に研 究されている。Ｈ．ツベロサスからの１−SSTは、次の反応に従って、フルクタ ン生合成の初期段階、すなわちスクロース（Ｇ−Ｆ）の２種の分子からの三糖１ −ケストース（１−〔Ｇ−（Ｆ）₂〕）の合成を触媒する： Ｇ−Ｆ＋Ｇ−Ｆ→１−〔Ｇ−（Ｆ）₂〕＋Ｇ （２） ここで、Ｇ−Ｆ＝スクロース、−Ｆ＝フルクトシル単位、−Ｇ＝グ ルコシル単位、Ｇ＝グルコース。 １−SSTはまた、四糖１，１−〔Ｇ−（Ｆ）₃〕及び五糖１，１，１−〔Ｇ−（ Ｆ）₄〕の形成を触媒する（図３Ａ）。従って、１−SST活性は、次の一般的反応 により記載され得る： Ｇ−（Ｆ）_n＋Ｇ−（Ｆ）_m→Ｇ−（Ｆ）_n-1＋ Ｇ−（Ｆ）_m+1，１≦ｎ≦３，１≦ｍ≦３ （３） Ｈ．ツベロサスからの１−SSTが、Ｇ−（Ｆ）_n，１≦ｎ≦３からのフルクトシ ル単位から水上への移行をある程度、移行することができることがまた見出され た。 第２酵素１−FFTは、高い程度の重合を伴ってフルクタンの形成を触媒する。 この酵素は、次の一般的な反応に従って、三糖、四糖及びより大きなフルクトー スポリマー間でのフルクトシル単位の移行により重合反応を触媒する： Ｇ−（Ｆ）_n＋Ｇ−（Ｆ）_m→Ｇ−（Ｆ）_n-1＋ Ｇ−（Ｆ）_m+1，ｎ≧２，ｍ≧２ （４） １−FFTは、スクロース（Ｇ−Ｆ）とガラクタンとも呼ばれる、ガラクトース( Gal)−含有炭水化物〔(Gal)_n−Ｇ−Ｆ〕との間のフルクトシル単位の移行を触媒 することがまた見出されている。たとえば、１−FFTは、Ｇ−（Ｆ）₃から、〔Ga l−Ｇ−（Ｆ）₃〕の形成をもたらすラフィノース(Gal−Ｇ−Ｆ)上へのフルクト シル単位の移行を触媒することができる。Ｈ．ツベロサスからの両１−SST及び １−FFTがフルクトシル受容体として他の基質を使用することができることは、 除外され得ない。 １−SST及び１−FFTはいくらかの重複する活性を有するけれども、両酵素は、 四糖及び五糖の形成を触媒することができ（反応３又は４）−１−SST及び１−F FTは明らかに異なった酵素である。１−SST及び１−FFTタンパク質は、異なった 物性を有し、そして 異なった遺伝子によりコードされる。１−SST及び１−FFTは、実質的に異なった 酵素的性質を有する。１−FFTは、フルクタン合成の初期段階（反応２）を触媒 することができないが、他方１−SSTは５〔Ｇ−（Ｆ）_n，ｎ＞４〕よりも高い程 度の重合を伴ってフルクタンポリマーの形成を触媒することができない。結論的 には、１−SST活性のみにより、５〔Ｇ−（Ｆ）_n，２≦ｎ≦４〕までの程度の重 合を伴ってスクロースからオリゴフルクタンを合成することが単に可能である。 より高い重合の程度を伴って及び基質としてスクロースを用いて、フルクタンを 合成するためには、１−SST及び１−FFTの両方が必要とされる。１−FFT活性の みにより、スクロースからフルクタンを合成することは不可能である。精製され た１−SST及び精製された１−FFTを含むタンパク質画分が少なくとも15〔Ｇ−（ Ｆ）₁₂，図３Ｂ〕の程度の重合を伴ってフルクタンの合成のための単一の基質と してスクロースを用いることができることが、本発明者により見出された。 細菌性フルクタンは、重合の程度及び枝分れのタイプ、並びに結果的に、化学 的及び物理的性質において、植物におけるフルクタンとは異なる。一般的に、植 物からのフルクタンは、1000以下のフルクトシル単位からアセンブルされる。Ｈ ．ツベロサスからのフルクタンは、100以下のフルクトシル単位からアセンブル される。細菌から合成されたフルクタンは、10,000以上のフルクトシル単位を含 むことができる。従って、植物及び細菌性フルクタンは、それらの可能な用途に おいて異なる。比較的低い程度の重合を有するフルクタン、たとえばアステラセ アエ（Asteraceae）（たとえば、Jerusalem Artichoke，chicory又はdahlia）か ら単離されたフルクタンに関しては、カルシウム結合剤及び界面活性剤における リン置換体としての用途はすでに研究されている（WO91/17189）。他の用途は、 フルクタンの感覚刺激性質に関連している。フルクタンＧ−（Ｆ）_nの甘味強度 は、低下する重合の程度（低下するｎ−値）により低下する。オリゴフルクタン Ｇ−（Ｆ）₂及びＧ−（Ｆ）₃の甘味強度は、スクロース（Ｇ−Ｆ）のその強度に 近い。ひじょうに長い鎖のフルクタン、たとえば細菌において生じるフルクタン は、まったく甘くない。ひじょうに短い鎖のフルクタン、たとえばスクロース： スクロース フルクトシルトランスフェラーゼにより合成されるフルクタンは、 それらの甘味フルクタンが非−う食原性であり、そして低カロリー甘味剤として の使用のための可能性を開く、ヒトの消化管における消化を耐えることができる 追加の利点を有する甘味剤として使用され得る。短い鎖のフルクタン及びまた、 長い鎖のフルクタンは、生物界面活性剤の親水性成分として使用され得る。 すでにクローン化されている、レバンスクラーゼをコードする細菌性遺伝子に 比較して、SST及びFFTをコードする遺伝子は、植物からこれまで単離されたこと はない。本発明者は、アミノ酸レベルで、植物からのSST及びFFT−コードの遺伝 子は、既知のレバンスクラーゼに対して有意な類似性を有さず、そしてDNAレベ ルで、レバンスクラーゼ遺伝子に対する有意な程度の相同性を有さないことを見 出した。この理由のために、細菌からの異種レバンスクラーゼプローブを用いて 、植物からフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を単離することは不可能であ った。精製されたSST及びFFT酵素のアミノ酸配列及びそれらの推定されるオリゴ ヌクレオチドプライマーを用いて植物からSST及びFFT−コードの遺伝子を単離す ることはまた不可能であった。これについての理由は、植物からのフルクトシル トランスフェラーゼの精製についての方法が記載されているが、SST及びFFT酵素 を、有意に多くの量で及び有意に高い程度の純度を伴って、得ることはこれまで 不可能であったことである。 本発明の目的は、SST及びFFTをコードするヌクレオチド配列を供給することで ある。 本発明のもう１つの目的は、フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有する酵 素をコードする、SST又はFFTをコードするヌクレオチド配列の組換え又は突然変 異誘発により得られるヌクレオチド配列を供給することである。 本発明のさらにもう１つの目的は、SST及び／又はFFT−コードの遺伝子の導入 により、非フルクタン合成穀物類をフルクタン合成穀物類に形質転換するための 方法を提供することである。 本発明のさらにもう１つの目的は、通常フルクタンを合成する穀物類における フルクタン合成を（部分的に）停止せしめることである。 従って、本発明は、図４Ａに示されるようなヌクレオチド配列（配列番号１） を有するDNAフラグメント、又は１−スクロース：スクロース フルクトシルト ランスフェラーゼをコードする少なくとも70％の程度の相同性を有する相同配列 を提供する。さらに、本発明は、図４Ｂに示されるようなヌクレオチド配列（配 列番号２）を有するDNAフラグメント、又は１−フルクタン：フルクタン フル クトシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも70％の程度の相同性を有す る相同配列を提供する。 １−スクロース：スクロース フルクトシルトランスフェラーゼ(１−SST)及 び１−フルクタン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ(１−FFT)が 、ヘリアンタス・ツベロサスの塊茎から精製された。精製された酵素はトリプシ ン消化によりペプチドに分解され、そしてその得られるペプチド混合物はHPLCに より分離された。Ｎ−末端アミノ酸の配列決定が選択されたペプチドについて行 なわれた。１−SST及び１−FFTに対して特異的なアミノ酸配列が 、RT−PCRへの使用のために、それぞれ、１−SST及び１−FFTに対して特異的な 縮重されたオリゴヌクレオチドプライマーを企画するために使用された。PCRが 、鋳型としてcDNA、すなわち末端−特異的プライマー、及び１−SST又は１−FFT のいづれかに対して特異的な縮重されたプライマーを用いて実施された。第１鎖 のcDNAが、Ｈ．ツベロサスからの塊茎から単離されたポリ（Ａ）⁺RNAから合成さ れた。１−FFT−特異的プライマーにより、RT−PCRは800bpの特異的フラグメン トをもたらした。450及び800bpのPCRフラグメントを続いて用いて、それぞれ、 １−SST及び１−FFTをコードする十分な長さのcDNA配列を単離するためにＨ．ツ ベロサスの塊茎から製造されたcDNAライブラリーをスクリーンした。 本発明の植物からのSST及びFFT−コード配列は、宿主生物、たとえば植物のゲ ノム中への挿入の後、少なくとも１つのフルクトシル単位を含む炭水化物（スク ロース、オリゴフルクタン、フルクタン又はガラクタン）の濃度の変化を誘発し 、又はオリゴフルクタン、フルクタン又はガラクタンの重合の程度の変化を引き 起こす。本発明は、前記炭水化物に関与する。なぜならば、スクロースはSSTの ための基質であり、オリゴフルクタンはSSTの生成物であり、高い重合度を有す るオリゴフルクタン及びフルクタンはFFTの基質及び生成物であるからである。 さらに、前記フルクトシルトランスフェラーゼ酵素はまた、フルクトシル受容体 としてラフィノースシリーズのガラクタンとのトランスフルクトシル化反応を行 なうことができる。 本発明は、相同配列が他の植物源に由来するか、又は植物源又は微生物からの フルクトシルトランスフェラーゼ−コードの配列の突然変異誘発により得られる かに関係なく、Ｈ．ツベロサスからの１−SST−コードの配列に少なくとも70％ の同一性を有するDNA配列 を包含する。相同性の程度は少なくとも80％であることが好ましく、より好まし くは、相同性の程度は少なくとも85％であり、そしてさらにより好ましくは、相 同性の程度は少なくとも90％である。特に最も好ましくは、相同性の程度は少な くとも95％である。 本発明は、相同配列が他の植物源に由来するか、又は微生物からのフルクトシ ルトランスフェラーゼ−コードの配列の突然変異誘発により得られるかに関係な く、Ｈ．ツベロサスからの１−FFT−コードの配列に少なくとも70％の同一性を 有するDNA配列を包含する。相同性の程度は少なくとも80％であることが好まし く、より好ましくは、相同性の程度は少なくとも85％であり、そしてさらにより 好ましくは、相同性の程度は少なくとも90％である。特に最も好ましくは、相同 性の程度は少なくとも95％である。 本発明はまた、植物からのSST及び／又はFFT−コードの配列、及び他の原核又 は真核源、たとえば細菌及び菌類からのフルクトシルトランスフェラーゼコード の配列を用いて、インビボ及びインビトロ組換えにより得られるDNA配列を包含 する。 本発明は、宿主生物のゲノム中への挿入の後、２，３及び／又は４のフルクト シル単位〔Ｇ−（Ｆ）_n，２≦ｎ≦４〕から成るオリゴフルクタンの合成を誘発 する植物からのSST−コードのDNA配列に関する。本発明はまた、SST−コードのD NA配列と共に宿主生物のゲノム中への挿入の後、高い重合度を有するフルクタン 〔Ｇ−（Ｆ）_n，ｎ＞４〕の合成を誘発する植物からのFFT−コードのDNA配列に も関する。 本発明はまた、SST又はFFTをコードする配列、又は前記配列の一部を含んで成 るキメラ性遺伝子構造体にも関し、ここで前記配列はアンチセンス配向で存在す る。フルクタンを合成することができる植物へのそれらのアンチセンス構造体の 導入は、SST又はFFT触 媒された反応の阻害を引き起こし、又はSST又はFFT発現の阻害を引き起こすであ ろう。 本発明は、SSTをコードする配列又は前記配列の一部を含んで成るキメラ性遺 伝子構造体に関し、ここで前記コード配列はアンチセンス配向で存在する。フル クタンを合成することができる宿主植物、たとえばキク科、ユリ科及びイネ科の 植物のゲノム中へのそれらのアンチセンス構造体の導入は、オリゴフルクタン〔 Ｇ−（Ｆ）_n，２≦ｎ≦４〕へのスクロースの転換を減じ又は阻止する。SSTのみ がそのようなトランスジェニック植物においてフルクタン合成の第１段階（反応 ２）を触媒することができるので、また高い重合度〔Ｇ−（Ｆ）_n，ｎ＞４〕を 有するフルクタンの合成のみが減じられ又は阻止され、そしてそれらの植物はフ ルクタンよりもむしろスクロースを蓄積するであろう。 本発明は、FFTをコードする配列又は前記配列の一部を含んで成るキメラ性遺 伝子構造体に関し、ここで前記コード配列はアンチセンス配向で存在する。フル クタンを合成することができる宿主植物のゲノム中へのそれらのアンチセンス構 造体の導入は、オリゴフルクタン〔Ｇ−（Ｆ）_n，２≦ｎ≦４〕の高い重合度を 有するフルクタン〔Ｇ−（Ｆ）_n，ｎ＞４〕への転換を減じ又は阻止する。この ようにして得られたトランスジェニック植物は、高い重合度を有するフルクタン よりもむしろオリゴフルクタンを蓄積するであろう。 従って、本発明は、変性されたフルクタンプロフィールを示す遺伝子的に形質 転換された宿主生物を生成するための方法を提供し、ここで前記方法は、 ｉ）前記宿主生物において活性的なプロモーター配列及び前記宿主生物におい て活性的なターミネーター配列に操作可能的に連結される、上記で定義されたよ うな１又は複数のDNAフラグメント、又 は逆の配向での前記DNAフラグメントを含んで成るキメラ性遺伝子構造体を調製 し、そして ii）前記キメラ性遺伝子構造体を前記宿主生物のゲノム中に導入する段階を含 んで成る。 前記宿主生物は、微生物か又は植物であり得る。宿主生物が植物である場合、 前記方法は、さらに、 iii）前記形質転換された植物細胞をトランスジェニック植物に再生する段階 を含んで成る。 より特定には、本発明の方法は、次の段階を含んで成る： ａ．次の配列を実質的に含んで成るキメラ性遺伝子の構成： 意図された標的生物、標的器官、組織又は細胞における機能的RNA又はタンパ ク質の形成を確保するプロモーター、SST又はFFTをコードするDNA配列；前記DNA 配列に操作可能的に連結される転写ターミネーター、ここで前記SST又はFFT−コ ードのDNA配列はプロモーターに機能的に連結されており、標的シグナル、又は 特定の非細胞区画へのSST又はFFTの標的化を確保するトランジットペプチドをコ ードするDNA配列； ｂ．前記DNA配列を含んで成る遺伝子材料を得るために、前記宿主生物のゲノ ム中への前記キメラ性遺伝子の導入；及び ｃ．形質転換された宿主生物における前記遺伝子材料の再生。 本発明の組換えDNAにおいては、SST又はFFTをコードするDNA配列は好ましくは 、十分に高い発現レベルで、宿主生物、たとえば細菌、酵母、藻類又は植物にお けるDNA配列の適切な発現を確保する調節配列に連結される。調節配列は、プロ モーター、停止シグナル及び転写又は翻訳エンハンサーである。プロモーターは 、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV）の35Ｓプロモーター、又は糖−誘発性 プロモーター、たとえばpatatineプロモーター、又は器官−特 異的プロモーター、たとえば塊茎特異的ジャガイモプロティナーゼインヒビター IIプロモーター、又はいづれか他の誘発性又は組織特異的プロモーターであり得 る。 本発明の組換えDNAにおいては、SST又はFFT−コードのDNA配列は、好ましくは 、植物において操作性であり、そして異なった植物器官、組織又は細胞において DNA配列の適切な発現を確保する調節配列に連結される。より好ましいプロモー ターは、通常、スクロース（フルクタン合成のための一次基質）を蓄積する器官 及び細胞タイプにおいて活性的であるプロモーターである。フルクタンの生成は 、多量のスクロースを貯蔵する器官、たとえば砂糖大根の上部の根又はサトウキ ビの茎において特に好都合である。根の他に、他の器官又は細胞タイプが、スク ロースの合成、加工、輸送及び蓄積に関与する。従って、SST又はFFT−コードの 配列はまた、葉、茎、塊茎、再生性器官及び種子において適切に発現される。 本発明の組換えDNAにおいては、SST又はFFTをコードするDNA配列は、スクロー スを含む非細胞区画にSST又はFFT成熟タンパク質を向けるトランジットペプチド をコードする配列を含み、又はその配列に連結される。フルクタンの生成は、ひ じょうに高い濃度のスクロース(900モルｍ³までの)を蓄積することができる液胞 において特に好都合である。液胞の他に、他の非細胞区画が、スクロースの合成 （細胞質）、プロセッシング（細胞質、ミトコンドリア、プラスチド）及び輸送 （細胞壁、細胞質）に関与している。従って、本発明は、特定の非細胞区画、た とえば液胞、細胞壁、ミトコンドリア、プラスチド及び細胞質へのSST又はFFT生 成物の標的化を可能にする配列の使用に関する。 本発明はまた、SST又はFFTをコードする配列又はその配列の一部を含んで成る 遺伝子構造体にも関し、ここで前記コード配列はア ンチセンス配向で存在する。それらの遺伝子構造体においては、SST又はFFTコー ドの配列は好ましくは、通常、フルクタンを合成することができる細胞タイプに おいてアンチセンスRNAの形成を確保するプロモーターに連結される。 本発明の組換えDNAはまた、除草剤耐性、植物成長促進、植物成長阻害、抗菌 、抗細菌、抗ウィルス及び／又は抗線虫性質を有し、又は耐ストレス性を付与す るタンパク質をコードすることができる。本発明の組換えDNAはさらに、生殖不 能性を誘発するタンパク質をコードすることができる。DNAが異種生物中に導入 される予定である場合、それは既知のmRNA不安定性モチーフ（たとえばATに富む 領域）を除去するために変性され得；そしてポリアデニル化シグナル、及び／又 は組換えDNAが挿入される予定である生物により好まれるコドンが使用され、そ の結果、宿主生物におけるそのような変性されたDNAの発現は、同じ宿主生物に おける変性されていない組換えDNAの発現により得られるものよりも一層高いも のである。 本発明はまた、上記方法により生成される、形質転換された宿主生物、特に形 質転換された植物を提供する。本発明は好ましくは、農業用、飼草用、野菜、観 賞用及び果実収穫物、より好ましくは、砂糖大根、サトウキビ、ジャガイモ、ペ チュニア、アルファルファ、大豆、米、ライグラス、チモチグラス、小麦、大麦 、サトウモロコシ、トウモロコシ、チコリー、キクイモ、チューリップ、メロン 、タマネギ、ニンニク、トマト、イチゴ、リンゴ及びナシを包含する。さらに、 本発明は、本明細書において定義されたようなSST又はFFTをコードする配列を含 んで成る、組換えDNAを有する、植物細胞、種子、果実、実生又はいづれかの植 物部分を包含する。さらに、本発明は、安定して導入され、そしてメンデルの法 則に従って遺伝できるDNAを含む形質転換された植物の子孫、及び／又はその ような植物及びそのような子孫の種子を包含する。実験 １−SSTの精製 ヘリアンタス・ツベロサス“Colombia”の塊茎を、１−SST及び１−FFTの抽出 のために使用した。塊茎は、急速な塊茎成長及び多量のフルクタン蓄積の期間で ある８〜９月に収穫された。塊茎を洗浄し、そして液体窒素において凍結した。 400ｇの凍結塊茎（−80℃）を微粉砕し、そしてその後、すぐに、10％（ｗ／ｖ ）グリセロール、１モル／ｍ³のMgSO₄，１モル／ｍ³のNa₂EDTA，１モル／ｍ³のP MSF（Sigma，USA），１モル／ｍ³のDTT，1.5％（ｗ／ｖ）のPVPP及び20モル／ｍ³ のNa₂SaO₄を含む、50モル／ｍ³のリン酸（Ｐ）緩衝液（pH6.5）900cm³において 、Waringブレンダーを用いて均質化した。そのホモジネートを３層のMiracloth を通して濾過し、そして17,000ｇで１時間、遠心分離した。 タンパク質抽出物を４℃で維持し、そして(NH₄)₂SO₄により45％飽和に調整し た。不溶性タンパク質を遠心分離（10,000ｇ，30分）によりペレット化し、そし て捨てた。45％上清液を、(NH₄)₂SO₄のさらなる添加により70％飽和した。第２ 回目の遠心分離段階の後に得られたペレットを、１モル／ｍ³のDTT及び１モル／ ｍ³のPMSF（Sigma，USA）を含む50モル／ｍ³のリン酸（Ｐ）緩衝液（pH6.5）60c m³に再溶解し、そして１モル／ｍ³のPMSF及び１モル／ｍ³のDTTを含む10モル／ ｍ³のＰ−緩衝液(pH6.5)に対する16時間の透析により脱塩化した。緩衝液の交換 の後、透析はさらに３時間、続けられた。それらの全工程は、０〜４℃の間の温 度で実施された。遠心分離された透析物（30,000ｇ，30分）を、10モル／ｍ³の ビス−トリス(pH6.5)，１モル／ｍ³のDTT，１モル／ｍ³のPMSF及び５モル／ｍ³ のEDTAのMilli Ｑ水の溶液により予備洗浄された、25 ×120mmのＱ Sepharose Phast Flowカラム（４℃）上に適用した。結合されたタ ンパク質を、５cm³／分の流速で、同じ緩衝液中、NaClグラジエント（０〜300モ ル／ｍ³）により溶出した。１−SSTは、200〜250モル／ｍ³のNaClで溶出した。 Ｑ Sepharose画分を、固体(NH₄)₂SO₄により400モル／ｍ³に調節した。20cm³の画 分を、500モル／ｍ³の(NH₄)₂SO₄，１モル／ｍ³のDTT，１モル／ｍ³のPMSF，２モ ル／ｍ³のEDTA及び0.1％のCHAPS(緩衝液Ａ)を含む、10モル／ｍ³のビス−トリス 緩衝液(pH6.5)により12℃で予備平衡化された、Phenyl Sepharose High Perfurm ance又はPhenyl Sepharose High Suhstitutionの15×50mmカラム上に負荷した。 結合されたタンパク質の溶出を、25％（ｖ／ｖ）のエチルグリセロールを含む緩 衝液Ａ(100−０％)（(NH₄)₂SO₄を含まない）の線状グラジエントを用いて、１cm³ ／分の流速で実施した。１−SSTは、100モル／ｍ³の(NH₄)₂SO₄で溶出した。 10cm³までのPhenyl Sepharose画分を、20モル／ｍ³のビス−トリス(pH6.5)、2 50モル／ｍ³のNaCl，0.5モル／ｍ³のCaCl₂，0.5モル／ｍ³のMnCl₂，１モル／ｍ³ のDTT及び１モル／ｍ³のDMSFの溶液により予備洗浄された５×50mmのConcanaval in Ａ Sepharoseカラム上に注入した。結合された１−SSTを、同じ緩衝液中、50 0モル／ｍ³のα−CH₃−マンノピラノシドにより溶出した。 １つのConcanavalin Ａ−実施の活性画分をプールし、そして球状（15μｍ） のヒドロキシルアパタイト(Merck，German)を充填した５×200カラムに適用した 。カラムを、２モル／ｍ³のCaCl₂，10モル／ｍ³のNaCl，１モル／ｍ³のDTT，１ モル／ｍ³のPMSF及び0.1％のCHAPS溶液（緩衝液Ａ）により予備平衡化した。カ ラムに結合されるタンパク質を、緩衝液Ａ及び500モル／ｍ³のリン酸カリウム緩 衝液(pH6.5)の段階的グラジエントにより、0.5ml／分 の流速で溶出した。１−SSTが75〜100モル／ｍ³のリン酸カリウムで溶出した。 １つのヒドロキシルアパタイト実施の活性画分をプールし、そして10モル／ｍ³ のＰ−緩衝液、pH6.5，１モル／ｍ³のDTT，１モル／ｍ³のEDTA及び0.1％のCHAP Sにより予備平衡化された5×50mmのMono Ｑ−カラム上に適用した。結合された タンパク質を、0.5cm³／分の流速で、NaClグラジエント（０−500モル／ｍ³）に より溶出した。１−SSTが250モル／ｍ³のNaClて溶出した。 すべてのカラム、カラム充填物及びクロマトグラフィー装置は、特にことわら ない限り、Pharmacia(スエーデン)から入手した。 １−PPTの精製 粗タンパク質抽出物を、１−SSTの精製について記載されるようにして、Ｈ． ツベロサスの塊茎から得た。遠心分離の後に得られるような、粗タンパク質抽出 物の上清液を、(NH₃)₃SO₄により45％飽和に調整し、そして１時間、撹拌した。 不溶性タンパク質を、10,000ｇでの30分間の遠心分離によりペレット化した。ペ レットを、50モル／ｍ³のＰ−緩衝液、pH6.5，１モル／ｍ³のDTT及び１モル／ｍ³ のPMSFの溶液60cm³に再溶解し、そして１モル／ｍ³のPMSF及び１モル／ｍ³のDT Tを含む10モル／ｍ³のクエン酸塩／リン酸塩（Ｃ／Ｐ）緩衝液(pH4.5)に対して 一晩、透析した。透析管の内容物を、0.2ＭのNa₂HPO₄によりpH6.5に再調整し、 そして不溶性タンパク質を、30,000ｇでの１時間の遠心分離により除去した。上 清液を、Milli Ｑ水（Millipore B．V.，The Netherlands）中、１モル／ｍ³のD TT，１モル／ｍ³のPMSF及び10モル／ｍ³のＰ−緩衝液(pH6.5)の溶液により予備 平衡化されたＱ Sepharose Phost Flow（Phormacia）の25×120mmカラム上に負 荷した。カラムを４℃に冷却した。結合されたタンパク質を、５cm³／分の流速 で、陽性 NaClグラジエントにより溶出した。１−FFTは、200〜250モル／ｍ³のNaClで溶出 した。 固体(NH₄)₂SO₄を、Ｑ Sepharose画分に添加し、750モル／ｍ³の最終濃度にし た。５cm³の画分を、750モル／ｍ³の(NH₄)₂SO₄及び１モル／ｍ³のDTTを含む、10 モル／ｍ³のＰ−緩衝液(pH6.5)により予備平衡化されたPhenyl Sepharose High Performance（Pharmacia）の15×50mmカラム上に負荷した。結合されたタンパク 質を、12℃で、１cm³／分の流速で、負の(NH₄)₂SO₄グラジエントにより溶出した 。１−FFTは、450〜400モル／ｍ³の(NH₄)₂SO₄で溶出した。 Phenyl Sepharose画分（４cm³までの）を、10モル／ｍ³のＰ−緩衝液(pH6.5) 及び１モル／ｍ³のDTTにより予備洗浄されたHiload 16×600mmのSuperdex 75予 備グレードカラム(Pharmacia)上に注入した。タンパク質を、20℃で0.5cm³／分 の流速で、同じ緩衝液により溶出した。１−FFTは、注入の後、95〜105分で溶出 した。 １−FFT及び１−SSTアッセイ カラム画分の１−FFT活性を、35℃で通常のようにしてアッセイした。25mm³の アリコートを、100モル／ｍ³のＣ／Ｐ−緩衝液(pH6.5)１cm³当たり、25mm³（0.3 ｇ）のNeosugar Ｐ（Meiji Seika Kaisha，Ltd，Tokyo，Japan：Neosugarは、１ ％ヘキソース、４％スクロース、42％Ｇ−（Ｆ）₂，44％Ｇ−（Ｆ）₃及び７％Ｇ −（Ｆ）₄から成る）と共に混合した。３時間後、その反応を、水浴におけるイ ンキュベーション混合物を５分間、煮沸することによって停止した。GF₄の正味 増量を、１−FFT活性の目安として取った。 １−SST活性のためには、15mm³のカラム画分を、100モルcm³ のＣ／Ｐ−緩衝液(pH5.0)中、500モル／ｍ³のGF15mm³と共に混合し、そして35℃ で３時間インキュベートした。GF₂合成を、１−SST活性の目安として取った。 糖及びフルクタンの分析 スクロース及びオリゴフルクタンを、2.1×220mmのSperi−５ RP18カラム(Bro wnlee Labs，Santa Clara，USA)を用いてRP−HPLCにより分析した。Milli Ｑ水 を、37℃で0.3cm³／分の流速で溶離剤として使用した。グルコース及びフルクト ースを、0.75cm³／分でMilli Ｑ水により85℃で実施された6.5×300mm Shodex SC−1011カラム(Millipore B．V.，Waters Chromatography Division，The Neth erland)上で定量化した。糖を、2142屈折率の検出器（RID，Pharmacia）により 検出した。オリゴフルクタンは、Ｈ．ツベロサスから又はNeosugar Ｐから精製 されたオリゴフルクタンからの保持時間と前記オリゴフルクタンの保持時間とを 比較することにより、そして個々のオリゴフルクタンのグルコース／フルクトー スの割合により確認された。 高い重合度を有する、オリゴフルクタン及びフルクタンのHPAEC分析を、250× ４mmのCarboPac PA１アニオン交換カラム及び25×３mmのCarboPac PAガードカラ ムを備えたDionex Series 4000イオンクロマトグラフィー上で行なった。フルク タンを、１ml／分の流速で、0.1モル／ｍ³のNaOH中、0.25〜0.4モル／ｍ³のNaAc の60分間の線状グラジエントにより分離した。検出は、金−作用性電極を有する パルスされた電流分析器(PAD)によるものであった。パルスの適用される電位は 、それぞれ0.5，0.1及び0.05秒の間、0.1，0.6及び−0.6Ｖで維持された。ラム ノースが内部標準として使用された。フルクタンは、Heinze and Praznik（1991 ）の方法に従って、Ｈ．ツベロサスから単離され、そして精製されたフルクタン 標準 の保持時間とそれらの保持時間とを比較することにより同定された。 １−SST及び１−FFTのアミノ酸配列決定 １−SSTのMono Ｑ画分又は１−FFTのSuperdex75画分を脱塩化し、そしてContr icon−10（２cm³）限外濾過装置（Grace B．V.，Amicon division，The Netherl and）における遠心分離により濃縮し、そして続いて、−20℃で80％（ｖ／ｖ） の水性アセトンにおける沈殿により集めた。１−SST及び１−FFT(それぞれ50μ ｇ)を、SDS−緩衝液(Laemmli，1970)に溶解し、そしてプレーキャストされたExc elGel SDS、グラジエント８−18上で分離した。タンパク質を、Rosenfeldなど.( 1992)に従って、クーマシーブリリアントブルーにより染色した。染色された１ −SST(２つのバンド；その固有の不安定性のために、１−SSTはSDS処理により分 解される)及び１−FFTバンドを、外科用メスにより切り出し、そして洗浄し、乾 燥せしめ、そしてRosen feldなど.(1992)の方法に従って、部分的に再水和化し た。配列決定−グレードのトリプシン(0.5μｇ；Boehringer，Germany)を、前記 ゲルスライスに添加し、そしてタンパク質のイン−ゲル消化を30℃で４時間行な った。得られるペプチドを、50μｌのアセトニトリル、水、トリフルオロ酢酸及 びTween 20（60：40：0.001：0.0002，ｖ／ｖ）によるそれぞれ20分の２回の抽 出により回収した。その得られるペプチド混合物を、４ml／分の流速で０〜60％ の水性アセトニトリル中、0.1％のTFAの線状グラジエントにより9.3×250mmのSa perPac Rep−Ｓカラム(Pharmacia)上で溶出する分離用RP−HPLCにより分離した 。個々のペプチド画分を手動的に集め、そして−80℃で貯蔵した。選択されたペ プチドのアミノ酸配列を、モデル 120Ａ RP−HPLC単位（Applied Biosystems） にオンラインで連結されるモデル 477Ａパルス−液体配列決定 器を用いて、エドマン分解により決定した。１−SST又は１−FTTに対して特異的 なアミノ酸配列を、PCRのためのプライマーとしても使用される、その対応する 分解されたDNA配列（例１、表１）に翻訳した。 DNA方法 DNA及びRNA単離、サブクローニング、制限分析及び配列決定を、分子生物学マ ニュアル（Sambrookなど．1989，Ausubelなど．1994）に記載されるような標準 の方法を用いて実施した。 cDNA合成 ポリ（Ａ）⁺RNAを、Ｈ．ツベロサス“Colombia”の塊茎から単離した。一本鎖 cDNAを、次の末端特異的プライマーによりポリ（Ａ）⁺RNAをプライムすることに よって10μｇのポリ（Ａ）⁺RNAから逆転写酵素により合成した：５’−CCGAATTC AATACGACTCACTATAGCG(T)₁₃−３’。 PCR １−SST又は１−FFT及び末端特異的プライマー、すなわち５’−CCGAATTCAATA CGACTCACTATAGCG−３’に対して特異的な縮重されたオリゴヌクレオチドを、一 本鎖cDNAの増幅のために使用した。PCRを、100ｐモルのcDNA鋳型、100ｐモルの 末端特異的プライマー、及び１−SST又は１−FFTに対して特異的な100ｐモルの プライマーを含むPCR緩衝液（Life Technologies）50μｌにおいて行なった。増 幅は、変性（１分、92℃）、アニーリング（１分、42℃）、及び増幅（１分、72 ℃）の30サイクルを包含した。得られるフラグメントを、0.7％のアガロースに おいて電気泳動し、ゲルから切り出し、アガロースマトリックスから単離し、そ してpMOSBlueベクター（Amereham）中にサブクローン化した。PCRにより生成さ れる、１−SST及び１−FFT特異的フラグメントを用いて、Uni−ZAP XR cDNAライブラリーをスクリーンした。 cDNAライブラリーの構成及びスクリーニング Ｈ．ツベロサス“Colombia”の塊茎から単離された10μｇのポリ（Ａ）⁺RNAを 、Uni−ZAP XR cDNAライブラリー（Stratagene）の構成のための出発材料として 使用した。ライブラリーの構成、プレート化及びスクリーニングは、Stratagene （La Jolla，California、カタログ番号237211）により開発された方法に従って 行なわれた。１−SST又は１−FFTに対して特異的な³²Ｐ−ラベルされたDNAプロ ーブを、ランダムオリゴヌクレオチドプライミングにより調製し、そして約100, 000個のプラークをスクリーンするために使用した。ハイブリダイゼーション及 びHybond−Ｎ膜の洗浄を、緊縮条件（65℃でのハイブリダイゼーション、0.1×S SC，0.1％ SDSによる最終洗浄段階、65℃）下で行なった。陽性クローンを精製 し、pBluescript phagemidを、Exassist／Solrシステム（Stratagene）を用いて Uni−ZAPベクターから切り出し、そして挿入体を、制限酵素分析、ハイブリダイ ゼーション及び配列決定により分析した。 トランスジェニック植物の分析 糖及びフルクタンの分析 葉組織50mgを、液体窒素において凍結し、そしてEppendorf管において0.lcm³ のMilli Ｑ水により均質化した。そのホモジネートを90℃に５分間、加熱し、次 に14,000ｇで10分間、遠心分離した。透明な上清液を、TLCにより分析した：上 清液２μｌを、シリカゲルＧ 1500（Schleicher ＆ Schuell）プレート上にスポ ットした。TLCプレートを、アセトン、水（９：１，ｖ／ｖ）、又はブタン−１ −オール、プロパン−２−オール及び水（３：12：４，ｖ／ｖ）により２度、展 開した。炭水化物を、尿素−リン酸によりTLCプレートを噴霧することによって 可視化した（Wiseなど．1995）。 １−FFTアッセイ 葉組織（50mg）を液体窒素において凍結し、そして２モル／ｍ³のMgSO₄，２モ ル／ｍ³のNa₂EDTA，２モル／ｍ³のPMSF（Sigma，USA），２モル／ｍ³のDTT，1.5 ％（ｗ／ｖ）の可溶性PVPD(Merck)及び20モル／ｍ³のNa₃S₂O₅を含む25モル／ｍ³ のリン酸（Ｐ）緩衝液（pH6.5）0.1cm³により、Eppendorf管において均質化した 。そのホモジネートを４℃で10分間、14,000ｇで遠心分離した。透明な上清液を 、１−FFTアッセイのために使用した。50μｌの上清液を、２モル／ｍ³のＧ−（ Ｆ）₃，80モル／ｍ³のＧ−（Ｆ）₄，50モル／ｍ³のクエン酸塩／リン酸塩緩衝液 (pH5.5)及び0.02％（ｗ／ｖ）のNaN₃を含むアッセイ混合物50μｌと共に混合し た。そのアッセイ混合物を28℃で暗室においてインキュベートした。サンプル15 μｌを、インキュベーションの４，20，44及び68時間後に採取し；そしてTLCに より分析した。例 例１ ．スクロース：スクロースフルクトシルトランスフェラーゼ( １−SST)及びフルクタンフルクトシルトランスフェラーゼ( １−FFT)の精製及び１−SST及び１−FFTをコードするcDNA の単離 １−SST及び１−FFTを、ヘリアンタス ツベロサスの塊茎から、沈殿枝法、い くつかの連続的クロマトグラフィー法及び電気泳動を用いて精製した。Mono Ｑ カラムから溶出する、１−SST−活性を有する画分は、活性PAGEの後、１つのバ ンドを付与した。１−SSTをSDSにより分解し、従ってSDS PAGEによる分析は27及 び55kDaの２種のバンドを生成した（図１、レーン２）。Superdex 75ゲル透過カ ラムから溶出する、１−FFT−活性を有する画分は、SDS PAGEに基づいて、70kDa の推定分子量を有する１つのバンドを付与し た（図１、レーン３）。１−SSTのみが、単独の基質としてスクロースからオリ ゴフルクタンを合成することができた（図３Ａ，80時間のインキュベーション） 。精製された１−FFTと精製された１−SSTとを組合すことによって、スクロース を、少なくとも15の重合程度を有するフルクタンに転換することができた〔Ｇ− （Ｆ）₁₄，図３Ｂ，80時間のインキュベーション〕。 エドマン分解法（フェニルイソチオシアネート）によるアミノ酸配列決定のた めに、55kDa(１−SST)及び70kDa(１−FFT)タンパク質バンドを、SDS PAGEゲルか ら切り出し、そしてトリプシンによるタンパク質分解消化にゆだねた。得られる ペプチド混合物を、別々の実験においてRP−HPLCにより分離した（図２Ａ−Ｃ） 。26分及び37分後（両者とも１−ＳＳＴの25kDaフラグメントから、図２Ａ）、2 7分、34分及び37分後（１−SSTの55kDaフラグメントから、図２Ｂ）、28分及び3 2分後（１−FFTから、図２Ｃ、32分で溶出する画分はペプチド７及び８を含んだ ）に溶出するペプチドを手動的に集め、そしてＮ−末端アミノ酸配列決定にゆだ ねた（表１）。 アミノ酸配列２(１−SST，25kDa)，６及び７(１−FFT)を用いて、PCRのために 使用される１−SST又は１−FFTに対して特異的なDNAプライマーを消化した。プ ライマー２，６又は７を用いてのPCRは、それぞれ約450bp，800bp及び300bpのDN Aを生成した。特異的プライマーとしてオリゴヌクレオチド７、及び鋳型として8 00bpのPCRフラグメントを用いての一連のPCRはまた、300bpのフラグメントが800 bpのフラグメントに含まれることを示唆する300bpのPCRフラグメントを生成した 。 Ｈ．ツベロサスの塊茎から単離されたmRNAから構成されたUni−ZAP cDNAライ ブラリーを、450bpの１−SST又は800bpの１−FFTフラグメントのいづれかにより スクリーンした。約100,000のcDNAクローンのスクリーニングは、450bpのフラグ メントにハイブリダイズする約20の陽性クローン及び800bpのフラグメントにハ イブリダイズする25のクローンを生成した。450bpのフラグメントにハイブリダ イズするクローンのDNAは、800bpのフラグメントに対して ハイブリダイズせず、そして逆もまた真である。陽性クローンを精製し、pBlnes cript phagemidsをUni−ZAPベクターから切り出し、そして挿入体を制限酵素分 析、ハイブリダイゼーション及び配列決定により特徴づけた。 １−SST及び１−FFTのDNA配列及びそれらの対応するアミノ酸配列は、それぞ れ図４Ａ及び４Ｂに示される。1−SSTをコードする配列番号１は、1890個の塩基 対の読み取り枠を有し、そして630個のアミノ酸残基のタンパク質をコードする 。DNAレベルに基づけば、１−SSTは、ニンジン(Daucus carota)からの可溶性の 酸性β−フルクトフラノシダーゼ（＝酸性インベルターゼ）cDNAとの68％の同一 性を示す。アミノ酸レベルで、１−SSTは、ニンジンからの可溶性の酸性β−フ ルクトフラノシダーゼとの66％の類似性を示す。 １−FFTをコードする配列番号２は、1845個の塩基対の読み取り枠を有し、そ して615個のアミノ酸残基及び約69kDaの分子量のタンパク質をコードする。これ は、SDS−PAGEにより確立される場合、精製された１−FFTタンパク質の分子量に 対応する（Koops and Jonker，1994）。DNAレベルに基づけば、１−FFTは、ニン ジンからの可溶性の酸性β−フルクトフラノシダーゼ（＝酸性インベルターゼ） cDNAとの65％の同一性を示す。アミノ酸レベルで、１−FFTは、ニンジンからの 可溶性の酸性β−フルクトフラノシダーゼと60％の類似性を示す。 １−SST及び１−FFTは酸性インベルターゼと比較的高い程度の相同性を有する が、１−SST又は１−FFT及びインベルターゼは明らかに異なった酵素であること が示された。１−SST及び１−FFTは、スクロースの加水分解（インベルターゼ活 性）を触媒することができないことが示された。スクロースに対する、精製され た１− SST及び１−FFTの加水分解活性を、広範囲のpH及びスクロース濃度で試験した。 それらのいづれの条件下でも有意なインベルターゼ活性は存在しなかった（Koop s and Jonker，1994）。68％よりも高い相同性は、１−SSTをコードするDNA配列 とPDB，GENBANK，GENBANK最新情報、EMBL及びEMBL最新情報のヌクレオチド配列 データベース内のいづれかの知られているDNA配列との間で観察されなかった。 １−FFTをコードするDNA配列と、PDB，GENBANK，GENBANK最新情報、EMBL及びEMB L最新情報のヌクレオチド配列データベース内のいづれかの知られているDNA配列 との間で、65％よりも高い相同性は観察されなかった。例２ ．キメラ性sst遺伝子の構成 pSST103と称する、十分な長さのsst cDNAクローンを、PCRを用いて、ATG(位置 34)でのNcoＩ部位及び停止コドン（位置1924）の下流でのEcoRＶの部位の導入の ために使用した。増強されたCaMV35 Ｓプロモーター、ALMVリーダー配列、uidA 遺伝子及びnosターミネーター配列を含むプラスミドpMOG18(Penなど.，1992)か らuidAコード配列をsst cDNAにより置換した。pMOG18を、BamHＩにより消化し、 クレノウDNAポリメラーゼによりフィルインし、そしてNcoＩにより消化した。Nc oＩ及びEcoRＩにより切断されたsst PCRフラグメントを、このベクター中に連結 し、クローンpSST217をもたらした。完全なキメラ性構造体(enh．35Ｓ＋ALMV−s st−nos)を含むpSST217のEcoRＩ／HindIIフラグメントを、pBINPLUS(Van Engele nなど.，1995)、すなわちpBIN19(Bevan，1984)に由来する二元植物形質転換ベク ターのEcoRＩ及びHindIII部位中にクローン化し、プラスミドpVS１をもたらした （図５Ａ）。例３ ．キメラ性fft遺伝子の構成 pFFT111と称する、十分な長さのfft cDNAクローンを、PCRを用 いて、ATG(位置29)でのNcoＩ部位及び停止コドン（位置1874）の下流でのBamHＩ 部位の導入のために使用した。増強されたCaMV35Ｓプロモーター、ALMVリーダー 配列、uidA遺伝子及びnosターミネーター配列を含むプラスミドpMOG18(Penなど. ，1992)からuidAコード配列をfft cDNAにより置換した。NcoＩ及びBamHＩにより 消化されたPCRフラグメントを、NcoＩ及びBamHＩにより消化されたpMOG18ベクタ ー中に連結し、クローンpFFT209を得た。完全なキメラ性構造体(enh．35Ｓ＋ALM V-fft−nos)を含むpFFT209のHindIII／EcoRＩフラグメントを、pBINPLUS(Van En gelenなど.，1995)、すなわちpBIN19(Bevan，1984)に由来する二元植物形質転換 ベクターのHindIII及びEcoRＩ部位中にクローン化し、プラスミドpVF１をもたら した（Fig ５Ｂ）。例４ ．ペチュニア及びジャガイモ植物の形質転換 二元ベクターpVS１及びpVF１（図５）を、Ｅ．コリXL１−Blueからアグロバク テリウム ツメファシエンス株AGLOに、三親性接合により接合した(Dittaなど. ，1980)。非接合体を用いて、Horschなど.，(1985)により記載されるようにして 、ペチュニアハイブリダ(Petunia hybrida)の葉ディスク（leaf discs）を形質 転換した。その葉ディスクは、若い開花していない植物の上部の葉から調製され た。Ｐ．ハイブリダ品種のW115もまた、形質転換実験に使用された。接合体はま た、前で記載されたように（Visser，1991）、二倍体ジャガイモ（ソラナムツベ ロサム(Solanum tuberosum)，Kardal品種）の茎外植体を形質転換するために使 用された。カナマイシン含有培地上での苗条及び根の再生の後、植物を土壌に置 き、そして室温に移した。植物は、対照として作用する二元ベクターを欠いてい るアグロバクテリウム株AGLOにより処理された葉ディスク及び茎外植体から再生 した（カナマイシンを含まない培地上で）。例５ ．sst 及びfft遺伝子を発現するトランスジェニック植物の分 析 pVS１構造体を有する、約25のトランスジェニックペチュニア植物及び25のト ランスジェニックのジャガイモ植物を再生し、そしてpVF１有する25のトランス ジェニックペチュニア及びジャガイモ植物を再生した。10のペチュニア及び10の ジャガイモ植物を、二元ベクターを欠いているアグロバクテリウム株AGLOにより 形質転換した。それらの植物は対照として用いられた。形質転換された植物から 単離されたゲノムDNAのサザンブロット分析は、導入されたキメラ性遺伝子の平 均１〜５のコピーが組込まれたことを示した（データは示されていない）。 トランスジェニック植物の炭水化物組成を、２種の実質的に異なった技法：液 体−液体隔壁に基づいて炭水化物を分離する薄層クロマトグラフィー(TLC)（TLC 処理後、フルクタンはフルクトース特異的色彩反応により検出された）及び電荷 に基づいてアルカリ性条件(pH13)下で炭水化物を分離し、そして金作用性電極に よる酸化により炭水化物を検出するHPAECにより分析した。pVS１を有するジャガ イモ及びペチュニア植物からの葉抽出物の分析は、トランスジェニック植物種が SST活性の結果である生成物を含むことを示した。TLCは、ジャガイモの葉の抽出 物に、少なくとも三糖Ｇ−（Ｆ）₂及び最とも好ましくはまた四糖Ｇ−（Ｆ）₃及 び五糖Ｇ−（Ｆ）₄の存在を示し、そしてそれらのオリゴフルクタンは対照植物 においては不在であった（図６）。ジャガイモ及びまた、トランスジェニックＰ ．ハイブリダ植物の葉抽出物におけるＧ−（Ｆ）₂及びＧ−（Ｆ）₃の存在は、HP AE分析により示された（図７及び８）。TLCよりも敏感且つより特異的であるHPA ECはまた、トランスジェニックジャガイモに少量のＧ−（Ｆ）₄を示した（図８ ）。図６〜８ の結果は、sst遺伝子がＰハイブリダ及びジャガイモの両者において酵素的活性S STタンパク質として発現されることを明確に示した。 pVF１構造体を有するトランスジェニック植物は、FFTがフルクタンの合成のた めの初期基質としてオリゴフルクタン（たとえば、Ｇ−（Ｆ）₂又はＧ−（Ｆ）₃ ）を必要とするので、フルクタンを含まなかった。オリゴフルクタンは、SST活 性を欠いている植物、たとえば野生型ジャガイモ又はペチュニア、又はpVF１構 造体を単に含むトランスジェニック植物においては存在しない。pVF１構造体を 有するトランスジェニック植物におけるFFT活性の存在は、従って、FFT活性測定 により確証される。トランスジェニックジャガイモにおける活性FFTの存在を評 価するために使用されるFFTアッセイは、Ｇ−（Ｆ）₄を犠牲にして、Ｇ−（Ｆ）_n ，ｎ＞４の合成を触媒するFFTの能力に基づかれた。pVF１構造体を有するジャ ガイモ植物からの全体の葉タンパク質抽出物を、Ｇ−（Ｆ）₄含有アッセイ混合 物と共に混合し、そして高い重合度（Ｇ−（Ｆ）_n，ｎ＞４）を有するフルクタ ンの存在をTLCにより試験した。すでに、４時間のインキュベーションの後、４ よりも高い重合度を有するフルクタン、たとえばＧ−（Ｆ）₄，Ｇ−（Ｆ）₅，Ｇ −（Ｆ）₆，Ｇ−（Ｆ）₇及びＧ−（Ｆ）₈が検出され得たが、ところがそれらの フルクタンは対照混合物には不在であった（図９）。これは、またfft遺伝子が 酵素的活性FFTタンパク質中に発現されることを示唆する。 図面の説明 図１．１−SST精製のMono Ｑ画分及びSDS−PAGEに基づく１−FFT精製のSuperd ex HR75画分の分析。レーン１、分子量マーカー （MWはkDaで与えられる）；レーン２，１−SST活性を有するMono Ｑ画分；レー ン３，１−FFT活性を有するSuperdex HR75画分。 図２．ａ．１−SSTの25kDaポリペプチド（Ａ）；ｂ．１−SSTの55kDaポリペプ チド（Ｂ）；ｃ．１−FFTの70kDaポリペプチド（Ｃ）のトリプシン消化物のRP− HPLC分離。矢印により示される遊離溶出ペプチド画分を手動的に集め、そしてア ミノ酸配列決定にゆだねた。 図３．精製された１−SST(Ａ)及び精製された１−SST及び精製された１−FFT の混合物（Ｂ）によりスクロースから合成されたオリゴフルクタンのHPAEC分離 。その反応は、100モル／ｍ³のスクロース、２モル／ｍ³のDTT，10モル／ｍ³の クエン酸塩／リン酸塩緩衝液、pH5.0，0.01％のアジ化ナトリウムにおいて25℃ で実施された。反応時間は、80時間であった。反応は、反応混合物を５分間、煮 沸することによって停止された。ラムノースは、内部標準として使用された。 図４．単離された１−SST（Ａ）及び１−FFT（Ｂ）cDNAのヌクレオチド配列及 び推定されるアミノ酸配列。精製された１−SST及び１−FFTタンパク質のアミノ 酸配列決定（また、表１を参照のこと）により決定されたアミノ酸は下線が引か れている。 図５．遺伝子構造体pVS１（Ａ）及びpVF１（Ｂ）。キメラ構造体は、ALMV翻訳 エンハンサー（Ｘ）、sst（Ｙ）又はfft（Ｗ）のコード配列、及びnos停止シグ ナル（Ｚ）、並びに増強されたCaMV35Ｓプロモーターから成る。クローニング工 程に使用された制限部位は示されている。 図６．pSF１構造体を有するトランスジェニックジャガイモ植物におけるフル クタンのTLC分析。TLCプレートは、90％水性アセトンにおいて２度、展開された 。Ｓ＝スクロース標準、Ｇ＝グルコー ス標準、Ｆ＝フルクトース標準、Ｈ＝Ｈ．ツベロサスの塊茎からの標準のフルク タン混合物、Ｎ＝Neosugar標準、Ｋ＝Ｇ−（Ｆ）₂標準、No.１〜６は、pVS１構 造体を有する個々のジャガイモ植物を示す。ＣはAGLO構造体を有する対照の植物 である。 図７．pVS１構造体を有するペチュニアハイブリダの葉から抽出された炭水化 物（ａ）、Ｈ．ツベロサスの塊茎から抽出された標準のフルクタン混合物（ｂ） 、及びAGLO構造体を有する対照のペチュニアの葉からの炭水化物（ｃ）のHPAEC 分離。 図８．pVS１構造体を有するジャガイモ（ソラナムツベロサム）の葉から抽出 された炭水化物（ａ）、Ｈ．ツベロサスの塊茎から抽出された標準のフルクタン 混合物（ｂ）、及びAGLO構造体を有する対照のジャガイモの葉からの炭水化物（ ｃ）のHPAEC分離。 図９．pVF１構造体を有するトランスジェニックジャガイモ植物の葉のタンパ ク質抽出物によりＧ−（Ｆ）₄から合成されたフルクタンのTLC分析。TLCプレー トは、ブタン−１−オール、プロパン−２−オール及び水（３：12：４，ｖ／ｖ ）において２度、展開された。Ｓ＝スクロース標準、Ｎ＝Neosugar標準、Ｈ＝Ｈ ．ツベロサスの塊茎からの標準のフルクタン混合物。No.１〜８は、pVF１構造体 を有する個々の異なったトランスジェニックジャガイモ植物を表わす。Ｃ₁びＣ₂ は、AGLO構造体を有する対照の植物である。 定義及び略語 フルクタン命名法はLewis(1993)に従っての通りである。 フルクトシル単位：他の糖分子（たとえば、グルコース、フルクトース又はガ ラクトース）に結合されるフルクトース分子。−Ｆ−（たとえば、Ｇ−Ｆ）又は −Ｆ−（たとえば、Ｇ−Ｆ＝Ｆ）として短縮される。１つ以上のフルクトシル単 位から成る分子（たとえば 、Ｇ−Ｆ−Ｆ−Ｆ−Ｆ−Ｆ−Ｆ）に関しては、短縮された表記が用いられる〔Ｇ −（Ｆ）₆〕又はGF₆。Ｇ−（Ｆ）₆は、１つのグルコシル及び６つのフルクトシ ル単位から成る。Ｇ−（Ｆ）₆は１つのフルクトシル−グルコース結合及び５つ のフルクトシル−フルクトース結合から成る。オリゴフルクタン：１，２又は３ 個のフルクトシル−フルクトース結合を有するいづれかの化合物（グルコースは 存在できるが、しかし必ずしも必要ではない）。本出願において、用語オリゴフ ルクタンとは、SST−活性の生成物〔Ｇ−（Ｆ）₂，Ｇ−（Ｆ）₃及びＧ−（Ｆ）₄ 〕を示すために使用された。オリゴフルクタンは、一般的に、短鎖のフルクタン 又は低重合度のフルクタンとして示される。本出願において、オリゴフルクタン はまた、２，３又は４個のフルクトシル単位から成る化合物を包含する（但し、 グルコシル単位は欠いている）。 フルクタン：１又は複数のフルクトシル−フルクトース結合がその結合の主要 を構成するいづれかの化合物（グルコースは存在できるが、しかし必ずしも必要 ではない）。フルクタンは、言及される物質が化学的に明確である列挙できる名 詞として使用される（たとえば、フルクタンＧ−（Ｆ）₂及びＧ−（Ｆ）₁₃）。 本出願においては、フルクタンは、FFT活性の生成物として定義される（Ｇ−Ｆ_n ，２≦ｎ≦60）。特にことわらない限り、フルクタンはまた、オリゴフルクタン を包含する。フルクタンの制限されたグループを示すために、“Ｇ−Ｆ_n，ｎ＝ ・・”が使用される。本出願においては、フルクタンはまた、１よりも多くのフ ルクトシル単位から成る（但し、グルコシル単位は欠いている）化合物も包含す る。 イヌリン：β−２，１−フルクトシル−フルクトース結合をほとんど有するフ ルクタン（グルコースは存在することができるが、しかし必ずしも必要ではない ）。 レバン：β−２，１−フルクトシル−フルクトース結合をほとんど有するフル クタン（グルコースは許容されるが、しかし必ずしも必要ではない）。レバンは また、細菌性フルクタンは必ずしも、優先的にβ−２，６−フルクトシル−フル クトース結合から成らないけれども、細菌起源からのフルクタンを示すためにも 使用される。たとえば、バシラス サブチラスからレバンスクラーゼにより合成 されたフルクタンは、優先的にβ−２，１−フルクトシル−フルクトース結合（ イヌリン）を有する。 レバンスクラーゼ：フルクタンの合成に包含される細菌起源の酵素。 スクロース：スクロース フルクトシルトランスフェラーゼ(SST)：フルクタ ン合成の初期段階（反応２）を触媒する植物由来の酵素。酵素はまた、オリゴフ ルクタン〔Ｇ−（Ｆ）_n，ｎ≦ｎ≦４〕の合成にも包含される（反応３）。本出 願においては、標示SSTは、１−SST、すなわちβ−２，１−フルクトシル−フル クトース結合をほとんど有するオリゴフルクタンの生合成に関与するSST形；又 は６−SST、すなわちβ−２，６−フルクトシル−フルクトース結合をほとんど 有するオリゴフルクタンの生合成に関与するSST形；又は１−SST及び６−SSTの いづれかを包含することができる。 フルクタン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ(FFT)：フルクタ ンの合成に関与する植物由来の酵素。オリゴフルクタン及び高い重合度のフルク タンの合成を触媒できる酵素。Ｈ．ツベロサスからのFFTは、Ｈ．ツベロサスか らのSSTと重複する活性を有するが（反応３）、しかしフルクタン合成の初期段 階を触媒できない（反応２）。本出願においては、表示FFTは、１−FFT、すなわ ちβ−２，１−フルクトシル−フルクトース結合をほとんど有するオリゴフルク タンの生合成に関与するFFT形；又は６−FFT、す なわちβ−２，６−フルクトシル−フルクトース結合をほとんど有するフルクタ ンの生合成に関与するFFT形；又は１−FFT及び６−FFTのいづれかを包含するこ とができる。 インベルターゼ：β−フルコシダーゼ又はβ−フルコフラノシダーゼ。 重合度（DP）：フルクトシル及びグリコシル残基の合計量を示すための用語； たとえば、Ｇ−（Ｆ）₂は、３つのDPを有する。Ｇ−Ｆ_nにおけるｎ−値は、重合 度の上昇と共に上昇する。 フルクタンプロフィール：植物、植物器官又は植物細胞由来の抽出物における 、フルクタンのサイズ／分布のパターン又は他方では、フルクタンの相対量及び 種類を説明するための用語。抽出物のフルクタンパターンを分析するために現在 、最とも信頼できる方法は、高性能アニオン交換クロマトグラフィー及びパルス されたアンペロメトリック（amperometric）検出(Chatlertonなど.，1990)によ るものである。 シコリウム インチバス(Cichorium intybas)：チコリー。 HPLC：高性能液体クロマトグラフィー。化合物の複雑な混合物の分離のための 技法。この技法の変法は、高性能逆相クロマトグラフィー（RP HPLC）、又はパ ルスされたアンペロメトリック検出と組合しての高性能アニオン交換クロマトグ ラフィー(HPAEC−PAD、たとえば図３を参照のこと)。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年１月２日 【補正内容】 請求の範囲 １．図４Ａに示されるようなヌクレオチド配列：配列番号１、又は下記の一般 的な反応： Ｇ−（Ｆ）_n＋Ｇ−（Ｆ）_m→Ｇ−（Ｆ）_n-1＋Ｇ−（Ｆ）_m+1，１≦ｎ≦３，１≦ ｍ≦３ 〔上記において、−Ｇはグルコシル単位を表わし、そして−Ｆはフルクトシル単 位を表わす〕を触媒する、１−スクロース：スクロース フルクトシルトランス フェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、少なくとも70％の同一性を有 する相同配列を有するDNAフラグメント。 ２．図４Ｂに示されるようなヌクレオチド配列：配列番号２、又は下記の一般 的な反応： Ｇ−（Ｆ）_n＋Ｇ−（Ｆ）_mＧ→−（Ｆ）_n-1＋Ｇ−（Ｆ）_m+1，ｎ≧２，ｍ≧２ 〔上記において、−Ｇ及び−Ｆは請求の範囲第１項記載の通りである〕を触媒す る、１−フルクタン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有す るタンパク質をコードする、少なくとも70％の同一性を有する相同配列を有する DNAフラグメント。 ３．少なくとも85％の同一性を有する請求の範囲第１又は２項記載のDNAフラ グメント。 ４．請求の範囲第１〜３のいづれか１項記載の１又は複数のDNAフラグメント を含んで成る組換えDNA配列。 ５．前記フラグメントが逆の配向で存在する請求の範囲第４項記載の組換えDN A配列。 ６．変性されたフルクタンプロフィールを示す遺伝子的に形質転換された宿主 生物を生成するための方法であって、 ｉ）前記宿主生物において活性なプロモーター配列及び前記宿主生物において 活性なターミネーター配列に作用可能に連結される、請求の範囲第１〜３のいづ れか１項記載の１又は複数のDNAフラグメント又は逆の配向での前記DNAフラグメ ントを含んで成るキメラ性遺伝子構造体を調製し、 ii）前記キメラ性遺伝子構造体を前記宿主生物のゲノム中に導入する段階を含 んで成る方法。 ７．前記宿主生物が植物であり、そしてiii）前記形質転換された植物細胞を トランスジェニック植物に再生する段階をさらに含んで成る請求の範囲第６項記 載の方法。 ８．植物において活性なプロモーター配列及び植物において活性なターミネー ター配列に作用可能に結合された、請求の範囲第１〜３のいづれか１項記載の１ 又は複数のDNAフラグメント、又は逆の配向での前記DNAフラグメントを含んで成 るキメラ遺伝子構造体を有する、変性されたフルクタンプロフィールを示す形質 転換された植物、又は前記植物の細胞、種子、果実、実生又はいづれかの部分。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，Ａ Ｌ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ， ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ ，ＶＮ (72)発明者 ファン デル メーヤ，イングリッド マ リア オランダ国，エヌエル−6708 ペーベー ワゲニンゲン，ドルーベンダールセステー グ １ (72)発明者 コープス，アンドリエス ジュリアン オランダ国，エヌエル−6708 ペーベー ワゲニンゲン，ドルーベンダールセステー グ １

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．図４Ａに示されるようなヌクレオチド配列：配列番号１、又は１−スクロ ース：スクロース フルクトシルトランスフェラーゼをコードする、少なくとも 70％の類似性を有する相同配列を有するDNAフラグメント。 ２．図４Ｂに示されるようなヌクレオチド配列：配列番号２、又は１−フルク タン：フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼをコードする、少なくとも 70％の類似性を有する相同配列を有するDNAフラグメント。 ３．少なくとも85％の類似性を有する請求の範囲第１又は２項記載のDNAフラ グメント。 ４．請求の範囲第１〜３のいづれか１項記載の１又は複数のDNAフラグメント を含んで成る組換えDNA配列。 ５．逆の配向で存在する、請求の範囲第１〜３のいづれか１項記載の１又は複 数のDNAフラグメントを含んで成る組換えDNA配列。 ６．変性されたフルクタンプロフィールを示す遺伝子的に形質転換された宿主 生物を生成するための方法であって、 ｉ）前記宿主生物において活性的なプロモーター配列及び前記宿主生物におい て活性的なターミネーター配列に操作可能的に連結される、請求の範囲第１〜３ のいづれか１項記載の１又は複数のDNAフラグメント又は逆の配向での前記DNAフ ラグメントを含んで成るキメラ性遺伝子構造体を調製し、 ii）前記キメラ性遺伝子構造体を前記宿主生物のゲノム中に導入する段階を含 んで成る方法。 ７．前記宿主生物が植物であり、そしてiii）前記形質転換された植物細胞を トランスジェニック植物に再生する段階をさらに含んで 成る請求の範囲第６項記載の方法。 ８．請求の範囲第７項記載の方法により生成された、形質転換された植物、又 は前記キメラ性遺伝子構造体を有する、植物細胞、種子、果実、実生、又はいづ れかの植物部分。