ES2294125T3 - Proteina endotoxina delta quimerica de cry1ea y cry1ca. - Google Patents

Abstract

Proteína endotoxina d quimérica Cry1E de ID SEC Nº 1.

Description

Proteína endotoxina \delta quimérica de Cry1Ea y Cry1Ca.

Ámbito técnico

La presente invención se refiere a una proteína endotoxina \delta quimérica Cry 1E de ID SEC Nº 1 con extraordinariamente alta propiedad insecticida y a un gen quimera de ID SEC Nº que codifica dicha proteína quimérica, y también a un método para tratar plantas infestadas por insectos usando dicha proteína quimera.

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Antecedentes de la técnica

Los daños debidos a los insectos cuestan miles de millones de dólares anualmente en forma de pérdidas de cosechas y debido al gasto que es necesario efectuar para mantener a estas plagas bajo control. Las pérdidas que son ocasionadas por las plagas en los entornos de producción agrícola incluyen la disminución del rendimiento de los cultivos, la mala calidad de las cosechas, los incrementados costes de recolección y los perjuicios para la salud y el medio
ambiente.

Puede hacerse referencia Hofte H. y Whiteley H.R., 1989, "Insecticidal crystal protein of Bacillus thuringiensis", Microbiol. Rev. 53: 242-255, donde la especie Bacillus thuringiensis (B.t.) es una ubicua bacteria del suelo formadora de esporas y gram-positiva que es conocida por su capacidad para producir inclusiones cristalinas parasporales durante la esporulación. Estas inclusiones constan de proteínas que son conocidas como proteínas cristal o proteínas Cry o endotoxinas \delta y presentan actividad insecticida, particularmente contra las larvas de especies de insectos de los órdenes de los lepidópteros, los dípteros y los coleópteros. Han sido también mencionadas en la literatura proteínas con toxicidad para insectos de los órdenes de los himenópteros, los homópteros, los ortópteros y los malófagos; los nematodos; los ácaros y los protozoos (pueden citarse al respecto Feitelson J.S., 1993, "The Bacillus thuringiensis family tree", 63-71, en L. kim ed. Advanced engineered pesticides. Marcel Dekker. Inc., New York, N.Y. y Feitelson et al., 1992, "Bacillus thuringiensis: insects and beyond", Bio/Tech. 10: 271-275). Varias cepas de Bacillus thuringiensis (B.t.) han sido identificadas con distintos espectros de huéspedes y clasificadas en distintas subespecies o serotipos sobre la base de los antígenos flagelares. El Instituto Pasteur de Francia ha catalogado 55 distintos serotipos flagelares y 8 biotipos no flagelados. Puede hacerse referencia a Schnepf et al., 1998, "Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins", Microbiol. Mol. Biol. Riv. 62: 775-806, donde varios genes codificadores de toxinas B.t. han sido clonados, secuenciados y caracterizados y han sido producidos y aprobados para el uso comercial productos basados en ADN recombinante. Mediante el empleo de técnicas de ingeniería genética se han desarrollado nuevos enfoques para aportar estas toxinas B.t. a los ambientes agrícolas, incluyendo el uso de los cultivos manipulados genéticamente y de las células microbianas intactas estabilizadas como vehículos de aportación de endotoxinas \delta (Gaertner, F.H., Kim L., 1988, TIBTECH 6: 54-57). Así, están llegando a ser comercialmente valiosos los genes de endotoxinas \delta que codifican para proteínas dirigidas a matar a los huéspedes, y especialmente a las plagas y los insectos que ocasionan pérdidas económicas.

El uso comercial de los pesticidas B.t. en un determinado ambiente de cultivo es limitado porque una determinada endotoxina \delta presenta toxicidad para una estrecha gama de plagas objetivo. Han venido usándose durante muchos años como insecticidas comerciales contra plagas de lepidópteros preparaciones de las esporas y los cristales de B. thuringiensis de la subespecie kurstaki. Por ejemplo, la variedad kurstaki HD-1 de B. thuringiensis produce varias endotoxinas \delta y es por consiguiente tóxica para una relativamente más amplia gama de insectos lepidópteros. Sin embargo, las formulaciones basadas en las endotoxinas \delta conocidas, incluyendo las B.t.k. HD-1, no son eficaces contra algunas de las plagas importantes de los cultivos, tales como las de Spodoptera sp., que también pertenecen al orden de los lepidópteros. Otras especies de B.t., y concretamente la israelensis y la tenebrionis, han sido usadas comercialmente para controlar ciertos insectos de los órdenes de los dípteros y los coleópteros, respectivamente (pueden citarse al respecto (Gaertner, F.H., 1989, "Cellular Delivery Systems for Insecticidal Proteins: Living and Non-Living Microorganisms", en Controlled Delivery of Crop Protection Agents, R.M. Wilkins, ed., Taylor and Francis, New York y Londres, 1990, pp. 245-255; Couch T.L., 1980, "Mosquito Pathogenicity of Bacillus thuringiensis var. israelensis", Development in Industrial Microbiology 22: 61-76 y Beegle C.C., 1978, "Use of Entomogenous Bacteria in Agroecosystems", "Developments in Industrial Microbiology" 20: 97-104). Kreig et. al. (1983), en Z. ang. Ent. 96: 500-508, describen Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que al parecer es activa contra dos escarabajos del orden de los coleópteros, es decir los escarabajos de la patata de Colorado Leptinotarsa decemlineata y Agelastica
alni.

Puede hacerse referencia a Crickmore et. al., 1998, "Revision in the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins", Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 807-813, donde los genes de proteínas cristal son clasificados en 22 clases, primariamente sobre la base de la homología de las secuencias de aminoácidos. La clonación y expresión de un gen de proteína cristal B.t. en Escherichia coli ha sido descrita en varios casos en la literatura publicada (puede citarse al respecto Schnepf et al., 1981, "Cloning and expression of the Bacillus thuringiensis crystal protein gene in Escherichia coli"). Las Patentes U.S. Núms. 4.448.885 y 4.467.036 describen la expresión de proteína cristal B.t. en E. coli. Las Patentes U.S. Núms. 4.797.276 y 4.853.331 describen B. thuringiensis de la cepa tenebrionis que puede ser usada para controlar plagas de coleópteros en varios ambientes. La Patente U.S. Nº 4.918.006 describe toxinas B.t. que tienen actividad contra dípteros. La Patente U.S. Nº 4.849.217 describe aislados de B.t. que tienen actividad contra el gusano verde de la alfalfa. La Patente U.S. Nº 5.208.017 describe aislados de Bacillus thuringiensis que tienen actividad contra los coleópteros. Las Patentes U.S. Núms. 5.151.363 y 4.948.734 describen ciertos aislados de B.t. que tienen actividad contra los nematodos. Extensivos recursos e investigaciones están siendo dedicados a descubrir nuevos aislados de B.t. y sus usos. Hasta la fecha sigue siendo una técnica empírica e imprevisible el descubrimiento de nuevos aislados de B.t. y de nuevos usos de los aislados de B.t. conocidos. Varios laboratorios en todo el mundo están intentando aislar nuevos genes de endotoxinas \delta de B. thuringiensis para distintas gamas de huéspedes y distintos mecanismos de acción.

Bulla et al., 1980, "Ultrastructure, physiology and biochemistry of Bacillus thuringiensis". CRC Crit. Rev. Microbiol. 8: 147-204 y Grochulski et al., 1995, "Bacillus thuringiensis CryIA(a) insecticidal toxin: crystal structure and channel formation", J. Mol. Biol, 254: 447-464, han descrito que la mayoría de las proteínas cristal insecticidas B.t. son sintetizadas de forma natural como protoxinas (de un peso molecular de 130-140 kDa) que forman inclusiones parasporales en virtud de interacciones hidrofóbicas, enlaces de hidrógeno y puentes de disulfuro. Las protoxinas, que no son tóxicas para las larvas de los insectos, se componen de dos segmentos que son la mitad N-terminal y la mitad C-terminal. Las protoxinas son convertidas en toxinas funcionalmente activas (de 60-70 kDa) en el intestino medio del insecto a continuación de su fragmentación específica de sitio por parte de proteasas a pH alcalino. Tales endotoxinas \delta truncadas procesadas proteolíticamente se fijan a receptores específicos en el intestino medio del insecto y ocasionan mortalidad haciendo poros en la membrana epitelial (pueden citarse al respecto las referencias de Bietlot et al., 1989, "Facile preparation and characterization of the toxin from Bacillus thuringiensis var. kurstaki", Biochem. J., 260: 87-91; Choma et al., 1990, "Unusual proteolysis of the protoxin and toxin from Bacillus thuringiensis: structural implications", Eur. J. Biochem. 189: 523-27; y Hofte et al., 1986, "Structural and functional analysis of a cloned delta endotoxin of Bacillus thuringiensis berliner 1715", Eur. J. Biochem. 161: 273-280). La toxina activa resistente a la proteasa corresponde a la mitad N-terminal de la molécula de protoxina. Se cree que el otro segmento correspondiente a la mitad C-terminal se requiere para la formación de cristales altamente estables. Durante el procesamiento proteolítico es retirado del N-terminal de la protoxina un pequeño polipéptido que comprende aproximadamente 25-30 residuos de aminoácidos.

Son conocidas las estructuras cristalinas del segmento tóxico central de las endotoxinas \delta Cry1Aa y Cry3Aa (Grochulsky et al., "Bacillus thuringiensis CryIA(a) insecticidal toxin: crystal structure and channel formation", J. Mol. Biol. 254: 447-464 y Li et al., 1991, "Crystal structure of insecticidal \delta-endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 \ring{A} resolution", Nature. 353: 815-821), y sus estructuras tridimensionales son superponibles. Los dominios polipeptídicos razonablemente conservados sugieren que las correspondientes toxinas tienen una similar estructura topológica. Éstas son moléculas globulares que se componen de 3 distintos dominios estructurales conectados por pequeños ligadores peptídicos. No hay cruzamientos de las cadenas de polipéptidos entre los dominios. El dominio I consta de 7 estructuras helicoidales \alpha. El dominio II consta de tres hojas \beta antiparalelas y dos hélices \alpha cortas. El dominio III es un sándwich \beta de dos hojas \beta altamente trenzadas antiparalelas. Los dominios II y III están situados en el lado en el que quedan encarados a la hélice \alpha7 del dominio I. Estos dominios están estrechamente empaquetados en virtud de numerosas fuerzas de van der Wall y numerosos enlaces de hidrógeno e interacciones electrostáticas (puentes de sal) entre los dominios.

Una de las principales razones para la estrecha gama de huéspedes de las endotoxinas \delta es la de que estas proteínas necesitan receptores específicos en el intestino del insecto a fin de hacer poros y ocasionar toxicidad. Puesto que una determinada endotoxina \delta presenta toxicidad para una muy reducida gama de insectos, es deseable manipular estas proteínas para modificar su reconocimiento de receptores en el intestino medio larval, para hacer que resulte más amplia la gama de huéspedes y mejorar la toxicidad. Se han seguido dos enfoques con esta finalidad, que son primeramente el desarrollo de genes quiméricos (o híbridos) a base de intercambiar dominios funcionales de las proteínas, y en segundo lugar el desarrollo de proteínas endotoxinas \delta mejoradas mediante mutagénesis sitio-dirigida. Puede hacerse referencia a las Patentes U.S. Núms. 5.128.130 y 5.055.294, en las que han sido construidas proteínas cristal B.t. híbridas que presentan una incrementada toxicidad y son de aplicación a una gama de huéspedes ampliada en cuanto a las plagas objetivo.

Puede hacerse referencia a Honne et al., 1990, "A translation fusion product of two different insecticidal crystal protein gene of Bacillus thuringiensis exhibits an enlarged insecticidal spectrum" Appl. Environ. Microbiol. 56: 823-825, donde se ha hecho la fusión traslacional de dos genes cry (cry1Ab y cry1Ca). La proteína híbrida resultante tenía un más amplio espectro de toxicidad que abarcaba a los de las dos proteínas cristal progenitoras que sirvieron para obtenerla. Sin embargo, el inconveniente es que la actividad de la toxina quimérica no aumentó con respecto a ninguna de las toxinas progenitoras para con las plagas insectiles que constituyen el objetivo perseguido. A pesar de la mala toxicidad, el gen de fusión fue expresado en tabaco tras modificación parcial, lo cual confirió solamente una protección parcial a las plantas transgénicas contra una más amplia gama de insectos entre los que se incluyen los de las especies Spodoptera exigua, Heliothis virescens y Manduca sexta (puede citarse a este respecto la referencia de van der Salm et al., 1994, "Insect resistance of transgenic plants that express modified Bacillus thuringiensis cry1Ab and cry1C genes: a resistance management strategy", Plant. Mol. Biol. 26: 51-59).

Puede hacerse referencia a Honee et al., 1991, "The C-terminal domain of the toxic fragment of Bacillus thuringiensis crystal protein determines receptor binding", Mol. Microbiol. 5: 2799-2806, donde han sido construidos 11 genes quiméricos usando cry1Ab y cry1Ca como genes progenitores a base de intercambiar dominios funcionales. El inconveniente es el de que solamente presentaban actividad insecticida dos proteínas quiméricas en las cuales habían sido intercambiados dominios formadores de poros. Sin embargo, la eficacia de las proteínas quiméricas toxinas era más baja que la de las proteínas progenitoras. Otras proteínas híbridas eran atóxicas.

Masson et al., 1992, "Insecticidal properties of a crystal protein gene product isolated from Bacillus thuringiensis subsp. kenyae", Appl. Environ. Microbiol. 58: 2, 642-646, describieron que una de las endotoxinas \delta Cry1, y concretamente la Cry1Ea, no presenta toxicidad contra las larvas de Spodoptera. Además puede hacerse referencia a Bosch et al., 1994, "Recombinant Bacillus thuringiensis Crystal protein with new properties: possibilities for resistance management", Bio/Tech 12: 915-918, donde muchos genes quiméricos han sido desarrollados a continuación de la recombinación in vivo de genes cry1Ca y cry1Ea. La endotoxina \delta expresada desde uno de los genes quiméricos, la cual constaba del dominio I y II de la proteína Cry1Ea y del dominio III de la proteína Cry1Ca, presentaba actividad larvicida. La transferencia del dominio III de la Cry1Ca a la proteína Cry1Ea dio una proteína insecticida. Sin embargo, la toxina quimérica no era una toxina mejorada con respecto a la Cry1Ca, que es la toxina mejor descrita para Spodoptera sp. Otra toxina quimérica presentó muy mala toxicidad. Las toxinas quiméricas restantes eran inestables o atóxicas.

Puede citarse la referencia de Rang et al., 1999, "Interaction between functional domain of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein", Appl Environ Microbiol, 65, 7: 2918-25, donde han sido desarrollados muchos genes quiméricos intercambiando las regiones que codifican para dominio I o dominio III de entre las endotoxinas \delta Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Ca y Cry1Ea y se ha verificado su estabilidad en E. coli y la permeabilidad de la membrana plásmica de células Sf9. Una toxina quimérica (que constaba de los dominios I y II de Cry1Ca y del dominio III de Cry1Ab) era más tóxica que las toxinas progenitoras. El intercambio del dominio III de Cry1Ab con el de Cry1Ca hizo que la proteína quimérica fuese más activa que la proteína Cry1Ca. Las proteínas con el intercambio de otros dominios eran inestables o menos tóxicas que las proteínas progenitoras. Sin embargo, no fue sometida a ensayo la toxicidad de la proteína quimérica para las larvas de insectos. Fue comparada la formación de poros en las líneas celulares de insectos, pero eso no puede ser correlacionado con la actividad insecticida de la endotoxina \delta.

Puede hacerse referencia a Chandra et al., 1999, "Amino acid substitution in alpha-helix 7 of Cry1Ac \delta-endotoxin of Bacillus thuringiensis leads to enhanced toxicity to Helicoverpa armigera Hubner", FEBS Lett. 458: 175-179, donde se comprobó que un motivo hidrofóbico en el extremo C-terminal del fragmento B de la toxina de la difteria era homólogo con la hélice \alpha7 de las endotoxinas \delta. Tras la sustitución de la hélice \alpha7 de la proteína Cry1Ac por este polipéptido, la proteína quimérica presentaba de 7 a 8 veces más toxicidad para con Helicoverpa armigera. El incremento de la toxicidad era debido a la mayor capacidad de formación de poros.

Estos ejemplos establecen el potencial de la manipulación de proteínas para el mejoramiento de las toxinas nativas, para desarrollar endotoxinas \delta comercialmente útiles.

Las plagas de lepidópteros son en su mayoría de naturaleza polífaga. El del género Spodoptera es un insecto lepidóptero común y sus 5 especies (litura, littoralis, exigua, frugiperda y exempta) se encuentran en todo el mundo. La de Spodoptera littoralis (el gusano de la hoja del algodón egipcio, CLW) es una importante plaga del algodón y otros cultivos de importancia agronómica en Europa (puede citarse a este respecto la referencia de Mazier et al., 1997, "The cry1C gene from Bacillus thuringiensis provides protection against Spodoptera littoralis in young trasgenic plants", Plant Sci. 127: 179-190. Se trata de una notoria plaga del algodón, del cacahuete, de la guindilla, de las leguminosas y de varios cultivos vegetales, especialmente en las regiones cálidas y húmedas tales como las partes meridionales de la India. La alta fecundidad, el corto ciclo de vida, los destructivos hábitos de alimentación y la frecuentemente descrita emergencia de resistencia a los insecticidas químicos han hecho que el control de Spodoptera constituya un creciente problema agrícola. Puede hacerse referencia a Bai et al., 1993, "Activity of insecticidal proteins and strains of Bacillus thuringiensis against Spodoptera exempta (Walker)" J. Inverteb. Pathol. 62: 211-215, donde se expone que las larvas jóvenes son susceptibles a ciertas endotoxinas \delta, pero las larvas que están más allá del 2º instar presentan considerable tolerancia. Esto ha sido atribuido al alto contenido de proteasas alcalinas en el jugo intestinal (puede citarse a este respecto la referencia de Keller et al., 1996, "Digestion of \delta-endotoxin by gut proteases may explain reduced sensitivity of advanced instar larvae of Spodoptera littoralis to Cry1C", Insect Biochem. Mol. Biol. 26: 365-373).

Se ha descrito que cuatro distintas endotoxinas \delta ocasionan un bajo nivel de mortalidad a los Spodoptera sp. De éstas, la Cry1Ca es la toxina más eficaz. Las plantas que expresaban Cry1Ca a alto nivel ocasionaban mortalidad y por consiguiente conferían protección contra las larvas en fase instar inicial (pueden citarse a este respecto las referencias de Mazier et al., 1997, "The cry1C gene from Bacillus thuringiensis provides protection against Spodoptera littoralis in young trasgenic plants". Plant Sci. 127: 179-190 y Strizhov et al., 1996, "A synthetic cry1C gene, encoding a Bacillus thuringiensis \delta-endotoxin, confers Spodoptera resistance in alfalfa and tobacco" Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 15012-15017). Sin embargo, en ningún caso se ha descrito una protección total contra Spodoptera. Las larvas en fases de desarrollo avanzadas son matadas a moderados niveles de las endotoxinas \delta conocidas. Por consiguiente, las plantas transgénicas que expresan Cry1Ca no son eficaces como plantas deseables para la protección contra Spodoptera. Otros genes tales como los cry1Cb, cry1Ea y cry1F no han sido empleados para el desarrollo de plantas transgénicas contra Spodoptera debido a su comparativamente baja toxicidad. La endotoxina \delta Cry1Cb es 5 veces menos tóxica que la Cry1Ca. La toxicidad de la endotoxina \delta Cry1Ea es muy baja y es puesta en duda en ciertos trabajos (pueden citarse a este respecto Masson et al., 1992 y Bosch et al., 1994). La Cry1F presenta ligera toxicidad para las larvas de Spodoptera (puede citarse a este respecto Chambers et al., 1991).

Puede hacerse referencia a Kalman et al., 1993, "Cloning of a novel cryC-type gene from a strain of Bacillus thuringiensis subsp. Galleriae", Appl. Environ. Microbiol. 59: 4: 1131-1137, donde se describe que la endotoxina \delta Cry1Cb es 5 veces menos tóxica que la Cry1Ca. Los dos primeros dominios de estas proteínas son altamente homólogos (idénticos en un 92%). Se observa una diferencia importante en el dominio III, que presenta tan sólo una homología del 48%. La más alta toxicidad (5 veces superior) de la Cry1Ca en comparación con la endotoxina \delta Cry1Cb nos sugirió que el dominio III de la Cry1Ca podría desempeñar un importante papel en su eficacia. La toxicidad de la endotoxina \delta Cry1Ea es muy mala por cuanto que la misma se fija al receptor muy débilmente en el intestino medio de Spodoptera exigua, pero el intercambio del dominio III de Cry1Ca con el de Cry1Ea hizo que ésta última fuese tóxica. Esto sugiere el papel desempeñado por el dominio III de la proteína Cry1C en la fijación al receptor en el intestino medio de Spodoptera (puede citarse a este respecto la referencia de Bosch et al., 1994, "Recombinant Bacillus thuringiensis Crystal protein with new properties: possibilities for resistance management". Bio/Tech 12: 915-918). En esta publicación, Bosch et al. (1994) establecieron la ventaja de la toxina híbrida por cuanto que la misma se fija a un receptor al que la Cry1Ca no se fija. Sin embargo era equiparable la toxicidad de ambas, o sea de la Cry1Ca nativa y de la Cry1Ea híbrida. Estos autores presentaron una patente (US 5736131) en la cual se reivindicaba un mejoramiento de 1,9 veces de la toxicidad para con Spodoptera exigua. La diferencia entre los resultados de la publicación que describe que no se da un acrecentamiento de la toxicidad y de la patente que reivindica una toxicidad mejorada 1,9 veces hace que la situación resulte en general poco clara.

La tecnología de la ingeniería genética en las plantas ha experimentado importantes adelantos durante los últimos 10 años. Ha llegado a ser posible introducir de manera estable genes foráneos en plantas. Esto ha proporcionado interesantes oportunidades para la agricultura moderna. Derivados del plásmido Ti del patógeno vegetal Agrobacterium tumefaciens han demostrado ser vehículos eficaces y altamente versátiles para la introducción de genes foráneos en tejido vegetal. Adicionalmente han sido desarrollados con la misma finalidad los de una variedad de métodos para aportar ADN (ADN = ácido desoxirribonucleico), tales como la electroporación, la microinyección, la transferencia de genes mediada por polen y la tecnología del cañón de partículas.

El principal objetivo que persigue la transformación de plantas mediante ingeniería genética ha sido el del mejoramiento de los cultivos. Se han hecho considerables esfuerzos para manipular las plantas para lograr que las mismas presenten rasgos útiles tales como la resistencia a los insectos. A este respecto se han logrado progresos en la línea de dotar artificialmente de resistencia a los insectos a las plantas transgénicas mediante el uso de genes que codifican endotoxinas \delta y pertenecen a cepas de B. thuringiensis. Puesto que las endotoxinas \delta poseen un específico espectro insecticida y no presentan toxicidad para otros animales y humanos no huéspedes, las mismas son muy adecuadas para desarrollar plantas comercialmente útiles. No se conoce otra proteína que como las endotoxinas \delta presente una toxicidad tan alta (a niveles de ppm) y sea sin embargo tan inocua para los organismos que no constituyen el objetivo de la misma.

Se ha demostrado la viabilidad de generar cultivos transgénicos que sean resistentes a los insectos y expresen endotoxinas \delta y su éxito en la agricultura comercial. (Puede hacerse a este respecto referencia a Vaeck et al., 1987, "Transgenic plants protected from insect attack", Nature. 328: 33-37; Fischoff et al., 1987, "Insect tolerant transgenic tomato plants", Bio/tech. 5: 807-813; Barton et al., 1987, "Bacillus thuringiensis\delta-endotoxin expressed in transgenic Nicotiana tabaccum provides resistance to lepidopteran insects", Plant Physiol. 85: 1103-1109). Las plantas transgénicas ofrecen una alternativa para el control de insectos en agricultura que es al mismo tiempo inocua, compatible con la conservación del medio ambiente y rentable. Se ha observado un exitoso control de insectos bajo las condiciones que se dan en el campo (puede hacerse referencia a Delannay et al., 19889; Meeusen y Warren,
1989).

Puede citarse la referencia de Von Tersch et al. 1991, "Insecticidal toxins from Bacillus thuringiensis subsp kanyae: Gene cloning and characterization and comparison with B. thuringiensis subsp kurstaki Cry1A(c) toxin" en Appl and Environ Microbial, 57:2:39-58, donde fueron aisladas de dos distintas cepas dos variantes de cry1Ac. Su composición de aminoácidos era distinta en 7 posiciones. Ambas endotoxinas \delta eran expresadas en E. coli, y fue llevado a cabo un experimento de toxicidad. Las dos toxinas no presentaron diferencia alguna en cuanto a la eficacia para con las plagas objetivo.

En otro estudio (Schnepf et al., 1998, "Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins", 62: 3, 775-806) fueron alterados los residuos de aminoácidos GYY de la endotoxina \delta Cry1Ac en la posición 312 a 314 para sustituirlos con ASY, GSY y GFS. No se observó diferencia de toxicidad alguna entre las tres proteínas.

Hay dos variantes naturales de la endotoxina \delta Cry1C, que son concretamente la Cry1Ca y la Cry1Cb. Estas proteínas presentan una identidad de las secuencias de aminoácidos de un 81% (Schnepf et al., 1998, "Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins", 62: 3, 775-806). A pesar de esta diferencia, ambas toxinas son tóxicas para su plaga objetivo, si bien hay cierta diferencia en cuanto al nivel de toxicidad. Su gama de huéspedes es también la misma. (Kalman et al., 1993, "Clonning of a noval cry1C type gene from a strain of Bacillus thuringiensis subsp galleriae" Appl. Environ Microbial 59: 4: 1131-37).

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Objetos de la presente invención

El principal objeto de la presente invención es el de desarrollar una proteína endotoxina \delta quimérica.

Otro objetivo principal de la presente invención es el de desarrollar un gen quimera que codifique para una proteína endotoxina \delta quimérica.

Otro objeto adicional de la presente invención es el desarrollar un método para desarrollar dicha proteína quiméri-
ca.

Aun otro objeto de la presente invención es el de desarrollar un método para sobreexpresar dicha proteína quimérica en un microbio adecuado.

Aun otro objeto de la presente invención es el de desarrollar un método para tratar plantas infestadas por insectos usando dicha proteína quimérica.

Un objeto adicional de la presente invención es el de desarrollar un insecticida para insectos resistentes a multidrogas.

Otro objeto de la presente invención es el de desarrollar un insecticida eficaz.

Aun otro objeto de la presente invención es el de desarrollar un insecticida que no tenga efecto adverso alguno en las plantas.

Otro objeto adicional de la presente es el de desarrollar un insecticida con una actividad insecticida de aproximadamente un 100%.

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Breve exposición de la presente invención

La presente invención se refiere a una proteína endotoxina \delta quimérica Cry1E de ID SEC Nº 1 con extraordinariamente alta propiedad insecticida y a un gen quimera de ID SEC Nº 2 que codifica dicha proteína quimérica, y también a un método para tratar a plantas infestadas por insectos usando dicha proteína quimera.

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Descripción detallada de la presente invención

En consecuencia, la presente invención se refiere a una proteína endotoxina \delta quimérica Cry1E de ID SEC Nº 1 con una extraordinariamente alta propiedad insecticida y a un gen quimera de ID SEC Nº 2 que codifica dicha proteína quimérica, y también a un método para tratar plantas infestadas por insectos usando dicha proteína quimera.

En una realización de la presente invención, una proteína endotoxina \delta quimérica Cry1E de ID SEC Nº 1 y otras proteínas de una homología de un 75% y más en la secuencia.

En otra realización de la presente invención, una proteína endotoxina \delta quimérica Cry1E de ID SEC Nº 1.

En otra realización adicional de la presente invención, donde dicha proteína es de una longitud de 641 residuos de aminoácidos.

En otra realización adicional de la presente invención, donde dicha proteína quimérica es diseñada a partir de las endotoxinas \delta Cry1Ea y Cry1Ca de Bacillus thuringiensis.

En otra realización adicional de la presente invención, donde dicha proteína de una longitud de 641 residuos consta de los residuos 1 a 529 de la endotoxina Cry1Ea de la misma posición, los residuos 530 a 599 de Cry1Ca de la posición 533 a la 602, los residuos 600 a 616 de Cry1Ea de la posición 588 a la 604 y los residuos 617 a 641 de un polipéptido sintético.

En otra realización adicional de la presente invención, donde el dominio peptídico de 530 a 587 de Cry1Ea puede ser sustituido por el de cualquier otra endotoxina \delta.

En otra realización adicional de la presente invención, donde los últimos 25 residuos de aminoácidos mejoran la estabilidad contra las proteasas de las plantas.

En otra realización adicional de la presente invención, donde dicha proteína quimérica es estable a una temperatura que está situada entre 4 y 35ºC.

En otra realización adicional de la presente invención, un gen quimera de ID SEC Nº 2.

En otra realización de la presente invención, donde dicha quimera codifica la proteína quimérica de ID SEC
Nº 1.

En otra realización adicional de la presente invención, donde dicha quimera es de una longitud de 1990 pares de bases (bp).

En otra realización adicional de la presente invención, donde dicha quimera es un ADN de doble hebra de 1,99 kb.

En otra realización adicional de la presente invención, donde dicha quimera contiene codón preferido por las plantas distribuido uniformemente para facilitar la eficaz traducción.

En otra realización adicional de la presente invención, donde dicha quimera contiene codón de ATGGCT de iniciación de la traducción preferido por las plantas en el extremo 5'.

En otra realización adicional de la presente invención, donde dicha quimera contiene codón de TAATGA de terminación de la traducción preferido por las plantas.

En otra realización adicional de la presente invención, donde dicha quimera contiene 33 sitios de restricción distribuidos uniformemente a todo lo largo del gen a una distancia de aproximadamente 40-80 bp.

En otra realización adicional de la presente invención, donde los sitios de restricción son enzimas seleccionadas de entre los miembros de un grupo que consta de Hind III, EcoRI y BamHI.

En otra realización adicional de la presente invención, donde dicha quimera está dividida en 58 oligonucleótidos solapados de una longitud de 40 a 65 bp cada uno situados a una distancia de 6 a 26 pares de bases (bp).

En otra realización adicional de la presente invención, donde dicha quimera contiene dichos nucleótidos solapados con un solapamiento de 13 a 18 nucleótidos con los oligonucleótidos inmediatamente adyacentes en la hebra complementaria.

En otra realización adicional de la presente invención, donde dicha quimera tiene un valor T_{m} que está situado entre 44 y 55ºC.

En una realización adicional de la presente invención, un método para sobreexpresar la proteína quimérica insecticida Cry1E en microbios.

En otra realización de la presente invención, clonar el gen Cry1E de ID SEC Nº 2 que codifica dicha proteína quimérica en un vector.

En otra realización adicional de la presente invención, transformar un microbio con dicho vector clonado.

En otra realización adicional de la presente invención, sobreexpresar dicha proteína quimérica en dicho microbio.

En otra realización adicional de la presente invención, donde dicha quimera es expresada en un microbio seleccionado de entre los miembros de un grupo que consta de bacterias, algas y hongos.

En otra realización adicional de la presente invención, donde las enzimas de restricción para dicha clonación son seleccionadas de entre los miembros de un grupo que consta de Hind III, EcoRI, Ncol, Mfe I y BamHI.

En otra realización adicional de la presente invención, donde se induce la sobreexpresión de dicha proteína usando isopropiltiogalactósido (IPTG).

En otra realización adicional de la presente invención, donde se sobreexpresa dicha proteína a 15ºC para evitar el plegado incorrecto de dichas proteínas.

En otra realización adicional de la presente invención, donde dichos vectores son seleccionados de entre los miembros de un grupo que consta de plásmidos, ADN viral y cósmidos.

En otra realización adicional de la presente invención, donde la expresión de la quimera en el microbio es confirmada mediante RT-PCR (RT-PCR = transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa), análisis western y ELISA (ELISA = inmunoanálisis ligado a enzimas).

En otra realización adicional de la presente invención, donde la presencia de quimera en el microbio es confirmada mediante PCR (PCR = reacción en cadena de la polimerasa) y análisis southern.

En otra realización adicional de la presente invención, un método para tratar plantas infectadas con insectos usando dicha proteína quimérica insecticida.

En otra realización de la presente invención, incorporar gen que codifica proteína quimera Cry1E a una planta infectada con insectos.

En otra realización adicional de la presente invención, exponer la planta transgénica a insectos.

En otra realización adicional de la presente invención, determinar la actividad insecticida de dichas plantas transgénicas.

En otra realización adicional de la presente invención, donde las plagas insectiles son seleccionadas de entre los miembros de un grupo que consta de spodoptera sp. y Helicoverpa sp.

En otra realización adicional de la presente invención, donde las plantas son seleccionadas de entre los miembros de un grupo que consta de tabaco, algodón, garbanzo, quinchoncho, cacahuete, coliflor, col, guindilla y pimien-
to.

En otra realización adicional de la presente invención, donde las enzimas de restricción para dicha clonación son seleccionadas de entre los miembros de un grupo que consta de Hind III, EcoRI, Ncol y BamHI.

En otra realización adicional de la presente invención, donde la proteína quimérica presenta un alto grado de expresión en plantas, ascendiendo a aproximadamente un 0,5% de la proteína soluble total de las plantas.

En otra realización adicional de la presente invención, donde dicha proteína quimérica es estable en dicha planta transgénica.

En otra realización adicional de la presente invención, donde los insectos expuestos a dicha proteína quimérica presentan pérdida de peso antes de la muerte.

En otra realización adicional de la presente invención, donde dicha proteína quimérica presenta propiedad insecticida contra los insectos en todas las fases de desarrollo.

En otra realización adicional de la presente invención, donde dicha proteína quimérica es un insecticida varias veces más potente en comparación con las proteínas progenitoras.

En otra realización adicional de la presente invención, donde la actividad insecticida de dicha proteína quimérica arroja una mortalidad de las plagas insectiles que está situada entre un 80 y un 100% a las aproximadamente 4 horas de exposición.

En otra realización adicional de la presente invención, donde los insectos expuestos a dicha proteína quimérica por espacio de aproximadamente 1 hora presentan un desarrollo retardado, infertilidad y metamorfosis desbaratada.

En otra realización adicional de la presente invención, donde la EC_{50} para Helicoverpa sp. está situada entre 250 y 350 ng/ml de dieta artificial de insectos.

En otra realización adicional de la presente invención, donde la EC_{50} para Spodoptera sp. está situada entre 25 y 50 ng/ml de dieta artificial.

En otra realización adicional de la presente invención, dicho método no presenta efecto adverso alguno en el crecimiento normal de las plantas transformadas.

En una realización adicional de la presente invención, una nueva endotoxina \delta quimérica de Bacillus thuringiensis es desarrollada estratégicamente sustituyendo un dominio polipeptídico de una endotoxina \delta, que es aquí la susodicha Cry1Ea, por el correspondiente dominio de otras endotoxinas \delta y un nuevo polipéptido en el extremo C-terminal. Se diseña teóricamente y se sintetiza químicamente un gen para codificar la nueva toxina quimérica y expresarla a alto nivel en el tejido vegetal. El gen fue expresado en un microbio (E. coli) y dos plantas dicotiledoneas (tabaco y algodón). Fue establecida en ambos sistemas la eficacia de la endotoxina \delta estratégicamente diseñada. Se vio mejorada la toxicidad de la proteína quimérica para las larvas de insectos lepidópteros (Spodoptera y Helicoverpa) en comparación con las proteínas progenitoras. El gen sintético quimérico es comercialmente valioso por cuanto que puede ser usado para desarrollar plantas de cultivo agronómicamente mejoradas para presentar resistencia a las plagas
insectiles.

En otra realización de la presente invención, en consecuencia, la presente invención aporta "una nueva endotoxina \delta mejorada para presentar actividad insecticida y un gen para su expresión a alto nivel en plantas", lo cual comprende el diseño estratégico de una nueva endotoxina \delta quimérica, que es aquí la susodicha Cry1E quimérica (616 residuos de aminoácidos), a base de sustituir un dominio polipeptídico (de la posición 530 a la 587) de proteína Cry1Ea por el de Cry1Ca (de la posición 533 a la 602), la incorporación de un nuevo polipéptido de 25 residuos de aminoácidos en el extremo C-terminal, el diseño teórico de un gen para codificar la endotoxina \delta quimérica de una longitud de 641 residuos de aminoácidos a alto nivel en plantas, el diseño y la síntesis química de los oligonucleótidos que representan al gen diseñado teóricamente, el ensamblaje de los oligonucleótidos para formar ADN de doble hebra, la clonación y el análisis de secuencia del ADN sintético clonado, la construcción de vectores para la expresión del gen quimérico en E. coli y plantas, la expresión del gen quimérico sintético en E. coli, la comparación de la toxicidad de la proteína quimérica con la de las proteínas progenitoras contra Spodoptera litura y Helicoverpa armigera, la transformación de tabaco con el gen quimérico, la expresión a alto nivel de la proteína manipulada en las plantas transgénicas, la purificación de la proteína endotoxina \delta quimérica a partir de las plantas transgénicas y la confirmación de su eficacia en las larvas de Spodoptera litura y Helicoverpa armigera, y la evaluación del potencial de la toxina quimérica expresada en las plantas transgénicas para la protección contra las plagas insectiles objetivo.

En una realización de la presente invención, una endotoxina \delta que se da de manera natural y es concretamente la Cry1Ea ha sido diseñada estratégicamente y modificada como corresponde para hacerla biológicamente activa contra las larvas de plagas insectiles como las de Spodoptera sp.

En otra realización de la presente invención, una endotoxina \delta quimérica de una longitud de 616 residuos de aminoácidos, que es aquí la susodicha Cry1E quimérica, fue diseñada teóricamente sustituyendo un dominio peptídico de Cry1Ea de la posición 530 a la 587 por el de Cry1Ca de la posición 533 a la 602. Adicionalmente fue introducido en el extremo C-terminal de la endotoxina \delta un nuevo polipéptido de 25 residuos de aminoácidos.

En otra realización adicional de la presente invención, dos dominios peptídicos de las posiciones 530 a 545 y 578 a 587 de Cry1Ea pueden ser sustituidos por los de Cry1Ca de las posiciones 533 a 555 y 558 a 602. Tal toxina quimérica puede también desarrollar una similar (o equivalente) actividad biológica.

En otra realización adicional de la presente invención, el dominio peptídico de 530 a 587 de Cry1Ea puede ser sustituido por el de otras endotoxinas \delta.

En otra realización adicional de la presente invención, un polipéptido de 25 residuos de aminoácidos es introducido en el C-terminal de la endotoxina \delta. Este polipéptido mejoró la estabilidad de la endotoxina \delta contra las proteasas de la planta. Esto podría haber mejorado la estabilidad de la endotoxina \delta en el intestino medio del insecto.

En otra realización adicional de la presente invención, un polipéptido de una longitud de 25 residuos de aminoácidos puede ser incluido en el C-terminal de otras endotoxinas \delta, pudiendo tales toxinas devenir estables contra distintas clases de proteasas.

En otra realización adicional de la presente invención, un polipéptido de una longitud de 25 residuos de aminoácidos puede ser incorporado en el C-terminal de cualquier proteína recombinante para dar a dichas proteínas estabilidad contra las proteasas.

En otra realización adicional de la presente invención, un ADN de doble hebra de 1,99 kb fue diseñado teóricamente para codificar la proteína quimérica. Fueron usados codones preferidos por las plantas para codificar los aminoácidos de la proteína toxina quimérica para facilitar la expresión a alto nivel del gen en las plantas.

Hay 6 variantes de la endotoxina \delta Cry1Aa, que son concretamente las que van desde la Cry1Aa1 hasta la Cry1Aa6, que aparecen en la base de datos EMBL. Se presenta a continuación el análisis grupal de la secuencia de aminoácidos de estas proteínas endotoxinas \delta. En tres posiciones (77, 148 y 302) son distintos los residuos de aminoácidos. Las posiciones variantes están indicadas a continuación en negritas. Sin embargo, los seis genes han sido desplegados en experimentos de toxicidad por distintos laboratorios. Es equiparable la eficacia de las seis variantes en cuanto a su toxicidad para con los insectos.

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Puede citarse la referencia de Von Tersch et al. 1991, "Insecticidal toxins from Bacillus thuringiensis subsp kanyae: Gene cloning and characterization and comparison with B. thuringiensis subsp kurstaki Cry1A(c) toxin" en Appl and Environ Microbial, 57: 2: 349-58, donde dos variantes de cry1Ac fueron aisladas a partir de dos cepas distintas. Su composición de aminoácidos era distinta en 7 posiciones. Ambas endotoxinas \delta fueron expresadas en E. coli, y fue llevado a cabo un experimento de toxicidad. Las dos toxinas no presentaban diferencia alguna en cuanto a la eficacia para con las plagas objetivo.

Además, esto indica claramente que en las proteínas, y más en particular en el campo de las endotoxinas, no se constata que la alta homología de la secuencia represente diferencia significativa alguna en cuanto a la actividad. El susodicho ejemplo de las endotoxinas Cry1Aa1 a Cry1Aa6 refleja claramente la esencia de este trabajo. En la presente Solicitud, la solicitante ha observado una extraordinariamente alta actividad insecticida. Además, se comprueba también que la homología de un 70% y más en la secuencia de la proteína quimérica Cry1E de la presente Solicitud no presenta variación significativa alguna en cuanto a la actividad. Esto significa que las proteínas con una homología de secuencia de un 70% y más para la proteína quimérica Cry1E se usan como agentes insecticidas.

En otro estudio (Schnepf et al., "Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins", 62: 3, 775-806), los residuos de aminoácidos GYY de la endotoxina \delta Cry1Ac en la posición 312 a 314 fueron alterados para sustituirlos con ASY, GSY y GFS. No se observó diferencia de toxicidad alguna de las tres proteínas.

Adicionalmente, hay dos variantes naturales de la endotoxina \delta Cry1C, que son concretamente la Cry1Ca y la Cry1Cb. Estas proteínas presentan una identidad de las secuencias de aminoácidos de un 81% (Schnepf et al., 1998, Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins'', 62: 3, 775-806). A pesar de esta diferencia, ambas toxinas son tóxicas para su plaga objetivo, si bien hay cierta diferencia en cuanto al nivel de toxicidad. Su gama de huéspedes es también la misma. (Kalman et al., 1993, "Cloning of a novel cry1C type gene from a strain of Bacillus thuringiensis subsp galleriae" Appl. Environ Microbiol 59: 4: 1131-37).

Breve descripción de los dibujos acompañantes

La Figura 1 representa el ensamblaje basado en la PCR de 58 oligonucleótidos solapados formando el nuevo ADN cry1E quimérico de 1,99 kb. Los carriles 2-4 representan el ensamblaje del gen en distintas condiciones de PCR, estando el deseado fragmento de ADN indicado con una flecha; mostrando el Carril 1 el marcador del peso molecular del \lambdaADN/HindIII-EcoRI.

La Figura 2 representa el análisis de restricción del plásmido pPK59 que tiene el promotor E-35-S en el lado de cabeza con respecto al nuevo gen quimérico. El plásmido fue sometido a digestión con la enzima de restricción SaII (a 40 bp en el lado de cola con respecto al gen). El plásmido lineal fue adicionalmente sometido a digestión con NcoI (carril 2), NheI (carril 3), BstXI (carril 4), NruI (carril 5) y SacI (carril 6). Los carriles 1 y 7 representan respectivamente los marcadores del peso molecular de \lambdaADN/HindIII-EcoRI y de \lambdaADN/HindIII.

La Figura 3 representa los mapas de los plásmidos pPK202, pPK141, pPK135 y pPk206.

La Figura 4 representa el bioensayo con insectos y con tabacos transgénicos. Las larvas de 1^{er} instar de Spodoptera litura presentaron una mortalidad del 100% tras 2 días de alimentarse en la hoja transgénica que expresaba el nuevo gen cry1E quimérico (izquierda). La hoja de control fue vorazmente devorada por las larvas (derecha).

La Figura 5 representa larvas de 3^{er} instar de Spodoptera litura que presentaron una mortalidad del 100% tras haber estado alimentándose durante 2 días (izquierda). La hoja de la planta transgénica presentaba un alto nivel de protección contra las larvas en contraste con la hoja de la planta de control (derecha).

La Figura 6 representa la mortalidad del 100% de las larvas de 5º instar de Spodoptera tras haber estado las mismas alimentándose por espacio de 48 h en la hoja de tabaco transgénico (izquierda). Durante el mismo periodo de tiempo, las larvas que se alimentaban con hojas de la planta de control ingirieron 6 hojas (derecha).

En otra realización adicional de la presente invención, fueron diseñados 58 oligonucleótidos para representar el ADN de cry1E quimérico de 1,99 kb. Todos los oligonucleótidos fueron sintetizados químicamente y fusionados enzimáticamente para así obtener el deseado ADN de doble hebra. (Hágase referencia a la figura 1).

En otra realización adicional de la presente invención se hicieron dos constructos independientes, cada uno para expresión en la planta y en E. coli. Los genes progenitores (cry1Ea y cry1Ca) fueron también introducidos en otros vectores de expresión para su expresión en E. coli.

En otra realización adicional de la presente invención, los tres genes fueron todos ellos expresados en E. coli. La eficacia de la Cry1E quimérica contra Spodoptera litura fue comparada con la de las toxinas progenitoras (Cry1Ea y Cry1Ca). Los experimentos de toxicidad establecieron que la toxina manipulada es varias veces más tóxica en comparación con las proteínas progenitoras.

En otra realización adicional de la presente invención, se demostró que la proteína quimérica expresada en las plantas era también tóxica para Helicoverpa armigera, que es otra grave plaga insectil. Esto estableció el mejoramiento en cuanto a la gama de huéspedes de la nueva toxina quimérica diseñada en este estudio.

En otra realización adicional de la presente invención, el gen sintético fue introducido en tabaco para la expresión de la toxina quimérica. Las plantas transgénicas expresaron la toxina quimérica y acumularon hasta un 0,5% de la proteína soluble total. Las plantas transgénicas presentaron una excelente protección contra las larvas de Spodoptera litura y ocasionaron una mortalidad del 100% en todas las fases de desarrollo.

En otra realización adicional de la presente invención, la nueva toxina quimérica fue purificada a partir de la proteína soluble total de la hoja del tabaco transgénico y fue mezclada en dieta semisintética. Los experimentos de toxicidad de nuevo establecieron la eficacia de la toxina híbrida.

La presente invención es relativa al descubrimiento de endotoxinas \delta quiméricas altamente activas. Una nueva endotoxina \delta de una longitud de 641 residuos de aminoácidos, que es aquí la susodicha Cry1E quimérica, fue diseñada estratégicamente a base de sustituir un dominio polipeptídico (de la posición 530 a la 587) de la proteína Cry1Ea por el de la Cry1Ca (de la posición 533 a la 602). De esta manera, la toxina quimérica comprende los residuos de aminoácidos 1-529 de Cry1Ea, 530 a 599 de Cry1Ca y 600 a 616 de Cry1Ea. Un nuevo polipéptido de 25 residuos de aminoácidos fue incluido como el extremo C-terminal de la endotoxina \delta. En otras palabras, este polipéptido constituía el residuo de aminoácidos 617-641 de la toxina quimérica. Pueden crearse varias toxinas quiméricas sustituyendo distintas partes de la toxina Cry1Ea por partes o secuencias de aminoácidos diseñadas estratégicamente de las otras toxinas. Una secuencia de nucleótidos de 1,99 kb fue diseñada teóricamente para codificar para la endotoxina \delta quimérica anteriormente mencionada. El gen que codifica proteína toxina, que es aquí el susodicho cry1E quimérico, fue diseñado para una expresión a alto nivel en las plantas, introduciendo codones preferidos por las plantas. Los codones preferidos por las plantas para cada aminoácido fueron distribuidos uniformemente para facilitar la eficaz traducción. Un contexto de iniciación de la traducción apropiado para la expresión génica en las plantas (TAAACCATGGCT) fue incluido en el extremo 5' y dos codones (señales) de parada de la traducción fueron introducidos en el extremo del marco de lectura de la toxina quimérica. Un total de 33 sitios de restricción únicos fueron introducidos uniformemente a todo lo largo del gen a una distancia de 40-80 bp. Fueron creados sitios de restricción BamHI y HindIII en el lado de cabeza y BamHI y EcoRI en el lado de cola del gen para facilitar su clonación (véase la Figura 2).

El contexto de iniciación de la traducción creó automáticamente un sitio NcoI en el inmediato inicio del gen. El gen fue dividido en 58 oligonucleótidos solapados (de una longitud de 40 a 65 nucleótidos) con separaciones de una longitud de 6 a 26 bases entremedio (véase la figura 1). Cada oligonucleótido tenía un solapamiento de una longitud de 13-18 nucleótidos con los oligonucleótidos inmediatamente adyacentes en la hebra complementaria. Los solapamientos complementarios fueron diseñados para mantener el valor T_{m} entre 48 y 50ºC. Los oligonucleótidos fueron sintetizados en un sintetizador de ADN (Gene Assembler Special, Pharmacia, Suecia) a escala de 200 nmoles y purificados por electroforesis en gel de urea-poliacrilamida desnaturalizante. Los 58 oligonucleótidos fueron ensamblados para así formar con los mismos ADN de doble hebra de 1,99 kb, que es aquí dicho gen cry1E quimérico, siguiendo el método de síntesis de genes sin ligación de Singh et al. (1996) y como se muestra en la figura 1. El ADN fue sometido a digestión con enzimas de restricción HindIII y EcoRI y clonado en pBluescriptII SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA). El plásmido fue denominado pPK200. La secuencia de nucleótidos del ADN sintético fue confirmada secuenciando el ADN sintético clonado en un sistema de secuenciación de ADN automatizada (Applied Biosystems modelo 373A).

Fue construido un casete también para la expresión de la toxina quimérica en E. coli bajo el control del promotor T7lac. El plásmido pPK200 fue sometido a digestión con las enzimas de restricción NcoI y BamHI y clonado en el vector de expresión pET-19b (Novagen, Madison WI). El plásmido fue denominado pPK206. ADNs que codificaban las toxinas Cry1Ca y Cry1Ea fueron amplificados mediante reacción en cadena de la polimerasa, usando cebadores adecuados, con lo cual se crearon sitios de restricción NcoI y BamHI en el lado de cabeza y en el lado de cola del amplicón. Los productos amplificados fueron clonados en el vector pET-19b. Los constructos que tenían ADN que codificaba las toxinas Cry1Ca y Cry1Ea fueron denominados pPK135 y pPK141, respectivamente. Cepa de E. coli BL21DE3 fue transformada con los constructos pPK206, pPK135 y pPK141. (Véase la figura 3). Las proteínas toxina fueron expresadas mediante inducción con apropiadas concentraciones de IPTG. La expresión fue realizada a 15ºC para evitar el posible plegado incorrecto. Células de E. coli fueron lisadas con lisozima y sonicadas para liberar las endotoxinas \delta. Las proteínas toxina fueron halladas en cuerpos de inclusión. Éstos fueron solubilizados en tampón de bicarbonato 50 mM (pH 9,5) a 28ºC. Las proteínas toxina fueron cuantificadas densitométricamente. Diluciones seriales de las toxinas fueron mezcladas en dieta semisintética y la mezcla fue vertida en las cápsulas de Petri. Sirvió de dieta de control proteína de E. coli total. Quince larvas neonatales de Spodoptera litura fueron liberadas sobre las tortas de la mezcla dietaria en un vaso de 100 ml y la boca fue cubierta con paño de muselina para permitir el intercambio gaseoso. Cada experimento fue llevado a cabo con 6 réplicas. Se cambiaba la dieta cada dos días. El bioensayo fue llevado a cabo con un fotoperiodo de 16/8 h a 25 \pm 0,2ºC. Los datos de toxicidad fueron registrados a los 7 días de haber sido iniciada la alimentación. La EC_{50} fue determinada mediante análisis log-probit estándar. Fueron analizadas simultáneamente las tres proteínas. Los resultados representativos son como aquí se indica en la Tabla 1 a continuación.

TABLA 1

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El resultado demostró que la cepa de E. coli que expresaba la toxina quimérica era varias veces más tóxica en comparación con la proteína Cry1Ea y más de cuatro veces más tóxica en comparación con la proteína Cry1Ca. La proteína toxina Cry1Ea no logró ocasionar efecto alguno en las larvas de Spodoptera. El resultado estableció la exitosa manipulación de la toxina Cry1Ea para desarrollar una nueva proteína quimérica Cry1E que es biológicamente activa y una toxina mejorada. La proteína manipulada era cuatro veces más tóxica que la proteína Cry1Ca, que es la endotoxina \delta mejor conocida contra Spodoptera sp.

Las tres endotoxinas \delta fueron también sometidas a ensayo contra larvas de Helicoverpa sp. de 72 h de edad. Cada larva fue depositada sobre la dieta dispuesta en una caja aparte. 40 larvas fueron expuestas a cada concentración de la toxina. Los resultados de toxicidad demuestran que la toxina quimérica es también tóxica para Helicoverpa. Se indica aquí a continuación en la Tabla 2 un resultado representativo.

TABLA 2

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En el sentido en el que se utiliza en la presente, el vocablo "toxina" significa el segmento N-terminal que es responsable de la actividad pesticida para los insectos. Un experto en esta materia puede convertir esta toxina en una protoxina incluyendo una parte de un fragmento C-terminal o todo un fragmento C-terminal de una endotoxina \delta homóloga o heteróloga. Tal protoxina será una molécula muy estable dentro de las células microbianas, como por ejemplo en E. coli, Pseudomonas, etc., y puede ser usada para desarrollar formulaciones microbianas. Tales formulaciones pueden ser usadas como pesticidas. El desarrollo de tales protoxinas y de formulaciones usando la nueva toxina desarrollada por nosotros queda también dentro del alcance de la invención reivindicada por nosotros.

El gen y la toxina que son útiles según la presente invención incluyen no tan sólo la toxina de una longitud de 641 aminoácidos, sino también fragmentos de la nueva secuencia, variantes y mutantes que conservan la actividad pesticida característica de la toxina que aquí se ejemplifica específicamente. En el sentido en el que se les utiliza en la presente, los vocablos "variantes" o "variaciones" de genes se refieren a secuencias de nucleótidos que codifican las mismas toxinas o que codifican toxinas que tienen una actividad pesticida más baja o equivalente. En el sentido en el que se la utiliza en la presente, la expresión "actividad pesticida equivalente" se refiere a toxinas que tienen una actividad
biológica similar o prácticamente igual contra las plagas objetivo en comparación con las toxinas que se reivindican.

Un experto en la materia está perfectamente en condiciones de crear secuencias de ADN alternativas que codifiquen la misma o prácticamente la misma toxina. Estas secuencias de ADN variantes quedan dentro del alcance de la presente invención. En el sentido en el que se la utiliza en la presente, la expresión "prácticamente la misma" secuencia hace referencia a secuencias que tienen sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de aminoácidos que prácticamente no afectan a la actividad pesticida. Los fragmentos que conservan la actividad pesticida quedan también incluidos en esta definición.

Se ha ejemplificado aquí específicamente una nueva toxina quimérica de la presente invención. Se comprenderá fácilmente que la presente invención comprende las toxinas variantes o equivalentes (y las secuencias de nucleótidos que codifican toxinas equivalentes) que tienen la misma actividad pesticida como la toxina ejemplificada o una actividad pesticida similar. Las toxinas equivalentes tendrán homología de aminoácidos con la toxina ejemplificada. Esta homología de aminoácidos será típicamente de más de un 75%, preferiblemente será de más de un 90% y con la máxima preferencia será de más un 95%. La homología de aminoácidos será máxima en las regiones críticas de la toxina que son responsables de la actividad biológica o intervienen en la determinación de la configuración tridimensional, que en última instancia es responsable de la actividad biológica. A este respecto, son aceptables y pueden ser de esperar ciertas sustituciones de aminoácidos y si estas sustituciones están en regiones que no son críticas para la actividad biológica o si dichas sustituciones son sustituciones de aminoácidos conservadoras que no afectan a la configuración tridimensional de la molécula. Por ejemplo, los aminoácidos pueden clasificarse en las clases siguientes: apolares, polares sin carga, básicos y ácidos. Las sustituciones conservadoras con las cuales un aminoácido de una clase es sustituido por otro aminoácido de la misma clase quedan dentro del alcance de la presente invención siempre que la sustitución no altere de manera importante la actividad biológica de la endotoxina \delta. Se da en la siguiente Tabla 3 un listado de ejemplos de aminoácidos pertenecientes a cada clase.

TABLA 3

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En algunos casos pueden también hacerse sustituciones no conservadoras. El factor decisivo es el de que estas sustituciones no deben redundar en un importante detrimento de la actividad biológica de la toxina. Un experto en la técnica de la manipulación de proteínas está perfectamente en condiciones de sustituir por alanina cualquier aminoácido de la toxina quimérica. La sustitución de cualquier aminoácido es la más segura, por cuanto que la alanina es un típico aminoácido. Tal sustitución queda también por entero dentro del alcance de la invención.

Puede ser introducido en los de una amplia variedad de huéspedes microbianos o vegetales un gen que codifique la toxina quimérica de la presente invención. La expresión del gen de la toxina redunda directa o indirectamente en la producción y el mantenimiento intracelular de la toxina quimérica pesticida. Con adecuados huéspedes microbianos, como p. ej. Pseudomonas, los microbios pueden ser aplicados a los sitios en los que proliferen las plagas. Esto redundará en el control de la plaga. Como alternativa, el microbio que alberga al gen de la toxina puede ser tratado bajo condiciones que prolonguen la actividad de la toxina y estabilicen la célula. La célula tratada, que conserva la actividad tóxica, puede ser entonces aplicada al ambiente de la plaga objetivo. En los casos en los que el gen que codifica la toxina quimérica es introducido a través de un vector adecuado en un huésped microbiano y dicho huésped es aplicado al ambiente en estado viviente, es esencial que se usen ciertos microbios huéspedes. Se seleccionan como huéspedes microorganismos de los que se sabe que ocupan la "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera y/o rizoplano) de uno o varios cultivos de interés. Estos microorganismos son seleccionados de forma tal que sean capaces de competir exitosamente en el ambiente en cuestión (el cultivo y otros habitats insectiles) con los microorganismos de tipo salvaje, proporcionar un estable mantenimiento y expresión del gen que expresa el pesticida polipeptídico, y, según lo deseable, proporcionar una mejorada protección del pesticida contra la degradación e inactivación ambiental.

Se sabe de los de un gran número de microorganismos que habitan el filoplano (la superficie de las hojas de las plantas) y/o la rizosfera (el suelo que rodea a las raíces de las plantas) de los de una amplia de variedad de importantes cultivos. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. Son particularmente de interés microorganismos tales como bacterias, como p. ej. las de los géneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc y Alcaligenes; hongos y particularmente levadura, como p. ej. los de los géneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula y Aureobasidium. Son particularmente de interés especies bacterianas de la fitosfera tales como las Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroids, Xanthomonas campestris, Rhozobium melioti, Alcaligenes entrophus y Azotobacter vinlandii y especies de levadura de la fitosfera tales como las Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae y Aureobasidium pollulans. Son particularmente de interés los microorganismos pigmentados. Hay una amplia variedad de maneras de introducir un gen que codifique una toxina quimérica en un huésped microorganismo bajo condiciones que permitan el estable mantenimiento y expresión del gen. Estos métodos son perfectamente conocidos para los expertos en la materia y están descritos, por ejemplo, en la Patente U.S. Nº 5.135.867, que queda incorporada a la presente por referencia.

Fue construido un vector de transformación de plantas para el desarrollo de plantas transgénicas. Un plásmido pPK58 (que tenía el promotor camv35s con potenciador duplicado) fue sometido a digestión con BamHI y HindIII y el pPK200 con HindIII y EcoRI para escindir el promotor CaMV35S con el potenciador duplicado y el gen cry1E quimérico, respectivamente. Fue efectuada una ligación triple para la clonación de los dos fragmentos en vector de clonación pLITMUS38 (New England Biolabs). El plásmido, que era concretamente el pPK59, tenía el promotor CaMV35S con el potenciador duplicado en el lado de cabeza con respecto al gen quimérico. Se muestra en la figura 2 el análisis de restricción de pPK59. El terminador de transcripción nos fue clonado en el lado de cola con respecto al gen quimérico. El ADN del elemento de poliadenilación nos fue amplificado usando pBI101.1 como plantilla con cebadores adecuados, lo cual creó sitios de restricción MfeI y EcoRI en el lado de cabeza y en el lado de cola, respectivamente. El plásmido pPK59 fue sometido a digestión con EcoRI y el producto de PCR fue clonado a continuación de la digestión con las enzimas de restricción MfeI y EcoRI. El clon en el cual el sitio de restricción EcoRI del gen sintético estaba ligado al sitio MfeI del terminador nos (por tener los mismos extremos compatibles) fue seleccionado y denominado pPK201. La correcta orientación del terminador nos fue confirmada mediante análisis de restricción y también mediante secuenciación. El casete de expresión (el gen cry sintético con promotor E-35S y terminado nos) fue clonado en vector binario Ti. El fragmento BamHI-EcoRI del plásmido pPL201 fue clonado en pBI101.1 en sustitución del fragmento BamHI-EcoRI (gen uidA y terminador nos) del plásmido. El vector binario fue denominado pPK202. Se muestran en la figura 3 los mapas de los vectores de expresión en E. coli y en plantas.

A fin de estudiar la eficacia de la toxina Cry1E quimérica en plantas, fue seleccionado para la expresión el tabaco. Agrobacterium tumefaciens de la cepa LBA 4404 que contenía el plásmido colaborador pAL4404 fue transformada con el vector binario pPK202 siguiendo el protocolo modificado de "electroporación de Agrobacterium" descrito por Cangelosi et al. (1991) y la colonia transformada fue sometida a selección sobre los antibióticos estreptomicina, rifampicina y canamicina. Fue efectuada transformación mediada por Agrobacterium de Nicotiana tobacum cv. Patit Havana siguiendo el método de Horsch et al., 1985, y las plantas transgénicas fueron sometidas a selección sobre el antibiótico canamicina. La presencia del gen que codifica la toxina quimérica fue confirmada mediante PCR y análisis Southern y la expresión del transgen fue establecida mediante RT-PCR, análisis Western y ELISA. El resultado del ELISA puso de manifiesto una expresión del 0,5% de la proteína toxina de entre la proteína foliar soluble total en una línea transgénica seleccionada. Este alto nivel de la expresión era el resultado del diseño del gen en el cual fueron usados exclusivamente codones preferidos por las plantas. El contexto de iniciación de la traducción preferido por las plantas que se usó en este estudio habría también desempeñado un importante papel de cara a alcanzar la expresión acrecentada.

Fue llevado a cabo bioensayo con insectos con plantas transgénicas de dos meses de edad y larvas de 1^{er} y 5º instar de Spodoptera litura. (Hágase referencia a las figuras 4-6). Discos foliares de 15 cm^{2} de plantas transgénicas y de control fueron puestos en cajas cilíndricas que contenían papel secante húmedo en el fondo, y fueron depositadas sobre los mismos larvas de 1^{er} instar. Las bocas de las cajas fueron cubiertas con paño de muselina húmedo para mantener una suficiente humedad y un suficiente intercambio de aire. Los experimentos de toxicidad fueron llevados a cabo en tres réplicas a 25 \pm 0,2ºC, y se mantuvo un fotoperiodo de 16/8 h. En el bioensayo con larvas de 5º instar se usaron hojas completas de plantas transgénicas y de control. El peciolo de la hoja fue mantenido en tapón de algodón en un matraz de 250 ml que contenía solución salina 1/2 MS (1/2 MS = diluida a la mitad) para así superar el marchitamiento de la hoja. Se dejó que se alimentasen en cada hoja cinco larvas de insecto. Las hojas de la planta de control se cambiaban cada 8 h, y las mismas fueron completamente consumidas por las larvas de insecto.

El resultado (figuras 4 y 6) estableció que las larvas de 1^{er} instar así como las de 5º instar murieron a las 48-72 h. La cantidad de hoja comida por las larvas de 1^{er} instar era despreciable en comparación con los discos foliares de la planta de control, que fueron devorados vorazmente. La ingestión de aproximadamente 1 cm^{2} de hoja transgénica era suficiente para matar las larvas de 5º instar. Estas larvas se veían moribundas a las 8-16 h de alimentarse con la hoja transgénica, y finalmente murieron a los 2-3 días. Se observaban sobre la superficie de la hoja excrementos de color verde con un alto contenido de agua. Algunas de las larvas presentaban una gran pérdida de peso antes de la muerte. En un experimento aparte se dejó que larvas de distintos instar se alimentasen con hojas de planta transgénica por espacio de 1 h, 2 h, 4 h, 8 h y 16 h, y dichas larvas fueron luego transferidas a hojas de planta de control. Se observó que 8 h de alimentación en las plantas transgénicas eran suficientes para ocasionar una mortalidad del 100% de las larvas en todas las fases de desarrollo, incluso después de haberse alimentado en plantas no transgénicas. La ingestión de muy pequeñas cantidades de la toxina por parte de larvas jóvenes retrasó su pupación en 10-15 días con respecto al ciclo larval normal de 15 días. Las pocas larvas que escaparon a la mortalidad se desarrollaron convirtiéndose en moscas. Dieron huevos los del 40% de los apareamientos con cópula en los que se usaron tales moscas. Sin embargo, los huevos eran estériles y no llegaron a eclosionar. La proteína soluble total del tabaco transgénico fue extraída y cargada en una columna de intercambio iónico Sepharose Q. La proteína fue eluida con un gradiente creciente de cloruro sódico y el pico que contenía endotoxina \delta fue reunido y desalado en columna G10. La proteína eluida fue mezclada en dieta semisintética. Fue también llevada a cabo una similar extracción y purificación de proteína a partir de las hojas de los tabacos no transgénicos, y tal proteína vegetal sirvió de control. El experimento de toxicidad fue llevado a cabo como se ha expuesto anteriormente. La EC_{50} para Spodoptera litura y Helicoverpa armigera fue de 37 ng/ml y 285 ng/ml de dieta artificial. El resultado confirmó de nuevo la eficacia de la endotoxina \delta quimérica para con las plagas insectiles objetivo.

Una nueva endotoxina \delta para el control de plagas insectiles y un gen para su expresión a alto nivel en plantas, comprendiendo el diseño teórico de una nueva endotoxina \delta a la que aquí se denomina la Cry1E quimérica, que es diseñada estratégicamente a base de sustituir un dominio polipeptídico (de la posición 530 a la 587) de la proteína Cry1Ea por el de la Cry1Ca (de la posición 533 a la 602), con un nuevo polipéptido de una longitud de 25 residuos de aminoácidos en el extremo C-terminal de la proteína para la estabilidad, el diseño teórico del gen para expresar la endotoxina \delta quimérica a alto nivel en plantas, el diseño y la síntesis química de los oligonucleótidos que representan al gen diseñado teóricamente, el ensamblaje de los oligonucleótidos para así formar ADN de doble hebra, la clonación y el análisis secuencial del ADN sintético clonado, la construcción de vectores para la expresión del gen quimérico en E. coli y en plantas, la expresión del gen sintético en E. coli, la comparación de la toxicidad de la proteína quimérica con la de las proteínas progenitoras contra Spodoptera litura, la transformación de la planta, como por ejemplo del tabaco, con el gen quimérico, la expresión a alto nivel de la proteína manipulada en las plantas transgénicas y la evaluación del potencial de la toxina quimérica en las plantas transgénicas para la protección contra Spodoptera litura.

En otra realización adicional de la presente invención, donde hay los aminoácidos Nº 1 a 529 de Cry1Ea, 530 a 599 de Cry1Ca, 600 a 616 de Cry1Ea y 617 a 641 de un nuevo polipéptido y sus variantes o fragmentos de ello estructural y/o funcionalmente equivalentes.

En otra realización adicional de la presente invención, donde dicha toxina tiene una secuencia de aminoácidos que se indica en la ID SEC Nº 1 y presenta una toxicidad varias veces más alta para los insectos lepidópteros objetivo en comparación con las toxinas progenitoras Cry1Ea y Cry1Ca.

En otra realización adicional de la presente invención, donde el gen cry1E quimérico que codifica una toxina quimérica que tiene actividad contra los insectos lepidópteros tiene la secuencia de nucleótidos que se indica en la ID SEC Nº 2 o su fragmento de la misma.

En otra realización adicional de la presente invención, donde se trata de un proceso para controlar las plagas de lepidópteros empleando la proteína, usándose una cantidad eficaz de la toxina tal cual o como componente de una formulación química o microbiana.

En otra realización adicional de la presente invención, donde se usa un vector de transferencia de ADN recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una toxina que tiene actividad contra los insectos lepidópteros, teniendo dicha secuencia polinucleotídica la secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 2 o fragmentos de la misma.

En otra realización adicional de la presente invención, donde un huésped recombinante es transformado con el gen.

En otra realización adicional de la presente invención, donde dicho huésped es un microbio como por ejemplo Escherichia coli, Pseudomonas, Levadura, Cianobacterias y/o otros microbios.

En otra realización adicional de la presente invención, donde dicho huésped transformado es una planta como por ejemplo tabaco, algodón garbanzo, quinchoncho, cacahuete, coliflor, col, guindilla, pimiento y/u otras plantas que expresan la toxina, donde dicha toxina tiene la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 1, o sus variantes con una equivalente actividad contra los insectos lepidópteros.

En una realización adicional de la presente invención, la presente Solicitud indica claramente que en las proteínas, y más en particular en el campo de las endotoxinas, no se constata que la alta homología de la secuencia implique diferencia importante alguna en cuanto a la actividad. Los susodichos trabajos sobre las endotoxinas Cry1Aa1 a Cry1Aa6 reflejan claramente la esencia de este trabajo. En la presente Solicitud, la solicitante ha observado una extraordinariamente alta actividad insecticida. Además, tampoco se constata que la homología de un 70% y más en la secuencia de la proteína quimérica Cry1E de la presente Solicitud presente variación importante alguna de la actividad. Esto significa que se usan como agentes insecticidas las proteínas con una homología de secuencia de un 70% y más para la proteína quimérica Cry1E.

Los ejemplos siguientes se dan a título de ilustraciones, y por consiguiente no deberá interpretarse que los mismos limiten en modo alguno en alcance de la presente invención.

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Ejemplo 1 Toxicidad comparativa de la nueva Cry1E quimérica expresada en E. coli para larvas de plagas insectiles de lepidópteros

Una endotoxina \delta quimérica de una longitud de 616 residuos de aminoácidos, que es aquí la susodicha Cry1E quimérica, fue diseñada estratégicamente a base de sustituir un dominio polipeptídico (de la posición 530 a la 587) de la proteína Cry1Ea por el de la Cry1Ca (de la posición 533 a la 602). Fue adicionalmente incluido en el extremo C-terminal como se ha descrito anteriormente un polipéptido de 25 residuos de aminoácidos. Una secuencia nucleotídica de 1,99 kb fue diseñada teóricamente para codificar para la endotoxina \delta quimérica anteriormente mencionada. Los codones para cada aminoácido fueron distribuidos uniformemente para evitar la deficiencia temporal del tARN durante la traducción. Fueron creados en el gen diseñado varios sitios de enzimas de restricción de corte de 6 bases. Fueron creados sitios de restricción BamHI, HindIII y NcoI en el extremo 5' y EcoRI en el extremo 3' del gen diseñado. El gen fue dividido en 58 oligonucleótidos solapados (de 40 a 65 nucleótidos de longitud). Cada oligonucleótido tenía un solapamiento de 13-18 nucleótidos de longitud con los nucleótidos inmediatamente adyacentes en la hebra complementaria (T_{m} de entre 48 y 50ºC). Los oligonucleótidos fueron sintetizados en un sintetizador de ADN (Gene Assembler Special, Pharmacia, Suecia) a una escala de 200 nmoles y purificados mediante electroforesis en gel de urea-poliacrilamida desnaturalizante. Los 58 oligonucleótidos fueron ensamblados para así formar el ADN de doble hebra, que es aquí el susodicho gen cry1E quimérico, siguiendo el método de síntesis de genes sin ligación de Singh et al. (1996) y como se muestra en la figura 1. El ADN fue sometido a digestión con enzima de restricción HindIII y EcoRI y clonado con pBluescriptII SK(+) (Stratagene). El plásmido fue denominado pPK200. La secuencia de nucleótidos del ADN sintético fue confirmada mediante secuenciación del ADN sintético clonado en un sistema de secuenciación de ADN automatizada (Applied Biosystems modelo 373).

Fue construido un casete para la expresión de la toxina quimérica en E. coli bajo el control del promotor T7. Para esto, el plásmido pPK200 fue sometido a digestión con las enzimas de restricción NcoI y BamHI y clonado en vector de expresión pET-19b (Novagen). El plásmido fue denominado pPK206. ADNs que codificaban la parte de toxina de Cry1Ea y Cry1Ca fueron amplificados mediante reacción en cadena de la polimerasa, usando cebadores adecuados, lo cual creó sitios de restricción NcoI y BamHI en el lado de cabeza y en el lado de cola con respecto al amplicón, respectivamente en ambos ADNs. Los productos amplificados fueron clonados en los sitios NcoI y BamHI en el mismo vector (pET-19b). El constructo que tenía el ADN de la toxina Cry1Ea fue denominado pPK141 y el constructo que tenía el ADN de la toxina Cry1Ca fue denominado pPK35, como se ha descrito anteriormente. La cepa BL21DE3 de E. coli fue transformada con los constructos pPK141, pPK135 y pPK206. Las proteínas toxina fueron expresadas mediante inducción con apropiadas concentraciones de IPTG. La expresión fue efectuada a 15ºC para evitar todo posible plegado incorrecto de las toxinas. Las proteínas toxina fueron cuantificadas densitométricamente sobre el gel de poliacrilamida desnaturalizante. Fueron mezcladas en dieta semisintética diluciones seriales de las toxinas. La proteína de E. coli total sirvió de control en la dieta. Quince larvas neonatales de Spodoptera litura fueron liberadas sobre las tortas de la mezcla dietaria en un vaso de 100 ml y la boca del vaso fue cubierta con paño de muselina para permitir el intercambio gaseoso. Cada experimento fue llevado a cabo en 6 réplicas. La dieta era cambiada cada dos días. El bioensayo fue llevado a cabo con un fotoperiodo de 16/8 h a 25 \pm 0,2ºC. Los datos de toxicidad fueron registrados después de 7 días de alimentación. La EC_{50} fue determinada mediante análisis log-probit estándar. Las tres proteínas fueron sometidas a ensayo simultáneamente. Los resultados representativos están indicados en la
Tabla 4.

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TABLA 4

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El resultado demostró que la toxina quimérica era varias veces más tóxica en comparación con la Cry1Ea y más de cuatro veces más tóxica en comparación con la proteína Cry1Ca. La proteína toxina Cry1Ea no logró ocasionar mortalidad alguna o retardo alguno del crecimiento de las larvas de Spodoptera. El resultado estableció la exitosa manipulación de la toxina Cry1Ea para convertirla en una toxina mejorada biológicamente activa. La proteína manipulada era más tóxica que la proteína Cry1Ca, que es la endotoxina \delta mejor conocida contra Spodoptera sp.

Un similar experimento de toxicidad fue llevado a cabo con las larvas de Helicoverpa armigera. En este caso, larvas de 72 h de edad fueron liberadas sobre dieta semisintética que contenía una de las tres proteínas, y fue liberada solamente una larva en cada caja. La pérdida de peso fue registrada después de 7 días de alimentación. Los resultados representativos están indicados en la siguiente Tabla 5.

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TABLA 5

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El resultado demuestra que la nueva endotoxina \delta quimérica diseñada por nosotros no solamente es más tóxica para Spodoptera, sino que es también eficaz contra Helicoverpa. El diseño ha ampliado la gama de huéspedes de la toxina y ha mejorado asimismo considerablemente la toxicidad en comparación con la de las proteínas progenitoras.

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Ejemplo 2 Alta toxicidad larval de las plantas transgénicas que expresan la nueva proteína Cry1E quimérica

A fin de establecer la eficacia de la nueva toxina quimérica en las plantas, fue construido un vector de transformación de plantas para el desarrollo de plantas transgénicas. Un plásmido pPK58 (que tenía el promotor CaMV35S con potenciador duplicado) fue sometido a digestión con BamHI y HindIII y un plásmido pPK200 fue sometido a digestión con HindIII y EcoRI para escindir el promotor CaMV35S con el potenciador duplicado y el gen cry1E quimérico, respectivamente. Fue efectuada una triple ligación para la clonación de los dos fragmentos en vector de clonación pLITMUS38 (New England Biolabs). El plásmido fue denominado pPK59, que tenía el promotor CaMV35S con el potenciador duplicado en el lado de cabeza con respecto al gen quimérico. El terminador de transcripción nos fue clonado en el lado de cola con respecto al gen quimérico. El elemento de poliadenilación nos fue amplificado usando pBI101.1 como plantilla con cebadores adecuados, lo cual creó sitios de restricción MfeI y EcoRI en el lado de cabeza y en el lado de cola, respectivamente. El plásmido pPK59 fue sometido a digestión con EcoRI y el producto de PCR fue clonado a continuación de la digestión con las enzimas de restricción MfeI y EcoRI. El clon en el cual el sitio de restricción EcoRI del gen sintético estaba ligado al sitio MfeI del terminador nos (por cuanto que los mismos tienen extremos compatibles) fue seleccionado y denominado pPK201. La orientación correcta del terminador nos fue confirmada mediante análisis de restricción y también mediante secuenciación de ADN. El casete de expresión (el gen cry sintético con promotor E-35S y terminador nos) fue clonado en vector binario Ti. El fragmento BamHI-EcoRI del plásmido pPK201 fue clonado en pBI101.1 sustituyendo el fragmento BamHI-EcoRI (gen uidA y terminador nos) del plásmido. Este vector binario fue denominado pPK202. Se presenta esquemáticamente en la figura 3 la construcción del vector de expresión en E. coli y en plantas. El constructo tenía las secuencias polinucleotídicas TAAACCATG GCT como contexto de iniciación de la traducción preferido por las plantas, siendo las TAA TGA introducidas en gen sintético para la terminación traslacional. Agrobacterium tumefaciens de la cepa LBA 4404 que contenía el plásmido colaborador pAL4404 fue transformada con vector binario pPK202 siguiendo el protocolo modificado de "electroporación de Agrobacterium" descrito por Cangelosi et al. (1991), y la colonia transformada fue sometida a selección sobre los antibióticos estreptomicina, rifampicina y canamicina. Fue efectuada transformación mediada por Agrobacterium de Nicotiana tobacum cv. Patit Havana siguiendo el método de Horsch et al., 1985, y las plantas transgénicas fueron sometidas a selección sobre el antibiótico canamicina. La presencia del gen que codificaba la toxina quimérica fue confirmada mediante PCR y Análisis Southern, y la expresión del transgen fue establecida mediante RT-PCR, análisis Western y ELISA. El resultado del ELISA estableció la expresión al 0,5% de la proteína toxina en la proteína foliar soluble total en la línea transgénica seleccionada para estos experimentos. Este alto nivel de la expresión fue el resultado del diseño del gen en el cual se usaron exclusivamente codones preferidos por las plantas. El contexto de iniciación de la traducción preferido por las plantas habría también desempeñado un importante papel en la expresión. Fue llevado a cabo bioensayo con insectos con las hojas de plantas transgénicas de dos meses de edad y larvas neonatales de Spodoptera litura. Discos foliares de 15 cm^{2} de plantas transgénicas y de control fueron puestos en cajas cilíndricas que contenían papel secante húmedo en el fondo, y fueron liberadas sobre los mismos diez larvas de 1^{er} instar. Las bocas de las cajas fueron cubiertas con paño de muselina húmedo para mantener una suficiente humedad y permitir el intercambio de aire. Los experimentos de toxicidad fueron llevados a cabo en seis réplicas a 25 \pm 0,2ºC, y se mantuvo un fotoperiodo de 16/8 h. El resultado demostró (figura 4) que las plantas transgénicas que expresaban la nueva proteína quimérica eran altamente tóxicas para las larvas neonatales de Spodoptera litura y ocasionan una mortalidad del 100% a las 48 h de alimentación. El daño infligido a los discos filiares por las larvas de insecto era despreciable en comparación con los discos foliares de las plantas de control, que fueron comidos casi completamente. El alto nivel de la protección de la planta transgénica y la mortalidad de las larvas de Spodoptera tras haberse alimentado de las plantas transgénicas establecieron la eficacia de la toxina quimérica y las plantas
transgénicas.

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Ejemplo 3 Alta toxicidad de la proteína Cry1E quimérica para las larvas de Spodoptera sp. en todas las fases de su desarrollo

Fue llevado a cabo un bioensayo con larvas de 1^{er} instar (de 3 días de edad), de 3^{er} instar (de 7 días de edad) y de 5º instar (de 12 días de edad) para establecer la eficacia de la proteína manipulada expresada en las plantas transgénicas. El bioensayo con larvas de 1^{er} instar ha sido descrito en el ejemplo 2. Fueron usadas para alimentar las larvas de fases avanzadas hojas completas de las plantas transgénicas y de control. El peciolo de la hoja fue mantenido en tapón de algodón en un matraz de 250 ml que contenía solución salina 1/2 MS para superar el marchitamiento de la hoja. Se dejó que se alimentasen de cada hoja cinco larvas de insecto. Las hojas de planta de control de las que se alimentaban las larvas de 3^{er} instar (figura 5) y de 5º instar (figura 6) se cambiaban a las 16 h y a las 8 h, respectivamente, puesto que las mismas eran consumidas por completo por las larvas de insecto. El resultado estableció que la alimentación a base de las hojas transgénicas ocasiona la mortalidad de las larvas en todas las fases de desarrollo a las 48 h. La ingestión de aproximadamente 1 cm^{2} de hoja transgénica fue suficiente para matar las larvas de 5º instar. Estas larvas se veían moribundas tras haber estado alimentándose en la hoja transgénica por espacio de 8-16 h, y finalmente murieron a los 2 días. Se observaron en la superficie de las hojas excrementos de color verde con un alto contenido de agua. Algunas de las larvas presentaban una considerable pérdida de peso antes de la muerte.

En un experimento aparte, larvas de distintos instar fueron alimentadas con hojas de plantas transgénicas por espacio de 1 h, 2 h, 4 h, 8 h y 16 h, y fueron luego trasladadas a hojas de plantas de control. Se observó que 4 h de alimentación en plantas transgénicas eran suficientes para ocasionar una mortalidad del 100% de las larvas en todas las fases de desarrollo, aunque dichas larvas fueses a continuación alimentadas con plantas no transgénicas. La ingestión de muy pequeñas cantidades de la toxina por parte de las larvas jóvenes retrasaba su pupación en 10-15 días más allá del ciclo larval normal de 15 días. Las pocas larvas que escaparon a la mortalidad se desarrollaron convirtiéndose en moscas. Los del 40% de los apareamientos con cópula usando tales moscas dieron huevos. Sin embargo, los huevos eran estériles y no llegaron a eclosionar. No ha sido descrita en la literatura hasta la fecha la toxicidad de la endotoxina \delta para larvas de insectos de fase avanzada. El ato nivel de toxicidad puede ser debido a la elevada estabilidad de la toxina quimérica en el intestino medio de las larvas de insecto o a la mejorada fijación al receptor y a la capacidad de formación de poros de la endotoxina \delta. El ejemplo estableció de nuevo el potencial de la toxina quimérica contra Spodoptera sp. Puesto que la Helicoverpa no prefiere comer hoja de tabaco, no pudo llevarse a cabo con Helicoverpa el experimento de toxicidad con tabacos transgénicos.

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Ejemplo 4 Alta toxicidad de la nueva Cry1E quimérica preparada a partir de hojas de tabacos transgénicos que expresan endotoxina \delta

Se preparó proteína soluble total a partir de hojas de tabaco transgénico. Tejido de hojas frescas fue pulverizado bajo N_{2} líquido y fue puesto luego en suspensión en 5 volúmenes de tampón de extracción de proteína (TrisCl, 20 mM, pH 9,5; EDTA 2 mM, pH 8,0; NaCl, 50 mM; DTT, 1 mM; PVP 2% y PMSF, 100 mM). La suspensión fue mezclada a fondo y centrifugada dos veces (20.000 x g, 20 min. y 4ºC). El supernatante fue cargado en columna Sepharose Q (de 10 cm x 2,5 cm). La proteína fue eluida con un gradiente creciente de NaCl en tampón de extracción, y fueron recogidas 100 fracciones de 5 ml. La endotoxina \delta fue detectada mediante ELISA. Fueron reunidas las fracciones que contenían la endotoxina \delta. Una cantidad conocida de la endotoxina \delta purificada a partir de la planta fue mezclada en dieta semisintética. Las pruebas de toxicidad fueron llevadas a cabo con larvas de 3 días de edad de Spodoptera litura y Helicoverpa armigera, como se ha descrito en los ejemplos anteriores. El resultado demostró que la EC_{50} (la concentración necesaria para una mortalidad del 50%) para Spodoptera y Helicoverpa era de 42,39 \pm 1,72 ng/ml y 283,11 \pm 8,29 ng/ml de dieta semisintética. El resultado estableció además el alto nivel de toxicidad para las larvas de Spodoptera y Helicoverpa. Es de notar que la proteína cristal insecticida hecha en tejido vegetal es mucho más tóxica en comparación con la misma proteína hecha en E. coli. Probablemente la endotoxina \delta se pliega mucho mejor en el citoplasma vegetal, no pudiendo desestimarse el papel de algunos acompañantes no identificados en tal plegado.

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Ejemplo 5 Estabilidad de la endotoxina \delta quimérica en tejido vegetal

Proteína foliar soluble total de planta transgénica fue extractada como se ha expuesto anteriormente e incubada a 4ºC y 28ºC. Esto se usó para pruebas de toxicidad. Las muestras fueron tomadas cada dos días en el primer caso y cada día en el segundo caso. La proteína cruda total fue mezclada en dieta semisintética, y fue efectuado un experimento de toxicidad con larvas neonatales de Spodoptera litura. Los datos de mortalidad de los insectos fueron registrados a los 7 días de alimentación, y fue calculada la LC_{50}. Los resultados están indicados en las siguientes Tablas 6 y 7.

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TABLA 6

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TABLA 7

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El resultado estableció la estabilidad de la endotoxina \delta quimérica diseñada por nosotros contra las proteasas vegetales. La toxina quimérica fue estable por espacio de más de 16 días a 4ºC y 3 días a 28ºC, y ocasionó una mortalidad de más de un 80%. El incremento de la LC_{50} con el transcurso del tiempo era presumiblemente debido a alguna degradación de la toxina.

Las principales ventajas de la presente invención son las siguientes:

1. La endotoxina \delta Cry1Ea fue manipulada para obtener una nueva toxina quimérica, que es aquí la susodicha Cry1E quimérica. La toxicidad de la proteína quimérica era varias veces más alta en comparación con las toxinas progenitoras o con otras endotoxinas \delta de las que se ha descrito que funcionan contra Spodoptera. Su actividad larvicida era muy alta cuando esta toxina se hace en plantas.

2. El gen que codifica la toxina quimérica fue diseñado para ser expresado tanto en E. coli como en plantas. Por consiguiente, dicho gen puede ser usado en la manipulación de un microbio para la expresión de la toxina quimérica, lo cual puede usarse en la preparación de la formulación microbiana. El mismo gen puede ser también usado en la manipulación genética de las plantas para impartir resistencia a los insectos. Hemos demostrado que la secuencia diseñada por nosotros da un muy alto nivel de expresión (un 0,5% de la proteína soluble total) de la toxina quimérica en las hojas de algodón y tabaco transgénico (resultados no incluidos).

3. Las plantas transgénicas que expresaban la toxina quimérica presentaban un muy alto grado de protección contra las larvas de Spodoptera litura en todas las fases de desarrollo. Dichas larvas morían a los 2-3 días de alimentarse con las plantas transgénicas. Tal alto nivel de toxicidad de las plantas transgénicas contra cualquier insecto lepidóptero no ha sido descrito hasta la fecha. Esta proteína puede también ser eficaz contra muchas otras larvas de insectos. Nuestros resultados demuestran que la toxina era también eficaz contra Helicoverpa.

4. El potencial de la toxina quimérica en las plantas transgénicas fue establecido adicionalmente mediante alimentación de corta duración con plantas transgénicas. La alimentación por espacio de 4 horas ocasionó una mortalidad del 100% de las larvas de Spodoptera en todas las fases de desarrollo. La alimentación por espacio de periodos de tiempo extremadamente cortos (de hasta una hora) retardaba el desarrollo larval y estorbaba la metamorfosis. Tal proteína puede ser extremadamente valiosa para proteger bosques y cultivos agronómicamente importantes. El gen que codifica la toxina quimérica puede ser usado en el desarrollo de plantas transgénicas y/o para la producción de la toxina en un microbio, que puede ser usado en formulaciones microbianas.

5. Puesto que las plantas transgénicas que expresaban la nueva toxina quimérica ocasionaban una mortalidad del 100% de las larvas de Spodoptera dentro de un muy corto periodo de tiempo de alimentación, será extremadamente baja la probabilidad de desarrollo de resistencia en los insectos contra esta endotoxina \delta.

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Información para la ID de secuencia Nº 1 1. Características de la secuencia

A	Longitud:	641
B	Tipo:	Aminoácido
C	Topología:	Lineal
D	Tipo molecular:	Proteína

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2. Descripción de secuencia: ID de secuencia Nº 1

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Información para la ID de secuencia Nº 2 1. Características de la secuencia

A	Longitud:	1990 bp
B	Tipo:	Ácido nucleico
C	Orientación:	Doble
D	Topología:	Lineal
E	Tipo molecular:	Sintético
F	Fuente original:	Bacillus thuringiensis
G	Característica:	Gen quimérico

2. Descripción de secuencia: ID de secuencia Nº 2

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<110> Consejo de Investigación Científica e Industrial

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<120> Proteína endotoxina delta quimérica con extraordinariamente alta actividad insecticida

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<130> PCT 206

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<140> PCT/IN 02/00092

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<141> 2000-03-28

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<160> 2

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 641

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Una proteína endotoxina delta quimérica Cry1E de una longitud de 641 residuos de aminoácidos

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<400> 1

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<210> 2

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<211> 1990

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Un gen quimera de una longitud de 1990 bps que codifica para proteína endotoxina delta quimérica Cry1E.

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<400> 2

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Claims (41)

1. Proteína endotoxina \delta quimérica Cry1E de ID SEC Nº 1.

2. Proteína como la reivindicada en la reivindicación 1, donde dicha proteína de ID SEC Nº 1 es de una longitud de 641 residuos de aminoácidos.

3. Proteína como la reivindicada en la reivindicación 1, donde dicha proteína quimérica de ID SEC Nº 1 es diseñada a partir de las endotoxinas \delta Cry1Ea y Cry1Ca de Bacillus thuringiensis.

4. Proteína como la reivindicada en la reivindicación 2, donde dicha proteína quimérica de una longitud de 641 residuos consta de los residuos 1 a 529 de la endotoxina Cry1Ea de la misma posición, los residuos 530 a 599 de Cry1Ca de la posición 533 a la 602, los residuos 600 a 616 de Cry1Ea de la posición 588 a la 604 y los residuos 617 a 641 de un polipéptido sintético.

5. Proteína como la reivindicada en la reivindicación 1, donde el dominio peptídico de 530 a 587 de Cry1Ea puede ser sustituido por el de la endotoxina \delta.

6. Proteína como la reivindicada en la reivindicación 2, donde los últimos 25 residuos de aminoácidos mejoran la estabilidad contra las proteasas de las plantas.

7. Proteína como la reivindicada en la reivindicación 1, donde dicha proteína quimérica es estable a temperaturas de entre 4 y 35ºC.

8. Gen quimera de ID SEC Nº 2.

9. Quimera como la reivindicada en la reivindicación 8, donde dicha quimera codifica proteína quimérica de ID SEC Nº 1.

10. Quimera como la reivindicada en la reivindicación 8, donde dicha quimera es de una longitud de 1990 pares de bases (bp).

11. Quimera como la reivindicada en la reivindicación 8, donde dicha quimera es un ADN de doble hebra de 1,99 kb.

12. Quimera como la reivindicada en la reivindicación 8, donde dicha quimera contiene codón preferido por las plantas distribuido uniformemente para facilitar la eficaz traducción.

13. Quimera como la reivindicada en la reivindicación 8, donde dicha quimera contiene codón de ATGGCT de iniciación de la traducción preferido por las plantas en el extremo 5'.

14. Quimera como la reivindicada en la reivindicación 8, donde dicha quimera contiene codón de TAATGA de terminación de la traducción preferido por las plantas.

15. Quimera como la reivindicada en la reivindicación 8, donde dicha quimera contiene 33 sitios de restricción distribuidos uniformemente a todo lo largo del gen a una distancia de aproximadamente 40-80 bp.

16. Quimera como la reivindicada en la reivindicación 15, donde los sitios de restricción son enzimas seleccionadas de entre los miembros de un grupo que consta de Hind III, EcoRI y BamHI.

17. Quimera como la reivindicada en la reivindicación 8, donde dicha quimera está dividida en 58 oligonucleótidos solapados de una longitud de 40 a 65 bp cada uno situados a una distancia de 6 a 26 pares de bases (bp).

18. Quimera como la reivindicada en la reivindicación 8, donde dicha quimera contiene dichos nucleótidos solapados con un solapamiento de 13 a 18 nucleótidos con los oligonucleótidos inmediatamente adyacentes en la hebra complementaria.

19. Quimera como la reivindicada en la reivindicación 8, donde dicha quimera tiene un valor T_{m} que está situado entre 44 y 55ºC.

20. Método para sobreexpresar la proteína quimérica insecticida Cry1E en microbios, comprendiendo dicho método los pasos de:

(a) clonar el gen Cry1E de ID SEC Nº 2 que codifica dicha proteína quimérica en un vector,

(b) transformar un microbio con dicho vector clonado, y

(c) sobreexpresar dicha proteína quimérica en dicho microbio.

21. Método como el reivindicado en la reivindicación 20, donde dicha quimera es expresada en un microbio seleccionado de entre los miembros de un grupo que consta de bacterias, algas y hongos.

22. Método como el reivindicado en la reivindicación 20, donde las enzimas de restricción para dicha clonación son seleccionadas de entre los miembros de un grupo que consta de Hind III, EcoRI, NcoI, Mfe I y BamHI.

23. Método como el reivindicado en la reivindicación 20, donde se induce la sobreexpresión de dicha proteína usando isopropiltiogalactósido (IPTG).

24. Método como el reivindicado en la reivindicación 20, donde se sobreexpresa dicha proteína a 15ºC para evitar el plegado incorrecto de dichas proteínas.

25. Método como el reivindicado en la reivindicación 20, donde dichos vectores son seleccionados de entre los miembros de un grupo que consta de plásmidos, ADN viral y cósmidos.

26. Método como el reivindicado en la reivindicación 20, donde la expresión de la quimera en el microbio es confirmada mediante RT-PCR, análisis Western y ELISA.

27. Método como el reivindicado en la reivindicación 20, donde la presencia de quimera en el microbio es confirmada mediante PCR y análisis southern.

28. Método para tratar plantas infectadas con insectos usando proteína quimérica insecticida de la reivindicación 1, comprendiendo dicho método los pasos de:

(a) incorporar un gen que codifica proteína quimera Cry1E de la reivindicación 1 a una planta infectada con insectos,

(b) exponer la planta transgénica a insectos, y

(c) determinar la actividad insecticida de dichas plantas transgénicas.

29. Método como el reivindicado en la reivindicación 28, donde las plagas insectiles son seleccionadas de entre los miembros de un grupo que consta de spodoptera sp. y Helicoverpa sp.

30. Método como el reivindicado en la reivindicación 28, donde las plantas son seleccionadas de entre los miembros de un grupo que consta de tabaco, algodón, garbanzo, quinchoncho, cacahuete, coliflor, col, guindilla y pimiento.

31. Método como el reivindicado en la reivindicación 28, donde las enzimas de restricción para dicha clonación son seleccionadas de entre los miembros de un grupo que consta de Hind III, EcoRI, Ncol y BamHI.

32. Método como el reivindicado en la reivindicación 28, donde la proteína quimérica presenta un alto grado de expresión en plantas, ascendiendo a aproximadamente un 0,5% de la proteína soluble total de las plantas.

33. Método como el reivindicado en la reivindicación 28, donde dicha proteína quimérica es estable en dicha planta transgénica.

34. Método como el reivindicado en la reivindicación 28, donde los insectos expuestos a dicha proteína quimérica presentan pérdida de peso antes de la muerte.

35. Método como el reivindicado en la reivindicación 28, donde dicha proteína quimérica presenta propiedad insecticida contra los insectos en todas las fases de desarrollo.

36. Método como el reivindicado en la reivindicación 28, donde dicha proteína quimérica es un insecticida varias veces más potente en comparación con las proteínas progenitoras.

37. Método como el reivindicado en la reivindicación 28, donde la actividad insecticida de dicha proteína quimérica arroja una mortalidad de las plagas insectiles que está situada entre un 80 y un 100% a las aproximadamente 4 horas de exposición.

38. Método como el reivindicado en la reivindicación 28, donde los insectos expuestos a dicha proteína quimérica por espacio de aproximadamente 1 hora presentan un desarrollo retardado, infertilidad y metamorfosis desbaratada.

39. Método como el reivindicado en la reivindicación 28, donde la EC_{50} para Helicoverpa sp. está situada entre 250 y 350 ng/ml de dieta artificial de insectos.

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40. Método como el reivindicado en la reivindicación 28, donde la EC_{50} para Spodoptera sp. está situada entre 25 y 50 ng/ml de dieta artificial.

41. Método como el reivindicado en la reivindicación 28, donde dicho método no presenta efecto adverso alguno en el crecimiento normal de las plantas transformadas.