CN1625562A - CRY1EA和CRY1CA的嵌合型δ－内毒素蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及SEQ ID No.1的嵌合型δ－内毒素蛋白Cry1E，其具有特别高的杀虫特性，以及SEQ ID No.2的嵌合体基因，其编码来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的δ－内毒素cry1Ea和cry1Ca的该嵌合蛋白，还涉及用该嵌合体蛋白处理受昆虫侵害的植物的方法。
Description
技术领域
本发明涉及SEQ ID No.1的嵌合型δ-内毒素蛋白Cry1E，其具有特别高的杀虫特性，以及SEQ ID No.2的嵌合体基因，其编码该嵌合蛋白，还涉及用该嵌合体蛋白处理受昆虫侵害的植物的方法。
背景技术
由于昆虫引起的损害每年以农作物损失的形式和在控制这些害虫的花费中造成几十亿美元的损失。在农业生产环境中由害虫引起的损失包括农作物产量的减少、差的农作物品质、增加的收获成本以及健康和环境的损失。
可以参考Hofte H.和Whiteley H.R.，1989，“Insecticidalcrystal protein of Bacillus thuringiensis”，Microbiol.Rev.53：242-255，其中苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(B.t.)是到处存在的革兰氏阳性产芽孢土壤杆菌，已知其能够在芽孢形成期间产生副孢子晶状包含体。这些包含体由称为晶体蛋白或Cry蛋白或δ-内毒素的蛋白质所组成，它们具有杀虫活性，特别是抗鳞翅目(lepidoptera)、双翅目(diptera)和鞘翅目(coleoptera)中的昆虫物种的幼虫。具有对膜翅目(hymenoptera)、同翅目(homoptera)、直翅目(orthoptera)、食毛目(mallophaga)；线虫；螨和原生动物的毒性的蛋白质也在文献(Feitelson J.S.，1993，“The Bacillusthuringiensis family tree”，63-71，L.kim(编者)，Advancedengineered pesticides，Marcel Dekker公司，New York，N.Y.，和Feitelson等人，1992，“Bacillus thuringiensis：insects andbeyond”，Bio/Tech.10：271-275；可以对此进行引用)中提到了。苏云金芽孢杆菌(B.t.)的几个菌株已经被鉴定了，其具有不同的宿主谱，并基于鞭毛抗原而将它们分类为不同的亚种或血清型。巴斯德研究所(法国)已经归类了55种不同的鞭毛血清型和8种无鞭毛的生物型。可以参考Schnepf等人，1998，“Bacillus thuringiensis and itspesticidal crystal proteins”，Microbiol.Mol.Biol.Riv.62：775-806，其中已经克隆、测序和表征了几个编码B.t.毒素的基因，已经生产出基于重组DNA的产品并经过批准而用于商业用途。通过使用遗传工程技术，已经开发出新的方法来递送这些B.t.毒素至农业环境，包括使用遗传工程改造的农作物和稳定化的完整微生物细胞作为δ-内毒素递送载体(Gaertner，F.H.，Kim L.，1988，TIBTECH 6：54-57)。因此，编码靶向杀死宿主(尤其是造成经济损失的害虫和昆虫)的蛋白质的δ-内毒素基因正变得具有商业价值。
B.t.杀虫剂在指定的农作物环境中的商业用途是有限的，因为指定的δ-内毒素显示出对于窄范围的目标害虫的毒性。许多年来已经使用苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种(B.thuringiensis subsp.kurstaki)的芽孢和晶体的制备物作为抗鳞翅目害虫的商业杀虫剂。例如，苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克变种(B.thuringiensis var.kurstaki)HD-1产生几种δ-内毒素，因此对于相对较宽范围的鳞翅目昆虫具有毒性。可是，基于已知的δ-内毒素(包括B.t.k.HD-1)的配剂不能有效地抗一些重要的农作物害虫，如也属于鳞翅目的灰翅夜蛾属(Spodoptera)物种。B.t.的其他种类即以色列亚种(israelensis)和tenebrionis亚种已经在商业上用于分别控制某些双翅目和鞘翅目的昆虫(GaertnerF.H.，1989，“Cellular Delivery Systems for Insecticidal Proteins：Living and Non-Living Microorganisms”，Controlled Delivery ofCrop Protection Agents，R.M.Wilkins(编者)，Taylor和Francis，New York和London，1990，pp.245-255；Couch T.L.，1980，“MosquitoPathogenicity of Bacillus thuringiensis var.israelensis”，Development in Industrial Microbiology 22：61-67；和Beegle C.C.，1978，“Use of Entomogenous Bacteria in Agroecosystems”，Developments in Industrial Microbiology 20：97-104；可以对此进行引用)。Kreig等人(1983)在Z.ang.Ent.96：500-508中描述了Bacillus thuringiensis var.tenebrionis，其据报道具有抗鞘翅目中的两种甲虫的活性，即马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata)和杨树萤叶甲(Agelastica alni)。
可以参考Crickmore等人，1998，“Revision in the nomenclaturefor the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins”，Microbiol.Mol.Biol.Rev.62：807-813，其中主要基于氨基酸序列的同源性将晶体蛋白基因分类为22种类型。B.t.晶体蛋白基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中的克隆和表达已经在出版的文献中进行了描述(Schnepf等人，1981，“Cloning and Expression of the Bacillusthuringiensis crystal protein gene in Escherichia coli”；可以对此进行引用)。U.S.Pat.No.4,448,885和4,467,036公开了B.t.晶体蛋白在大肠杆菌中的表达。U.S.Pat.No.4,797,276和4,853,331公开了苏云金芽孢杆菌菌株tenebrionis，其可以用于在多种环境中控制鞘翅目害虫。U.S.Pat.No.4,918,006公开了具有抗双翅目的活性的B.t.毒素。U.S.Pat.No.4,849,217公开了具有抗紫苜蓿叶象的活性的B.t.分离物。U.S.Pat.No.5,208,017公开了具有鞘翅目活性的苏云金芽孢杆菌分离物。U.S.Pat.No.5,151,363和4,948,734公开了某些B.t.的分离物，其具有抗线虫的活性。正进行广泛的研究和消耗大量的资源来发现新的B.t.分离物和它们的用途。到目前为止，新的B.t.分离物和已知B.t.分离物的新用途的发现还是完全凭经验的、不可预测的领域。全世界的几个实验室正设法从苏云金芽孢杆菌中分离出具有不同的宿主范围和作用机制的新型δ-内毒素基因。
Bulla等人，1980，“Ultrastructure，physiology andbiochemistry of Bacillus thuringiensis”，CRC Crit.Rev.Microbiol.8：147-204；和Grochulski等人，1995，“Bacillusthuringiensis CryIA(a)insecticidal toxin：crystal structure andchannel formation”，J.Mol.Biol.，254：447-464已经报道了大多数的B.t.杀虫晶体蛋白是作为前毒素的天然形式(分子量130-140kDa)而合成，这些前毒素依靠疏水相互作用、氢键和二硫桥而形成副孢子包含体。对于昆虫幼虫无毒性的前毒素由两个部分构成，即N-末端半部分(N-terminal half)和C-末端半部分(C-terminal half)。在碱性pH由蛋白酶对于这些前毒素进行位点特异性切割之后，它们在昆虫的中肠中转变成功能上有活性的毒素(60-70kDa)。这种经蛋白酶解加工的、截短的δ-内毒素与昆虫中肠中的特异性受体结合，并通过在上皮膜中形成孔而引起死亡(参考文献为，Bietlot等人，1989，“Facilepreparation and characterization of the toxin from Bacillusthuringiensis var.kurstaki”，Biochem.J.260：87-91；Choma等人，1990，“Unusual proteolysis of the protoxin and toxin fromBacillus thuringiensis：structural implications”，Eur.J.Biochem.189：523-27；和Hofte等人，1986，“Structural andfunctional analysis of a cloned delta endotoxin of Bacillusthuringiensis berliner 1715”，Eur.J.Biochem.161：273-280；可以对此进行引用)。具有蛋白酶抗性的毒素相当于前毒素分子的N-末端半部分。另一个相当于C-末端半部分的片段被相信对于高度稳定的晶体的形成是必需的。在蛋白酶解加工期间，从前毒素的N-末端去除含有大约25-30个氨基酸残基的小多肽。
Cry1Aa和Cry3Aa δ-内毒素的核心毒性片段的晶体结构是已知的(Grochulsky等人，1995，“Bacillus thuringiensis CryIA(a)insecticidal toxin：crystal structure and channel formation”，J.Mol.Biol.254：447-464；和Li等人，1991，“Crystal structureof insecticidal δ-endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 resolution”，Nature.353：815-821)，而且它们的三维结构是可重叠的。相当保守的多肽结构域暗示了相关毒素具有类似的拓扑结构。它们是由3个不同的并通过小肽连接体进行连接的结构域所构成的球状分子。在结构域之间不存在多肽链的交叉。结构域I由7个α-螺旋结构组成。结构域II由3个反平行β-折叠和2个短α-螺旋组成。结构域III是2个反平行高度扭型β-折叠的β-夹层。结构域II和III位于侧面，在那里它们面向结构域I的螺旋α7。这些结构域依靠结构域之间的许多范德华力、氢键和静电相互作用(盐桥)而紧密地包裹在一起。
δ-内毒素的窄宿主范围的一个主要原因是，这些蛋白质需要昆虫肠中的特异性受体以便形成孔并引起毒性。由于给定的δ-内毒素对于非常窄范围的昆虫具有毒性，因此希望对于这些蛋白质进行改造以便修饰它们在幼虫中肠中的受体识别，从而拓宽宿主范围和改善毒性。对此目的随后有了两种方法，第一，通过交换蛋白质的功能结构域而形成嵌合(或杂交)基因；第二，通过定点诱变而形成经改善的δ-内毒素蛋白。可以参考U.S.Pat.No.5,128,130和5,055,294，其中已经构建了杂合B.t.晶体蛋白，这种蛋白质具有增加的毒性并显示出扩展的对于目标害虫的宿主范围。
可以参考Honee等人，1990，“A translation fusion product oftwo different insecticidal crystal protein gene of Bacillusthuringiensis exhibits an enlarged insecticidal spectrum”，Appl.Environ.Microbiol.56：823-825，其中进行了两个cry基因(cry1Ab和cry1Ca)的翻译融合。结果所得的杂合蛋白具有更宽的毒性谱，该毒性谱覆盖了两个亲本晶体蛋白的毒性谱。可是，缺点是嵌合型毒素的活性没有增加至超过任何亲本毒素对于目标昆虫害虫的活性。尽管具有较差的毒性，但是在部分修饰之后将融合基因在烟草中表达，这只赋予转基因植物部分保护以抗更宽范围的昆虫，包括甜菜灰翅夜蛾(Spodoptera exigua)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、和烟草天蛾(Manduca sexta)(参考文献为，van der Salm等人，1994，“Insectresistance of transgenic plants that express modified Bacillusthuringiensis cryIAb and cryIC genes：a resistance managementstrategy”，Plant Mol.Biol.26：51-59；可以对此进行引用)。
可以参考Honee等人，1991，“The C-terminal domain of the toxicfragment of Bacillus thuringiensis crystal protein determinesreceptor binding”，Mol.Microbiol.5：2799-2806，其中已经通过交换功能结构域并用cry1Ab和cry1Ca作为亲本基因而构建了11个嵌合基因。其缺点是，只有两个已经交换了成孔(pore-forming)结构域的嵌合蛋白具有杀虫活性。可是，毒素嵌合蛋白的效能比亲本蛋白低。其他杂合蛋白没有毒性。
Masson等人，1992，“Insecticidal properties of a crystalprotein gene product isolated from Bacillus thuringiensis subsp.kenyae”，Appl.Environ.Microbiol.58：2，642-646报道了一种Cry1δ-内毒素即Cry1Ea不具有抗灰翅夜蛾幼虫的毒性。此外，可以参考Bosch等人，1994，“Recombinant Bacillus thuringiensis Crystalprotein with new properties：possibilities for resistancemanagement”，Bio/Tech 12：915-918，其中依照cry1Ca和cry1Ea基因的体内重组已经形成了许多嵌合基因。从一种嵌合基因表达出的δ-内毒素由Cry1Ea蛋白的结构域I和II以及Cry1Ca蛋白的结构域III构成，其具有杀幼虫的活性。将Cry1Ca蛋白的结构域III转移至Cry1Ea蛋白就得到杀虫蛋白。可是，嵌合型毒素并不是优于Cry1Ca的经改善的毒素，Cry1Ca是报道得最好的对于灰翅夜蛾属物种的毒素。另一个嵌合型毒素具有非常低的毒性。剩余的嵌合型毒素要么不稳定要么无毒性。
可以引用的文献为Rang等人，1999，“Interaction betweenfunctional domain of Bacillus thuringiensis insecticidal crystalprotein”，Appl Environ Microbiol，65，7：2918-25，其中通过在Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ca和Cry1Eaδ-内毒素之间交换编码结构域I或结构域III的区域已经形成了许多嵌合基因，并检查了它们在大肠杆菌中的稳定性和对于Sf9细胞的质膜渗透性。一种嵌合型毒素(由Cry1Ca的结构域I和II以及Cry1Ab的结构域III构成)比亲本毒素更具有毒性。交换Cry1Ab的结构域III与Cry1Ca的结构域III形成比Cry1Ca蛋白更具有活性的嵌合蛋白。交换了其他结构域的蛋白质要么不稳定要么比亲本蛋白的毒性小。可是，没有测试嵌合蛋白对于昆虫幼虫的毒性。比较了在昆虫细胞系中的孔形成，但是不能将其与δ-内毒素的杀虫活性联系起来。
可以参考Chandra等人，1999，“Amino acid substitution inalpha-helix 7 of CrylAcδ-endotoxin of Bacillus thuringiensisleads to enhanced toxicity to Helicoverpa armigera Hubner”，FEBSLett.458：175-179，其中发现在白喉毒素的片段B的C-末端中的疏水基元与δ-内毒素的螺旋α7是同源的。通过用该多肽替换Cry1Ac蛋白的螺旋α7，嵌合蛋白对于棉铃虫(Helicoverpa armigera)的毒性显示出7-8倍的增强。增强的毒性是由于更高的成孔能力造成的。
这些例子确立了用蛋白质工程改善天然毒素的可能性，从而形成商业上有用的δ-内毒素。
大多数鳞翅目害虫在自然界中是杂食性的。灰翅夜蛾是常见的鳞翅目昆虫，其5个种(斜纹灰翅夜蛾(litura)、棉灰翅夜蛾(littoralis)、甜菜灰翅夜蛾(exigua)、草地灰翅夜蛾(frugiperda)和非洲灰翅夜蛾(exempta)在世界范围内都能找到。棉灰翅夜蛾(Spodopteralittoralis)(埃及棉斜纹夜蛾，CLW)在欧洲是棉花和其他具有农业经济重要性的农作物的主要害虫(参考文献为Mazier等人，1997，“ThecryIC gene from Bacillus thuringiensis provides protectionagainst Spodoptera littoralis in young transgenic plants”，PlantSci.127：179-190；可以对此进行引用)。这是一种臭名昭著的棉花、花生、红辣椒、豆类植物和几种蔬菜作物的害虫，尤其是在温暖和潮湿的地区，如印度的南部。高繁殖力、短生活周期、破坏性的摄食习惯和经常报道的对于化学杀虫剂的抗性的出现已经使得灰翅夜蛾的控制成为日益严重的农业问题。可以参考Bai等人，1993，“Activity ofinsecticidal proteins and strains of Bacillus thuringiensisagainst Spodoptera exempta(Walker)”，J.Inverteb.Pathol.62：211-215，其中讨论了，年幼的幼虫对于某些δ-内毒素是敏感的，但是超过2龄的幼虫显示出相当高的耐受性。这是由于肠液中的高含量的碱性蛋白酶(参考文献为Keller等人，1996，“Digestion of δ-endotoxin by gut proteases may explain reduced sensitivity ofadvanced instar larvae of Spodoptera littoralis to CryIC”，InsectBiochem.Mol.Biol.26：365-373；可以对此进行引用)。
已经报道了4种不同的δ-内毒素可引起灰翅夜蛾属物种的低水平死亡。其中，Cry1Ca是最有效的毒素。高水平表达Cry1Ca的植物引起低龄幼虫的死亡，因此被赋予抗低龄幼虫的保护(参考文献为Mazier等人，1997，“The cryICgene from Bacillus thuringiensis providesprotection against Spodoptera littoralis in young transgenicplants”，Plant Sci.127：179-190；和Strizhov等人，1996，“Asynthetic cry1C gene，encoding a Bacillus thuringiensis δ-endotoxin，confers Spodoptera resistance in alfalfa andtobacco”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93：15012-15017；可以对此进行引用)。可是，在任何情况下都没有报道抗灰翅夜蛾的完全保护。处于高级发育阶段的幼虫在已知δ-内毒素的中等水平未被杀死。因此，表达Cry1Ca的转基因植物在抗灰翅夜蛾的保护中不像所期望的那样有效。其他基因如cry1Cb、cry1Ea和cry1F没有用于形成抗灰翅夜蛾的转基因植物，因为它们的毒性比较低。Cry1Cb δ-内毒素的毒性比Cry1Ca低5倍。Cry1Eaδ-内毒素的毒性非常低，并且在某些报道中存在争议(Masson等人，1992和Bosch等人，1994；可以对此进行引用)。Cry1F具有中度的对于灰翅夜蛾幼虫的毒性(Chambers等人，1991；可以对此进行引用)。
可以参考Kalman等人，1993，“Cloning of a novel cryIC-typegene from a strain of Bacillus thuringiensis subsp.Galleriae”，Appl.Environ.Microbiol.59：4：1131-1137，其中Cry1Cbδ-内毒素的毒性据报道比Cry1Ca低5倍。这些蛋白质的前两个结构域是高度同源的(92％的同一性)。在只显示出48％的同源性的结构域III中观察到主要的差异。超过Cry1Cbδ-内毒素更高的Cry1Ca的毒性(5倍)暗示我们Cry1Ca的结构域III可能在其效能中起着重要作用。Cry1Eaδ-内毒素的毒性非常低，因为其在甜菜灰翅夜蛾的中肠中非常弱地与受体结合，但是交换Cry1Ca与Cry1Ea的结构域III使得Cry1Ea具有毒性。这表明了Cry1C蛋白的结构域III在灰翅夜蛾的中肠中的受体结合之中的作用(参考文献为Bosch等人，1994，“Recombinant Bacillusthuringiensis Crystal protein with new properties：possibilitiesfor resistance management”，Bio/Tech 12：915-918；可以对此进行引用)。在该出版物中，Bosch等人(1994)确立了杂合毒素的优点，因为其与Cry1Ca不结合的受体结合。可是，天然的Cry1Ca和杂合的Cry1Ea的毒性是相当的。他们申请了一个专利(US 5736131)，在该专利中声称对于甜菜灰翅夜蛾的毒性有了1.9倍的提高。在报道毒性没有增加的出版物中和在声称毒性有1.9倍增加的专利中的结果之间的差异使得总体情况变得不清楚了。
植物遗传工程技术在最近的10年期间已经取得了显著的进步。现在已经可能稳定地将外源基因导入植物中。这已经为现代农业提供了令人激动的机会。已经证实了植物病原体即根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ti质粒的衍生物是对于将外源基因导入植物组织有效的和高度通用的载体。另外，对于同一个目的已经形成了多种方法来递送DNA，例如电穿孔、微注射、花粉介导的基因转移和基因枪技术。
通过遗传工程的植物转化的主要目的是农作物的改良。已经作出了大量的努力来改造植物以获得有用的特性，例如抗虫性。在这一方面，通过使用来自苏云金芽孢杆菌菌株的编码δ-内毒素的基因已经在转基因植物改造抗虫性之中获得了进步。因为δ-内毒素具有特异的杀虫谱，并对于其他非宿主动物和人不显示出毒性，这些非常适合于形成商业上有用的植物。已知没有其他蛋白质显示出与δ-内毒素一样高的毒性(在ppm水平)，并且与δ-内毒素一样对于非目标生物是安全的。
产生表达δ-内毒素的具有抗虫性的转基因农作物的可行性以及这些转基因农作物在商业化农业中的成功已经得到了证实。(可以参考Vaeck等人，1987，“Transgenic plants protected from insectattack”，Nature 328：33-37；Fischoff等人，1987，“Insecttoleranttransgenic tomato plants”，Bio/Tech.5：807-813”；Barton等人，1987，“Bacillus thuringiensis δ-endotoxin expressed intransgenic Nicotiana tabaccum provides resistance tolepidopteran insects”，Plant Physiol.85：1103-1109；可以对此进行引用)。转基因植物提供了吸引人的一种选择来在农业中控制昆虫，而同时其是安全的、有利于环境的和有成本效益的。已经在田地条件下观察到成功的昆虫控制(可以参考Delannay等人，1989；Meeusen和Warren，1989)。
可以引用的文献为Von Tersch等人，1991，“Insecticidal toxinsfrom Bacillus thuringiensis subsp kanyae：Gene cloning andcharacterization and comparison with B.thuringiensis subspkurstaki Cry1A(c)toxin”，Appl and Environ Microbial，57：2：349-58，其中从两个不同的菌株中分离得到了cry1Ac的两个变体。它们的氨基酸组成在7个位置上存在差异。将这两个δ-内毒素在大肠杆菌中表达，并进行毒性实验。这两个毒素在对于目标昆虫的效能中没有显示出任何差异。
在另一个研究(Schnepf等人，1998，“Bacillus thuringiensisand its pesticidal crystal proteins”，62：3，775-806)中，将Cry1Ac δ-内毒素在312-314位上的氨基酸残基GYY分别用ASY、GSY和GFS进行替换。没有观察到这三个蛋白质的毒性之间的差异。
存在有Cry1Cδ-内毒素的两个天然变体即Cry1Ca和Cry1Cb。这些蛋白质显示出81％的氨基酸序列同一性(Schnepf等人，1998，“Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins”，62：3，775-806)。尽管有这种差异，但是这两种毒素对于它们的目标害虫都是有毒性的，虽然在毒性水平上有着一些差异。它们的宿主范围也是一样的。(Kalman等人，1993，“Cloning of a noval cry1C typegene from a strain of Bacillus thuringiensis subsp galleriae”，Appl.Environ Microbial 59：4：1131-37)。
本发明的目标
本发明的主要目标为形成嵌合型δ-内毒素蛋白。
本发明的另一个主要目标为形成编码嵌合型δ-内毒素蛋白的嵌合体基因。
本发明的另一个目标为开发用于形成所述嵌合蛋白的方法。
本发明的另一个目标为开发在合适的微生物中过表达所述嵌合蛋白的方法。
本发明的另一个目标为开发用所述嵌合蛋白处理受昆虫侵害的植物的方法。
本发明的进一步目标为开发用于具有多重药物抗性的昆虫的杀虫剂。
本发明的另一个目标为开发有效的杀虫剂。
本发明的另一个目标为开发不会对植物产生不利影响的杀虫剂。
本发明的另一个目标为开发具有大约100％杀虫活性的杀虫剂。
本发明概述
本发明涉及SEQ ID No.1的嵌合型δ-内毒素蛋白Cry1E，其具有特别高的杀虫特性，以及SEQ ID No.2的嵌合体基因，其编码该嵌合蛋白，还涉及用该嵌合体蛋白处理受昆虫侵害的植物的方法。
本发明详述
因此，本发明涉及SEQ ID No.1的嵌合型δ-内毒素蛋白Cry1E，其具有特别高的杀虫特性，以及SEQ ID No.2的嵌合体基因，其编码该嵌合蛋白，还涉及用该嵌合体蛋白处理受昆虫侵害的植物的方法。
在本发明的一个实施方案中，涉及SEQ ID No.1的嵌合型δ-内毒素蛋白Cry1E和其他在序列上具有75％及以上同源性的蛋白质。
在本发明的另一个实施方案中，涉及SEQ ID No.1的嵌合型δ-内毒素蛋白Cry1E。
在本发明的另一个实施方案中，所述蛋白质的长度为641个氨基酸残基。
在本发明的另一个实施方案中，所述嵌合蛋白是从苏云金芽孢杆菌的δ-内毒素Cry1Ea和Cry1Ca中设计出来的。
在本发明的另一个实施方案中，长度为641个残基的所述嵌合蛋白由下列部分构成，即残基1-529来自内毒素Cry1Ea的相同位置、残基530-599来自Cry1Ca的533-602位、残基600-616来自Cry1Ea的588-604位和残基617-641为合成多肽。
在本发明的另一个实施方案中，Cry1Ea的530-587的肽结构域可以用任何其他δ-内毒素的肽结构域替换。
在本发明的另一个实施方案中，最后2 5个氨基酸残基改善了抵抗植物蛋白酶的稳定性。
在本发明的另一个实施方案中，所述嵌合蛋白在4-35℃的温度是稳定的。
在本发明的进一步的实施方案中，涉及SEQ ID No.2的嵌合体基因。
在本发明的另一个实施方案中，所述嵌合体编码SEQ ID No.1的嵌合蛋白。
在本发明的另一个实施方案中，所述嵌合体的长度为1990个碱基对(bp)。
在本发明的另一个实施方案中，所述嵌合体为1.99kb的双链DNA。
在本发明的另一个实施方案中，所述嵌合体含有平均分布的植物首选的密码子以便促进有效的翻译。
在本发明的另一个实施方案中，所述嵌合体在5’-末端含有植物首选的翻译起始密码子ATGGCT。
在本发明的另一个实施方案中，所述嵌合体含有植物首选的翻译终止密码子TAATGA。
在本发明的另一个实施方案中，所述嵌合体含有33个限制位点，这些限制位点以大约40-80bp的间距均匀地分布于基因的全部长度之中。
在本发明的另一个实施方案中，限制位点为选自HindIII、EcoRI和BamHI的酶。
在本发明的另一个实施方案中，将所述嵌合体分成58个长度为40-65bp的重叠的寡核苷酸，它们每个以6-26个碱基对(bp)的间距进行分布。
在本发明的另一个实施方案中，所述嵌合体含有所述重叠的核苷酸，这些重叠的核苷酸具有13-18个核苷酸的重叠，并且其紧邻的寡核苷酸位于互补链上。
在本发明的另一个实施方案中，所述嵌合体具有44-55℃的Tm值。
在本发明的进一步的实施方案中，涉及在微生物中过表达杀虫嵌合蛋白Cry1E的方法。
在本发明的另一个实施方案中，将编码所述嵌合蛋白的SEQ ID No.2的基因Cry1E克隆进载体中。
在本发明的另一个实施方案中，用所述克隆载体转化微生物。
在本发明的另一个实施方案中，在所述微生物中过表达所述嵌合蛋白。
在本发明的另一个实施方案中，在选自细菌、藻类和真菌的微生物中表达所述嵌合体。
在本发明的另一个实施方案中，用于所述克隆的限制性内切酶选自HindIII、EcoRI、Ncol、MfeI和BamHI。
在本发明的另一个实施方案中，使用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导所述蛋白质的过表达。
在本发明的另一个实施方案中，于15℃过表达所述蛋白质以避免所述蛋白质的错误折叠。
在本发明的另一个实施方案中，所述载体选自质粒、病毒DNA和粘粒。
在本发明的另一个实施方案中，嵌合体在微生物中的表达通过RT-PCR、Western分析和ELISA来确认。
在本发明的另一个实施方案中，嵌合体在微生物中的存在通过PCR和Southern分析来确认。
在本发明的进一步的实施方案中，涉及用所述杀虫嵌合蛋白处理受昆虫侵害的植物的方法。
在本发明的另一个实施方案中，将编码嵌合蛋白Cry1E的基因整合入受昆虫侵害的植物中。
在本发明的另一个实施方案中，将转基因植物暴露于昆虫。
在本发明的另一个实施方案中，测定所述转基因植物的杀虫活性。
在本发明的另一个实施方案中，昆虫害虫选自灰翅夜蛾属物种和实夜蛾属物种(Helicoverpa sp.)。
在本发明的另一个实施方案中，植物选自烟草、棉花、鹰嘴豆、pegeonpea、花生、花椰菜、甘蓝、红辣椒和辣椒。
在本发明的另一个实施方案中，用于所述克隆的限制性内切酶选自HindIII、EcoRI、Ncol和BamHI。
在本发明的另一个实施方案中，嵌合蛋白显示出在植物中的高度表达，其占植物总溶解蛋白质的大约0.5％。
在本发明的另一个实施方案中，所述嵌合蛋白在所述转基因植物中是稳定的。
在本发明的另一个实施方案中，暴露于所述嵌合蛋白的昆虫在死亡之前显示出体重损失。
在本发明的另一个实施方案中，所述嵌合蛋白显示出抗处于所有发育阶段的昆虫的杀虫特性。
在本发明的另一个实施方案中，所述嵌合蛋白为具有比亲本蛋白高几倍的能力的杀虫剂。
在本发明的另一个实施方案中，所述嵌合蛋白的杀虫活性显示为，在大约4小时的暴露中有80-100％的昆虫害虫死亡率。
在本发明的另一个实施方案中，暴露于所述嵌合蛋白大约1小时的昆虫显示出延缓的发育、不育和中断的变态。
在本发明的另一个实施方案中，对于实夜蛾属物种的EC50为250-350ng/ml人工昆虫饲料。
在本发明的另一个实施方案中，对于灰翅夜蛾属物种的EC50为25-50ng/ml人工饲料。
在本发明的另一个实施方案中，所述方法对于转化植物的正常生长没有显示出不利影响。
在本发明的进一步的实施方案中，通过将δ-内毒素(此处称为Cry1Ea)的多肽结构域用其他δ-内毒素的相应结构域进行替换，并在C-末端用新的多肽进行替换，从而在策略上形成新型嵌合型苏云金芽孢杆菌δ-内毒素。在理论上设计一个基因并进行化学合成，以便编码新型嵌合型毒素，并且将该嵌合型毒素在植物组织中以高水平进行表达。将该基因在一种微生物(大肠杆菌)和两种双子叶植物(烟草和棉花)中表达。在这两个系统中证实在策略上设计出的δ-内毒素的效能。当与亲本蛋白相比较时，嵌合蛋白对于鳞翅目昆虫幼虫(灰翅夜蛾和实夜蛾)的毒性是得到增强的。嵌合型合成基因在商业上是有价值的，因为其可以用于形成在农业经济上于昆虫害虫的抗性方面得到改善的农作物植物。
在本发明的另一个实施方案中，本发明因此提供了“在杀虫活性方面得到改善的新型δ-内毒素和用于该新型δ-内毒素在植物中高水平表达的基因”，这包括以下步骤：通过将Cry1Ea蛋白的多肽结构域(530-587位)用Cry1Ca的多肽结构域(533-602位)进行替换，并在C-末端整合入新的25个氨基酸残基的多肽，从而在策略上设计出新型嵌合型δ-内毒素(此处称为Cry1E(616个氨基酸残基))；在理论上设计出一个基因，其编码在植物中以高水平表达的长度为641个氨基酸残基的嵌合型δ-内毒素；设计并化学合成代表了所述理论上设计出的基因的寡核苷酸；将寡核苷酸装配成双链DNA，克隆，并对于克隆得到的合成DNA进行序列分析；构建用于在大肠杆菌和植物中表达嵌合基因的载体；在大肠杆菌中表达合成的嵌合基因；比较嵌合蛋白与亲本蛋白抗斜纹灰翅夜蛾(Spodoptera litura)和棉铃虫的毒性；用嵌合基因转化烟草；在转基因植物中高水平表达经改造的蛋白质；从转基因植物中纯化出嵌合型δ-内毒素蛋白，并进一步确认其对于斜纹灰翅夜蛾和棉铃虫的幼虫的效能；评价在转基因植物中表达的嵌合型毒素抗目标昆虫的保护能力。
在本发明的一个实施方案中，对于天然存在的δ-内毒素即Cry1Ea进行策略上的设计，并由此进行修饰从而使得其具有抗昆虫害虫的幼虫的生物活性，例如灰翅夜蛾属物种。
在本发明的另一个实施方案中，通过将Cry1Ea的530-587位的肽结构域用Cry1Ca的533-602位的肽结构域进行替换从而在理论上设计出长度为616个氨基酸残基的嵌合型δ-内毒素(此处称为Cry1E)。此外，在δ-内毒素的C-末端引入25个氨基酸残基的新的多肽。
在本发明的另一个实施方案中，Cry1Ea的530-545位和578-587位的两个肽结构域可以用Cry1Ca的533-555位和588-602位的两个肽结构域进行替换。这样的嵌合型毒素也可以表现出类似的(或相等的)生物活性。
在本发明的另一个实施方案中，Cry1Ea的530-587位的肽结构域可以用其他δ-内毒素的肽结构域进行替换。
在本发明的另一个实施方案中，在δ-内毒素的C-末端引入25个氨基酸残基的多肽。该多肽改善了δ-内毒素抗植物蛋白酶的稳定性。该多肽可能改善了δ-内毒素在昆虫中肠中的稳定性。
在本发明的另一个实施方案中，在其他δ-内毒素的C-末端可以包含有长度为25个氨基酸残基的多肽，这种毒素可以稳定地抗不同种类的蛋白酶。
在本发明的另一个实施方案中，可以在任何重组蛋白质的C-末端整合入长度为25个氨基酸残基的多肽以增强它们抗蛋白酶的稳定性。
在本发明的另一个实施方案中，在理论上设计出1.99kb的双链DNA以编码该嵌合蛋白。使用植物首选的密码子来编码嵌合型毒素蛋白的氨基酸，以便促进该基因在植物中的高水平表达。
在EMBL数据库中给出了Cry1Aaδ-内毒素的6种变体，即Cry1Aal至Cry1Aa6。对于这些δ-内毒素蛋白的氨基酸序列的群分析显示在下面。在三个位置(77、148和302)上氨基酸残基是不同的。那些有变化的位置在下面以粗体字母显示。可是，所有的6个基因已经被不同的实验室用于毒性实验。所有的6种变体在它们对于昆虫的毒性方面的效能是相当的。
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可以引用的文献为Von Tersch等人，1991，“Insecticidal toxinsfrom Bacillus thuringiensis subsp kanyae：Gene cloning andcharacterization and comparison with B.thuringiensis subspkurstaki Cry1A(c)toxin”，Appl and Environ Microbial，57：2：349-58，其中从两个不同的菌株中分离得到了cry1Ac的两个变体。它们的氨基酸组成在7个位置上存在差异。将这两个δ-内毒素在大肠杆菌中表达，并进行毒性实验。这两个毒素在对于目标昆虫的效能中没有显示出任何差异。
此外，这清楚地表明，在蛋白质中，更特别是在内毒素的领域中，没有发现序列的高度同源性能够造成任何显著的活性上的差异。上面提及的内毒素Cry1Aa1至Cry1Aa6的例子清楚地反映了本工作的本质。在本申请中，申请者观察到了特别高的杀虫活性。此外，也发现在本申请的嵌合蛋白Cry1E的序列上的70％及以上同源性没有显示出活性上的显著变化。这意味着与嵌合蛋白Cry1E具有70％及以上序列同源性的蛋白质可用作杀虫剂。
在另一个研究(Schnepf等人，1998，“Bacillus thuringiensisand its pesticidal crystal proteins”，62：3，775-806)中，将Cry1Acδ-内毒素在312-314位上的氨基酸残基GYY分别改变为ASY、GSY和GFS。没有观察到这三个蛋白质的毒性之间的差异。
另外，存在有Cry1Cδ-内毒素的两个天然变体即Cry1Ca和Cry1Cb。这些蛋白质显示出81％的氨基酸序列同一性(Schnepf等人，1998，“Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystalproteins”，62：3，775-806)。尽管有这种差异，但是这两种毒素对于它们的目标害虫都是有毒性的，虽然在毒性水平上有着一些差异。它们的宿主范围也是一样的。(Kalman等人，1993，“Cloning of a novalcry1C type gene from a strain of Bacillus thuringiensis subspgalleriae”，Appl.Environ Microbial 59：4：1131-37)。
附图简述
图1显示了用PCR将58个重叠的寡核苷酸装配成1.99kb的新型嵌合型cry1E DNA。泳道2-4代表在不同PCR条件下的基因装配，所希望的DNA片段通过在显示了λDNA/HindIII-EcoRI分子量标记的泳道1上标注箭头而显示出来。
图2显示了在新型嵌合基因的上游具有E-35-S启动子的质粒pPK59的限制性内切酶酶切分析。该质粒用SalI限制性内切酶(基因下游40bp处)进行消化。线性质粒进一步用NcoI(泳道2)、NheI(泳道3)、BstXI(泳道4)、NruI(泳道5)和SacI(泳道6)进行消化。泳道1和7分别代表λDNA/HindIII-EcoRI和λDNA/HindIII分子量标记。
图3显示了质粒pPK202、pPK141、pPK135和pPK206的图谱。
图4显示了转基因烟草植物的昆虫生物测定。在表达新型嵌合型cry1E基因的转基因叶片上饲养2天之后，斜纹灰翅夜蛾的1龄幼虫显示出100％的死亡率(左)。对照叶片则被幼虫狼吞虎咽地吃掉了(右)。
图5显示了斜纹灰翅夜蛾的3龄幼虫在饲养2天之后显示出100％的死亡率(左)。与对照植物叶片(右)相比，转基因植物叶片显示出抗幼虫的高水平的保护。
图6显示了灰翅夜蛾的5龄幼虫在转基因烟草叶片上饲养48小时之后显示出100％的死亡率(左)。在同一过程期间，在对照植物叶片上饲养的幼虫摄取了6片叶片(右)。
在本发明的另一个实施方案中，设计58个寡核苷酸来代表1.99kb的嵌合型cry1E DNA。化学合成所有的寡核苷酸，并通过酶催化进行融合，从而获得所希望的双链DNA(请参考图1)。
在本发明的另一个实施方案中，制成两个独立的构建体，分别用于大肠杆菌和植物的表达。还将亲本基因(cry1Ea和cry1Ca)导入用于它们在大肠杆菌中表达的其他表达载体中。
在本发明的另一个实施方案中，将所有三个基因在大肠杆菌中表达。将嵌合型Cry1E抗斜纹灰翅夜蛾的效能与亲本毒素(Cry1Ea和Cry1Ca)进行比较。毒性实验表明，经改造的毒素比亲本蛋白的毒性高几倍。
在本发明的另一个实施方案中，在植物中表达的嵌合蛋白也显示出对于棉铃虫这一另一种严重的昆虫害虫的毒性。这表明在该研究中设计出的新型嵌合型毒素的宿主范围有了扩大。
在本发明的另一个实施方案中，将合成基因导入烟草中以表达嵌合型毒素。转基因植物表达了嵌合型毒素，并积聚至总溶解蛋白质的0.5％。转基因植物显示出抗斜纹灰翅夜蛾的幼虫的良好保护，并在所有发育阶段造成100％的死亡率。
在本发明的另一个实施方案中，从来自转基因烟草植物的叶片的总溶解蛋白质中纯化出新型嵌合型毒素，并混合在半合成饲料中。毒性实验再次表明了杂合毒素的效能。
本发明涉及高活性嵌合型δ-内毒素的发现。通过将Cry1Ea蛋白的多肽结构域(530-587位)用Cry1Ca的多肽结构域(533-602位)进行替换从而在策略上设计出长度为641个氨基酸残基的新型δ-内毒素(此处称为嵌合型Cry1E)。在这种方式中，嵌合型毒素含有Cry1Ea的氨基酸残基1-529、Cry1Ca的氨基酸残基530-599和Cry1Ea的氨基酸残基600-616。25个氨基酸残基的新的多肽作为δ-内毒素的C-末端而包括在其中。换句话说就是该多肽构成了嵌合型毒素的氨基酸残基617-641。通过将Cry1Ea的不同部分用在策略上设计出的氨基酸序列或者其他毒素的部分进行替换可以形成几个嵌合型毒素。在理论上设计出1.99kb的核苷酸序列以编码上面提及的嵌合型δ-内毒素。设计出编码毒素蛋白的基因(此处称为cry1E)以便通过引入植物首选的密码子来获得植物中的高水平表达。每个氨基酸的植物首选的密码子均匀地分布以促进有效的翻译。在5’-末端引入适合于植物中的基因表达的翻译起始邻近序列(TAAACCATGGCT)，并在嵌合型毒素的读码框的末端引入两个翻译终止密码子(信号)。将总共33个唯一的限制位点以40-80bp的间距均匀地引入基因的全部长度之中。在基因的上游创建BamHI和HindIII限制位点，并在基因的下游创建BamHI和EcoRI限制位点，以便使得其克隆变得容易。(请参考图2)。
翻译起始邻近序列自动在基因的紧靠着起始的地方形成NcoI位点。将基因分成58个重叠的寡核苷酸(长度为40-65个核苷酸)，它们相互之间有长度为6-26个碱基的间隙(请参考图1)。每个寡核苷酸具有长度为13-18个核苷酸的重叠，并且其紧邻的寡核苷酸位于互补链上。设计互补的重叠以保持Tm值位于48-50℃。在DNA合成仪(GeneAssembler Special，Pharmacia，瑞典)上以200nmole的规模合成寡核苷酸，并在变性尿素-PAGE上进行纯化。依照Singh等人(1996)的无连接基因合成方法将所有58个寡核苷酸装配成1.99kb的双链DNA(此处称为嵌合型cry1E基因)，这显示在图1中。用HindIII和EcoRI限制性内切酶消化该DNA，并克隆进pBluescriptII SK(+)(Stratagene，La Jolla，CA)中。将该质粒命名为pPK200。合成DNA的核苷酸序列通过在自动DNA测序系统(Applied Biosystems 373A型)上对克隆得到的合成DNA进行测序而加以确认。
还构建了盒(cassette)以用于在T71ac启动子的控制下于大肠杆菌中表达嵌合型毒素。用限制性内切酶NcoI和BamHI消化质粒pPK200，并克隆进表达载体pET-19b(Novagen，Madison WI)中。将该质粒命名为pPK206。通过聚合酶链反应扩增编码Cry1Ca和Cry1Ea毒素的DNA，其使用能够在扩增子的上游和下游形成NcoI和BamHI限制位点的合适的引物。将扩增出的产物克隆进pET-19b载体中。将具有编码Cry1Ca和Cry1Ea毒素的DNA的构建体分别命名为pPK135和pPK141。用构建体pPK206、pPK135和pPK141转化大肠杆菌BL21DE3菌株。(请参考图3)。通过用合适浓度的IPTG进行诱导而表达毒素蛋白。表达于15℃进行以避免可能的错误折叠。用溶菌酶裂解大肠杆菌细胞，并进行超声处理，以释放出δ-内毒素。在包含体中发现有毒素蛋白。将这些包含体于28℃溶解在50mM的碳酸氢盐缓冲液(pH9.5)中。毒素蛋白通过光密度测定方法进行定量。将系列稀释的毒素混合入半合成饲料中，并将混合物倒入培养皿中。总大肠杆菌蛋白质用作对照饲料。将15条斜纹灰翅夜蛾的新生幼虫释放到置于100-ml烧杯中的饼状饲料混合物之上，并用薄纱织物覆盖杯口以允许空气交换。每个实验重复进行六次。每隔一天之后更换一次饲料。生物测定以16/8小时的光周期于25±0.2℃进行。在饲养7天之后记录毒性数据。EC50通过标准的log-概率值分析来测定。全部三种蛋白质同时进行测定。具有代表性的结果显示于下面的表1中。
表1
| δ-内毒素(S) | EC50(μg/ml半合成饲料) |
| Cry1Ea | ＞108 |
| Cry1Ca | 29.48±1.77 |
| 嵌合型Cry1E | 6.27±0.59 |
结果显示了表达嵌合型毒素的大肠杆菌菌株具有超过Cry1Ea蛋白几倍的毒性，和具有超过Cry1Ca蛋白4倍以上的毒性。Cry1Ea毒素蛋白不能对灰翅夜蛾幼虫产生任何影响。结果表明成功地改造了Cry1Ea毒素而形成新型蛋白质即嵌合型Cry1E，其具有生物活性，并且为经改良的毒素。经改造的蛋白质具有比Cry1Ca蛋白高4倍的毒性，Cry1Ca蛋白是最众所周知的抗灰翅夜蛾属物种的δ-内毒素。
还将全部三种δ-内毒素进行抗实夜蛾属物种的72小时大小的幼虫的测试。将每只幼虫释放在置于分离的盒中的饲料上。用每种浓度的毒素测试40只幼虫。毒性结果显示出嵌合型毒素对于实夜蛾也具有毒性。具有代表性的结果显示于下面的表2中。
表2
| δ-内毒素(S) | EC50(μg/ml半合成饲料) |
| Cry1Ea | ＞176 |
| Cry1Ca | 136.22±8.77 |
| 嵌合型Cry1E | 26.71±1.39 |
在此处使用时，“毒素”表示对于杀昆虫害虫的活性起着重要作用的N-末端部分。本领域熟练技术人员能够通过添加同源或异源δ-内毒素的部分或完整C-末端片段而将该毒素转化为前毒素。这种前毒素将会是在微生物细胞(例如大肠杆菌、假单胞菌(Pseudomonas)等等)中非常稳定的分子，并可以用于形成微生物配剂。这种配剂可以用作杀虫剂。用由我们开发出的新型毒素来形成这种前毒素和配剂也在我们所要求保护的发明的范围之内。
根据本发明有用的基因和毒素不仅包括长度为641氨基酸的毒素，而且包括所述新的序列的片段、变体和突变体，它们保持了此处特别地举例说明的毒素的特征性杀虫活性。在此处使用时，术语基因的“变体”或“变异体”是指编码同样的毒素或编码具有较低或相等杀虫活性的毒素的核苷酸序列。在此处使用时，术语“相等的杀虫活性”是指具有与所要求保护的毒素具有类似的或基本上同样的抗目标害虫生物活性的毒素。
本领域经训练的技术人员可以很容易地创建出另外的编码同样或基本同样的毒素的DNA序列。这些变体DNA序列在本发明的范围之内。在此处使用时，“基本上同样的”序列是指具有氨基酸的替换、缺失、添加或插入但没有实质性地影响杀虫活性的序列。保持了杀虫活性的片段也包括在此定义之内。
本发明的新型嵌合型毒素已经在此处特别地进行了举例说明。应当显而易见的是，本发明包括具有与举例说明的毒素同样或类似的杀虫活性的变体或者相当的毒素(和编码相当的毒素的核苷酸序列)。相当的毒素会与举例说明的毒素具有氨基酸同源性。这一氨基酸同源性通常会高于75％，优选高于90％，最优选高于95％。这一氨基酸同源性在毒素的关键性区域中是最高的，这些关键性区域造成了生物活性的出现，或者参与了三维构型的决定，这种三维构型最终对于生物活性起着重要作用。在这一点上，某些氨基酸替换是可接受的和可以希望的，如果这些替换位于对于生物活性来说不是关键性的区域之中，或者这些替换是不影响分子的三维构型的保守氨基酸替换。例如，氨基酸可以分为下列类别：非极性的、无电荷的极性的、碱性的和酸性的。将一个类别的一个氨基酸用同一类别的另一个氨基酸进行替换的保守替换在本发明的范围之内，只要该替换不实质性地改变δ-内毒素的生物活性。下面给出的表3提供了属于每个类别的氨基酸的例子的列表。
表3
| 氨基酸的类别 | 氨基酸的例子 |
| 非极性的 | Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp |
| 无电荷的极性的 | Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln |
| 酸性的 | Asp、Glu |
| 碱性的 | Lys、Arg、His |
在一些情况下，也可以进行非保守的替换。关键性的因素是这些替换一定不能显著地降低毒素的生物活性。在蛋白质工程领域经训练的技术人员的能力之内，可以用丙氨酸替换嵌合型毒素的任何氨基酸。任何氨基酸的这种替换是最安全的，因为丙氨酸是常见的氨基酸。这种替换也正好位于本发明的范围之内。
可以将编码本发明的嵌合型毒素的基因导入很多种微生物或植物宿主中。毒素基因的表达直接或间接地导致在细胞内产生和维持杀虫嵌合型毒素。使用合适的微生物宿主例如假单胞菌可以将微生物施用于害虫增殖的地点。这将会导致控制住害虫。可选择地，含有毒素基因的微生物可以在延长毒素的活性和稳定细胞的条件下进行处理。然后可以将保持了毒性活性的经处理的细胞施用于目标害虫的环境中。当将编码嵌合型毒素的基因通过合适的载体导入微生物宿主中，并将该宿主以有生命状态施用于环境中时，必要的是使用某些宿主微生物。选择那些已知占据了一种或多种目标农作物的“植物圈”(叶面、叶圈、根际和/或根面)的微生物。选择这些微生物以致能够成功地在特殊环境(农作物和其他昆虫生活环境)中与野生型微生物进行竞争，从而能够稳定地维持和表达表达多肽杀虫剂的基因，和按希望能够更好地保护杀虫剂不受环境降解和失活的影响。
已知大量的微生物存在于很多种重要农作物的叶面(植物叶片的表面)和/或根际(围绕植物根的土壤)。这些微生物包括细菌、藻类和真菌。其中特别感兴趣的微生物例如为细菌，如假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、嗜甲基菌属(Methylophilius)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotoba cter)、明串珠菌属(Leuconostoc)和产碱菌属(Alcaligenes)；真菌，特别是酵母，如酵母属(Saccharomyces)、隐球酵母属(Cryptococcus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)和短梗霉属(Aureobasidium)。其中特别感兴趣的是那些植物圈的细菌物种，如丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、根瘤土壤杆菌(Agrobactetiumtumefaciens)、类球红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroids)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿根瘤菌(Rhozobiummelioti)、真养产碱菌(Alcaligenes entrophus)和棕色固氮菌(Azotobacter vinlandii)；和那些植物圈的酵母物种，如深红酵母(Rhodotorula rubra)、黏红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄红酵母(R.aurantiaca)、浅白隐球酵母(Cryptococcusalbidus)、流散隐球酵母(C.diffluens)、罗伦隐球酵母(C.laurentii)、罗斯酵母(Saccharomyces rosei)、普地酵母(S.pretoriensis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、掷孢酵母(Sporobolomycesroseus)、香气掷孢酵母(S.odorus)、佛地克鲁维酵母(Kluyveromycesveronae)和出芽短梗霉(Aureobasidium pollulans)。其中特别感兴趣的是有颜色的微生物。有很多种方法可用于在这样的情况下将编码嵌合型毒素的基因导入微生物宿主之中，即这种情况使得能够稳定地维持和表达该基因。这些方法对于本领域的熟练技术人员来说是熟知的，并描述于例如U.S.Pat.No.5,135,867之中，此处引用作为参考。
构建植物转化载体以形成转基因植物。将质粒pPK58(含有具有双重增强子的CaMV35S启动子)用BamHI和HindIII进行消化，并将质粒pPK200用HindIII和EcoRI进行消化，以便分别切出具有双重增强子的CaMV35S启动子和嵌合型cr1E基因。施行三重连接以便将这两个片段克隆进pLITMUS38克隆载体(New England Biolabs)中。该质粒即pPK59在嵌合基因的上游含有具有双重增强子的CaMV35S启动子。pPK59的限制性内切酶酶切分析显示在图2中。在嵌合基因的下游克隆了nos转录终止子。扩增nos聚腺苷酸化元件的DNA，这是使用pBI101.1作为模板并使用能够分别在上游和下游形成MfeI和EcoRI限制位点的合适的引物来进行的。用EcoRI消化质粒pPK59，并在用MfeI和EcoRI限制性内切酶消化之后克隆PCR产物。挑选出这样的克隆并命名为pPK201，即在该克隆中合成基因的EcoRI限制位点与nos终止子的MfeI位点相连(因为它们具有匹配末端)。通过限制性内切酶酶切分析还可以通过测序来确认nos终止子的正确方向。将表达盒(具有E-35S启动子和nos终止子的合成的cry基因)克隆进Ti二元载体中。将质粒pPK201的BamHI-EcoRI片段克隆进pBI101.1中以替换pBI101.1的BamHI-EcoRI片段(uidA基因和nos终止子)。将该二元载体命名为pPK202。大肠杆菌和植物表达载体的图谱显示在图3中。
为了研究嵌合型Cry1E毒素在植物中的效能，选择烟草用于表达。根据由Cangelosi等人(1991)所讨论的“土壤杆菌的电穿孔”的修改方案，用二元载体pPK202转化含有辅助质粒pAL4404的根瘤土壤杆菌菌株LBA 4404，并将经转化的菌落对于抗生素链霉素、利福平和卡那霉素进行选择。根据Horsch等人(1985)的方法进行土壤杆菌介导的烟草栽培品种Patit Havana(Nicotiana tobacum cv.Patit Havana)的转化，并将转基因植物对于抗生素卡那霉素进行选择。编码嵌合型毒素的基因的存在通过PCR和Southern分析来确认，转基因的表达通过RT-PCR、Western分析和ELISA来加以确定。ELISA结果显示出，在选择出的转基因品系中，在总溶解叶蛋白质之中毒素蛋白有0.5％的表达。该高水平的表达是设计了在其中专门使用植物首选密码子的基因的结果。在该研究中使用的植物首选翻译起始邻近序列也会在获得增强的表达中起重要的作用。
使用两个月大小的转基因植物和斜纹灰翅夜蛾的1龄与5龄幼虫来施行昆虫生物测定。(请参考图4-6)。将15cm2的转基因植物和对照植物的叶片圆盘置于在底部含有弄湿的纸的圆柱形盒子之中，然后在它们上面释放10条1龄幼虫。盒口用湿的薄纱织物覆盖以保持足够的湿度和空气交换。于25±0.2℃重复三次进行毒性实验，并保持16/8小时的光周期。在使用5龄幼虫的生物测定中，使用完整的转基因植物和对照植物的叶片。将叶柄置于位于含有MS盐溶液的250ml烧瓶上方的棉花塞之中，以克服叶片的萎蔫。在每个叶片上允许饲养5条昆虫幼虫。对照植物的叶片每8小时之后进行更换，它们被昆虫幼虫完全吃光了。
结果(图4和6)表明，1龄以及5龄幼虫在48-72小时之内死亡。被1龄幼虫吃掉的叶片的数量与被狼吞虎咽地吃掉的对照植物叶片圆盘相比是可以忽略的。摄取大约1cm2的转基因叶片就足够杀死5龄幼虫。这些幼虫在转基因叶片上饲养8-16小时之后显现出濒死的状态，并最后在2-3天之内死亡。在叶片表面上观察到具有高水份含量的绿色排泄物。一些幼虫在死亡之前显示出严重的体重损失。在一个分开的实验中，让不同龄期的幼虫在转基因植物的叶片上饲养1小时、2小时、4小时、8小时和16小时，然后将它们转移至对照植物叶片上。观察到在转基因植物上饲养8小时足够引起处于所有发育阶段的幼虫的100％死亡率，甚至是在非转基因植物上饲养之后。年幼的幼虫摄取非常少量的毒素，这将它们的蛹化从15天的正常幼虫周期延迟了10-15天。少数逃脱死亡的幼虫发育成蛾。40％的使用这种蛾的配对交配得到了卵。可是，这些卵是不育的和不能孵化。从转基因烟草植物中提取总溶解蛋白质，并上载至Sepharose Q离子交换柱上。用梯度增加的氯化钠洗脱下蛋白质，汇集含有δ-内毒素的峰，并在G10柱上进行脱盐。将洗脱下的蛋白质混合入半合成饲料中。也进行类似的从非转基因烟草植物的叶片中的蛋白质提取和纯化，并将这种植物蛋白质用作对照。依照前面的讨论施行毒性实验。对于斜纹灰翅夜蛾和棉铃虫的EC50为37ng/ml人工饲料和285ng/ml人工饲料。结果再次确认了嵌合型δ-内毒素对于目标昆虫害虫的效能。
用于控制昆虫害虫的新型δ-内毒素和用于该新型δ-内毒素在植物中高水平表达的基因，这包括下列步骤：在理论上设计一种新型δ-内毒素(此处称为嵌合型Cry1E)，这是通过将Cry1Ea蛋白的多肽结构域(530-587位)用Cry1Ca的多肽结构域(533-602位)进行替换，并在蛋白质的C-末端加入新的长度为25个氨基酸残基的多肽以增加稳定性，从而设计出来的；在理论上设计出用于在植物中以高水平表达嵌合型δ-内毒素的基因；设计并化学合成代表了理论上设计出的基因的寡核苷酸；将寡核苷酸装配成双链DNA，克隆，并对于克隆得到的合成DNA进行序列分析；构建用于在大肠杆菌和植物中表达嵌合基因的载体；在大肠杆菌中表达合成基因；比较嵌合蛋白与亲本蛋白抗斜纹灰翅夜蛾的毒性；用嵌合基因转化植物如烟草；在转基因植物中高水平表达经改造的蛋白质；和评价嵌合型毒素在转基因植物中抗斜纹灰翅夜蛾的保护能力。
在本发明的另一个实施方案中，涉及Cry1Ea的氨基酸1-529、Cry1Ca的氨基酸530-599、Cry1Ea的氨基酸600-616和新型多肽的氨基酸617-641，以及其在结构上和/或在功能上相当的变体或其片段。
在本发明的另一个实施方案中，所述毒素具有SEQ ID No.1中显示的氨基酸序列；并且显示出比亲本毒素Cry1Ea和Cry1Ca高几倍的对于目标鳞翅目昆虫的毒性。
在本发明的另一个实施方案中，编码具有抗鳞翅目昆虫活性的嵌合型毒素的嵌合型cry1E基因具有SEQ ID No.2中显示的核苷酸序列或其片段。
在本发明的另一个实施方案中，使用该蛋白质控制鳞翅目害虫的方法使用有效剂量的就这样应用的毒素，或者使用有效剂量的作为化学或微生物配剂的组分进行应用的毒素。
在本发明的另一个实施方案中，重组DNA转移载体含有编码具有抗鳞翅目昆虫活性的毒素的多核苷酸序列，其中该多核苷酸序列具有SEQID No.2的核苷酸序列或其片段。
在本发明的另一个实施方案中，用该基因转化重组宿主。
在本发明的另一个实施方案中，所述宿主为微生物，例如大肠杆菌、假单胞菌、酵母、蓝细菌和/或其他微生物。
在本发明的另一个实施方案中，所述的经转化的宿主为表达毒素的植物，例如烟草、棉花、鹰嘴豆、pegeonpea、花生、花椰菜、甘蓝、红辣椒、辣椒和/或其他植物，其中该毒素具有SEQ ID No.1的氨基酸序列，或者其具有相等的抗鳞翅目昆虫活性的变体。
在本发明的进一步的实施方案中，本申请清楚地表明，在蛋白质中更特别是在内毒素的领域中，没有发现序列的高度同源性能够造成任何显著的活性上的差异。上面提及的内毒素Cry1Aal至Cry1Aa6的例子清楚地反映了本工作的本质。在本申请中，申请者观察到了特别高的杀虫活性。此外，也发现在本申请的嵌合蛋白Cry1E的序列中的70％及以上同源性没有显示出活性上的显著变化。这意味着与嵌合蛋白Cry1E具有70％及以上序列同源性的蛋白质可用作杀虫剂。
下面的实施例是作为举例说明而给出的，因此不应当将它们解释为限制了本发明的范围。
实施例1
在大肠杆菌中表达的新型嵌合型Cry1E对于鳞翅目昆虫害虫的幼虫的相当的毒性
通过将Cry1Ea蛋白的多肽结构域(530-587位)用Cry1Ca的多肽结构域(533-602位)进行替换从而在策略上设计出长度为616个氨基酸残基的嵌合型δ-内毒素(此处称为嵌合型Cry1E)。如前所述在C-末端附加地包含有25个氨基酸残基的多肽。在理论上设计出1.99kb的核苷酸序列以编码上面提及的嵌合型δ-内毒素。每个氨基酸的密码子均匀地分布以避免在翻译期间暂时的tRNA缺乏。在所设计的基因中形成几个6碱基切割体限制性内切酶酶切位点。在所设计的基因的5’-末端形成BamHI、HindIII和NcoI限制位点，和在3’-末端形成EcoRI限制位点。将基因分成58个重叠的寡核苷酸(长度为40-65个核苷酸)。每个寡核苷酸具有长度为13-18个核苷酸的重叠，其紧邻的寡核苷酸位于互补链上(Tm位于48-50℃)。在DNA合成仪(Gene Assembler Special，Pharmacia，瑞典)上以200nmole的规模合成寡核苷酸，并在变性尿素-PAGE上进行纯化。依照Singh等人(1996)的无连接基因合成方法将所有58个寡核苷酸装配成双链DNA(此处称为嵌合型cry1E基因)，这显示在图1中。用HindIII和EcoRI限制性内切酶消化该DNA，并克隆进pBluescriptII SK(+)(Stratagene)中。将该质粒命名为pPK200。合成DNA的核苷酸序列通过在自动DNA测序系统(Applied Biosystems373型)上对克隆得到的合成DNA进行测序而加以确认。
还构建了盒以用于在T7启动子的控制下于大肠杆菌中表达嵌合型毒素。为此，用限制性内切酶NcoI和BamHI消化质粒pPK200，并克隆进表达载体pET-19b(Novagen)中。将该质粒命名为pPK206。通过聚合酶链反应扩增编码Cry1Ea和Cry1Ca的毒素部分的DNA，其使用分别在两个DNA中能够在扩增子的上游和下游形成NcoI和BamHI限制位点的合适的引物。将扩增出的产物于NcoI和BamHI位点克隆进同一载体(pET-19b)中。如前所述将具有Cry1Ea毒素DNA的构建体命名为pPK141，和将具有Cry1Ca毒素DNA的构建体命名为pPK135。用构建体pPK141、pPK135和pPK206转化大肠杆菌BL21DE3菌株。通过用合适浓度的IPTG进行诱导而表达毒素蛋白。表达于15℃进行以避免任何可能的毒素的错误折叠。毒素蛋白在变性聚丙烯酰胺凝胶上通过光密度测定方法进行定量。将系列稀释的毒素混合入半合成饲料中。总大肠杆菌蛋白质用作饲料中的对照。将15条斜纹灰翅夜蛾的新生幼虫释放到置于100-ml烧杯中的饼状饲料混合物之上，并用薄纱织物覆盖杯口以允许空气交换。每个实验重复进行六次。每隔一天之后更换一次饲料。生物测定以16/8小时的光周期于25±0.2℃进行。在饲养7天之后记录毒性数据。EC50通过标准的log-概率值分析来测定。全部三种蛋白质同时进行测定。具有代表性的结果显示于下面给出的表4中。
表4
| δ-内毒素(S) | EC50(μg/ml半合成饲料) |
| Cry1Ea | ＞108 |
| Cry1Ca | 29.48±1.77 |
| 嵌合型Cry1E | 6.27±0.59 |
结果显示了嵌合型毒素具有超过Cry1Ea蛋白几倍的毒性，和具有超过Cry1Ca蛋白4倍的毒性。Cry1Ea毒素蛋白不能引起任何灰翅夜蛾幼虫的死亡或生长阻滞。结果表明成功地改造了Cry1Ea毒素而将其转变为具有生物活性并得到改善的毒素。经改造的蛋白质具有比Cry1Ca蛋白更高的毒性，Cry1Ca蛋白是最众所周知的抗灰翅夜蛾属物种的δ-内毒素。
用棉铃虫的幼虫来施行类似的毒性实验。在这种情况下，将72小时大小的幼虫释放在含有三种蛋白质中的一种的半合成饲料上，并且每个盒中只释放1条幼虫。在饲养7天之后记录体重损失。具有代表性的结果显示于下面的表5中。
表5
| δ-内毒素(S) | EC50(μg/ml半合成饲料) |
| Cry1Ea | ＞176 |
| Cry1Ca | 136.22±8.77 |
| 嵌合型Cry1E | 26.71±1.39 |
结果表明，由我们设计的新型嵌合型δ-内毒素不仅对于灰翅夜蛾更具有毒性，而且抗实夜蛾也是有效的。该设计已经扩大了毒素的宿主范围，以及以相当大的程度将毒性增强至超过亲本蛋白。
实施例2
表达新型嵌合型Cry1E蛋白的转基因植物的高度幼虫毒性
为了确认新型嵌合型毒素在植物中的效能，构建一个植物转化载体以用于形成转基因植物。将质粒pPK58(含有具有双重增强子的CaMV35S启动子)用BamHI和HindIII进行消化，并将质粒pPK200用HindIII和EcoRI进行消化，以便分别切出具有双重增强子的CaMV35S启动子和嵌合型cry1E基因。施行三重连接以便将这两个片段克隆进pLITMUS38克隆载体(New England Biolabs)中。将该质粒命名为pPK59，其在嵌合基因的上游含有具有双重增强子的CaMV35S启动子。在嵌合基因的下游克隆了nos转录终止子。扩增nos聚腺苷酸化元件，这是使用pBI101.1作为模板并使用能够分别在上游和下游形成MfeI和EcoRI限制位点的合适的引物来进行的。用EcoRI消化质粒pPK59，并在用MfeI和EcoRI限制性内切酶消化之后克隆PCR产物。挑选出这样的克隆并命名为pPK201，即在该克隆中合成基因的EcoRI限制位点与nos终止子的MfeI位点相连(因为它们具有匹配末端)。通过限制性内切酶酶切分析还可以通过DNA测序来确认nos终止子的正确方向。将表达盒(具有E-35S启动子和nos终止子的合成的cry基因)克隆进Ti二元载体中。将质粒pPK201的BamHI-EcoRI片段克隆进pBI101.1中以替换pBI101.1的BamHI-EcoRI片段(uidA基因和nos终止子)。将该二元载体命名为pPK202。大肠杆菌和植物表达载体的构建示意性地显示在图3中。该构建体具有多核苷酸序列TAAACC
ATG
GCT作为植物首选的翻译起始邻近序列，在合成基因中导入
TAA
TGA用于翻译终止。根据由Cangelosi等人(1991)所讨论的“土壤杆菌的电穿孔”的修改方案，用二元载体pPK202转化含有辅助质粒pAL4404的根瘤土壤杆菌菌株LBA4404，并将经转化的菌落对于抗生素链霉素、利福平和卡那霉素进行选择。根据Horsch等人(1985)的方法进行土壤杆菌介导的烟草栽培品种Patit Havana(Nicotiana tobacum cv.Patit Havana)的转化，并将转基因植物对于抗生素卡那霉素进行选择。编码嵌合型毒素的基因的存在通过PCR和Southern分析来确认，转基因的表达通过RT-PCR、Western分析和ELISA来加以确定。ELISA结果显示出，在选择来用于这些实验的转基因品系中，在总溶解叶蛋白质之中毒素蛋白有0.5％的表达。该高水平的表达是设计了在其中专门使用植物首选密码子的基因的结果。植物首选的翻译起始邻近序列也会在表达中起重要的作用。使用两个月大小的转基因植物和斜纹灰翅夜蛾的新生幼虫来施行昆虫生物测定。将15cm2的转基因植物和对照植物的叶片圆盘置于在底部含有弄湿的纸的圆柱形盒子之中，然后在它们上面释放10条1龄幼虫。盒口用湿的薄纱织物覆盖以保持足够的湿度和允许空气交换。于25±0.2℃重复六次进行毒性实验，并保持16/8小时的光周期。结果(图4)显示出表达新型嵌合蛋白的转基因植物对于斜纹灰翅夜蛾的新生幼虫具有高度的毒性，其在饲养48小时之内引起100％的死亡率。昆虫幼虫对于叶片圆盘所造成的损害与被几乎完全吃光的对照植物叶片圆盘相比是可以忽略的。转基因植物的高水平的保护以及由于在转基因植物上进行饲养而造成的灰翅夜蛾幼虫的死亡再次证明了嵌合型毒素和转基因植物的效能。
实施例3
嵌合型Cry1E蛋白对于灰翅夜蛾物种处于所有发育阶段的幼虫的高毒性
对于1龄(3天大小)、3龄(7天大小)和5龄(12天大小)幼虫进行生物测定以确定在转基因植物中表达的经改造的蛋白质的效能。用1龄幼虫所进行的生物测定已经在实施例2中进行了讨论。使用完整的转基因植物和对照植物的叶片来饲养高级阶段的幼虫。将叶柄置于位于含有MS盐溶液的250ml烧瓶上方的棉花塞之中，以克服叶片的萎蔫。在每个叶片上允许饲养5条昆虫幼虫。饲养3龄(图5)和5龄(图6)幼虫的对照植物的叶片分别在16小时和8小时之后进行更换，因为它们被昆虫幼虫完全吃光了。结果表明，在转基因叶片上饲养引起处于所有发育阶段的幼虫在48小时之内死亡。摄取大约1cm2的转基因叶片就足够杀死5龄幼虫。这些幼虫在转基因叶片上饲养8-16小时之后显现出濒死的状态，并最后在2天之内死亡。在叶片表面上观察到具有高水份含量的绿色排泄物。一些幼虫在死亡之前显示出严重的体重损失。
在一个分开的实验中，让不同龄期的幼虫在转基因植物的叶片上饲养1小时、2小时、4小时、8小时和16小时，然后将它们转移至对照植物叶片上。观察到在转基因植物上饲养4小时足够引起处于所有发育阶段的幼虫的100％死亡率，甚至是当它们随后在非转基因植物上进行饲养。年幼的幼虫摄取非常少量的毒素，这会超过15天的正常幼虫周期而将它们的蛹化延迟10-15天。少数逃脱死亡的幼虫发育成蛾。40％的使用这种蛾的配对交配得到了卵。可是，这些卵是不育的和不能孵化。至今还没有在文献中报道δ-内毒素对于高级阶段的昆虫幼虫的毒性。高水平的毒性可能是由于嵌合型毒素在昆虫幼虫中肠中的更高的稳定性，或者是由于改善了的δ-内毒素的受体结合能力和成孔能力。该实施例再次表明嵌合型毒素抗灰翅夜蛾物种的能力。因为实夜蛾不喜欢吃烟草叶，所以不能对实夜蛾进行使用转基因烟草植物的毒性实验。
实施例4
从表达δ-内毒素的转基因烟草植物的叶中制备得到的新型嵌合型Cry1E蛋白的高毒性
从转基因烟草的叶中制备总溶解蛋白质。将新鲜的叶组织在液氮条件下磨成粉，然后悬浮在5倍体积的蛋白质提取缓冲液(Tris Cl，20mM，pH9.5；EDTA 2mM，pH8.0；NaCl，50mM；DTT，1mM；PVP2％和PMSF，100mM)中。将该悬浮液充分混合，并离心两次(20,000×g，20分钟和4℃)。将上清液上载至Sepharose Q柱(10cm×2.5cm)上。用在提取缓冲液中的梯度增加的NaCl洗脱下蛋白质，并收集100个5ml的级分。用ELISA检测δ-内毒素。汇集含有δ-内毒素的级分。将已知数量的从植物中纯化出的δ-内毒素混合入半合成饲料中。如前面实施例的描述，用3天大小的斜纹灰翅夜蛾和棉铃虫的幼虫进行毒性试验。结果显示出，对于灰翅夜蛾和实夜蛾的EC50(对于50％的致死率所需的浓度)为42.39±1.72ng/ml半合成饲料和283.11±8.29ng/ml半合成饲料。该结果进一步证明了对于灰翅夜蛾和实夜蛾的幼虫的高水平毒性。值得注意的一点是，在植物组织中制造出的杀虫晶体蛋白比在大肠杆菌中制造出的同样的蛋白质更具有毒性。可能是δ-内毒素在植物细胞质中折叠得更好，不能否认一些未鉴定的侣伴蛋白在这种折叠中的作用。
实施例5
嵌合型δ-内毒素在植物组织中的稳定性
如前面所讨论的，提取转基因植物的总溶解叶蛋白质，并于4℃和28℃进行温育。将它们用于毒性试验。在前者的情况下每2天取出样品，在后者的情况下每天取出样品。将总的粗制蛋白质混合入半合成饲料中，并用斜纹灰翅夜蛾的新生幼虫进行毒性实验。在饲养7天之后记录昆虫死亡率数据，并计算LC50。结果显示在下面的表6和表7中。
表6
| S.No | 粗制蛋白质在4℃的温育时间(天) | LD50(ng/ml半合成饲料) |
| 1. | 2 | 48.71±2.4 |
| 2. | 4 | 57.87±2.96 |
| 3. | 6 | 66.44±3.65 |
| 4. | 8 | 70.19±3.55 |
| 5. | 12 | 73.82±3.1 |
| 6. | 16 | 74.37±3.67 |
表7
| S.No | 粗制蛋白质在28℃的温育时间(天) | LD50(ng/ml半合成饲料) |
| 1. | 1 | 76.44±3.3 |
| 2. | 2 | 98.13±4.6 |
| 3. | 3 | 143.46±8.5 |
| 4. | 4 | --- |
| 5. | 5 | --- |
结果证实了由我们所设计的嵌合型δ-内毒素抗植物蛋白酶的稳定性。嵌合型毒素在4℃温育多于16天是稳定的，在28℃温育3天是稳定的，并引起超过80％的死亡率。LC50随着时间的增加大概是由于毒素有一些降解。
本发明的主要优点为：
1.改造Cry1Eaδ-内毒素以获得新型嵌合型毒素，此处称为嵌合型Cry1E。嵌合蛋白的毒性比亲本毒素或其他据报道具有抗灰翅夜蛾的功能的δ-内毒素高几倍。当该嵌合蛋白在植物中形成时，其杀幼虫活性是非常高的。
2.设计编码嵌合型毒素的基因以便在大肠杆菌和植物中表达。因此，其可以用于改造微生物以表达嵌合型毒素，该嵌合型毒素可以用于制备微生物配剂。同样的基因还可以用于遗传工程改造植物以获得昆虫抗性。我们已经表明了，我们所设计的序列造成嵌合型毒素在转基因烟草和棉花叶(此处未包括结果)中的非常高水平的表达(总溶解蛋白质的0.5％)。
3.表达嵌合型毒素的转基因植物具有非常高度的抗处于所有发育阶段的斜纹灰翅夜蛾幼虫的保护。它们在于转基因植物上饲养2-3天之内死亡。至今还没有报道这种转基因植物抗任何鳞翅目昆虫的高水平毒性。该蛋白质还可能有效地抗许多其他的昆虫幼虫。我们的结果表明该毒素对于抗实夜蛾也是有效的。
4.通过在转基因植物上进行短期的饲养进一步证实了嵌合型毒素在转基因植物中的效能。饲养4小时引起处于所有发育阶段的灰翅夜蛾幼虫的100％死亡率。饲养非常短的时间(1小时以内)延缓了幼虫的发育和干扰了变态。这种蛋白质可能在保护农业经济上重要的农作物和森林中非常有价值。编码嵌合型毒素的基因可以用于形成转基因植物和/或在微生物中产生可用于微生物配剂的毒素。
5.因为表达新型嵌合型毒素的转基因植物引起灰翅夜蛾幼虫在非常短时间的饲养中的100％死亡率，所以昆虫形成抗该δ-内毒素的抗性的可能性将会是非常低的。
SEQ ID No.1的信息
1.序列特征
A长度 ： 641
B类型 ： 氨基酸
C拓扑学 ： 线性
D分子类型 ： 蛋白质
2.序列描述：SEQ ID No.1
1 M A I V N N Q N Q C V P Y N C L N N P E N E I L D I E R S N
31 S T V A T N I A L E I S R L L A S A T P I G G I L L G L F D
61 A I W G S I G P S Q W D L F L E Q I E L L I D Q K I E E F A
91 R N Q A I S R L E G I S S L Y G I Y T E A F R E W E A D P T
121 N P A L K E E M R T Q F N D M N S I L V T A I P L F S V Q N
151 Y Q V P F L S V Y V Q A A N L H L S V L R D V S V F G Q A W
181 G F D I A T I N S R Y N D L T R L I P I Y T D Y A V R W Y N
211 T G L D R L P R T G G L R N W A R F N Q F R R E L T I S V L
241 D I I S F F R N Y D S R L Y P I P T S S Q L T R E V Y T D P
271 V I N I T D Y R V G P S F E N I E N S A I R S P H L M D F L
301 N N L T I D T D L I R G V H Y W A G H R V T S H F T G S S Q
331 V I T T P Q Y G I T A N A E P R R T I A P S T F P G L N L F
361 Y R T L S N P F F R R S E N I T P T L G I N V V Q G V G F I
391 Q P N N A E V L Y R S R G T V D S L N E L P I D G E N S L V
421 G Y S H R L S H V T L T R S L Y N T N I T S L P T F V W T H
451 H S A T N T N T I N P D I I T Q I P L V K G F R L G G G T S
481 V I K G P G F T G G D I L R R N T I G E F V S L Q V N I N S
511 P I T Q R Y R L R F R Y A S S R D A R V I V L T G A A S T G
541 V G G Q V S V N M P L Q K T M E I G E N L T S R T F R Y T D
571 F S N P F S F R A N P D I I G I S E Q P L F G A G S I S S G
601 E L Y I D K I E L I L A D A T F K R R R W S V H K A S R P L
631 H L H Q Q A G L A A D
SEQ ID No.2的信息
1.序列特征
A长度 ： 1990bp
B类型 ： 核酸
C标准 ： 双链
D拓扑学 ： 线性
E分子类型 ： 合成的
F来源 ： 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)
G特征 ： 嵌合基因
2.序列描述：SEQ ID No.2
10 20 30 40 50
| | | | |
1 CCCGCATGCCCCGGGGGATCCAAGCTTTAAACCATGGCTATCGTTAACAA
GGGCGTACGGGGCCCCCTAGGTTCGAAATTTGGTACCGATAGCAATTGTT
51
CCAGAACCAGTGCGTCCCTTACAATTGCCTCAACAACCCAGAGAACGAGA
GGTCTTGGTCACGCAGGGAATGTTAACGGAGTTGTTGGGTCTCTTGCTCT
101TCTTGGACATCGAAAGATCCAATTCTACCGTGGCCACCAACATTGCTCTT
AGAACCTGTAGCTTTCTAGGTTAAGATGGCACCGGTGGTTGTAACGAGAA
151GAGATTTCCAGATTGCTCGCTAGCGCAACTCCCATTGGTGGCATCCTCCT
CTCTAAAGGTCTAACGAGCGATCGCGTTGAGGGTAACCACCGTAGGAGGA
201
TGGATTGTTCGACGCCATTTGGGGTTCCATCGGACCATCACAATGGGATC
ACCTAACAAGCTGCGGTAAACCCCAAGGTAGCCTGGTAGTGTTACCCTAG
251
TCTTCCTTGAACAGATCGAGTTGCTCATTGACCAGAAGATCGAAGAGTTT
AGAAGGAACTTGTCTAGCTCAACGAGTAACTGGTCTTCTAGCTTCTCAAA
301
GCTAGGAACCAGGCAATTAGCCGTCTCGAGGGGATCTCTTCCCTTTACGG
CGATCCTTGGTCCGTTAATCGGCAGAGCTCCCCTAGAGAAGGGAAATGCC
351
AATCTATACAGAGGCCTTCAGAGAGTGGGAAGCTGACCCTACTAATCCAG
TTAGATATGTCTCCGGAAGTCTCTCACCCTTCGACTGGGATGATTAGGTC
401
CATTGAAGGAAGAGATGCGTACTCAATTCAACGATATGAACTCTATCTTG
GTAACTTCCTTCTCTACGCATGAGTTAAGTTGCTATACTTGAGATAGAAC
451GTCACCGCCATTCCTCTCTTCTCAGTGCAGAACTACCAAGTGCCATTCCT
CAGTGGCGGTAAGGAGAGAAGAGTCACGTCTTGATGGTTCACGGTAAGGA
501CTCCGTCTATGTTCAAGCTGCAAACTTGCACCTTTCTGTCCTTCGCGACG
GAGGCAGATACAAGTTCGACGTTTGAACGTGGAAAGACAGGAAGCGCTGC
551TGTCCGTCTTTGGTCAAGCCTGGGGCTTCGATATCGCTACTATCAACTCC
ACAGGCAGAAACCAGTTCGGACCCCGAAGCTATAGCGATGATAGTTGAGG
601CGTTACAACGACCTCACAAGGTTGATTCCTATCTACACTGACTACGCTGT
GCAATGTTGCTGGAGTGTTCCAACTAAGGATAGATGTGACTGATGCGACA
651
TAGATGGTACAATACTGGGCTTGACAGACTCCCACGTACCGGCGGATTGA
ATCTACCATGTTATGACCCGAACTGTCTGAGGGTGCATGGCCGCCTAACT
701
GGAATTGGGCTCGCTTCAACCAGTTTAGGCGTGAGCTCACCATTAGCGTG
CCTTAACCCGAGCGAAGTTGGTCAAATCCGCACTCGAGTGGTAATCGCAC
751TTGGACATCATTTCCTTCTTCAGAAACTACGACTCTAGACTTTATCCTAT
AACCTGTAGTAAAGGAAGAAGTCTTTGATGCTGAGATCTGAAATAGGATA
801
TCCAACTAGTTCTCAACTCACCAGGGAGGTCTACACCGATCCTGTGATCA
AGGTTGATCAAGAGTTGAGTGGTCCCTCCAGATGTGGCTAGGACACTAGT
851
ACATTACCGACTATCGTGTGGGTCCCTCCTTCGAGAACATTGAAAACAGC
TGTAATGGCTGATAGCACACCCAGGGAGGAAGCTCTTGTAACTTTTGTCG
901GCTATCAGATCTCCACACCTTATGGACTTCCTCAATAACTTGACTATCGA
CGATAGTCTAGAGGTGTGGAATACCTGAAGGAGTTATTGAACTGATAGCT
951
TACAGACCTTATCAGAGGTGTTCACTACTGGGCTGGCCATAGGGTCACCT
ATGTCTGGAATAGTCTCCACAAGTGATGACCCGACCGGTATCCCAGTGGA
1001
CTCACTTTACCGGTAGTTCCCAAGTGATCACAACCCCTCAATACGGAATT
GAGTGAAATGGCCATCAAGGGTTCACTAGTGTTGGGGAGTTATGCCTTAA
1051
ACTGCCAACGCAGAGCCAAGACGTACCATTGCTCCAAGTACCTTTCCCGG
TGACGGTTGCGTCTCGGTTCTGCATGGTAACGAGGTTCATGGAAAGGGCC
1101GTTGAACCTCTTCTACCGCACATTGTCAAATCCATTCTTCAGGAGATCTG
CAACTTGGAGAAGATGGCGTGTAACAGTTTAGGTAAGAAGTCCTCTAGAC
1151
AGAACATCACCCCTACCCTTGGGATCAACGTTGTCCAGGGAGTGGGTTTC
TCTTGTAGTGGGGATGGGAACCCTAGTTGCAACAGGTCCCTCACCCAAAG
1201
ATCCAGCCAAACAATGCTGAGGTGCTCTACAGGTCTAGAGGCACAGTGGA
TAGGTCGGTTTGTTACGACTCCACGAGATGTCCAGATCTCCGTGTCACCT
1251
CTCCTTGAACGAACTTCCAATTGACGGTGAGAACTCACTCGTCGGATACA
GAGGAACTTGCTTGAAGGTTAACTGCCACTCTTGAGTGAGCAGCCTATGT
1301GTCACCGTCTTAGCCACGTTACTTTGACCAGGTCTCTCTATAACACTAAT
CAGTGGCAGAATCGGTGCAATGAAACTGGTCCAGAGAGATATTGTGATTA
1351
ATCACTAGTTTGCCCACCTTCGTGTGGACTCACCACTCAGCCACCAACAC
TAGTGATCAAACGGGTGGAAGCACACCTGAGTGGTGAGTCGGTGGTTGTG
1401
AAACACTATCAATCCCGATATCATTACACAAATCCCCCTTGTCAAGGGCT
TTTGTGATAGTTAGGGCTATAGTAATGTGTTTAGGGGGAACAGTTCCCGA
1451
TCCGCTTGGGTGGAGGGACCTCCGTCATTAAAGGGCCCGGATTCACCGGT
AGGCGAACCCACCTCCCTGGAGGCAGTAATTTCCCGGGCCTAAGTGGCCA
1501
GGCGATATCCTCCGTAGAAACACCATTGGTGAGTTTGTGTCCCTCCAGGT
CCGCTATAGGAGGCATCTTTGTGGTAACCACTCAAACACAGGGAGGTCCA
1551
TAACATTAACTCTCCTATCACACAAAGGTACCGTCTTAGGTTCCGCTACG
ATTGTAATTGAGAGGATAGTGTGTTTCCATGGCAGAATCCAAGGCGATGC
1601
CTTCCTCTAGAGACGCAAGAGTCATTGTGCTTACCGGTGCCGCTTCCACA
GAAGGAGATCTCTGCGTTCTCAGTAACACGAATGGCCACGGCGAAGGTGT
1651
GGAGTCGGTGGCCAAGTCAGCGTTAACATGCCATTGCAAAAGACTATGGA
CCTCAGCCACCGGTTCAGTCGCAATTGTACGGTAACGTTTTCTGATACCT
1701
GATCGGAGAGAACCTCACTAGTAGAACCTTCAGGTATACCGACTTCTCTA
CTAGCCTCTCTTGGAGTGATCATCTTGGAAGTCCATATGGCTGAAGAGAT
1751
ACCCTTTCTCCTTCCGTGCTAACCCAGATATCATTGGCATCAGCGAACAA
TGGGAAAGAGGAAGGCACGATTGGGTCTATAGTAACCGTAGTCGCTTGTT
1801
CCTCTCTTCGGCGCCGGCTCCATCAGCTCTGGTGAACTCTACATCGATAA
GGAGAGAAGCCGCGGCCGAGGTAGTCGAGACCACTTGAGATGTAGCTATT
1851
GATCGAGTTGATCCTTGCTGACGCCACATTCAAGAGGAGACGATGGAGCG
CTAGCTCAACTAGGAACGACTGCGGTGTAAGTTCTCCTCTGCTACCTCGC
1901
TGCACAAAGCCTCACGCCCTCTTCACCTCCACCAACAAGCTGGACTCGCT
ACGTGTTTCGGAGTGCGGGAGAAGTGGAGGTGGTTGTTCGACCTGAGCGA
1951GCTGATTAATGAGAATTCGGATCCAAGCTTGGGCCCGCTC
CGACTAATTACTCTTAAGCCTAGGTTCGAACCCGGGCGAG
Claims (41)
1.SEQ ID No.1的嵌合型δ-内毒素蛋白Cry1E，和其他在序列上具有75％及以上同源性的蛋白质。
2.权利要求1所述的蛋白质，其中所述SEQ ID No.1的蛋白质的长度为641个氨基酸残基。
3.权利要求1所述的蛋白质，其中所述SEQ ID No.1的嵌合蛋白是从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的δ-内毒素Cry1Ea和Cry1Ca中设计出来的。
4.权利要求2所述的蛋白质，其中所述长度为641个残基的嵌合蛋白的组成如下：残基1-529来自内毒素Cry1Ea的相同位置、残基530-599来自Cry1Ca的533-602位、残基600-616来自Cry1Ea的588-604位、残基617-641为合成多肽。
5.权利要求1所述的蛋白质，其中Cry1Ea的530-587的肽结构域可以用任何其他δ-内毒素的进行替换。
6.权利要求2所述的蛋白质，其中最后25个氨基酸残基改善了抵抗植物蛋白酶的稳定性。
7.权利要求1所述的蛋白质，其中所述嵌合蛋白在4-35℃的温度是稳定的。
8.SEQ ID No.2的嵌合体基因。
9.权利要求8所述的嵌合体，其中所述嵌合体编码SEQ ID No.1的嵌合蛋白。
10.权利要求8所述的嵌合体，其中所述嵌合体的长度为1990个碱基对(bp)。
11.权利要求8所述的嵌合体，其中所述嵌合体为1.99kb的双链DNA。
12.权利要求8所述的嵌合体，其中所述嵌合体含有均匀分布的植物首选的密码子以促进有效的翻译。
13.权利要求8所述的嵌合体，其中所述嵌合体在5’-末端含有植物首选的翻译起始密码于ATGGCT。
14.权利要求8所述的嵌合体，其中所述嵌合体含有植物首选的翻译终止密码子TAATGA。
15.权利要求8所述的嵌合体，其中所述嵌合体含有33个限制位点，这些限制位点以大约40-80bp的间距均匀地分布于基因的全部长度之中。
16.权利要求15所述的嵌合体，其中限制位点为选自HindIII、EcoRI和BamHI的酶。
17.权利要求8所述的嵌合体，其中所述嵌合体分成58个长度为40-65bp的重叠的寡核苷酸，它们每个以6-26个碱基对(bp)的间距进行分布。
18.权利要求8所述的嵌合体，其中所述嵌合体含有所述重叠的核苷酸，这些重叠的核苷酸具有13-18个核苷酸的重叠，并且其紧邻的寡核苷酸位于互补链上。
19.权利要求8所述的嵌合体，其中所述嵌合体具有44-55℃的Tm值。
20.在微生物中过表达杀虫嵌合蛋白Cry1E的方法，该方法包括：
(a)将编码所述嵌合蛋白的SEQ ID No.2的基因Cry1E克隆进载体中，
(b)用所述克隆载体转化微生物，和
(c)在所述微生物中过表达所述嵌合蛋白。
21.权利要求20所述的方法，其中所述嵌合体在选自细菌、藻类和真菌的微生物中表达。
22.权利要求20所述的方法，其中用于所述克隆的限制性内切酶选自HindIII、EcoRI、Ncol、MfeI和BamHI。
23.权利要求20所述的方法，其中使用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导所述蛋白质的过表达。
24.权利要求20所述的方法，其中于15℃过表达所述蛋白质以避免所述蛋白质的错误折叠。
25.权利要求20所述的方法，其中所述载体选自质粒、病毒DNA和粘粒。
26.权利要求20所述的方法，其中嵌合体在微生物中的表达通过RT-PCR、Western分析和ELISA来确认。
27.权利要求20所述的方法，其中嵌合体在微生物中的存在通过PCR和Southern分析来确认。
28.用权利要求1的杀虫嵌合蛋白处理受昆虫侵害的植物的方法，该方法包括：
(a)将编码嵌合蛋白Cry1E的基因整合入受昆虫侵害的植物中，
(b)将转基因植物暴露于昆虫，和
(c)测定所述转基因植物的杀虫活性。
29.权利要求28所述的方法，其中昆虫害虫选自灰翅夜蛾属物种和实夜蛾属物种。
30.权利要求28所述的方法，其中植物选自烟草、棉花、鹰嘴豆、pegeonpea、花生、花椰菜、甘蓝、红辣椒和辣椒。
31.权利要求28所述的方法，其中用于所述克隆的限制性内切酶选自HindIII、EcoRI、Ncol和BamHI。
32.权利要求28所述的方法，其中嵌合蛋白显示出在植物中的高度表达，其占植物总溶解蛋白质的大约0.5％。
33.权利要求28所述的方法，其中所述嵌合蛋白在所述转基因植物中是稳定的。
34.权利要求28所述的方法，其中暴露于所述嵌合蛋白的昆虫在死亡之前显示出体重损失。
35.权利要求28所述的方法，其中所述嵌合蛋白显示出抗处于所有发育阶段的昆虫的杀虫特性。
36.权利要求28所述的方法，其中所述嵌合蛋白为具有比亲本蛋白高几倍的能力的杀虫剂。
37.权利要求28所述的方法，其中所述嵌合蛋白的杀虫活性为，在大约4小时的暴露中有80-100％的昆虫害虫死亡率。
38.权利要求28所述的方法，其中暴露于所述嵌合蛋白大约1小时的昆虫显示出延缓的发育、不育和中断的变态。
39.权利要求28所述的方法，其中对于实夜蛾属物种的EC50为250-350ng/ml人工昆虫饲料。
40.权利要求2 8所述的方法，其中对于灰翅夜蛾属物种的EC50为25-50ng/ml人工饲料。
41.权利要求28所述的方法，其中所述方法对于转化植物的正常生长没有显示出不利影响。
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