ES2279178T3 - Dispositivo y procedimiento para el tratamiento de un medio liquido por ultrasonido en la prevencion del crecimiento de celulas hiperproliferativas o infectadas. - Google Patents
Dispositivo y procedimiento para el tratamiento de un medio liquido por ultrasonido en la prevencion del crecimiento de celulas hiperproliferativas o infectadas. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento in vitro para la neutralización, la eliminación y/o la prevención del crecimiento de células hiperproliferativas no diferenciadas, o células aisladas infectadas viralmente suspendidas en un fluido fisiológico que comprende: - la emisión de un ultrasonido que presenta una frecuencia superior a 100 kHz en un compartimento que contiene el fluido fisiológico a tratar a un nivel de potencia que es inferior a 30 mW/cm3; y - la emisión de microburbujas que presentan un diámetro medio inferior a 1 mm en el campo ultrasónico en el compartimento que contiene el fluido fisiológico, de manera que la emisión del ultrasonido y de las microburbujas induce una muerte celular programada considerable en las células hiperproliferativas, no diferenciadas o en las células infectadas viralmente sin provocar una cavitación considerable o sin calentar el fluido considerablemente.
Description
Dispositivo y procedimiento para el tratamiento
de un medio líquido por ultrasonido en la prevención del crecimiento
de células hiperproliferativas o infectadas.
La presente invención está dirigida a la
utilización del ultrasonido de alta frecuencia y baja energía para
tratar medios líquidos. En formas de realización específicas los
dispositivos y procedimientos proporcionados en la presente memoria
pueden inducir una apóptosis importante en células suspendidas en un
fluido fisiológico.
Las células pueden resultar dañadas si son
expuestas al ultrasonido. Por ejemplo, el ultrasonido puede provocar
un daño celular irreversible y puede inducir modificaciones
destructivas en la membrana celular. Varios informes han sugerido
que la cavitación que resulta del colapso de las burbujas de gas
generadas por los campos de presión acústica puede ser la causa del
daño celular después de una radiación ultrasónica. También se ha
sugerido que la cavitación induce roturas monocatenarias en el ADN
por la acción del peróxido de hidrógeno residual.
La utilización del ultrasonido en la terapia
contra el cáncer se ha convertido en una cuestión importante. El
ultrasonido se ha utilizado conjuntamente con la hipertermia, y
conjuntamente con la fototerapia, la radioterapia y la
quimioterapia. Las células malignas son conocidas por ser más
susceptibles a estos procedimientos combinados que a sus
equivalentes normales. El efecto de la radiación directa (por
ejemplo, el ultrasonido, el láser, la luz) sobre determinadas
moléculas (por ejemplo, las fotosensibilizadoras clásicas y las
sonosensibilizadoras clásicas) es la generación de especies de
oxígeno altamente activo, tales como oxígeno singlete, radicales
superóxidos, hidroperóxidos, o radicales de ácidos grasos, que
puedan jugar un papel importante en el tratamiento contra el
cáncer, actuando de manera selectiva sobre las células malignas.
Según el origen de la radiación, la terapia
descrita anteriormente se denomina PDT (terapia fotodinámica), o si
es mediante ultrasonido o sonoluminescencia: SDT (terapia
sonodinámica). La adición de un fotosensibilizador es un
prerrequisito para ambas terapias. Aunque que los efectos generales
inducidos por la SDT y la PDT son diferentes en términos de
viabilidad celular, tanto la SDT (específicamente relacionada con la
actividad cavitacional ultrasónica) como la PDT generan especies
oxigenadas activas y conducen a una disminución de los niveles de
tioles intracelulares. En el caso de la PDT mediante rayos
ultravioleta-A (UVA), la apóptosis de las células T
auxiliares puede ser inducida por la generación de oxígeno singlete,
pero este efecto depende esencialmente de la concentración inicial
en los fotosensibilizadores (PS) y de la concentración de oxígeno
local. Para la SDT, como resultado de las altas energías
implicadas, la lisis celular es el fenómeno más importante,
enmascarando probablemente otros efectos en las células
supervivientes.
La patente US 4.971.991 de Umemura et al.
da a conocer la utilización del ultrasonido para tratar células
tumorales, aunque se basa en altos niveles de potencia ultrasónica,
y no describe la utilización de microburbujas. Otras patentes que
describen el ultrasonido y las microburbujas, tales como la patente
US 5.215.680 de D'Arrigo, se basan en la utilización de los efectos
cavitacionales y termales del ultrasonido para tratar tumores, a
diferencia de las células cancerígenas individuales, cuyo alcance se
determina por la duración y el número de tratamientos. Este tipo de
tratamiento utiliza alta potencia y tiempos de radiación largos,
produciendo predominantemente lisis celular y necrosis. Véase
Kondo, Cancer Letters 178 (1), 63-70, (2002).
La Figura 1 es una figura que muestra una forma
de realización de un dispositivo para tratamientos ultrasónicos
descrita en la presente memoria.
La Figura 2 es una figura que muestra tres
vistas de un dispositivo para el tratamiento de células
hiperproliferativas en una suspensión con ultrasonido y
microburbujas. La vista del extremo izquierdo es una vista superior
del dispositivo, la vista central es una vista frontal, y la vista
del extremo derecho es una vista lateral del dispositivo.
La Figura 3 es un gráfico de barras que muestra
los efectos del tratamiento ultrasónico sobre los niveles de
glutatión celular. Los datos se expresan en porcentaje de células
que presentan un nivel de glutatión comparable al de las células no
tratadas. Los valores son la media \pm SEM de 3 experimentos
independientes.
La Figura 4 es un gráfico de barras que
representa los efectos del ultrasonido de alta frecuencia sobre la
actividad caspasa-3 celular.
La Figura 5 es un gráfico de barras que muestra
el efecto de la radiación sobre la eficacia de la clonación de las
células K562. Los resultados se expresan como la media \pm SEM de
3 experimentos independientes.
\newpage
La Figura 6 es un gráfico de barras que muestra
el porcentaje de células K562 apoptóticas 5 horas después de 1 o 3
tratamientos ultrasónicos. La velocidad de apóptosis se determina
mediante citometría de flujo después de la tinción con
anexina-V y los resultados se expresan como la media
\pm SEM de 7 experimentos independientes.
La Figura 7 es un gráfico de puntos que muestra
los cambios de la distribución de la fosfatidilserina en función del
tiempo y de los tratamientos ultrasónicos sucesivos. Se expresan los
resultados de un experimento representativo como porcentaje de
células teñidas con la
anexina-V-FITC.
La Figura 8 es un gráfico de barras que muestra
el efecto del tratamiento ultrasónico sobre la apóptosis de células
mononucleares normales (MNC) y sobre células leucémicas
(Nalm-6, KG1a, HL-60, y células
leucémicas primarias obtenidas de 5 pacientes). Los resultados son
la media \pm SEM de 5 experimentos independientes
La apóptosis, o muerte celular programada, es un
componente normal del desarrollo y de la salud de los organismos
multicelulares. La apóptosis garantiza la homeóstasis de los tejidos
durante el desarrollo, la defensa del huésped, el envejecimiento, y
se produce en respuesta a una gran diversidad de señales incluyendo
la radiación \gamma y la exposición a los rayos ultravioleta. Las
células mueren en respuesta a una diversidad de estímulos, durante
la apóptosis típicamente lo hacen de una manera controlada. Esto
hace que la apóptosis sea distinta a otra forma de muerte celular
denominada necrosis en la que la muerte celular no controlada
conduce a la lisis de las células, a respuestas inflamatorias y,
potencialmente, a serios problemas de salud. La apóptosis, en
cambio, es un proceso en el que las células juegan un papel activo
en su propia muerte, siendo ésta la razón por la que la apóptosis
se denomina frecuentemente como suicidio celular.
Cuando las células reciben señales específicas
con instrucciones para que lleven a cabo la apóptosis, típicamente
en la célula se producen una serie de cambios bioquímicos y
morfológicos distintivos. Por ejemplo, en las etapas iniciales de
la apóptosis típicamente se activa una familia de proteínas
conocidas como caspasas. Estas proteínas descomponen o clivan
sustratos celulares clave que son requeridos para una función
celular normal, incluyendo las proteínas estructurales del
citoesqueleto y las proteínas nucleares, tales como las enzimas
reparadoras del ADN. Las caspasas también pueden activar otras
enzimas degradantes, tales como las DNasas, que clivan el ADN en el
núcleo. En general, la muerte celular apoptótica se caracteriza por
cambios prematuros en la membrana nuclear, la condensación de la
cromatina y la fragmentación del ADN. Estos cambios bioquímicos
resultan en cambios morfológicos en la célula.
Las indicaciones proporcionadas en la presente
memoria estás dirigidas a dispositivos y procedimientos que pueden
neutralizar, eliminar y prevenir el crecimiento de las células
hiperproliferativas (por ejemplo, las células tumorales) que se
encuentran presentes en un medio líquido. En formas de realización
más específicas, los procedimientos y dispositivos proporcionados
en la presente memoria inducen la apóptosis en células
hiperproliferativas que se encuentran presentes en una suspensión,
como por ejemplo un fluido fisiológico. Entre los fluidos
fisiológicos tratables se incluyen la sangre, el plasma, el suero,
y el fluido cerebroespinal que pueden ser extraídos de y/o pueden
ser administrados a animales, incluyendo mamíferos, seres humanos, y
similares.
El tratamiento de baja energía y alta frecuencia
según las indicaciones proporcionadas en la presente memoria puede
inducir efectos apoptóticos en las células hiperproliferativas.
Entre estos efectos se incluyen, por ejemplo, un efecto sobre las
membranas mitocondriales (descenso del potencial mitocondrial),
pérdida de asimetría en la fosfatidilserina, provocando una
oxidación lipídica de la membrana (decremento del nivel de GSH
celular), variaciones morfológicas, fragmentación del ADN, pérdida
de la membrana plasmática, y similares. Además, la apóptosis
inducida por el ultrasonido de baja energía puede implicar la
activación de la caspasa-3, la degradación
proteolítica del sustrato de la caspasa PARP, y la modulación de la
relación bcl-2/bax en las células.
Ensayos específicos (ver los ejemplos) han
confirmado la muy rápida inducción de la apóptosis con cantidades
limitadas de necrosis.
Pueden encontrarse formas de realización de
dispositivos que pueden utilizarse para implementar los
procedimientos de la presente invención en la aplicación de patente
provisional US 60/423.368, en la aplicación de patente US
10/358445, y en la patente US 6.540.922 de Cordemans et al.
Los procedimientos para el tratamiento de las células
hiperproliferativas pueden llevarse a cabo con dispositivos dados a
conocer en la presente memoria. Una forma de realización particular
de un dispositivo que puede utilizarse para el tratamiento de un
medio líquido como por ejemplo un medio acuoso (por ejemplo, los
fluidos fisiológicos) es ilustrada en la Figura 1. En determinadas
formas de realización los fluidos a tratar contienen células
hiperproliferativas. En otras formas de realización, los fluidos a
tratar pueden ser líquidos fisiológicos de los que se sospecha que
puedan contener células hiperproliferativas, como por ejemplo
después de un diagnóstico. Las células que no se encuentran
totalmente diferenciadas, tales como las células madre, así como las
soluciones que contienen virus y/o células infectadas por virus
también pueden ser tratadas. Entre los ejemplos de virus tratables
se pueden incluir HIV, HCV, HBV, virus del herpes, hantavirus,
virus influenza, y virus del ébola, por ejemplo.
Con relación a la Figura 1, los dispositivos
descritos en la presente memoria incluyen un compartimento 2,
preferentemente en forma de un cilindro o de una sección transversal
rectangular. En determinadas formas de realización el compartimento
2 puede estar en comunicación con un depósito (no mostrado) que
almacena el medio líquido a tratar. En otras formas de realización
(por ejemplo, cuando se trata el fluido fisiológico de un ser
humano o de un animal), los dispositivos proporcionados en la
presente memoria no contienen un depósito que esté directamente
conectado al cuerpo del animal o del ser humano. Entre dichas formas
de realización se incluyen aquellas en las que el fluido
fisiológico se extrae y/o se administra (por ejemplo, por
reinyección) durante el tratamiento extracorpóreo del cuerpo del
ser humano o de otro animal. Por consiguiente, un animal, tal como
un ser humano, puede ser sustituido por cualquier referencia de la
presente memoria realizada a un "depósito".
En otras formas de realización, una suspensión
de células hiperproliferativas puede tratarse en un dispositivo
como el que se muestra en la Figura 2. En esta forma de realización,
se utiliza un tubo de entrada de aire 3 como un emisor de
microburbujas 3 para emitir microburbujas 5 a la suspensión de
células hiperproliferativas 22 contenida en un compartimento (o
recipiente) 20. El compartimento (o recipiente) 20, que contiene la
suspensión celular 22 puede estar inmerso en una bañera de agua 24,
como por ejemplo un incubador.
En formas de realización adicionales, el
compartimento 2 contiene (por ejemplo, a lo largo de su pared o
adyacente a la parte inferior) uno o más emisores de ultrasonido de
alta frecuencia 1 que emiten el ultrasonido 4 al compartimento 2
(ventajosamente hacia el centro de este compartimento 2). En otras
formas de realización el contenedor puede también disponer de uno o
más emisores de microburbujas 3 para emitir microburbujas de gas 5,
que se colocan para emitir las microburbujas de gas 5 al campo
ultrasónico 4 emitido en el compartimento 2.
El término "microburbujas", tal como se
utiliza en la presente memoria se refiere a burbujas de gas con un
diámetro medio inferior a 1 mm. En algunas formas de realización, el
diámetro es inferior o igual a 50 \mum. Todavía en otras formas
de realización, las microburbujas presentan un diámetro inferior a
30 \mum. En determinadas formas de realización las microburbujas
se seleccionan de entre microburbujas de aire, oxígeno, y ozono, o
de una mezcla de los mismos. Para reducir los costes operativos,
puede resultar ventajoso utilizar microburbujas que no sean
microburbujas de ozono, como por ejemplo las microburbujas de aire.
Las formas de realización de la invención ventajosas no se basan en
la generación de de un efecto térmico para tratar las células.
Aunque en determinadas formas de realización la utilización de
microburbujas estabilizadas puede resultar efectiva en el
tratamiento de células, en formas de realización preferentes, la
utilización de microburbujas estabilizadas resulta innecesaria. Las
microburbujas con capa lipídica son un ejemplo de microburbujas
estabilizadas.
La expresión "células hiperproliferativas"
se refiere a células que se dividen, se reproducen o de lo contrario
proliferan a una velocidad relativamente alta, y puede incluir
células cancerígenas (por ejemplo, células leucémicas), células
precancerígenas, células tumorales, células de la médula ósea, y
células totipotentes.
En determinadas formas de realización, la
expresión "medio líquido" se refiere a líquidos fisiológicos
que pueden ser administrados a seres humanos o a animales, y/o que
pueden ser extraídos de seres humanos o animales. En formas de
realización específicas, se reinyectan fluidos fisiológicos después
del tratamiento (es decir, un tratamiento ex vivo). En
determinadas formas de realización la expresión "líquidos
fisiológicos" puede incluir sangre, suero, líquido
cefalorraquidiano, fluido cerebroespinal, plasma, y similares. La
patente US 5.401.237, de Tachibana et al., describe un
procedimiento de extracción y de readministración de fluidos
fisiológicos.
En formas de realización específicas, los
procedimientos y los dispositivos proporcionados en la presente
memoria incluyen el ultrasonido de baja energía y alta frecuencia
para tratar células hiperproliferativas. La expresión "alta
frecuencia" se refiere a frecuencias superiores a 100 kHz y hasta
varios MHz. En determinadas formas de realización, las altas
frecuencias utilizadas se encuentran en el intervalo de entre 200
kHz y 20 MHz. En diversas formas de realización, la frecuencia de
ultrasonido puede seleccionarse de entre 200 kHz y 10 MHz. En una
forma de realización preferente, la frecuencia utilizada es de entre
200 kHz y 1,8 MHz.
En diversas formas de realización de los
dispositivos descritos en la presente memoria, el emisor de
microburbujas 3 para la emisión de microburbujas de gas 5 se
dispone en la base 11 del compartimento 2 (es decir, en la parte
inferior del compartimento 2), de manera que las microburbujas se
mueven por elevación natural o por el arrastre del gas en el flujo
de líquido.
En formas de realización adicionales, los
dispositivos y procedimientos descritos en la presente memoria
inducen la apóptosis en células hiperproliferativas. Se ha
descubierto que las células sanas son mucho menos sensibles al
ultrasonido de alta frecuencia que las células leucémicas. Esta
diferencia de comportamiento entre las células sanas y las células
leucémicas no puede relacionarse con una diferencia en la
localización de los fotosensibilizadores endógenos sino que
probablemente es debida a una modificación de los mecanismos
celulares fundamentales, tales como el estado de la p53, las vías
de señalización, y la resistencia a la carga oxidante, por ejemplo.
Específicamente, la apóptosis puede ser inducida en células
cancerígenas (por ejemplo, las células leucémicas), células
precancerígenas, células tumorales, células de la médula ósea,
células totipotentes, y similares.
En formas de realización más específicas los
dispositivos y los procedimientos proporcionados en la presente
memoria pueden producir radicales, tales como los radicales ROS
(especies reactivas de oxígeno), H-, -OH, y HOO- que también pueden
formar H_{2}O_{2}, siendo esta molécula y/o estos radicales
tóxicos para las células hiperproliferativas y provocando de esta
manera su desactivación y/o destrucción. Los productos de la
peroxidación lipídica, que resultan de la carga oxidante creada bajo
las condiciones ultrasónicas son también participantes potenciales
para este biomecanismo.
Aunque se han presentado evidencias suficientes
contra la formación de oxígeno singlete durante la terapia
sonodinámica, estos datos son consistentes solamente para una
exposición de ultrasonido de "alta energía" y larga duración,
conduciendo a una acumulación de radicales libres derivados de
sensibilizadores bien por pirolisis directa o debido a reacciones
con radicales H- o radicales -OH formados por pirolisis del solvente
de agua.
Se cree que las especies creadas utilizando los
procedimientos y dispositivos dados a conocer son derivadas de la
reacción del ultrasonido a alta frecuencia en una molécula de agua,
dando lugar más probablemente (en particular en presencia de
oxígeno) a las reacciones que se muestran a continuación:
- \quad
- H_{2}O -> H- + -OH
- \quad
- H- + O_{2} -> HOO-
- \quad
- HOO- + HOO- -> H_{2}O_{2} + O_{2'}
- \quad
- -OH + -OH -> H_{2}O_{2}
De manera ventajosa, la energía requerida para
producir estas especies tóxicas se reduce si el proceso se lleva a
cabo en presencia de microburbujas, tal como se describe en la
presente memoria. En determinadas formas de realización, se
configura un generador para suministrar al emisor de ultrasonido una
potencia inferior a 1 W/cm^{2}. En formas de realización
preferentes, la potencia suministrada es aproximadamente de 0,5
W/cm^{2} o inferior, o en otras muchas formas de realización
ventajosas es aproximadamente de 0,25 W/cm^{2} o inferior. En
formas de realización ventajosas, la potencia disipada en el volumen
del fluido fisiológico de este nivel de potencia aplicada al emisor
es inferior a 30 mW/cm^{3}. En algunas formas de realización, la
potencia disipada es aproximadamente de 7 mW/cm^{3}.
Aunque en determinadas formas de realización, el
ultrasonido puede administrarse de manera continua, en otras formas
de realización, el ultrasonido puede administrarse de manera
intermitente, utilizando ciclos ON/OFF. Los expertos en la materia
pueden determinar tiempos de ciclos ON/OFF efectivos en función del
volumen de células, de los tipos de células, y de otras variables
relevantes.
En formas de realización adicionales las
indicaciones proporcionadas en la presente memoria se refieren al
tratamiento de células hiperproliferativas en suspensión, en vez de
al tratamiento de un tumor o de una masa neoplástica. En estas
formas de realización, las indicaciones proporcionadas en la
presente memoria no se basan en microburbujas a concentrar o
agrupar en una zona tumoral particular. Esto permite el tratamiento
de células hiperproliferativas no deseadas que no se encuentran
agrupadas.
Otra ventaja de los procedimientos y
dispositivos proporcionados en la presente memoria es que las
células hiperproliferativas pueden tratarse de manera efectiva en
periodos de tiempo cortos. En formas de realización específicas,
las células hiperproliferativas pueden ser tratadas en un tiempo
inferior a 1 minuto. En formas de realización incluso más
específicas, las células pueden se tratadas en un tiempo inferior a
30 segundos, incluso en un tiempo de entre 5 y 20 segundos, por
ejemplo.
Tal como es conocido en la técnica, los métodos
biofísicos de acción ultrasónica están clasificados en función de
si presentan efectos bien sean termales, cavitacionales, o bien sean
no termales y no cavitacionales. Resulta importante tener en cuenta
que utilizando los intervalos de potencia y los tiempos cortos de
tratamiento descritos anteriormente, se evita un calentamiento de
fluidos y/o de células importante, de manera que se producen pocas
muertes celulares o no se producen muertes celulares debidas al
calor. Como ejemplo, entre los tratamientos que resultan en un
efecto no térmico se incluyen tratamientos llevados a cabo a
temperaturas inferiores a 40ºC, 35ºC y 30ºC. Los niveles de
potencia son tales que tampoco se produce la cavitación en una
medida importante, de manera que se evita de manera sustancial el
daño de la membrana celular debido al ultrasonido.
Bajo potencias ultrasónicas elevadas,
recientemente se ha apreciado que la inyección de microburbujas en
el campo ultrasónico da lugar a un incremento en el fenómeno de la
sonoluminescencia, por la superposición de las microburbujas sobre
las burbujas de cavitación inducidas por el ultrasonido, se puede
multiplicar el número de especies excitadas y tóxicas. Este
fenómeno es apreciado en un nivel macroscópico cuando el tratamiento
por ultrasonido se combina sinergísticamente con la presencia de
microburbujas de un tamaño adecuado.
En formas de realización adicionales, los
dispositivos y procedimientos proporcionados en la presente memoria
presentan la ventaja de que no hay una necesidad de dedicar el
ultrasonido a zonas específicas, debido a que se observa que el
sistema de tratamiento funciona mediante la difusión de los
productos formados in situ (por ejemplo radicales y
H_{2}O_{2} formados) al depósito 6 del medio acuoso a
tratar.
En formas de realización adicionales el emisor o
los emisores 1 de ultrasonido 4 en los dispositivos descritos en la
presente memoria se orientan con el fin de no dar lugar a cualquier
fenómeno de onda estacionaria. Por ejemplo, en determinadas formas
de realización, uno o más emisores de ultrasonido pueden orientarse
oblicuamente en relación al eje 9 del compartimento 2 (ángulo agudo
no perpendicular a este eje 9) y en relación al flujo del líquido y
del flujo de las microburbujas 5 (ver Figura 1). Esta característica
hace posible que todas las microburbujas 5 del compartimento 2 sean
tratadas de una manera estadísticamente idéntica, sin crear zonas
estacionarias en el compartimento 2.
Los dispositivos y procedimientos proporcionados
en la presente memoria pueden incluir la emisión de microburbujas
de gas con un diámetro medio inferior a 1 mm en un campo ultrasónico
de alta frecuencia en el medio líquido tratado. En algunas formas
de realización el diámetro de las microburbujas es inferior o igual
a 50 \mum. Todavía en otras formas de realización las
microburbujas presentan un diámetro inferior a 30 \mum. En
determinadas formas de realización las microburbujas se seleccionan
de entre microburbujas de aire, oxígeno, y ozono. En otras formas
de realización las microburbujas no son microburbujas de ozono.
Según otras formas de realización, los
dispositivos y procedimientos descritos en la presente memoria
pueden incluir un emisor de luz 12 (es decir, un emisor de
radiación electromagnética) que emite radiación en el compartimento
2 en el campo ultrasónico 4, a una frecuencia que principalmente se
encuentra en el umbral visible. Sin embargo, para determinadas
aplicaciones, con el fin de eliminar determinadas células
hiperproliferativas específicas, resulta ventajoso emitir radiación
electromagnética a una frecuencia que es principalmente no visible,
tal como la radiación ultravioleta (por ejemplo, del tipo UVA, UVB o
UVC), el infrarrojo, el láser o las microondas.
Recientemente se ha descubierto inesperadamente
que, un tratamiento que comprende la emisión de microburbujas en
los campos combinado con el ultrasonido y opcionalmente con
radiación de luz resulta particularmente efectivo en la
desactivación y en la eliminación de células hiperproliferativas que
se encuentran presentes en un medio líquido, como por ejemplo un
fluido fisiológico. El fenómeno de la luminiscencia puede promover
la producción de especies oxigenadas extremadamente activas, tales
como el radical superóxido o el oxígeno singlete, lo que puede
resultar en una serie de reacciones bioquímicas que son
extremadamente tóxicas para determinadas células
hiperproliferativas. En formas de realización ventajosas, la
radiación es emitida intermitentemente en ciclos ON/OFF. En formas
de realización más específicas el ciclo ON/OFF puede ser
aproximadamente de 5,5 ms/3 ms.
Es conocido que la luminiscencia puede tener
lugar en la presencia de las denominadas moléculas sensibilizadoras
(por ejemplo, fotosensibilizadoras y sonosensibilizadoras), con el
fin de dar lugar a una acción antitumoral sobre determinadas
células cancerígenas. Entre dichas moléculas pueden incluirse:
porfirinas, clorinas, tetraciclinas, azul metileno, fluoresceína,
acridina, rodamina, y similares. Estos agentes activos pueden
inyectarse en el organismo o pueden administrarse oralmente y
posteriormente activarse mediante sonoluminescencia. Tras la
activación, estos agentes pueden producir oxígeno singlete que a su
vez juega un papel fundamental, en particular en procesos
bioquímicos que resulten de la carga oxidante. Específicamente, un
oxígeno singlete puede oxidar los diversos componentes de una
célula, tales como las proteínas, los lípidos, los aminoácidos y los
nucleótidos, por ejemplo.
En otras formas de realización, pueden
utilizarse partículas sólidas o superficies sólidas para sinergizar
la luminiscencia y/o la emisión de radiación. Entre estos sólidos
pueden incluirse, por ejemplo, TIO_{2}, arcilla, y cerámicas.
Diversas formas de realización están dirigidas a
dispositivos y procedimientos que no requieren productos químicos
adicionales, tales como los fotosensibilizadores y/o los
sonosensibilizadores para neutralizar, eliminar y/o prevenir el
crecimiento de células hiperproliferativas de un medio fisiológico.
No resulta siempre necesario añadir un agente fotosensibilizador o
un agente sonosensibilizador al medio líquido a tratar, ya que se ha
apreciado inesperadamente que la luminiscencia puede producirse
in situ en determinadas células hiperproliferativas (por
ejemplo, las células leucémicas) que se encuentran presentes en
fluidos fisiológicos (por ejemplo, la sangre) que ya contienen
estas moléculas fotosensibilizadoras.
Aunque los dispositivos y procedimientos
proporcionados en la presente memoria pueden utilizarse
conjuntamente con otros fármacos, tales como fotosensibilizadores,
sonosensibilizadores, agentes quimioterapéuticos, antibióticos,
fármacos antivirales, resulta importante tener en cuenta que la
efectividad de los procedimientos y de los dispositivos
proporcionados en el tratamiento de células hiperproliferativas no
depende de la utilización de otros agentes químicos, reactivos o
fármacos. Por consiguiente, los procedimientos y dispositivos
descritos en la presente memoria pueden utilizarse sin sustancias
adicionales, entre las que se incluyen agentes químicos, reactivos,
hormonas, péptidos, proteínas, ácidos nucléicos, carbohidratos,
vacunas ADN, fármacos o estimuladores de la angiogénesis. En formas
de realización incluso más específicas, las indicaciones
proporcionadas en la presente memoria no se basan en la absorción
celular de estas sustancias.
Específicamente, los efectos obtenidos con las
indicaciones proporcionadas en la presente memoria pueden ser
alcanzados sin la necesidad de los fotosensibilizadores y
sonosensibilizadores clásicos. Los efectos fisiológicos obtenidos
con técnicas, tales como la PDT dependen al mismo tiempo de la dosis
de radiación, de la naturaleza del fotosensibilizador utilizado, de
su concentración, y de su localización. Aunque son requerimientos
para los tratamientos tradicionales, los agentes sensibilizadores
no resultan necesarios para las indicaciones proporcionadas en la
presente memoria, simplificando de esta manera los procedimientos y
los dispositivos considerablemente.
En determinadas formas de realización, los
efectos netos de la acción ultrasónica implican fotosensibilizadores
endógenos en la estructura en la que su concentración local es
elevada. Por ejemplo, los fotosensibilizadores endógenos se
encuentran localizados principalmente en las estructuras de
membrana, tales como las lisosomas, la mitocondria, las membranas
nucleares, el aparato de Golgi, y las microsomas del retículo
endoplásmico, cuya superficie relativa representa casi el 50% de la
superficie de la membrana celular.
En algunas formas de realización, los
dispositivos y procedimientos descritos en la presente memoria
pueden incluir una bomba para la circulación del medio líquido, así
como uno o más dispositivos para la recuperación, preferentemente
por filtración, centrifugación o precipitación (como por ejemplo los
ciclones, etc.), de las células hiperproliferativas que se
encuentran presentes en el medio líquido. En determinadas formas de
realización la bomba y/o el dispositivo para la recuperación se
colocan entre el depósito (o el animal) que contiene el medio
líquido a tratar y el compartimento 2.
En determinadas formas de realización, los
dispositivos y procedimientos proporcionados en la presente memoria
pueden utilizarse para extraer fluido fisiológico (por ejemplo,
sangre) de un sujeto, del que se sospechosa (por ejemplo, tras ser
diagnosticado) que pueda tener cáncer (por ejemplo, leucemia). Tras
la extracción, el fluido fisiológico puede ser tratado con
ultrasonido de alta frecuencia y baja energía y con microburbujas
de gas de un diámetro inferior a 1 mm. En determinadas formas de
realización los procedimientos inducen la apóptosis en las células
cancerosas (por ejemplo, leucemia). Tras tratar el fluido
fisiológico de manera que las células hiperproliferativas han sido
suficientemente neutralizadas, se ha prevenido su crecimiento, o
han sido eliminadas, el fluido puede volver a administrarse al
sujeto. Estos procedimientos pueden llevarse a cabo de manera
similar a otros procedimientos ex vivo, tales como la
hemodiálisis, por ejemplo.
Puede adjuntarse un sujeto con un tratamiento
sanguíneo a uno de los dispositivos descritos en la presente
memoria. Según determinadas formas de realización, el flujo
sanguíneo del sujeto puede conectarse a un dispositivo de
ultrasonido descrito en la presente memoria, a través de una fístula
interior en su brazo. Esto implica tener una arteria y una vena
conectadas quirúrgicamente. Cuando se unen, el flujo sanguíneo más
fuerte de la arteria provoca que la vena se haga más grande. Pueden
insertarse agujas en la vena aumentada para conectar el sujeto al
dispositivo del ultrasonido.
Otra manera de proporcionar acceso al flujo
sanguíneo consiste en insertar un injerto interior. En este
procedimiento una arteria es conectada quirúrgicamente a una vena
con una pieza corta de tubería especial colocada bajo la piel, a la
que se le puede insertar una aguja.
En otras formas de realización, cuando resulta
necesario tener acceso al flujo sanguíneo de manera rápida, o
cuando las venas del brazo son demasiado pequeñas para proporcionar
suficiente sangre para el tratamiento ultrasónico, por ejemplo,
puede utilizarse un catéter venoso central. En este procedimiento,
se inserta quirúrgicamente un tubo blando en una vena grande del
cuello o en una vena cercana a la clavícula. En algunas formas de
realización este procedimiento puede ser temporal hasta que se
prepare una zona de acceso permanente.
Entre los sujetos que pueden ser tratados según
los procedimientos descritos en la presente memoria se puede
incluir cualquier animal, tales como los mamíferos, incluyendo seres
humanos, ratas, monos, perros o cerdos.
En formas de realización adicionales, los
dispositivos y procedimientos proporcionados en la presente memoria
utilizan ondas de ultrasonido de baja energía y alta frecuencia para
prevenir, tratar, o neutralizar células hiperproliferativas
mediante la inducción de la apóptosis en las células (por ejemplo,
células leucémicas). La inducción de la apóptosis en las células
hiperproliferativas puede conducir a una secuencia de eventos
característicos entre los que se incluyen un descenso del potencial
mitocondrial, pérdida de asimetría en la fosfatidilserina,
variaciones morfológicas, fragmentación del ADN, pérdida de membrana
plasmática, y similares. Además, la apóptosis inducida por el
ultrasonido de baja energía puede implicar la activación de la
caspasa-3, la degradación proteolítica del sustrato
de la caspasa PARP, y la modulación de la relación
bcl-2/bax en las células.
Procedimientos adicionales implican la
iniciación de la apóptosis utilizando luminiscencia sonoquímica
inducida por el ultrasonido para activar la producción de oxígeno
singlete fotosensibilizado a partir de la fotorradiación directa.
En condiciones de radiación ultrasónica clásicas, los efectos de la
cavitación destructiva directa dominan la sonoluminescencia, que
resulta ser bastante débil ante la ausencia de una interfaz de
aire/líquido inyectada en el medio. Por consiguiente, puede
resultar ventajoso utilizar microburbujas conjuntamente con el
ultrasonido con el fin de mejorar la luminiscencia sobre los efectos
cavitacionales.
Los ejemplos que siguen a continuación describen
el tratamiento de células con ultrasonido de alta frecuencia y baja
energía y diversos ensayos para indicar la presencia de la apóptosis
en dichas células.
Se cultivaron líneas celulares leucémicas
humanas (K562, Nalm-6, KGla, y
HL-60) obtenidas de la "American Type Culture
Collection" (ATCC, Rockville, MD, USA) en
RPMI-1640 (BioWhittaker, Walkersville, MD, USA)
suplementadas con suero fetal bovino al 10% (Gibco, Grand Island,
NY, USA) y L-glutamina al 1% (Gibco). Se recogieron
las células leucémicas, se resuspendieron en una solución salina
tamponada con fosfato (PBS, pH = 7,2, Gibco), y se utilizaron
inmediatamente para el experimento. Se obtuvo sangre venosa
heparinizada de voluntarios sanos y de pacientes con leucemia. Se
separaron las células mononucleares mediante una centrifugación en
gradiente de densidad Ficoll-Hypaque (International
Medical Products, Bruselas, Bélgica).
A continuación se describe el tratamiento
ultrasónico llevado a cabo sobre las células. Se trataron líneas
celulares leucémicas humanas (K562, HL-60, KG1a, y
Nalm-6), células leucémicas primarias, y células
mononucleares normales mediante ultrasonido a una frecuencia de 1,8
MHz durante diversos tiempos de exposición a una potencia acústica
de 7 mW/ml y unos ciclos (ON/OFF) de radiación de 5,5 ms/3 ms.
Tras 18 horas de cultivo en la incubadora (37ºC
de temperatura y CO_{2} al 5%) las células se sometieron con
éxito a un ensayo de viabilidad celular mediante un ensayo de
exclusión con azul tripan. Se llevaron a cabo ensayos adicionales
sobre las células tratadas y se describen más detalladamente en los
ejemplos que siguen a continuación. La apóptosis fue evaluada
mediante la morfología celular, la exposición de la
fosfatidilserina, y la fragmentación del ADN. Se sometieron a
ensayo el potencial mitocondrial, el contenido de glutatión, la
activación de la caspasa-3, el clivaje PARP, y la
relación bcl-2/bax mediante la citometría de flujo.
Se evaluó la eficacia de la clonación mediante ensayos en
metilcelulosa.
La fragmentación del ADN ha estado asociada con
la apóptosis. La cuantificación de células con ADN degradado se
llevó a cabo utilizando un procedimiento descrito por Nicoletti, I.
et al., J Immunol. Methods 139 (2): 271 (1991), y un equipo
de ensayo "Apotarget Quick DNA Ladder Detection Kit" (de
Biosource). Los pellets o sedimentos celulares (106 células) se
resuspendieron en 20 l de tampón de lisis y el ADN fue extraído
según las instrucciones del fabricante. Se analizó el ADN tras la
separación mediante electroforesis en gel (agarosa al 1%). Como un
control positivo, las células fueron sometidas a radiación con luz
ultravioleta colocando una placa directamente debajo de un
transiluminador de luz ultravioleta durante 10 minutos (intensidad
de 5 mW/cm^{2}). A continuación se incubaron las células a 37ºC
durante 5 horas y 18 horas antes de que se evaluara la
apóptosis.
Tras la permeabilización, las células fueron
incubadas con una solución que contenía PI y RNAse (reactivo
Coulter DNA-prep). Los tubos fueron colocados a una
temperatura de 4ºC y a oscuras, durante la noche, antes de proceder
al análisis por citometría de flujo para identificar el pico
sub-G0 correspondiente a la apóptosis.
Se observaron patrones de ADN del tipo escalera
o nucleosomales clásicos en muestras de ADN correspondientes a
células tratadas mediante la luz ultravioleta (control positivo) y
mediante ultrasonido. El clivaje del ADN internucleosomal era
apenas perceptible 5 horas después del tratamiento ultrasónico pero
se hizo claramente evidente 18 horas más tarde (resultados no
mostrados). Además, se apreció un incremento en el número de núcleos
con ADN fragmentado con una tinción con IP, 5 horas después del
tratamiento. Específicamente, el 15% de las células tratadas
presentaban ADN fragmentado y el 2% de las células no tratadas
presentaban ADN fragmentado (datos no mostrados).
La disrupción prematura del potencial
transmembrana mitocondrial (\DeltaYm), que precede a la
fragmentación avanzada del ADN, ha sido apreciada en varios modelos
de apóptosis celular. Se llevó a cabo el ensayo que se describe a
continuación para determinar el efecto del tratamiento ultrasónico
de alta frecuencia sobre el \DeltaYm.
El potencial mitocondrial fue estimado mediante
la incorporación del fluorocromo catiónico DiOC6 inmediatamente
después de un tratamiento celular según el protocolo publicado en A.
Macho et al., Blood 86(7): 2481 (1995).
Brevemente, se incubaron las células K562
(106/ml) con 2,5 nmol/l de
3,3'-diexiloxacarbocianina (DiOC6; Molecular
Probes, Eugene, OR) durante 15 minutos a 37ºC, seguido de un
análisis por citometría de flujo.
El tratamiento ultrasónico estuvo acompañado de
un incremento de la población celular con un \DeltaYm reducido
(resultados no proporcionados). Se evidenció una población de
células con una incorporación reducida de DiOC6 30 minutos después
del tratamiento, y el descenso del potencial mitocondrial se hizo
muy claro 5 horas después del tratamiento ultrasónico, presentando
más del 50% de las células un \DeltaYm reducido. Estos resultados
proporcionan evidencias suficientes para confirmar la apóptosis
celular.
Se ha mostrado que existe una reducción de
glutatión durante la apóptosis. Se llevó a cabo un ensayo para
determinar el contenido de glutatión celular tras un tratamiento
ultrasónico. Se utilizó una sonda "Cell Tracker Green CMFDA"
(diacetato de 5-clorometil fluoresceína; Molecular
Probes) para determinar los niveles de glutatión intracelular, tal
como se ha descrito anteriormente en D.W. Hedley et al.
Cytometry 15: 349 (1994).
Inmediatamente después del tratamiento por
ultrasonido, surgió una subpoblación con niveles inferiores de GSH
a los apreciados en las células no tratadas (> 50% de las células
mostraban un nivel reducido de GSH), tal como se muestra en la
Figura 3. Los resultados de tratamientos sucesivos indicaban una
mayor reducción de GSH después de 5 horas. Los resultados,
expresados como un porcentaje de células que mostraban un nivel de
GSH comparable al del las células no tratadas, demuestran claramente
que el tratamiento ultrasónico de alta frecuencia está asociado con
la reducción de GSH.
Se ha mostrado que la caspasa-3
juega un papel importante en la apóptosis inducida por la
quimioterapia. Específicamente, la activación de las caspasas
conduce a la muerte celular a través del clivaje de sustratos
celulares, tales como la actina, la gelsolina, o la PARP. Para
abordar directamente la implicación de la caspasa-3
en la apóptosis inducida por el ultrasonido, se determinó la
actividad de la caspasa utilizando la citometría de flujo y un
ensayo colorimétrico.
Específicamente, se detectó la
caspasa-3 mediante el análisis de citometría de
flujo utilizando el anticuerpo policlonal de conejo anti anticuerpo
monoclonal de la caspasa-3 activa conjugado con
ficoeritrina (PE) (BD-Pharmingen, San Diego, CA,
USA). Las células fueron fijadas y permeabilizadas utilizando un
equipo de ensayo "Fix and Perm Kit" (Catlag, Burlingame, CA)
durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación las
células fueron teñidas con un anticuerpo
anticaspasa-3 e incubadas durante 15 minutos. Las
células fueron lavadas y analizadas por citometría de flujo. La
actividad enzimática de la caspasa-3 fue determinada
utilizando el equipo de ensayo "Apotarget
caspase-3/cpp32/colorimetric protease assay kit"
(Biosource), tal como se sugiere por el fabricante. También se
evaluó indirectamente la activación de la caspasa-3
mediante un clivaje de PARP utilizando un anticuerpo de conejo anti
sitio de clivaje de PARP conjugado con FITC (Biosource).
Tal como se muestra en la Figura 4, el
tratamiento ultrasónico de alta frecuencia conduce a la activación
de la caspasa-3. Es más, esta actividad proteasa se
encontraba en su nivel máximo 1 hora después del tratamiento.
Además, el clivaje de PARP era evidente 2 horas después del
tratamiento, con el 40% de las células teñidas mediante el anti
PARP de conejo conjugado con FITC, contra un 5% de las células no
tratadas (resultados no mostrados).
Diferentes proteínas de la familia
bcl-2 han estado implicadas en la activación o en la
prevención de la apóptosis. El ensayo que se describe a
continuación fue llevado a cabo para determinar si
bcl-2 y bax, los dos miembros más importantes de la
familia de proteínas bcl-2, estaban implicados en la
inducción de la apóptosis mediante el ultrasonido. Tras la
permeabilización, las células fueron incubadas con control negativo
del mismo isotipo, anticuerpo de ratón anti proteína
bcl-2 humana marcada con FITC (Dako, Glostrup,
Dinamarca) y anticuerpos policlonales de conejo para la proteína
bax. Posteriormente, se añadió un anticuerpo secundario marcado con
FITC (Dako) a la proteína bax. Para cuantificar la expresión de
bc-2 y bax, el citómetro fue calibrado utilizando
una mezcla de perlas marcadas con cantidades conocidas de
fluorocromo (Dako). Los valores de intensidad fluorescente media
(MFI) fueron a continuación convertidos en moléculas de un
fluorocromo soluble equivalente (MESF) utilizando una curva de
calibración.
Los resultados (datos no proporcionados)
demostraron que las células no tratadas expresaban niveles elevados
de la proteína antiapoptótica bcl-2 (47 \pm 4 X
103 MESF) y esta expresión se muestra como un pico unimodal de la
fluorescencia. Una hora después del tratamiento ultrasónico, la
expresión de la proteína bcl-2 se encontraba ya
regulada a la baja (40 \pm 0,9 y 32 \pm 0,9 X 103 MESF en
células K562 tratadas mediante 1 o 3 tratamientos ultrasónicos,
respectivamente). Dos horas después del tratamiento, la expresión de
bcl-2 se mostraba claramente bimodal, mostrando las
células un fenotipo bcl-2 alto (comparable al de las
células no tratadas) o un fenotipo bcl-2 bajo (11
\pm 2 X 103 MESF).
A diferencia de la proteína
bcl-2, los niveles de la proteína proapoptótica,
bax, resultaron superiores en células tratadas con el ultrasonido
en comparación a las células no tratadas (85 \pm 0,5 y 48 \pm 5
X 103 MESF para células K562 tratadas y no tratadas,
respectivamente). De esta manera la relación
bcl-2/bax resultó considerablemente reducida
durante el tratamiento ultrasónico de alta frecuencia,
proporcionando evidencias suficientes para confirmar la apóptosis
celular (0,98 para células de control contra 0,38 para células
tratadas con el ultrasonido).
Durante la apóptosis, los residuos de la
fosfatidilserina pasan de la parte interior a la parte exterior de
la membrana plasmática y este cambio puede detectarse utilizando la
anexina-FITC, que se une a los residuos de la
fosfatidilserina. A continuación se describe un ensayo de unión con
la anexina-V que fue llevado a acabo. Se llevó a
cabo un análisis citométrico de flujo de células teñidas con
anexina-V conjugada con isotiocianato de
fluoresceína (FITC) y con yoduro de propidio (IP) utilizando el
equipo de ensayo adquirido en Biosource International (Camarillo,
CA, USA), tal como se recomendaba por el fabricante. Los datos
fueron presentados como diagramas de puntos mostrando el cambio en
la intensidad fluorescente media de la
anexina-V-FITC/yoduro de propidio
(no mostrados).
Los resultados indicaban que los cambios de la
distribución de la fosfatidilserina variaban en función del tiempo.
Específicamente, los resultados mostraron que el tratamiento
ultrasónico provocó daños en la membrana plasmática en un
porcentaje reducido de células, demostrando que la acción necrótica
del tratamiento ultrasónico sometido a ensayo es muy débil. De
manera interesante, se apreció un incremento de células apoptóticas
tras dos horas de tratamiento. Tras cinco horas de tratamiento, el
35% de las células resultaron ser anexina-V
positivas, demostrando la inducción ultrasónica de la apóptosis en
las células K562.
Una prueba importante para un efecto en la
viabilidad celular es la incapacidad de una célula para
multiplicarse y formar una colonia. A continuación se describe un
ensayo clonogénico que fue llevado a cabo sobre una línea celular
de células K562 para determinar el efecto de la radiación
ultrasónica de alta frecuencia sobre le eficacia de la clonación.
Brevemente, el medio de cultivo consistía en IMDM suplementado con
FCS al 20% y metilcelulosa en una concentración final del 4%. Los
cultivos fueron incubados a 37ºC en aire CO_{2} al 5%, y las
colonias (> 20 células) fueron identificadas tras 5 días. La
eficacia clonogénica de la línea celular de células K562 era del
16%. Tal como se muestra en la Figura 5, se aprecia una reducción
considerable de la eficacia de la clonación en las células K562
después de 1 tratamiento y después de 3 tratamientos (una
inhibición del 25% y del 42%, respectivamente), confirmando la
sensibilidad de la células leucémicas al ultrasonido de alta
frecuencia.
El procedimiento que se describe a continuación
fue llevado a cabo para determinar el efecto de los absorbedores de
oxígeno activo en la inducción de la apóptosis mediante el
ultrasonido de alta frecuencia. Se incubaron células K562 con
L-histidina (10 mM) y/o con manitol (100 mM).
Algunas células fueron tratadas con ultrasonido de alta frecuencia
y otras no fueron tratadas. Se detectó la apóptosis celular mediante
un ensayo con anexina-V/PI. Los resultados, tal
como se muestran en la Tabla 1, demuestran que el daño celular
inducido ultrasónicamente se reduce de manera considerable en la
presencia de la histidina y del manitol (43% y 47% de inhibición de
la apóptosis inducida mediante 3 tratamientos sucesivos,
respectivamente).
La asociación del manitol y la histidina condujo
a una inhibición de la apóptosis superior al 60%. La efectividad de
estos agentes en la reducción de la apóptosis celular inducida por
un tratamiento ultrasónico proporciona evidencias suficientes para
afirmar que el oxígeno singlete y los radicales hidróxilos inducidos
ultrasónicamente son mediadores importantes para inducir la
apóptosis.
Se llevó a cabo un seguimiento de una citometría
de flujo sobre células K562 cultivadas 0,5 horas después, 2 horas
después y 5 horas después del tratamiento ultrasónico. Tras un
tratamiento, el nivel de células apoptóticas apreciadas era tres
veces superior al de las células de control (26% y 8% tras 5 horas
de cultivo para células tratadas y no tratadas, respectivamente).
También se apreció un efecto necrótico de entre 5% y 10%, que es
bastante inferior al efecto encontrado cuando se utilizan fármacos o
un tratamiento fotodinámico (PDT). Con radiaciones sucesivas, bajo
las mismas condiciones (7 mW/ml, 20 segundos) y en intervalos
diferentes, la apóptosis de las células K562 se vio incrementada
hasta un 37 \pm 3% (p < 0,02) y hasta un 49 \pm 5% (p <
0,02) tras 1 tratamiento y tras 3 tratamientos sucesivos,
respectivamente (Figura 6). También se apreciaron variaciones
morfológicas (por ejemplo, contracción celular, formación de
burbujas o "blebbing" en la membrana, condensación de la
cromatina) tras tratamientos sucesivos (resultados no mostrados). La
Figura 7 demuestra que la cantidad de la fosfatidilserina celular
se ve incrementada tras tratamientos de ultrasonido de alta
frecuencia sucesivos, tal como se detecta mediante un ensayo con la
anexina-V.
Además de las células K562, se sometió a ensayo
el efecto del tratamiento ultrasónico sobre otras líneas celulares
malignas y normales, incluyendo las células KG1a (células blásticas
de leucémica mieloide aguda poco diferenciadas e inmaduras),
HL-60 (leucemia promielocítica), y
Nalm-6 (línea celular ALL). Los resultados
presentados en la Figura 8 demuestran que la sensibilidad al
ultrasonido depende del tipo de célula, pero los tratamientos
sucesivos condujeron a un incremento considerable del número de
células apoptóticas para todas las líneas celulares sometidas a
evaluación.
También fueron tratadas por ultrasonido las
células mononucleares de 5 pacientes (1 caso de anemia refractaria
con exceso de células blásticas [RAEB], 1 caso de leucemia
mielogenosa aguda secundaria [AML], y 3 casos de AML, subtipos M3,
M4 y M4Eo, según la clasificación
"French-American-British"
[FAB]), y se discriminaron las células blásticas de células
normales contaminantes en base a su expresión de CD45, tal como ha
sido descrito anteriormente en F. Lacombe, F. et al.,
Leukemia 11: 1878 (1997). Estas células también habían sido
marcadas para su exposición de fosfatidilserina mediante
FITC-anexina. Este procedimiento hace posible
comparar los respectivos comportamientos apoptóticos de las células
blásticas leucémicas y de las células normales tratadas por
ultrasonido. Los resultados presentados en la Figura 8 demuestran
que las células leucémicas primarias son sensibles al tratamiento
ultrasónico con más del 37 \pm 18% de las células apoptóticas
apreciadas 5 horas después de 3 tratamientos.
Claims (10)
1. Procedimiento in vitro para la
neutralización, la eliminación y/o la prevención del crecimiento de
células hiperproliferativas no diferenciadas, o células aisladas
infectadas viralmente suspendidas en un fluido fisiológico que
comprende:
- la emisión de un ultrasonido que presenta una
frecuencia superior a 100 kHz en un compartimento que contiene el
fluido fisiológico a tratar a un nivel de potencia que es inferior a
30 mW/cm^{3}; y
- la emisión de microburbujas que presentan un
diámetro medio inferior a 1 mm en el campo ultrasónico en el
compartimento que contiene el fluido fisiológico, de manera que la
emisión del ultrasonido y de las microburbujas induce una muerte
celular programada considerable en las células hiperproliferativas,
no diferenciadas o en las células infectadas viralmente sin provocar
una cavitación considerable o sin calentar el fluido
considerablemente.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que las microburbujas de gas no son microburbujas de ozono.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que las microburbujas de gas se seleccionan de entre el grupo que
consiste de microburbujas de aire y de microburbujas de oxígeno.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el fluido fisiológico se selecciona de entre el grupo que
consiste de sangre, plasma, suero y fluido cerebroespinal.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el diámetro medio de las microburbujas de gas es inferior a
50 \mum.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el diámetro medio de las microburbujas de gas es inferior a
30 \mum.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el ultrasonido emitido en el compartimento no genera un
fenómeno de campo estacionario.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende adicionalmente la emisión de una luz, que presenta una
radiación electromagnética principalmente en el umbral visible, en
el campo ultrasónico.
9. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que las células hiperproliferativas se seleccionan de entre el
grupo que consiste de células tumorales, células de la médula ósea,
células madre cancerígenas, células precancerígenas y células
leucémicas.
10. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende adicionalmente el suministro de potencia al emisor de
ultrasonido a un valor inferior a 1 W/cm^{2}.
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