ES2274059T3 - Instrumentos analiticos y biosensores, metodos para aumentar su precision y vida efectiva. - Google Patents

Abstract

Un método para eliminar agentes parásitos de una membrana compuesta (60) tras una medición de muestra, constando dicho método de los siguientes pasos: - proporcionar un electrodo de enzima (59), dicho electrodo de enzima comprendiendo un hilo conductor (57) y una membrana compuesta (60), constando dicha membrana compuesta de una capa externa (51), una capa de enzima (53), y una capa de rechazo de interferencia interna (55), donde dicha capa de rechazo de interferencia interna está en contacto con dicho hilo y dicha capa de enzima está dispuesta entre la capa externa y la capa de rechazo de interferencia interna; - proporcionar una fuente eléctrica en contacto eléctrico con dicho electrodo (59); - aplicar continuamente una polarización estable a dicho electrón; y - superponer un pulso de polarización adicional sobre dicha polarización estable después de que una medición de muestra sea suficiente para causar oxidación y eliminar al menos una parte de agentes parásitos en dicha membrana compuesta.

Description

Instrumentos analíticos y biosensores, métodos para aumentar su precisión y vida efectiva.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con el campo de sensores electroquímicos de enzima-electrodo, y con la regeneración o mantenimiento de las propiedades funcionales de las membranas de tales sensores.

Contexto de la invención

Los sistemas de sensores electroquímicos son herramientas analíticas que combinan un componente de reconocimiento bioquímico (una enzima) con un transductor físico como un electrodo de platino. La enzima es capaz de interactuar de manera selectiva con un analito de interés y generar, directa o indirectamente, una señal eléctrica a través del transductor. Los sistemas de sensores electroquímicos juegan un papel relevante en la resolución de problemas analíticos y clínicos, y en encontrar aplicaciones en el campo de diagnósticos médicos.

La selección de enzimas hace posible que se desarrollen sensores electroquímicos que pueden detectar de manera precisa ciertos analitos biológicos incluso en una mezcla compleja de analitos como la sangre. A pesar del alto grado de selección de enzimas, la selección de tales sensores como un todo puede sin embargo estar comprometida por la presencia de ciertos agentes perturbadores o parásitos (por ejemplo, ácido ascórbico, ácido úrico, acetaminofeno, cisteína, etc.) que pueden interactuar directamente con el transductor físico si no se previene tal comportamiento. La exactitud y precisión de los sistemas de sensores electroquímicos con enzimas también se pone en peligro por los niveles residuales de analito que queda en el sensor de una muestra anterior afectando el análisis de la muestra siguiente.

US 5403451 se refiere a un método y aparato para detección electroquímica pulsada usando electrodos electroactivos de polímero. El documento describe un método para dedopar capas poliméricas de un electrodo electroquímico. El método descrito se refiere a reducir un electrodo de polímero electroactivo conductor, por ejemplo para renovarlo, reciclando lentamente el polímero electroactivo conductor con un potencial apropiado, por ejemplo, -1.5 VDC durante diez minutos.

Anal. Chem. 1986, 58, 1803-1806 se refiere a un electrodo polipirrol como un detector para aniones electroinactivos por medio de análisis de inyección de flujo. El documento describe un método para dedopar capas poliméricas de un electrodo electroquímico. El método descrito incluye aplicar -0.3 V después de cada respuesta analítica.

Resumen de la invención

El objeto de la presente invención es proporcionar un método para aumentar la precisión y la duración de vida de un sensor electroquímico. La polimerización de monómeros electropolimerizables dentro de una membrana interna polimérica en un sensor electroquímico forma una membrana de rechazo de interferencia. Esta membrana interna polimérica funciona para proteger el sensor electroquímico del obstáculo o interferencia de compuestos en la muestra y, por lo tanto, aumentar la precisión que se pierde por la degradación de obstáculos de la membrana o por la interferencia por compuestos analitos de la muestra.

El sensor electroquímico incluye un electrodo y una membrana compuesta. La membrana compuesta incluye una capa externa, una capa de enzima, y una capa interna restaurable. La capa interna está en contacto con el electrodo e incluye una membrana polimerizable.

Tales sensores se conocen en US 6 051 389 y US 5 352 349. US 5 352 349 también describe un método para eliminar los agentes parásitos aplicando un potencial de reducción.

De acuerdo con la presente invención, los agentes parásitos se eliminan aplicando un pulso de potencial de oxidación, como se define en la reivindicación 1.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un diagrama esquemático de los componentes de un aparato de sensor electroquímico que incluye una cápsula de sensor con un banco de sensores y un bloqueo termal para hidración acelerada y calibración de los sensores.

La Fig. 2 muestra una vista frontal inversa de la tarjeta de sensor, parcialmente incompleta, de una realización de cápsula de la invención.

Las Figs. 3A-B muestran vistas transversales de un sensor de enzima.

Descripción detallada de la invención

Haciendo referencia a las Figuras 1 y 2, se describe un sistema de sensor electroquímico para el cual la presente invención es útil.

En referencia a la Fig. 1, un sistema de sensor electroquímico 8 emplea un montaje de sensor, generalmente indicado en 10, incorporando un conjunto de electrodos adaptados para realizar medidas eléctricas en una muestra, como una muestra de sangre, introducido en el montaje de sensor 10. Las muestras de sangre que van a ser analizadas por el sistema se introducen por medio de una entrada muestra 13a. Las muestras de sangre se obtienen, por ejemplo, por flebotomía o se derivan de una base periódica de un circuito de flujo de sangre extracorporal conectado al paciente durante, por ejemplo, una operación a corazón abierto. Las muestras de sangre pueden introducirse en la entrada muestra 13a a través de medios automáticos o manualmente, con una jeringuilla. Las muestras de sangre pueden introducirse como muestras diferenciadas.

El sistema electroquímico 8 está contenido en una cápsula desechable 37. Una cápsula de tipo similar se describe en detalle en Patente U.S Nº 4,734,184. El sistema de sensor electroquímico 8 incorpora en la cápsula 37 al menos dos envases preempaquetados 14 y 16, cada uno de los cuales conteniendo un solución acuosa calibradora que posee valores conocidos de los parámetros que el sistema necesita medir. Para propósitos de referencia, la solución contenida en el envase preempaquetado 14 se denominará Solución Calibradora A y la solución contenida en el envase preempaquetado 16 se denominará Solución Calibradora B. El sistema electroquímico 8, mostrado en Fig. 1, puede incluir un tercer envase preempaquetado 23 que contiene Solución Calibradora AO. Cada uno de los envases preempaquetados 14, 16 y 23 contienen una cantidad suficiente de su solución calibradora para permitir que el sistema se calibre un gran número de veces antes de que el envase preempaquetado se vacíe. Cuando uno o más envases 14, 16 0 23 que contienen soluciones calibradoras se vacía, la cápsula que contiene los envases preempaquetados 14, 16 y 23 debe ser reemplazado.

En referencia a la Fig. 1, el envase preempaquetado 14 está conectado a la entrada de una válvula multi-posición 18 a través de la línea de flujo 20, y el envase 16 está conectado a una segunda entrada de la válvula multi-posición 18 a través de la línea de flujo 22. El envase 23 está conectado a una tercera entrada de la válvula multi-posición 18 a través de una línea de flujo 25. Otro envase 17 contiene una solución de enjuague y está conectada a la entrad de la válvula multi-posición 18 a través de una línea de flujo 21. La bolsa de enjuague 17 se elimina y una de las soluciones de calibración A o B se emplea también como una solución de enjuague. La línea de salida 12 es la salida de la válvula multi-posición 18 y está conectada a la línea de entrada 13 de la muestra a través de una aguja 11. Dependiendo de la posición de la válvula 18, las líneas de entrada 20, 21, 22, 25 o el aire se abren a la válvula 18. De manera similar, cuando la aguja está en posición normal (posición 11b) de la línea de entrada de muestra 13b, la línea 12b está abierta a la línea de entrada de muestra 13b y permite el paso de calibración, o solución de enjuague, o aire a través de la línea de entrada de muestra 13b al montaje de sensor 10 por medio de la línea 24, facilitado por la operación de una bomba peristáltica esquemáticamente ilustrada en 26. Sin embargo, en un modo de aceptación de muestra (13a), la línea 12 se separa de la línea de entrada de muestra (posición 12a) y la muestra se introduce directamente al montaje de sensor 10 por medio de línea 24, facilitado por la operación de la bomba peristáltica 26. La cápsula 37 también incluye un envase 28, para una solución de referencia. El envase 28 está conectado al montaje de sensor por medio de una línea de flujo 30. El sistema además incluye un envase 32 para material sobrante, que recibe las muestras de sangre, las soluciones de calibración y la solución referencial tras haber pasado por el montaje de sensor 10, por medio de un conducto flexible 34 que tiene una entrada del montaje de sensor 10.

Tanto el conducto de flujo de material sobrante o residuos 34 como la línea de flujo de solución referencial 30 consisten en o incluyen secciones de tubo cercado flexible que pasan a través de la bomba peristáltica 26. La bomba 26 comprime y golpea suavemente las secciones flexibles de las líneas de flujo 30 y 34 para producir un flujo presionado de solución referencial del envase 28 al montaje de electrodo 10 y para crear una presión negativa sobre los productos de desecho en la línea de flujo 34 para sacar fluidos, incluyendo los fluidos con los monómeros polimerizables, en la línea de flujo 24 a través de pasajes en el montaje de electrodo 10 tras las membranas de los sensores. Esta disposición, opuesta a la alternativa de inducir presión positiva en la sangre y calibrar soluciones para forzarlas a través del montaje 10, evita la imposición de fuerzas mecánicas innecesarias y posiblemente traumáticas en la muestra de sangre y minimiza las posibilidades de fugas o escapes en el montaje de electrodo 10.

La cápsula 37 también contiene una tarjeta sensora 50 que proporciona una cámara estrecha de gas, de volumen bajo en la cual la muestra, como una muestra de sangre, solución de calibración o solución que contiene monómeros, se presenta a uno o más sensores electroquímicos, es decir, el pH, pCO_{2}, pO_{2}, Na^{+}, Ca^{++}, glucosa, lactato, creatina, creatinina, y sensores hematocrito, junto con el electrodo de referencia colectivamente indicado como los sensores 10, son partes integrales de la cámara. Químicamente sensibles, las membranas hidrofóbicas normalmente formadas por polímeros, como cloruro polivinilo, ionóforos específicos, y un plasticida adecuado, están permanentemente unidos al cuerpo de la cámara. Estas membranas hidrofóbicas químicamente sensibles, descritas con detalle a continuación, son la interfaz entre la muestra o soluciones de calibración y la solución búfer en contacto con el electrodo interno (plata/cloruro de plata).

La cápsula 37 puede incluir tres soluciones que permiten la calibración a altas y bajas concentraciones para todos los parámetros excepto para hematocrito, que calibra en un nivel. La cápsula 37 también incluye el brazo de entrada rotor-para-muestra 5, el tubo de bomba 24, 30 y 34, la aguja de muestra 11, los envases de solución de calibración 14, 16 y 23, la válvula de control 33, y tubos 12, 20, 21, 22 y 25. Las muestras de sangre que se han analizado no pueden fluir hacia atrás en la tarjeta sensora 50 desde el envase de material sobrante 32 debido a la presencia de una válvula 33 de control de único sentido en la línea de material sobrante 34. Tras el uso en el sistema 8, la cápsula 37 se descarta y se sustituye por otra cápsula.

En relación a la Fig. 1, los sensores están disponibles como un banco de electrodos 10 fabricados en una tarjeta de plástico 50 y situados en la cápsula desechable 37 que funciona en conjunto con un montaje de bloqueo termal 39 de una máquina de análisis químicos de sangre adecuadamente adaptada. El montaje de bloqueo termal 39 contiene los dispositivos de calentamiento/enfriamiento como un elemento resistente o un dispositivo de efecto Peltier, un termistor 41 para monitorizar y controlar la temperatura, la interrelación eléctrica 38 entre los sensores en la tarjeta de plástico 50 y el microprocesador 40 a través de la placa análoga 45. La placa análoga 45 contiene conversores análogo-a-digital y digital-a-análogo. La señal de la interfaz de electrodo 38 pasa a través del conversor análogo-a-digital, convertido en forma digital para que el procesador 40 la almacene y visualice. De manera opuesta, las señales digitales procedentes del procesador 40, por ejemplo, el voltaje de polarización para sensor de oxígeno, recorren el conversor digital-a-análogo, convertidas en formas análogas y alimentadas a los sensores para el control por medio de la interfaz de electrodo 38.

El sistema de sensor electroquímico 8 se forma tras la inserción de la cápsula 37 en el aparato de sensor electroquímico. Tras la inserción, la tarjeta sensora 10 se ajusta al montaje de bloqueo del calentador 39, descrito con detalle a continuación, y el montaje de calentamiento/enfriamiento regulado por el microprocesador 40 programa la temperatura de la tarjeta de sensor 50 y la solución en contacto con los sensores dentro de la tarjeta sensora 50 por medio de una temperatura específica durante un tiempo específico. El montaje de bloqueo del calentador 39 es capaz de calentar y enfriar rápidamente por, por ejemplo, un dispositivo termoeléctrico aplicando, por ejemplo, el efecto Peltier, controlado por un termistor 41, estando todo controlado por el microprocesador 40. Los sensores se conectan a la interfaz del electrodo 38 que selecciona una señal del conjunto de señales eléctricas generada por los sensores y pasa la señal eléctrica al microprocesador 40 en la máquina a través de un conversor análogo-a-digital en una placa análoga 45 donde se convierte de forma análoga a forma digital, adecuándose así para el almacenaje y la visualización.

En referencia a la Fig. 1, el montaje de electrodo 10 tiene un número de conectores de filo 36 en un banco que permite que se enchufe en un conector correspondiente hembra 38 para que los electrodos formados sobre el montaje 10 puedan estar conectados al microprocesador 40 a través de la placa análoga 45. El microprocesador 40 se conecta a la válvula multipuerto 18 por medio de un conductor de válvula 43 por una línea 42 y al motor de la bomba peristáltica 26 por medio de un conductor de bomba 45 por una línea 44. El microprocesador 40 controla la posición del brazo de la muestra 5 por medio del conductor de brazo 15, y la posición de la válvula 18 y la energización de la bomba 26 para provocar secuencias de muestras de sangre y calibrar soluciones que pasarán por medio del montaje de electrodos 10. Cuando las soluciones de calibración de, por ejemplo, envases 14, 16, y 23 se bombean dentro del montaje de electrodo 10, los electrodos que forman parte del montaje hacen medidas de los parámetros de la muestra y el microprocesador 40 almacena estos valores eléctricos. Basándose en las medidas realizadas durante el paso de las soluciones de calibración a través del montaje de electrodos 10, y los valores conocidos de los parámetros medidos contenidos en la solución de calibración de los envases 14, 16 y 23, el microprocesador 40 crea de manera efectiva una curva de calibración para cada uno de los parámetros medidos para que cuando una muestra de sangre pase a través del montaje de electrodo 10 las medidas realizadas por los electrodos puedan usarse para derivar medidas precisas de los parámetros de interés. Estos parámetros se almacenan y se visualizan con el microprocesador 40. El microprocesador 40 está correctamente programado para realizar funciones de medida, cálculo, almacenaje y control como diferencias en potencial eléctrico a través de uno o más electrodos.

Montaje de Electrodos

En referencia a la Fig. 1, durante el funcionamiento de la bomba 26, el montaje de electrodo 10 recibe un flujo de pulso constante de la solución referencial a través de la línea 30 y flujos de pulsación secuenciales e intermitentes de la muestra de sangre o de una de las soluciones de calibración a través de la línea 24. El montaje también proporciona una salida correspondiente de sus productos de desecho a una bolsa de recolección de desperdicios 34 por medio de la línea 34.

En referencia a la Fig. 2, como modo de ejemplo, el montaje de electrodo 10 consiste en una tarjeta rectangular 50 estructuralmente rígida de polivinilcloruro que tiene una placa de cubierta 52 hecha de aluminio (u otro material adecuado) adherida a una de sus superficies. La placa de cubierta 52 cierra los canales de flujo 56 formados en una superficie de la tarjeta 50 y también actúa como un medio de transferencia de calor para hidratar los sensores mediante ciclos termales, descritos a continuación, y para mantener que los fluidos fluyan a través del montaje de electrodo 10, y los propios electrodos, a una temperatura constante durante la calibración y durante la medida de parámetros relevantes en una muestra de un paciente. Esto se podría lograr midiendo la temperatura de la placa 52 y empleando un elemento adecuado de enfriamiento o calentamiento, como por ejemplo un dispositivo efecto Peltier y termistor 41 para mantener la temperatura de la placa 52 a una temperatura deseada.

En referencia a la Fig. 2, una solución referencial se introduce en un pozo 64, formado en la superficie del sustrato 50 de la misma manera que otros canales de flujo 56 y de manera similar se cubre con la placa de metal 52. La línea de flujo 34 de la solución referencial pasa a través de un orificio inclinado en el pozo 64. El pozo 64 está conectado a la sección de salida 34 del canal de flujo 56 a través de una sección capilar muy fina 66 formada en la superficie del sustrato de plástico 50 de la misma manera que los canales principales de flujo. El canal capilar 66 es sustancialmente más plano y más estrecho que los canales principales de flujo 56; su sección transversal es aproximadamente 0.5 sq. mm. El fluido referencial bombeado en el pozo 64 por la bomba 26, a través de una línea 30 (ver también Fig. 1), llena el pozo, y se fuerza a través de la sección capilar 66 donde se une con la corriente de salida de fluido que pasa a través de la sección de canal principal de flujo 56 y luego fluye con él hasta la bolsa de desperdicios 32. La influencia combinada de su densidad más alta descrita anteriormente y la naturaleza capilar del canal de flujo 66 sirve para minimizar cualquier posibilidad de solución de calibración o paso de sangre hacia abajo a través del canal 66 al pozo 64 y alterar las medidas electroquímicas.

Cuando una cantidad de muestra de sangre o solución de calibración introducida en el canal de flujo 24 pasa a través del canal de flujo 56 a la sección de salida 34, pasa sobre un número de electrodos mostrados en la Fig. 2.

En relación a las Figs. 1 y 2, la placa de calor 52 está contigua y forma una pared del canal de muestra 56. La placa de calor 52 está en contacto con el dispositivo de efecto Peltier del montaje de bloqueo termal 39 descrito anteriormente. El montaje de bloqueo termal es capaz de cambiar y controlar la temperatura de la placa de calor 52 entre 15ºC y 75ºC. El cambio y control de temperatura se controla por un termistor 41 y se regula con el microprocesador 40. Un reloj digital interno del microprocesador 40 controla el tiempo y puede encender y apagar el montaje de bloqueo termal 39 de acuerdo con un programa preestablecido. Por lo tanto, el microprocesador 40 controla el montaje de bloqueo termal 39, regulando el programa de temperatura y la duración de cada temperatura establecida de la placa de calor 52.

Detalles de Electrodo de Enzima

Un sensor de enzima consta de un sistema de tres electrodos que incluyen un electrodo trabajador, un electrodo referencial y un electrodo contador. El electrodo trabajador incluye una membrana compuesta que se deposita sobre una superficie en contacto con un cable conductor, un cable de platino, por ejemplo. La membrana compuesta consta de dos o más capas, incluyendo una capa de enzima y una membrana de rechazo de interferencia interna, por ejemplo.

La fabricación de sensor puede basarse en técnicas de fundición de disolvente conocidas en la técnica. El grosor de las capas puede controlarse administrando volúmenes precisos de solutos encontrados en las capas. La membrana polimérica que comprende una membrana de rechazo de interferencia interna, descrita con detalle a continuación, se forma en el electrodo de cable por medio de electropolimerización de monómeros electropolimerizables, como se describe a continuación.

En relación a las Figs. 3A y 3B, un electrodo de enzima 59, como un electrodo de glucosa, se localiza en el canal de flujo 56 de la tarjeta sensora 50. Fig. 3B es una sección aumentada de Fig. 3A. El electrodo de enzima 59 incluye una membrana compuesta de tres capas 60 que consta, desde el canal de flujo 56 al cable 57, de una membrana externa 51 adyacente al canal de flujo 56, una capa de enzima 53, localizada entre la membrana externa 51 y una membrana de rechazo de interferencia interna 55 adyacente al cable 57. El electrodo de enzima 59 contacta con la muestra cuando la muestra fluye a lo largo del canal de flujo 56 y sobre la membrana externa 51 del electrodo de enzima 59. La señal eléctrica generada por el electrodo de enzima 59 es transportada por el cable 57 y transferida al conductor 61 que está en comunicación eléctrica con el montaje de electrodo 10 mostrado en Fig. 2.

Aún en referencia a Figs. 3A y 3B, la membrana externa del electrodo de enzima 59 generalmente funciona para controlar la difusión del analito en la capa de enzima 53 y para proteger los otros componentes del electrodo 59 del contacto directo con los constituyentes de la muestra en el canal 56. En una realización, la membrana externa 51 es una membrana polimérica que comprende uno o más compuestos basados en poliuretano. La hidrofobicidad de la membrana se determina por la mezcla de especies de compuestos polímeros. Cuando la hidrofobicidad de la membrana aumenta, la habilidad del oxígeno para difundirse a través de la membrana aumenta mientras la habilidad de analitos para difundirse a través de la membrana disminuye. La composición preferente de la membrana externa 51 es la concentración en la cual un balance óptimo de tasas de difusión de oxígeno, que es un sustrato necesario de las reacciones enzimáticas, y analito (lactato en un sensor lactato; o creatinina y creatina en un sensor de creatinina, y glucosa en un sensor de glucosa) existen bajo condiciones típicas. Una membrana externa altamente hidrofóbica puede ser preferible porque el oxígeno se difundirá rápidamente a la capa de la enzima 53 y por lo tanto no será un factor limitativo para la reacción enzimática. La membrana externa 51 puede tener un grosor preferible de 8 a 15 micrones y puede funcionar con un grosor en el rango de 5 a 30 micrones.

La membrana externa 51 está compuesta por una mezcla de poliuretanos con diferentes niveles de absorción de agua. Una composición típica de la membrana externa 51 es 77% alifático, poliuretano basado en poliéster con 20% de absorción de agua, 17% alifático, poliuretano basado en poliéster con 60% de absorción de agua, y 6% alifático, poliuretano basado en poliéster con 3% de absorción de agua. La membrana externa 51 con esta composición puede producirse administrando un volumen de una solución de 3.0 mL disolvente ciclohexanona, 17.0 mL disolvente tetrahidrofuran, 1.08 g de poliuretano 20% de absorción de agua, 0.24 g de poliuretano 60% de absorción de agua y 0.08 g de poliuretano 3% de absorción de agua en la capa de la enzima 53 de la membrana compuesta 60.

En referencia a la Fig. 3B, la membrana externa 51, que está dividida en capas directamente y en contacto con la capa de enzima 53, funciona para proteger la capa de enzima 53 impidiendo la exposición de una enzima 49 unida a la capa de enzima 53, y la matriz estabilizadora en la cual la enzima 49 está sujeta, a proteínas o compuestos degradantes de la muestra en el canal 56. Del mismo modo, la membrana externa 51 también funciona para controlar la tasa de difusión del analito (por ejemplo, glucosa, lactato, creatina, creatinina) y oxígeno de la muestra a la capa de la enzima 53. En caso de fallo del control de difusión del analito y oxígeno a la capa de enzima 53 las medidas del analito en la muestra resultarán imprecisas y no lineales.

En referencia aún a Fig. 3B, la capa de enzima 53 del sensor de glucosa o lactato, incluye al menos un tipo de enzima 49 necesaria para la reacción enzimática en la cual el analito específico participa que se estabiliza en la matriz de la capa de enzima 53. En una realización, la enzima 49 incluye al menos una proteína con actividad enzimática. En otras realizaciones, la enzima 49 incluye una mezcla de varias enzimas, proteínas y estabilizadores, por ejemplo.

En una realización particular de la invención, la enzima de proteína 49 oxidasa de glucosa u oxidasa de lactato están insertadas en la capa de enzima 53 y crean un electrodo 91 y 92 específicamente sensibles a la glucosa y lactato, respectivamente, presentes en la muestra. El electrodo de glucosa 91 incluye glutaraldehído y oxidasa de glucosa en la capa de enzima 53. En una realización, el electrodo de glucosa 91 podría incluir 0.10 g de glutaraldehído por gramo de oxidasa de glucosa. En una realización particular, el electrodo de lactato 92 incluye al menos glutaraldehído, albúmina de suero bovino, un estabilizador de enzima como, por ejemplo, polietileneimina y oxidasa de lactato en la capa de enzima 53. En una realización, el electrodo de lactato 92 incluye 45% oxidasa de lactato por peso, 45% albúmina de suero bovino por peso, 5% polietileneimina (un estabilizador de enzima) por peso y 5% glutaraldehído por peso, por ejemplo. Las fracciones de peso de oxidasa de lactato y albúmina de suero bovino pueden variar. El porcentaje de peso de polietileneimina en la capa de enzima puede variar de 1 a 20, y el porcentaje de peso de glutaraldehído puede variar de 1 a 10. Otros estabilizadores de enzima incluyen aunque no limitan compuestos poliiónicos como polipropileneimina, poli (N-vinilimidazol), polialilamina, polivinilpiridina, polivinilpirrolidona, polilisina, protamina y sus derivados.

Incluso en otra realización de la invención, la capa de enzima 53 incluye una mezcla de varias enzimas, proteínas y estabilizadores insertados en la matriz de la capa de enzima 53 para detección específica de creatinina y creatina o sólo creatina. Las mezclas de enzima se usan en el electrodo de creatinina 116 y electrodo de creatina 118. La creatina sola se detecta con el electrodo de creatina 118. En una realización particular, el electrodo de creatinina 116 incluye una mezcla de 5% creatininasa por peso, 55% creatinasa por peso, 30% oxidasa sarcosina por peso, 5% poli(N-vinilimidazol) (un estabilizador de enzima) por peso y 5% glutaraldehído por peso, por ejemplo. Las fracciones de peso de creatininasa, creatinasa y oxidasa sarcosina en el electrodo de creatinina y las fracciones de peso de creatinasa y oxidasa sarcosina en el electrodo de creatinina pueden variar. El porcentaje de peso de poli (N-vinilimidazola) en electrodos de creatinina y creatina pueden variar, por ejemplo, de 10% a 20%, y el porcentaje de peso de glutaraldehído en los electrones de creatinina y creatina también puede variar, por ejemplo, de 1% a 10%. Los estabilizadores polifónicos, distintos a poly(N-vinilimidazola), también pueden usarse para estabilizar la mezcla de enzima. Ejemplos de compuesto poliiónicos incluyen, aunque no sólo se limitan, polietilenimina, polipropileneimina, polialilamina, polivinilpiridina, polivinilpirrolidona, polilisina, protamina y sus derivados.

En una realización de electrodos de glucosa, lactato, creatina, y creatinina, la capa de enzima 53 consiste en una matriz de enzimas de enlace cruzado, estabilizadores tales como polietilenimina o poli (N-vinilimidazola), y otras proteínas como albúmina de suero bovino. El enlace cruzado de las enzimas, estabilizadores, y otras moléculas de proteína se lleva a cabo con, por ejemplo, glutaraldehído o dialdehído. También pueden emplearse otros reactivos de enlace cruzado como 1,4-diisocianatobutano, un diisocianato, 1,2,7,8-diepoxioctano y 1,2,9,10-diepoxioctano y 1,2,9,10-diepoxidecano, ambos diepóxidos. En enlace cruzado de las moléculas de enzima y el uso de estabilizadores polifónicos y proteínas inertes en la matriz de enzima puede alargar de manera significativa la duración de almacenamiento así como la duración de uso de los electrodos de enzima.

En otra realización de la invención relacionada con los electrodos de creatinina 116 y creatina 118, la capa de enzima 53 incluye una mezcla de varias enzimas, proteínas, pero no tiene un estabilizador de enzima. En esta realización, el electrón de creatinina 116 incluye una mezcla de 30% creatininasa, 30% creatinasa, 30% oxidasa sarcosina y 10% glutaraldehído (porcentajes por peso). En esta realización, el electrodo de creatina 118 incluye una mezcla de 45% creatinasa, 45% oxidasa sarcosina y 10% glutaraldehído (porcentajes por peso). La capa de enzima 53 puede tener un grosor en el rango de 1 a 10 micrones, preferentemente 2-5 micrones medidos a partir de la superficie interna de la membrana externa 51 hasta la superficie externa de la membrana de rechazo de interferencia interna 55.

En referencia a Figs. 3A y 3B, el electrodo de enzima 59 también incluye una membrana de rechazo de interferencia interna 55 que es una membrana polimérica restaurable en cercano contacto con el cable 57. La membrana de rechazo de interferencia interna 55 puede estar formada por la polimerización de monómeros electropolimerizables. Adecuados monómeros electropolimerizables incluyen benzotiofeno, fenilenediaminas, y fenoles, por ejemplo. La membrana de rechazo de interferencia interna 55, que normalmente tiene menos de un micrón de grosor, aísla o protege el cable 57 del compuesto en la muestra, específicamente compuestos oxidables, que interfieren con el funcionamiento correcto del electrodo de enzima.

En una realización de acuerdo con la invención, la membrana polimérica que comprende la membrana de rechazo de interferencia interna 55 está formada por la aplicación de un potencial eléctrico al cable 57 en la presencia de monómeros electropolimerizables. Los monómeros en la presencia de un potencial eléctrico polimerizan el cable 57 para formar una membrana de rechazo de interferencia interna 55 eléctricamente aislable en el cable 57 que se muestra en Figs. 3A y 3B. Peróxido de hidrógeno, que se genera de la actividad de la enzima del electrodo de enzima en un analito específico, pasa a través de los poros de la membrana de rechazo de interferencia interna 55 y entra en contacto con el cable 57 provocando una señal eléctrica que se generará en el cable 57. El tamaño más pequeño de los poros en la membrana de rechazo de interferencia interna 55 evita que los compuestos encontrados en la muestra, mayores que el peróxido de hidrógeno, como acetaminofeno, ácido ascórbico, ácido úrico, cisteína y otros compuestos electroactivos que son mayores que H_{2}O_{2}, interfieran y reduzcan la eficacia del electrodo 59 del sensor
electroquímico.

Retirada de Agentes Parásitos

La exposición del electrodo de enzima 59 a la muestra en el canal de flujo 56 provoca que la membrana compuesta 60 retenga concentraciones residuales del sustrato de la muestra y productos de la reacción enzimática de la operación del electrodo de enzima 59. Estas sustancias son ejemplos de los agentes perturbadores o parásitos que provocarán que el electrodo pierda exactitud y precisión en la medición del analito elegido. Con el fin de reestablecer la exactitud y precisión en el electrodo de enzima 59, se retiran los agentes parásitos de la membrana compuesta 60 del electrodo de enzima 59 aplicando una amplitud adicional de polarización al cable 57 del electrodo de enzima 59.

Un pulso de polarización puede aplicarse mediante una fuente eléctrica al cable 57 después de cada exposición del electrodo 59 a la muestra con el fin de preparar el electrodo 59 para la siguiente medición. Por ejemplo, peróxido de hidrógeno, un producto de la reacción de enzima y el analito de la operación del electrodo 59, es un ejemplo de agente parásito. Para eliminar los agentes parásitos como peróxido de hidrógeno, se aplica una amplitud adicional de polarización al cable 57 que provoca oxidación del agente parásito. La oxidación del agente parásito provoca que el agente parásito sea incapaz de afectar la actividad eléctrica en el cable 57 eliminando de manera eficaz los agentes del electrodo 59. Los analitos, como glucosa y lactato, también constituyen agentes parásitos cuando concentraciones residuales de glucosa y lactato permanecen en el electrodo de enzima 59 entre lecturas de muestra. Un pulso de polarización aplicado al cable 57 oxida el analito residual y por lo tanto elimina la contribución de analito residual entre muestras para medidas erróneas de analitos.

En una realización de acuerdo con la invención, después de que se haya completado la medición del analito en una muestra, el electrodo de enzima 59 es reestablecido sacando la muestra fuera del canal de flujo 56, y un volumen de solución de lavado del depósito 17 se extrae a través del canal de flujo 56. Durante este momento, una polarización adicional es interpuesta sobre la polarización estable aplicada continuamente a los electrodos 59 tras la medición de la muestra. La polarización vuelve posteriormente a su línea base y se introduce una solución de calibración en el canal de flujo 56 seguida de una calibración de un punto para preparar al electrodo 59 para la próxima medición.

La amplitud suficiente y la duración del pulso de polarización requerido para la oxidación de agentes parásitos se determinan por geometría del canal de flujo 56. Amplitudes de mayor pulso y duraciones de pulso más largas son necesarias para un electrodo 59 con un canal de flujo estrecho 56 y un ritmo de flujo lento de solución de lavado. En una realización preferente ilustrada en Fig. 3A, una amplitud de polarización de 0.4 V contra un electrodo referencial integrado durante una duración de 50 segundos es suficiente para eliminar compuestos parásitos de la membrana compuesta 60, y por lo tanto mejorar la precisión de la mediciones del electrodo 59. Una amplitud de polarización en la tasa de 0.1 a 0.8 V contra el electrodo referencial integrado durante una duración de 10 a 200 segundos podría ser suficiente.

Operación Inicial del Montaje

En referencia a la Fig. 1, cuando la cápsula con el montaje de sensor 10 y las bolsas rellenas 14, 16 y 28 se usan por primera vez, la válvula 18 se controla para dirigir una de las soluciones de calibración, por ejemplo, solución de calibración B, en el montaje de sensor de modo que llene por completo el canal de flujo. Posteriormente, la bomba es detenida durante un periodo de tiempo de 10-30 minutos, preferentemente 12-15 minutos, y durante este periodo los electrodos del sensor químico seco se hidratan por ciclo termal, por ejemplo, de 37ºC a 60ºC y de nuevo a 37ºC.

En una realización de la invención, el montaje de sensor de electrodo químico seco 10 se inserta en el sistema de sensor electroquímico 8 y la válvula 18 se controla mediante el microprocesador 40 para dirigir la solución de calibración B hacia el montaje de sensor 10. El montaje de bloqueo termal se establece a una temperatura por medio de la cual la temperatura de la placa termal 52 es suficiente para calentar la solución calibradora en contacto con el sensor químico seco a una temperatura en el rango de 55ºC a 75ºC, preferentemente 60ºC, durante 10-30 minutos, preferentemente 12 minutos. Después de un periodo de tiempo específico, el microprocesador 40 invierte el sentido del flujo de corriente a través del dispositivo termoeléctrico para enfriar la placa termal 52. La tarjeta sensora 50 y la solución calibradora en contacto con la placa termal 52 se enfrían a 37ºC. La temperatura, controlada por el microprocesador 40, se mantiene a 37ºC durante la vida de la cápsula 37. Tras la hidración de los sensores, el ciclo de tratamiento de los electrodos de enzima 59 empieza bombeando la solución AO 23 a la tarjeta sensora 50 y empapando los electrodos 50 de 1 a 6 minutos, preferentemente durante 3 minutos mientras el potencial de polarización de los electrodos de enzima 59 se eleva de 0.25 a 0.5 V contra el electrodo referencial integrado. Durante la exposición AO, la membrana de rechazo de interferencia interna 55 de los electrodos de enzima 59, mostrados en Fig. 3B, es restablecida. Además, en este ciclo el nivel bajo de oxígeno es también calibrado. Cuando se completa el ciclo AO, el ciclo de enjuague comienza bombeando la solución de enjuague del envase preempaquetado 17 y el canal de flujo 56 por la bomba peristáltica 26. Durante el ciclo de enjuague, el potencial de polarización de los electrodos de enzima 59 se cambia de 0.5 a 0.4 V con el fin de acelerar la eliminación de residuos AO de la membrana de rechazo de interferencia interna 55. Tras la finalización del ciclo de enjuague, el potencial de polarización de los electrodos de enzima 59 descienden al nivel normal de aproximadamente 0.25 V contra el electrodo referencial integrado. Un ciclo de calibración con soluciones A 14 y B 16 por lo tanto comienza. La cápsula 37 se prepara de este modo para la medición de muestra durante los 30 minutos de inserción de la cápsula 37 en el sistema de sensor electroquímico 8.

Claims (6)

1. Un método para eliminar agentes parásitos de una membrana compuesta (60) tras una medición de muestra, constando dicho método de los siguientes pasos:

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proporcionar un electrodo de enzima (59), dicho electrodo de enzima comprendiendo un hilo conductor (57) y una membrana compuesta (60), constando dicha membrana compuesta de una capa externa (51), una capa de enzima (53), y una capa de rechazo de interferencia interna (55), donde dicha capa de rechazo de interferencia interna está en contacto con dicho hilo y dicha capa de enzima está dispuesta entre la capa externa y la capa de rechazo de interferencia interna;

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proporcionar una fuente eléctrica en contacto eléctrico con dicho electrodo (59);

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aplicar continuamente una polarización estable a dicho electrón; y

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superponer un pulso de polarización adicional sobre dicha polarización estable después de que una medición de muestra sea suficiente para causar oxidación y eliminar al menos una parte de agentes parásitos en dicha membrana compuesta.

2. El método de la reivindicación 1, donde dicho pulso de polarización tiene una amplitud cuyo rango se sitúa entre +0.1 V a 0.8 V contra un electrodo referencial integrado Ag/AgNO_{3} (106).

3. El método de la reivindicación 1, donde dicho pulso de polarización se aplica durante 10 a 200 segundos.

4. El método de la reivindicación 1, donde dicho pulso de polarización tiene una amplitud de +0.4 V contra un electrodo referencial integrado Ag/AgNO_{3} (106) y se aplica durante 50 segundos.

5. El método de la reivindicación 1, donde dicha capa de enzima (53) comprende oxidasa de
glucosa.

6. El método de la reivindicación 1, donde dicha capa de enzima (53) comprende oxidasa de lactato.