ES2256362T3

ES2256362T3 - Homologo de la proteina del veneno de serpiente y acido nucleico que lo codifica.

Info

Publication number: ES2256362T3
Application number: ES02012968T
Authority: ES
Inventors: Kevin Baker; Jian Chen; Audrey Goddard; Austin L. Gurney; Victoria Smith; Colin K. Watanabe; William I. Wood; Jean Yuan
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1998-08-11
Filing date: 1999-06-02
Publication date: 2006-07-16
Anticipated expiration: 2019-06-02
Also published as: DE69929253D1; EP1247863B1; PT1247863E; ATE314473T1; EP1247863A1; DE69929253T2; DK1247863T3

Abstract

Ácido nucleico que comprende el DNA que codifica un polipéptido con al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de los residuos aminoacídicos 1 o 20 al 105, inclusive, de la secuencia aminoacídica que se muestra en la Figura 2 (SEC ID NO:4), o el complemento de lo mismo, en donde dicha identidad de secuencia se determina sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan.

Description

Homólogo de la proteína del veneno de serpiente y ácido nucleico que lo codifica.

Campo de la invención

La presente invención hace referencia en general a la identificación y aislamiento de un DNA nuevo y a la producción recombinante de nuevos polipéptidos.

Antecedentes de la invención

Las proteínas extracelulares desempeñan funciones importantes en, entre otras cosas, la formación, la diferenciación y el mantenimiento de los organismos multicelulares. El destino de muchas células individuales, p.ej., la proliferación, la migración, la diferenciación o la interacción con otras células, está gobernado por la información recibida por otras células y/o el entorno inmediato. La información se transmite a menudo por los polipéptidos secretados (por ejemplo, los factores mitogénicos, los factores de supervivencia, los factores citotóxicos, los factores de diferenciación, los neuropéptidos y las hormonas) que, a su vez, son recibidos e interpretados por los diversos receptores celulares o proteínas unidas a membrana. Estos polipéptidos secretados o moléculas de señalización a través, generalmente, de vías de secreción celular alcanzan su sitio de reacción en el entorno extracelular.

Las proteínas secretadas tienen aplicaciones industriales diversas, incluyendo las farmacéuticas y diagnósticas, o las aplicaciones en biosensores y bioreactores. La mayoría de los fármacos proteicos que están disponibles en la actualidad, como los agentes trombolíticos, los interferones, las interleucinas, las eritropoyetinas, los factores estimulantes de la formación de colonias y diversas otras citoquinas, son proteínas de secreción. Sus receptores, que son proteínas de membrana, también tienen un potencial como agentes terapéuticos o diagnósticos. Se han realizado esfuerzos tanto por la industria como por el mundo académico para identificar proteínas secretadas nativas, nuevas. Muchos de los esfuerzos se han centrado en el cribado de librerías de DNA recombinante de mamífero para identificar las secuencias codificantes de nuevas proteínas secretadas. Ejemplos de procedimientos y técnicas de cribado están descritos en la literatura (véase, p.ej., Klein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:710-7113 (1996); y la patente americana U.S. 5.536.637).

Las proteínas unidas a membrana y los receptores pueden desempeñar funciones importantes en, entre otras cosas, la formación, diferenciación y mantenimiento de organismos multicelulares. El destino de muchas células individuales, p.ej., la proliferación, la migración, la diferenciación o la interacción con otras células, está gobernado por la información recibida por otras células y/o el entorno inmediato. La información se transmite a menudo por los polipéptidos secretados (por ejemplo, los factores mitogénicos, los factores de supervivencia, los factores citotóxicos, los factores de diferenciación, los neuropéptidos y las hormonas) que, a su vez, son recibidos e interpretados por los diversos receptores celulares o proteínas unidas a membrana. Dichas proteínas unidas a membrana y receptores incluyen, pero no se limitan a, los receptores de citoquinas, los receptores quinasas, los receptores fosfatasas, los receptores implicados en las interacciones célula-célula y las moléculas de adhesión celular como las selectinas y las integrinas. Por ejemplo, la transducción de señales que regula el crecimiento celular y la diferenciación está controlada en parte por la fosforilación de diversas proteínas celulares. Las proteínas tirosina-quinasas, enzimas que catalizan dicho proceso, también pueden actuar como receptores de factores de crecimiento. Como ejemplos se incluyen el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos y el receptor del factor de crecimiento.

Las proteínas unidas a membrana y las moléculas de receptor tienen diversas aplicaciones industriales, incluyendo los agentes farmacológicos y los diagnósticos. Los receptores inmunoadhesinas, por ejemplo, pueden utilizarse como agentes terapéuticos para bloquear las interacciones receptor-ligando. Las proteínas unidas a membrana también pueden utilizarse para el cribado de inhibidores potenciales de péptidos o pequeñas moléculas implicados en la interacción receptor/ligando.

Se han realizado esfuerzos tanto por la industria como por el mundo académico para identificar nuevos receptores nativos o proteínas unidas a membrana. Muchos de los esfuerzos se han centrado en el cribado de librerías de DNA recombinante de mamífero con el fin de identificar las secuencias codificantes de nuevos receptores o proteínas unidas a membrana.

PRO 1186

La proteína A del veneno de Dendroaspis polylepis (mamba negra) que comprende 81 aminoácidos, incluyendo los diez de la mitad de residuos de cisteína. Los venenos son de interés por una parte como armas bélicas, y por otra parte, para utilizar en ensayos de determinación de agentes que invierten o inhiben los efectos del veneno o un veneno similar. El veneno de la mamba negra se describe además en Int. J. Biochem., 17(6):695-699 (1985) y Joubert y Strydom, Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem., 361 (12):1787-1794 (1980).

En la presente invención se describe la identificación y caracterización de polipéptidos nuevos que tienen una homología con la proteína A del veneno de la serpiente, denominados aquí como polipéptidos PRO1186.

Resumen de la invención PRO1186

Se ha identificado un clon de cDNA (DNA60621-1516) que codifica un polipéptido nuevo que tiene identidad de secuencia con la proteína A del veneno de la serpiente y se ha denominado en la presente invención como "PRO1186".

En una realización, tal como se define en las reivindicaciones, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende un DNA que codifica un polipéptido PRO1186.

En un aspecto, tal como se define en las reivindicaciones, el ácido nucleico aislado comprende el DNA que tiene al menos una identidad de secuencia del 80%, preferentemente de al menos un 85% de identidad de secuencia, preferentemente de al menos un 90% de identidad de secuencia, más preferentemente de al menos un 95% de identidad de secuencia con (a) la secuencia de DNA de la Fig. 1 (SEC ID NO:3) que codifica un polipéptido PRO1186 con la secuencia de residuos aminoacídicos desde el 20 al 105, inclusive, de la Figura 2. (SEC ID NO:4); y con (b) el complemento de la molécula de DNA de (a).

En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislado que comprende el cDNA de la proteína humana depositado en el ATCC con el número 203091 (DNA60621-1516).

En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende (a) el DNA que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia, preferentemente al menos un 85% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 90% de identidad de secuencia y todavía más preferentemente un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de los residuos aminoacídicos desde aproximadamente el 20 al 105, inclusive de la Figura 2 (SEC ID NO:4), o la secuencia complementaria a la del DNA de (a).

En otra realización, tal como se define en las reivindicaciones, la invención proporciona el polipéptido PRO1186 aislado.

En un aspecto específico, tal como se define en las reivindicaciones, la invención proporciona la secuencia nativa del polipéptido PRO1186, el cual en una realización, incluye una secuencia aminoacídica que comprende los residuos del 20 al 105 de la Figura 2: (SEC ID NO:4).

En otro aspecto, tal como se define en las reivindicaciones, la invención se refiere a un polipéptido PRO1186 aislado, que comprende una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia, preferentemente al menos un 85% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 90% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia aminoacídica de los residuos 20 a aproximadamente el 105, inclusive, de la Figura 2 (SEC ID NO:4).

En otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido PRO1186 aislado, que comprende la secuencia de residuos aminoacídicos 20 al 105, inclusive de la Figura 2 (SEC IS NO:4).

Realizaciones adicionales

En otra realización de la presente invención, la invención proporciona vectores que comprenden el DNA que codifica cualquiera de los polipéptidos descritos más arriba o más adelante. También se proporciona una célula huésped que comprende cualquiera de dichos vectores. A modo de ejemplo, las células huéspedes pueden ser células CHO, E. coli, o levaduras. Se proporciona además un proceso para la producción de cualquiera de los polipéptidos descritos más arriba o más adelante, el cual comprende el cultivo de células huésped en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido deseado y la recuperación de dicho polipéptido deseado del cultivo celular.

En otras realizaciones, la invención proporciona moléculas quiméricas que comprenden cualquiera de los polipéptidos descritos más arriba o más adelante fusionados con un polipéptido heterólogo o la secuencia aminoacídica. Un ejemplo de dicha molécula quimérica comprende cualquiera de los polipéptidos descritos más arriba o más adelante fusionados con una secuencia etiqueta epitópica o una región Fc de una inmunoglobulina.

En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a cualquiera de los polipéptidos descritos más arriba o más adelante. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En otra realización, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido PRO.

En otros aspectos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia, preferentemente al menos un 81% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 82% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos un 83% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos un 84% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos un 85% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos un 86% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos un 87% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos un 88% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos un 89% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos un 90% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos un 91% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos un 92% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos un 93% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos un 94% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos un 95% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos un 96% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos un 97% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos un 98% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos un 99% de identidad de secuencia con (a) una molécula de DNA que tiene la secuencia codificante de un cDNA del polipéptido PRO de longitud completa tal como se describe aquí, o la secuencia codificante de un polipéptido PRO de longitud completa que carece del péptido señal tal como se describe aquí, o (b) la secuencia complementaria de la molécula de DNA de (a).

En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia, preferentemente al menos un 81% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 82% de identidad de secuencia, todavía más preferentemente al menos un 83% de identidad de secuencia.

En otra realización, la invención proporciona un polipéptido PRO aislado codificado por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico aisladas identificadas más arriba.

En algunos aspectos, la invención concierne a un polipétido PRO aislado, que corresponde a una secuencia de aminoácidos con al menos una identidad de secuencia del 80%, preferentemente con al menos una identidad de secuencia del 81%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia de 82%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia de al menos un 87%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia de al menos un 88%, aún más preferentemente con al menos un 89% de identidad de secuencia, aún más preferentemente con al menos una identidad de secuencia del 90%, aún más preferentemente con al menos una identidad de secuencia de 91%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia de al menos un 92%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia de 93%, o aún más preferentemente con al menos una identidad de secuencia de 94%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia de 95%, aún más preferentemente con al menos una identidad de secuencia de 96%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia del 97%, aún más preferentemente con al menos una identidad de secuencia del 98% y aún más preferentemente con una identidad de secuencia de al menos 99% de la secuencia completa de aminoácidos correspondiente al polipéptido PRO tal como se describe aquí, o de una secuencia completa de aminoácidos sin péptido señal tal como se describe aquí.

En otro aspecto, la presente invención concierne a un polipétido PRO aislado que corresponde a una secuencia de aminoácidos con al menos una identidad de secuencia del 80%, preferentemente con una identidad de secuencia de al menos alrededor del 81%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia de al menos 82%, aún más preferentemente de una identidad de secuencia de al menos 83%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia de al menos un 84%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia de 85%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia de al menos 86%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia de al menos 87%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia de al menos 88%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia de al menos 89%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia de al menos 90%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia de al menos 91%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia de al menos 92%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia de al menos 93%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia de al menos 94%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia de al menos 91%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia de al menos 95%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia de al menos 96%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia de al menos 97%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia de al menos 98%, aún más preferentemente con una identidad de secuencia de al menos 99% con una secuencia de aminoácidos codificada por el cDNA de la proteína humana depositado en el ATCC, tal como se describe aquí.

En un aspecto específico, la invención proporciona un polipéptido PRO aislado sin secuencia señal N-terminal y/o metionina inicial y la secuencia de nucleótidos que codifica para esa secuencia de aminoácidos. Se describen aquí, los diferentes procesos para la producción del mismo que incluyen el cultivo de las células huéspedes, el vector que contiene la molécula de ácido nucleico que codifica en condiciones adecuadas la expresión del polipéptido PRO y su recuperación del cultivo celular.

Descripción resumida de las figuras

La Figura 1 muestra una secuencia nucleotídica (SEC ID NO:3) de una secuencia nativa PRO1186 (UNQ60 cDNA, en donde la SEC ID NO:3 es un clon denominado aquí como "DNA 60621-1516".

La Figura 2 muestra la secuencia aminoacídica (SEC ID NO:4) derivada de la secuencia codificante de la SEC ID NO: 3, tal como se muestra en la Figura 1.

Descripción detallada de las realizaciones preferidos I. Definiciones

Los términos "polipéptido PRO" y "PRO", tal como se usan aquí, y cuando van seguidos inmediatamente de una designación numérica se refieren a polipéptidos, cuya designación completa (p.ej., PRO/número) indica la secuencia específica, tal como se describe aquí. En los términos "PRO/número del polipéptido" y "PRO/número", en donde el término "número" proporciona una designación numérica, tal como se utiliza aquí, abarca secuencias nativas de polipéptidos y variantes polipeptídicas (que se definen más adelante). Los polipéptidos PRO descritos aquí, pueden aislarse de una variedad de fuentes, tal como a partir de tejidos humanos de diferentes tipos o de otras fuentes, o pueden prepararse mediante procedimientos recombinantes o sintéticos.

Una "secuencia nativa de polipéptido PRO" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el correspondiente polipéptido PRO de la naturaleza. Dicha secuencia nativa de polipéptidos PRO, puede aislarse de la naturaleza o puede producirse mediante procedimientos recombinante o sintéticos. El término "secuencia nativa de polipéptido PRO" abarca específicamente formas naturales truncadas o formas secretadas del polipéptido específico PRO (p.ej., una secuencia del dominio extracelular), formas variantes naturales (p.ej., formas derivadas por ayuste alternativo) y variantes naturales alélicas del polipéptido. En varias realizaciones de la presente invención, la secuencia nativa PRO1188 es una secuencia completa o una secuencia nativa madura PRO1185 que comprende los aminoácidos 1 o 20 hasta el 105 de la Figura 2 (SEC ID NO:4).

En las figuras, los codones de iniciación y parada se muestran en negrita y subrayados.

"Variante del polipéptido PRO" significa un polipéptido PRO activo, tal como se ha definido más arriba o más adelante, que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia nativa completa del polipéptido PRO, o con la secuencia completa nativa del polipéptido PRO sin péptido señal, como se describe aquí. Dichas variantes del polipéptido PRO incluyen, polipéptidos PRO a los que se han añadido o delecionado uno o más residuos de aminoácidos en los extremos N- o C-terminales de la secuencia de aminoácidos nativa completa. Generalmente, la variante del polipéptido PRO tiene al menos una identidad de secuencia del 80%, preferentemente al menos una identidad de secuencia del 81%, más preferentemente al menos una identidad de secuencia del 82%, más preferentemente una identidad de secuencia de al menos un 83%, más preferentemente una identidad de secuencia de al menos un 84%, más preferentemente una identidad de secuencia de al menos un 85%, más preferentemente una identidad de secuencia de al menos un 85%, más preferentemente una identidad de secuencia de al menos un 86%, más preferentemente una identidad de secuencia de al menos un 87%, más preferentemente una identidad de secuencia de al menos un 88%, más preferentemente una identidad de secuencia de al menos un 89%, más preferentemente una identidad de secuencia de al menos un 90%, más preferentemente una identidad de secuencia de al menos un 91%, más preferentemente una identidad de secuencia de al menos un 92%, más preferentemente una identidad de secuencia de al menos un 93%, más preferentemente una identidad de secuencia de al menos un 94%, más preferentemente una identidad de secuencia de al menos un 95%, más preferentemente una identidad de secuencia de al menos un 96%, más preferentemente una identidad de secuencia de al menos un 97%, más preferentemente una identidad de secuencia de al menos un 98%, más preferentemente una identidad de secuencia de al menos un 99% con la secuencia nativa completa de aminoácidos aquí descrita. Generalmente, las variantes del polipéptido PRO tienen al menos 70 aminoácidos de longitud, o más frecuentemente al menos 80 aminoácidos de longitud, más frecuentemente al menos 90 aminoácidos de longitud, más frecuentemente al menos 100 aminoácidos de longitud.

La "identidad de secuencia en porcentaje (%) de aminoácidos" con respecto a las secuencias identificadas para el polipéptido PRO, se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en cada secuencia candidata que es idéntico a los residuos de aminoácidos en la secuencia específica del polipéptido PRO, después de alinear las secuencias e introduciendo los espacios de no alineamiento, si fuera necesario, para alcanzar la máxima identidad de secuencia, sin considerar substituciones conservadoras como parte de la identidad de la secuencia. El alineamiento, para propósitos de determinación del porcentaje de identidad de secuencia, puede alcanzarse de diferentes formas que son bien conocidas en la materia y con las herramientas de disponibilidad pública de los programas informáticos como son BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia, pueden determinar de forma adecuada los parámetros para medir el alineamiento, incluyendo los algoritmos necesarios para alcanzar el máximo alineamiento en la mayor longitud de secuencias a comparar. Para los propósitos descritos aquí, sin embargo, los valores en % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan con el programa de ordenador WU-BLAST2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)). Para la mayoría de los parámetros de búsqueda del WU-BLAST-2 se utilizan los valores por defecto. En aquellos que no son por defecto, por ejemplo los parámetros ajustables, se incluyen los siguientes valores: overlap span=1 (extensión del solapamiento), overlap fraction=0.125 (fracción del solapamiento), word threshold (T)=11 (umbral) y scoring matrix=BLOSUM62 (matriz de valoración). Para los propósitos descritos aquí, un valor en % de identidad de secuencia se determina dividiendo (a), el número de residuos de aminoácidos idénticos coincidentes entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO de interés que tiene una secuencia derivada del polipéptido PRO nativo y la secuencia aminoacídica de comparación (p.ej., la secuencia con quien se compara el polipéptido PRO de interés puede ser una variante del polipéptido PRO), que se determina por WU-BLAST-2, por (b) el número total de residuos de aminoácidos del polipéptido PRO de interés.

"Polinucleótido PRO variante" o "secuencia nucleotídica variante de PRO" significa una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido activo de PRO tal como se define más adelante y que tiene al menos una identidad de secuencia del 80% con una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia nativa completa para el polipétido PRO tal como se describe aquí o una secuencia nativa completa del polipéptido PRO que carece de péptido señal tal como se describe aquí. Generalmente, un polipéptido PRO variante tendrá al menos un 80% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 81% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 82% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 83% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 84% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 85% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 86% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 87% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 88% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 89% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 90% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 91% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 92% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 93% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 94% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 95% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 96% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 97% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 98% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia nativa completa de la secuencia del polipéptido PRO que se describe aquí, o la secuencia nativa completa que carece del péptido señal, tal como se describe aquí. Las variantes no abarcan la secuencia nativa de nucleótidos.

Generalmente, los polinucleótidos variantes de PRO tienen al menos 210 nucleótidos de longitud, más frecuentemente al menos 240 nucleótidos de longitud, más frecuentemente al menos 270 nucleótidos de longitud, más frecuentemente al menos 300 nucleótidos de longitud.

"Identidad de secuencia en % porcentaje de ácidos nucleicos" con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos de las secuencias que codifican PRO, identificadas aquí, se define como un porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos con los nucleótidos en una secuencia de ácidos nucleicos de PRO de interés, después de alinear las secuencias e introducir los espacios sin alineamiento, si fuera necesario, para alcanzar el máximo porcentaje de identidad de secuencia. El alineamiento para propósitos de determinación del porcentaje de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, puede alcanzarse de formas diferentes bien conocidas en la materia y con las herramientas de programas informáticos disponibles públicamente como son BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Para los propósitos descritos aquí, sin embargo, los valores de % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, se generan con el programa de ordenador WU-BLAST2 (Altschul y col., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)). Para la mayoría de los parámetros de búsqueda de WU-BLAST-2, se utilizan los valores por defecto. En aquellos que no son por defecto, por ejemplo los parámetros ajustables, se incluyen los siguientes valores: overlap span=1, overlap fraction=0.125, word threshold (T)=11 y scoring matrix=BLOSUM62. Para los propósitos descritos aquí, un valor en % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos se determina dividiendo (a), el número de nucleótidos idénticos coincidentes entre la secuencia de ácidos nucleicos codificante del polipéptido PRO de interés que tiene una secuencia derivada de la secuencia de ácido nucleico codificante del polipéptido PRO y la molécula del ácido nucleico de interés a comparar (p.ej., la secuencia contra la que el ácido nucleico codificante del polipéptido PRO de interés se compara puede ser una variante del polipéptido PRO), y determinado según WU-BLAST-2, por (b), el número total de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico codificante del polipéptido PRO de interés.

En otras aplicaciones, los polinucleótidos variantes de PRO son moléculas de ácidos nucleicos que codifican una forma activa de polipéptido PRO y que son capaces de hibridar, preferentemente en condiciones astringentes de hibridación y lavado, con las secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia completa del polipéptido PRO, tal como se describe aquí. Los polipéptidos variantes de PRO pueden ser los codificados por polinucleótidos variantes de PRO.

El término "aislado" cuando se utiliza para describir los diferentes polipéptidos descritos aquí, significa que el polipéptido ha sido identificado y separado y/o recuperado de entre los componentes de su entorno natural. Los componentes contaminantes de ese entorno natural son materiales que podrían interferir en el uso diagnóstico o terapéutico del polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, el polipéptido se purifica: (1) a un grado suficiente como para obtener al menos 15 residuos N-terminales o de la secuencia de aminoácidos interna, mediante el uso de un secuenciador spinning cup, o (2) a homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o condiciones reductoras con azul de Coomassie o, preferentemente, con tinción de plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ en las células recombinantes, ya que al menos un componente del medio natural del polipéptido PRO no está presente. Generalmente, sin embargo, el polipéptido aislado se prepara con al menos un paso de purificación.

Un ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO "aislado" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante que está asociada generalmente en la fuente natural del ácido nucleico del polipéptido PRO. Una molécula aislada de ácido nucleico del polipéptido PRO es distinta a la forma en que se encuentra en la naturaleza. Por tanto, una molécula aislada de ácido nucleico del polipéptido PRO se distingue de la molécula específica del ácido nucleico del polipéptido PRO que existe en la célula de forma natural. Sin embargo, la molécula aislada de ácido nucleico del polipéptido PRO incluye moléculas de ácido nucleico del polipéptido PRO contenidas en las células que generalmente expresan el polipéptido PRO donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se halla en una localización cromosómica diferente a la de las células naturales.

El término "secuencias control" se refiere a secuencias de DNA que son necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped determinado. Las secuencias control que son adecuadas para procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un lugar de unión al ribosoma. Las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación e intensificadores de la transcripción.

Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando está situado en relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el DNA de una presecuencia o líder secretor está unido operativamente al DNA por un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador de la transcripción está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un lugar de unión al ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si está situado de forma que se facilita la traducción. Generalmente "unido operativamente" significa que las secuencias de DNA unidas son contiguas y en el caso de un líder secretor, contiguas y en la misma pauta de lectura. Sin embargo, los intensificadores de la transcripción no tienen por qué ser contiguos. La unión se consigue por ligación en las dianas de restricción correspondientes. Si estas dianas de restricción no existen, se utilizan oligonucleótidos sintéticos o engarces según procedimientos convencionales.

El término "anticuerpo" se utiliza en un sentido amplio y abarca específicamente, por ejemplo, anticuerpos monoclonales sencillos anti-PRO (incluyendo agonistas, antagonistas y anticuerpos neutralizantes), anticuerpos anti-PRO con especificidad poliepitópica, anticuerpos anti-PRO de una sola cadena, y fragmentos de anticuerpos anti-PRO (véase más abajo). El término "anticuerpo monoclonal", tal como se usa aquí, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, p.ej., una población de anticuerpos idénticos excepto por posibles mutaciones ocurridas de forma natural que pueden presentarse en menor proporción.

La "astringencia" de las reacciones de hibridación se determina fácilmente mediante por el experto en la materia y en general mediante un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración salina. En general, las sondas largas requieren temperaturas altas para una hibridación adecuada, mientras que sondas cortas necesitan temperaturas menores. La hibridación, en general, depende de la capacidad de un DNA desnaturalizado para renaturalizarse cuando las hebras complementarias se encuentran presentes en un mismo medio por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado deseado de homología entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor la temperatura relativa que debe utilizarse. Como consecuencia, a altas temperaturas relativas, las condiciones de reacción son más astringentes, mientras que es menor a bajas temperaturas. Para detalles adicionales y explicación de la astringencia de las reacciones de hibridación, véase Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

"Condiciones astringentes" o "altas condiciones de astringencia" tal como se definen aquí, pueden identificarse con lo siguiente: (1) empleo de baja fuerza iónica y alta temperatura de lavado, por ejemplo cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecil sulfato sódico al 0,1% a 50ºC;

(2) empleo durante la hibridación de un agente desnaturalizante, como la formamida, por ejemplo la formamida al 50% (v/v) con albúmina sérica bovina al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o (3) empleo de formamida al 50%, SSC 5X (ClNa 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, Solución de Denhardt 5X, DNA de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), SDS al 0,1%, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en SSC X 0,2 (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50% a 55ºC, seguido de lavados de alta astringencia consistentes en SSC X 0,1 con EDTA y a 55ºC.

"Condiciones moderadas de astringencia" pueden identificarse como las descritas por Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (p.ej., temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos astringentes que las descritas más arriba. Un ejemplo de condiciones de astringencia moderada es la incubación toda la noche a 37ºC en una solución que contiene: formamida al 20%, SSC X5 (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), Solución de Denhardt 5X, sulfato de dextrano al 10%, y DNA de esperma de salmón desnaturalizado a 20 mg/ml, seguido del lavado de los filtros en SSC X 1 y a aproximadamente 37º-50ºC. Un profesional cualificado hará los ajustes nece-
sarios de temperatura, condiciones iónicas, etc. para adaptar estos factores a la longitud de la sonda y otros factores.

El término "etiquetado epitópicamente" cuando se usa aquí se refiere a un polipéptido quimérico que comprende el polipéptido PRO fusionado con una "etiqueta polipeptídica" El polipéptido etiqueta tiene suficientes residuos para proporcionar un epitopo contra el que se pueda hacer un anticuerpo, incluso si es tan corto que no interfiera con la actividad del polipéptido con el que está fusionado. Además, preferentemente el polipéptido etiqueta es bastante único de forma que el anticuerpo no presente una reacción cruzada substancial con otros epitopos. Generalmente, los polipéptidos etiqueta adecuados tienen al menos seis residuos de aminoácidos y normalmente entre 8 y 50 residuos de aminoácidos (preferentemente, entre 10 y 20 residuos de aminoácidos).

Tal como se usa aquí, el término "immunoadhesina" designa moléculas semejantes a anticuerpos que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de los dominios constantes de las inmunoglobulinas. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden la fusión de una secuencia de aminoácidos con la deseada especificad de unión que es distinta a la de reconocimiento del antígeno y de la unión del antígeno al anticuerpo (es decir, es "heteróloga"), y una secuencia del dominio constante de la inmunoglobulina. La porción de adhesina de una molécula de inmunoadhesina generalmente es una secuencia contigua de aminoácidos que comprende al menos el sitio de unión de un receptor o un ligando. La secuencia del dominio constante de la inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse de cualquier inmunoglobulina, como a partir de los subtipos IgG-1, IgG-2, Ig-G3, o Ig-G4, IgA (incluidas las IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD o IgM.

"Activo" o "Actividad" para los propósitos descritos aquí, se refieren a la(s) forma(s) del polipéptido PRO que conservan actividad inmunológica y/o biológica del PRO nativo o natural, refiriéndose actividad "biológica" a función biológica (tanto inhibidora como estimuladora) causada por el PRO nativo o natural, y que difiere de la capacidad de inducción de la producción de anticuerpos contra un epitopo antigénico propio del PRO nativo o natural, y una actividad "inmunológica" hace referencia a la capacidad para inducir la producción de un anticuerpo contra un epitopo antigénico propio del PRO nativo o natural.

El término "agonista" se utiliza en sentido amplio e incluye cualquier molécula que parcial o totalmente bloquee, inhiba, o neutralice la actividad biológica de un polipéptido PRO nativo, tal como se ha descrito aquí. De forma similar, el término "agonista" se utiliza en un sentido amplio e incluye cualquier molécula que imite la actividad natural de un PRO activo nativo, descrito aquí. Entre las moléculas agonistas o antagonistas adecuadas, se incluyen específicamente los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, los fragmentos o variantes de la secuencia de aminoácidos de polipéptidos PRO nativos, los péptidos, las pequeñas moléculas orgánicas, etc. Los métodos para identificar agonistas o antagonistas de un polipéptido PRO pueden incluir el contacto del polipéptido PRO con una de esas moléculas candidatas y la cuantificación de los cambios detectables en una o más de las actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido PRO.

"Tratamiento" se refiere tanto a un tratamiento terapéutico como profiláctico o a las medidas preventivas, el objetivo aquí es prevenir o disminuir una condición o trastorno patológicos determinados. Entre los que tienen necesidad de tratamiento se incluyen los que presentan el trastorno, los que son propensos a tenerlo o aquellos en los que debe prevenirse la aparición de éste.

Administración "crónica" se refiere a la administración de agente(s) de forma continua, en oposición con la forma aguda, para el mantenimiento del efecto terapéutico inicial (o actividad) durante un período de tiempo más amplio. Administración "intermitente" se refiere al tratamiento que se realiza sin interrupción pero de forma no consecutiva, distribuido en ciclos.

"Mamífero" para los propósitos de tratamiento se refiere a animales clasificados como mamíferos, incluyendo los seres humanos, los animales domésticos o animales de granja, zoo, los deportivos o las mascotas como los perros, gatos, el ganado vacuno, los caballos, las ovejas, los cerdos, las cabras, los conejos, etc. Preferentemente, el mamífero es el hombre.

La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos hace referencia a la administración simultáneamente (en concurrencia) y la administración consecutiva a la administración en cualquier orden.

"Vehículos" tal como se usa aquí, incluyen los vehículos farmacéuticamente aceptados, los excipientes, o los estabilizantes que no sean tóxicos para la célula o el mamífero que se exponga a las dosis y concentraciones empleadas. A menudo el vehículo aceptable fisiológicamente es una solución acuosa de pH tamponado. Ejemplos de vehículos fisológicamente acceptables incluyen los tampones como el fosfato, el citrato u otros ácidos orgánicos; los antioxidantes incluyendo el ácido ascórbico; los polipéptidos de bajo peso molecular (menor de aproximadamente 10 residuos); las proteínas, como la albúmina sérica, la gelatina o las inmunoglobulinas; los polímeros hidrofílicos como la polivinilpirrolidona; los aminoácidos como la glicina, la glutamina, la asparraguina, la arginina o la lisina; los monosacáridos, los disacáridos y otros carbohidratos como la glucosa, la manosa o las dextrinas; los agentes quelantes como el EDTA;

los azúcares alcohólicos como el manitol o el sorbitol; los iones formadores de sales como el sodio; y/o los tensoactivos no iónicos como el TWEEN^{TM}, el polietilén glicol (PEG) y el PLURONICS^{TM}.

Se entiende por "fragmentos de anticuerpos" una porción de un anticuerpo intacto, preferentemente la unión al antígeno o la región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab')_{2} y fragmentos Fv; los diacuerpos; los anticuerpos lineales (Zapata y col., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); las moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y los anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpos.

La digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos idénticos de unión al antígeno, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un único lugar de unión al antígeno, y un fragmento "Fc" residual, una designación que releja la capacidad de cristalizar. El tratamiento con pepsina rinde un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos lugares de unión al antígeno combinados y es capaz todavía de unirse con el antígeno.

"Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un lugar de reconocimiento completo del antígeno y un lugar de unión. Esta región es un dímero de una cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, en asociación no covalente. Es en esa configuración que las tres CDRs de cada dominio variable interactúan para definir un lugar de unión al antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Las seis CDRs conjuntamente, confieren al anticuerpo especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un dominio variable único (o mitad de un Fv que comprende sólo tres CDRs específicas para un antígeno) tiene la habilidad de reconocer y unir al antígeno aunque con menor afinidad que el lugar de unión entero.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab' por la adición de unos pocos residuos al extremo carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada e incluye una o más de una cisteína de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación para Fab' en donde el residuo(s) de cisteína de los dominios constantes, llevan un grupo tiol libre. El fragmento del anticuerpo F(ab')_{2} originalmente se produce como parejas de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. Así mismo, se conocen otros conectores de fragmentos de anticuer-
pos.

Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrados, pueden ser clasificadas como uno o dos tipos claramente distintos, denominados kappa y lambda, según las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas puede clasificarse según cinco clases mayores de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM y alunas de éstas pueden dividirse en subclases (isotipos), p.ej., IgG1, IgG2, IgG, IgG4, IgA, y IgA_{2}.

Los fragmentos de anticuerpos "Fv de cadena sencilla" o "sFv" comprenden los dominios de anticuerpos VH y VL, estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica sencilla. Preferentemente, el polipéptido tiene un engarce polipeptídico entre los dominios VH y VL que le permite, al sFv, formar la estructura deseada para la unión con el antígeno. Para una revisión sobre sFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 264-315 (1994).

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos lugares de unión al antígeno que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Utilizando un engarce demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, se fuerza a que los dominios se emparejen con dominios complementarios de otra cadena y se crean así dos lugares de unión al antígeno. Los diacuerpos se describen de manera más completa en, por ejemplo, la patente europea EP 404, 097; la patente internacional WO 93/11161; y Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

Un anticuerpo "aislado" es aquel que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente del medio natural. Los componentes contaminantes del medio natural son materiales que podrían interferir en el diagnóstico o en los usos terapéuticos de un anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En aplicaciones preferentes, el anticuerpo puede purificarse: (1) en más del 95% en peso de anticuerpo según se determina por el método de Lowry, y más preferentemente en más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos del N-terminal o de la secuencia de aminoácido interna con un secuenciador spinning cup sequenator, o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE, en condiciones reductoras o no reductoras con azul de Comassie o, preferentemente con tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ en células recombinantes, ya que al menos un componente del medio natural del anticuerpo no se encuentra presente. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se prepara con al menos un paso de purificación.

La palabra "marcado" cuando se utiliza aquí se refiere a un compuesto o composición detectable que está conjugado directa o indirectamente con el anticuerpo generando un anticuerpo "marcado". El marcaje debe ser detectable por sí mismo (p.ej., radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso del marcaje enzimático, se puede catalizar una alteración química de un compuesto o composición substrato que sea detectable.

Por "fase sólida" se entiende una matriz no acuosa a la que el anticuerpo de la presente invención puede adherirse. Ejemplos de fase sólida que están comprendidos aquí, incluyen aquellos formados parcial o enteramente de vidrio (p.ej., vidrios porosos controlados, polisacáridos, (p.ej., agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, polivinil alcohol y siliconas. En ciertas aplicaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida comprende el pocillo de una placa de ensayo; en otras, la purificación en columna (p.ej., columnas de cromatrografía de afinidad). Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas tal como las descritas en la patente americana U.S. No. 4.275.149.

Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensoactivos, la cual es útil para la administración de un compuesto (tal como el polipéptido PRO o el anticuerpo) a un mamífero. Los componentes del liposoma están normalmente ordenados en una formación en bicapa, similar al ordenamiento de los lípidos en las membranas biológicas.

Por "molécula pequeña" se definen aquí las que tienen un peso molecular inferior a los 500 Daltons.

\vskip1.000000\baselineskip

I. Composiciones y procedimientos de la invención

La presente invención proporciona secuencias nuevas de nucleótidos identificadas y aisladas que codifican para los polipéptidos referidos en la presente solicitud como polipéptidos de PRO. En particular, se han identificado y aislado cDNAs que codifican varios polipéptidos PRO, tal como se describe con mayor detalle en los Ejemplos de más adelante. Se ha observado que las proteínas producidas en rondas separadas de expresión pueden rendir diferentes números de PRO pero el número UNQ es único para una molécula de DNA dada y la proteína que codifica. Sin embargo, para simplificar, en la presente especificación de la proteína codificada por las moléculas de ácido nucleico completas descritas aquí, así como en las variantes homólogas nativas incluidas en la definición de PRO, nos referiremos como "PRO/número", independientemente de su origen o modo de preparación.

Tal como se describe en los Ejemplos de más adelante, varios clones de cDNA se han depositado en la ATCC. Las secuencias de nucleótidos de estos clones pueden ser determinadas, hoy en día por un experto en la materia mediante secuenciación del clon depositado mediante los procedimientos de rutina. Para los polipéptidos PRO codificados por los ácidos nucleicos descritos aquí, los solicitantes han identificado lo que se cree es la pauta de lectura mejor idenditificable con la información de secuencia disponible en este momento.

Polipéptidos PRO1186 de secuencia completa

La presente invención proporciona secuencias de nucleótidos identificadas por primera vez y aisladas que codifican polipéptidos que en la presente aplicación se denominan PRO1186. En particular, se ha identificado y aislado el cDNA que codifica el polipéptido PRO1186 tal como se describe con mayor detalle en los Ejemplos más adelante.

Mediante el alineamiento de secuencias con el programa informático WU-BLAST2, se ha hallado una secuencia nativa completa PRO1186 (tal como se muestra en la Figura 2 y SEC ID NO:4) que tiene identidad con la secuencia de aminoácidos de la proteína A del veneno de Dendroaspis polylepsis polylepsis. Según ello, actualmente se piensa que el PRO1186 descrito en la presente solicitud es un nuevo miembro de proteína A del veneno y que puede compartir un mecanismo relacionado.

B. Variantes de PRO

Además de los polipéptidos de secuencia nativa completa de PRO, descritos aquí, se contempla la preparación de las variantes de PRO. Las variantes de PRO pueden prepararse por introducción de cambios nucleotídicos adecuados en el DNA de PRO y/o por la síntesis del polipéptido PRO de interés. Como comprenderán los expertos en la materia, los cambios de aminoácidos pueden alterar los procesos post-traduccionales de PRO, así como los cambios en el número o la posición de la glicosilación o la alteración de las características de anclaje en la membrana.

Las variaciones en la secuencia nativa completa de PRO o en varios dominios de PRO descritos aquí, pueden realizarse, por ejemplo, mediante técnicas y guías para la introducción de mutaciones conservadoras o no conservadoras descritas en la Patente americana U.S. No. 5.364.934. Las variaciones pueden ser por substitución, deleción o inserción, de uno o más codones que codifican para PRO, que resultan en un cambio en la secuencia de aminoácidos de PRO en comparación con la secuencia nativa de PRO. La variación, es una substitución opcional de al menos un aminoácido por otro en uno o más de los dominios de PRO. Para obtener una guía en la determinación del residuo aminoacídico que deba insertarse, subtituirse o deleccionarse sin afectar de forma adversa la actividad deseada, se compara la secuencia de PRO con la de una molécula de proteína homóloga conocida y se minimizan, en número, los cambios aminoacídicos de la secuencia que se hagan en la región de más alta homología. Las substituciones de aminoácidos pueden ser el resultado del reemplazo de un aminoácido por otro con propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como el reemplazo de leucina por serina, o reemplazos conservadores de aminoácidos. Las inserciones o deleciones, pueden hallarse, opcionalmente, en el intervalo de 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida se determina realizando inserciones, deleciones o substituciones sistemáticas de la secuencia de aminoácidos y examinando la actividad exhibida por las variantes resultantes en relación a la secuencia nativa madura o completa.

Se proporcionan aquí los fragmentos del polipéptido PRO se. Tales fragmentos pueden estar truncados en los extremos C- o N-terminal o pueden perder residuos internos, por ejemplo, cuando se comparan con la proteína nativa completa. Ciertos fragmentos pierden los residuos de aminoácidos que no son esenciales para la actividad biológica deseada de un polipéptido PRO.

Los fragmentos PRO pueden prepararse mediante numerosas técnicas convencionales. Así, los fragmentos peptídicos deseados, se pueden sintetizarse de forma química. Un enfoque alternativo, implica la generación de fragmentos PRO por digestión enzimática, p.ej., por tratamiento de la proteína con una enzima conocida que digiere en lugares determinados los residuos de aminoácidos concretos o, por digestión del DNA con enzimas de restricción adecuadas y aislamiento posterior del fragmento obtenido. Otra técnica también adecuada, implica el aislamiento de un fragmento de DNA que codifica el fragmento del polipéptido deseado utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos que definen los extremos deseados del fragmento de DNA se emplean como cebadores en los extremos 5' y 3' en la reacción de PCR. Preferentemente, los fragmentos del polipéptido PRO comparten al menos una actividad biológica o/y inmunológica con el polipéptido PRO aquí descrito.

Para algunas realizaciones determinadas, las substituciones conservadoras de interés se muestran en la Tabla 1 bajo del título de substituciones preferentes. Si tales substituciones resultan en un cambio de actividad biológica, y en consecuencia en más cambios substanciales, se denominan substituciones ejemplarizantes en la Tabla 1, o como se describen más extensamente más adelante respecto a las clases aminoacídicas, se introducen también los aminoácidos y los productos examinados.

TABLA 1

Residuo Original	Substituciones ejemplarizantes	Substituciones preferentes

Ala (A)		val; leu; ile	val
Arg (R)		lys; gln; asn	lys
Asn (N)		gln; his; lys; arg	gln
Asp (D)		glu
		glu
Cys (C)		ser
		ser
Gln (Q)		asn
		asn
Glu (E)		asp
		asp
Gly (G)		pro; ala	ala
His (H)		asn; gln; lys; arg	arg
Ile (I)		leu; val; met; ala; phe
		norleucine	leu
Leu (L)		norleucine; ile; val;
		met; ala; phe
		ile
Lys (K)		arg; gln; asn;
		arg
Met (M)		leu; val; ile; ala; tyr	leu
Phe (F)		leu; val; ile; ala; tyr	leu
Pro (P)		ala
		ala
Ser (S)		thr
		thr
Thr (T)		ser
		ser
Trp (W)		tyr; phe	tyr
Tyr (Y)		trp; phe; thr; ser	phe
Val (V)		ile: leu; met; phe;
		ala; norleucine	leu

Se consiguen modificaciones substanciales, en la función o la identidad inmunológica del polipéptido PRO, seleccionando substituciones que difieran significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la substitución, por ejemplo, la conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el lugar diana, o (c)la mayor parte de la cadena lateral. De forma natural los residuos se dividen en grupos según las propiedades comunes de su cadena lateral:

(1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;

(3) acídicos: asp, glu;

(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5) residuos que influencian la orientación de la cadena: gly; pro; y

(6) aromáticos: tro, tyr, phe.

Las substituciones no conservadoras imponen el cambio de clase a los miembros de éstas. Por otro lado, los residuos substituidos pueden introducirse en lugares no conservadores pero también en lugares conservadores.

Con el fin de producir una variante en el DNA de PRO, se utilizan procedimientos conocidos en esta materia como la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (de sitio específico), el rastreo por alaninas, y la mutagénesis por PCR. La mutagénesis dirigida (Carter y col., Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller y col., Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)), la mutagénesis en casetes (Wells y col., Gene, 34: 315 (1985)), la mutagénesis por selección restrictiva (Wells y col., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)) u otras técnicas conocidas.

El rastreo de aminoácidos también puede utilizarse para identificar uno más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Los aminoácidos que preferentemente se utilizan, son los relativamente pequeños y neutros. Dichos aminoácidos incluyen la alanina, la glicina, la serina y la cisteína. La alanina es el aminoácido preferido pra el rastreo de aminoácidos entre los de este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante [Cunninghma y Wells, Science, 24:1081-1085 (1989)]. La alanina también es el aminoácido preferido porque es el más común. Además, se halla frecuentemente en posiciones expuestas (Creighton, The proteins, (W. H. Freeman & Co., N. Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)). Cuando la substitución de la alanina no rinde cantidades suficientes de variantes, se puede utilizar un aminoácido
isotérico.

C. Modificaciones de PRO

Las modificaciones covalentes de PRO están incluidas en las competencias de la presente invención. Un tipo de modificación covalente incluye la reacción de determinados residuos de aminoácidos del polipéptido PRO con un agente orgánico derivador que es capaz de reaccionar en lugares fijos de la cadena lateral o de los residuos N- o C-terminales de PRO. La derivación con agentes bifuncionales es útil para el entrecruzamiento de PRO con una matriz de soporte insoluble en agua o una superficie que pueda utilizarse para purificación de anticuerpos anti-PRO, y viceversa. Normalmente se utilizan agentes entrecruzantes, que incluyen, p.ej., el 1-1-bis (diazoacetil), el 2-feniletano, el glutaraldehído, los ésteres de N-hidroxisuccinimida, los ésteres con ácido 4-acidosalicílico, los imidoésteres bifuncionales, que incluyen los ésteres de disuccinimidil como el 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), las maleimidas bifuncionales como el bis-N-maleimido-1,8-octano y los agentes como el metil-3-((p-acidofenil)ditio)propioimidato.

Otras modificaciones incluyen la desamidación de residuos glutaminil y asparaginil de los correspondientes residuos glutamil y aspartil, la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de los residuos seril o treonil, la metilación de los grupo \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins; Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], la acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de algún grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente del polipéptido PRO, incluida en las competencias de la presente invención, comprende la alteración del patrón de glicosilación nativo del polipéptido. Por "alteración del patrón de glicosilación nativo" se entiende, para los propósitos aquí descritos, la deleción de una o más porciones de carbohidratos que se encuentran en la secuencia nativa de PRO (tanto por eliminación de sitios esenciales de glicosilación como por supresión de la glicosilación por medios químicos o/y enzimáticos), y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación de proteínas nativas, que implica un cambio en la naturaleza y proporciones de varias de las porciones de carbohidratos presentes.

La adición de sitios de glicosilación en el polipéptido PRO puede conseguirse mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos. La alteración pude realizarse, por ejemplo, por adición de, o substitución por, uno o más residuos serina o treonina a la secuencia nativa de PRO (para sitios de O-glicosilación). La secuencia de aminoácidos de PRO puede alterarse, de forma opcional, mediante cambios a nivel del DNA, particularmente por mutación del DNA que codifica el polipéptido PRO en algunas bases preseleccionadas para generar codones que se traduzcan en los aminoácidos deseados.

Otra manera de aumentar el número de porciones de carbohidratos en el polipéptido PRO es mediante la unión química o enzimática de glicósidos al polipéptido. Estos procedimientos se describen en, p.ej., la patente internacional WO 87/05330 publicada el 11 Septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

La eliminación de las porciones de carbohidratos presentes en el polipéptido PRO puede conseguirse de forma química o enzimática o por substitución por mutación de los codones que codifican los residuos de aminoácidos que sirven como diana para la glicosilación. Las técnicas de glicosilación química se conocen y están descritas, por ejemplo, en Hakimuddin, y col., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y en Edge y col., Anal. Biochem., 118:131 (1981). La digestión enzimática de las porciones de carbohidratos en los polipéptidos puede conseguirse con la utilización de una variedad de endo y exo glicosidasas, tal como describieron Thotakura y col., Meth Enzymol., 138:350 (1987).

Otro tipo de modificación covalente de PRO, comprende la unión al polipéptido PRO de una variedad de polímeros noproteináceos, (p.ej., el polietilén glicol PEG), el polipropilén glicol, o los polioxialquilenos, en la manera descrita en las Patentes americanas U.S. Nos, 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144: 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.

En la presente invención, PRO también puede ser modificado para formar una molécula quimérica que contenga el PRO unido a un polipéptido o secuencia de aminoácido heterólogos.

En otra aplicación, la molécula quimérica que comprende la fusión de PRO con un polipéptido etiqueta, proporciona un epitopo al que puede unirse selectivamente el anticuerpo anti-etiqueta. La etiqueta epitópica se coloca generalmente en los extremos amino o carboxilo terminales de PRO. La presencia de estas formas de etiquetas epitópicas de PRO puede detectarse con un anticuerpo contra el polipéptido. También, la presencia de la etiqueta epitópica permite que PRO sea purificado por afinidad utilizando en la purificación un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se una a la etiqueta epitópica. Varios polipéptidos etiqueta y sus respectivos anticuerpos son conocidos por los expertos en la materia. Los ejemplos incluyen las etiquetas de poli-histidina (poli-his) o de poli-histidina-glicina (poli-his-gly); el polipéptido etiqueta HA del virus de la gripe y su anticuerpo 12CA5 (Fiels y col., Mol. Cel. Biol., 8: 2159-2165 (1988)); la etiqueta de c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 (Evan y col., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)); y la etiqueta de glicoproteina D (gD) del virus Herpes Simplex y su anticuerpo (Paborsky y col., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)). Otros polipéptidos etiqueta incluyen el péptido Flag (Hopp y col., Bio Technology, 6:1204-1210 (1988)); el epitopo del péptido KT3 (Martin y col., Science, 255: 192-194 (1992)); y el epitopo del péptido de la \alpha-tubulina (Skinner y col., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)); y la etiqueta peptídica de la proteína 10 del gen T7 (Lutz-Freyermuth y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)).

En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender la fusión de PRO con una inmunoglubulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también denominada "inmunoadhesina") la fusión puede realizarse con la región Fc de una molécula IgG. Las fusiones de Ig incluyen preferentemente la substitución de una forma soluble (dominio transmembrana delecionado o inactivado) del polipéptido PRO el lugar de al menos una región variable en la molécula de Ig. En una realización particular preferida, la fusión de la inmunoglobulina incluye la bisagra, las regiones CH2 y CH3, o la bisagra, las regiones CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgG1. Para la producción de inmunoglobulinas de fusión véase también la patente americana US No. 5.428.130 publicada el 27 de Junio de 1995.

D. Preparación de PRO

La descripción de más adelante relata en primer lugar la producción de PRO por células en cultivo transformadas o transfectadas con un vector que contiene el ácido nucleico de PRO. Se contempla que puedan emplearse procedimientos alternativos, que son bien conocidos en la materia, para la preparación de PRO. La secuencia de PRO o sus porciones, pueden producirse por síntesis directa del péptido mediante técnicas de fase sólida [véase, p.ej., Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco. CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. La síntesis proteica in vitro puede realizarse mediante técnicas manuales o automáticas. La síntesis automatizada puede conseguirse por ejemplo, mediante el sintetizador de péptidos de Applied Biosystems (Foster City, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Varias porciones de PRO pueden sintetizarse químicamente, por separado y en combinación, con procedimientos químicos o enzimáticos para producir el PRO de secuencia
completa.

1. Aislamiento del DNA codificante de PRO

El DNA que codifica PRO puede obtenerse de una librería de cDNA preparada a partir de un tejido que se crea tiene el mRNA de PRO y lo exprese a un nivel detectable. Así, el DNA de PRO humano se obtiene convenientemente de una librería de cDNA preparada de tejido humano, tal como se describe en los Ejemplos. El gen codificante de PRO puede también obtenerse de una librería genómica o por procedimientos sintéticos conocidos (p.ej., la síntesis automatizada de ácidos nucleicos).

Las librerías pueden ser cribadas mediante sondas (como anticuerpos contra PRO o los oligonucleótidos de al menos unas 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por él. El cribado de la librería de cDNA o genómica con la sonda seleccionada puede realizarse mediante procedimientos estándares, como los descritos en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Una forma alternativa para aislar el gen codificante para PRO, es utilizar la metodología de la PCR [Sambrook y col., supra; Dieffenbach y col., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

Los Ejemplos de más adelante, describen las técnicas para el cribado de la librería de cDNA. Las secuencias de los oligonucleótidos seleccionados como sondas deberían ser de una longitud suficiente y sin ambigüedades innecesarias para minimizar los falsos positivos. Es preferible que los oligonucleótidos estén marcados de forma que se pueda detectar la hibridación del DNA en la librería que se va a cribar. Los métodos de marcaje son bien conocidos en la materia, e incluyen el uso de marcadores radioactivos como ^{32}P-ATP, biotinilización o marcaje enzimático. Las condiciones de hibridización, incluyendo la astringencia moderada y la alta astringencia, se realizaron según Sambrook y col., supra.

Las secuencias identificadas en la librería por los métodos de cribado pueden compararse y alinearse con otras secuencias conocidas depositadas en los bancos de datos públicos como el GenBank o en otros bancos de datos privados. La identidad de secuencia (tanto a nivel de aminoácido o como de nucleótido) en las regiones definidas de la molécula o a través de la secuencia completa, puede determinarse mediante métodos conocidos en la material y que se describen aquí.

Los ácidos nucleicos que tienen la secuencia que codifica para la proteína pueden obtenerse por cribado del cDNA seleccionado o en librerías genómicas mediante la secuencia de aminoácidos deducida, descrita aquí por primera vez, y, si es necesario, mediante procedimientos convencionales de extensión por cebador, tal como se describe en Sambrook y col., supra, para la detección de precursores e intermediarios del procesado del mRNA que puedan no haberse transcrito a cDNA.

2. Selección y transformación de células huéspedes

Las células huéspedes se transfectan o transforman con los vectores de expresión o clonaje descritos aquí para la producción de PRO y el cultivo en medios con nutrientes convencionales y modificados según sea apropiado para la introducción de promotores, selección de transformantes, o amplificación de los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, lo medios, la temperatura, el pH y otros factores, pueden ser seleccionadas por el experto en la materia sin necesidad de demasiada experimentación. En general, los principios, protocolos y las técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares pueden encontrarse en Mammalian Cell Biotechnolgy: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y en Sambrook y col., supra.

Los métodos para la trasfección de células eucariotas y la tranformación de células procariotas son conocidos para cualquiera con práctica en la materia, por ejemplo, con Cl_{2}Ca, PO_{4}Ca y electroporación mediada por liposomas. Según la célula huésped utilizada, la transformación se realiza con las técnicas estándares más apropiadas. Generalmente para procariotas se utiliza el tratamiento con cloruro de calcio, tal como se describe en Sambrook y col., supra, o la electroporación. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de ciertas células de plantas, tal como ha descrito Shaw et al., Gene, 23: 315 (1983) y la patente internacional WO 89/05859 publicada el 20 de Junio de 1989. Para células de mamífero, sin esas paredes celulares, puede emplearse la precipitación con fostato cálcico según el método de Graham y van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Los aspectos generales de las transfecciones en sistemas de células huéspedes de mamífero se han descrito en la Patente americana U.S. No. 4.399.216. Las transformaciones en levaduras se llevan a cabo normalmente según el método de Van Solingen y col., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (US), 76:3829 (1979). Sin embargo, también pueden utilizarse otros métodos para la introducción de DNA en las células, como la microinyección nuclear, la electroporación, la fusión de protoplastos bacterianos en células intactas, o los policationes, p. ej., el polibreno, la poliornitina. Para varias técnicas de transformación de células de mamífero, véase Keown y col., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour y col., Nature, 336:348-352 (1988).

Las células adecuadas para el clonaje y la expresión de DNA en vectores, incluyen aquí las procariotas, las levaduras, o las células de eucariotas superiores. Las procariotas que son adecuados incluyen, pero no de forma limitante, las eubacterias, los organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo las Enterobacteriaceae como E. coli. Se encuentran disponibles varias cepas, como la cepa E. coli K12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1775 (ATCC 31. 537); la cepa E. coli W3110 (ATCC 27.325) y K5 772 (ATCC 53.635). Otras células huéspedes procariotas incluyen las Enterobacteriaceae como Escherichia, p.ej., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, p.ej., Salmonella typhimurium, Serratia, p.ej., Serratia marcescens, y Shigella, así como Bacilli como B. subtillis y B. licheniformis (p.ej., B. licheniformis 41P descrita en la patente DD 266.710 publicada el 12 de Abril de 1989), Pseudomonas como P. aeruginosa y Streptomyces. Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes. La cepa W3110 es un huésped particularmente preferido ya que es una cepa huésped común para el DNA recombinante de productos de fermentación. Preferentemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 puede ser modificada para efectuar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas del huésped, como ejemplos de estos huéspedes se incluyen E. coli W3110 cepa 1A2, que tiene el genotipo completo tonA; E. coli cepa W3110 9E4, que tiene el genotipo completo tonA ptr3; E. coli W3110 cepa 27C7 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kanl; E. coli W3110 cepa 37D6 con una mutación por delección de no resistencia a la kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene una proteasa periplasmática mutante descrita en la patente americana U.S. No. 4.946.783 del 7 de Agosto del 1990. También son adecuados los procedimientos alternativos de clonaje in vitro, p.ej., mediante PCR u otras reacciones de la polimerasa de ácidos nucleicos.

Además de los procariotas, los microbios eucarióticos como los hongos filamentosos o las levaduras son adecuados como huéspedes para el clonaje o expresión de vectores que codifican PRO. Saccharomyces cerevisiae es un eucariota sencillo que se utiliza comúnmente como microorganismo huésped. Entre otros se pueden incluir a Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 290:140 (1981); EP 139.383 publicada el 2 de mayo de 1985); Kluyveromyces (patente americana U.S. No. 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)), o como p.ej., K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt y col., J. Bacteriol., 737 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045, K wickermaii (ATCC 24.178), K. walrii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906); Van den Berg y col., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (patente europea EP 402.226); Pichia pastoris (patente europea EP 183.070; Sreekrishna y col., J. Basic Microbiol., 28:256-278 (1988); Candida; Trichoderma reesia (patente europea EP 244.234); Neurospora crassa (Case y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979)); Schwarna reeesia (patente europea EP 244,234); Neurospora crassa (Case y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979); Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis (patente europea EP 394.538 publicada el 31 de Octubre de 1990); un hongo filamentoso como por ejemplo Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (patente internacional WO 91/00357 publicada el 10 de enero de 1991), y Aspergillus como A. nidulans (Ballance y col., Biochem. Biophys. Res. Commun, 112:284-289 (1983)); Tiburn y col., Gene, 26: 205-221 (1983); Yelton y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 (1984)) y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J., 4:475-479 (1985)). Levaduras metilotrópicas son también adecuadas aquí, e incluyen, pero de forma no limitante, a levaduras capaces de crecer en metanol de los géneros Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, Rhodotorula. Una lista específica de especies como ejemplos de esta clase de levaduras puede encontrarse en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).

Para la expresión de PRO glicosilado, las célula huéspedes adecuadas derivan de organismos multicelulares. Son ejemplos las células procedentes de invertebrados donde se incluyen células de insecto como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células de plantas. Ejemplos de líneas celulares huéspedes de mamíferos incluyen las de ovario de hámster chino (CHO) y las células COS. Ejemplos más específicos incluyen la línea transformada por SV40 de riñón de mono CV1 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón humano embrionario (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento de cultivo en suspensión, Grahan y col., Gen Virol., 36:59 (1977)), células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); y de tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). La selección de la célula huésped apropiada dependerá del criterio del experto en la materia.

3. Selección y empleo de un vector replicable

El ácido nucleico (p.ej., cDNA o DNA genómico) que codifica PRO puede insertarse en un vector replicable para su clonaje (amplificación del DNA) o para su expresión. Se encuentran disponibles varios vectores. El vector puede, por ejemplo, estar en la forma de un plásmido, cósmido, partícula viral o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada se inserta en el vector según una variedad de procedimientos. Generalmente, el DNA se inserta en dianas específicas para enzimas de restricción y según las técnicas conocidas en la materia. Los componentes del vector incluyen en general, pero de forma no limitante, una o más secuencias señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, elementos intensificadores, un promotor, y una secuencia terminadora de la transcripción. En la construcción de vectores adecuados que contengan uno o más de estos componentes, se emplean técnicas estándares de ligación que son conocidas por los expertos en la materia.

PRO puede producirse de manera recombinante no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un lugar de digestión específico N-terminal de la proteína madura o polipéptido. En general la secuencia señal es un componente del vector o una parte del DNA que codifica para PRO y está insertada en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, de entre el grupo compuesto por la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, lpp, o secuencias líder de la enterotoxina II estable al calor. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal puede ser, p.ej., el líder de la invertasa de levadura, o del factor alfa (icluyendo los líderes de los factores \alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces, el último descrito en la patente americana U.S. 5.010.182) o de la fosfatasa ácida, o de la glucoamylasa de C. albicans (patente europea EP 362.179 publicada el 4 de Abril de 1990), o la señal descrita en la patente internacional WO 90/13646 publicada el 15 de Noviembre del 1990. En la expresión en células de mamíferos, las secuencias señal de mamíferos se utilizan para dirigir la secreción de la proteína, como por ejemplo las secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma o especies relacionadas, así como de líderes de secreción virales.

Tanto los vectores de expresión como de clonaje, contienen una secuencia de ácido nucleico que consigue que el vector se replique en una o más células huéspedes seleccionadas. Estas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. Así, el origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido \mu es adecuado para levaduras, y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son últiles para el clonaje de vectores en células de mamíferos.

La expresión y el clonaje de vectores que normalmente contienen un gen para la selección, se denominan también marcadores seleccionables. Los genes de selección codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, p.ej., ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) aportan nutrientes críticos no disponibles en los medios complejos, p.ej., el gen que codifica la D-alanina racemasa de Bacilli.

Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son aquellos que consiguen la identificación de células competentes para la incorporación del ácido nucleico que codifica PRO, como DHFR o timidina quinasa. Una célula huésped adecuada cuando se utiliza DHFR de tipo salvaje es la línea celular CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada tal como se ha descrito por Urlaub y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección adecuado para utilizar en levadura es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb y col., Nature, 282:39 (1979); Kingsman y col., Gene, 7;141 (1979); Tschemper y col., Gene, 10:157 (1980). El gen trp1 proporciona un marcador de selección en una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics, 95:12 (1977)).

Los vectores de expresión y clonaje contienen normalmente un promotor unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica directamente PRO para dirigir la síntesis del mRNA. Los promotores son reconocidos por una gran variedad de células huéspedes potenciales. Los promotores son adecuados para su uso en huéspedes procariotas, se incluyen los sistemas de promotores de la \beta-lactamasa y la lactosa (Chang y col., Bature, 275:615 (1978); Goedde y col., Nature, 281:544 (1979)), fosfatasa alcalina, y el sistema del promotor del triptófano (trp) (Goeddel, Nucelic Acid. Res., 8:4057 (1980); patente europea EP 36.776), y promotores híbridos como el promotor tac (deBoer y col., Proc. Ntl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)). Los promotores para su uso en sistemas bacterianos también contiene una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.), secuencia unida operativamente al DNA que codifica PRO.

Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su uso en huéspedes de levadura incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato kinasa (Hitzeman y col., J. Biol. Chem. 255:2073 (1980)) u otras enzimas glicolíticas (Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978), tal como la enolasa, la gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato decarboxilasa, la fosfofructoquinasa, la glucosa-6-fosfato isomerasa, la 3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato kinasa, la triosafosfatoisomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la glucoquinasa.

Otros promotores de levadura, que tienen promotores inducibles, con la ventaja adicional del control de la transcripción según las condiciones de crecimiento, son las regiones del promotor para la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la fosfatasa ácida, las enzimas degradadoras asociadas al metabolismo del nitrógeno, la metalotioneína, la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, y las enzimas responsables para la utilización de la maltosa y galactosa.

Los vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión de levaduras se describen más extensamente en la patente europea EP 73.657.

La transcripción de PRO en vectores de células huéspedes de mamífero se controla, por ejemplo, con promotores obtenidos de genomas de virus, como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar (patente UK 2.211.504 publicada el 5 de Julio del 1989), el adenovirus (tal como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, los retrovirus, el virus de la hepatitis B y el virus de simio 40 (SV40), de los promotores de mamíferos heterólogos, p.ej., el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina, y los promotores de choque térmico que proporcionan promotores compatibles con los sistemas de células huéspedes.

La transcripción de un DNA que codifica PRO en eucariotas superiores puede incrementarse si se inserta una secuencia intensificadora en el vector. Los intensificadores son elementos cis del DNA, con normalmente de 10 a 300 bp, que actúan sobre el promotor para aumentar su transcripción. Algunas secuencias intensificadoras se conocen a partir de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Normalmente, sin embargo, se utiliza un intensificador de un virus de célula eucariota.

Ejemplos en este sentido, incluyen el intensificador de SV40 al final del origen de replicación (bp 100-270), el regulador del promotor temprano de citomegalovirus, el regulador del polioma en el origen de replicación tardío y los de adenovirus. EL intensificador puede colocarse en el vector en posición 5' o 3' de la secuencia codificante de PRO, pero es preferible situarlo en el extremo 5' del promotor.

Los vectores de expresión utilizados en células huéspedes eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contienen secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del mRNA. Estas secuencias están disponibles normalmente en el extremo 5' y ocasionalmente en el 3' de regiones no traducidas de eucariotas o del DNA viral o de los cDNAs. Estas regiones de DNAs o cDNAs eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del mRNA que codifica PRO.

Existen todavía otros métodos, vectores y células huéspedes adecuadas para la adaptación de la síntesis de PRO en cultivos celulares recombinantes tal como se describe en Gething y col., Nature, 293:620-625 (1981); Mantel y col., Nature, 281:40-46 (1979); patente europea EP 117.060; y patente europea EP 117.058.

4. Detección de la expresión/amplificación génica

La amplificación génica y/o expresión puede cuantificarse en las muestras directamente, por ejemplo, con la técnica convencional de la transferencia de Southern, transferencia de Northern para cuantificar la transcripción de mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1990)), transferencia de mancha (análisis de DNA), o hibridación in situ, con una sonda marcada apropiadamente, basada en las secuencias proporcionadas aquí. De forma alternativa, pueden emplearse anticuerpos para reconocer dúplex expecíficos, incluidos dúplex de DNA, dúplex de RNA, y dúplex híbridos de RNA-DNA o DNA-proteína. Los anticuerpos a su vez pueden marcarse y el ensayo realizarse cuando el dúplex está unido a una superficie, por lo que una vez formado el dúplex en la superficie, es posible detectar la presencia del anticuerpo unido al dúplex.

La expresión génica, de forma alternativa, puede cuantificarse mediante procedimientos inmunológicos como la tinción inmunohistoquímica de células o secciones de tejidos y ensayos de cultivo celular o de fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de muestras de fluidos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra la secuencia nativa del polipéptido PRO o contra un péptido sintético, según las secuencias de DNA proporcionadas aquí, o contra secuencias exógenas fusionadas al DNA de PRO que codifica un epitopo específico del anticuerpo.

5. Purificación del polipéptido

Las formas de PRO pueden ser recogidas del medio de cultivo o de los lisados de las células huéspedes. Si están unidos a la membrana, se pueden liberar de la membrana utilizando una solución detergente adecuada (p.ej., Tritón-X 100) o por digestión enzimática. Las células empleadas en la expresión de PRO pueden romperse por varios medios físicos y químicos, como por ejemplo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, disrupción mecánica o agentes de lisis celular.

Es deseable purificar PRO de las proteínas o polipéptidos recombinantes celulares. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados por fraccionamiento o por columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en gel sílice o con resina de intercambio iónico como el DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico; filtración en gel utilizando por ejemplo Sephadex G-75; columnas de proteína A Sepharose para eliminar contaminantes como la IgG; y columnas quelantes de metales para unir las formas etiquetadas con epitopos del PRO. Pueden utilizarse diversos procedimientos de purificación de proteínas y todos son bien conocidos en la materia y se describen en, p.ej., Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). Las etapas de purificación seleccionadas dependerán de la naturaleza del proceso de producción y del PRO determinado producido.

E. Utilizaciones de PRO

Las secuencias nucleotídicas (o sus complementarias) que codidifican PRO tienen diversas aplicaciones en la materia de biología molecular, incluyendo las utilizaciones como sondas de hibridación, en el mapeo cromosómico y génico y en la generación de RNA antisentido y DNA. El ácido nucleico de PRO también será de utilidad para la preparación de polipéptidos PRO por las técnicas recombinantes aquí descritas.

El gen PRO de secuencia nativa de longitud completa, o fragmentos de lo mismo, puede utilizarse como sondas de hibridación para cribar una librería de cDNAs y aislar el cDNA de PRO de longitud completa o para aislar otros cDNAs (por ejemplo, los que codifican variantes naturales de PRO o PRO de otras especies), que tienen una identidad de secuencia deseada respecto a la secuencia PRO nativa aquí descrita. Opcionalmente, la longitud de las sondas será de aproximadamente 20 a 50 bases. Las sondas de hibridación pueden derivarse al menos parcialmente de regiones nuevas de la secuencia nucleotídica nativa de longitud completa, y en las que dichas regiones pueden determinarse sin excesiva experimentación o a partir de secuencias genómicas incluyendo promotores, elementos intensificadores e intrones de PRO de secuencia nativa. A modo de ejemplo, un procedimiento de cribado comprenderá el aislamiento de la región codificante del gen PRO utilizando la secuencia de DNA conocida para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación pueden marcarse mediante diversos tipos de marcaje, incluyendo los radionucleótidos como el P^{32} o el S^{35}, o los marcajes enzimáticos como la fosfatasa alcalina conjugada con la sonda mediante sistemas de acoplamiento avidina/biotina. Las sondas marcadas que tienen una secuencia complementaria con la del gen PRO de la presente invención pueden utilizarse para cribar librerías humanas de cDNA, DNA genómico o mRNA para determinar qué miembros de dichas librerías son los que hibridan con las sondas. Las técnicas de hibridación se describen con mayor detalle en los Ejemplos de más abajo.

Cualquier secuencia EST descrita en la presente solicitud puede utilizarse de forma similar como una sonda, utilizando los procedimientos aquí descritos.

Otros fragmentos de utilidad de los ácidos nucleicos de PRO incluyen los oligonucleótidos antisentido o sentido que comprenden una secuencia de ácido nucleico de cadena sencilla (RNA o DNA) capaz de unirse a las secuencias de mRNA (sentido) de PRO diana o del DNA de PRO (antisentido). Los oligonuclótidos sentido y antisentido de transcripción, de acuerdo con la presente invención, comprenden un fragmento de la región codificante del DNA de PRO. Dicho fragmento comprende generalmente al menos 14 nucleótidos, preferentemente desde aproximadamente 14 a 30 nucleótidos. La capacidad para derivar un oligonucleótido sentido o antisentido, basándose en una secuencia de cDNA que codifica una proteína dada se describe por ejemplo en Stein y Cohen (Cancer Res. 48:2659, 1988) y van der Krol y col., (BioTechniques 6:958, 1988).

La unión de oligonucleótidos sentido o antisentido a las secuencias de ácido nucleico dianas da como resultado la formación de dúplex que bloquean la transcripción o la traducción de la secuencia diana mediante uno o diversos mecanismos, incluyendo la degradación de los dúplexs, la terminación prematura de la transcripción o la traducción, o mediante otros mecanismos. Los oligonucleótidos antisentido pueden utilizarse para bloquear la expresión de proteínas PRO. Los oligonucleótidos antisentido o sentido comprenden además oligonucleótidos con armazones de azúcar-fosfodiéster modificados (u otras uniones de azúcares, como las descritas en la patente internacional WO 91/06629) y en donde dichas uniones de azúcar son resistentes a las nucleasas endógenas. Dichos oligonucleótidos con uniones de azúcares resistentes son estables in vivo (es decir, capaces de resistir la degradación enzimática) pero retienen la especificidad de secuencia para ser capaces de unirse a secuencias nucleotídicas diana.

Otros ejemplos de oligonucleótidos sentido y antisentido incluyen aquellos oligonucleótidos que están unidos covalentemente a porciones orgánicas, como las descritas en la patente internacional WO90/10048, y otras porciones que aumentan la afinidad del oligonucleótido para una secuencia de ácido nucleico diana, como la poli-(L-lisina). Además, los agentes intercalantes, como la elipticina, y los agentes alquilantes o los complejos metálicos pueden unirse a oligonucleótidos sentido o antisentido para modificar las especificidades de unión de dichos oligonucleótidos con la secuencia nucleotídica diana.

Los oligonucleótidos sentido o antisentido pueden introducirse en una célula que contenga el ácido nucleico diana mediante cualquier procedimiento de transferencia génica, incluyendo, por ejemplo, la transfección de DNA mediada por CaPO_{4}, la electroporación, o utilizando vectores de transferencia de genes como el virus de Epstein-Barr. En un procedimiento preferido, se inserta un oligonucleótido sentido o antisentido en un vector retroviral adecuado. Una célula que contenga la secuencia de ácido nucleico diana se pone en contacto con el vector retroviral recombinante, in vivo o ex vivo. Los vectores retrovirales adecuados incluyen, pero no se limitan a, los derivados de retrovirus murinos M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV), o vectores de copia doble denominados DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase la patente internacional WO 90/13641).

Los oligonucleótidos sentido o antisentido también pueden introducirse en una célula que contenga la secuencia nucleotídica diana mediante la formación de un conjugado con una molécula de unión a ligando, tal como se describe en la patente internacionl WO 91/04753. Las moléculas de unión a ligando adecuadas incluyen, pero no se limitan a, receptores de superficie celular, factores de crecimiento, otras citoquinas, y otros ligandos que se unen a los receptores de superficie celular. Preferentemente, la conjugación de la molécula de unión al ligando no interfiere esencialmente con la capacidad de la molécula de unión al ligando para unirse con su correspondiente molécula o receptor, o bloquear la entrada del oligonucleótido sentido o antisentido o su versión conjugada en la célula.

Alternativamente, un oligonucleótido sentido o antisentido puede introducirse en una célula que contenga la secuencia de ácido nucleico diana mediante la formación de un complejo oligonucleótido-lípido, tal como se describe en la patente internacional WO 90/10448. El complejo formado por el oligonucleótido sentido o antisentido y el lípido se disocia preferentemente dentro de la célula por una lipasa endógena.

Las sondas también se pueden utilizar en técnicas de PCR para generar un conjunto de secuencias para la identificación de secuencias codificantes de PRO estrechamente relacionadas.

Las secuencias nucleotídicas que codifican un PRO también pueden utilizarse para construir sondas de hibridación para el mapeo del gen que codifica PRO y para el análisis genético de individuos con trastornos genéticos. Las secuencias nucleotídicas que aquí se proporcionan pueden localizarse en los cromosomas y en regiones específicas de éstos mediante la utilización de técnicas conocidas, como la hibridación in situ, el análisis de ligamiento con marcadores cromosómicos conocidos y el cribado mediante hibridación de librerías.

Cuando las secuencias para PRO codifican una proteína que se une a otra proteína (por ejemplo, si el PRO es un receptor), se puede utilizar PRO en ensayos para identificar las otras proteínas o moléculas implicadas en la interacción de la unión. Mediante dichos procedimientos, pueden identificarse los inhibidores de la interacción de la unión receptor/ligando. Las proteínas implicadas en dichas interacciones de unión también pueden utilizarse para cribar inhibidores peptídicos o de pequeñas moléculas o agonistas de la interacción de la unión. También, se puede utilizar el receptor PRO para aislar el o los ligandos correlativos. Los ensayos de cribado pueden diseñarse para hallar compuestos líderes que mimeticen la actividad biológica de un Pro nativo o un receptor para PRO. Dichos ensayos de cribado incluirán ensayos escalables a un cribado de alto rendimiento de librerías químicas, lo que los hace especialmente adecuados para identificar fármacos candidatos de moléculas pequeñas. Dichas moléculas pequeñas incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos de síntesis. Los ensayos se pueden realizar de diversas formas, incluyendo ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de cribado bioquímico, inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien caracterizados en la materia.

Los ácidos nucleicos que codifican PRO o sus formas modificadas también se pueden utilizar para generar animales transgénicos o animales "knock out", que a su vez, son útiles para el desarrollo y cribado de reactivos de utilidad terapéutica. Un animal transgénico (p.ej., un ratón o un rata) es un animal que tiene células que contienen un transgén, el cual se introdujo en el animal o en el ancestro del animal en un estadio prenatal, p.ej., un estadio embrional. Un transgén es un DNA que se ha integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla el animal. En una realización, puede utilizarse el cDNA que codifica PRO para clonar el DNA genómico que codifica PRO de acuerdo con técnicas establecidas y las secuencias genómicas para generar animales transgénicos que contengan células que expresen el DNA que codifica PRO. Los procedimientos para generar animales transgénicos, en particular animales como el ratón o la rata, son actualmente técnicas convencionales en la materia y se describen, por ejemplo, en las patentes americanas U.S. 4.736.866 y 4.870.009. En general, células determinadas pueden ser las dianas para la incorporación del transgén PRO con los intensificadores específicos de tejido. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica PRO introducido en la línea germinal del animal en un estadio embrional pueden utilizarse para examinar el efecto de una expresión aumentada del DNA que codifica PRO. Dichos animales pueden utilizarse como animales test para reactivos pensados para conferir protección contra, por ejemplo, condiciones patológicas asociadas con su sobre-expresión. De acuerdo con esta faceta de la invención, se trata un animal con el reactivo y se analiza la incidencia de las condiciones patológicas respecto a los animales no tratados que contienen el transgén. Si la incidencia de dichas condiciones patológicas es reducida en estos animales, entonces ello es indicativo de una intervención terapéutica potencial para la condición patológica.

Alternativamente, se pueden utilizar homólogos no-humanos de PRO para construir un animal "Knock out" de PRO, es decir que tenga un gen alterado o defectuoso que codifica PRO como resultado de una recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica PRO y el DNA genómico alterado que codifica PRO introducido en una célula madre embrional del animal. Por ejemplo, el cDNA que codifica PRO puede utilizarse para clonar el DNA genómico que codifica PRO de acuerdo con técnicas establecidas. Una porción del DNA genómico que codifica PRO puede delecionarse o reemplazarse con otro gen, como un gen que codifique un marcador seleccionable que puede utilizarse para controlar la integración. De forma característica, se incluyen en el vector varias Kb de DNA flanqueante inalterado (tanto en el extremo 5' como en el 3') [véase, p.ej., Thomas y Capcchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homóloga]. El vector se introduce en una línea de células madre embrionales (p.ej., mediante electroporación) y se seleccionan las células en las que el DNA introducido se ha recombinado homólogamente con el DNA endógeno [véase p.ej., Li y col., Cell, 69:915 (1992)]. Las células seleccionadas se inyectan en el blastocisto de un animal (p.ej., un ratón o una rata) para formar quimeras por agregación [véase p.ej., Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J: Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. A continuación, se puede implantar un embrión quimérico en un animal huésped hembra pseudopreñada y llevarse a término de la gestación para crear un animal Knock out. La progenie que porta el DNA recombinado homólogamente en las células germinales puede identificarse mediante técnicas estándares y utilizarse para producir animales en los que todas las células contengan el DNA recombinado homólogamente. Los animales Knockout pueden caracterizarse por ejemplo, por su capacidad para defenderse frente a ciertas condiciones patológicas y por el desarrollo de ciertas condiciones patológicas debido a la ausencia de polipéptido PRO.

El ácido nucleico que codifica los polipéptidos PRO pueden también utilizarse en la terapia génica. En las aplicaciones de terapia génica, los genes se introducen en las células con el fin de lograr la síntesis in vivo de un producto genético efectivo terapéuticamente, por ejemplo para reemplazar un gen defectuoso. La "terapia génica" incluye tanto la terapia génica convencional, en donde se logra un efecto duradero mediante un solo tratamiento, como la administración de agentes terapéuticos que implican la administración en una sola vez o en repetidas veces del DNA o mRNA efectivo terapéuticamente. Se pueden utilizar RNAs y DNAs antisentido como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de ciertos genes in vivo. Se ha demostrado que oligonucleótidos cortos antisentido pueden introducirse en las células en donde actúan como inhibidores, a pesar de sus concentraciones intracelulares bajas causadas por una incorporación restringida por parte de la membrana celular. (Zamecnik y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83:4143-4116 [1986]). Los oligonucleótidos pueden modificarse para aumentar su incorporación, p.ej., sustituyendo sus grupos fosfodiéster cargados negativamente por grupos no cargados.

Existen diversas técnicas disponibles para introducir los ácidos nucleicos en las células viables. Las técnicas varían dependiendo de que el ácido nucleico se transfiera a las células en cultivo in vitro, o in vivo en las células del huésped. Las adecuadas para la transferencia del ácido nucleico en las células de mamífero incluyen la utilización de liposomas, la electroporación, la microinyección, la fusión celular, el DEAE-dextrano, el procedimiento de la precipitación por fosfato cálcico, etc. Las técnicas actuales preferidas para la transferencia de genes in vivo incluyen la transfección con vectores virales y la transfección mediada por liposomas-proteína de cubierta viral (Dzau y col., Trends in Biotechnology 11, 205-210 [1993]). En algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que se dirija a las células diana, como por ejemplo un anticuerpo específico para una proteína de superficie celular de la célula diana, un ligando para un receptor en la célula diana, etc. Cuando se utilizan liposomas, pueden utilizarse proteínas que se unan a una proteína de superficie de membrana asociada con la endocitosis para facilitar la destinación y/o la incorporación; p.ej., las proteínas de la cápside o fragmentos de lo mismo que puedan tener un tropismo positivo por un determinado tipo celular, los anticuerpos de proteínas que llevan a cabo la internalización durante el reciclado, las proteínas con un destino intracelular y que incrementen la vida media intracelular. La técnica de la endocitosis mediada por receptor se describe, por ejemplo, por Wu y col., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (19879; y Wagner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). Para una revisión sobre protocolos de marcaje de genes y terapia génica véase Anderson y col., Science, 256, 808-813 (1992).

Los polipéptidos PRO aquí descritos también pueden utilizarse como marcadores de peso molecular para la electroforesis de proteínas.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos PRO o fragmentos de lo mismo aquí descritas son útiles para la identificación cromosómica. A este respecto, existe una necesidad para identificar nuevos marcadores cromosómicos, ya que actualmente están disponibles relativamente pocos reactivos que marquen cromosomas, según las bases de datos de secuencias actuales. Cada molécula de ácido nucleico de PRO de la presente invención puede utilizarse como un marcador cromosómico.

Los polipéptidos PRO y las moléculas de ácido nucleico de la presente invención también pueden utilizarse para el tipado de tejidos, en donde los polipéptidos PRO de la presente invención pueden expresarse diferencialmente en un tejido en comparación con otro. Las moléculas de ácido nucleico de PRO serán de utilidad en la generación de sondas para PCR, análisis de Northern, análisis de Southern y de Western.

Los polipéptidos PRO aquí descritos también se pueden utilizar como agentes terapéuticos. Los polipéptidos PRO de la presente invención pueden formularse de acuerdo con procedimientos conocidos para preparar composiciones de utilidad farmacéutica, para lo cual el producto de PRO se combina en una mezcla con un vehículo transportador aceptable farmacéuticamente. Las formulaciones terapéuticas se preparan para el almacenaje mezclándolas con un ingrediente activo que tenga el deseado grado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizantes opcionales y aceptables fisiológicamente (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. ED. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos a los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen los tampones como el fosfato, citrato y ácidos orgánicos; los antioxidantes como el ácido ascórbico; los polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a 10 residuos); las proteínas, como la albúmina sérica, la gelatina o las inmunoglobulinas; los polímeros hidrofílicos como la polivinilpirrolidona, los aminoácidos como la glicina, la glutamina, la asparraguina, la arginina o la lisina; los monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo la glucosa, la manosa o las dextrinas; los agentes quelantes como el EDTA; los azúcares alcohólicos como el manitol o el sorbitol; los iones formadores de sales como el sodio; y/o los tensoactivos no iónicos como el TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} o el PEG.

Las formulaciones a utilizar en la administración in vivo deben ser estériles. Ello se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes de o después de la liofilización y reconstitución.

Las composiciones terapéuticas se colocan generalmente en un recipiente con un puerto de acceso estéril, por ejemplo una bolsa para solución intravenosa con un tapón agujereable por una aguja de inyección hipodérmica.

La vía de administración está de acuerdo con los procedimientos conocidos, p.ej., la inyección o la infusión por vía intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional, la administración tópica o por sistemas de liberación prolongada.

Las dosis y las concentraciones de los fármacos de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar dependiendo de la utilización prevista para cada caso. La elección de una dosis o de una ruta de administración adecuada es competencia del médico. Los experimentos con animales proporcionan una guía fiable para determinar las dosis efectivas para la terapia en humanos. Es posible realizar una estimación de las dosis efectivas entre especies siguiendo los principios indicados por Mordenti, J. y Chappell, W. The use of interspecies scaling in toxicokinetics en Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi y col., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96.

Cuando se utiliza la administración in vivo de un polipéptido PRO o de un agonista o antagonista de lo mismo, las dosis normales pueden variar entre 10 ng/Kg y 100 mg/Kg de peso corporal del mamífero, o más por día, preferentemente de 1 \mug/Kg/día a 10 mg/Kg/día, dependiendo de la vía de administración. Las guías para dosificaciones y procedimientos de liberación particulares se proporcionan en la literatura; véase por ejemplo, la patente americana U.S. 4.657.760; 5.206.344; o 5.225.212. Es previsible que formulaciones diferentes serán efectivas para compuestos de tratamiento distintos y trastornos distintos, y que la administración dirigida a un órgano o tejido específico, por ejemplo, pueda requerir la liberación de una forma distinta a la de otro órgano o tejido.

Si se requiere una administración de liberación prolongada de un polipéptido PRO en una formulación con características adecuadas para el tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno que necesite de dicha administración de polipéptido PRO, se contempla la microencapsulación del polipéptido PRO. La microencapsulación de proteínas recombinantes para la liberación prolongada se ha realizado satisfactoriamente con la hormona de crecimiento humana (rhGH), el interferón (rhIFN), la interleucina-2 y el MN rgp 120, Johnson y col., Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993); Hora y col., Bio/Technology, 8:755-758 (1990); Cleland, Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems, in Vaccine Design: The subunit and adyuvant approach, Powell y Newman, eds., (Plenum Press, New York, 1995), pp. 439-462; patente internacional WO 96/40072, patente internacional WO 96/07399; y la patente americana U.S. 5.654.010.

Las formulaciones de liberación prolongada de estas proteínas se desarrollan utilizando el polímero de ácido poli-láctico-coglicólico (PLGA) por su biocompatibilidad y amplio rango de propiedades biodegradables. Los productos de degradación de PLGA, ácidos láctico y glicólico se pueden eliminar rápidamente por el cuerpo humano. Además, la degradación de este polímero puede ajustarse desde meses a años dependiendo de su peso molecular y composición. Lewis, Controlled release of bioactive agentes from lactide/glycolide polymer, en: M. Chasin y R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41.

Esta invención abarca los procedimientos de cribado de compuestos para identificar aquellos que mimetizan el polipéptido PRO (agonistas) o impiden el efecto del polipéptido PRO (antagonistas). Los ensayos de cribado para los candidatos de fármacos antagonistas se diseñan para identificar compuestos que se unen o forman un complejo con los polipéptidos PRO codificados por los genes aquí identificados, o que interfieren con la interacción de los polipéptidos codificados por otras proteínas celulares. Dichos ensayos de cribado incluirán los ensayos escalables a un cribado de alto rendimiento de librerías químicas, con lo que dichos ensayos son particularmente adecuados para identificar fármacos candidatos de moléculas pequeñas.

Los ensayos pueden realizarse en diversos tipos de formatos, incluyendo los ensayos de unión proteína-proteína, los ensayos de cribado bioquímico, los inmunoensayos y los ensayos basados en células, bien caracterizados en la materia.

Todos los ensayos tienen en común el contacto del fármaco candidato con un polipéptido PRO codificado por un ácido nucleico identificado aquí en las condiciones adecuadas y durante un tiempo suficiente para permitir la interacción de estos dos compuestos.

En los ensayos de unión, la interacción es la unión y el complejo formado puede aislarse o detectarse en la mezcla de reacción. En una realización particular, el polipéptido PRO codificado por el gen identificado aquí o el fármaco candidato se inmoviliza en una fase sólida, p.ej., una placa de microtitulación, mediante uniones covalentes o no covalentes. La unión no covalente se logra generalmente mediante recubrimiento de la superficie sólida con una solución del polipéptido PRO y secado posterior. Alternativamente, un anticuerpo inmovilizado, p.ej., un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido PRO a inmovilizar puede utilizarse para anclar éste a una superficie sólida. El ensayo se realiza mediante adición del componente no-inmovilizado, el cual puede marcarse mediante un marcaje detectable, con el componente inmovilizado, p.ej., la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Una vez finalizada la reacción, se eliminan los componentes que no han reaccionado, p.ej., mediante lavado y se procede a la detección de los complejos anclados sobre la superficie sólida. Si el componente no inmovilizado lleva originalmente un marcaje detectable, la detección del marcaje inmovilizado sobre la superficie indica que ha tenido lugar la formación del complejo. Si el componente no inmovilizado no lleva originalmente un marcaje, se puede detectar la formación del complejo mediante p.ej., un anticuerpo marcado que se una específicamente al complejo inmovilizado.

Si el compuesto candidato interacciona pero no se une con un polipéptido PRO particular codificado por un gen identificado aquí, su interacción con dicho polipéptido puede analizarse mediante procedimientos bien conocidos para la detección de interacciones proteína-proteína. Dichos ensayos incluyen tradicionalmente aproximaciones, como por ejemplo, la unión cruzada, la co-inmunoprecipitación y la co-purificación mediante gradientes o columnas de cromatografía. Además, las interacciones proteína-proteína pueden controlarse utilizando un sistema genético de levaduras descrito por Fields y colaboradores (Fields y Song, Nature (London), 340:245-246 (1989); Chien y col., Proc Natl. Acad Sci USA 88:9578-9582 (1991)), tal como se describe por Chevray y Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5789-5793 (1991). Muchos activadores transcripcionales, como el GAL4 de levaduras, consisten en dos dominios modulares discretos físicamente, uno actúa como el dominio de unión a DNA y el otro como el dominio activador de la transcripción. El sistema de expresión de levaduras en las publicaciones anteriores (referidos generalmente como el "sistema del doble híbrido") presenta la ventaja de dicha propiedad, y utiliza dos proteínas híbridas, una en la que se une la proteína diana con el dominio de unión a DNA de GAL4 y la otra en la que las proteínas de activación candidatas se fusionan con el dominio de activación. La expresión del gen reportero GAL1-LacZ bajo el control de un promotor activado por GAL4 depende de la reconstitución de la actividad de GAL4 mediante la interacción proteína-proteína. Las colonias que contienen polipéptidos que interactúan se detectan con un sustrato cromogénico para la \beta-galactosidasa. Un equipo completo (MATCHMAKER^{TM}) para la identificación de interacciones proteína-proteína entre dos proteínas específicas utilizando la técnica del doble híbrido está disponible comercialmente por Clontech. Este sistema también puede ampliarse para mapear dominios de proteínas implicados en interacciones de proteínas específicas así como también para señalar los aminoácidos cruciales para dichas interacciones.

Los compuestos que interfieren con la interacción de un gen que codifica un polipéptido PRO aquí identificado y otros componentes extra o intra-celulares pueden analizarse de la manera siguiente: por lo general, se prepara una mezcla de reacción que contenga el producto del gen y el componente intra o extracelular en las condiciones y tiempo que permitan la interacción y la unión de los dos productos. Para analizar la capacidad de un compuesto candidato para inhibir la unión, la reacción se lleva a cabo en presencia y en ausencia de un inhibidor del compuesto a analizar. Además, se puede añadir un placebo a una tercera mezcla de reacción, para que sirva de control positivo. La unión (formación del complejo) entre el compuesto a analizar y el componente intra o extracelular presente en la mezcla se controla tal como se indicó más arriba. La formación de un complejo en la reacción control pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto a analizar indica que dicho compuesto a analizar interfiere con la interacción de dicho compuesto y su pareja de reacción.

Para analizar los antagonistas, se puede añadir el polipéptido PRO a una célula junto con el compuesto a cribar para una actividad determinada, y la capacidad del compuesto para inhibir la actividad de interés en presencia del polipéptido PRO indica que el compuesto es un antagonista del polipéptido PRO. Alternativamente, los antagonistas pueden detectarse combinando el polipéptido PRO y un antagonista potencial con receptores del polipéptido PRO unidos a membrana o con receptores recombinantes en las condiciones adecuadas para un ensayo de inhibición competitiva. El polipéptido PRO puede marcarse, con radioactividad por ejemplo, de modo que pueda utilizarse el número de moléculas de polipéptido PRO unidas al receptor para determinar la eficacia del antagonista potencial. El gen que codifica el receptor puede identificarse mediante diversos procedimientos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, hibridación con un panel de ligandos y la selección por FACS. Coligan y col., Current Protocols in Immun., 1(2): Capítulo 5 (1991). Preferentemente, se utiliza el clonaje y expresión en donde el RNA poliadenilado se prepara a partir de una célula que responde al polipéptido PRO y la librería de cDNA creada a partir de este mRNA se divide en varios grupos y se utiliza para transfectar células COS u otras células que no sean sensibles al polipéptido PRO. Las células transfectadas que crecen en portaobjetos de vidrio se exponen al polipéptido PRO. Este polipéptido puede marcarse por diversos procedimientos incluyendo la yodinación o la inclusión de un sitio de reconocimiento para una protein quinasa de sitio específico. Después de la fijación y la incubación, las preparaciones se someten a un análisis autorradiográfico. Los grupos positivos se identifican y se preparan subgrupos que se re-transfectan utilizando procesos
interactivos de sub-agrupación y re-cribado, para llegar a poder aislar un clon único que codifique el receptor putativo.

Como una aproximación alternativa para la identificación del receptor, el polipéptido PRO marcado puede unirse mediante foto-afinidad con la membrana celular o preparaciones de extractos que expresen la molécula del receptor. El material unido se analiza mediante PAGE y se expone a una película de rayos X. El complejo marcado que contiene el receptor puede escindirse, resultando en fragmentos peptídicos, y someterse a una micro-secuenciación de proteínas. La secuencia aminoacídica obtenida de la micro-secuenciación podría utilizarse para diseñar un grupo de sondas de oligonucleótidos degenerados para cribar una librería de cDNA con el fin de identificar el gen que codifica el receptor putativo.

En otro ensayo para antagonistas, las células de mamífero o una preparación de membrana que expresa el receptor se incuba con el polipéptido PRO en presencia del compuesto candidato. A continuación, es posible cuantificar la capacidad del compuesto para aumentar o bloquear esta interacción.

Ejemplos más específicos de antagonistas potenciales incluyen un oligonucleótido que se une a las fusiones de la inmunoglobulina con el polipéptido PRO, y, en particular, los anticuerpos incluyendo, sin limitación, los anticuerpos poli y monoclonales y los fragmentos de anticuerpo, los anticuerpos de cadena sencilla y los anticuerpos anti-idiopáticos, y las versiones quiméricas o humanizadas de dichos anticuerpos o fragmentos, así como los anticuerpos humanos y los fragmentos de anticuerpos. Alternativamente, un antagonista potencial puede ser una proteína estrechamente relacionada, por ejemplo, una forma mutada del polipéptido PRO que reconozca el receptor pero que no tenga ningún efecto, con lo que inhibe competitivamente la acción del polipéptido PRO.

Otro antagonista del polipéptido PRO potencial es una construcción de RNA o DNA antisentido preparada mediante tecnología del ácido nucleico antisentido, en donde la molécula de RNA o DNA antisentido actúan para bloquear directamente la traducción del mRNA al hibridarse con el mRNA diana e impedir la traducción proteica. La tecnología del ácido nucleico antisentido puede utilizarse para controlar la expresión de un gen mediante la formación de una triple hélice, o de DNA o RNA antisentido, ambos procedimientos se basan en la unión de un polinucleótido al DNA o al RNA. Por ejemplo, la porción 5' codificante de la secuencia polinucleotídica, que codifica los polipéptidos PRO maduros, se utiliza para diseñar un oligonucleótido de RNA antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Un oligonucleótido de DNA se diseña para ser complementario a una región del gen implicada en la transcripción (hélice triple-véase Lee y col., Nucl. Acids. Res., 6:3073 (1979); Cooney y col., Science, 241:456 (1988); Dervan y col., Science, 251:1360 (1991)), con lo que se impide la transcripción y la producción del polipéptido PRO. El oligonucleótido de RNA antisentido hibrida con el mRNA in vivo y bloquea la traducción de la molécula de mRNA en el polipéptido PRO (antisentido - Okano, Neurochem., 56:560 (1991): Oligondeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988). Los oligonucleótidos descritos anteriormente también pueden liberarse a las células para que pueda expresarse el RNA o DNA antisentido in vivo con el fin de inhibir la producción del polipéptido PRO. Cuando se utiliza un DNA antisentido, se prefieren los oligodesoxiribonucleótidos derivados
del sitio de inicio de la traducción, p.ej., entre las posiciones -10 y +10 de la secuencia nucleotídica del gen diana.

Los antagonistas potenciales incluyen moléculas pequeñas que se unen al sitio activo, el sitio de unión al receptor, o al factor de crecimiento, u otro sitios de unión relevantes del polipéptido PRO, con lo que se bloquea la actividad biológica normal del polipéptido PRO. Ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, péptidos pequeños o moléculas de tipo peptídico, preferentemente péptidos solubles y compuestos orgánicos u inorgánicos no peptídicos.

Las ribozimas son moléculas de RNA enzimáticas capaces de catalizar el corte específico del RNA. Las ribozimas actúan mediante hibridación específica de la secuencia con el RNA diana complementario, seguido del corte endonucleotídico. Los sitios de corte específicos de ribozimas en una diana de RNA pueden identificarse mediante técnicas conocidas. Para mayores detalles, véase Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994), y la publicación de PCT de patente internacional WO 97/33551 (publicada el 18 de Septiembre de 1997).

Las moléculas de ácido nucleico en la formación de triple hélice utilizadas para inhibir la transcripción deberían ser de cadena sencilla y estar compuestas de desoxinucleótidos. La composición en bases de estos oligonucleótidos está diseñada para favorecer la formación de la triple hélice según las reglas de apareamiento de bases de Hoogteen, que requieren generalmente secuencias considerables de purinas o pirimidinas en una cadena de un dúplex. Para más detalles, véase p.ej., la publicación de PCT de patente internacional WO 97/33551, supra.

Estas moléculas pequeñas pueden identificarse mediante cualquiera de los ensayos de cribado citados anteriormente y/o por otras técnicas de cribado bien conocidas por los expertos en la materia.

PRO 189 puede utilizarse en ensayos con W01A6.1 de C. Elegans, fofodiesterasas, proteínas de transporte que se unen a los ácidos grasos, para determinar las actividades relativas de PRO189 contra estas proteínas. Los resultados pueden aplicarse de según sea conveniente.

F. Anticuerpos anti-PRO

La presente invención proporciona además anticuerpos anti-PRO. Ejemplos de anticuerpos incluyen los anticuerpos policlonales, monoclonales, los humanizados, los biespecíficos y los heteroconjugados.

1. Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos anti-PRO pueden comprender anticuerpos policlonales. Los procedimientos de preparación de anticuerpos policlonales son conocidos por el experto en la materia. Los anticuerpos policlonales pueden producirse en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. En general, el agente inmunizante y/o el adyuvante se inyectarán en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir el polipéptido PRO o una proteína de fusión de lo mismo. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante con una proteína conocida por ser inmunogénica en el mamífero a inmunizar. Ejemplos de dichas proteínas inmunogénicas incluyen pero no se limitan a la hemocianina de la lapa, la seroalbúmina, la tiroglobulina bovina y el inhibidor de la tripsina de soja. Ejemplos de adyuvantes que pueden utilizarse incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante MPL-TDM (monofosforil Lípido A, dicorinomicolato trehalosa sintético). El protocolo de inmunización puede seleccionarse por el experto en la materia sin excesiva experimentación.

2. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos anti-PRO pueden, alternativamente, ser anticuerpos monoclonales. Dichos anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando procedimientos de hibridomas, como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975). En un procedimiento de hibridomas, se inmuniza de forma característica un animal huésped como el ratón, el hámster u otro animal adecuado con un agente inmunizante para generar linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro.

El agente inmunizante incluirá típicamente el polipéptido PRO o una proteína de fusión de lo mismo. Por lo general, se utilizan linfocitos de sangre periférica (PBLs) si se requieren células de origen humano, o células del bazo o de los nódulos linfáticos si se trata de otras fuentes de células de mamífero no humanas. A continuación se fusionan los linfocitos con una línea celular inmortalizada con un agente fusionante adecuado, como por ejemplo el polietilén glicol, para formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. Las líneas celulares inmortalizadas son generalmente células de mamífero transformadas, en particular células de mieloma de origen humano, bovino o de roedor. Por lo general, se utilizan líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma se pueden cultivar en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si la célula parental carece de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá de forma típica hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que impiden el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.

Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son las que se fusionan eficientemente, soportan niveles estables de expresión elevada del anticuerpo por las células productoras del anticuerpo seleccionado, y son sensibles a un medio como el medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son las líneas de mieloma murino, que pueden obtenerse, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y del American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63].

A continuación, es posible analizar el medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma para la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra PRO. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Dichas técnicas y ensayos son conocidos en la materia. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Después de identificar las células de hibridoma, los clones pueden subclonarse mediante dilución limitante y crecerse mediante procedimientos estándares [Goding, supra]. Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, el Dulbecco's Modified Eagle's Medium y el RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridomas pueden crecerse in vivo como ascitas en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse a partir del medio de cultivo o del líquido ascítico mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales como, por ejemplo, Sepharose-A, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales también pueden modificarse mediante procedimientos del DNA recombinante, como los descritos en la patente americana U.S. 4.816.567. El DNA que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede fácilmente aislarse y secuenciarse utilizando procedimientos convencionales (p.ej., utilizando sondas oligonucleotídicas capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas ligera y pesada de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la invención sirven como una fuente preferida de dicho DNA. El DNA, una vez aislado, puede introducirse en el vector de expresión, y a continuación transfectarse en las células huésped como por ejemplo las células de simio COS, las de ovario de hámster chino (CHO), o las células de mieloma para que produzcan la proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El DNA también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de cadena ligera y pesada humanas en lugar de las secuencias murinas homólogas [patente americana U.S. 4.816.567; Morrison y col., supra] o mediante unión covalente con la secuencia codificante de la inmunoglobulina, toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido no-inmunoglobulínico. Dicho polipéptido no-inmunoglobulínico puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede sustituirse por los dominios variables de un sitio de combinación antigénico de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los procedimientos para la preparación de anticuerpos monovalentes son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera y de la cadena pesada de inmunoglobulina. La cadena pesada se rompe generalmente por cualquier punto en la región Fc para impedir la unión de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisteína relevantes se sustituyen por otro residuo de aminoácido o se delecionan para impedir la unión.

Los procedimientos in vitro son también adecuados para la preparación de anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de lo mismo, en particular, fragmentos Fab, puede lograrse utilizando técnicas de rutina conocidas en la materia.

3. Anticuerpos humanos y humanizados

Los anticuerpos anti-PRO de la invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de los anticuerpos no-humanos (p.ej., murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de lo mismo (como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión al antígeno de anticuerpos), que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no-humana. Los anticuerpos humanizados incluyen las inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en la que se reemplazan los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor por los residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) como el ratón, rata o conejo con especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de entramado Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los correspondientes residuos no humanos. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se hallen ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de la CDR o región de entramado importadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá esencialmente todos o al menos uno de los dos dominios variables, en los que todas las regiones CDR corresponden con las de una inmunoglobulina no humana y todas o esencialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de una inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá óptimamente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente el de una inmunoglobulina humana [Jones y col., Nature, 321.522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].

Los procedimientos para la humanización de anticuerpos no humanos son bien conocidos en la materia. Por lo general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoacídicos introducidos en él a partir de una fuente que no es humana. Estos residuos aminoacídicos no humanos son a menudo referidos como residuos "de importación", los cuales proceden generalmente de un dominio variable "de importación". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science, 239:1534-1536 (1988)], mediante sustitución de las secuencias CDRs de un anticuerpo humano por las correspondientes de roedor. Según ello, dichos anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos (patente americana U.S. 4.816.567), en donde se ha sustituido menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son anticuerpos humanos típicamente en los que algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en los anticuerpos de roedor.

Los anticuerpos humanos también se pueden producir utilizando diversas técnicas conocidas en la materia, incluyendo las librerías de expresión en fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. Las técnicas de Cole y col., y Boemer y col., también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77 (1985) y Boerner y col., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. De modo similar, los anticuerpos humanos pueden generarse introduciendo loci de inmunoglobulinas humanas en animales transgénicos, p.ej., ratones en los que los genes de inmunogloblinas endógenas se han inactivado parcial o completamente. Tras un estímulo, se observa la producción de anticuerpo humano, que recuerda estrechamente la observada en humanos en todos los aspectos, incluyendo el reordenamiento y el ensamblamiento de genes, y el repertorio de anticuerpos. Esta aproximación se describe, por ejemplo, en las patentes americanas 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.25.126; 5.633.425; 5.661.016 y en las publicaciones científicas siguientes: Marks y col., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Longerg y col., Nature, 368:856-859 (19949; Morrison, Nature, 368:812-13 (1994); Fishwild y col., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonbern y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995).

4. Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferentemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión por al menos dos antígenos distintos. En el caso presente, una de las especificidades de unión es para el PRO, la otra es para cualquier otro antígeno, y preferentemente para una proteína de superficie celular o receptor o subunidad de receptor.

Los procedimientos para la generación de anticuerpos biespecíficos son conocidos en la materia. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la co-expresión de dos pares de cadenas ligera-pesada de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas pesadas tienen especificidades distintas [Milstein y Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. Debido a la variedad de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo distintas, de las cuales sólo una tiene la estructura correcta. La purificación de la molécula correcta se logra generalmente mediante etapas de cromatografía de afinidad. Procedimientos similares se describen en la patente internacional WO 93/08829, publicada el 13 de Mayo de 1993 y en Traunecker y col., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

Los dominios variables de anticuerpos con las especificidades deseadas (sitios de combinación antígeno-anticuerpo) pueden fusionarse con las secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión se realiza preferentemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la bisagra y las regiones CH2 y CH3. Es preferible que la primera región constante de cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para la unión de la cadena ligera en al menos una de las fusiones. Los DNAs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se co-transfectan en un organismo huésped adecuado. Para mayores detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh y col., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acuerdo con otra aproximación descrita en la patente internacional WO 96/27011, la interfaz entre una pareja de moléculas de anticuerpo puede diseñarse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfaz preferida comprende al menos una parte de la región CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas se reemplazan por cadenas mayores (p.ej., tirosina o triptófano). Cavidades compensatorias de tamaño idéntico o similar a la cadena o cadenas laterales se crean sobre la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando las cadenas laterales grandes de aminoácidos por otras más pequeñas (p.ej., alanina o treonina). Ello proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados como los homodímeros.

Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (p.ej., anticuerpos biespecíficos F(ab')2). Las técnicas para la generación de anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo están descritas en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse utilizando ligamiento químico. Brennan y col., Science 229:81 (1985) describen un procedimiento en donde anticuerpos intactos se digieren proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente formador de complejos ditiol, el arsenito sódico para estabilizar los ditioles vecinos e impedir la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados se convierten en derivados de trinitrobenceno (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB se reconvierte a continuación en Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar de otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmovilización selectiva de
enzimas.

Los fragmentos Fab' pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby y col., J.Exp. Med. 175:217-225 (1992) describen la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecífico humanizado. Cada fragmento Fab' se secretó separadamente de E. coli y se sometió al acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de unirse a las células que sobre-expresaban el receptor de ErbB2 y a las células T humanas normales, así como de dirigir la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumores de mama.

También se han descrito diversas técnicas para la generación y aislamiento de fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente del cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se han producido utilizando cremalleras de leucina. Kostelny y col., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Péptidos de cremallera de leucinas de las proteínas Fos y Jun se unieron a porciones Fab' de dos anticuerpos distintos mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpos se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y luego se re-oxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este procedimiento también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpos" descrita por Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para la generación de fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un engarce que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Según ello, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios complementarios VL y VH de otro fragmento, formándose así dos sitios de unión antigénica. Se ha publicado también otra estrategia para la generación de fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante la utilización de dímeros de Fv(sFv) de cadena sencilla. Véase Gruber y col., J. Immunol. 152:5368 (1994).

Se contemplan los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos. Tuu y col., J. Immunol. 147:60 (1991).

Ejemplos de anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos epitopos diferentes de un polipéptido PRO dado. Alternativamente, un brazo de un anti-polipéptido PRO puede combinarse con un brazo que se une a una molécula desencadenante en un leucocito como por ejemplo una molécula de receptor de células T (p.ej., CD2, CD3, CD28, o B7), o receptores FC para IgG (Fc\gammaR), como Fc\gammaRI(CD64), Fc\gammaRII (CD32) y Fc\gammaRIII (CD16) para focalizar los mecanismos de defensa celulares hacia la expresión celular del polipéptido PRO particular. Los anticuerpos biespecíficos también pueden utilizarse para localizar agentes citotóxicos contra células que expresan un polipéptido PRO determinado. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a PRO y un brazo que se une a un agente citotóxico o un quelante radionucleido, como el EOTUBE, DPTA, DOTA, o el TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés se une al polipéptido PRO y además se une al factor tisular (TF).

5. Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados se hallan también dentro del ámbito de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Se ha propuesto, por ejemplo, que dichos anticuerpos dirijan las células del sistema inmune contra las células no deseadas [patente americana U.S. 4.676.980], y para el tratamiento de la infección por VIH [patente internacional WO 91/00360; patente internacional WO92/200373; patente europea EP03089]. Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro utilizando procedimientos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo los agentes de unión implicados. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o mediante la formación de un enlace tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen el iminotiolato y el metil-4-mercaptobutirimidato y los descritos, por ejemplo, en la patente americana 4.676.980.

6. Diseño de la función efectora

Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención respecto a la función efectora, para incrementar, p.ej., la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, pueden introducirse residuos de cisteína en la región Fc, lo que permite la formación de enlaces disulfuro en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una mejor capacidad de internalización y/o una mejor capacidad de la eliminación de células mediada por el complemento y de la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Véase, Caron y col., J. Exp. Med., 176:1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol., 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad anti-tumoral aumentada también pueden prepararse utilizando agentes de unión heterobifuncionales como los descritos en Wolff y col., Cancer Research, 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, se puede generar un anticuerpo que tenga regiones Fc duales y que de esta manera tenga una mayor capacidad de lisis mediada por el complemento y de ADCC. Véase Stevenson y col., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989).

7. Inmunoconjugados

La invención también pertenece a los inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico como el agente quimioterapéutico, toxina (p.ej., una toxina activa enzimáticamente de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de lo mismo), o un isotopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).

Los agentes quimioterapéuticos de utilidad en la generación de dichos inmunoconjugados se han descrito más arriba. Las toxinas activas enzimáticamente y los fragmentos de lo mismo que pueden utilizarse incluyen la cadena A de la difteria, los fragmentos activos de no unión de la toxina de la difteria, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modecina, la alfa-sarcina, las proteínas de Aleurites fordii, las proteínas diantinas, las proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PIII y PAP-S), el inhibidor de Momordica charantia, la curcina, la crotina, el inhibidor de la Sapaonaria officinalis, la gelonina, la mitogelina, la restrictocina, la fenomicina, la enomicina y los tricotecenos. Están disponibles diversos radionucleidos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Ejemplos incluyen el Bi^{212}, I^{131}, In^{131},
Y^{90} y Re^{186}.

Los conjugados del anticuerpo y del agente citotóxico se generan utilizando diversos agentes acoplantes de proteínas bifuncionales como el N-succinimidil-3-(2-piridiltiol) propionato (SPDP), el iminotiolan (IT), los derivados bifuncionales de los imidoésteres (como el dimetil adipimidato HCL), los ésteres activos (como el dissuccinimidil suberato), los aldehídos (como el glutaraldehido), los compuestos bis-azido (como el bis(p-azidobenzoil) hexanediamina), los derivados del bisdiazonio (como el bis-(p-diazoniobenzoilo)-etilendiamina), los diisocianatos (como el tolieno 2,6-diisocianato) y los compuestos de flúor bi-activo (como el 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse tal como se describe en Vitetta y col., Science, 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilén triaminopentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de radionucleidos con el anticuerpo. Véase la patente internacional WO94/11026.

En otra realización, el anticuerpo puede conjugarse con un "receptor" (como la estreptavidina) para la utilización en la predestinación tumoral, en donde el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por la eliminación de la circulación del conjugado no unido con un agente de aclaramiento y luego por la administración de un "ligando" (p.ej., avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (p.ej., un radionucleótido).

8. Inmunoliposomas

Los anticuerpos aquí descritos también pueden formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en la materia, como los descritos en Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 81980); y las patentes americanas U.S. 4.485.045 y 4.544.545. En la patente americana U.S. 5.013.556, se describen liposomas con un tiempo de circulación aumentado.

Es posible generar liposomas particularmente útiles mediante el procedimiento de la evaporación de fase inversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina modificada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen con filtros de tamaño de poro definido para obtener liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse con los liposomas tal como se describe en Martin y col., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982) mediante una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico (como la Doxorubicina) se incluye opcionalmente dentro de los liposomas. Véase Gabizon y col., J. National Cancer Inst., 81(19):1484 (1989).

9. Composiciones farmacéuticas de anticuerpos

Los anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido PRO aquí identificados, así como otras moléculas identificadas por ensayos de cribado descritos más arriba, pueden administrarse para el tratamiento de diversos trastornos en la forma de composiciones farmacéuticas.

Si el polipéptido PRO es intracelular y como inhibidores se utilizan anticuerpos completos, son preferibles los anticuerpos de internalización. Sin embargo, también se pueden utilizar lipofecciones o liposomas para liberar el anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo en las células. Si se utilizan fragmentos de anticuerpo, se prefiere el fragmento inhibidor más pequeño que se una específicamente al dominio de unión de la proteína diana. Por ejemplo, las moléculas peptídicas se pueden diseñar para que retengan la capacidad de unirse a la secuencia de la proteína diana, basándose en las secuencias de región variable de un anticuerpo. Dichos péptidos pueden sintetizarse químicamento y/o producirse mediante tecnología del DNA recombinante. Véase p.ej., Marasco y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893 (1993). La formulación también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para cada indicación particular, preferentemente aquellas con actividades complementarias pero sin que se vean afectadas negativamente unas con otras. Alternativamente, o adicionalmente, la composición puede comprender un agente que aumente su función, como por ejemplo, un agente citotóxico, una citoquina, un agente quimioterapéutico, o un agente inhibidor del crecimiento. Dichas moléculas están presentes adecuadamente en combinación con cantidades que son efectivas para el propósito pretendido.

Los ingredientes activos también pueden incluirse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en los sistemas de liberación del fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microsferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.

Las formulaciones a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Ello se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

Pueden prepararse preparaciones de liberación prolongada. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación prolongada incluyen las matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo. Dichas matrices pueden tener formas determinadas, p.ej., películas, o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación prolongada incluyen los poliésteres, los hidrogeles (por ejemplo, el poli(2-tridroxietil-metcrilato), o el poli(vinil-alcohol), los poliláctidos (patente americana U.S. 3.773.919), los copolímeros del ácido L-glutámico y el \gammaetil-L-glutamato, el etilén-vinil acetato no degradable, los copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables como el LUPRON DEPOT^{TM} (microsferas inyectables compuestas de copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide), y ácido poli-D-(-)3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros como el etilén-vinil acetato y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante aproximadamente 100 días, algunos hidrogeles liberan proteínas durante períodos más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante largo tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37ºC, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y cambios posibles en la inmunogenicidad. Es posible concebir estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación fuera la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio de tio-disulfuros, la estabilización podría lograrse modificando los residuos sulfidrilo, liofilizando las soluciones acídicas, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matriz de polímeros específicos.

G. Utilización de los anticuerpos anti-PRO

Los anticuerpos anti-PRO de la invención tienen diversas utilidades. Por ejemplo, los anticuerpos anti-PRO pueden utilizarse en ensayos diagnósticos para PRO, p.ej., detectando su expresión en células, tejidos o suero específicos. Se pueden utilizar diversas técnicas diagnósticas conocidas en la materia, como los ensayos de unión competitiva, los ensayos de sándwich directos o indirectos y los ensayos de inmunoprecipitación realizados en fases heterogéneas u homogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, INC. (1987) pp. 147-158]. Los anticuerpos utilizados en el ensayo diagnóstico pueden marcarse con una porción detectable. La porción detectable debería ser capaz de producir, bien directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la porción detectable puede ser un isótopo, como el H^{3}, C^{14}, P^{32}, S^{35}, o I^{125}, un compuesto fluorescente o uno quimioluminiscente, como el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, o la luciferina o una enzima, como la fosfatasa alcalina, la beta-galactosidasa o la peroxidasa de rábano. Puede utilizarse cualquier metodología conocida en la materia para la conjugación del anticuerpo con la porción detectable, incluyendo los procedimientos descritos por Hunter y col., Nature, 144:945 (1962); David y col., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain y col., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981); y Nygren J. Histochem and Cytochem., 30:407 (1982).

Los anticuerpos anti-PRO también se utilizan para la purificación por afinidad de PRO a partir del cultivo celular recombinante o de fuentes naturales. En este proceso, los anticuerpos contra PRO se inmovilizan en un soporte adecuado, como la resina de Sephadex o el papel de filtro, utilizando procedimientos bien conocidos en la materia. El anticuerpo inmovilizado se contacta a continuación con una muestra que contiene el PRO a purificar, y en consecuencia el soporte se lava con un solvente que eliminará esencialmente todo el material en la muestra excepto el PRO, el cual se une al
anticuerpo inmovilizado. Por último, el soporte se lava con otro solvente adecuado que liberará el PRO del anticuerpo.

Los ejemplos siguientes se ofrecen a título ilustrativo, y no pretenden limitar el ámbito de la presente invención.

Ejemplos

En los ejemplos, se utilizaron reactivos disponibles comercialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante, salvo que se indique lo contrario. La fuente de estas células identificadas en los ejemplos siguientes, y a través de las especificaciones, por el número de acceso ATCC corresponde al American Type Culture Collection, Manassas, VA.

Ejemplo 1 Cribado por homología del dominio extracelular para identificar nuevos polipéptidos y el cDNA que los codifica

Las secuencias del dominio extracelular (ECD) (incluyendo la secuencia señal de secreción, si la hubiera) de aproximadamente 950 proteínas secretadas conocidas de las bases de datos públicas Swiss-Prot se utilizaron para buscar en las bases de datos de EST. Estas bases de EST, incluyeron las públicas, (p.ej., Dayhoff, Genbank) y las bases de datos privadas (p.ej., LIFESEQTM, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). La búsqueda se realizó utilizando el programa informático WU-BLAST-2 (Altschul y col., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)) en comparación con las secuencias de la proteína ECD en 6 pautas de lectura abierta de las secuencias EST. Estas comparaciones con un valor de BLAST de 70 (en algunos casos de 90) o superior que no codificaban proteínas nuevas se agruparon en secuencias de DNA consenso con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA).

Utilizando este cribado por homología de dominios extracelulares, se agruparon las secuencias de DNA consenso en relación con otras secuencias EST identificadas utilizando phrap. Además, las secuencias de DNA consenso obtenidas se ampliaron a menudo (pero no siempre) mediante ciclos repetidos de WU-BLAST-2 y phrap para extender la secuencia consenso tan lejos como fue posible utilizando las fuentes de secuencias EST citadas más arriba.

Basándose en las secuencias consenso obtenidas tal como se describió más arriba, los oligonucleótidos se sintetizaron y utilizaron para identificar mediante PCR una librería de cDNA que contenía la secuencia de interés y para utilizar como sondas para aislar un clon de secuencia codificante completa de un polipéptido PRO. Los cebadores de sentido 5' y 3' de transcripción para la PCR son generalmente de 20 a 30 nucleótidos y a menudos se diseñan para proporcionar un producto de PCR de aproximadamente 100-1000 pb de longitud. Las secuencias de la sonda son generalmente de 40-55 pb de longitud. En algunos casos, los oligonucleótidos adicionales se sintetizan cuando la secuencia consenso es superior a aproximadamente 1-1,5 Kb. Con el fin de cribar varias librerías para un clon de tamaño completo, se cribó el DNA de las librerías mediante amplificación por PCR, tal como se indicó por Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, con la pareja de cebadores de PCR. Una librería positiva se utilizó para aislar los clones que codifican el gen de interés utilizando la sonda oligonucleotídica y una de las parejas de cebadores.

Las librerías de cDNA utilizadas para aislar los clones de cDNA se construyeron mediante procedimientos estándares utilizando reactivos disponibles comercialmente como los de Invitrogen, San Diego, CA. El cDNA cebado con oligodT y con una diana NotI, se ligó por extremos romos a adaptadores SalI hemifosforilados, se cortó con NotI y se recortó la banda de tamaño adecuado tras migrar en una electroforesis en gel, y se clonó en una orientación definida en un vector de clonaje adecuado (como pRKB o pRKD; pRK5B es un precursor de pRKD5D que no contiene la diana SfiI; véase Holmes y col., Science, 253:1278-1280 (1991)) en las dianas únicas de XhoI y NotI.

Ejemplo 2 Aislamiento de los clones de cDNA por cribado de amilasa 1. Preparación de librerías de cDNA cebadas con oligo dT

Se aisló el mRNA de un tejido humano de interés utilizando reactivos y protocolos de Invitrogen, San Diego, Ca (Fast Track 2). Este RNA se utilizó para generar una librería de cDNA cebada con oligo dT en el vector pRK5D utilizando los reactivos y protocoles de Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script Plasmid System). En este procedimientos, el cDNA de cadena doble se seleccionó por su tamaño superior a 1000 pb y se clonó el cDNA SalI/NotI en el vector cortado por Xho//NotI. El vector pRK5D es un vector de clonaje que tiene un inicio de transcripción seguido por una diana de restricción SfiI anterior a las dianas de clonaje del cDNA XhoI//NotI.

2. Preparaciones de la librería de cDNA cebado aleatoriamente

Se generó una librería de cDNA secundaria con el fin de representar preferentemente los extremos 5' de los clones de cDNA principal. Se generó un RNA con Sp6 a partir de la librería principal (descrita más arriba), y este RNA se utilizó para generar una librería de cDNA cebado aleatoriamente en el vector pSST-AMY.0 utilizando reactivos y protocolos de Life Technologies (Super Script Plasmid System, referenciado anteriormente). En este procedimiento, el cDNA de cadena doble se seleccionó entre 500-1000 pb, se ligó con adaptadores NotI, se cortó con SfiI y se clonó en el vector cortado con SfiI/NotI. El vector pSST-AMY.o es un vector de clonaje que tiene el promotor de la alcohol deshidrogenasa de levaduras antes de las dianas de clonaje del cDNA y de la secuencia de la amilasa de ratón (la secuencia madura sin la señal de secreción) seguido del terminador de la alcohol deshidrogenasa de levadura, y después de las dianas de clonaje. En consecuencia, los cDNAs clonados en este vector que están fusionados en la misma pauta de lectura con la secuencia de la amilasa conducirán a la secreción de la amilasa de las colonias de levadura transfectadas adecuadamente.

3. Transformación y detección

El DNA de la librería descrita en el párrafo 2 anterior se enfrió en hielo antes de añadirse a las bacterias DH10B electrocompetentes (Life Technologies, 20 ml). Las bacterias y la mezcla del vector se electroporaron tal como se recomienda por el fabricante. A continuación, se añadió medio SOC (Life Technologies, 1 ml) y la mezcla se incubó a 37ºC durante 30 minutos. Los transformantes se plaquearon en 20 placas estándares de LB de 150 mm con ampicilina y se incubaron durante 16 horas (37ºC). Las colonias positivas se extrajeron de la placa y se aisló el DNA del sedimento bacteriano utilizando protocolos estándares, p.ej., gradiente de ClCs. El DNA purificado se utilizó a continuación en los protocolos de levaduras de más adelante.

Los procedimientos de levadura se dividieron en tres categorías: (1) transformación de levaduras con el vector combinado de plásmido/cDNA; (2) detección y aislamiento de clones de levaduras que secretan amilasa; y (3) amplificación por PCR del insertó directamente de la colonia de levadura y purificación del DNA para la secuenciación y análisis posterior.

La cepa de levadura utilizada fue la HD56-5A (ATCC-90785). Esta cepa tiene el genotipo siguiente: MAT alfa, ura3-52, leu2-3, leu2-112, his3-11, his3-15, MAL+, SUC+, GAL+. Preferentemente, se utilizan mutantes de levadura que son deficientes en las vías post-traduccionales. Dichos mutantes pueden tener alelos deficientes en la translocación en sec71, sec72, sec62, siendo la más preferida la truncada sec71. Alternativamente, se utilizarán preferentemente o en combinación con la levadura que expresa la amilasa los antagonistas (incluyendo los nucleótidos antisentido y/o ligandos) que interfieren con la operación normal de estos genes, otras proteínas implicadas en esta vía post-traduccinal (p.ej., SEC61p, SEC72p, SEC62p, SEC63p, TDJ1p o SSA1p-4p), o el complejo formado por estas proteínas.

La transformación se realiza basándose en el protocolo descrito por Giezz y col., Nucl. Acid. Res., 20:1425 (1992). Las células transformadas se inocularon a continuación del agar al medio complejo YEPD (100 ml) y se crecieron durante la noche a 30ºC. El medio YEPD se preparó tal como se describe en Kaiser y col., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p.207 (1994). El cultivo de toda la noche se diluyó a continuación a aproximadamente 2x10^{6} células/ml (aproximadamente DO_{600}=0,1) en medio YEPD fresco (500 ml) y se volvió a crecer a 1x10^{7} células/ml (aproximadamente, DO_{600}=0,4-0,5).

A continuación, se cosecharon las células y se prepararon para la transformación. Se transfirieron a botellas para rotor GS3 Sorval y se centrifugó a 5000 rpm durante 5 minutos, se descartó el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en agua estéril, se centrifugó de nuevo en tubos falcon de 50 ml a 3500 rpm en una centrífuga Beckmann GS-6KR. El sobrenadante se descartó y las células se lavaron a continuación con LiAc/TE (10 ml, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM pH 7,5, Li2OOCCH3 100 mM), y se resuspendieron en LiAc/TE (2,5 ml).

La transformación tuvo lugar mezclando las células preparadas (100 \mul) con el DNA de esperma de salmón de cadena sencilla desnaturalizado (Lofstrand Labs, Gaithersburg, MD) y se realizó la transformación en tubos de microcentrífuga (1 \mug, vol <10 \mul). La mezcla se mezcló brevemente mediante vórtex, luego se añadió PEG/TE al 40% (600 \mul, polietilén glicol-4000 al 40%, Tris-HCl 10 mm, EDTA 1 mM, Li2OOCCH3 100 mM, pH 7,5). Esta mezcla se mezcló cuidadosamente y se incubó a 30ºC en agitación durante 30 min. A continuación, se calentaron las células a 42ºC durante 15 minutos, y el recipiente de reacción se centrifugó a 12.000 rpm durante 5-10 s, se decantó el sobrenadante y el sedimento se centrifugó en TE (500 \mul, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5) seguido por una recentrifugación. Las células se diluyeron en TE (1 ml) y alícuotas de 200 \mul se extendieron sobre el medio selectivo preparado previamente en placas de crecimiento de 150 mm (VWR).

Alternativamente, en lugar de múltiples reacciones pequeñas, la transformación se realizó utilizando una sola reacción a gran escala, en donde se escalaron las cantidades del reactivo de acuerdo con la magnitud.

El medio selectivo utilizado fue un agar de dextrosa sintético sin uracilo (SCD-Ura) preparado tal como se describe en Kaiser y col., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994). Los transformantes se crecieron a 30ºC durante 2-3 días.

La detección de colonias que secretaban amilasa se realizó incluyendo rojo almidón en el medio de crecimiento selectivo. El almidón se acopló a un colorante rojo (Reactive Red-120 de Sigma) según el procedimiento descrito por Biely y col., Anal. Biochem., 172:176-179 (1988). El almidón acoplado se incorporó en las placas de agar SCD-Ura a una concentración final de 0,15% (p/v) y se tamponó con fosfato potásico a un pH de 7,0 (50-100 mM concentración final).

Las colonias positivas se picaron y se sembraron en estría (en placas de 150 mm) con el fin de obtener colonias aisladas identificables. Las colonias bien aisladas y positivas para la secreción de amilasa se detectaron mediante incorporación directa de rojo almidón en agar SCD-Ura tamponado. Se determinaron las colonias positivas por su capacidad para romper el almidón lo que proporcionó un halo claro alrededor de la colonia positiva visualizada directamente.

4. Aislamiento del DNA mediante amplificación por PCR

Cuando se aisló una colonia positiva, una porción de ésta se tocó con un palillo y se diluyó en agua estéril (30 \mul) en una placa de 96 pocillos. En este momento, las colonias positivas se congelaron y se guardaron para el análisis posterior o se amplificaron inmediatamente. Una alícuota de las células (5 \mul) se utilizó como molde para la reacción de PCR en un volumen de 25 \mul que contenía: 0,5 \mul de Klentaq (Clontech, Palo Alto, CA); 4,0 \mul de dNTPs 10 mM (Perkin Elmer); 2,5 \mul de tampón Kentaq (Clontech); 0,25 \mul de oligo 1 de sentido de transcripción 5' y 0,25 \mul de oligo 2 de sentido de transcripción 3'; 12,5 \mul de agua destilada.

La secuencia del oligo 1 de sentido de transcripción 5' fue:

5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3'

\hskip0,5cm

(SEC ID NO:1)

La secuencia del oligo 2 de sentido de transcripción 3' fue:

5'-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3'

\hskip0,5cm

(SEC ID NO:2)

La PCR se realizó de la manera siguiente:

a.	Desnaturalización 92ºC 5 min
b. 3 ciclos de	Desnaturalización 92ºC, 30 s
	Hibridación 59ºC, 30 s
	Extensión 72ºC, 60 s

c. 3 ciclos de	Desnaturalización 92ºC, 30 s
	Hibridación 57ºC, 30 s
	Extensión 72ºC, 60 s

d. 25 ciclos de	Desnaturalización 92ºC, 30 s
	Hibridación 55ºC, 30 s
	Extensión 72ºC, 60 s
	Mantener a 4ºC

Las regiones subrayadas de los oligonucleótidos hibridaron con la región promotora ADH y la región de la amilasa, respectivamente, y la región de 307 pb del vector pSST-AMY.0 cuando no hay inserto. En general, los primeros 18 nucleótidos del extremo 5' de estos oligonucleótidos contienen las dianas de hibridación para los cebadores de secuenciación. Así, el producto total de la reacción de PCR de un vector vacío fue de 343 pb. Sin embargo, el cDNA fusionado a la secuencia señal dio como resultado secuencias de nucleótidos más largas.

Después de la PCR, una alícuota de la reacción (5 \mul) se examinó por electroforesis en gel de agarosa gd al 1% con un sistema tampón Tris-Borato-EDTA (TBE), tal como se describe en Sambrook y col., supra. Los clones que produjeron una sola banda de PCR intensa y superior a 400 pb se analizaron por secuenciación del DNA tras purificación con una columna 96 Qiaquick PCR clean-up (Qiagen Inc., Chatsworth, CA).

Ejemplo 3 Aislamiento de los clones de cDNA mediante análisis del algoritmo señal

Se identificaron diversas secuencias que codificaban polipéptidos mediante el algoritmo de búsqueda de señal adecuado desarrollado por Genentech, Inc. (South San Francisco, CA) en ESTs, así como en fragmentos de EST agrupados y ensamblados procedentes de bases de datos públicas (p.ej., GenBAnk) y/o privadas (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals Inc., Palo Alto, CA). El algoritmo de la secuencia señal computa una valoración de señal de secreción basada en el carácter de los nucleótidos de DNA alrededor del primer y opcionalmente del segundo codón de metionina (ATG) en el extremo 5' de la secuencia o fragmento de secuencia a considerar. Los nucleótidos posteriores al ATG deben codificar para al menos 35 aminoácidos no ambiguos sin codones de parada. Si el primer ATG tiene los aminoácidos requeridos, el segundo ya no se examina. Si ninguno cumple con los requisitos, la secuencia candidata no se valora. Con el fin de determinar si la secuencia EST contiene una señal auténtica, el DNA y las secuencias aminoacídicas correspondientes que rodean el codón ATG se valoran utilizando un grupo de 7 sensores (parámetros de evaluación) conocidos por estar asociados con las señales de secreción. La utilización de este algoritmo dio como resultado la identificación de numerosas secuencias de ácido nucleico que codificaban polipéptidos.

Ejemplo 4 Aislamiento de los clones de cDNA que codifican el PRO 1186 humano

La utilización del algoritmo de secuencia señal descrito en el Ejemplo 3 anterior permitió la identificación de una sola secuencia clúster EST a partir de la base de datos Incyte. Esta secuencia clúster EST se comparó con diversas bases de datos de secuencias etiqueta (EST) que incluyen las bases de datos EST públicas (p.ej., GenBank) y una base de datos de DNA de EST privada (LIFESEQ®, Icyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) para identificar las homologías existentes. La búsqueda de homología se realizó utilizando el programa informático BLAST o BLAST2 (Altshul y col., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)). Aquellas comparaciones que dieron como resultado una valoración de BLAST de 70 (o en algunos casos 90), o superior no codifican proteínas conocidas se agruparon y ensamblaron en una secuencia de DNA consenso con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington). La secuencia consenso obtenida se denominó aquí DNA56748.

En vista de la homología de secuencia observada entre la secuencia consenso DNA56748 y una secuencia EST comprendida dentro del clon ESTde Incyte noº 3476792, el clon EST 3476792 se consiguió y se obtuvo un inserto de cDNA que se secuenció, hallándose que codificaba una proteína de longitud completa. La secuencia de este inserto de cDNA se muestra en la Figura 265 y aquí se ha denominado como DNA60621-1516.

El clon de longitud completa que se muestra en la Figura 265 contenía una sola pauta de lectura abierta con un sitio aparente de inicio de la traducción en las posiciones nucleotídicas 91-93 y que finaliza en el codón de parada hallado en las posiciones 406-408 (Figura 1; SEC NO: 3). El precursor del polipéptido predicho (Figura 2, SEC ID No:4) tiene 105 aminoácidos de largo. El péptido señal se halla en los aminoácidos 1-19 de la SEC ID NO:4. PRO1186 tiene un peso molecular calculado de aproximadamente 11.715 daltons y un pI estimado de aproximadamente 9,05. El clon DNA60621-1516 se depositó en el ATCC el 4 de agosto de 1998 con el número 203091.

Un análisis de la base de datos de Dayhoff (versión 35.45 SwissProt 35), utilizando un análisis de alineamiento de secuencia WU-BLAST2 de la secuencia de longitud completa que se muestra en la Figura 2 (SEC ID NO:4), demostró cierta identidad de secuencia entre la secuencia aminoacídica de PRO1186 y las secuencias siguientes de Ayhoff:VPRA_DENPO, LF4_CHICK, AF=034208_1, AF=030433_1, A55035, COL_RABIT, CELB=0507_9), S67826_1 y CRU73817_1.

Ejemplo 5 Utilización de PRO como sonda de hibridación

El procedimiento siguiente describe la utilización de una secuencia nucleotídica que codifica PRO como una sonda de hibridación.

El DNA que comprende la secuencia codificante de longitud completa o madura de PRO tal como se describe aquí se utiliza como una sonda para cribar los DNAs homólogos (como los que codifican variantes naturales de PRO) en librerías de cDNA de tejido humano o librerías genómicas humanas.

La hibridación y el lavado de los filtros que contenían los DNAs de la librería se realizaron en las condiciones de alta astringencia siguientes. La hibridación de la sonda derivada de PRO marcada isotópicamente con los filtros se realizó en una solución de formamida al 50%, 5XSSC, SDS 0,1%, pirofosfato sódico al 0,1%, fosfato sódico 50 mM, pH 6,8, solución de 2xDenhardts y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC durante 20 horas. El lavado de los filtros se realizó en una solución acuosa de 0,1X SSC y SDS al 0,1% a 42ºC.

Los DNAs que presentaban una identidad de secuencia deseada con el DNA que codifica PRO de secuencia nativa de longitud completa pueden identificarse mediante técnicas estándares conocidas en la materia.

Ejemplo 6 Expresión de PRO en E. coli

Este ejemplo ilustra la preparación de una forma glicosilada de PRO mediante expresión recombinante de E. coli.

La secuencia del DNA que codifica PRO se amplificó inicialmente con cebadores de PCR específicos. Los cebadores deben contener dianas de restricción que correspondan con las dianas de restricción en el vector de expresión seleccionado. Pueden utilizarse diversos vectores de expresión. Un ejemplo de un vector adecuado es el pBR322 (derivado de E. coli; véase Bolivar y col., Gene, 2:95 (1977)) que contiene genes para la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina. El vector se digirió con la enzima de restricción y se desfosforiló. Y las secuencias amplificadas por PCR se ligaron en el vector. El vector incluirá preferentemente secuencias que codifiquen un gen de resistencia a un antibiótico, un promotor trp, un líder polihis (incluyendo los 6 primeros codones STII, la secuencia polihis y la diana de corte de la enteroquinasa), la región codificante de PRO, el terminador transcripcional de lambda y un gen argU.

La mezcla de ligación se utilizó para transformar una cepa de E. coli seleccionada mediante procedimientos descritos en Sambrook y col., supra. Los transformantes se identificaron por su capacidad para crecer en placas LB y a continuación se seleccionaron las colonias resistentes. A continuación, se aisló el DNA del plásmido y se realizó un análisis de restricción enzimática y secuenciación de DNA para confirmar la identidad del mismo.

Los clones seleccionados pueden crecerse durante la noche en un medio de cultivo líquido como el LB suplementado con antibióticos. El cultivo de toda la noche puede utilizarse de este modo para inocular un cultivo a mayor escala. Las células se crecen a una densidad óptica deseada, durante la cual se favorece la expresión del promotor.

Después de cultivar las células durante varias hora más, éstas se pueden cosechar por centrifugación. El sedimento celular obtenido por centrifugación puede solubilizarse con diversos agentes conocidos en la materia, y la proteína PRO solubilizada puede purificarse a continuación con una columna quelante de metales en condiciones que permitan la unión estrecha de la proteína.

PRO puede expresarse en E. coli en una forma con etiqueta de poli-His, utilizando procedimiento que se detalla a continuación. El DNA que codifica PRO se amplifica inicialmente con cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores contienen dianas de restricción que corresponden con las del vector de expresión seleccionado, y otras secuencias de utilidad para el inicio de la traducción eficiente, para una purificación rápida en una columna quelante de metales y extracción proteolítica con enteroquinasas. Las secuencias etiquetadas con poli-His, amplificadas por PCR, se ligan en un vector de expresión, que se utiliza para transformar un huésped de E.coli derivado de la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA)lon galE rpoHts(htpRts) clpP(laclq). Los transformantes se crecen en primer lugar en medio LB con 50 mg/ml de carbenicilina a 30ºC y en agitación hasta alcanzar una DO_{600} de 3-5. Los cultivos se diluyen a continuación de 50-100 veces en medio CRAP (preparado mezclando 3,57 g de (NH4)SO4, 0,71 g de citrato sódico.2H2O, 1,07 g de KCL, 5,36 de extracto de levadura Difco, 5,36 g de hycase de Sheffield SF en 500 ml de agua, MPOS 110 mM, pH 7,3, glucosa al 0,55% (p/v) y MgSO4 7 mM y se crecen durante unas 20-30 horas a 30ºC y en agitación. Se recogen muestras para verificar la expresión por análisis de SDS-PAGE, y se centrifuga todo el cultivo para sedimentar las células. Los sedimentos celulares se congelan hasta su posterior purificación y renaturalización.

La pasta de la fermentación de 0,5 a 1 l de E. coli (6-10 g de sedimento) se resuspende en 10 volúmenes (p/v) de guanidina 7M, Tris 20 mM, pH 8. Se añaden el sulfito sódico sólido y el tetrationato sódico a una concentración final de 0,1 M y 0,02 M, respectivamente, y la solución se mezcla durante la noche a 4ºC. Esta etapa da como resultado una proteína desnaturalizada con todos los residuos de cisteína bloqueados por sulfitolización. La solución se centrifuga a 40.000 rpm en una ultracentrífuga Beckman durante 30 min. El sobrenadante se diluye con 3-5 volúmenes de tampón quelante de metales (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7,4) y se filtra a través de filtros de 0,22 \mum para clarificar. El extracto así clarificado se carga en una columna Qiagen Ni-NTA quelante de metales de 5 ml y equilibrada con el tampón quelante de metales. La columna se lava con tampón adicional que contiene imidazol 50 mM (Calbiochem, grado Utrol), pH 4,7. La proteína se eluye con tampón que contiene imidazol 250 mM. Las fracciones que contienen la proteína deseada se agrupan y guardan a 4ºC. La concentración de proteína se estima por su absorbancia a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción basado en su secuencia aminoacídica.

Las proteínas se renaturalizan diluyendo la muestra lentamente en tampón de renaturalización recién preparado que contiene Tris 20 mM, pH 8,6, NaCl 0,3 M, urea 2,5 M, cisteína 5 mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes de renaturalización se eligen de manera que la concentración final de proteína se halle entre los 50-100 \mug/ml. La solución de renaturalización se mezcla suavemente a 4ºC durante 12-36 h. La reacción de renaturalización se para mediante adición de TFA a una concentración final del 0,4% (pH aproximado de 3). Antes de purificar la proteína, la solución se filtra a través de filtros de 0,22 \mum y se añade acetonitrilo a una concentración final del 2-10%. La proteína renaturalizada se cromatografía en una columna de fase inversa Poros R1/H utilizando un tampón móvil de TFA al 0,1% con elución con un gradiente de acetonitrilo desde el 10 al 18%. Se analizan alícuotas de las fracciones con absorbancia a A_{280} en geles de poliacrilamida y se agrupan las fracciones que contienen la proteína renaturalizada homogénea. Por lo general, las especies renaturalizadas adecuadamente de la mayoría de proteínas se eluyen a las concentraciones menores de acetonitrilo ya que esas especies son las más compactas por sus interiores hidrofóbicos protegidos de la interacción con la resina de la fase inversa. Las especies agregadas se eluyen generalmente a concentraciones de acetonitrilo superiores. Además de resolver formas mal plegadas de las proteínas de la forma deseada, la etapa de fase inversa también elimina la endotoxina de las muestras.

Las fracciones que contienen el polipéptido PRO plegado correctamente se agrupan y se elimina el acetonitrilo con una corriente de nitrógeno dirigido a la solución. Las proteínas se formulan en Hepes 20 mM, pH 6,8 con cloruro sódico 0,14 M y manitol al 4% por diálisis o filtración en gel con resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el tampón de la formulación y filtradas estérilmente.

Muchos de los polipéptidos PRO descritos en la solicitud primera, patente internacional WO99/63088 (de la cual deriva la presente solicitud) se expresaron satisfactoriamente tal como se describió anteriormente.

Ejemplo 7 Expresión de PRO en células de mamífero

Este ejemplo ilustra la preparación de una forma glicosilada potencialmente de PRO mediante expresión recombinante en células de mamífero.

El vector, pRK5 (véase la patente europea EP 307.247, publicada el 15 de Marzo de 1989) se utilizó como vector de expresión. Opcionalmente, el DNA de PRO se ligó en pRK5 con enzimas de restricción para permitir la inserción del DNA de PRO utilizando procedimientos de ligación tal como se describe en Sambrook y col., supra. El vector resultante se denominó pRK5-PRO.

En una realización, las células huésped seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC CCL 1573) se crecen hasta su confluencia en placas de medio de cultivo como el DMEM suplementado con suero de ternera fetal y opcionalmente componentes nutricionales y/o antibióticos. Aproximadamente, 10 \mug del DNA de pRK5-PRO se mezcla con aproximadamente 1 \mug de DNA que codifica el gen VARNA [Thimmappaya y col., Cell, 31:543 (1982)] y se resuspenden en 500 \mul de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl2 0,227 M. A esta mezcla se añaden gota a gota 500 \mul de HEPES 50 mM (pH7,35), NaCl 280 mM, NaPO4 1,5 mM y se deja formar un precipitado durante 10 min a 25ºC. El precipitado se resuspende y se añade a las células 293, y se deja sedimentar durante unas 4 horas a 37ºC. El medio de cultivo se aspira y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 s. Las células 293 se lavan a continuación con medio sin suero, se añade medio fresco y las células se incuban durante unas 5 horas.

Al cabo de aproximadamente unas 24 horas después de la transfección, se elimina el medio de cultivo y se reemplaza por medio nuevo (solo) o medio de cultivo con 200 \muCi/ml de cisteína-S^{25} y 200 \muCi/ml de metionina-S^{35}. Al cabo de 12 horas de incubación, el medio condicionado se recoge, se concentra por centrifugación en un filtro, y se carga en un gel con SDS al 15%. El gel procesado puede secarse y exponerse a una película durante un periodo de tiempo seleccionado para revelar la presencia del polipéptido PRO. Los cultivos que contienen las células transfectadas pueden sufrir una incubación adicional (en medio sin suero) y el medio se analiza entonces en bioensayos seleccionados.

En una técnica alternativa, PRO puede introducirse en las células 293 de forma transitoria utilizando el procedimiento del sulfato de dextrano descrito por Somparyrac y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981). Las células 293 se crecen a densidad máxima en un frasco de centrifugación y se añaden 700 g del DNA de pRK5-PRO. En primer lugar, las células se concentran en el frasco centrifugador mediante centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado de DNA-dextrano se incuba sobre el sedimento celular durante 4 h. A continuación, las células se tratan con glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de tejidos y se re-introducen en el frasco centrifugador que contiene el medio de cultivo de tejidos, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Al cabo de 4 días, se centrifuga el medio condicionado y se filtra para eliminar células y restos celulares. La muestra que contenía el PRO expresado puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, como la diálisis y/o la cromatografía en columna.

En otra realización, PRO se puede expresar en células CHO. PRK5-PRO se puede transfectar en células CHO utilizando reactivos conocidos como el CaPO4 o el DEAE-dextrano. Tal como se describió más arriba, se pueden incubar los cultivos celulares y reemplazarse el medio por medio de cultivo (solo) o medio que contenga un marcaje radioactivo como la metionina-S^{35}. Después de determinar la presencia del polipéptido PRO, el medio de cultivo se puede reemplazar con medio sin suero. Preferentemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días, y a continuación se cosecha el medio condicionado. El medio que contiene el PRO expresado puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado.

El PRO etiquetado epitópicamente también puede expresarse en células CHO. El PRO puede subclonarse en otro vector distinto al pRK5. Para colocar el inserto del subclon en la misma pauta de lectura que la etiqueta epitópica, como por ejemplo poli-his, se amplifica el inserto del subclon por PCR y luego se fusiona con un vector de expresión de Baculovirus. El inserto PRO etiquetado epitópicamente puede subclonarse en un vector dirigido por SV40 que contenga el marcador de selección como el DHFR para la selección de clones estables. Por último, las células CHO se transfectan (tal como se describe más arriba) con el vector dirigido por SV40. Se puede realizar un marcaje, tal como se describió más arriba, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contenga PRO etiquetado con poli-His puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, como una cromatografía de afinidad con quelato-Ni^{2+}.

PRO también puede expresarse en células CHO y/o COS mediante expresión transitoria o en células CHO mediante otro procedimiento de expresión estable.

La expresión estable en células CHO se realiza utilizando el procedimiento siguiente. Las proteínas se expresan como una construcción de IgG (inmunoadhesina), en la que secuencias codificantes para las formas solubles (p.ej., dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan con una secuencia de región constante de IgG1 que contiene la bisagra, los dominios CH1 y CH2 y/o la forma etiquetada con poli-His.

Después de la amplificación por PCR, los DNAs se subclonan en un vector de expresión de CHO mediante técnicas estándares como las descritas por Ausubel y col., Current Protocols of Molecular Biology, Unidad 3.16, John Wiley and Sons (1997). Los vectores de expresión en CHO se construyeron para tener dianas de restricción compatibles en 5' y 3' con el DNA de interés para permitir la destinación adecuada de los cDNAs. El vector de expresión utilizado en las células CHO es el descrito por Lucas y col., Nucl. Acids. Res., 24:9 (1774-1779 (1996), y utiliza el promotor temprano/intensificador de transcripción de SV40 para conducir la expresión del cDNA de interés y la dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la selección para el mantenimiento estable del plásmido después de la transfección.

Doce microgramos del DNA plasmídico se introducen en aproximadamente 10x10^{6} de células mediante reactivos de transfección disponibles comercialmente como Superfect (Qiagen), Dosper o Fugene (Boehringer Mannheim). Las células se crecieron tal como se describen en Lucas y col., supra. Aproximadamente, 3x10^{7} células se congelaron en un vial para el crecimiento y producción posteriores tal como se describe más abajo.

Los viales que contienen el DNA plasmídico se descongelan colocándolos en un baño de agua y se mezclan con ayuda del vórtex. Los contenidos se pipetean en un tubo de centrífuga que contiene 10 ml de medio y se centrifugan a 1000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se aspira y las células se resuspenden en 10 ml de medio selectivo (PS20 filtrado con 0,2 \mum con 5% de suero fetal bovino filtrado con 0,2 \mum). Las células se alicuotaron en un frasco centrifugador de 100 ml que contenía 90 ml de medio selectivo. Al cabo de 1-2 días, las células se transfectaron en un frasco centrifugador de 250 ml lleno con 150 ml de medio de crecimiento selectivo y se incubaron a 37ºC. Después de 2-3 días, los frascos de centrifugación de 500 ml y 2000 ml se sembraron con 3x105 células/ml. El medio celular se cambió por medio fresco mediante centrifugación y resuspensión en medio de producción. Aunque es posible utilizar cualquier tipo de medio adecuado para CHO, se utilizó un medio de producción descrito en la patente americana U.S. 5.122.469, publicada el 16 de Junio de 1992. Un frasco centrifugador de 3 l de producción se sembró con 1,2x10^{6} células/ml. El día 0, se determinó el número de células y el pH. El día 1, se tomó una muestra y se inició la introducción de aire filtrado. El día 2, se tomó una muestra, la temperatura se disminuyó a 33ºC y se añadieron 30 ml de glucosa a 500g/l y 0,6 ml de antiespumante al 10% (p.ej., emulsión de polidimetilsiloxano al 35%, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion). Durante la producción, se ajustó el pH al punto necesario para mantenerlo a aproximadamente a 7,2. Al cabo de 10 días, o hasta que la viabilidad disminuyera por debajo del 70%, el cultivo celular se cosechó por centrifugación y se filtró a través de un filtro de 0,22 \mum. El filtrado se guardó a 4ºC o se cargó inmediatamente en columnas para la purificación.

Para las construcciones etiquetadas con poli-His, las proteínas se purificaron con una columna de Ni-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se añadió imidazol al medio condicionado a una concentración de 5 mM. El medio condicionado se cargó en una columna de Ni-NTA de 6 ml equilibrada con Hepes 20 mM, pH 7,4 que contenía NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min a 4ºC. Después de cargarlo, la columna se lavó con tampón de equilibrio adicional y la proteína se eluyó con tampón de equilibrio que contenía imidazol 0,25 M. La proteína altamente purificada se desaló a continuación en un tampón de almacenamiento con Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna Superfine de G25 (Pharmacia) y se guardó a -80ºC.

Las construcciones de inmunoadhesina (que contienen Fc) se purificaron del medio condicionado de la manera siguiente. El medio condicionado se cargó en una columna de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que había sido equilibrada con tampón fosfato sódico 20 mM, pH 6,8. Después de cargarla, la columna se lavó extensamente con tampón de equilibrio antes de la elución con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluída se neutralizó inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contenían 275 \mul de tampón Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada se desaló en tampón de almacenamiento tal como se describió más arriba para las proteínas etiquetadas con poli-His. La homogeneidad se valoró mediante geles de poliacrilamida y SDS y secuenciación aminoacídica por degradación de Edman. Muchos de los polipéptidos PRO descritos en la solicitud primer, patente internacional WO99/63088 (de la cual se desprende esta solicitud) se expresaron satisfactoriamente tal como se describió más arriba.

Ejemplo 8 Expresión de PRO en levaduras

El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante de PRO en levaduras.

En primer lugar, se construyeron los vectores de expresión en levaduras para la producción o secreción de PRO a partir del promotor ADH2/GAPDH. El DNA que codifica PRO y el promotor se inserta en dianas de restricción adecuadas en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión de PRO. Para la secreción, el DNA que codifica PRO puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto con el DNA que codifica el promotor ADH2/GAPDH, un péptido señal de PRO u otro péptido señal de mamífero, o por ejemplo, una factor-alfa de levaduras o la secuencia señal/líder secretora, y las secuencias engarce (si fuera necesario) para la expresión de PRO.

Las células de levadura de la cepa AB110, también pueden transformarse con los plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivarse en medio de fermentación seleccionado. Los sobrenadantes de levadura transformados pueden analizarse mediante precipitación con ácido tricloroacético al 10% y separación por SDS-PAGE, seguido de la tinción de geles con azul de Coomassie.

El PRO recombinante puede a continuación aislarse y purificarse eliminando las células de levadura del medio de fermentación mediante centrifugación y luego concentrando el medio con filtros de cartuchos seleccionados. El concentrado que contiene PRO puede purificarse posteriormente con resinas seleccionadas de cromatografía en columna. Muchos de los polipéptidos PRO descritos en la solicitud previa, patente internacional WO99/63088 (de la cual se deriva la presente solicitud) se expresaron satisfactoriamente tal como se describió más arriba.

Ejemplo 9 Expresión de PRO en células de insecto infectadas con baculovirus

El procedimiento siguiente describe la expresión recombinante de PRO en células de insecto infectadas con baculovirus.

La secuencia codificante para PRO se fusionó cadena arriba de una etiqueta epitópica que contenía el vector de expresión de baculovirus. Dichas etiquetas epitópicas incluyen una etiqueta poli-his y etiquetas de inmunoglobulina (como las regiones Fc de IgG). Se puede utilizar una gran variedad de plásmidos, incluyendo los derivados de plásmidos disponibles comercialmente como el pVL1393 (Novagen). En resumen, la secuencia codificante PRO de la porción deseada de la secuencia codificante de PRO como la secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína transmembrana, o la secuencia que codifica la proteína madura si la proteína es extracelular se amplifica por PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar las dianas de restricción flanqueantes (seleccionadas). El producto se digiere a continuación con las enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en el vector de expresión.

El baculovirus recombinante se generó mediante co-transfección del plásmido anterior y el DNA del virus BAculoGoldTM (Pharmigen) en las células Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Al cabo de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se cosecharon y utilizaron para las amplificaciones posteriores. La infección viral y la expresión de la proteína se realizaron tal como se describió por O'Reily y col., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).

El PRO etiquetado con poli-his y así expresado puede purificarse, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad con quelante-Ni2+ de la manera siguiente. Se prepararon extractos de las células Sf9 infectadas con el virus recombinante tal como se describe en Rupen y col., Nature, 362:175-179 (1993). En resumen, las células Sf9 se lavaron, se resuspendieron y sonicaron en tampón (25 ml de Hepes, pH 7,9; Cl_{2}Mg 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; glicerol al 10%; NP-40 al 0,1%; KCl 0,4 M), y se sonicaron dos veces durante 20 segundos en hielo. Los sonicados se clarificaron mediante centrifugación, y el sobrenadante se diluyó 50 veces en tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtró a través de un filtro de 0,45 \mum. Se preparó una columna de agarosa Ni2+-NTA (disponible comercialmente de Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lavó con 25 ml de agua y se equilibró con 25 ml de tampón de carga. El extracto celular filtrado se cargó en la columna a 0,5 ml por minuto. La columna se lavó en el nivel basal de A280 con tampón de carga, en cuyo momento se inició la recolección de las fracciones. A continuación, la columna se lavó con un tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 6,0), que eluye inespecíficamente la proteína unida. Después de alcanzar de nuevo el nivel basal de A280, la columna se resolvió con un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el segundo tampón de lavado. Se recogieron fracciones de 1 ml y se analizaron mediante SDS-PAGE y tinción de plata o transferencia de western con Ni2+-NTA conjugado con fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contenían el PRO etiquetado con poli-His eluido se agruparon y se dializaron frente al tampón de carga.

Alternativamente, puede realizarse la purficación de PRO etiquetado con IgG (o Fc) mediante técnicas cromatográficas bien conocidas en la materia. Estas técnicas incluyen por ejemplo la cromatografía en columna de proteína A o proteína G. Muchos de los polipéptidos PRO descritos en la solicitud previa, patente internacional WO99/63088 (de la cual se deriva la presente solicitud) se expresaron satisfactoriamente tal como se describió más arriba.

Ejemplo 10 Preparación de anticuerpos que se unen a PRO

Este ejemplo muestra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a PRO.

Las técnicas para la producción de anticuerpos monoclonales son conocidas en la materia y se describen, por ejemplo, en Goding, supra. Los inmunógenos que pueden utilizarse incluyen el PRO purificado, las proteínas de fusión que contienen PRO, y las células que expresan el PRO recombinante en la superficie de las células. La selección del inmunógeno puede realizarse por el operario experto sin excesiva experimentación.

Se inmunizaron ratones como los Balb/c con el inmunógeno PRO en emulsión con adyuvante completo de Freund y se inyectaron subcutánea o peritonealmente en una cantidad de 1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno se emulsionó en adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyectó en los cojinetes de las patas traseras de los animales. Los ratones inmunizados se re-estimularon a los 10-12 días con inmunógeno emulsionado adicional en adyuvante seleccionado. Después, durante varias semanas, los ratones también se estimularon con inyecciones de inmunización adicional. Las muestras de suero pueden obtenerse periódicamente de los ratones mediante sangrado retro-orbital para el ensayo de ELISA con el fin de detectar anticuerpos anti-PRO.

Después de detectar una titulación de anticuerpo adecuada, los animales positivos para los anticuerpos se pueden inyectar con una inyección final intravenosa de PRO. De tres a cuatro días más tarde, los ratones se sacrificaron y se extrajeron los bazos. Las células del bazo se fusionaron (utilizando el procedimiento del polietilén glicol al 35%) con una línea de células de mieloma murino seleccionada como la P3X63AgU.1, disponible comercialmente por ATCC, No. CRL 1597. Las fusiones generaron células de hibridoma que a continuación pueden plaquearse en placas de 96 pocillos de cultivo de tejidos con medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina), para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células del bazo.

Las células de hibridoma se cribarán con un ELISA por su reactividad contra PRO. La determinación de las células de hibridomas como positivas para la secreción de anticuerpos monoclonales contra PRO se halla dentro de las competencias del experto en la materia.

Las células de hibridoma positivas pueden inyectarse intraperitonealmente en ratones Balb/c singénicos para producir ascitas que contengan anticuerpos monoclonales anti-PRO. Alternativamente, las células de hibridoma pueden crecerse en frascos de cultivo de tejido o en ampollas de agitación. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en las ascitas puede lograrse utilizando la precipitación con sulfato amónico, seguido por la exclusión en gel. Alternativamente, puede utilizarse la cromatografía por afinidad basada en la unión del anticuerpo con la proteína A o la proteína G.

Ejemplo 11 Purificación de polipéptidos PRO utilizando anticuerpos específicos

Los polipéptidos PRO recombinantes o nativos pueden purificarse mediante una variedad de técnicas estándares en la materia de purificación de proteínas. Por ejemplo, el polipéptido pro-PRO, el polipéptido PRO maduro, o el polipéptido pre-PRO se purifican mediante cromatografía de afinidad utilizando anticuerpos específicos para el polipéptido de interés. Por lo general, se construye una columna de inmunoafinidad mediante acoplamiento covalente del anticuerpo anti-polipéptido PRO con una resina cromatográfica activada.

Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a partir del suero inmune bien por precipitación con sulfato amónico o mediante purificación sobre la proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). De igual forma, se prepararon los anticuerpos monoclonales del fluido de ascitas de ratones mediante precipitación con sulfato amónico o cromatografía sobre Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina parcialmente purificada se une covalentemente a una resina cromatográfica como la SEPHAROSETM CnBr activada (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se acopla a la resina, la resina se bloquea, y la resina derivada se lava de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Una columna de inmunoafinidad se utiliza en la purificación del polipéptido PRO mediante preparación de una fracción a partir de las células que contienen el polipéptido PRO en una forma soluble. Esta preparación se deriva mediante solubilización de las células enteras o de una fracción subcelular obtenida por centrifugación diferencial con adición de detergente o mediante otros procedimientos bien conocidos en la materia. Alternativamente, el polipéptido PRO soluble que contiene una secuencia señal puede secretarse en cantidad suficiente en el medio de crecimiento de las células.

Un polipéptido PRO soluble que contiene la preparación se pasa por la columna de inmunoafinidad y la columna se lava en las condiciones que permiten la absorbancia preferencial del polipéptido PRO (p.ej., tampones de alta fuerza iónica en presencia de detergentes). Luego, se eluye la columna en condiciones que rompen la unión anticuerpo/polipéptido PRO (p.ej., un tampón de pH bajo como por ejemplo pH 3,2, o una concentración elevada de un agente caotrópico como la urea o el ión isotiocianato) y por último se recoge el polipéptido PRO.

Ejemplo 12 Cribado del fármaco

La invención es particularmente útil para el cribado de compuestos mediante el polipéptido PRO o la unión de fragmentos de éste en cualquiera de las técnicas de cribado de fármacos. El polipéptido PRO o un fragmento del mismo utilizado en un ensayo de este tipo pueden estar en solución, fijado a un soporte sólido, en la superficie de una célula, o localizado intracelularmente. Un procedimiento de cribado de fármacos utiliza células huésped eucariotas o procariotas que se transforman establemente con los ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido PRO o el fragmento del mismo. Los fármacos se criban contra dichas células transformadas en ensayos de unión competitiva. Dichas células, bien vivas o fijadas, pueden utilizarse para ensayos de unión estándares. Se puede cuantificar, por ejemplo, la formación de complejos entre el polipéptido PRO o un fragmento y el agente que se analiza. Alternativamente, se puede examinar la disminución en la formación del complejo entre el polipéptido PRO y su célula diana o los receptores diana causada por el agente que se analiza.

Así, la presente invención proporciona procedimientos de rastreo para fármacos de cualquier agente que pueda afectar a una enfermedad o trastorno asociado al polipéptido PRO. Estos procedimientos comprenden el contacto de dicho agente con un polipéptido PRO o fragmento de lo mismo y el ensayo (I) para la presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido PRO o fragmento de lo mismo, o (II) para la presencia de un complejo entre el polipéptido PRO o un fragmento de éste y la célula, mediante procedimientos bien conocidos en la materia. En dichos ensayos de unión competitiva, el polipéptido PRO o un fragmento de éste se marca. Después de una incubación adecuada, se separa el polipéptido PRO o fragmento del presente en la forma unida, y la cantidad de polipéptido libre o no de marcaje que no forma un complejo se una medida de la capacidad del agente particular para unirse al polipéptido PRO o para interferir con el complejo polipéptido PRO/célula.

Otra técnica para el cribado de fármacos proporciona un cribado de alto rendimiento para compuestos que tienen una afinidad de unión adecuada y se describen en detalle en la patente internacional WO 84/03564, publicada el 13 de Septiembre de 1984. En resumen, se sintetiza un gran número de compuestos a analizar, distintos péptidos pequeños, sobre un sustrato sólido, como clavijas de plástico u otra superficie. En la aplicación al polipéptido PRO, los compuestos a analizar peptídicos reaccionan con el polipéptido PRO y a continuación se lavan. El polipéptido PRO unido se detecta mediante procedimientos bien conocidos en la materia. El polipéptido PRO purificado también puede disponerse recubriendo directamente las placas para utilizarse en las técnicas de cribado de fármacos mencionadas anteriormente. Además, los anticuerpos no neutralizantes pueden utilizarse para capturar el péptido e inmovilizarlo en un soporte sólido.

Esta invención también contempla la utilización de ensayos de cribado de fármacos en los que los anticuerpos neutralizantes capaces de unirse al polipéptido PRO compiten específicamente con un compuesto test para unirse al polipéptido PRO o a fragmentos de lo mismo. De esta manera, los anticuerpos se pueden utilizar para detectar cualquier péptido que comparta uno o más determinantes antigénicos con el polipéptido PRO.

Ejemplo 13 Diseño racional del fármaco

El objetivo del diseño racional de fármacos es producir análogos estructurales del polipéptido activo biológicamente de interés (es decir, un polipéptido PRO) o de moléculas pequeñas con las que interactúen, p.ej., agonistas, antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos puede utilizarse para fármacos de diseño que sean formas más activas o estables del polipéptido PRO o que interfieran o intensifiquen la función del polipéptido PRO in vivo (c.f., Hodgson, Bio/Technology, 9:19-21 (1991)).

En una aproximación, la estructura tridimensional del polipéptido PRO, o de un complejo polipéptido PRO-inhibidor, se determina mediante cristalografía de rayos X, mediante modelado informático o, más característicamente, mediante una combinación de las dos aproximaciones. Tanto la forma como las cargas del polipéptido PRO deben conocerse para resolver la estructura y para determinar el o los sitios activos de la molécula. También aunque menos de forma menos frecuente, se puede obtener información útil respecto a la estructura del polipéptido PRO mediante el modelado basado en la estructura de proteínas homólogas. En ambos casos, la información estructural relevante se utiliza para diseñar las moléculas de tipo polipéptido PRO análogas o para identificar inhibidores eficientes. Ejemplos útiles del diseño de fármacos racional pueden incluir moléculas que tengan una actividad o una estabilidad mejoradas tal como se muestra en Braxton y Wells, Biochemistry, 31:7796-7801 (1992) o que actúan como inhibidores, agonistas o antagonistas de péptidos nativos tal como se muestra por Athauda y col., J. Biochem., 113:742-746 (1993).

También es posible aislar un anticuerpo específico dirigido, seleccionado mediante un ensayo funcional, tal como se describió más arriba, y a continuación resolver su estructura cristalina. Esta aproximación, en principio, da como rendimiento un núcleo base del fármaco, o farmacore, sobre el cual se pueden diseñar los siguientes fármacos. Es posible, obviar la cristalografía de proteínas al generar anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ids) contra un anticuerpo activo farmacológicamente y funcional. Como una imagen en un espejo, el sitio del anti-ids debería ser un análogo del receptor original. El anti-id podría a continuación utilizarse para identificar y aislar formas peptídicas de bancos de péptidos producidos química o biológicamente. Los péptidos aislados podrían actuar a continuación como el farmacore.

De acuerdo con la presente invención, cantidades suficientes del polipéptido PRO pueden estar disponibles para realizar dichos estudios analíticos como la cristalografía de rayos X. Además, el conocimiento de la secuencia aminoacídica del polipéptido PRO que aquí se proporciona será una guía para aquellos que utilicen técnicas de modelado informático en lugar de o además de la cristalografía de rayos X.

Depósito del material

Los materiales siguientes se han depositado en el American Type Culture Collection, 1081 University Blvd., Manassas. VA 20110-2209, USA (ATCC):

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2

Material	Dep. nº ATCC	Fecha del depósito
DNA 60621-1516	203091	4 de Agosto de 1988

\newpage

Estos depósitos se realizaron de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con el Propósito de Procedimiento de Patentes y las Regulaciones comprendidas (Tratado de Budapest). Ello asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años desde la fecha del depósito. Los depósitos estarán disponibles por el ATCC según los términos del Tratado de Budapest, y sometidos al acuerdo entre Genentech, Inc., y ATCC, que asegura la disponibilidad permanente y no restringida de la progenie del cultivo del depósito para el público tras la expedición de la patente americana U.S. o permaneciendo abiertas al público de acuerdo con cualquier solicitud de patente americana o extranjera, cualquiera que sea quien fuera primero, y asegura la disponibilidad de la progenie al sujeto determinado por el Comisionado de patentes y marcas U.S. de acuerdo con 35 USC§122 y las normas del Comisionado de ello derivadas (inlcuyendo 37 CFR§1.14 con especial referencia a 886 OG 638).

El cesionario de la presente solicitud acuerda de que si el cultivo de los materiales en depósito puede morir o perderse o destruirse cuanto se cultiva en las condiciones adecuadas, los materiales deberán reemplazarse prontamente tras su notificación con otro igual. La disponibilidad del material depositado no debe considerarse como una licencia para la práctica de la invención en contravención de los derechos garantizados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.

La especificación aquí escrita se considera suficiente para permitir a un experto en la materia la práctica de la invención. La presente invención no está limitada en su ámbito por la construcción depositada, ya que la realización depositada debe considerarse una mera ilustración de ciertos aspectos de la invención y otras construcciones que sean funcionalmente equivalentes se hallan también dentro del ámbito de la invención, tal como se define en las reivindicaciones. El depósito del material no constituye una admisión de que la descripción aquí proporcionada sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de su realización, ni tampoco debe considerarse como limitante del ámbito de las reivindicaciones respecto a las ilustraciones específicas que la representan. Serán evidentes por los expertos en la materia a partir de la descripción aquí proporcionada diversas modificaciones, además de las aquí mostradas y descritas, que puedan realizarse y que se hallan dentro del ámbito de las reivindicaciones anexadas.

Claims

1. Ácido nucleico que comprende el DNA que codifica un polipéptido con al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de los residuos aminoacídicos 1 o 20 al 105, inclusive, de la secuencia aminoacídica que se muestra en la Figura 2 (SEC ID NO:4), o el complemento de lo mismo, en donde dicha identidad de secuencia se determina sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan.

2. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el grado de identidad es de al menos el 90%.

3. Ácido nucleico de la reivindicación 2, en donde el grado de identidad es de al menos el 95%.

4. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, que codifica un polipéptido de secuencia nativa que comprende los aminoácidos 1 o 20 a 105, inclusive, de la secuencia aminoacídica que se muestra en la Figura 2 (SEC ID NO:4).

5. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia codificante de longitud completa de la secuencia de la Figura 1 (SEC ID NO:3), o la complementaria.

6. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia nucleotídica que se muestra en la Figura 1 (SEC ID NO:3), o la complementaria.

7. Molécula de ácido nucleico aislado que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia codificante de longitud completa de la secuencia nucleotídica que se muestra en la Figura 1 (SEC ID NO:3), o la secuencia de los nucleótidos 148 a 405, inclusive, de la Figura 1 (SEC ID NO:3), o su complementaria, en donde dicha identidad de secuencia se determina sobre las secuencias de longitud completa que se comparan.

8. Ácido nucleico que comprende la secuencia codificante de longitud completa del inserto de ácido nucleico; DNA 60621-1516, contenido con el número de acceso ATCC 203091.

9. Vector que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

10. Vector de acuerdo con la reivindicación 9, el cual está unido operativamente con las secuencias control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector.

11. Célula huésped que comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 9 o la 10.

12. Célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicha célula es una célula CHO, una célula E. coli o de levadura.

13. Procedimiento para la producción de un polipéptido que comprende el cultivo de la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11 o la 12 en condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido y la recuperación del mencionado polipéptido a partir del cultivo celular.

14. Polipéptido aislado que tiene una identidad de secuencia aminoacídica de al menos el 80% con la secuencia de residuos de aminoácidos del 1 o el 20 al 105, inclusive, de la secuencia aminoacídica que se muestra en la Figura 2 (SEC ID NO:4).

15. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 14 que consiste en la secuencia de residuos aminoacídicos del 1 o el 20 al 105, inclusive, de la secuencia aminoacídica que se muestra en la Figura 2 (SEC ID NO:4).

16. Polipéptido aislado que tiene una identidad de secuencia aminoacídica de al menos el 80% con la secuencia aminoacídica codificada por el inserto de ácido nucleico de longitud completa, DNA 60621, contenido en el número de acceso ATCC 203091, con o sin su péptido señal.

17. Polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 16, que consiste en la secuencia aminoacídica codificada por la secuencia de longitud completa del inserto de ácido nucleico, DNA 60621-11516, contenida en el número de acceso ATCC 203091, con o sin su péptido señal.

18. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 14 o la 16, en donde el grado de identidad de al menos del 90%.

19. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el grado de identidad es de al menos del 95%.

20. Molécula quimérica que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19 fusionada con una secuencia aminoacídica heteróloga.

21. Molécula quimérica de acuerdo con la reivindicación 20, en donde dicha secuencia aminoacídica heteróloga es una secuencia etiqueta epitópica.

22. Molécula quimérica de acuerdo con la reivindicación 20, en donde dicha secuencia aminoacídica heteróloga es una región Fc de una inmunoglobulina.

23. Anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de acuerdo con la reivindicación 15 o la 17.

24. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 23, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

25. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 23, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

26. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 23, en donde dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo capaz de unirse al antígeno.

27. Composición que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 23-26 en combinación con un vehículo aceptable farmacéuticamente.