DE69929253T2

DE69929253T2 - Zum Schlangengiftpolypeptid A homologes Polypeptid und dafür kodierende Nukleinsäure

Info

Publication number: DE69929253T2
Application number: DE69929253T
Authority: DE
Inventors: Kevin Darnestown Baker; Jian Princeton Chen; Audrey San Francisco Goddard; Austin L. Belmong Gurney; Victoria Smith; Colin K. Watanabe; William I. Hillsborough Wood; Jean San Mateo Yuan
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1998-08-11
Filing date: 1999-06-02
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2019-06-03
Also published as: DE69929253D1; EP1247863B1; ES2256362T3; PT1247863E; ATE314473T1; EP1247863A1; DK1247863T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifikation und Isolierung neuer DNA und die rekombinante Produktion neuer Polypeptide.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Extrazelluläre Proteine spielen wichtige Rollen unter anderem bei der Bildung, Differenzierung und Aufrechterhaltung mehrzelliger Organismen. Die Bestimmung zahlreicher einzelner Zellen, z.B. zu Proliferation, Migration, Differenzierung oder Wechselwirkung mit anderen Zellen, wird typischerweise durch Informationen gesteuert, die von anderen Zellen und/oder der unmittelbaren Umgebung erhalten werden. Diese Informationen werden oft mittels sekretierter Polypeptide (beispielsweise mitogener Faktoren, Überlebensfaktoren, zytotoxischer Faktoren, Differenzierungsfaktoren, Neuropeptide und Hormone) übertragen, die ihrerseits von verschiedenen Zellrezeptoren oder membrangebundenen Proteinen empfangen und interpretiert werden. Diese sekretierten Polypeptide oder signalgebenden Moleküle durchwandern normalerweise den zellulären Sekretionsstoffwechselweg, um ihre Wirkungsstelle in der extrazellulären Umgebung zu erreichen.
Für sekretierte Proteine existieren verschiedene gewerbliche Anwendungen, einschließlich pharmazeutischer und diagnostischer Biosensoren und Bioreaktoren. Die meisten zur Zeit verfügbaren Proteinwirkstoffe, wie beispielsweise thrombolytische Mittel, Interferone, Interleukine, Erythropoietine, Koloniewachstum stimulierende Faktoren und verschiedene Cytokine, sind Sekretionsproteine. Ihre Rezeptoren, die Membranproteine sind, haben auch Potenzial als therapeutische oder diagnostische Mittel. Es werden zur Zeit sowohl in der Industrie als auch in der Forschung Anstrengungen unternommen, neue, native sekretierte Proteine zu identifizieren. Zahlreiche Bemühungen konzentrieren sich auf das Screenen von Bibliotheken rekombinanter Säugetier-DNA, um die Kodiersequenzen für neue sekretierte Proteine zu identifizieren. Beispiele für Screening-Verfahren und -Techniken werden in der Literatur be schrieben (siehe beispielsweise Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 7108-7113 (1996); US-Patent Nr. 5.536.637)).
Membrangebundene Proteine und Rezeptoren können wichtige Rollen bei unter anderem der Bildung, Differenzierung und Aufrechterhaltung mehrzelliger Organismen spielen. Die Bestimmung zahlreicher einzelner Zellen, z.B. zu Proliferation, Migration, Differenzierung oder Wechselwirkung mit anderen Zellen, wird typischerweise durch Informationen gesteuert, die von anderen Zellen und/oder der unmittelbaren Umgebung erhalten werden. Diese Informationen werden oft mittels sekretierter Polypeptide (beispielsweise mitogener Faktoren, Überlebensfaktoren, zytotoxischer Faktoren, Differenzierungsfaktoren, Neuropeptide und Hormone) übertragen, die wiederum von verschiedenen Zellrezeptoren oder membrangebundenen Proteinen empfangen und interpretiert werden. Solche membrangebundenen Proteine und Zellrezeptoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Cytokinrezeptoren, Rezeptorkinasen, Rezeptorphosphatasen, Rezeptoren, die in Zell-Zell-Wechselwirkungen eingebunden sind, und zelluläre Adhäsinmoleküle wie Selektine und Integrine. Die Übertragung von Signalen, die Zellwachstum und -differenzierung regulieren, wird teilweise durch Phosphorylierung verschiedener Zellproteine reguliert. Proteintyrosinkinasen, Enzyme, die diesen Vorgang katalysieren, können auch als Wachstumsfaktorrezeptoren wirken. Beispiele umfassen Fibroblastenwachstumsfaktor-Rezeptor und Nervenwachstumsfaktor-Rezeptor.
Membrangebundene Proteine und Rezeptormoleküle haben verschiedene gewerbliche Anwendungen, einschließlich jener als Pharmazeutika und Diagnostika. Rezeptor-Immunadhäsine beispielsweise können als Therapeutika zur Regulierung von Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen verwendet werden. Die membrangebundenen Proteine können auch zum Screenen möglicher Peptid- oder niedermolekularer Inhibitoren der relevanten Rezeptor/Liganden-Wechselwirkung verwendet werden.
Sowohl in der Industrie als auch in der Forschung werden Anstrengungen unternommen, um neue, native rezeptor- oder membrangebundene Proteine zu identifizieren. Zahlreiche Bemühungen konzentrieren sich auf das Screenen von Bibliotheken re kombinanter Säugetier-DNA, um die Kodiersequenzen für neue rezeptor- oder membrangebundenen Proteine zu identifizieren.
PRO1186
Protein A aus dem Gift der Dendroaspis polylepis (schwarze Mamba) umfasst 81 Aminosäuren einschließlich zehn Halb-Cysteinresten. Gifte sind einerseits als Waffen im Krieg von Interesse, andererseits zur Verwendung in Tests, um Mittel zu bestimmen, die Wirkungen des tierischen Gifts oder eines ähnlichen Gifts umkehren oder hemmen. Das Gift der schwarzen Mamba wird in Int. J. Biochem. 17(6), 695-699 (1985), und von Joubert & Styrdom, Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 361(12), 1787-1794 (1980), näher beschrieben.
Die Erfinder beschreiben hierin die Identifikation und Charakterisierung neuer Polypeptide mit Homologie zu Schlangengift-Protein A, hierin bezeichnet als PRO1186-Polypeptide.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
PRO1186
Ein cDNA-Klon (DNA 60621-1516) wurde identifiziert, der für ein neues Polypeptid mit Sequenzidentität mit Gift-Protein A kodiert und in der vorliegenden Anmeldung als "PRO1186" bezeichnet wird.
In einer Ausführungsform, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das DNA umfasst, die für ein PRO1186-Polypeptid kodiert.
In einem Aspekt, wie in den Ansprüchen definiert, umfasst die isolierte Nucleinsäure DNA mit zumindest 80 % Sequenzidentität, vorzugsweise zumindest 85 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 90 % Sequenzidentität, am meisten bevorzugt zumindest 95 % Sequenzidentität mit (a) der DNA-Sequenz aus 1 (Seq.-ID Nr. 3), die für ein PRO1186-Polypeptid mit der Sequenz an Aminosäureresten von 20 bis 105 (Grenzen eingeschlossen) aus 2 (Seq.-ID Nr. 4) kodiert, oder (b) dem Komplement des DNA-Moleküls von (a).
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das die menschliche Protein-cDNA mit der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 203091 (DNA60621-1516) umfasst.
In wiederum einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das (a) DNA, die für ein Polypeptid mit zumindest etwa 80 % Sequenzidentität, vorzugsweise zumindest etwa 85 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Sequenzidentität, am meisten bevorzugt zumindest etwa 95 % Sequenzidentität mit der Sequenz der Aminosäurereste von etwa 20 bis etwa 105 (Grenzen eingeschlossen) aus 2 (Seq.-ID Nr. 4) kodiert, oder (b) das Komplement der DNA aus (a) umfasst.
In einer anderen Ausführungsform, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung isoliertes PRO1186-Polypeptid bereit.
In einem spezifischen Aspekt, wie in den Ansprüchen definiert, stellt die Erfindung isoliertes Nativsequenz-PRO1186-Polypeptid bereit, das in einer Ausführungsform eine Aminosäuresequenz einbindet, die die Reste 20 bis 105 aus 2 (Seq.-ID Nr. 4) umfasst.
In einem anderen Aspekt, wie in den Ansprüchen definiert, betrifft die Erfindung ein isoliertes PRO1186-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz mit zumindest etwa 80 % Sequenzidentität, vorzugsweise zumindest etwa 85 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Sequenzidentität, am meisten bevorzugt zumindest etwa 95 % Sequenzidentität, mit der Sequenz der Aminosäurereste 20 bis etwa 105 (Grenzen eingeschlossen) aus 2 (Seq.-ID Nr. 4) umfasst.
In wiederum einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes PRO1186-Polypeptid, das die Sequenz der Aminosäurereste 20 bis etwa 105 (Grenzen eingeschlossen) aus 2 (Seq.-ID Nr. 4) umfasst.
Zusätzliche Ausführungsformen
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt die Erfindung Vektoren bereit, die DNA umfassen, die für die vorangehend oder nachstehend beschriebenen Polypeptide kodiert. Eine Wirtszelle, die einen dieser Vektoren umfasst, wird auch bereitgestellt. Die Wirtszellen können beispielsweise CHO-Zellen, E. coli oder Hefe sein. Ein Verfahren zur Herstellung eines der vorangehend oder nachstehend beschriebenen Polypeptide wird weiters bereitgestellt und umfasst das Kultivieren von Wirtszellen unter Bedingungen, die zur Expression des gewünschten Polypeptids und zur Gewinnung des gewünschten Polypeptids aus der Zellkultur geeignet sind.
In anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung Moleküle bereit, die jedes beliebige der vorangehend oder nachstehend beschriebenen Polypeptide, fusioniert an ein heterologes Polypeptid oder eine Aminosäuresequenz, umfassen. Ein Beispiel für solch ein chimäres Molekül umfasst jedes beliebige der vorangehend oder nachstehend beschriebenen Polypeptide, fusioniert an eine Epitop-Tag-Sequenz oder eine Fc-Region eines Immunglobulins.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung einen Antikörper bereit, der sich spezifisch an jedes beliebige der vorangehend oder nachstehend beschriebenen Polypeptide bindet. Gegebenenfalls ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper.
In anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein PRO-Polypeptid kodiert.
In anderen Aspekten umfasst das isolierte Nucleinsäuremolekül eine Nucleotidsequenz mit zumindest 80 % Sequenzidentität, vorzugsweise 81 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 82 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 83 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 84 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 85 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 86 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 87 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 88 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 89 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 90 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 91 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 92 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 93 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 94 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 95 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 96 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 97 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 98 % Sequenzidentität und noch bevorzugter zumindest 99 % Sequenzidentität, mit (a) einem DNA-Molekül, das die Kodiersequenz einer PRO-Polypeptid-cDNA voller Länge wie hierin geoffenbart oder die Kodiersequenz eines Pro-Polypeptids voller Länge, dem das Signalpeptid fehlt, wie hierin geoffenbart, aufweist, oder (b) dem Komplement des DNA-Moleküls (a).
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung isoliertes PRO-Polypeptid bereit, für das eine beliebige der hierin zuvor definierten, isolierten Nucleinsäuresequenzen kodiert.
In einem bestimmten Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes PRO-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz mit zumindest 80 % Sequenzidentität, vorzugsweise 81 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 82 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 83 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 84 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 85 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 86 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 87 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 88 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 89 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 90 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 91 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 92 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 93 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 94 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 95 Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 96 % Sequenzidentität, noch bevor zugter zumindest 97 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 98 % Sequenzidentität und noch bevorzugter zumindest 99 % Sequenzidentität, mit einem PRO-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz voller Länge wie hierin geoffenbart oder eine Aminosäuresequenz voller Länge, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin geoffenbart, aufweist, umfasst.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes PRO-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz mit zumindest 80 % Sequenzidentität, vorzugsweise 81 Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 82 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 83 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 84 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 85 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 86 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 87 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 88 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 89 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 90 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 91 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 92 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 93 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 94 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 95 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 96 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 97 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 98 % Sequenzidentität und noch bevorzugter zumindest 99 % Sequenzidentität, mit einer Aminosäuresequenz, für die die bei ATCC hinterlegte menschliche Protein-cDNA kodiert, wie hierin geoffenbart, umfasst.
In einem spezifischen Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes PRO-Polypeptid ohne die N-terminale Signalsequenz und/oder das Anfangs-Methionin bereit, für das eine Nucleotidsequenz kodiert, die für solch eine Aminosäuresequenz wie hierin zuvor beschrieben kodiert. Verfahren zur Herstellung desselben werden ebenfalls hierin beschrieben, worin diese Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle, die einen Vektor umfasst, der das geeignete kodierende Nucleinsäuremolekül umfasst, unter Bedingungen, die zur Expression des PRO-Polypeptids geeignet sind, und die Gewinnung des PRO-Polypeptids aus der Zellkultur umfasst.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 3) einer nativen Sequenz PRO1186 (UNQ60-cDNA), worin Seq.-ID Nr. 3 ein Klon ist, der hierin als "DNA 60621-1516" bezeichnet wird.
2 zeigt die von der in 1 gezeigten Kodiersequenz der Seq.-ID Nr. 3 abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 4).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
I. Definitionen
Die Bezeichnungen "PRO-Polypeptid" und "PRO", wie hierin verwendet und wenn auf sie unmittelbar eine Zahlenbezeichnung folgt, beziehen sich auf verschiedene Polypeptide, worin sich die vollständige Bezeichnung (d.h. PRO/Zahl) auf spezifische Polypeptidsequenzen wie hierin beschrieben bezieht. Die Bezeichnungen "PRO/Zahl-Polypeptid" und "PRO/Zahl", worin für die Bezeichnung "Zahl" eine tatsächliche numerische Bezeichnung wie hierin verwendet eingesetzt wird, umfassen Nativsequenz-Polypeptide und Polypeptidvarianten (die hierin noch näher definiert werden). Die hierin beschriebenen PRO-Polypeptide können aus zahlreichen verschiedenen Quellen, wie beispielsweise aus menschlichen Gewebetypen oder aus einer anderen Quelle, isoliert oder mittels Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt werden.
Ein "Nativsequenz-PRO-Polypeptid" umfasst ein Polypeptid, das dieselbe Aminosäuresequenz wie das entsprechende PRO-Polypeptid, das aus einer natürlichen Quelle stammt, aufweist. Solche Nativsequenz-PRO-Polypeptide können aus der Natur isoliert oder können durch Rekombinations- oder Synthesemittel hergestellt werden. Die Bezeichnung "Nativsequenz-PRO-Polypeptid" umfasst insbesondere natür lich vorkommende, trunkierte oder sekretierte Formen des spezifischen PRO-Polypeptids (z.B. eine Sequenz einer extrazellulären Domäne), natürlich vorkommende Variantenformen (z.B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich vorkommende Allelvarianten des Polypeptids. In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung ist die Nativsequenz PRO1186 eine Volllängen- oder reife Nativsequenz PRO1186, die die Aminosäuren 1 oder 20 bis 105 aus 2 (Seq.-ID Nr. 4) umfasst.
Start- und Stopp-Codons sind in den Figuren fettgedruckt und unterstrichen gezeigt.
"PRO-Polypeptidvariante" bezeichnet ein aktives PRO-Polypeptid, wie vorangehend oder nachstehend definiert, mit zumindest 80 % Sequenzidentität mit der Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz wie hierin geoffenbart oder die Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin geoffenbart. Solche PRO-Polypeptidvarianten umfassen beispielsweise PRO-Polypeptide, in denen ein oder mehrere Aminosäurereste, am N- oder C-Terminus der nativen Volllängen-Aminosäuresequenz, zugesetzt oder deletiert sind. Üblicherweise weist eine PRO-Polypeptidvariante zumindest 80 % Aminosäuresequenz-Identität, vorzugsweise zumindest 81 % Aminosäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 82 % Aminosäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 83 % Aminosäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 84 % Aminosäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 85 % Aminosäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 86 % Aminosäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 87 % Aminosäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 88 % Aminosäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 89 % Aminosäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 90 % Aminosäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 91 % Aminosäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 92 % Aminosäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 93 % Aminosäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 94 % Aminosäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 95 % Aminosäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 96 % Aminosäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 97 % Aminosäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 98 % Aminosäuresequenz-Identität und noch bevorzugter zumindest 99 % Aminosäuresequenz- Identität mit der Aminosäuresequenz der nativen Volllängen-Aminosäuresequenz wie hierin geoffenbart auf. Üblicherweise weisen variable PRO-Polypeptide zumindest eine Länge von 70 Aminosäuren, häufiger zumindest von 80 Aminosäuren, noch häufiger zumindest von 90 Aminosäuren, noch häufiger zumindest von 100 Aminosäuren auf.
"Prozentuelle (%) Aminosäuresequenz-Identität" in Bezug auf die hierin identifizierten PRO-Polypeptidsequenzen ist definiert als der Prozentsatz an Aminosäureresten in einer Kandidaten-Sequenz, die mit den Aminosäureresten in der spezifischen PRO-Polypeptidsequenz, nach Abgleichen der Sequenzen und Einführen von Gaps, sofern erforderlich, um die maximale prozentuelle Sequenzidentität zu erlangen; und ohne Berücksichtigung jeglicher konservativer Substitutionen als Teil der Sequenzidentität, identisch sind. Abgleich zu Zwecken der Bestimmung der prozentuellen Aminosäuresequenz-Identität kann auf verschiedene Weisen erreicht werden, die Fachleuten bekannt sind, beispielsweise unter Verwendung von öffentlich zugänglicher Computer-Software wie der BLAST-, BLAST-2-, ALIGN- oder Megalign- (DNA-STAR) Software. Fachleute können geeignete Parameter zur Messung des Abgleichs bestimmen, einschließlich jeglicher Algorithmen, die erforderlich sind, um maximalen Abgleich über die volle Länge der zu vergleichenden Sequenzen zu erzielen. Für die Zwecke hierin jedoch werden %-Aminosäuresequenz-Identitätswerte unter Verwendung des WU-BLAST-2-Computerprogramms (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996)) berechnet. Die meisten der WU-BLAST-2-Suchparameter sind auf Standardwerte eingestellt. Jene, die nicht auf Standardwerte eingestellt sind, d.h. einstellbare Parameter, werden mit den folgenden Werten eingestellt: "overlap span" = 1, "overlap fraction" = 0,125, "word threshold (T)" = 11 und "scoring matrix" = BLOSUM 62. Für die vorliegenden Zwecke wird ein %-Aminosäuresequenz-Identitätswert mittels Dividieren (a) der Anzahl an übereinstimmenden identischen Aminosäureresten zwischen der vom nativen PRO-Polypeptid abgeleiteten Aminosäuresequenz des PRO-Polypeptids von Interesse, und der Vergleichs-Aminosäuresequenz von Interesse (d.h. der Sequenz, mit der das PRO-Polypeptid von Interesse verglichen wird, die eine PRO-Polypeptidvariante sein kann), wie sie durch WU-BLAST-2 bestimmt wird, durch (b) die Gesamtzahl an Aminosäureresten des PRO-Polypeptids von Interesse bestimmt.
"PRO-Polynucleotid-Variante" oder "PRO-Nucleinsäuresequenz-Variante" bezeichnet ein Nucleinsäuremolekül, das für ein aktives PRO-Polypeptid wie nachstehend definiert kodiert und das zumindest 80 % Nucleinsäuresequenz-Identität mit einer Nucleinsäuresequenz aufweist, die für eine Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz wie hierin geoffenbart oder eine Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz, der das Signalpeptid wie hierin geoffenbart fehlt, kodiert. Üblicherweise weist eine PRO-Polynucleotid-Variante zumindest 80 % Nucleinsäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 81 % Nucleinsäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 82 % Nucleinsäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 83 % Nucleinsäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 84 % Nucleinsäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 85 % Nucleinsäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 86 % Nucleinsäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 87 % Nucleinsäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 88 % Nucleinsäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 89 % Nucleinsäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 90 % Nucleinsäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 91 % Nucleinsäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 92 % Nucleinsäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 93 % Nucleinsäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 94 % Nucleinsäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 95 % Nucleinsäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 96 % Nucleinsäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 97 % Nucleinsäuresequenz-Identität, noch bevorzugter zumindest 98 % Nucleinsäuresequenz-Identität und noch bevorzugter zumindest 99 % Nucleinsäuresequenz-Identität mit der Nucleinsäuresequenz auf, die für die Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz wie hierin geoffenbart oder die Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptidsequenz, der das Signalpeptid fehlt, wie hierin geoffenbart, kodiert. Varianten umfassen nicht die native Nucleotidsequenz.
Üblicherweise sind PRO-Polynucleotid-Varianten zumindest 210 Nucleotide, häufiger zumindest 240 Nucleotide, noch häufiger zumindest 270 Nucleotide, noch häufiger zumindest 300 Nucleotide, lang.
"Prozentuelle (%) Nucleinsäuresequenz-Identität" in Bezug auf die hierin identifizierten, kodierenden PRO-Nucleinsäuresequenzen ist definiert als der Prozentsatz an Nucleotiden in einer Kandidaten-Sequenz, die mit den Nucleotiden in der PRO-Nucleinsäuresequenz von Interesse, nach Abgleichen der Sequenzen und Einführen von Gaps, sofern erforderlich, um die maximale prozentuelle Sequenzidentität zu erzielen, identisch sind. Abgleich zu Zwecken der Bestimmung der prozentuellen Nucleinsäuresequenz-Identität kann auf verschiedene Weisen erreicht werden, die Fachleuten bekannt sind, beispielsweise unter Verwendung von öffentlich zugänglicher Computer-Software wie der BLAST-, BLAST-2-, ALIGN- oder Megalign- (DNA-STAR) Software. Für die Zwecke hierin jedoch werden %-Nucleinsäuresequenz-Identitätswerte unter Verwendung des WU-BLAST-2-Computerprogramms (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996)) berechnet. Die meisten der WU-BLAST-2-Suchparameter sind auf Standardwerte eingestellt. Jene, die nicht auf Standardwerte eingestellt sind, d.h. einstellbare Parameter, werden mit den folgenden Werten eingestellt: "overlap span" = 1, "overlap fraction" = 0,125, "word threshold (T)" = 11 und "scoring matrix" = BLOSUM62. Für die vorliegenden Zwecke wird ein %-Nucleinsäuresequenz-Identitätswert mittels Dividieren (a) der Anzahl an übereinstimmenden identischen Nucleotide zwischen der Nucleinsäuresequenz des für PRO-Polypeptid kodierenden Nucleinsäuremoleküls von Interesse mit einer Sequenz, die von der für Nativsequenz-PRO-Polypeptid kodierenden Nucleinsäure abgeleitet ist, und dem Vergleichs-Nucleinsäuremolekül von Interesse (d.h. der Sequenz, mit der das für PRO-Polypeptid kodierende Nucleinsäuremolekül von Interesse verglichen wird, die eine PRO-Polypeptidvariante sein kann), wie sie durch WU-BLAST-2 bestimmt wird, durch (b) die Gesamtzahl an Nucleotiden des für PRO-Polypeptid kodierenden Nucleinsäuremoleküls von Interesse bestimmt.
In anderen Ausführungsformen sind PRO-Polynucleotid-Varianten Nucleinsäuremoleküle, die für ein aktives PRO-Polypeptid kodieren und die in der Lage sind, vor zugsweise unter stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen an Nucleotidsequenzen zu hybridisieren, die für ein PRO-Polypeptid voller Länge wie hierin geoffenbart kodieren. PRO-Polypeptid-Varianten können jene sein, für die eine PRO-Polynucleotid-Variante kodiert.
"Isoliert", sofern verwendet, um die verschiedenen, hierin geoffenbarten Polypeptide zu beschreiben, beschreibt ein Polypeptid, das aus einer Komponente aus seiner natürlichen Umgebung identifiziert und getrennt und/oder gewonnen wurde. Verunreinigende Komponenten aus seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die typischerweise diagnostische oder therapeutische Verwendungen für das Polypeptid stören, und können Enzyme, Hormone und andere proteinhältige und nichtproteinhältige gelöste Stoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Polypeptid (1) bis zu einem Grad gereinigt, der ausreichend ist, um zumindest 15 Reste von N-terminaler oder innerer Aminosäuresequenz unter Verwendung eines Drehbechersequenzierers zu erhalten, oder (2) bis zur Homogenität durch SDS-PAGE unter nichtreduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassieblau- oder, vorzugsweise, Silberfärbung gereinigt. Isoliertes Polypeptid umfasst auch Polypeptid in situ innerhalb rekombinanter Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des PRO-Polypeptids nicht vorhanden ist. Üblicherweise wird das Polypeptid jedoch mittels zumindest eines Reinigungsschrittes erhalten.
Eine "isolierte", für PRO-Polypeptid kodierende Nucleinsäure ist ein Nucleinsäuremolekül, das identifiziert und von zumindest einem verunreinigenden Nucleinsäuremolekül getrennt wurde, mit dem es gewöhnlich in der natürlichen Quelle der PRO-Polypeptid-Nucleinsäure assoziiert ist. Ein isoliertes PRO-Polypeptid-Nucleinsäuremolekül unterscheidet sich in Form oder Ausstattung von jenem, wie es in der Natur zu finden ist. Isolierte PRO-Polypeptid-Nucleinsäuremoleküle unterscheiden sich daher von dem spezifischen PRO-Polypeptid-Nucleinsäuremolekül, wie es in natürlichen Zellen vorliegt. Dennoch umfasst ein isoliertes PRO-Polypeptid-Nucleinsäuremolekül auch PRO-Polypeptid-Nucleinsäuremoleküle, die in Zellen enthalten sind, die üblicherweise das PRO-Polypeptid exprimieren, wenn beispielsweise das Nu cleinsäuremolekül an einer chromosomalen Position liegt, die sich von jener der natürlichen Zellen unterscheidet.
Die Bezeichnung "Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die für die Expression einer operabel gebundenen Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen, die für Prokaryoten geeignet sind, umfassen beispielsweise einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz und eine Ribosom-Bindungsstelle. Eukaryotische Zellen sind dafür bekannt, Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer zu verwenden.
Nucleinsäure ist "operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gesetzt wird. DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader ist beispielsweise operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosom-Bindungsstelle ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn sie so angeordnet ist, dass sie Translation erleichtert. Im Allgemeinen bedeutet "operabel gebunden", dass die zu verbindenden DNA-Sequenzen zusammenhängend und, im Fall eines Sekretionsleaders, zusammenhängend und in Lesephase sind. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Bindung erfolgt durch Ligation an passenden Restriktionsschnittstellen. Sind solche Stellen nicht vorhanden, so werden die synthetischen Oligonucleotid-Adaptoren oder -Linker gemäß der herkömmlichen Praxis verwendet.
Die Bezeichnung "Antikörper" wird im weitesten Sinn verwendet und umfasst insbesondere beispielsweise einzelne monoklonale Anti-PRO-Antikörper (einschließlich Agonisten-, Antagonisten- und neutralisierende Antikörper), Anti-PRO-Antikörper-Zusammensetzungen mit Polyepitopspezifität, einkettige Anti-PRO-Antikörper und Fragmente von Anti-PRO-Antikörpern (siehe unten). Die Bezeichnung "monoklonaler Antikörper" wie hierin verwendet bezieht sich auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern gewonnen ist, d.h., dass die einzelnen, die Population bildenden Antikörper bis auf mögliche, natürlich vorkommende Mutationen, die in geringem Ausmaß vorhanden sein können, identisch sind.
Die "Stringenz" von Hybridisierungsreaktionen kann von Fachleuten leicht bestimmt werden und beruht im Allgemeinen auf einer empirischen Berechnung, die von der Sondenlänge, der Waschtemperatur und der Salzkonzentration abhängt. Im Allgemeinen erfordern längere Sonden höhere Temperaturen für korrekte Anellierung, während kürzere Sonden niedrigere Temperaturen benötigen. Hybridisierung hängt im Allgemeinen von der Fähigkeit denaturierter DNA ab, neuerlich zu anellieren, wenn komplementäre Stränge in einer Umgebung unter ihrer Schmelztemperatur vorhanden sind. Je höher der Grad an gewünschter Homologie zwischen der Sonde und der hybridisierbaren Sequenz ist, desto höher ist die relative Temperatur, die verwendet werden kann. Daraus folgt, dass höhere relative Temperaturen dazu neigen würden, die Reaktionsbedingungen stringenter zu gestalten, während niedrigere Temperaturen diese Neigung weniger zeigen. Weitere Details und Erklärungen zu Stringenz von Hybridisierungsreaktionen sind in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995), zu finden.
"Stringente Bedingungen" oder "hochstringente Bedingungen" wie hierin definiert können als jene identifiziert werden, die: (1) geringe Ionenstärke und hohe Waschtemperatur verwenden, beispielsweise 0,015 M Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1 % Natriumdodecylsulfat bei 50 °C; (2) während der Hybridisierung ein Denaturierungsmittel wie Formamid, beispielsweise 50 Vol.-% Formamid mit 0,1 % Rinderserumalbumin/0,1 % Ficoll/0,1 % Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42 °C, verwenden; oder (3) 50 % Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1 % Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt-Lösung, beschallte Lachssperma-DNA (50 μg/ml), 0,1 % SDS und 10 % Dextransulfat bei 42 °C verwenden, mit Waschschritten bei 42 °C in 0,2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50 % Formamid bei 55 °C, gefolgt von einem hochstringenten Waschschritt, bestehend aus 0,1 × SSC, das EDTA enthält, bei 55 °C.
"Mäßig stringente Bedingungen" können wie in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press (1989), beschrieben identifiziert werden und umfassen die Verwendung von Waschlösung und Hybridisierungsbedingungen (z.B. Temperatur, Ionenstärke und %SDS), die weniger stringent sind als jene, die zuvor beschrieben wurden. Ein Beispiel für mäßig stringente Bedingungen ist Übernacht-Inkubation bei 37 °C in einer Lösung, die 20 % Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10 % Dextransulfat und 20 mg/ml denaturiert gescherte Lachssperma-DNA umfasst, gefolgt von Waschen der Filter in 1 × SSC bei etwa 37-50 °C. Fachleute werden erkennen, wie Temperatur, Ionenstärke usw. nach Bedarf einzustellen sind, um Faktoren wie z.B. Sondenlänge und dergleichen anzupassen.
Die Bezeichnung "Epitop-markiert" wie hierin verwendet bezieht sich auf ein chimäres Polypeptid, das ein PRO-Polypeptid, fusioniert an ein "Tag-Polypeptid", umfasst. Das Tag-Polypeptid weist genug Reste auf, um ein Epitop, gegen das ein Antikörper gebildet werden kann, bereitzustellen, ist jedoch auch kurz genug, sodass es die Aktivität des Polypeptids, an das es fusioniert ist, nicht stört. Das Tag-Polypeptid ist vorzugsweise auch durchwegs einmalig, sodass der Antikörper nicht nennenswert mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete Tag-Polypeptide weisen im Allgemeinen zumindest sechs Aminosäurereste und üblicherweise zwischen etwa 8 und 50 Aminosäurereste (vorzugsweise zwischen 10 und 20 Aminosäurereste) auf.
Wie hierin verwendet bezeichnet die Bezeichnung "Immunoadhäsin" Antikörper-ähnliche Moleküle, die die Bindungsspezifität eines heterologen Proteins (eines "Adhäsins") mit den Effektorfunktionen von konstanten Immunglobulindomänen kombinieren. Strukturell gesehen umfassen die Immunoadhäsine eine Fusion einer Aminosäuresequenz mit der gewünschten Bindungsspezifität, die sich von jener der Antigen-Erkennungs- und -Bindungsstelle eines Antikörpers unterscheidet (d.h., "heterolog" ist), und einer konstanten Immunglobulindomänensequenz. Der Adhäsin-Teil eines Immunoadhäsinmoleküls ist typischerweise eine zusammenhängende Aminosäuresequenz, die zumindest die Bindungsstelle eines Rezeptors oder eines Liganden umfasst. Die konstante Immunglobulindomänensequenz im Immunoadhäsin kann aus jedem beliebigen Immunglobulin, wie z.B. IgG-1-, IgG-2-, IgG-3- oder IgG-4-Subtypen, IgA (einschließlich IgA-1 und IgA-2), IgE, IgD oder IgM, gewonnen werden.
"Aktiv" oder "Aktivität" für die vorliegenden Zwecke bezieht sich auf Form(en) eines PRO-Polypeptids, die eine biologische und/oder immunologische Aktivität von nativem oder natürlich vorkommendem PRO beibehalten, worin sich "biologische" Aktivität auf eine biologische Funktion (entweder Inhibitions- oder Stimulationsfunktion), hervorgerufen durch ein natives oder natürlich vorkommendes PRO, die nicht die Fähigkeit ist, die Produktion eines Antikörpers gegen ein antigenes Epitop zu induzieren, über die ein natives oder natürlich vorkommendes PRO verfügt, und eine "immunologische" Aktivität bezieht sich auf die Fähigkeit, die Produktion eines Antikörpers gegen ein antigenes Epitop zu induzieren, über die ein natives oder natürlich vorkommendes PRO verfügt.
Die Bezeichnung "Antagonist" wird im weitesten Sinn verwendet und umfasst jedes beliebige Molekül, das eine biologische Aktivität eines hierin geoffenbarten, nativen PRO-Polypeptids teilweise oder vollständig blockiert, inhibiert oder neutralisiert. Auf eine ähnliche Weise wird die Bezeichnung "Agonist" im weitesten Sinn verwendet und umfasst jedes beliebige Molekül, das eine biologische Aktivität eines hierin geoffenbarten, nativen PRO-Polypeptids nachahmt. Geeignete Agonisten- oder Antagonisten-Moleküle umfassen spezifisch Agonisten- oder Antagonisten-Antikörper oder Antikörperfragmente, Fragmente oder Aminosäuresequenz-Varianten von nativem PRO-Polypeptid, Peptide, kleine organische Moleküle usw. Verfahren zur Identifikation von Agonisten oder Antagonisten von einem PRO-Polypeptid können das Kontaktieren eines PRO-Polypeptids mit einem Kandidaten-Agonisten- oder -Antagonisten-Molekül und das Messen einer nachweisbaren Veränderung einer oder mehrerer biologischer Aktivitäten, die normalerweise mit dem PRO-Polypeptid assoziiert werden, umfassen.
"Behandlung" bezieht sich sowohl auf therapeutische Behandlung als auch prophylaktische oder präventive Maßnahmen, worin das Ziel ist, das pathologische Leiden oder die pathologische Störung, auf das bzw. die abgezielt wird, zu unterbinden oder zu verlangsamen (abzuschwächen). Jene, die einer Behandlung bedürfen, umfassen jene, die bereits erkrankt sind, wie auch jene, die geneigt sind, diese Störung zu entwickeln, oder jene, bei denen es die Störung zu unterbinden gilt.
"Chronische" Verabreichung bezieht sich auf die Verabreichung des Agens/der Agenzien auf kontinuierliche Weise im Gegensatz zur akuten Verabreichung, um die anfängliche therapeutische Wirkung (Aktivität) innerhalb einer längeren Zeitspanne aufrechtzuerhalten. "Aussetzende" Verabreichung ist eine Behandlung, die nicht kontinuierlich ohne Unterbrechung erfolgt, sondern eher zyklisch organisiert ist.
"Säugetier" für die Zwecke der Behandlung bezieht sich auf jegliches Tier, das als ein Säugetier klassifiziert ist, einschließlich Menschen, Haus- und Zuchttiere und Zoo-, Sport- oder Kleintiere, wie z.B. Hunde, Katzen, Rinder, Pferde, Schafe, Schweine, Ziegen, Kaninchen usw. Vorzugsweise ist das Säugetier ein Mensch.
Verabreichung "in Kombination mit" einem oder mehreren therapeutischen Mitteln umfasst gleichzeitige (parallele) und aufeinanderfolgende Verabreichung in jeder beliebigen Reihenfolge.
"Träger" wie hierin verwendet umfassen pharmazeutisch annehmbare Träger, Arzneimittelträger oder Stabilisatoren, die gegenüber der Zelle oder dem Säugetier, das dieser Substanz ausgesetzt wird, bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch sind. Häufig ist der physiologisch annehmbare Träger eine wässrige, pH-gepufferte Lösung. Beispiele für physiologisch annehmbare Träger umfassen Puffer wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidanzien einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulare Polypeptide (mit weniger als 10 Resten); Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie z.B. Na trium; und/oder nichtionische Tenside wie z.B. TWEEN^TM, Polyethylenglykol (PEG) und PLURONICS^TM.
"Antikörperfragmente" umfassen einen Teil eines intakten Antikörpers, vorzugsweise der Antigen-Bindungs- oder variablen Region des intakten Antikörpers. Beispiele für Antikörperfragmente umfassen Fab, Fab', F(ab')₂ und Fv-Fragmente; Diabodies, unverzweigte Diabodies (Zapta et al., Protein Eng. 8(10), 1057-1062 (1995)); einkettige Antikörpermoleküle; und multispezifische Antikörper, gebildet aus Antikörperfragmenten.
Papain-Verdau von Antikörpern bringt zwei identische Antigen-Bindungsfragmente, die als "Fab"-Fragmente bezeichnet werden, jedes mit einer einzelnen Antigen-Bindungsstelle, und ein restliches "Fc"-Fragment hervor, eine Bezeichnung, die die Fähigkeit, leicht zu kristallisieren, anzeigt. Pepsinbehandlung ergibt ein F(ab')₂-Fragment, das zwei Antigen-Kombinationsstellen aufweist und stets zur Vernetzung von Antigen in der Lage ist.
"Fv" ist das minimale Antikörperfragment, das eine vollständige Antigen-Erkennungs- und -Bindungsstelle aufweist. Diese Region besteht aus einem Dimer aus einer variablen Schwerketten- und einer variablen Leichtkettendomäne in enger, nichtkovalenter Verbindung. In dieser Konfiguration wechselwirken die drei CDRs jeder variablen Domäne, um eine Antigen-Bindungsstelle an der Oberfläche des VH-VL-Dimers zu definieren. Zusammen verleihen die sechs CDRs dem Antikörper Antigen-Bindungsspezifität. Jede einzelne variable Domäne (oder Hälfte eines Fv, die nur drei für ein Antigen spezifische CDRs aufweist) verfügt jedoch über die Fähigkeit, Antigen zu erkennen und zu binden, wenn auch mit einer geringeren Affinität als die vollständige Bindungsstelle.
Das Fab-Fragment enthält auch die konstante Domäne der Leichtkette und die erste konstante Domäne (CH1) der Schwerkette. Fab-Fragmente unterscheiden sich von Fab'-Fragmenten durch den Zusatz einiger weniger Reste am Carboxy-Terminus der Schwerketten-CH1-Domäne, einschließlich eines oder mehrerer Cysteine aus der Antikörper-Gelenksregion. Fab'-SH ist hierin die Bezeichnung für Fab', in dem der/die Cysteinrest(e) der konstanten Domänen eine freie Thiolgruppe trägt/tragen. F(ab')₂-Antikörperfragmente wurden ursprünglich als Paare von Fab'-Fragmenten gebildet, die Gelenkcysteine zwischen sich aufweisen. Andere chemische Bindungen von Antikörperfragmenten sind auch bekannt.
Die "Leichtketten" von Antikörpern (Immunglobuline) aus jeder beliebigen Wirbeltierspezies können auf Grundlage der Aminosäuresequenzen ihrer konstanten Domänen einem von zwei eindeutig unterschiedlichen Typen zugeordnet werden, die als kappa und lambda bezeichnet werden.
Je nach der Aminosäuresequenz der konstanten Domäne ihrer Schwerketten können Immunglobuline unterschiedlichen Klassen zugeordnet werden. Es gibt fünf Hauptklassen von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und mehrere davon können weiter in Unterklassen (Isotypen) aufgeteilt werden, z.B. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA und IgA2.
"Einkettige Fv"- oder "sFv"-Antikörperfragmente umfassen die VH- und VL-Domänen von Antikörper, worin diese Domänen in einer einzigen Polypeptidkette vorhanden sind. Vorzugsweise umfasst das Fv-Polypeptid weiters einen Polypeptidlinker zwischen den VH- und VL-Domänen, der es ermöglicht, dass sFv die gewünschte Struktur für Antigenbindung bildet. Ein Überblick zu sFv ist in Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Bd. 113, Rosenburg & Moore (Hrsg.), Springer-Verlag, New York, S. 269-315 (1994), zu finden.
Die Bezeichnung "Diabodies" bezieht sich auf kleine Antikörperfragmente mit zwei Antigen-Bindungsstellen, worin diese Fragmente eine variable Schwerketten-Domäne (VH), verbunden mit einer variablen Leichtketten-Domäne (VL) in derselben Polypeptidkette (VH-VL) umfassen. Durch die Verwendung eines Linkers, der zu kurz ist, um Paarungsbildung zwischen den zwei Domänen an derselben Kette zu ermöglichen, werden die Domänen gezwungen, sich mit den komplementären Domänen einer anderen Kette zu paaren und zwei Antigen-Bindungsstellen zu bilden. Diabo dies werden noch ausführlicher beispielsweise in der EP 404.097 ; der WO 93/11161; und in Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448 (1993), beschrieben.
Ein "isolierter" Antikörper ist einer, der aus einer Komponente aus seiner natürlichen Umgebung identifiziert und getrennt und/oder gewonnen wurde. Verunreinigende Komponenten aus seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die diagnostische oder therapeutische Verwendungen für das Polypeptid stören würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinhältige und nichtproteinhältige gelöste Stoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Polypeptid (1) zu mehr als 95 Gew.-% von Antikörper, bestimmt durch das Lowry-Verfahren, und am meisten bevorzugt zu mehr als 99 Gew.-%, gereinigt, (2) zu einem Grad gereinigt, der ausreichend ist, um zumindest 15 Reste von N-terminaler oder innerer Aminosäuresequenz unter Verwendung eines Drehbechersequenzierers zu erhalten, oder (2) bis zur Homogenität durch SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassieblau- oder, vorzugsweise, Silberfärbung gereinigt. Isolierter Antikörper umfasst den Antikörper in situ innerhalb rekombinanter Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des Antikörpers nicht vorhanden ist. Üblicherweise wird isolierter Antikörper jedoch mittels zumindest eines Reinigungsschritts gebildet.
Die Bezeichnung "Markierung" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine nachweisbare Verbindung oder Zusammensetzung, die direkt oder indirekt an den Antikörper konjugiert ist, um einen "markierten" Antikörper zu bilden. Die Markierung kann durch sich selbst nachweisbar sein (z.B. Radioisotopen-Markierung oder Fluoreszenzmarkierung) oder kann, im Fall einer enzymatischen Markierung, eine chemische Veränderung einer Substratverbindung oder -zusammensetzung, die nachweisbar ist, katalysieren.
Unter "Festphase" wird eine nicht-wässrige Matrix verstanden, an die der Antikörper der vorliegenden Erfindung anhaften kann. Beispiele für Festphasen, die in dieser Definition enthalten sind, umfassen jene, die teilweise oder vollständig aus Glas (z.B.
Controlled Pore Glass), Polysacchariden (z.B. Agarose), Polyacrylamiden, Polystyrol, Polyvinylalkohol und Siliconen gebildet sind. In bestimmten Ausführungsformen, je nach Zusammenhang, kann die Festphase den Well einer Testplatte umfassen; in anderen Ausführungsformen ist sie eine Reinigungssäule (z.B. eine Affinitätschromatographiesäule). Diese Bezeichnung umfasst auch eine diskontinuierliche Festphase einzelner Teilchen, wie beispielsweise jene, die im US-Patent Nr. 4.275.149 beschrieben wird.
Ein "Liposom" ist ein kleines Vehikel, zusammengesetzt aus verschiedenen Typen von Lipiden, Phospholipiden und/oder Tensid, die bzw. das zur Zufuhr eines Wirkstoffs (wie beispielsweise eines PRO-Polypeptids oder eines Antikörpers hiergegen) zu einem Säugetier nützlich sind bzw. ist. Die Komponenten des Liposoms sind üblicherweise in einer Doppelschichtkonformation angeordnet, ähnlich wie in der Lipidanordnung biologischer Membranen.
Ein "kleines Molekül" ist hierin definiert als eines, das ein Molekulargewicht von unter etwa 500 Da aufweist.
II. Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt neu identifizierte und isolierte Nucleotidsequenzen bereit, die für Polypeptide kodieren, die in der vorliegenden Anmeldung als PRO-Polypeptide bezeichnet werden. Insbesondere wurden cDNAs, die für verschiedene PRO-Polypeptide kodieren, identifiziert und isoliert, wie in den nachstehenden Beispielen noch näher beschrieben wird. Es gilt anzumerken, dass Proteinen, die in getrennten Expressionsdurchgängen gebildet wurden, unterschiedliche PRO-Zahlen zugeteilt wurden, doch die UNQ-Zahl ist für jede gegebene DNA und das kodierte Protein einmalig und wird nicht verändert. Zur einfachen Gestaltung werden in der vorliegenden Beschreibung nun das Protein, für das die hierin geoffenbarten Volllängen-Nativsequenz-Nucleinsäuremoleküle kodieren, sowie alle weiteren nativen Homologe und Varianten, die unter die obige Definition von PRO fallen, unabhängig von ihrem Ursprung oder Herstellungsweise als "PRO/Zahl" bezeichnet.
Wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben, wurden verschiedene cDNA-Klone bei der ATCC hinterlegt. Die tatsächlichen Nucleotidsequenzen dieser Klone können von Fachleuten leicht durch Sequenzieren des hinterlegten Klons unter Verwendung von Routineverfahren nach dem Stand der Technik bestimmt werden. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz kann aus der Nucleotidsequenz unter Einsatz von Fachwissen bestimmt werden. Für die hierin beschriebenen PRO-Polypeptide und kodierenden Nucleinsäuren haben die Anmelder das identifiziert, was unter Nutzung der zur Zeit verfügbaren Sequenzinformation als der am besten identifizierbare Leseraster angesehen wird.
PRO1186-Polypeptide voller Länge
Die vorliegende Erfindung stellt neu identifizierte und isolierte Nucleotidsequenzen bereit, die für Polypeptide kodieren, die in der vorliegenden Erfindung als PRO1186 bezeichnet werden. Insbesondere wurde cDNA, die für ein PRO1186-Polypeptid kodiert, identifiziert und isoliert, wie in den nachstehenden Beispielen noch ausführlicher geoffenbart wird.
Unter Verwendung des Sequenzabgleich-Computerprogramms WU-BLAST2 wurde erkannt, dass ein Volllängen-Nativsequenz-PRO1186 (gezeigt in 2 und Seq.-ID Nr. 4) Aminosäuresequenz-Identität mit Gift-Protein A aus Dendroaspis-polylepispolylepis-Gift aufweist. Demgemäß wird nun angenommen, dass das in der vorliegenden Anmeldung geoffenbarte PRO1186 ein neu identifiziertes Element von Gift-Protein A ist und damit einen verwandten Mechanismus aufweisen kann.
B. PRO-Varianten
Zusätzlich zu den hierin beschriebenen Volllängen-Nativsequenz-PRO-Polypeptiden wird erwogen, dass PRO-Varianten hergestellt werden können. PRO-Varianten können durch Einführen geeigneter Nucleotidänderungen in die PRO-DNA und/oder durch Synthese des gewünschten PRO-Polypeptids hergestellt werden. Fachleuten wird bekannt sein, dass Aminosäureänderungen posttranslationale Prozesse des PRO verändern können, wie beispielsweise die Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen ändern oder die Membranverankerungs-Eigenschaften verändern können.
Variationen im nativen Volllängensequenz-PRO oder in verschiedenen Domänen des hierin beschriebenen PRO können unter Verwendung der Verfahren und Leitlinien für konservative und nicht-konservative Mutationen, die beispielsweise im US-Patent Nr. 5.364.934 erläutert werden, gebildet werden. Variationen können eine Substitution, Deletion oder Insertion von einem oder mehreren Codons, die für das PRO kodieren, sein, was zu einer Änderung der Aminosäuresequenz des PRO im Vergleich mit dem PRO nativer Sequenz führt. Gegebenenfalls erfolgt die Variation durch Substitution von zumindest einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure in einer oder mehreren der Domänen des PRO. Anhaltspunkte zur Bestimmung, welcher Aminosäurerest insertiert, substituiert oder deletiert werden kann, ohne die gewünschte Aktivität negativ zu beeinflussen, können durch Vergleichen der Sequenz des PRO mit jener bekannter, homologer Proteinmoleküle und durch Minimieren der Anzahl an Aminosäuresequenz-Änderungen, die in Regionen hoher Homologie vorgenommen werden, gefunden werden. Aminosäuresubstitutionen können das Resultat der Ersetzung einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften, wie beispielsweise der Ersetzung eines Leucins durch ein Serin, d.h. das Resultat konservativer Aminosäureersetzungen, sein. Insertionen oder Deletionen können gegebenenfalls im Bereich von etwa 1 bis 5 Aminosäuren liegen. Die ermöglichte Variation kann durch systematisches Bilden von Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in der Sequenz und Testen der resultierenden Varianten auf Aktivität, die die Volllängen- oder reife native Sequenz aufweist, bestimmt werden.
PRO-Polypeptidfragmente werden hierin bereitgestellt. Solche Fragmente können am N-Terminus oder C-Terminus trunkiert sein, oder es können ihnen innere Reste, beispielsweise im Vergleich mit einem nativen Protein voller Länge, fehlen. Bestimmten Fragmenten fehlen Aminsäurereste, die für eine gewünschte biologische Aktivität des PRO-Polypeptids nicht wesentlich sind.
PRO-Fragmente können durch jedes beliebige von zahlreichen herkömmlichen Verfahren hergestellt werden. gewünschte Peptidfragmente können chemisch synthetisiert werden. Ein alternativer Ansatz umfasst die Bildung von PRO-Fragmenten durch Enzymverdau, z.B. durch Behandeln des Proteins mit einem Enzym, das dafür bekannt ist, Proteine an Stellen zu spalten, die durch bestimmte Aminosäurereste identifiziert werden, oder durch Verdauen der DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen und Isolieren des gewünschten Fragments. Wiederum ein anderes, geeignetes Verfahren umfasst das Isolieren und Amplifizieren eines DNA-Fragments, das für ein gewünschtes Polypeptidfragment kodiert, durch Polymerasekettenreaktion (PCR). Oligonucleotide, die die gewünschten Termini des DNA-Fragments definieren, werden an den 5'- und 3'-Primern in der PCR verwendet. Vorzugsweise haben PRO-Polypeptidfragmente zumindest eine biologische und/oder immunologische Aktivität mit dem hierin geoffenbarten, nativen PRO-Polypeptid gemein.
In bestimmten Ausführungsformen sind konservative Substitutionen von Interesse in Tabelle I unter der Überschrift "Bevorzugte Substitutionen" gezeigt. Resultieren solche Substitutionen in einer Änderung der biologischen Aktivität, so werden wesentlichere Änderungen, die in Tabelle I als "Beispielhafte Substitutionen" bezeichnet sind, oder wie nachstehend in Bezug auf Aminosäureklassen noch näher beschrieben wird, eingeführt und die Produkte werden gescreent. Tabelle I
Wesentliche Modifikationen bezüglich Funktion oder immunologischer Identität des PRO-Polypeptids werden durch Auswählen von Substitutionen vorgenommen, die sich in ihrer Wirkung zur Aufrechterhaltung (a) der Struktur der Polypeptid-Hauptkette im Bereich der Substitution, beispielsweise als Faltblatt- oder Helixkonformation, (b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Targetstelle oder (c) des Hauptteils der Seitenkette signifikant unterscheiden. Natürlich vorkommende Reste werden in Gruppen unterteilt, die auf Grundlage gemeinsamer Seitenketten-Eigenschaften definiert sind:

(1) hydrophob: Norleucin, met, ala, val, leu, ile;
(2) neutral hydrophil: cys, ser, thr;
(3) sauer: asp, glu;
(4) basisch: asn, gln, his, lys, arg;
(5) Reste, die Kettenausrichtung beeinflussen: gly, pro; und
(6) aromatisch: trp, tyr, phe.

Nichtkonservative Substitutionen bedingen das Austauschen eines Elements einer dieser Klassen gegen eine andere Klasse. Solche substituierten Reste können auch in die konservativen Substitutionsstellen oder, noch bevorzugter, in die verbleibenden (nicht konservierten) Stellen eingeführt werden.
Die Variationen können unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren, wie beispielsweise Oligonucleotid-vermittelte (ortsgerichtete) Mutagenese, Alanin-Scanning und PCR-Mutagenese, vorgenommen werden. Ortsgerichtete Mutagenese (Carter et al., Nucl. Acids. Res. 13, 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10, 6487 (1987)), Kassetten-Mutagenese (Wells et al., Gene 34, 315 (1985)), Restriktionsselektions-Mutagenese (Wells et al., Philos. Trans. R: Soc. London SerA 317, 415 (1986)) oder andere bekannte Verfahren können an der klonierten DNA durchgeführt werden, um die variable PRO-DNA zu bilden.
Scanning-Aminosäureanalyse kann auch verwendet werden, um eine oder mehrere Aminosäuren entlang einer zusammenhängenden Sequenz zu identifizieren. Zu den bevorzugten Scanning-Aminosäuren zählen relativ kleine, neutrale Aminosäuren. Solche Aminosäuren umfassen Alanin, Glycin, Serin und Cystein. Alanin ist typischerweise eine bevorzugte Scanning-Aminosäure aus dieser Gruppe, da es die Seitenkette über den β-Kohlenstoff hinaus eliminiert und weniger stark zu Veränderungen der Hauptkettenkonformation der Variante neigt (Cunningham & Wells, Science 244, 1081-1085 (1989)). Alanin wird auch typischerweise bevorzugt, da es die üblichste Aminosäure ist. Weiters ist es häufig sowohl in nicht zugänglichen als auch in freiliegenden Positionen zu finden (Creighton, The Proteins (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol. 150, 1 (1976)). Ergibt Alanin-Substitution keine angemessenen Mengen an Varianten, so kann eine isosterische Aminosäure verwendet werden.
C. Modifikationen von PRO
Kovalente Modifikationen von PRO liegen im Schutzumfang dieser Erfindung. Ein Typ von kovalenter Modifikation umfasst die Umsetzung von Target-Aminosäureres ten eines PRO-Polypeptids mit einem organischen derivatisierenden Mittel, das in der Lage ist, sich mit ausgewählten Seitenketten der N- oder C-terminalen Reste des PRO umzusetzen. Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist beispielsweise zur Vernetzung von PRO mit einer wasserlöslichen Trägermatrix oder Oberfläche zur Verwendung im Verfahren zur Reinigung von Anti-PRO-Antikörpern nützlich, und umgekehrt. Üblicherweise verwendete Vernetzer umfassen z.B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester wie z.B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), bifunktionelle Maleimide wie Bis-N-maleimido-1,8-octan und Mittel wie Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio)propioimidat.
Andere Modifikationen umfassen Desamidierung von Glutaminyl- und Asparaginylresten zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten, Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydraxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten (T.E. Creighton, Proteins: Siructure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 79-86 (1983)), Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung jeglicher C-terminaler Carboxylgruppen.
Ein anderer Typ kovalenter Modifikation des PRO-Polypeptids, der im Schutzumfang dieser Erfindung liegt, umfasst die Änderung des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. "Änderung des nativen Glykosylierungsmusters" bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung die Deletion einer oder mehrerer Kohlenhydratgruppierungen, die in Nativsequenz-PRO zu finden sind (entweder durch Entfernen der zugehörigen Glykosylierungsstelle oder durch Löschen der Glykosylierung durch chemische und/oder enzymatische Mittel), und/oder den Zusatz einer oder mehrere Glykoslierungsstellen, die im Nativsequenz-PRO nicht vorhanden sind. Darüber hinaus umfasst dieser Ausdruck qualitative Änderungen der Glykosylierung der nativen Proteine, einschließlich einer Änderung der Beschaffenheit und Proportionen der verschiedenen vorhandenen Kohlenhydratgruppierungen.
Hinzufügung von Glykosylierungsstellen zum PRO-Polypeptid kann durch Ändern der Aminosäuresequenz erfolgen. Die Änderung kann beispielsweise durch den Zusatz von oder die Substitution durch einem/einen oder mehreren Serin- oder Threoninreste(n) zum bzw. im Nativsequenz-PRO (für O-gebundene Glykosylierungsstellen) erfolgen. Die PRO-Aminosäuresequenz kann gegebenenfalls durch Änderungen auf DNA-Ebene, insbesondere durch Mutation der für das PRO-Polypeptid kodierenden DNA an vorbestimmten Basen, verändert werden, sodass Codons gebildet werden, die in die gewünschten Aminosäuren translatiert werden.
Ein anderes Mittel zur Steigerung der Anzahl der Kohlenhydratgruppierungen am PRO-Polypeptid ist chemisches oder enzymatisches Binden von Glykosiden an das Polypeptid. Solche Verfahren werden im Stand der Technik z.B. in der WO 87/05330, veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin & Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306 (1981), beschrieben.
Entfernung von Kohlenhydratgruppierungen, die am PRO-Polypeptid vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch oder durch Mutationssubstitution von Codons, die für Aminosäurereste kodieren, die als Targets für Glykosylierung dienen, erfolgen. Chemische Deglykosylierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 51 (1987), und von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Enzymatische Spaltung von Kohlenhydratgruppierungen an Polypeptiden kann durch die Verwendung vieler verschiedener Endo- und Exoglykosidasen, wie von Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben, erreicht werden.
Ein anderer Typ kovalenter Modifikation von PRO umfasst das Binden des PRO-Polypeptids an eines der zahlreichen verschiedenen, nicht-proteinhältigen Polymere, z.B. Polyethylenglykol (PEG), Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, auf die Art und Weise, wie sie in den US-Patenten Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 erläutert wird.
Das PRO der vorliegenden Erfindung kann auch auf solch eine Weise modifiziert werden, dass ein chimäres Molekül gebildet wird, das PRO, fusioniert an ein anderes heterologes Polypeptid oder eine Aminosäuresequenz, umfasst.
In einer Ausführungsform umfasst solch ein chimäres Molekül eine Fusion des PRO an ein Tag-Polypeptid, woraus ein Epitop entsteht, an das sich ein Anti-Tag-Antikörper selektiv binden kann. Die Epitop-Markierung wird im Allgemeinen an dem Amino- oder Carboxyl-Terminus des PRO angeordnet. Die Gegenwart solcher Epitop-markierten Formen des PRO kann unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Tag-Polypeptid nachgewiesen werden. So ermöglicht die Bereitstellung der Epitop-Markierung, dass das PRO leicht mittels Affinitätsreinigung unter Verwendung eines Anti-Tag-Antikörpers oder eines anderen Typs von Affinitätsmatrix, die sich an die Epitop-Markierung bindet, gereinigt werden kann. Verschiedene Tag-Polypeptide und ihre jeweiligen Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt. Beispiele umfassen Poly-Histidin- (poly-his-) oder Poly-Histidin-Glycin- (poly-his-gly-) Markierungen; das flu-HA-Tag-Polypeptid und seinen Antikörper 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159-2165 (1988)); die c-myc-Markierung und die Antikörper 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 und 9E10 hiergegen (Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5, 3610-3616 (1985)); und die Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein-D- (gD) Markierung und ihren Antikörper (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6), 547-553 (1990)). Andere tag-Polypeptide umfassen das Flag-Peptid (Hopp et al., BioTechnology 6, 1204-1210 (1988)); das KT3-Epitoppeptid (Martin et al., Science 255, 192-194 (1992)); ein α-Tubulin-Epitoppeptid (Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163-15166 (1991)); und die T7-Gen-10-Proteinpeptid-Markierung (Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA 87, 6393-6397 (1990)).
In einer alternativen Ausführungsform kann das chimäre Molekül eine Fusion des PRO mit einem Immunglobulin oder einer bestimmten Region eines Immunglobulins umfassen. Für eine zweiwertige Form des chimären Moleküls (auch als "Immunadhäsin" bezeichnet) könnte solch eine Fusion an die Fc-Region eines IgG-Moleküls gebildet werden. Die Ig-Fusionen umfassen vorzugsweise die Substitution einer löslichen (Transmembrandomäne deletiert oder aktiviert) Form eines PRO-Polypeptids anstelle einer variablen Region innerhalb eines Ig-Moleküls. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Immunglobulin-Fusion die Gelenks-, CH2- und CH3- oder die Gelenks-, CH1-, CH2- und CH3-Regionen eines IgG1-Moleküls. Informationen zur Bildung von Immunglobulin-Fusionen sind auch im US-Patent Nr. 5.428.130, ausgegeben am 27. Juni 1995, zu finden.
D. Herstellung von PRO
Die nachstehende Beschreibung bezieht sich primär auf die Herstellung von PRO durch Kultivieren von Zellen, die mit einem Vektor, der PRO-Nucleinsäure enthält, transformiert oder transfiziert sind. Es wird natürlich in Betracht gezogen, dass alternative Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, verwendet werden können, um PRO herzustellen. Die PRO-Sequenz beispielsweise, oder Teile davon, kann durch direkte Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasenverfahren hergestellt werden (siehe z.B. Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963)). In-vitro-Proteinsynthese kann unter Verwendung manueller oder automatisierter Verfahren erfolgen. Automatisierte Synthese kann beispielsweise mittels eines Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers durchgeführt werden. Verschiedene Teile des PRO können getrennt chemisch synthetisiert und unter Verwendung chemischer oder enzymatischer Verfahren kombiniert werden, um das PRO voller Länge zu bilden.
1. Isolierung von für PRO kodierender DNA
DNA, die für PRO kodiert, kann aus einer cDNA-Bibliothek gewonnen werden, die aus Gewebe erstellt wird, von dem angenommen wird, dass es die PRO-mRNA aufweist und sie auf einem nachweisbaren Niveau exprimiert. Demgemäß kann menschliche PRO-DNA leicht aus einer cDNA-Bibliothek gewonnen werden, die aus menschlichem Gewebe erstellt wurde, wie in den Beispielen beschrieben wird. Das für PRO kodierende Gen kann auch aus einer genomischen Bibliothek oder mittels bekannter Syntheseverfahren (z.B. automatisierter Nucleinsäuresynthese) gewonnen werden.
Bibliotheken können mit Sonden (wie beispielsweise Antikörper gegen das PRO oder Oligonucleotide mit zumindest etwa 20-80 Basen) gescreent werden, die dazu konzipiert sind, das Gen von Interesse oder das davon kodierte Protein zu identifizieren. Screening der cDNA oder der genomischen Bibliothek mit der ausgewählten Sonde kann unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden, wie z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)), beschrieben wird. Ein alternatives Mittel zur Isolierung des für PRO kodierenden Gens ist die Verwendung von PCR-Verfahren (Sambrook et al., s.o.; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1995)).
Die nachstehenden Beispiele beschreiben Verfahren zum Screenen einer cDNA-Bibliothek. Die als Sonden ausgewählten Oligonucleotidsequenzen sollten ausreichend lang und ausreichend eindeutig sein, sodass falsche Positive minimiert werden. Das Oligonucleotid ist vorzugsweise so markiert, dass es bei Hybridisierung an DNA in der zu screenenden Bibliothek nachgewiesen werden kann. Verfahren zur Markierung sind nach dem Stand der Technik bekannt und umfassen die Verwendung von radioaktiven Markierungen wie ³²P-markiertem ATP, Biotinylierung oder Enzymmarkierung. Hybridisierungsbedingungen, einschließlich mäßiger Stringenz und hoher Stringenz, werden in Sambrook et al., s.o., bereitgestellt.
Sequenzen, die in solchen Bibliotheks-Screeningverfahren identifiziert werden, können mit anderen bekannten Sequenzen, die hinterlegt und in öffentlichen Datenbanken wie z.B. GenBank oder anderen privaten Sequenz-Datenbanken verfügbar sind, verglichen und abgeglichen. Sequenzidentität (entweder auf Aminosäure- oder auf Nucleotid-Ebene) innerhalb definierter Regionen des Moleküls oder entlang der Sequenz voller Länge kann unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannter und hierin beschriebener Verfahren bestimmt werden.
Nucleinsäure mit Protein-Kodiersequenz kann durch Screenen ausgewählter cDNA oder genomischer Bibliotheken unter Verwendung der abgeleiteten, hierin zum ersten Mal geoffenbarten Aminosäuresequenz und, sofern erforderlich, unter Ver-wendung herkömmlicher Primer-Extensions-Verfahren, wie sie in Sambrook et al., s.o., beschrieben werden, gewonnen werden, um Vorläufer und Verarbeitungs-Zwischenprodukte von mRNA nachzuweisen, die noch nicht zu cDNA revers transkribiert wurden.
2. Selektion und Transformation von Wirtszellen
Wirtszellen werden mit Expressions- oder Kloniervektoren, die hierin für PRO-Herstellung beschrieben sind, transfiziert oder transformiert und in herkömmlichem Nährmedium, passend zur Induktion von Promotoren, Selektion von Transformanten oder Amplifikation der Gene, die für die gewünschten Sequenzen kodieren, modifiziert, kultiviert. Die Kulturbedingungen, wie Temperatur des Mediums, pH und dergleichen, können von Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt werden. Im Allgemeinen sind Grundlagen, Arbeitsvorschriften und praktische Verfahren zur Maximierung der Produktivität von Zellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Buller (Hrsg.) (IRL Press, 1991) und Sambrook et al., s.o., zu finden.
Verfahren zur Transfektion eukaryotischer Zellen und Transformation prokaryotischer Zellen sind durchschnittlichen Fachleuten bekannt, beispielsweise CaCl₂, CaPO₄, Liposomen-vermittelt und Elektroporation. Je nach der verwendeten Wirtszelle erfolgt Transformation unter Verwendung herkömmlicher Verfahren, die für solche Zellen geeignet sind. Die Calciumbehandlung, die Calciumchlorid verwendet, wie in Sambrook et al., s.o., beschrieben, oder Elektroporation wird im Allgemeinen für Prokaryoten verwendet. Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation bestimmter Pflanzenzellen, wie von Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und in der WO 89/05859, veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschrieben, verwendet. Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände kann das Calciumphosphat-Ausfällungsverfahren von Graham & van der Eb, Virology 57, 456-457 (1978), verwendet werden. Allgemeine Aspekte zu Säugetierzellwirtsystem-Transfektionen sind im US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben. Transformationen in Hefe werden typischerweise gemäß dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 3829 (1979), beschrieben. Andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen jedoch, wie z.B. durch Kernmikroinjektion, Elektroporation, Bakterienprotoplasten-Fusion mit intakten Zellen oder Polykationen, z.B. Polybren, Polyornithin, können verwendet werden. Für Informationen zu verschiedenen Verfahren zur Transformation von Säugetierzellen, siehe Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527-537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348-352 (1988).
Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der DNA in den Vektoren hierin umfassen Prokaryoten-, Hefe- oder höhere Eukaryotenzellen. Geeignete Prokaryoten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Eubakterien, wie Gram-negative oder Gram-positive Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae wie E. coli. Verschiedene E.-coli-Stämme sind allgemein erhältlich, wie E.-coli-K12-Stamm MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E.-coli-Stamm W3110 (ATCC 27.325) und K5 772 (ATCC 53.635). Andere geeignete prokaryotische Wirtszellen umfassen Enterobacteriaceae wie Escherichia, z.B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z.B. Salmonella typhimurium, Serratia, z.B. Serratia marcescans, und Shigella siwoe Bacilli wie B. subtilis und B. licheniformis (z.B. B. licheniformis 41P, geoffenbart in der DD 266.710 , veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas wie P. aeruginosa und Streptomyces. Diese Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung. Stamm W3110 ist ein besonders bevorzugter Wirt oder verwandter Wirt, da er ein üblicher Wirtsstamm für rekombinante DNA-Produkt-Fermentationen ist. Vorzugsweise sekretiert die Wirtszelle geringe Mengen an proteolytischen Enzymen. Stamm W3110 beispielsweise kann modifiziert werden, um eine genetische Mutation in den Genen zu bewirken, die für dem Wirt gegenüber endogene Proteine kodieren, wobei Beispiele für solche Wirte E.-coli-W3110-Stamm 1A2, der den kompletten Genotypus tonA aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 9E4, der den kompletten Genotypus tonA ptr3 aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 27C7 (ATCC 55.244), der den kompletten Genotypus tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan^r aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 37D6, der den kom pletten Genotypus tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan^r aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 40B4, der Stamm 37D6 mit einer nich-Kanamycin-resistenten degP-Deletionsmutation ist; und einen E.-coli-Stamm, der mutierte periplasmatische Protease aufweist, geoffenbart im US-Patent Nr. 4.946.783, ausgegeben am 7. August 1990, umfassen. Alternativ dazu sind In-vitro-Verfahren zum Klonieren, z.B. PCR oder andere Nucleinsäure-Polymerasereaktionen, geeignet.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben wie Fadenpilze oder Hefe geeignete Klonierungs- oder Expressionswirte für PRO-kodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae ist ein üblicherweise verwendeter, niederer eukaryotischer Wirtsorganismus. Andere umfassen Schizosaccharomyces pombe (Beach & Nurse, Nature 290, 140 (1981); EP 139.383 , veröffentlicht am 2. Mai 1985); KluyveromycesWirte (US-Patent Nr. 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology 9,968-975 (1991)) wie z.B. K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. walrii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology 8, 135 (1990)), K. thermotolerans und K. marxianus; Yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265-278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259-5263 (1979)); Schwanniomyces wie z.B. Schwanniomyces occidentalis ( EP 394.538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990); und filamentöse Pilze wie z.B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91100357, veröffentlicht am 10. Januar 1991) und Aspergillus-Wirte wie A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284-289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470-1474 (1984)) und A. niger (Kelly & Hynes, EMBO J. 4, 475-479 (1985)). Methylotrophe Hefen sind hierin geeignet und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Hefe, die zu Wachstum auf Methanol geeignet ist, ausgewählt aus den Gattungen, die sich aus Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis und Rhodotorula zusammensetzen. Eine Liste spezifischer Spezies, die Beispiele für diese Klasse von Hefen sind, ist in C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982), zu finden.
Geeignete Wirtszellen für die Expression von glykosyliertem PRO stammen von mehrzelligen Organismen ab. Beispiele für Wirbellosenzellen umfassen Insektenzellen wie Drosophila 52 und Spodoptera Sf9 sowie Pflanzenzellen. Beispiele für nützliche Säugetier-Wirtszelllinien umfassen Chinahamster-Eierstock- (CHO-) und COS-Zellen. Spezifischer Beispiele umfassen Affennieren-CV1-Linie, transformiert mit SV40 (COS-7, ATCC-CRL 1651); menschliche embryonale Nierenlinie (293 oder 293-Zellen, zum Wachstum in Suspensionskultur subkloniert, Graham et al., J. Gen Virol. 36, 59 (1977)); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub & Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243-251 (1980)); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); und Maus-Brusttumor (MMT 060562, ATCC CCL 51). Die Auswahl der geeigneten Wirtszelle wird als Routineverfahren auf dem Gebiet der Erfindung angesehen.
3. Auswahl und Verwendung eines replizierbaren Vektors
Die Nucleinsäure (z.B. cDNA oder genomische DNA), die für PRO kodiert, kann in einen replizierbaren Vektor zum Klonieren (Amplifikation der DNA) oder zur Expression insertiert werden. Verschiedene Vektoren sind allgemein verfügbar. Der Vektor kann beispielsweise in Form eines Plasmids, von Viruspartikeln oder eines Phagen vorliegen. Die geeignete Nucleinsäuresequenz kann in den Vektor mittels zahlreicher verschiedener Verfahren insertiert werden. Im Allgemeinen wird DNA unter Anwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren in (eine) geeignete Restriktionsendonuclease-Schnittstelle(n) insertiert. Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht beschränkt auf eine oder mehrere Signalsequenzen, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz. Zur Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere dieser Komponenten enthalten, werden herkömmliche Ligationsverfahren, die Fachleuten bekannt sind, eingesetzt.
Das PRO kann rekombinant nicht nur direkt sondern auch als ein Fusionsprotein mit einem heterologen Polypeptid gebildet werden, das eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltungsstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids sein kann. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein oder kann ein Teil der PRO-kodierenden DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die Signalsequenz kann eine prokaryotische Signalsequenz, ausgewählt aus beispielsweise der aus alkalischer Phosphatase, Penicillinase, Ipp oder wärmestabilen Enterotoxin-II-Leadern bestehenden Gruppe, sein. Zur Hefesekretion kann die Signalsequenz z.B. der Hefe-Invertase-Leader, α-Faktor-Leader (einschließlich Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktor-Leader, wobei Letztere im US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben werden) oder das in der WO 90/13646, veröffentlicht am 15. November 1990, beschriebene Signal sein. Bei Säugetierzellexpression können Säugetier-Signalsequenzen verwendet werden, um Sekretion des Proteins zu steuern, wie beispielsweise Signalsequenzen aus sekretierten Polypeptiden derselben oder einer verwandten Spezies, sowie virale Sekretionsleader.
Sowohl Expressions- als auch Kloniervektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, eine oder mehrere der selektierten Wirtszellen zu replizieren. Solche Sequenzen sind für zahlreiche verschiedene Bakterien, Hefen und Viren bekannt. Der Replikationsursprung aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten Gram-negativen Bakterien nützlich, das 2μ-Plasmidursprung ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind zum Klonieren von Vektoren in Säugetierzellen nützlich.
Expressions- und Kloniervektoren enthalten typischerweise ein Selektionsgen, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophen Mängeln Abhilfe schaffen oder (c) maßgebliche Nährstoffe, die aus komplexen Medien nicht erhältlich sind, z.B. das für D-Alanin-Racemase für Bacilli kodierende Gen, liefern.
Ein Beispiel für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind jene, die die Identifikation von Zellen ermöglichen, die kompetent sind, die PRO-kodierende Nucleinsäure aufzunehmen, wie DHFR oder Thymidinkinase. Eine geeignete Wirtszelle, wenn Wildtyp-DHFR verwendet wird, ist die CHO-Zelllinie, der DHFR-Aktivität fehlt, hergestellt und vermehrt wie von Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben. Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen, das im Hefeplasmid YRp7 vorhanden ist (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)). Das trp1-Gen liefert einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, z.B. ATCC-Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 (1977)).
Expressions- und Kloniervektoren enthalten üblicherweise einen operabel an die für PRO kodierende Nucleinsäuresequenz gebundenen Promotor, um mRNA-Synthese zu steuern. Promotoren, die durch zahlreiche verschiedene, potenzielle Wirtszellen erkannt werden, sind durchwegs bekannt. Promotoren, die zur Verwendung in Verbindung mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)), alkalische Phosphatase, ein Tryptophan- (trp-) Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP 36.776 ) und Hybridpromotoren wie den tac-Promotor (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25 (1983)). Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno- (S.D.-) Sequenz, die operabel an die für PRO kodierende DNA gebunden ist.
Beispiele für geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)), wie Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil von durch Wachstumsbedingungen gesteuerter Transkription sind, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, abbauende, mit Stickstoffmetabolismus assoziierte Enzyme, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung zur Hefeexpression werden in der EP 73.657 näher beschrieben.
PRO-Transkription aus Vektoren in Säugetierwirtszellen wird beispielsweise von Promotoren gesteuert, die aus den Genomen von Viren wie z.B. Polyoma-Virus, Geflügelpocken-Virus (UK 2.211.504, veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie Adenovirus 2), Rinder-Papillomavirus, Vogel-Sarkomavirus, Zytomegalie-Virus, ein Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und Simian-Virus 40 (SV 40), aus heterologen Säugetierpromotoren, z.B. dem Actin-Promotor oder einem Immunglobulinpromotor, und aus Hitzeschock-Promotoren, mit der Maßgabe, dass solche Promotoren mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind, stammen.
Transkription einer DNA, die für das PRO kodiert, durch höhere Eukaryoten kann durch Insertieren einer Enhancer-Sequenz in den Vektor gesteigert werden. Enhancer sind cis-wirkende Elemente von DNA, üblicherweise etwa 10 bis 300 bp lang, die auf einen Promotor einwirken, um seine Transkription zu steigern. Zahlreiche Enhancer-Sequenzen sind nun bereits aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird jedoch ein Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus verwendet. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer. Der Enhancer kann in den Vektor an einer Position 5' oder 3' zur PRO-Kodiersequenz gespleißt werden, ist jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor angeordnet.
Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, menschliche oder kernhältige Zellen aus anderen mehrzelligen Organismen) verwendet werden, enthalten auch Sequenzen, die zur Termination von Trans kription und zur Stabilisierung der mRNA erforderlich sind. Solche Sequenzen sind üblicherweise aus den untranslatierten 5'- und gegebenenfalls 3'-Regionen von eukaryotischen oder viralen DNAs oder cDNAs erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für PRO kodierenden mRNA transkribiert werden.
Wiederum andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Anpassung an die Synthese von PRO in rekombinanter Wirbeltier-Zellkultur geeignet sind, werden in Gething et al., Nature 293, 620-625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40-46 (1979); in der EP 117.060 ; und der EP 117.058 beschrieben.
4. Detektion von Gen-Amplifikation/Expression
Genamplifikation und/oder -expression können in einer Probe direkt, beispielsweise durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting, um die Transkription von mRNA zu quantifizieren (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201-5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeignet markierten Sonde, basierend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen, gemessen werden. Alternativ dazu können Antikörper verwendet werden, die spezifische Duplexe, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe und DNA-RNA-HybridDuplexe oder DNA-Protein-Duplexe, erkennen können. Die Antikörper wiederum können markiert werden, und der Test kann durchgeführt werden, wenn der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, sodass bei der Bildung von Duplex an der Oberfläche die Gegenwart von Antikörper, der an den Duplex gebunden ist, nachgewiesen werden kann.
Genexpression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren, wie z.B. immunhistochemisches Färben von Zellen oder Gewebeschnitten und Testen von Zellkultur oder Körperflüssigkeiten, gemessen werden, um die Expression des Genprodukts direkt zu quantifizieren. Antikörper, die für immunhistochemisches Färben und/oder Testen von Probenflüssigkeiten nützlich sind, können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jedem beliebigen Säugetier hergestellt werden.
Praktisch wäre es, die Antikörper gegen ein Nativsequenz-PRO-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid, basierend auf den hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen, oder gegen exogene Sequenz, die an PRO-DNA fusioniert ist und für ein spezifisches Antikörper-Epitop kodiert, herzustellen.
5. Reiniqunq von Polypeptiden
Formen von PRO können aus Kulturmedium oder aus Wirtszelllysaten gewonnen werden. Sofern es membrangebunden ist, kann es aus der Membran unter Verwendung einer geeigneten Waschlösung (z.B. Triton-X 100) oder durch enzymatische Spaltung freigesetzt werden. Zellen, die zur Expression von PRO verwendet werden, können mittels verschiedener physikalischer oder chemischer Mittel aufgebrochen werden, wie beispielsweise mittels Gefrier-Auftau-Zyklierens, Beschallung, mechanischen Aufbruchs oder Zelllysemittel.
Es kann wünschenswert sein, PRO aus rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen. Die folgenden Verfahren sind Beispiele für Reinigungsverfahren: Fraktionierung an einer Ionenaustauschsäule; Ethanolfällung; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie auf Siliciumdioxid oder an einem Kationenaustauschharz wie z.B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatfällung, Gelfiltration unter Verwendung von z.B. Sephadex G-75; Protein-A-Sepharose-Säulen zur Entfernung von Verunreinigungen wie IgG; und Metallchelatbildner-Säulen zur Bindung Epitop-markierter Formen des PRO. Verschiedene Verfahren zur Proteinreinigung können verwendet werden, und solche Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise in Deutscher, Methods in Enzymology 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982), beschrieben. Der/Die selektierte(n) Reinigungsschritt(e) hängen beispielsweise von der Beschaffenheit des Herstellungsverfahrens und dem jeweiligen produzierten PRO ab.
E. Verwendungen von PRO
Nucleotidsequenzen (oder ihr Komplement), die für PRO kodieren, haben verschiedene Anwendungsbereiche auf dem Gebiet der Molekularbiologie, einschließlich Verwendungen als Hybridisierungssonden, bei der Chromosom- und Genkartierung und bei der Bildung von Antisense-RNA und -DNA. PRO-Nucleinsäure ist auch zur Herstellung von PRO-Polypeptiden durch die hierin beschriebenen rekombinanten Verfahren nützlich.
Das Volllängen-Nativsequenz-PRO-Gen oder Abschnitte davon können als Hybridisierungssonden für eine cDNA-Bibliothek verwendet werden, um die Volllängen-PRO-cDNA zu isolieren oder um wiederum andere cDNAs (beispielsweise jene, die für natürlich vorkommende Varianten von PRO oder PRO aus anderen Spezies kodieren) zu isolieren, die eine gewünschte Sequenzidentität mit der hierin geoffenbarten, nativen PRO-Sequenz aufweisen. Gegebenenfalls umfasst die Länge der Sonden etwa 20 bis etwa 50 Basen. Die Hybridisierungssonden können aus zumindest teilweise neuen Regionen der nativen Nucleotidsequenz voller Länge gewonnen werden, worin diese Regionen ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt werden können, oder aus genomischen Sequenzen einschließlich Promotoren, Enhancerelementen und Introns von Nativsequenz-PRO. Ein Screening-Verfahren umfasst beispielsweise das Isolieren der Kodierregion des PRO-Gens unter Verwendung der bekannten DNA-Sequenz, um eine ausgewählte Sonde mit etwa 40 Basen zu synthetisieren. Hybridisierungssonden können durch zahlreiche verschiedene Markierungen, einschließlich Radionucleotide wie ³²P oder ³⁵S oder enzymatischer Markierungen wie alkalische Phosphatase, gebunden an die Sonde über Avidin/Biotin-Bindungssysteme, markiert werden. Markierte Sonden mit einer Sequenz, die zu jener des PRO-Gens der vorliegenden Erfindung komplementär ist, können verwendet werden, um Bibliotheken menschlicher cDNA, genomischer DNA oder mRNA zu screenen, um zu bestimmen, an welche Mitglieder solcher Bibliotheken die Sonde hybridisiert. Hybridisierungsverfahren werden näher in den nachstehenden Beispielen beschrieben.
Jegliche in der vorliegenden Anmeldung geoffenbarten EST-Sequenzen können gleichermaßen unter Anwendung der hierin geoffenbarten Verfahren als Sonden verwendet werden.
Andere nützliche Fragmente der PRO-Nucleinsäuren umfassen Antisense- oder Sense-Oligonucleotide, die eine einzelsträngige Nucleinsäuresequenz (entweder RNA oder DNA) umfassen, die in der Lage ist, sich an PRO-mRNA- (Sense) oder PRO-DNA- (Antisense) Sequenzen zu binden. Antisense- oder Sense-Oligonucleotide gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen ein Fragment der Kodierregion von PRO-DNA. Solch ein Fragment umfasst im Allgemeinen zumindest etwa 14 Nucleotide, vorzugsweise etwa 14 bis 30 Nucleotide. Die Fähigkeit, ein Antisense- oder Sense-Oligonucleotid basierend auf einer cDNA-Sequenz, die für ein bestimmtes Protein kodiert, abzuleiten, wird beispielsweise in Stein & Cohen (Cancer Res. 48, 2659 (1988)) und Krol et al. (BioTechniques 6, 958 (1988)) beschrieben.
Bindung von Antisense- oder Sense-Oligonucleotiden, um auf Nucleinsäuresequenzen abzuzielen, führt zur Bildung von Duplexen, die die Transkription oder Translation der Target-Sequenz auf eine von mehreren Arten blockieren, umfassend gesteigerten Abbau der Duplexe, verfrühte Termination von Transkription oder Translation, oder auf andere Weise. Die Antisense-Oligonucleotide können somit verwendet werden, um Expression von PRO-Proteinen zu blockieren. Antisense- oder Sense-Oligonucleotide umfassen weiters Oligonucleotide mit modifizierten Zucker-Phosphodiester-Hauptketten (oder anderen Zuckerbindungen, wie beispielsweise jenen, die in der WO 91/06629 beschrieben werden), in denen darüber hinaus solche Zuckerbindungen gegen endogene Nucleasen resistent sind. Solche Oligonucleotide mit resistenten Zuckerbindungen sind in vivo stabil (z.B. in der Lage, gegen enzymatischen Abbau resistent zu bleiben), behalten jedoch Sequenzspezifität bei, um in der Lage sein, sich an Target-Nucleotidsequenzen zu binden.
Andere Beispiele von Sense- oder Antisense-Oligonucleotiden umfassen jene Oligonucleotide, die kovalent an organische Gruppierungen gebunden sind, wie beispielsweise jene, die in der WO 90/10048 beschreiben werden, und andere Gruppierun gen, die Affinität des Oligonucleotids für eine Target-Nucleinsäuresequenz steigern, wie beispielsweise Poly-(L-Lysin). Darüber hinaus können interkalierende Agenzien, wie Ellipticin, und Alkylierungsmittel oder Metallkomplexe an Sense- oder Antisense-Oligonucleotide gebunden werden, um Bindungsspezifitäten des Antisense- oder Sense-Oligonucleotids für die Target-Nucleotidsequenz zu modifizieren.
Antisense- oder Sense-Oligonucleotide können durch jedes beliebige Transferverfahren, einschließlich z.B. CaPO₄-vermittelte DNA-Transfektion, Elektroporation oder unter Verwendung von Gentransfervektoren wie Epstein-Barr-Virus, in eine Zelle eingeführt werden, die die Target-Nucleinsäuresequenz enthält. In einem bevorzugten Verfahren wird ein Antisense- oder Sense-Oligonucleotid in einen geeigneten retroviralen Vektor insertiert. Eine Zelle, die die Target-Nucleinsäuresequenz enthält, wird mit dem rekombinanten retroviralen Vektor kontaktiert, entweder in vivo der ex vivo. Geeignete retrovirale Vektoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, jene, die aus dem murinen Retrovirus M-MuLV, N2 (ein von M-MuLV abstammendes Retrovirus) abgeleitet sind, oder die Doppelkopie-Vektoren, die als DCT5A, DCT5B und DCT5C bezeichnet werden (siehe die WO 90/13641).
Sense- oder Antisense-Oligonucleotide können auch durch Bildung eines Konjugats mit einem Liganden-bindenden Molekül, wie in der WO 91/04753 beschrieben, in eine Zelle eingeführt werden, die die Target-Nucleotidsequenz enthält. Geeignete Liganden-Bindungsmoleküle umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Zelloberflächenrezeptoren, Wachstumsfaktoren, andere Cytokine oder andere Liganden, die sich an Zelloberflächenrezeptoren binden. Vorzugsweise stört Konjugation des Liganden-Bindungsmoleküls die Fähigkeit des Liganden-Bindungsmoleküls, sich an sein(en) entsprechendes Molekül oder entsprechenden Vektor zu binden oder den Eintritt des Sense- oder Antisense-Oligonucleotids oder seiner konjugierten Version in die Zelle zu blockieren, nicht wesentlich.
Alternativ dazu kann ein Sense- oder Antisense-Oligonucleotid in eine Zelle eingeführt werden, die die Target-Nucleinsäuresequenz durch Bildung eines Oligonucleotid-Lipid-Komplexes wie in der WO 90/10448 beschrieben enthält. Der Sense- oder Antisense-Oligonucleotid-Lipid-Komplex ist vorzugsweise innerhalb der Zelle durch eine endogene Lipase dissoziiert.
Die Sonden können auch in PCR-Verfahren verwendet werden, um einen Pool an Sequenzen zur Identifikation eng verwandter PRO-Kodiersequenzen zu bilden.
Nucleotidsequenzen, die für ein PRO kodieren, können auch verwendet werden, um Hybridisierungssonden zur Kartierung des Gens, das für jenes PRO kodiert, und zur genetischen Analyse von Individuen mit genetischen Störungen zu konstruieren. Die hierin bereitgestellten Nucleotidsequenzen können zu einem Chromosom und spezifischen Regionen eines Chromosoms unter Verwendung bekannter Verfahren, wie z.B. In-situ-Hybridisierung, Bindungsanalyse gegen bekannte chromosomale Marker und Hybridisierungs-Screenen mit Bibliotheken, kartiert werden.
Kodieren die Kodiersequenzen für PRO für ein Protein, das sich an ein anderes Protein bindet (beispielsweise wenn PRO ein Rezeptor ist), so kann das PRO in Tests verwendet werden, um die anderen Proteine oder Moleküle zu identifizieren, die in die Bindungswechselwirkung eingebunden sind. Mittels solcher Verfahren können Inhibitoren der Rezeptor/Liganden-Wechselwirkung identifiziert werden. Proteine, die in solche Bindungswechselwirkungen eingebunden sind, können auch verwendet werden, um auf Peptid oder niedermolekulare Inhibitoren oder Agonisten der Bindungswechselwirkung zu screenen. Auch kann das Rezeptor-PRO verwendet werden, um Korrelationsligand(en) zu isolieren. Screeningtests können so entworfen werden, dass sie Leitverbindungen finden, die die biologische Aktivität eines nativen PRO oder eines Rezeptors für PRO nachahmen. Solche Screeningtests umfassen Tests, die zu Screening mit hohem Durchsatz von chemischen Bibliotheken geeignet sind, was sie besonders nützlich für die Identifikation niedermolekularer Wirkstoffkandidaten macht. Kleine Moleküle, die hierbei in Betracht gezogen werden, umfassen synthetische organische oder anorganische Verbindungen. Die Tests können in zahlreichen verschiedenen Formaten durchgeführt werden, einschließlich Protein-Protein-Bindungstests, biochemische Screening-Tests, Immuntests und zellbasierter Tests, die auf dem Gebiet der Erfindung gut beschrieben sind.
Nucleinsäuren, die für PRO oder seine modifizierten Formen kodieren, können auch verwendet werden, um entweder transgene Tiere oder "Knock-out"-Tiere zu bilden, die wiederum zur Entwicklung und zum Screenen therapeutisch nützlicher Reagenzien nützlich sind. Ein transgenes Tier (z.B. eine Maus oder eine Ratte) ist ein Tier, das Zellen aufweist, die ein Transgen enthalten, worin das Transgen in das Tier oder einen Vorfahren das Tiers in einem pränatalen, z.B. einem embryonalen, Stadium eingeführt wurde. Ein Transgen ist eine DNA, die in das Genom einer Zelle integriert wurde, aus der sich ein transgenes Tier entwickelt. In einer Ausführungsform kann cDNA, die für PRO kodiert, verwendet werden, um genomische DNA, die für PRO kodiert, gemäß bekannter Verfahren zu klonieren, und die genomischen Sequenzen können verwendet werden, um transgene Tiere zu bilden, die Zellen enthalten, die für PRO kodierende DNA exprimieren. Verfahren zur Bildung transgener Tiere wie z.B. von Mäusen oder Ratten, sind mittlerweile auf dem Gebiet der Erfindung Routineverfahren und werden beispielsweise in den US-Patenten Nr. 4.736.866 und 4.870.009 beschrieben. Typischerweise würden bestimmte Zellen zur PRO-Transgen-Inkorporation mittels gewebespezifischen Enhancern als Target dienen. Transgene Tiere, die eine Kopie eines für Transgen kodierenden PRO, eingeführt in die Keimlinie des Tiers in einem embryonalen Stadium, umfassen, können verwendet werden, um die Wirkung von gesteigerter Expression von für PRO kodierender DNA zu untersuchen. Solche Tiere können als Testtiere für Reagenzien verwendet werden, von denen angenommen wird, dass sie Schutz vor beispielsweise pathologischen Leiden in Verbindung mit deren Überexpression verleihen. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung wird ein Tier mit dem Reagens behandelt, und eine reduzierte Inzidenz des pathologischen Leidens im Vergleich zu nicht behandelten Tieren, die das Transgen tragen, würde auf eine potenzielle therapeutische Beeinflussung des pathologischen Leidens hinweisen.
Alternativ dazu können nicht-menschliche Homologe von PRO verwendet werden, um ein PRO-"Knock-out"-Tier zu konstruieren, das ein defektes oder verändertes, für PRO kodierendes Gen als Resultat homologer Rekombination zwischen dem endogenen Gen, das für PRO kodiert, und einer veränderten genomischen DNA, die für PRO kodiert und in eine embryonale Stammzelle des Tiers eingeführt wurde, auf weist. Ein Teil der genomischen DNA, die für PRO kodiert, kann deletiert oder durch ein anderes Gen ersetzt werden, wie beispielsweise ein Gen, das für einen selektierbaren Marker kodiert, der verwendet werden kann, um Integration zu überwachen. Typischerweise werden mehrere kb unveränderter flankierender DNA (sowohl an den 5'- als auch den 3'-Enden) in den Vektor eingebunden (siehe z.B. Thomas & Capecchi, Cell 51, 503 (1987) für eine Beschreibung homologer Rekombinationsvektoren). Der Vektor wird in eine embryonale Stammzellenlinie (z.B. durch Elektroporation) eingeführt, und Zellen, in denen sich die eingeführte DNA homolog mit der endogenen DNA rekombinierte, werden ausgewählt (siehe z.B. Li et al., Cell 69, 915 (1992)). Die ausgewählten Zellen werden dann in eine Blastocyste eines Tiers (z.B. einer Maus oder Ratte) injiziert, um Aggregationschimären zu bilden (siehe z.B. Bradley, in: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson (Hrsg.), IRL, Oxford, 113-152 (1987)). Ein chimärer Embryo kann dann in ein geeignetes, scheinschwangeres weibliches Ammentier implantiert und ausgetragen werden, um ein "Knock-out"-Tier zu schaffen. Nachkommenschaft, die die homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen trägt, kann mittels herkömmlicher Verfahren identifiziert und verwendet werden, um Tiere zu züchten, in denen alle Zellen des Tiers die homolog rekombinierte DNA enthalten. Knockout-Tiere können beispielsweise auf Grundlage ihrer Fähigkeit, gegen bestimmte pathologische Leiden Abwehr zu entwickeln, und ihrer Entwicklung pathologischer Leiden aufgrund nicht vorhandenen PRO-Polypeptids charakterisiert werden.
Nucleinsäure, die für die PRO-Polypeptide kodieren, können in Gentherapie verwendet werden. In Gentherapieanwendungen werden Gene in Zellen eingeführt, um Invivo-Synthese eines therapeutisch wirksamen, genetischen Produkts, beispielsweise zur Ersetzung eines defekten Gens, zu erreichen. "Gentherapie" umfasst sowohl herkömmliche Gentherapie, bei der eine langanhaltende Wirkung durch eine einzige Behandlung errecht wird, und die Verabreichung von Gentherapeutika, die eine einmalige oder wiederholte Verabreichung einer therapeutisch wirksamen DNA oder mRNA umfasst. Antisense-RNAs und -DNAs können als therapeutische Mittel zum Blockieren der Expression bestimmter Gene in vivo verwendet werden. Es wurde bereits gezeigt, dass kurze Antisense-Oligonucleotide in Zellen importiert werden können, in denen sie trotz ihrer niederen intrazellulären Konzentrationen, die durch ihre eingeschränkte Aufnahme durch die Zellmembran entstehen, als Inhibitoren wirken. (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4143-4146 (1986)). Die Oligonucleotide können modifiziert werden, um ihre Aufnahme zu steigern, z.B. durch Substituieren ihrer negativ geladenen Phosphodiestergruppen durch ungeladene Gruppen.
Es gibt zahlreiche verschiedene Verfahren, die zur Einführung von Nucleinsäuren in lebensfähige Zellen verfügbar sind. Die Verfahren variieren je nachdem, ob die Nucleinsäure in vitro in kultivierte Zellen oder in vivo in die Zellen des geplanten Wirts transferiert wird. Verfahren, die für den Transfer von Nucleinsäure in Säugetierzellen in vitro geeignet sind, umfassen die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Mikroinjektion, Zellfusion, DEAE-Dextran, das Calciumphosphat-Ausfällungsverfahren usw. Die zur Zeit bevorzugten In-vivo-Gentransferverfahren umfassen Transfektion mit viralen (typischerweise retroviralen) Vektoren und durch virales Hüllprotein-Liposom vermittelte Transfektion (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993)). In manchen Situationen ist es wünschenswert, die Nucleinsäurenquelle mit einem Mittel zu versehen, das sich auf die Targetzellen richtet, wie beispielsweise mit einem Antikörper, der für ein Zelloberflächenmembranprotein oder die Targetzelle spezifisch ist, einem Liganden für einen Rezeptor an der Targetzelle usw. Werden Liposomen verwendet, so können Proteine, die sich an ein mit Endozytose assoziiertes Zelloberflächenmembranprotein binden, zum Targeting und/oder zur Erleichterung der Aufnahme von z.B. Capsidproteinen oder Fragmenten davon, die für einen bestimmten Zelltyp spezifisch sind, Antikörpern gegen Proteine, die beim Zyklieren Internalisierung erfahren, Proteinen, die sich auf intrazelluläre Lokalisierung richten und intrazelluläre Halbwertszeit verlängern, verwendet werden. Das Verfahren von rezeptorvermittelter Endozytose wird beispielsweise von Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); und Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990), beschrieben. Einen Überblick über Genmarkierung und Arbeitsvorschriften für Gentherapie geben Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992).
Die hierin beschriebenen PRO-Polypeptide können auch als Molekulargewichtsmarker zu Zwecken der Protein-Elektrophorese verwendet werden.
Die für die PRO-Polypeptide kodierenden Nucleinsäuremoleküle oder Fragmente davon, die hierin beschrieben werden, sind für Chromosom-Identifikation nützlich. In dieser Hinsicht besteht ein steter Bedarf daran, neue Chromosomenmarker zu identifizieren, da relativ wenige Chromosom-Markierungsreagenzien, basierend auf aktuellen Sequenzdaten, zur Zeit erhältlich sind. Jedes PRO-Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kann als Chromosomenmarker verwendet werden.
Die PRO-Polypeptide und Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung können auch zur Gewebetypisierung verwendet werden, worin die PRO-Polypeptide der vorliegenden Erfindung in einem Gewebe im Vergleich zu einem anderen differenziell exprimiert werden können. PRO-Nucleinsäuremoleküle werden zur Bildung von Sonden für PCR, Northern-Analyse, Southern-Analyse und Western-Analyse Anwendung finden.
Die hierin beschriebenen PRO-Polypeptide können auch als Therapeutika verwendet werden. Die PRO-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können durch bekannte Verfahren formuliert werden, um pharmazeutisch nützliche Zusammensetzungen herzustellen, wobei das PRO-Produkt hiervon zu einem Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägervehikel kombiniert wird. Therapeutische Formulierungen werden zur Lagerung durch Vermischen des aktiven Bestandteils mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit gegebenenfalls physiologisch annehmbaren Trägern, Arzneimittelträgern oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol (Hrsg.) (1980)) in Form von lyophilisierten Formulierungen oder wässrigen Lösungen hergestellt. Annehmbare Träger, Arzneimittelträger oder Stabilisatoren sind bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen für den Empfänger nicht-toxisch und umfassen Puffer wie Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidanzien, einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulare Peptide (mit weniger als 10 Resten); Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie Polyvinylpyrrolidon, Aminosäuren wie Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie EDTA; Zuckeralkohole wie Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie Natrium; und/oder nichtionische Tenside wie TWEEN^TM, PLURONICS^TM oder PEG.
Die für In-vivo-Verabreichung zu verwendenden Formulierungen müssen steril sein. Dies kann leicht durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen vor oder nach Lyophilisierung und Rekonstitution erreicht werden.
Therapeutische Zusammensetzungen hierin werden im Allgemeinen in ein Behältnis mit einer sterilen Zugangsöffnung, beispielsweise in einen intravenösen Lösungsbeutel oder eine Phiole mit einem mittels transdermaler Injektionsnadel durchstechbaren Septum, gefüllt.
Die Art der Verabreichung entspricht bekannten Verfahren, z.B. Injektion oder Infusion durch intravenöse, intraperitoneale, intrazerebrale, intramuskuläre, intraokulare, intraarterielle oder intraläsionale Verabreichung, durch topische Verabreichung oder mittels Retard-Systemen.
Dosierung und gewünschte Wirkstoffkonzentrationen pharmazeutischer Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können je nach der jeweils in Betracht gezogenen Verwendung variieren. Die Bestimmung der geeigneten Dosierung oder Art der Verabreichung liegt durchwegs im Kompetenzbereich des Allgemeinmediziners. Tierversuche liefern zuverlässige Richtlinien für die Verabreichung wirksamer Dosen in der Therapie an Menschen. Proportionales Berechnen wirksamer Dosierungen von einer Spezies auf eine andere kann gemäß den Grundlagen von J. Mordenti & W. Chappell, "The use of interspecies scaling in toxicokinetics", in: Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al. (Hrsg.), Pergamon Press, New York, 42-96 (1989), erfolgen.
Erfolgt In-vivo-Verabreichung eines PRO-Polypeptids oder Agonisten oder Antagonisten davon, so können normale Dosierungsmengen von etwa 10 ng/kg bis zu 100 mg/kg Säugetier-Körpergewicht oder mehr pro Tag variieren, vorzugsweise von etwa 1 μg/kg/Tag bis 10 mg/kg/Tag, je nach der Art der Verabreichung. Richtlinien bezüglich bestimmten Dosierungen und Zufuhrverfahren finden sich in der Literatur; siehe beispielsweise die US-Patente Nr. 4.657.760; 5.206.344; oder 5.225.212. Es wird vorausgesetzt, dass verschiedene Formulierungen für verschiedene Behandlungsverbindungen und verschiedene Erkrankungen wirksam sind und dass die Verabreichung an ein Organ oder Gewebe beispielsweise eine andere Art der Verabreichung erfordern kann als jene an ein anderes Organ oder Gewebe.
Ist Retard-Verabreichung eines PRO-Polypeptids in einer Formulierung mit Freisetzungseigenschaften erwünscht, die für die Behandlung jeglicher Erkrankungen oder Störungen geeignet sind, die Verabreichung des PRO-Polypeptids erfordern, so wird Mikroeinkapselung des PRO-Polypeptids in Erwägung gezogen. Mikroeinkapselung rekombinanter Proteine für Retard-Freisetzung wurde bereits mit dem menschlichen Wachstumshormon (rhGH), Interferon- (rhIFN-), Interleukin-2 und MN rgp120 erfolgreich durchgeführt. Johnson et al., Nat. Med. 2, 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther. 27, 1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology 8, 755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems", in: Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell & Newman (Hrsg.), Plenum Press: New York, 439-462 (1995); WO 97/03692, WO 96/07399; und US-Patent Nr. 5.654.010.
Die Retard-Formulierungen dieser Proteine wurden unter Verwendung von Polymilch-co-glykolsäure- (PLGA) Polymer aufgrund seiner Biokompatibilität und der vielfältigen biologischen Abbaubarkeit entwickelt. Die Abbauprodukte von PLGA, Milch- und Glykolsäure, können im menschlichen Körper rasch geklärt werden. Darüber hinaus kann die Abbaubarkeit dieses Polymers je nach Gewicht und Zusammensetzung auf Monate bis Jahre eingestellt werden. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer", in: M. Chasin & R. Langer (Hrsg.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems, Marcel Dekker: New York, 1-41 (1990).
Diese Erfindung umfasst Verfahren zum Screenen von Verbindungen, um jene zu identifizieren, die das PRO-Polypeptid nachahmen (Agonisten) oder die Wirkung des PRO-Polypeptids unterbinden (Antagonisten). Screening-Tests für Antagonisten- Wirkstoffkandidaten sind so konzipiert, dass sie Verbindungen identifizieren, die sich an die PRO-Polypeptide binden oder mit den PRO-Polypeptiden Komplexe bilden, für die die hierin identifizierten Gene kodieren, oder auf andere Weise die Wechselwirkung der kodierten Polypeptide mit anderen zellulären Prateinen stören. Solche Screening-Tests umfassen Tests, die für Hochdurchsatz-Screening chemischer Bibliotheken geeignet sind, was sie besonders geeignet für die Identifikation niedermolekularer Wirkstoffkandidaten macht.
Die Tests können in zahlreichen verschiedenen Formaten durchgeführt werden, einschließlich Protein-Protein-Bindungstests, biochemischer Screening-Tests, Immuntests und zellbasierter Tests, die auf dem Gebiet der Erfindung gut beschrieben sind.
Alle Tests für Antagonisten haben die Eigenschaft gemeinsam, dass sie alle das Kontaktieren des Wirkstoffkandidaten mit einem PRO-Polypeptid, für das eine hierin identifizierte Nucleinsäure kodiert, unter Bedingungen und für eine ausreichende Zeitspanne, die eine Wechselwirkung zwischen diesen zwei Komponenten ermöglichen, erfordern.
In Bindungstests ist die Wechselwirkung Bindung, und der gebildete Komplex kann im Reaktionsgemisch isoliert oder nachgewiesen werden. In einer bestimmten Ausführungsform wird das PRO-Polypeptid, für das das hierin identifizierte Gen kodiert, oder der Wirkstoffkandidat an eine Festphase, z.B. eine Mikrotiterplatte, durch kovalente oder nichtkovalente Bindungen immobilisiert. Nichtkovalente Bindung erfolgt im Allgemeinen durch Beschichten der festen Oberfläche mit einer Lösung des PRO-Polypeptids und Trocknen. Alternativ dazu kann ein immobilisierter Antikörper, z.B. ein monoklonaler Antikörper, der für das zu immobilisierende PRO-Polypeptid spezifisch ist, verwendet werden, um es an einer festen Oberfläche zu verankern. Der Test erfolgt durch Zusatz der nichtimmobilisierten Komponente, die durch eine nachweisbare Markierung markiert werden kann, zu der immobilisierten Komponente, z.B. der beschichteten Oberfläche, die die verankerte Komponente enthält. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, werden die nicht-umgesetzten Komponenten, z.B. durch Waschen, entfernt, und Komplexe, die an der festen Oberfläche verankert sind, wer den nachgewiesen. Trägt die ursprünglich nichtimmobilisierte Komponente eine nachweisbare Markierung, so weist die Detektion von an der Oberfläche immobilisierter Markierung darauf hin, dass Komplexbildung eingetreten war. Trägt die ursprünglich nichtimmobilisierte Komponente keine Markierung, so kann Komplexbildung beispielsweise durch die Verwendung eines markierten Antikörpers, der den immobilisierten Komplex spezifisch bindet, nachgewiesen werden.
Wechselwirkt die Kandidatenverbindung mit einem bestimmten PRO-Polypeptid, für das ein hierin identifiziertes Gen kodiert, bindet sich jedoch nicht an dieses, so kann ihre Wechselwirkung mit diesem Polypeptid mittels Verfahren, die zur Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen bekannt sind, getestet werden. Solche Tests umfassen herkömmliche Ansätze, wie z.B. Vernetzen, Co-Immunfällung und Co-Reinigung durch Gradienten oder Chromatographiesäulen. Darüber hinaus können Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung eines Hefe-basierten genetischen Systems, das von Fields & Mitarbeitern beschrieben wird, beobachtet werden (Fields & Song, Nature (London) 340, 245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)), wie von Chevray & Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991), beschrieben wird. Zahlreiche Transkriptionsaktivatoren, wie beispielsweise Hefe GAL4, bestehen aus zwei physikalisch unterschiedlichen Moduldomänen, wobei eine als die DNA-Bindungsdomäne wirkt und die andere als die Transkriptions-Aktivierungsdomäne. Das in den oben genannten Publikationen beschriebene Hefe-Expressionssystem (im Allgemein als "Zwei-Hybrid-System" bezeichnet) profitiert von dieser Eigenschaft und verwendet zwei Hybridproteine, eines, in dem das Targetprotein an die DNA-Bindungsdomäne von GAL4 fusioniert ist, und ein anderes, in dem mutmaßliche aktivierende Proteine an die Aktivierungsdomäne fusioniert sind. Die Expression eines GAL1-lacZ-Reportergens unter der Steuerung eines GAL4-aktivierten Promotors hängt von der Rekonstitution von GAL4-Aktivität über Protein-Protein-Wechselwirkung ab. Kolonien, die wechselwirkende Polypeptide enthalten, werden mit einem chromogenen Substrat für β-Galactosidase nachgewiesen. Ein vollständiges Set (MATCHMAKER^TM) zur Identifikation von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei spezifischen Proteinen unter Verwendung des Zwei-Hybrid-Verfahrens ist im Handel bei Clontech erhältlich. Dieses System kann auch erweitert werden, um Proteindomänen zu kartieren, die in spezifische Protein-Wechselwirkungen eingebunden sind, sowie um Aminosäurereste zu lokalisieren, die für diese Wechselwirkungen maßgeblich sind.
Verbindungen, die die Wechselwirkung eines Gens stören, das für ein hierin identifiziertes PRO-Polypeptid kodiert, und andere intra- oder extrazelluläre Komponenten können wie folgt getestet werden: üblicherweise wird ein Reaktionsgemisch, das das Produkt des Gens und die intra- oder extrazelluläre Komponente enthält, unter Bedingungen und über eine Zeitspanne hinweg, die die Wechselwirkung und Bindung der zwei Produkte ermöglichen, hergestellt. Um die Fähigkeit der Kandidatenverbindung zu testen, Bindung zu inhibieren, wird die Reaktion in Abwesenheit und in Gegenwart der Testverbindung laufen gelassen. Zusätzlich kann ein Placebo zu einem dritten Reaktionsgemisch zugesetzt werden, um als positive Kontrolle zu dienen. Die Bindung (Komplexbildung) zwischen der Testverbindung und der intra- oder extrazellulären Komponente, die im Gemisch vorhanden ist, wird wie hierin zuvor beschrieben beobachtet. Die Bildung eines Komplexes in der/den Kontrollreaktion(en), jedoch nicht im Reaktionsgemisch, das die Testverbindung enthält, weist darauf hin, dass die Testverbindung die Wechselwirkung der Testverbindung und seinem Reaktionspartner stört.
Um auf Antagonisten zu testen, kann das PRO-Polypeptid gemeinsam mit der auf eine bestimmte Aktivität zu screenenden Verbindung zu einer Zelle zugesetzt werden, und die Fähigkeit der Testverbindung, Aktivität von Interesse in Gegenwart des PRO-Polypeptids zu inhibieren, weist darauf hin, dass die Verbindung ein Antagonist des PRO-Polypeptids ist. Alternativ dazu können Antagonisten durch Kombinieren des PRO-Polypeptids und eines potenziellen Antagonisten mit membrangebundenen PRO-Polypeptid-Rezeptoren oder rekombinanten Rezeptoren unter geeigneten Bedingungen für einen kompetitiven Inhibitionstest nachgewiesen werden. Das PRO-Polypeptid kann beispielsweise durch Radioaktivität markiert werden, sodass die Anzahl an PRO-Polypeptidmolekülen, die an den Rezeptor gebunden sind, verwendet werden kann, um die Wirksamkeit des potenziellen Antagonisten zu bestimmen. Das für den Rezeptor kodierende Gen kann mittels zahlreicher verschiedener Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, beispielsweise durch Liganden-Panning und FACS-Sortieren, identifiziert werden. Coligan et al., Current Protocols in Immunl. 1(2), Kapitel 5 (1991). Vorzugsweise wird Expressionsklonieren verwendet, worin polyadenylierte RNA aus einer Zelle hergestellt wird, die auf das PRO-Polypeptid reagiert, und eine cDNA-Bibliothek, die aus dieser RNA geschaffen wird, wird in Pools aufgeteilt und verwendet, um COS-Zellen oder andere Zellen zu transfizieren, die auf das PRO-Polypeptid nicht reagieren. Transfizierte Zellen, die auf Glasobjektträgern gezüchtet werden, werden markiertem PRO-Polypeptid ausgesetzt. Das PRO-Polypeptid kann mittels zahlreicher verschiedener Mittel markiert werden, einschließlich lodierung oder Einbindung einer Erkennungsstelle für eine ortsspezifische Proteinkinase. Nach -Fixation und Inkubation werden die Objektträger autographischer Analyse unterzogen. Positive Pools werden identifiziert, und Sub-Pools werden hergestellt und unter Verwendung eines interaktiven Sub-Pooling- und Re-Screening-Verfahrens neuerlich transfiziert, woraus schließlich ein einzelner Klon resultiert, der für den mutmaßlichen Rezeptor kodiert.
Als ein alternativer Ansatz für Rezeptoridentifikation kann markiertes PRO-Polypeptid mit Zellmembran oder mit Extraktpräparaten, die das Rezeptormolekül exprimieren, photoaffinitätsgebunden sein. Vernetztes Material wird durch PAGE aufgelöst und ein Röntgenfilm wird damit belichtet. Der markierte Komplex, der den Rezeptor enthält, kann ausgeschnitten, in Peptidfragmente aufgelöst und Protein-Mikrosequenzierung unterzogen werden. Die aus der Mikrosequenzierung erhaltene Aminosäuresequenz würde verwendet werden, um eine Reihe an degenerierten Oligonucleotidsonden zu entwerten, um eine cDNA-Bibliothek zu screenen, um das für den mutmaßlichen Rezeptor kodierende Gen zu identifizieren.
In einem anderen Test für Antagonisten würden Säugetierzellen oder ein Membranpräparat, das den Rezeptor exprimiert, mit markiertem PRO-Polypeptid in Gegenwart der Kandidatenverbindung inkubiert werden. Die Fähigkeit der Verbindung, diese Wechselwirkung zu steigern oder zu blockieren, könnte dann gemessen werden.
Spezifischer Beispiele für potenzielle Antagonisten umfassen ein Oligonucleotid, das sich an die Fusionen von Immunglobulin mit PRO-Polypeptid bindet, und insbesondere Antikörper, die, ohne dies als einschränkende Definition zu betrachten, poly- und monoklonale Antikörper und Antikörperfragmente, einkettige Antikörper, antiidiotypische Antikörper und chimäre oder humanisierte Versionen solcher Antikörper oder Fragmente, sowie menschliche Antikörper und Antikörperfragmente umfassen. Alternativ dazu kann ein potenzieller Antagonist ein eng verwandtes Protein sein, beispielsweise eine mutierte Form des PRO-Polypeptids, das den Rezeptor erkennt, jedoch keine Wirkung verleiht und somit die Wirkung des PRO-Polypeptids kompetitiv inhibiert.
Ein anderer potenzieller PRO-Polypeptid-Antagonist ist ein Antisense-RNA- oder – DNA-Konstrukt, das unter Verwendung von Antisense-Technologie hergestellt wurde, worin z.B. ein Antisense-RNA- oder -DNA-Molekül so wirkt, dass es die Translation von mRNA durch Hybridisierung an Target-mRNA und Prävention von Proteintranslation direkt blockiert. Antisense-Technologie kann verwendet werden, um Genexpression durch Tripelhelix-Bildung oder Antisense-DNA oder -RNA zu steuern, wobei beide Verfahren auf der Bindung eines Polynucleotids an DNA oder RNA basieren. Der 5'-Kodierabschnitt der Polynucleotidsequenz, die für die reifen PRO-Polypeptide hierin kodiert, wird beispielsweise verwendet, um ein Antisense-RNA-Oligonucleotid mit einer Länge von etwa 10 bis 40 Basenpaaren zu entwerfen. Ein DNA-Oligonucleotid ist so entworfen, dass es zu einer Region des Gens, die in Transkription eingebunden ist (Tripelhelix – siehe Lee et al., Nucl. Acids Res. 6, 3073 (1979); Cooney et al., Science 241, 456 (1988); Dervan et al., Science 251, 1360 (1991)), komplementär ist, wodurch Transkription und Produktion des PRO-Polypeptids unterbunden werden. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert an die mRNA in vivo und blockiert die Translation des mRNA-Moleküls in das PRO-Polypeptid (Antisense – Okano, Neurochem. 56, 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press: Boca Raton, FL (1988)). Die zuvor beschriebenen Oligonucleotide können auch Zellen zugeführt werden, sodass die Antisense-RNA oder -DNA in vivo exprimiert werden kann, um Produktion des PRO-Polypeptids zu inhibieren. Wird Antisense-DNA verwendet, so werden Oligodesoxyribonucleotide, abstammend aus der Translationsinitiationsstelle, z.B, zwischen etwa -10- und +10-Positionen der Target-Gennucleotidsequenz, bevorzugt.
Potenzielle Antagonisten umfassen kleine Moleküle, die sich an die aktive Stelle, die Rezeptorbindungsstelle oder den Wachstumsfaktor oder andere relevante Bindungsstellen des PRO-Polypeptids binden und dadurch die normale biologische Aktivität des PRO-Polypeptids blockieren. Beispiele für kleine Moleküle umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, kleine Peptide oder peptidähnliche Moleküle, vorzugsweise lösliche Peptide, und synthetische, organische oder anorganische Nicht-Peptidyl-Verbindungen.
Ribozymen sind enzymatische RNA-Moleküle, die in der Lage sind, die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren. Ribozymwirkung durch sequenzspezifische Hybridisierung an die komplementäre Target-RNA, gefolgt von endonucleolytischer Spaltung. Spezifische Ribozym-Spaltungsstellen innerhalb eines potenziellen RNA-Targets können durch bekannte Verfahren identifiziert werden. Für nähere Details, siehe z.B. Rossi, Current Biology 4, 469-471 (1994), und die PCT-Veröffentlichungs-Nr. WO 97/33551 (veröffentlicht am 18. September 1997).
Nucleinsäuremoleküle in Tripelhelix-Formation, zur Inhibition von Transkription verwendet, sollten einzelsträngig und aus Desoxynucleotiden zusammengesetzt sein. Die Basenzusammensetzung dieser Oligonucleotide ist so entworfen, dass sie Tripelhelix-Bildung gemäß den Hoogsteen-Basenpaarungsregeln fördert, die im Allgemeinen große Abschnitte von Purinen oder Pyrimidinen an einem Strang eines Duplex erfordern. Nähere Details hierzu sind z.B. in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551, s.o., zu finden.
Diese kleinen Moleküle können durch jeden beliebigen oder mehrere beliebige Screeningtests, die hierin zuvor erläutert wurden, und/oder durch andere Screeningverfahren, die Fachleuten bekannt sind, identifiziert werden.
PRO189 kann in Tests mit W01A6.1 von C. Elegans, Phosphodiesterasen, Transportern und Proteinen, die sich an Fettsäuren binden, verwendet werden, um die relativen Aktivitäten von PRO189 gegen diese Proteine zu bestimmen. Die Resultate können demgemäß eingesetzt werden.
F. Anti-PRO-Antikörper
Die vorliegende Erfindung stellt weiters Anti-PRO-Antikörper bereit. Beispiele für Antikörper umfassen polyklonale, monoklonale, humanisierte, bispezifische und Heterokonjugat-Antikörper.
1. Polyklonale Antikörper
Die Anti-PRO-Antikörper können polyklonale Antikörper umfassen. Verfahren zur Herstellung polyklonaler Antikörper sind Fachleuten bekannt. Polyklonale Antikörper können in einem Säugetier, beispielsweise durch eine oder mehrere Injektionen eines immunisierenden Mittels und, sofern gewünscht, eines Adjuvans, gezüchtet werden. Typischerweise werden das immunisierende Mittel und/oder das Adjuvans in das Säugetier mittels subkutaner oder intraperitonealer Mehrfachinjektionen injiziert. Das immunisierende Mittel umfasst das PRO-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon. Es kann nützlich sein, das immunisierende Mittel an ein Protein zu konjugieren, das dafür bekannt ist, im zu immunisierenden Säugetier immunogen zu sein. Beispiele für solche immunogenen Proteine umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin und Sojabohnentrypsin-Inhibitor. Beispiele für Adjuvanzien, die verwendet werden können, umfassen komplettes Freundsches Adjuvans und MPL-TDM-Adjuvans (Monophosphoryl-Lipid A, synthetisches Trehalose-Dicorynomycolat). Die Arbeitsvorschrift zur Immunisierung kann von Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren ausgewählt werden.
2. Monoklonale Antikörper
Die Anti-PRO-Antikörper können, alternativ dazu, monoklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können unter Verwendung von Hybridomverfahren, wie beispielsweise jenen, die von Kohler & Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschrieben werden, hergestellt werden. In einem Hybridomverfahren wird eine Maus, ein Hamster oder ein anderes, geeignetes Wirtstier typischerweise mit einem Immunisierungsmittel immunisiert, um Lymphozyten anzuregen, die Antikörper produzieren oder in der Lage sind, Antikörper zu produzieren, die sich spezifisch an das immunisierende Mittel binden. Alternativ dazu können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden.
Das immunisierende Mittel umfasst typischerweise das PRO-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon. Im Allgemeinen werden entweder periphere Blutlymphozyten ("PBLs") verwendet, sofern Zellen menschlichen Ursprungs gewünscht sind, oder Milzzellen oder Lymphknotenzellen, sofern nichtmenschliche Säugetierzellen erwünscht sind. Die Lymphozyten werden dann mit einer sich unbegrenzt vermehrenden Zelllinie unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, wie beispielsweise Polyethylenglykol, fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 59.103 (1986)). Sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind üblicherweise transformierte Säugetierzellen, insbesondere Myelomzellen, die von Nagetieren, Rindern oder Menschen abstammen. Üblicherweise werden Ratten- oder Mausmyelomzelllinien verwendet. Die Hybridomzellen können in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden, das vorzugsweise eine oder mehr Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der nichtfusionierten, sich unbegrenzt vermehrenden Zellen inhibieren. Fehlt beispielsweise den parentalen Zellen das Enzym Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT), so umfasst das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin ("HAT-Medium"), Substanzen, die das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen unterbindet.
Bevorzugte, sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind jene, die wirksam fusionieren, stabile Expression auf hohem Niveau von Antikörper durch die ausgewählten Antikörper-produzierenden Zellen unterstützt und auf ein Medium wie z.B. das HAT-Medium empfindlich sind. Noch bevorzugtere, sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind murine Myelomlinien, die beispielsweise vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, und bei der Type Culture Collection, Manassas, Virginia, erhalten werden können. Menschliche Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelom-Zellinien wurden ebenfalls bereits für die Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern beschrieben (Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibady Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, 51-63 (1987)).
Das Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen kultiviert werden, kann dann auf die Gegenwart von monoklonalen Antikörpern, die gegen PRO gerichtet sind, getestet werden. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität monoklonaler Antikörper, die durch die Hybridomzellen gebildet werden, durch Immunfällung oder durch einen Invitro-Bindungstests, wie z.B. Radioimmuntest (RIA) oder enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA) bestimmt. Solche Verfahren und Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise durch die Scatchard-Analyse von Munson & Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt.
Nachdem die gewünschten Hybridomzellen identifiziert wurden, können die Klone durch Grenzwert-Verdünnungsverfahren subkloniert und mittels herkömmlicher Verfahren gezüchtet werden (Goding, s.o.). Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck umfassen beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle's Medium und RPMI-1640-Medium. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in vivo als Ascites in einem Säugetier gezüchtet werden.
Die von den Subklonen sekretierten monoklonalen Antikörper können aus dem Kulturmedium oder der Ascitesflüssigkeit durch herkömmliche Immunglobulin-Reinigungsverfahren wie z.B. Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie isoliert oder gereinigt werden.
Die monoklonalen Antikörper können auch durch rekombinante DNA-Verfahren wie beispielsweise jenen, die im US-Patent Nr. 4.816.567 beschrieben werden, gebildet werden. DNA, die für die monoklonalen Antikörper der Erfindung kodiert, kann leicht unter Verwendung herkömmlicher Verfahren (z.B. unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die in der Lage sind, sich spezifisch an Gene zu binden, die für die schweren und leichten Ketten von murinen Antikörpern kodieren) isoliert und sequenziert werden. Die Hybridomzellen der Erfindung dienen als eine bevorzugte Quelle für solche DNA. Nachdem sie isoliert wurde, kann die DNA in Expressionsvektoren eingeführt werden, die dann in Wirtszellen wie beispielsweise Affen-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zellen oder Myelomzellen transfiziert werden, die sonst Immunglobulinprotein nicht bilden, um die Synthese monoklonaler Antikörper in den rekombinanten Wirtszellen zu erhalten. Die DNA kann auch modifiziert werden, beispielsweise durch Substituieren der Kodiersequenz für menschliche konstante Schwer- und Leichtkettendomänen anstelle der homologen murinen Sequenzen (US-Patent Nr. 4.816.567; Morrison et al., s.o.), oder durch kovalentes Binden der gesamten Kodiersequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid oder eines Teils davon an die Immunglobulin-Kodiersequenz. Solch ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid kann anstelle der konstanten Domänen eines Antikörpers der Erfindung eingesetzt werden, oder es kann anstelle der variablen Domänen einer Antigen-Kombinationsstelle eines Antikörpers der Erfindung eingesetzt werden, um einen chimären zweiwertigen Antikörper zu bilden.
Die Antikörper können einwertige Antikörper sein. Verfahren zur Herstellung einwertiger Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt. Ein Verfahren umfasst beispielsweise rekombinante Expression von Immunglobulinleichtkette und modifizierter Schwerkette. Die Schwerkette ist im Allgemeinen an jedem beliebigen Punkt der Fc-Region trunkiert, um Schwerkettenvernetzung zu unterbinden. Alternativ dazu sind die relevanten Cysteinreste durch einen anderen Aminosäurerest substituiert oder deletiert, um Vernetzung zu vermeiden.
In-vitro-Verfahren sind ebenfalls zur Herstellung einwertiger Antikörper geeignet. Verdau von Antikörpern zur Bildung von Fragmenten, insbesondere Fab-Fragmenten, davon kann unter Verwendung von Routineverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, erfolgen.
3. Menschliche und humanisierte Antikörper
Die Anti-PRO-Antikörper der Erfindung können weiters humanisierte Antikörper oder menschliche Antikörper umfassen. Humanisierte Formen von nicht-menschlichen (z.B. murinen) Antikörpern sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere Antigenbindungs-Subsequenzen von Antikörpern), die Minimalsequenz, abgeleitet von nichtmenschlichem Immunglobulin, enthalten. Humanisierte Antikörper umfassen- menschliche Immunglobuline (Rezipienten-Antikörper), in denen Reste aus einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Rezipienten durch Reste aus einer CDR aus einer nichtmenschlichen Spezies (Donor-Antikörper) wie z.B. Maus, Ratte oder Kaninchen mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt werden. In manchen Fällen werden Fv-Gerüstreste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nichtmenschliche Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können auch Reste umfassen, die weder im Rezipienten-Antikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen zu finden sind. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer, und typischerweise zwei, variable(n) Domäne(n), in denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen eines nichtmenschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene aus einer menschlichen Immunglobulin-Consensussequenz sind. Der humanisierte Antikörper umfasst optimalerweise auch zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jenen eines menschlichen Immunglobulins (Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596 (1992)).
Verfahren zur Humanisierung nicht-menschlicher Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die in ihn aus einer Quelle eingeführt wur den, die nicht-menschlich ist. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden häufig als "Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise aus einer variablen "Import"-Domäne genommen werden. Humanisierung kann im Wesentlichen gemäß dem Verfahren von Winter und Mitarbeitern (Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)), durch Substituieren von Nagetier-CDRs oder CDR-Sequenzen anstelle der entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers erfolgen. Demgemäß sind solche "humanisierte" Antikörper chimäre Antikörper (US-Patent Nr. 4.816.567), worin wesentlich weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies substituiert wurde. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper; in denen manche CDR-Reste und möglicherweise manche FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nagetier-Antikörpern substituiert sind.
Menschliche Antikörper können auch unter Verwendung verschiedener Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, einschließlich Phagendisplay-Bibliotheken (Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)), gebildet werden. Die Verfahren von Cole et al. und Boerner et al. sind auch zur Herstellung menschlicher monoklonaler Antikörper einsetzbar (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 77 (1985) und Boerner et al., J. Immunol. 147(1), 86-95 (1991)). In ähnlicher Weise können menschliche Antikörper durch Einführen menschlicher Immunglobulin-Loci in transgene Tiere, z.B. Mäuse, in denen die endogenen Immunglobulingene teilweise oder vollständig deaktiviert wurden, gebildet werden. Bei Provokation wird die Produktion menschlicher Antikörper beobachtet, die jener, die bei Menschen gesehen wurde, in jeglicher Hinsicht, umfassend Genneuordnung, Assemblierung und Antikörperrepertoire, sehr ähnlich ist. Dieser Ansatz wird beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016 und in den folgenden wissenschaftlichen Publikationen beschrieben: Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368-856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995).
4. Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte, Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall ist eine der Bindungsspezifitäten für das PRO, und die andere ist für jedes beliebige andere Antigen, und vorzugsweise für ein Zelloberflächenprotein oder einen Rezeptor oder eine Rezeptoruntereinheit.
Verfahren zur Bildung bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Üblicherweise basiert die rekombinante Produktion bispezifischer Antikörper auf der Co-Expression von zwei Immunglobulin-Schwerketten/Leichtketten-Paaren, worin die zwei schweren Ketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen (Milstein & Cuello, Nature 305, 537-539 (1983)). Aufgrund der Auswahl an Immunglobulinschwer- und -leichtketten nach dem Zufallsprinzip produzieren diese Hybridome (Quadrorne) ein potenzielles Gemisch aus zehn verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls erfolgt üblicherweise durch Affinitätschromatographieschritte. Ähnliche Verfahren sind in der WO 93/08829, veröffentlicht am 13. Mai 1993 und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655-3649 (1991), geoffenbart.
Variable Antikörperdomänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Kombinationsstellen) können an konstante Immunglobulindomänensequenzen fusioniert werden Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten Immunglobulinschwerkettendomäne, die zumindest einen Teil der Gelenks-, CH2- und CH3-Regionen umfasst. Es wird bevorzugt, dass die erste konstante Schwerkettenregion (CH1) die Stelle, die für Leichtkettenbindung erforderlich ist, zumindest in einer der Fusionen enthält. DNAs, die für die Immunglobulinschwerketten-Fusionen und, sofern gewünscht, für die Immunglobulinleichtkette kodieren, werden in getrennte Expressionsvektoren insertiert und in einen geeigneten Wirtsorganismus co-transfiziert.
Nähere Details zur Bildung bispezifischer Antikörper sind in Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986), zu finden.
Gemäß einem anderen Ansatz, der in der WO 96/27011 beschrieben wird, kann die Schnittstelle zwischen einem Paar von Antikörpermolekülen gentechnisch verändert werden, um den Prozentsatz an Heterodimeren, die aus rekombinanter Zellkultur gewonnen werden, zu maximieren. Die bevorzugte Grenzfläche umfasst zumindest einen Teil der CH3-Region einer konstanten Antikörperdomäne. In diesem Verfahren werden eine oder mehrere kurze Aminosäureseitenketten von der Schnittstelle des ersten Antikörpermoleküls durch längere Seitenketten (z.B. Tyrosin oder Tryptophan) ersetzt. Kompensations-"Hohlräume" identischer oder ähnlicher Größe wie die lange(n) Seitenkette(n) werden an der Schnittstelle des zweiten Antikörpermoleküls durch Ersetzen langer Aminosäureseitenketten durch kürzere (z.B. Alanin oder Threonin) geschaffen. Dies liefert einen Mechanismus zur Steigerung der Ausbeute an Heterodimer gegenüber nicht gewünschten Endprodukten wie z.B. Homodimeren.
Bispezifische Antikörper können als Volllängen-Antikörper oder Antikörperfragmente (z.B. F(ab')₂-bispezifische Antikörper) hergestellt werden. Verfahren zur Bildung bispezifischer Antikörper aus Antikörperfragmenten wurden in der Literatur bereits beschrieben. Bispezifische Antikörper können beispielsweise unter Verwendung chemischer Bindung hergestellt werden. Brennan et al., Science 229, 81 (1985), beschreiben ein Verfahren, worin intakte Antikörper proteolytisch gespalten werden, um F(ab')₂-Fragmente zu bilden. Diese Fragmente werden in Gegenwart des Dithiol-Komplexbildners Natriumarsenit reduziert, um benachbarte Dithiole zu stabilisieren und intermolekulare Disulfidbildung zu unterbinden. Die gebildeten Fab'-Fragmente werden dann zu Thionitrobenzoat- (TNB-) Derivaten umgesetzt. Eines der Fab'-TNB-Derivate wird dann zum Fab'-Thiol durch Reduktion mit Mercaptoethylamin rückgewandelt und mit einer äquimolaren Menge des anderen Fab'-TNB-Derivats vermischt, um den bispezifischen Antikörper zu bilden. Die gebildeten bispezifischen Antikörper können als Mittel für selektive Immobilisierung von Enzymen verwendet werden.
Fab'-Fragmente können direkt aus E. coli umgesetzt und chemisch aneinander gebunden werden, um bispezifische Antikörper zu bilden. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217-225 (1992), beschreiben die Produktion eines vollständig humanisierten bispezifischen Antikörper-F(ab')₂-Moleküls. Jedes Fab'-Fragment wurde getrennt aus E. coli sekretiert und direkter chemischer Bindung in vitro unterzogen, um den bispezifischen Antikörper zu bilden. Der so gebildete bispezifische Antikörper war in der Lage, sich an Zellen zu binden, die ErbB2-Rezeptor und normale menschliche T-Zellen überexprimieren sowie die lytische Aktivität menschlicher zytotoxischer Lymphozyten gegen menschliche Brusttumor-Targets auslösen.
Verschiedene Verfahren zur Herstellung und Isolierung bispezifischer Antikörperfragmente direkt aus rekombinanter Zellkultur wurden ebenfalls bereits beschrieben. Bispezifische Antikörper wurden beispielsweise unter Verwendung von Leucin-Zippern gebildet. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5), 1547-1553 (1992). Die Leucin-Zipper-Peptide aus den Fos- und Jun-Proteinen wurden an die Fab'-Abschnitte von zwei verschiedenen Antikörpern durch Genfusion gebunden. Die Antikörper-Homodimere wurden an der Gelenksregion reduziert, um Monomere zu bilden, und anschließend reoxidiert, um die Antikörper-Heterodimere zu bilden. Dieses Verfahren kann auch zur Bildung von Antikörper-Homodimeren verwendet werden. Die "Diabody"-Technologie, die von Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448 (1993), beschrieben wird, liefert einen alternativen Mechanismus zur Herstellung bispezifischer Antikörperfragmente. Die Fragmente umfassen eine variable Schwerkettendomäne (V_H), die über einen Linker mit einer variablen Leichtkettendomäne (V_L) verbunden ist, der zu kurz ist, um Paarung zwischen den zwei Domänen an derselben Kette zu ermöglichen. Demgemäß sind die V_H- und V_L-Domänen eines Fragments gezwungen, mit den komplementären V_L- und V_H-Domänen eines anderen Fragments Paare zu bilden, wodurch zwei Antigen-Bindungsstellen gebildet werden. Eine andere Vorgehensweise zur Bildung bispezifischer Antikörperfragmente unter Verwendung einkettiger Fv- (sFv-) Dimere wurde ebenfalls bereits erläutert. Siehe Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994).
Antikörper mit mehr als zwei Valenzen werden auch in Betracht gezogen. Trispezifische Antikörper können hergestellt werden. Tuu et al., J. Immunol. 147, 60 (1991).
Beispielhafte bispezifische Antikörper können sich an zwei verschiedene Epitope eines bestimmten PRO-Polypeptids der vorliegenden Erfindung binden. Alternativ dazu kann ein Anti-PRO-Polypeptid-Arm mit einem Arm kombiniert werden, der sich an ein Triggermolekül an einem Leukozyten wie einem T-Zell-Rezeptormolekül (z.B. CD2, CD3, CD28 oder B7) oder Fc-Rezeptoren für IgG (FcγR), wie FcγRI (CD64), FcγRII CD32) und FcγRIII (CD16) bindet, um zelluläre Abwehrmechanismen auf die Zelle zu fokussieren, die das bestimmte PRO-Polypeptid exprimiert. Bispezifische Antikörper können auch verwendet werden, um zytotoxische Mittel gegen Zellen, die ein bestimmtes PRO-Polypeptid exprimieren, zu lokalisieren. Diese Antikörper besitzen einen PRO-Bindungsarm und einen Arm, der sich an ein zytotoxisches Mittel oder einen Radionuklid-Komplexbildner, wie EOTUBE, DPTA, DOTA oder TETA, bindet. Ein anderer bispezifischer Antikörper von Interesse bindet das PRO-Polypeptid und bindet weiters Gewebefaktor (TF).
5. Heterokonjugat-Antikörper
Heterokonjugat-Antikörper liegen auch im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Heterokonjugat-Antikörper setzen sich zusammen aus zwei kovalent verbundenen Antikörpern. Solche Antikörper wurden beispielsweise vorgeschlagen, um auf Immunsystemzellen gerichtet zu werden (US-Patent Nr. 4.676.980), sowie zur Behandlung von HIV-Infektion (WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089 ). Es wird erwogen, dass die Antikörper in vitro unter Verwendung von auf dem Gebiet der Proteinsynthesechemie bekannten Verfahren, einschließlich jener, die Vernetzer einbinden, hergestellt werden können. Immunotoxine können beispielsweise unter Verwendung einer Disulfidaustauschreaktion oder durch Bildung einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele für geeignete Reagenzien für diesen Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat und jene, die beispielsweise im US-Patent Nr. 4.676.980 geoffenbart sind.
6. Bearbeitung der Effektorfunktion
Es kann wünschenswert sein, den Antikörper der Erfindung bezüglich seiner Effektorfunktion zu modifizieren, um z.B. die Wirksamkeit des Antikörper bei der Behandlung von Krebs zu steigern. Cysteinrest(e) kann/können beispielsweise in die Fc-Region eingeführt werden, wodurch Zwischenketten-Disulfidbindungsbildung in dieser Region ermöglicht wird. Der so gebildete, homodimere Antikörper kann verbesserte Internalisierungsfähigkeit und/oder gesteigertes, komplementvermitteltes Zelltöten und Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) aufweisen. Siehe Caron et al., J. Exp. Med. 176, 1191-1195 (1992) und Shopes, J. Immunol. 148, 2918-2922 (1992). Homodimere Antikörper mit gesteigerter Anti-Tumor-Aktivität können auch unter Verwendung bifunktioneller Vernetzer hergestellt werden, wie in Wolff et al., Cancer Research 53, 2560-2565 (1993), beschrieben wird. Alternativ dazu kann ein Antikörper gentechnisch verändert werden, der zwei Fc-Regionen aufweist, und kann dadurch gesteigerte Komplementlyse- und ADCC-Fähigkeiten aufweisen. Siehe Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3, 219-230 (1989).
7. Immunkonjugate
Die Erfindung betrifft auch Immunkonjugate, die einen Antikörper umfassen, der an ein zytotoxisches Mittel wie z.B. ein chemotherapeutisches Mittel, Toxin (z.B. ein enzymatisch aktives Toxin bakteriellen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder von Pilzen abstammend, oder Fragmente davon), oder ein radioaktives Isotop (z.B. Radiokonjugat) konjugiert ist.
Chemotherapeutische Mittel, die zur Bildung solcher Immunkonjugate nützlich sind, wurden bereits oben beschrieben. Enzymatisch aktive Toxine und Fragmente davon, die verwendet werden können, umfassen Diphtherie-A-Kette, nicht-bindende aktive Fragmente von Diphtherie-Toxin, Exotoxin-A-Kette (aus Pseudomonas aeruginosa), Ricin-A-Kette, Abrin-A-Kette, Modeccin-A-Kette, α-Sarcin, Aleurites-fordii-Proteine, Dianthin-Proteine, Phytolaca-americana-Proteine (PAPI, PAPII und PAP-S), Momordica-charantia-Inhibitor, Curcin, Crotin, Sapaonaria-officinafis-Inhibitor, Gelonin, Mito gellin, Restrictocin, Phenomycin, Enomycin und Tricothecene. Zahlreiche verschiedene Radionuclide sind zur Herstellung von radioaktiv konjugierten Antikörpern erhältlich. Beispiele umfassen ³¹²Bi,¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y und ¹⁸⁶Re.
Konjugate des Antikörpers und zytotoxischen Mittels werden unter Verwendung zahlreicher verschiedener bifunktioneller Protein-Bindungsmittel wie z.ß. von N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP), Iminothiolan (IT), bifunktionellen Derivaten von Imidoestern (wie Dimethyladipimidat HCl), aktiven Estern (wie Disuccinimidylsubstrat), Aldehyden (wie Glutaraldehyd), Bis-azido-Verbindungen (wie Bis(p-azidobenzoyl)hexandiamin), Bis-diazonium-Derivaten (wie Bis-(p-diazoniumbenzoyl)ethylendiamin); Diisocyanaten (wie Toluol-2,6-diisocyanat) und bis-aktiven Fluorverbindungen (wie 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol) gebildet werden. Ein Ricin-Immunotoxin kann wie in Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987), beschrieben hergestellt werden. C14-markierte 1-Isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylentriaminpentaessigsäure (MX-DTPA) ist ein Beispiel für einen Chelatbildner zur Konjugation von Radionuclid an den Antikörper. Siehe die WO 94/11026.
In einer anderen Aminosäuresequenz kann der Antikörper zur Verwendung bei Tumor-Pretargeting an einen "Rezeptor" (wie Streptavidin) konjugiert werden, worin das Antikörper-Rezeptor-Konjugat dem Patienten verabreicht wird, gefolgt von der Entfernung von nichtgebundenem Konjugat aus dem Blutkreislauf unter Verwendung eines Klärungsmittels und anschließender Verabreichung eines "Liganden" (z.B. Avidin), der an ein zytotoxisches Mittel (z.B. ein Radionucleotid) konjugiert ist.
8. Immunliposomen
Die hierin geoffenbarten Antikörper können auch als Immunliposomen formuliert werden. Liposomen, die den Antikörper enthalten, werden mittels nach dem Stand der Technik bekannter Verfahren hergestellt, wie beispielsweise in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980); und in den US-Patenten Nr. 4.485.045 und 4.544.545 beschrieben wird.
Liposomen mit erhöhten Clearance-Zeiten sind im US-Patent Nr. 5.013.556 beschrieben.
Besonders nützliche Liposomen können durch das Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren mit einer Lipidzusammensetzung, die Phosphatidylcholin, Cholesterin und PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) umfasst, gebildet werden. Liposomen werden durch Filter definierter Porengröße extrudiert, um Liposomen mit dem gewünschten Durchmesser zu ergeben. Fab'-Fragmente des Antikörpers der vorliegenden Erfindung können an die Liposomen, wie in Martin et al., J. Biol. Chem. 257, 286-288 (1982), beschrieben, mittels einer Disulfid-Austauschreaktion konjugiert werden. Ein chemotherapeutisches Mittel (wie z.B. Doxorubicin) ist gegebenenfalls im Liposom enthalten. Siehe Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19), 1484 (1989).
9. Pharmazeutische Zusammensetzungen von Antikörpern
Antikörper, die ein hierin definiertes PRO-Polypeptid spezifisch binden, sowie andere Moleküle, die durch die hierin zuvor geoffenbarten Screening-Tests identifiziert werden, können zur Behandlung verschiedener Erkrankungen in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden.
Ist das PRO-Polypeptid intrazellulär und werden ganze Antikörper als Inhibitoren verwendet, so werden internalisierende Antikörper bevorzugt. Lipofektionen oder Liposome können jedoch auch verwendet werden, um den Antikörper oder ein Antikörperfragment zu den Zellen zuzuführen. Werden Antikörperfragmente verwendet, so wird das kleinste Inhibitionsfragment, das sich spezifisch an die Bindungsdomäne des Target-Proteins bindet, bevorzugt. Basierend auf den Sequenzen variabler Regionen eines Antikörpers beispielsweise können Peptidmoleküle entworten werden, die die Fähigkeit beibehalten, die Target-Proteinsequenz zu binden. Solche Peptide können chemisch synthetisiert und/oder durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden. Siehe z.B. Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993). Die Formulierung hierin kann auch mehr als eine aktive Verbindung enthal ten, je nachdem, was für die bestimmte, zu behandelnde Indikation erforderlich ist, vorzugsweise jene mit komplementären Aktivitäten, die sich gegenseitig nicht negativ beeinflussen. Alternativ dazu oder zusätzlich dazu kann die Zusammensetzung ein Mittel umfassen, das ihre Funktion fördert, wie beispielsweise ein zytotoxisches Mittel, Cytokin, chemotherapeutisches Mittel oder Wachstums-inhibierendes Mittel. Solche Moleküle sind geeigneterweise in Kombination in Mengen vorhanden, die für die beabsichtigten Zwecke wirksam sind.
Die aktiven Bestandteile können auch in Mikrokapseln eingefangen werden, die beispielsweise durch Koazervierungsverfahren oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden, beispielsweise Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly-(methylmethacrylat)-Mikrokapseln in kolloidalen Wirkstofffreisetzungssystemen (beispielsweise Liposomen, Albuminmikroperlen, Mikroemulsionen, Nano-Teilchen und Nano-Kapslen) oder in Makroemulsionen. Solche Verfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, s.o., geoffenbart.
Die Formulierungen, die für In-vivo-Verabreichung vorgesehen sind, müssen steril sein. Dies kann leicht durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen erreicht werden.
Retard-Präparate können hergestellt werden. Geeignete Beispiele für Retard-Präparate umfassen semipermeable Matrices von festen hydrophoben Polymeren, die den Antikörper enthalten, worin die Matrices als Formartikeln, z.B. Folien oder Mikrokapseln, vorliegen. Beispiele für Retard-Matrices umfassen Polyester, Hydrogele (beispielsweise Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat, nichtabbaubares Ethylenvinylacetat, abbaubares Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer wie LUPRON DEPOT^TM (injizierbare Mikroperlen, bestehend aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat) und Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure. Während Polymere wie Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen innerhalb von 100 Tagen ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine über kürzere Zeitspannen hinweg frei. Bleiben eingekapselte Antikörper für längere Zeit im Körper, so können sie infolge der Aussetzung gegenüber Feuchtigkeit bei 37 °C denaturieren oder aggregieren, was zu einem Verlust an biologischer Aktivität und möglichen Veränderungen der Immunogenität führt. Zweckmäßige Vorgehensweisen können je nach eingebundenem Mechanismus zur Stabilisierung entwickelt werden. Wird der Aggregationsmechanismus als intermolekulare S-S-Bindungsbildung durch Thio-Disulfid-Austausch erkannt, so kann Stabilisierung durch Modifikation von Sulfhydrylresten, Lyophilisierung aus sauren Lösungen, Steuerung des Feuchtigkeitsgehalts, unter Verwendung geeigneter Additive, und Entwicklung spezifischer Polymermatrix-Zusammensetzungen erreicht werden.
G. Anwendungen von Anti-PRO-Antikörpern
Die Anti-PRO-Antikörper der Erfindung haben verschiedene Einsatzbereiche. Anti-PRO-Antikörper können beispielsweise in diagnostischen Tests für PRO, z.B. zur Detektion seiner Expression in bispezifischen Zellen, Geweben oder Serum, verwendet werden. Verschiedene diagnostische Testverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, können verwendet werden, wie beispielsweise kompetitive Bindungstests, direkte oder indirekte Sandwichtests und Immunfällungstests, die entweder in heterogenen oder homogenen Phasen durchgeführt werden (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., 147-158 (1987)). Die in den Diagnosetests verwendeten Antikörper können mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert werden. Die nachweisbare Gruppierung sollte in der Lage sein, entweder direkt oder indirekt, ein nachweisbares Signal zu erzeugen. Die nachweisbare Gruppierung kann beispielsweise ein Radioisotop wie z.B. ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I, eine fluoreszierende oder chemolumineszierende Verbindung, wie z.B. Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin, oder ein Enzym wie alkalische Phosphatase, β-Gafactosidase oder Meerrettichperoxidase sein. Jedes beliebige Verfahren, das auf dem Gebiet der Erfindung zur Konjugation des Antikörpers an die nachweisbare Gruppierung bekannt ist, kann verwendet werden, einschließlich jener Verfahren, die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982), beschrieben werden.
Anti-PRO-Antikörper sind auch für die Affinitätsreinigung von PRO aus rekombinanter Zellkultur oder aus natürlichen Quellen nützlich. In diesem Verfahren werden die Antikörper gegen PRO an einem geeigneten Träger, wie beispielsweise Sephadex-Harz oder Filterpapier, unter Einsatz von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren immobilisiert. Die immobilisierten Antikörper werden dann mit einer Probe kontaktiert, die das zu reinigende PRO enthält, und hiernach wird der Träger mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen, das im Wesentlichen das gesamte Material in der Probe unter Ausnahme von PRO entfernt, das an den immobilisierten Antikörper gebunden ist. Schließlich wird der Träger mit einem anderen geeigneten Lösungsmittel gewaschen, das das PRO aus dem Antikörper freisetzt.
Die folgenden Beispiele werden ausschließlich zur Veranschaulichung bereitgestellt und sind in keiner Weise als Einschränkung des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung zu betrachten.
BEISPIELE
Im Handel erhältliche Reagenzien, auf die in den Beispielen Bezug genommen wird, wurden, außer anders angegeben, gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die in den folgenden Beispielen und in der gesamten Beschreibung durch ATCC-Zugriffsnummern identifizierten Zellen stammen aus der American Type Culture Collection, Manassas, VA.
BEISPIEL 1: Screenen auf Homologie extrazellulärer Domänen, um neue Polypeptide und cDNA, die dafür kodiert, zu identifizieren
Die Sequenzen extrazellulärer Domänen (ECD) (einschließlich der Sekretions-Signalsequenz, sofern eine vorhanden ist) aus etwa 950 bekannten sekretierten Proteinen aus der öffentlichen Swiss-Prot-Datenbank wurden verwendet, um EST-Datenbanken zu testen. Die EST-Datenbanken umfassten öffentliche Datenbanken (z.B. Dayhoff, GenBank) und private Datenbanken (z.B. LIFESEQ^TM, Incyte Pharmaceuti cals, Palo Alto, CA). Die Suche wurde unter Verwendung des Computerprogramms WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996)) als Vergleich der ECD-Proteinsequenzen mit einer 6-Raster-Translation der EST-Sequenzen durchgeführt. Jene Vergleiche mit einem Blast-Ergebnis von 70 (oder in manchen Fällen von 90) oder mehr, die nicht für bekannte Proteine kodierten, wurden gruppiert und mit dem Programm "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA) zu Conensus-DNA-Sequenzen assembliert.
Unter Verwendung dieses Screens von extrazellulärer Domänenhomologie wurden Consensus-DNA-Sequenzen in Bezug auf die anderen identifizierten EST-Sequenzen unter Verwendung von phrap assembliert. Darüber hinaus wurden die erhaltenen Consensus-DNA-Sequenzen häufig (jedoch nicht immer) unter Verwendung wiederholter Zyklen von WU-BLAST-2 und phrap verlängert, um die Consensus-Sequenz unter Verwendung der zuvor erläuterten Quellen von EST-Sequenzen so weit wie möglich zu verlängern.
Basierend auf den wie zuvor beschrieben erhaltenen Consensus-Sequenzen wurden anschließend Oligonucleotide synthetisiert und verwendet, um mittels PCR eine cDNA-Bibliothek zu identifizieren, die die Sequenz von Interesse enthielt, sowie zur Verwendung als Sonden eingesetzt, um einen Klon der Volllängen-Kodiersequenz für ein PRO-Polypeptid zu isolieren. Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer liegen im Allgemeinen im Bereich von 20 bis 30 Nucleotiden und sind häufig so entworfen, dass sie ein PCR-Produkt mit einer Länge von etwa 100-1.000 bp ergeben. Die Sondensequenzen weisen typischerweise eine Länge von 40-55 bp auf. In manchen Fällen werden zusätzliche Oligonucleotide synthetisiert, wenn die Consensus-Sequenz länger als etwa 1-1,5 kbp ist. Um mehrere Bibliotheken für einen Volllängen-Klon zu screenen, wurde DNA aus den Bibliotheken mittels PCR-Amplifikation, wie von Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology beschrieben wurde, mit dem PCR-Primerpaar gescreent. Eine positive Bibliothek wurde dann verwendet, um Klone, die für das Gen von Interesse kodieren, unter Verwendung des Sonden-Oligonucleotids und eines der Primerpaare zu isolieren.
Die zur Isolierung der cDNA verwendeten cDNA-Bibliotheken wurden mittels herkömmlicher Verfahren unter Verwendung von handelsüblichen Reagenzien wie beispielsweise jenen von Invitrogen, San Diego, CA, konstruiert. Die cDNA wurde mit Oligo dT, das eine NotI-Stelle enthielt, geprimt, mit dem stumpfen Ende an Sall-hemikinasierte Adaptoren gebunden, mit NotI gespalten, mittels Gelelektrophorese auf geeignete Weise klassiert und in einer definierten Ausrichtung in einen geeigneten Klonierungsvektor (wie pRKB oder pRKD; pRK5B ist ein Vorläufer von pRK5D, der ebenfalls die Sfil-Stelle enthält; siehe Holmes et al., Science 253, 1278-1280 (1991)) in die geeigneten XhoI- und NotI-Stellen kloniert.
BEISPIEL 2: Isolierung von cDNA-Klonen durch Amylase-Screenen
1. Herstellung von Oligo-dT-geprimter cDNA-Bibliothek
mRNA wurde aus einem menschlichen Gewebe unter Verwendung von Reagenzien und Arbeitsvorschriften von Invitrogen, San Diego, CA (Fast Track 2) isoliert. Diese RNA wurde verwendet, um eine Ofigo-dT-geprimte cDNA-Bibliothek im Vektor pRK5D unter Verwendung von Reagenzien und Arbeitsvorschriften von Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script Plasmid System), zu bilden. In diesem Verfahren wurde die doppelsträngige cDNA bis zu mehr als 1.000 bp klassiert, und die SalI/NotI-gebundene cDNA wurde in XhoI/NotI-gespaltenen Vektor kloniert. pRK5D ist ein Klonierungsvektor, der eine sp6-Transkriptionsinitiationsstelle aufweist, gefolgt von einer Sfi-Restriktionsenzym-Schnittstelle, die den XhoI/NotI-cDNA-Klonierungsstellen vorangeht.
2. Herstellung einer zufallsgeprimten cDNA-Bibliothek
Eine sekundäre cDNA-Bibliothek wurde gebildet, um die 5'-Enden der primären cDNA-Klone präferenziell zu bilden. Sp6-RNA wurde aus der primären Bibliothek (oben beschrieben) gebildet, und diese RNA wurden verwendet, um eine zufallsgeprimte cDNA-Bibliothek im Vektor pSST-AMY.0 unter Verwendung von Reagenzien und Arbeitsvorschriften von Life Technologies (Super Script Plasmid System, s.o.) zu bilden. In diesem Verfahren wurde die doppelsträngige cDNA bis zu 500- 1.000 bp klassiert, mit dem stumpfen Ende an NotI-Adaptoren gebunden, mit Sfil gespalten und in SfiI/NotI-gespaltenen Vektor kloniert. pSST-AMY.0 ist ein Klonierungsvektor, der einen Hefealkoholdehydrogenase-Promotor aufweist, der den cDNA-Klonierungsstellen und der Maus-Amlyasesequenz (der reifen Sequenz ohne Sekretionssignal) vorangeht, gefolgt von dem Hefealkoholdehydrogenase-Terminator nach den Klonierungsstellen. Somit führen cDNAs, die in diesen Vektor kloniert wurden, der in Raster mit Amylasesequenz fusioniert ist, zur Sekretion von Amylase aus auf geeignete Weise transfizierten Hefekolonien.
3. Transformation und Detektion
DNA aus der in Absatz 2 oben beschriebenen Bibliothek wurde auf Eis gekühlt, dem elektrokompetente DH10B-Bakterien (Life Technologies, 20 ml) zugesetzt wurden. Die Bakterien und das Vektorgemisch wurden dann gemäß den Empfehlungen des Herstellers Elektrophorese unterzogen. Daraufhin wurde SOC-Medium (Life Technologies, 1 ml) zugesetzt, und das Gemisch wurde bei 37 °C 30 min lang inkubiert. Die Transformanten wurden dann auf 20 Standard-150mm-LB-Platten, die Ampicillin enthielten, ausplattiert und 16 h lang (37 °C) inkubiert. Positive Kolonien wurden von den Platten abgeschabt, und die DNA wurde aus dem Bakterienpellet unter Verwendung von Standard-Arbeitsvorschriften, z.B. CsCl-Gradienten, isoliert. Die gereinigte DNA wurde dann gemäß den nachstehenden Hefe-Arbeitsvorschriften verwendet.
Die Hefeverfahren wurden in drei Kategorien eingeteilt: (1) Transformation von Hefe mit dem Plasmid/cDNA-Kombinationsvektor; (2) Detektion und Isolierung von Hefeklonen, die Amylase sekretieren; und (3) PCR-Amplifikation des Inserts direkt aus der Hefekolonie und Reinigung der DNA zur Sequenzierung und weiteren Analyse.
Der verwendete Hefestamm war HD56-5A (ATCC-90785). Dieser Stamm weist den folgenden Genotyp auf: MAT alpha, ura3-52, leu2-3, leu2-112, his3-15, MAL⁺, SUC⁺, GAL⁺. Vorzugsweise können Hefemutanten verwendet werden, die defiziente posttranslationale Stoffwechselwege aufweisen. Solche Mutanten können Translokations-defiziente Allele in sec71, sec72, sec62, wobei sec71 am meisten bevorzugt ist, aufweisen. Alternativ dazu können auch Antagonisten (einschließlich Antisense-Nucleotide und/oder -Liganden), die die normale Funktion dieser Gene stören, andere Proteine, die in diesen posttranslationalen Stoffwechselweg eingebunden sind (z.B. SEC61p, SEC72p, SEC62p, SEC63p, TDJ1p oder SSA1p-4p) oder die Komplexbildung dieser Proteine in Kombination mit der Amylase-exprimierenden Hefe vorzugsweise verwendet werden.
Transformation wurde basierend auf der von Gietz et al., Nucl. Acid. Res. 20, 1425 (1992), vorgegebenen Arbeitsvorschrift durchgeführt. Transformierte Zellen wurden dann aus Agar in YEPD-Komplexnährmedium (100 ml) inokuliert und über Nacht bei 30 °C gezüchtet. Das YEPD-Nährmedium wurde wie in Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 207 (1994), beschrieben hergestellt. Die Übernacht-Kultur wurde dann zu etwa 2 × 10⁶ Zellen/ml (ungefähre OD_60D = 0,1) in frischem Nährmedium (500 ml) verdünnt und zu 1 × 10⁷ Zellen/ml (ungefähre OD₆₀₀ = 0,4-0,5) neu gezüchtet.
Die Zellen wurden dann geerntet und auf Transformation durch Transfer in GS3-Rollflaschen in einem Rotor Sorval GS3 bei 5.000 U/min 5 min lang vorbereitet, der Überstand wurde verworfen, und in sterilem Wasser resuspendiert und neuerlich in 50-ml-Falcon-Röhrchen bei 3.500 U/min in einer Beckman-GS-6KR-Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und die Zellen wurden daraufhin mit LiAc/TE (10 ml, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5, 100 mM Li₂OOCCCH₃) gewaschen und in LiAc/TE (2,5 ml) resuspendiert.
Transformation erfolgte durch Vermischen der vorbereiteten Zellen (100 μl) mit frisch denaturierter, einzelsträngiger Lachshoden-DNA (Lofstrand Labs, Gaithersburg, MD) und Transformation von DNA (1 μg, Vol. < 10 μl) in Mikrozentrifugenröhrchen. Das Gemisch wurde kurz durch Zentrifugieren vermischt, dann wurden 40 % PEG/TE (600 μl, 40 % Polyethylenglykol-4000, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM Li₂OOCCH₃, pH 7,5) zugesetzt. Dieses Gemisch wurde dann bei 42 °C 15 min lang hitzegeschockt und das Reaktionsgefäß in einer Mikrozentrifuge bei 12.000 U/min 5-10 s lang zentrifugiert, dekantiert und in TE (500 μl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5) resuspendiert, gefolgt von Rezentrifugation. Die Zellen wurden dann in TE (1 ml) verdünnt, und Aliquoten (200 μl) wurden auf dem davor hergestellten selektiven Medium in 150-mm-Wachstumsplatten (VWR) ausgebreitet.
Alternativ dazu wurde anstelle mehrerer kleiner Reaktionen die Transformation unter Verwendung einer einzigen großtechnischen Reaktion durchgeführt, worin Reagensmengen proportional erhöht wurden.
Das verwendete selektive Medium war ein synthetischer kompletter Dextrose-Agar, dem Uracil fehlte (SCD-Ura) und der wie in Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 208-210 (1994); hergestellt wurde. Die Transformanten wurden bei 30 °C 2-3 Tage lang gezüchtet.
Die Detektion von Amylase sekretierenden Kolonien erfolgte durch Einbindung von roter Stärke in das selektive Wachstumsmedium. Stärke wurde mittels des von Biely et al., Anal. Biochem. 172, 176-179 (1988), beschriebenen Verfahrens an den roten Farbstoff Reactive Red-120, Sigma, gebunden. Die gebundene Stärke wurde in die SCD-Ura-Agarplatten in einer Endkonzentration von 0,15 % (Gew./Vol.) inkorporiert und wurde mit Kaliumphosphat auf einen pH von 7,0 (50-100 mM Endkonzentration) gepuffert.
Die positiven Kolonien wurden entnommen und über frisches selektives Medium (auf 150-mm-Platten) ausgestrichen, um gut isolierte und identifizierbare Einzelkolonien zu erhalten. Gut isolierte Einzelkolonien, die bezüglich Amyfasesekretion positiv waren, wurden durch direkte Inkorporation von roter Stärke in gepufferten SCD-Ura-Agar nachgewiesen. Positive Kolonien wurden durch ihre Fähigkeit bestimmt, Stärke abzubauen, was in einem Halo rund um die positive Kolonie resultierte, der direkt sichtbar war.
4. Isolierung von DNA durch PCR-Amplifikation
Wurde eine positive Kolonie isoliert, so wurde ein Teil davon mit einem Zahnstocher entnommen und in sterilem Wasser (30 μl) in einer 96-Well-Platte verdünnt. Zu diesem Zeitpunkt wurden die positiven Kolonien entweder eingefroren und für spätere Analyse gelagert oder sofort amplifiziert. Eine Aliquote von Zellen (5 μl) wurde als eine Matrix für die PCR-Reaktion in einem Volumen von 25 μl, das 0,5 μl Klentaq (Clontech, Palo Alto, CA); 4,0 μl 10 mM dNTP's (Perkin Elmer-Cetus); 2,5 μl Kentaq-Puffer (Clontech); 0,25 μl Vorwärts-Oligo 1; 0,25 μl Rückwärts-Oligo 2; und 12,5 μl destilliertes Wasser enthielt, verwendet.
Die Sequenz des Vorwärts-Oligonucleotids 1 lautete:
Die Sequenz des Rückwärts-Oligonucleotids 2 lautete:
PCR wurde wie folgt durchgeführt:
Die unterstrichenen Regionen der Oligonucleotide anellierten an die ADH-Promotorregion bzw. die Amylaseregion und amplifizierten eine 307-bp-Region aus Vektor pSST-AMY.0, wenn kein Insert vorhanden war. Typischerweise enthielten die ersten 18 Nucleotide des 5'-Endes dieser Oligonucleotide Anellierungsstellen für die Se quenzierungsprimer. Somit umfasste das Gesamtprodukt der PCR-Reaktion aus einem leeren Vektor 343 bp. Mit Signalsequenz fusionierte cDNA resultierte jedoch in beträchtlich längeren Nucleotidsequenzen.
Nach der PCR wurde eine Aliquote der Reaktion (5 μl) durch Agarose-Gelelektrophorese in einem 1%igen Agarosegel unter Verwendung eines Tris-Borat-EDTA- (TBE-) Puffersystem, wie von Sambrook et al., s.o., beschrieben, untersucht. Klone, die in einem einzelnen starken PCR-Produkt, das größer als 400 bp war, resultierten, wurden mittels DNA-Sequenzierung nach Reinigung mit einer 96-Qiaquick-PCR-Reinigungssäule (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) näher analysiert.
BEISPIEL 3: Isolierung von cDNA-Klonen unter Verwendung von Signalalgorithmus-Analyse
Verschiedene für Polypeptid kodierende Nucleinsäuresequenzen wurden durch Einsatz eines rechtlich geschützten Signalsequenz-Findungsalgorithmus, entwickelt von Genentech, Inc. (South San Francisco, CA) an ESTs sowie gesammelten und assemblierten EST-Fragmenten aus öffentlichen (z.B. GenBank) und/oder privaten (LIFESEQ^®, Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA) Datenbanken identifiziert. Der Signalsequenz-Algorithmus berechnet ein Sekretionssignalergebnis auf Grundlage der Beschaffenheit der DNA-Nucleotide, die das erste und gegebenenfalls das zweite Methionincodon (ATG) am 5'-Ende der Sequenz oder des Sequenzfragments, die bzw. das untersucht wird, umgeben. Die Nucleotide nach dem ersten ATG müssen für zumindest 35 eindeutige Aminosäuren ohne jegliche Stoppcodons kodieren. Weist das erste ATG die erforderlichen Aminosäuren auf, so wird das zweite nicht untersucht. Wird keines den Anforderungen gereicht, so wird keine Kandidatensequenz verzeichnet. Um zu bestimmen, ob die EST-Sequenz eine authentische Signalsequenz enthält, werden die DNA und die entsprechenden Aminosäuresequenzen, die das ATG-Codon umgeben, unter Verwendung einer Reihe von sieben Sensoren (Bewertungsparametern), die bekanntermaßen mit Sekretionssignalen assoziiert sind, verzeichnet. Die Verwendung dieses Algorithmus resultierte in der Identifikation zahlreicher für Polypeptid kodierender Nucleinsäuresequenzen.
BEISPIEL 4: Isolierung von cDNA-Klonen die für menschliches PRO1186 kodieren
Die Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Signalsequenzalgorithmus ermöglichte die Identifikation einer einfachen EST-Sammelsequenz aus der Incyte-Datenbank. Diese EST-Sammelsequenz wurde dann mit zahlreichen verschiedenen exprimierten Sequenzmarkierungs- (EST-) Datenbanken verglichen, die öffentliche EST-Datenbanken (z.B. GenBank) und eine private EST-DNA-Datenbank (LIFESEQ^®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) umfassten, um bestehende Homologie zu identifizieren. Die Homologiesuche erfolgte unter Verwendung des Computerprogramms BLAST oder BLAST2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996)). Diese Vergleiche führten zu einem BLAST-Ergebnis von 70 (oder in manchen Fällen 90) oder mehr, die nicht für bekannte Proteine kodierten, wenn sie gesammelt und mit dem Programm "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) zu einer Consensus-DNA-Sequenz assembliert wurden. Die hieraus erhaltene Consensus-Sequenz wird hierin als DNA56748 bezeichnet.
Angesichts einer beobachteten Sequenzhomologie zwischen der DNA56748-Consensus-Sequenz und einer EST-Sequenz, die im Incyte-EST-Klon Nr. 3476792 beinhaltet ist, wurde der Incyte-EST-Klon Nr. 3476792 erworben, und das cDNA-Insert wurde gewonnen und sequenziert. Es wurde erkannt, dass dieses Insert für ein Protein voller Länge kodierte. Die Sequenz dieses cDNA-Inserts ist in 265 gezeigt und wird hierin als DNA60621-1516 bezeichnet.
Der in 265 gezeigte Klon voller Länge enthielt einen einzelnen offenen Leseraster mit einer scheinbaren Translationsinitiationsstelle an Nucleotidpositionen 91-93 und endete am Stoppcodon, das an Nucleotidpositionen 406-408 (1; Seq.-ID Nr. 3) zu finden war. Der vorhergesagte Polypeptid-Vorläufer (2, Seq.-ID Nr. 4) ist 105 Aminosäuren lang. Das Signalpeptid ist an den Aminosäuren 1-19 von Seq.-ID Nr. 4 angeordnet. PRO1186 weist ein berechnetes Molekulargewicht von etwa 11.715 Da und einen geschätzten pI von etwa 9,05 auf. Der Klon DNA60621-1516 wurde bei der ATCC am 4. August 1998 hinterlegt, und ihm wurde die ATCC-Hinterlegungs-Nr. 203091 zugeteilt.
Eine Analyse der Dayhoff-Datenbank (Version 35.45 SwissProt 35) unter Verwendung einer WU-BLAST2-Sequenzabgleichanalyse der in 2 gezeigten Volllängensequenz (Seq.-ID Nr. 4) zeigte gewisse Sequenzidentität zwischen der PRO1186-Aminosäuresequenz und den folgenden Dayhoff-Sequenzen: VPRA_DENPO, LFE4_CHICK, AF034208_1, AF030433_1, A55035, COL_RABIT, CELB0507_9, S67826_1, S34665 und CRU73817_1.
BEISPIEL 5: Verwendung von PRO als Hybridisierungssonde
Das folgende Verfahren beschreibt die Verwendung einer Nucleotidsequenz, die für PRO kodiert, als Hybridisierungssonde.
DNA, die die Kodiersequenz von PRO voller Länge oder reifem PRO, das hierin geoffenbart ist, umfasst, wird als eine Sonde zum Screenen auf homologe DNAs (wie jene, die für natürlich vorkommende Varianten von PRO kodieren) in menschlichen Gewebe-cDNA-Bibliotheken oder menschlichen genomischen Gewebebibliotheken verwendet.
Hybridisierung und Waschen von Filtern, die beide Bibliotheks-DNAs enthalten, erfolgt unter den folgenden, hochstringenten Bedingungen. Hybridisierung von radioaktiv markierter, von PRO abstammender Sonde an die Filter erfolgte in einer Lösung von 50 % Formamid, 5 × SSC, 0,1 % SDS, 0,1 % Natriumpyrophosphat, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 2x Denhardt-Lösung und 10 % Dextransulfat bei 42 °C 20 h lang. Waschen der Filter erfolgt in einer wässrigen Lösung von 0,1 × SSC und 0,1 SDS bei 42 °C.
DNAs, die eine gewünschte Sequenzidentität mit der für Volllängen-Nativsequenz-PRO kodierenden DNA aufweist, kann dann unter Verwendung von Standard-Verfahren nach dem Stand der Technik identifiziert werden.
BEISPIEL 6: Expression von PRO in E. coli
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer unglykosylierten Form von PRO durch rekombinante Expression in E. coli.
Die für PRO kodierende DNA-Sequenz wird anfänglich unter Verwendung selektierter PCR-Primer amplifiziert. Die Primer sollten Restriktionsenzyme enthalten, die den Restriktionsenzym-Schnittstellen am ausgewählten Expressionsvektor entsprechen. Zahlreiche verschiedene Expressionsvektoren können verwendet werden. Ein Beispiel für einen geeigneten Vektor ist pBR322 (abgeleitet von E. coli; siehe Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)), der Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz enthält. Der Vektor wird mit Restriktionsenzym verdaut und dephosphoryliert. Die mittels PCR amplifizierten Sequenzen werden dann in den Vektor ligiert. Der Vektor umfasst vorzugsweise Sequenzen, die für ein Antibiotikaresistenz-Gen kodieren, einen trp-Promotor, einen polyhis-Leader (einschließlich der ersten sechs STII-Codons, polyhis-Sequenz und Enterokinase-Spaltungsstelle), die PRO-kodierende Region, lambda-Transkriptionsterminator und ein argU-Gen.
Das Ligationsgemisch wird dann verwendet, um einen selektierten E.-coli-Stamm unter Verwendung der in Sambrook et al., s.o., beschriebenen Verfahren zu transformieren. Die Transformanten werden durch ihre Fähigkeit, auf LB-Platten zu wachsen, identifiziert, und Antibiotika-resistente Kolonien werden dann selektiert. Plasmid-DNA kann isoliert und durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzieren bestätigt werden.
Selektierte Klone können über Nacht in flüssigem Kulturmedium wie z.B. LB-Nährmedium, ergänzt mit Antibiotika, gezüchtet werden. Die Übernacht-Kultur kann daraufhin verwendet werden, um eine Kultur größeren Formats zu inokulieren. Die Zellen werden dann bis zu einer gewünschten optischen Dichte gezüchtet, währenddessen der Expressionspromotor aktiviert ist.
Nach dem Kultivieren der Zellen über mehrere Stunden hinweg können die Zellen mittels Zentrifugation geerntet werden. Das durch die Zentrifugation erhaltene Zellpellet kann unter Verwendung verschiedener, auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Mittel löslich gemacht werden, und das löslich gemachte PRO-Protein kann dann unter Verwendung einer Metallchelatbildungssäule unter Bedingungen, die enge Bindung des Proteins ermöglichen, gereinigt werden.
PRO kann in E. coli in einer poly-His-markierten Form unter Verwendung des folgenden Verfahrens exprimiert werden. Die für PRO kodierende DNA wird anfänglich unter Verwendung selektierter PCR-Primer amplifiziert. Die Primer enthalten Restriktionsenzymstellen, die den Restriktionsenzymstellen am ausgewählten Expressionsvektor entsprechen, und andere nützliche Sequenzen, die für wirksame und zuverlässige Translationsinitiation, rasche Reinigung an einer Metallchelatbildungssäule und proteolytische Entfernung mit Enterokinase sorgen. Die PCR-amplifizierten, poly-His-markierten Sequenzen werden dann in einen Expressionsvektor ligiert, der verwendet wird, um einen E.-coli-Wirt basierend auf Stamm 52 (W3110 fuhA (tonA) Ion galE rpoHts(htpRts) clpP(laclq) zu transformieren. Transformanten werden zuerst in LB mit 50 mg/ml Carbenicillin bei 30 °C unter Schütteln gezüchtet, bis eine OD600 von 3-5 erreicht ist. Die Kulturen werden dann 50-100fach in CRAP-Medium (hergestellt durch Vermischen von 3,57 g (NH₄)₂SO₄, 0,71 g Natriumcitrat 2H₂O, 1,07 g KCl, 5,36 g Difco-Hefeextrakt, 5,36 g Sheffield-Hycase SF in 500 ml Wasser sowie 110 mM MPOS, pH 7,3, 0,55 % (Gew./Vol.) Glucose und 7 mM MgSO₄) verdünnt und etwa 20-30 Stunden bei 30 °C unter Schütteln gezüchtet. Proben werden entfernt, um Expression durch SDS-PAGE-Analyse zu überprüfen; und der Hauptteil der Kultur wird zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Zellpellets werden unter Reinigung und Neufaltung eingefroren.
E.-coli-Paste aus 0,5 bis 1 l Fermentationen (6-10 g Pellets) wird in 10 Volumen (Gew./Vol.) in Puffer (7 M Guanidin, 20 mM Tris, pH 8) resuspendiert. Festes Natriumsulfit und Natriumtetrathionat werden zugesetzt, um Endkonzentrationen von 0,1 M bzw. 0,02 M zu bilden, und die Lösung wird über Nacht bei 4 °C gerührt. Dieser Schritt führt zu einem denaturierten Protein, an dem alle Cysteinreste durch Sulfi tolierung blockiert sind. Die Lösung wird bei 40.000 U/min in einer Beckman Ultracentrifuge 30 min lang zentrifugiert. Der Überstand wird mit 3-5 Volumen Metallchelatsäulenpuffer (6 M Guanidin, 20 mM Tris, pH 7,4) verdünnt und durch 0,22-μm-Filter filtriert, um geklärt zu werden. Der geklärte Extrakt wird auf eine 5-ml-Qiagen-Ni-NTA-Chelatsäule, äquilibriert im Metallchelatsäulenpufter, geladen. Die Säule wird mit zusätzlichen Puffer, der 50 mM Imidazol (Calbiochem, Utrol-Qualität), pH 7,4, enthält, gewaschen. Das Protein wird mit Puffer, der 250 mM Imidazol enthält, eluiert. Fraktionen, die das gewünschte Protein enthalten, werden vereinigt und bei 4 °C gelagert. Proteinkonzentration wird durch seine Absorption bei 280 nm unter Verwendung des berechneten Extinktionskoeffizienten, basierend auf seiner Aminosäuresequenz, berechnet.
Die Proteine werden durch langsames Verdünnen der Probe in frisch hergestellten Neufaltungspuffer, der aus 20 mM Tris, pH 8,6, 0,3 M NaCl, 2,5 M Harnstoff, 5 mM Cystein, 20 mM Glycin und 1 mM EDTA besteht, neu gefaltet. Die Neufaltungsvolumina werden so ausgewählt, dass die Endproteinkonzentration zwischen 50 und 100 μg/ml liegt. Die Neufaltungslösung wird sanft bei 4 °C 12-36 Stunden lang gerührt. Die Neufaltungsreaktion wird durch den Zusatz von TFA in einer Endkonzentration von 0,4 % (pH von etwa 3) gequencht. Vor weiterer Reinigung des Proteins wird die Lösung durch ein 0,22-μm-Filter filtriert, und Acetonitril wird in 2-10 % Endkonzentration zugesetzt. Das neu gefaltete Protein wird auf einer Umkehrphasensäule Poros R1/H unter Verwendung eines mobilen Puffers von 0,1 % TFA bei Elution mit einem Acetonitrilgradienten von 10 bis 80 % chromatographiert. Aliquoten von Fraktionen mit A280-Absorption werden auf SDS-Polyacrylamidgelen analysiert, und Fraktionen, die homogenes, neu gefaltetes Protein enthalten, werden vereinigt. Im Allgemeinen werden neu gefaltete Spezies der meisten Proteine bei den geringsten Acetonitril-Konzentrationen eluiert, da jene Spezies mit ihrem hydrophoben Inneren, das vor Wechselwirkung mit dem Umkehrphasenharz abgeschirmt ist, am kompaktesten sind. Aggregierte Spezies werden üblicherweise bei höheren Acetonitril-Konzentrationen eluiert. Zusätzlich zur Auflösung fehlgefalteter Formen von Proteinen aus der gewünschten Form entfernt der Umkehrphasenschritt auch Endotoxin aus den Proben.
Fraktionen, die das gewünschte gefaltete PRO-Polypeptid enthalten, werden vereinigt, und das Acetonitril wird unter Verwendung eines schwachen Stickstoffstroms, der auf die Lösung gerichtet wird, entfernt. Proteine werden in 20 mM Hepes, pH 6,8, mit 0,14 M Natriumchlorid und 4 % Mannit durch Dialyse oder Gelfiltration unter Verwendung von im Formulierungspuffer äquilibrierten G25 Superfine- (Pharmacia) Harzen formuliert und steril filtriert.
Zahlreiche der in der früheren Anmeldung WO 99/63088 (von der diese eine Teilanmeldung darstellt) geoffenbarten PRO-Polypeptide erfolgreich wie zuvor beschrieben exprimiert.
BEISPIEL 7: Expression von PRO in Säugetierzellen
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer potenziell glykosylierten Form von PRO durch Rekombinationsexpression in Säugetierzellen.
Der Vektor pRK5 (siehe EP 307.247 , veröffentlicht am 15. März 1989) wird als Expressionsvektor verwendet. Gegebenenfalls wird die PRO-DNA mit ausgewählten Restriktionsenzymen in pRKS ligiert, um Einführung der PRO-DNA unter Verwendung von Ligationsverfahren, wie sie in Sambrook et al., s.o., beschrieben werden, zu ermöglichen. Der resultierende Vektor wird als pRK5-PRO bezeichnet.
In einer Ausführungsform können die ausgewählten Wirtszellen 293-Zellen sind. Menschliche 293-Zellen (ATCC-CCL 1573) werden bis zur Konfluenz in Gewebekulturplatten in Medium wie beispielsweise DMEM, ergänzt mit fötalem Kälberserum und gegebenenfalls Nährstoffkomponenten und/oder Antibiotika, gezüchtet. Etwa 10 μg pRK5-PRO-DNA werden mit etwa 1 μg DNA, die für das VA-RNA-Gen kodiert (Thimmappaya et al., Cell 31, 543 (1982)), vermischt und in 500 μl von 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl₂, aufgelöst. Zu diesem Gemisch werden 500 μl von 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO₄ zugetropft, und die Bildung eines Präzipitats wird 10 min lang bei 25 °C zugelassen. Das Präzipitat wird suspendiert und zu den 293-Zellen zugesetzt, und etwa 4 h lang kann es sich bei 37 °C absetzen. Das Kulturmedium wird abgesaugt, und 2 ml von 20 % Glycerin in PBS werden 30 s lang zugesetzt. Die 293-Zellen werden mit serumfreiem Medium gewaschen, frisches Medium wird zugesetzt, und die Zellen werden etwa 5 Tage lang inkubiert.
Etwa 24 h nach den Transfektionen wird das Kulturmedium entfernt und durch Kulturmedium (alleine) oder Kulturmedium, das 200 μCi/ml ³⁵S-Cystein und 200 μCi/ml ³⁵S-Methionin enthält, ersetzt. Nach einer 12-stündigen Inkubation wird das konditionierte Medium gesammelt, an einem Zentrifugenfilter eingeengt und auf ein 15%iges SDS-Gel geladen. Das verarbeitete Gel kann getrocknet werden, und ein Film kann damit innerhalb einer ausgewählten Zeitspanne belichtet werden, um die Gegenwart von PRO-Polypeptid aufzuzeigen. Die Kulturen, die transfizierte Zellen enthalten, können weiterer Inkubation (in serumfreiem Medium) unterzogen werden, und das Medium wird in ausgewählten Bioassays getestet.
In einem alternativen Verfahren kann PRO in 293-Zellen vorübergehend unter Verwendung des von Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 12, 7575 (1981), beschriebenen Verfahren eingeführt werden. 293-Zellen werden bis zur maximalen Dichte in einem Zentrifugenkolben gezüchtet, und 700 μg pRK5-PRO-DNA werden zugesetzt. Die Zellen werden zuerst im Zentrifugenkolben durch Zentrifugation eingeengt und mit PBS gewaschen. Das DNA-Dextranpräzipitat wird am Zellpellet 4 h lang inkubiert. Die Zellen werden mit 20 % Glycerin 90 s lang behandelt, mit Gewebekulturmedium gewaschen und neuerlich den Zentrifugenkolben eingeführt, der Gewebekulturmedium, 5 μg/ml Rinderinsulin und 0,1 μg/ml Rindertransferrin enthält. Nach etwa vier Tagen wird das konditionierte Medium zentrifugiert und filtriert, um Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Die Probe, die exprimiertes PRO enthält, kann dann eingeengt und durch jedes beliebige, ausgewählte Verfahren, wie Dialyse und/oder Säulenchromatographie, gereinigt werden.
In einer anderen Ausführungsform kann PRO in CHO-Zellen exprimiert werden. Das pRK5-PRO kann unter Verwendung bekannter Reagenzien wie CaPO₄ oder DEAE-Dextran in CHO-Zellen transfiziert werden. Wie zuvor beschrieben können die Zell kulturen inkubiert und das Medium durch Kulturmedium (alleine) oder Medium, das eine radioaktive Markierung wie z.B. ³⁵S-Methionin trägt, ersetzt werden. Nach Bestimmung der Gegenwart von PRO-Polypeptid kann das Kulturmedium durch serumfreies Medium ersetzt werden. Vorzugsweise werden die Kulturen etwa 6 Tage lang inkubiert, und dann wird das konditionierte Medium geerntet. Das das exprimierte PRO enthaltende Medium kann dann eingeengt und durch jedes beliebige ausgewählte Verfahren gereinigt werden.
Epitop-markiertes PRO kann auch in Wirt-CHO-Zellen exprimiert werden. Das PRO kann aus dem pRK5-Vektor subkloniert werden. Das Subklon-Insert kann PCR unterzogen werden, um in Raster mit einer ausgewählten Epitopmarkierung wie poly-his-Markierung in einen Baculovirus-Expressionsvektor zu fusionieren. Das poly-his-markierte PRO-Insert kann dann zur Selektion stabiler Klone in einen SV40-gesteuerten Vektor, der einen Selektionsmarker wie z.B. DHFR enthält, subkloniert werden. Schließlich können die CHO-Zellen (wie zuvor beschrieben) mit dem SV40-gesteuerten Vektor transfiziert werden. Markierung kann, wie zuvor beschrieben, erfolgen, um Expression zu überprüfen. Das das exprimierte, poly-His-markierte PRO enthaltende Kulturmedium kann dann eingeengt und mittels jedes beliebigen ausgewählten Verfahrens, wie z.B. durch Ni²⁺-Chelataffinitätschromatographie, gereinigt werden.
PRO kann auch in CHO- und/oder COS-Zellen durch ein Verfahren zu vorübergehender Expression oder in CHO-Zellen durch ein anderes Expressionsverfahren exprimiert werden.
Stabile Expression in CHO-Zellen wird unter Einsatz des folgenden Verfahrens durchgeführt. Die Proteine werden als ein IgG-Konstrukt (Immunoadhäsin) exprimiert, in dem die Kodiersequenzen für die löslichen Formen (z.B. extrazellulären Domänen) der jeweiligen Proteine an eine IgG1-Sequenz einer konstanten Region, die die Gelenks-, CH2- und CH3-Domänen enthält und/oder eine poly-His-markierte Form ist, fusioniert werden.
Nach PCR-Amplifikation werden die jeweiligen DNAs unter Anwendung herkömmlicher Verfahren, wie sie in Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Abschnitt 3.16, John Wiley & Sons (1997), beschrieben werden, in einen CHO-Expressionsvektor subkloniert. CHO-Expressionsvektoren werden so konstruiert, dass sie kompatible Restriktionsstellen 5' und 3' von der DNA von Interesse aufweisen, um geeignetes Shuttling von cDNAs zu ermöglichen. Der für Expression in CHO-Zellen verwendete Vektor ist wie in Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24(9), 1774-1779 (1996) beschrieben und verwendet den SV40-frühen Promotor/Enhancer, um Expression der cDNA von Interesse und von Dihydrofolatreductase (DHFR) zu steuern. DHFR-Expression ermöglicht Selektion auf stabile Aufrechterhaltung des Plasmids nach erfolgter Transfektion.
12 μg der gewünschten Plasmid-DNA werden in etwa 10 Million CHO-Zellen unter Verwendung von handelsüblichen Transfektionsreagenzien Superfect^® (Qiagen), Dosper^® und Fugene^® (Boehringer Mannheim) eingeführt. Die Zellen werden wie in Lucas et al., s.o., beschrieben gezüchtet. Etwa 3 × 10^-7 Zellen werden in einer Ampulle für weiteres Wachstum und Produktion, wie nachstehend beschrieben, eingefroren.
Die die Plasmid-DNA enthaltenden Ampullen werden durch Platzieren in ein Wasserbad aufgetaut und durch Zentrifugieren vermischt. Der Inhalt wird in ein Zentrifugenröhrchen, das 10 ml Medium enthält, pipettiert und bei 1.000 U/min 5 min lang zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt, und die Zellen werden in 10 ml selektivem Medium (0,2 μm filtriertes PS20 mit 5 % 0,2 μm diafiltriertem fötalem Rinderserum) resuspendiert. Die Zellen werden dann in eine 100-ml-Zentrifuge, die 90 ml selektives Medium enthält, in Aliquoten aufgeteilt. Nach 1-2 Tagen werden die Zellen in eine 250-ml-Zentrifuge, gefüllt mit 150 ml selektivem Wachstumsmedium, transferiert und bei 37 °C inkubiert. Nach weiteren 2-3 Tagen werden 250-ml-, 500-ml- und 2.000-ml-Zentrifugen mit 3 × 10⁵ Zellen/ml überimpft. Das Zellmedium wird mittels Zentrifugation und Resuspension in Produktionsmedium durch frisches Medium ausgetauscht. Obwohl jedes beliebige, geeignete CHO-Medium eingesetzt werden kann, kann in der Praxis ein Produktionsmedium, das im US-Patent Nr. 5.122.469, ausgegeben am 16. Juni 1992, beschrieben ist, verwendet werden. Eine 31-Produktionszentrifuge wird mit 1,2 × 10⁶ Zellen/ml überimpft. An Tag 0 wird der Zelldichte-pH bestimmt. An Tag 1 werden aus der Zentrifuge Proben entnommen, und Durchperlenlassen von filtrierter Luft wird begonnen. An Tag 2 werden aus der Zentrifuge Proben gezogen, die Temperatur wird auf 33 °C geändert, und 30 ml von 500 g/l Glucose und 0,6 ml von 10 % Antischaummittel (z.B. 35 % Polydimethylsiloxanemulsion, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion) werden genommen. Im Laufe der Produktion wird der pH je nach Bedarf eingestellt, um ihn bei etwa 7,2 zu halten. Nach 10 Tagen, oder bis die Lebensfähigkeit unter 70 % gefallen ist, wird die Zellkultur durch Zentrifugation und Filtrieren durch ein 0,22-μm-Filter geerntet. Das Filtrat wird entweder bei 4 °C gelagert oder unmittelbar auf Säulen zur Reinigung geladen.
Für die poly-His-markierten Konstrukte werden die Proteine unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wird Imidazol zum konditionierten Medium auf eine Konzentration von 5 mM zugesetzt. Das konditionierte Medium wird auf eine 6-ml-Ni-NTA-Säule, äquilibriert in 20 mM Hepes, pH 7,4, Puffer, der 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthält, bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 4-5 ml/min bei 4 °C gepumpt. Nach dem laden wird die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen, und das Protein wird mit Äquilibrierungspuffer, der 0,25 M Imidazol enthält, eluiert. Das hoch gereinigte Protein wird daraufhin in einen Lagerungspuffer, der 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4 % Mannit, pH 6,8 enthält, mit einer 25-ml-G25-Superfine-Säule (Pharmacia) entsalzt und bei -80 °C gelagert.
(Fc-hältige) Immunoadhäsin-Konstrukte werden aus dem konditionierten Medium wie folgt gereinigt. Das konditionierte Medium wird auf eine 5-ml-Protein-A-Säule (Pharmacia) gepumpt, die in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,8, äquilibriert wurde. Nach Laden wird die Säule ausführlich mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bevor Elution mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, erfolgt. Das eluierte Protein wird unmittelbar durch Abnahme von 1-ml-Fraktionen in Röhrchen, die 275 μl von 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthalten, neutralisiert. Das hochgereinigte Protein wird daraufhin wie zuvor für die poly-His-markierten Proteine beschrieben in Lagerungspuffer entsalzt. Die Homoge nität wird durch SDS-Polyacrylamidgele und mittels N-terminaler Aminosäure-Sequenzierung durch Edman-Abbau bewertet.
Zahlreiche der in der früheren Anmeldung WO 99/63088 (von welcher diese eine Teilanmeldung darstellt) geoffenbarten PRO-Polypeptide wurden erfolgreich wie zuvor beschrieben exprimiert.
BEISPIEL 8: Expression von PRO in Hefe
Das folgende Verfahren beschreibt rekombinante Expression von PRO in Hefe.
Zuerst werden Hefeexpressionsvektoren für intrazelluläre Produktion oder Sekretion von PRO aus dem ADH2/GAPDH-Promotor konstruiert. DNA, die für PRO und den Promotor kodiert, wird in geeignete Restriktionsenzym-Schnittstellen im ausgewählten Plasmid insertiert, um intrazelluläre Expression von PRO zu steuern. Zur Sekretion kann für PRO kodierende DNA in das ausgewählte Plasmid kloniert werden, zusammen mit DNA, die für den ADH2/GAPDH-Promotor, ein natives PRO-Signalpeptid oder anderes Säugetiersignalpeptid kodiert, z.B. eine Hefe-α-Faktor- oder Invertase-Sekretionssignal/Leadersequenz und Linkersequenzen (sofern erforderlich) für Expression von PRO.
Hefezellen, wie z.B. Hefestamm AB110, können mit den zuvor beschriebenen Expressionsplasmiden transformiert und in ausgewähltem Fermentationsmedium kultiviert werden. Die transformierten Hefeüberstände können durch Fällung mit 10 % Trichloressigsäure und Trennung durch SDS-PAGE analysiert werden, gefolgt von Färbung der Gele mit Coomassieblau-Färbung.
Rekombinantes PRO kann daraufhin isoliert und durch Entfernen der Hefezellen aus dem Fermentationsmedium durch Zentrifugation gereinigt werden, woraufhin das Medium unter Verwendung ausgewählter Kerzenfilter eingeengt wird. Das PRO-hältige Konzentrat kann unter Verwendung ausgewählter Säulenchromatographieharze gereinigt werden.
Zahlreiche der in der früheren Anmeldung WO 99/63088 (von welcher diese eine Teilanmeldung darstellt) geoffenbarten PRO-Polypeptide wurden erfolgreich wie zuvor beschrieben exprimiert.
BEISPIEL 9: Expression von PRO in Baculovirus-infizierten Insektenzellen
Das folgende Verfahren beschreibt rekombinante Expression von PRO in Baculovirus-infizierten Insektenzellen.
Die für PRO kodierende Sequenz wird stromauf von einer Epitopmarkierung, die innerhalb eines Baculovirus-Expressionsvektors liegt, fusioniert. Solche Epitopmarkierungen umfassen poly-His-Markierungen und Immunglobulin-Markierungen (wie Fc-Regionen von IgG). Zahlreiche verschiedene Plasmide können verwendet werden, einschließlich Plasmide, die von im Handel erhältlichen Plasmiden wie z.B. pVL1393 (Novagen) abstammen. Kurz zusammengefasst wird die für PRO kodierende Sequenz oder der gewünschte Abschnitt der Kodiersequenz für PRO, wie beispielsweise die für die extrazelluläre Domäne eines Transmembranproteins kodierende Sequenz oder die für reifes Protein kodierende Sequenz, sofern das Protein extrazellulär ist, durch PCR mit Primern, die zu den 5'- und 3'-Regionen komplementär sind, amplifiziert. Der 5'-Primer kann flankierende (ausgewählte) Restriktionsenzym-Schnittstellen umfassen. Das Produkt wird dann mit jenen ausgewählten Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert.
Rekombinantes Baculovirus wird durch Co-Transfizieren des oben genannten Plasmids und BaculoGold^TM-Virus-DNA (Pharmingen) in Spodoptera-frugiperda- ("Sf9") Zellen (ATCC-CRL 1711) unter Verwendung von Lipofectin (im Handel bei GIBCO-BRL erhältlich) gebildet. Nach 4-5 Tagen Inkubation bei 28 °C wurden die freigesetzten Viren geerntet und für weitere Amplifikationen verwendet. Virale Infektion und Proteinexpression werden wie von O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994), beschrieben durchgeführt.
Exprimiertes, poly-His-markiertes PRO kann dann, beispielsweise durch Ni²⁺-Chelataffinitätschromatographie, wie folgt gereinigt werden. Extrakte werden aus rekombinanten, Virus-infizierten Sf9-Zellen wie von Rupert et al., Nature 362, 175-179 (1993), beschrieben hergestellt. Kurz zusammengefasst werden Sf9-Zellen gewaschen, in Beschallungspuffer (25 ml Hepes, pH 7,9; 12,5 mM MgCl₂; 0,1 mM EDTA; 10 % Glycerin; 0,1 % NP-40; 0,4 M KCl) resuspendiert und zweimal 20 s lang auf Eis beschallt. Die Beschallungsprodukte werden durch Zentrifugation geklärt, und der Überstand wird 50fach in Ladepuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10 % Glycerin, pH 7,8) verdünnt und durch ein 0,45-μm-Filter filtriert. Eine Ni²⁺-NTA-Agarosesäule (im Handel bei Qiagen erhältlich) mit einem Bettvolumen von 5 ml wird vorbereitet, mit 25 ml Wasser gewaschen und mit 25 ml Ladepuffer äquilibriert. Das gefilterte Zellextrakt wird mit 0,5 ml/min auf die Säule geladen. Die Säule wird bis zur Grundlinie der A₂₈₀ mit Ladepuffer gewaschen, zu welchem Zeitpunkt dann mit der Abnahme von Fraktionen begonnen wird. Daraufhin wird die Säule mit einem sekundären Waschpuffer (50 mM Phosphat; 300 mM NaCl, 10 % Glycerin, pH 6,0) gewaschen, der nicht spezifisch gebundenes Protein eluiert. Nach neuerlichem Erreichen der A₂₈₀-Grundlinie wird die Säule mit einem Imidazolgradienten von 0 bis 500 mM im sekundären Waschpuffer entwickelt. 1-ml-Fraktionen werden abgenommen und durch SDS-PAGE und Silberfärbung oder Western-Blot, mit Ni²⁺-NTA konjugiert an alkalische Phosphatase (Qiagen), analysiert. Fraktionen, die das eluierte, His₁₀-markierte PRO enthalten, werden vereinigt und gegen Ladepuffer dialysiert.
Alternativ dazu kann Reinigung des IgG-markierten (oder Fc-markierten) PRO unter Verwendung bekannter Chromatographieverfahren, einschließlich beispielsweise Protein-A- oder Protein-G-Säulenchromatographie, durchgeführt werden.
Zahlreiche der in der früheren Anmeldung WO 99/63088 (von welcher diese eine Teilanmeldung darstellt) geoffenbarten PRO-Polypeptide wurden erfolgreich wie zuvor beschrieben exprimiert.
BEISPIEL 10: Herstellung von Antikörpern die PRO binden
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung monoklonaler Antikörper, die PRO spezifisch binden.
Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise in Goding, s.o., beschrieben. Immunogene, die verwendet werden können, umfassen gereinigtes PRO, Fusionsproteine, die PRO enthalten, und Zellen, die rekombinantes PRO an ihrer Zelloberfläche exprimieren. Selektion des Immunogens kann von Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren durchgeführt werden.
Mäuse, wie z.B. Balb/c, werden mit dem PRO-Immunogen, das in komplettem Freundschem Adjuvans emulgiert wird, immunisiert, und ihnen wird eine Menge von 1-100 μg subkutan oder intraperitoneal injiziert. Alternativ dazu wird das Immunogen in MPL-TDM-Adjuvans (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) emulgiert und in die Pfoten des Hinterlaufs des Tiers injiziert. Die immunisierten Mäuse werden dann 10 bis 12 Tage später mit zusätzlichem Immunogen, das im ausgewählten Adjuvans emulgiert wurde, geboostet. Hiernach können die Mäuse mehrere Wochen lang auch mittels zusätzlicher Immunisierungsinjektionen geboostet werden. Serumproben können den Mäusen regelmäßig durch retroorbitale Blutabnahme für Tests mittels ELISA abgenommen werden, um Anti-PRO-Antikörper nachzuweisen.
Nachdem ein geeigneter Antikörpertiter erreicht wurde, kann den bezüglich Antikörpern "positiven" Tieren eine abschließende intravenöse Injektion von PRO verabreicht werden. Drei oder vier Tage später werden die Mäuse getötet, und Milzzellen werden geerntet. Die Milzzellen werden dann (unter Verwendung von 35 % Polyethylenglykol) an eine ausgewählte murine Myelomzelllinie wie P3X63AgU.1 fusioniert, die bei der ATCC-Nr. CRL 1597 erhältlich ist. Die Fusionen bilden Hybridomzellen, die dann in 96-Well-Gewebekulturplatten, die HAT- (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) Medium enthalten, ausplattiert werden können, um Proliferation von nichtfusionierten Zellen, Myelomhybriden und Milzzellhybriden inhibieren.
Die Hybridomzellen werden in einem ELISA auf Reaktivität gegen PRO gescreent. Bestimmung von "positiven" Hybridomzellen, die die gewünschten monoklonalen Antikörper gegen PRO sekretieren, liegt im Bereich der Erfindung.
Die positiven Hybridomzellen können syngenetischen Balb/c-Mäusen intraperitoneal injiziert werden, um Ascites zu bilden, die die monoklonalen Anti-PRO-Antikörper enthalten. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in Gewebekulturkolben oder Rollflaschen gezüchtet werden. Reinigung der in den Ascites gebildeten, monoklonalen Antikörper kann unter Verwendung von Ammoniumsulfatfällung erfolgen, gefolgt von Gelausschluss-Chromatographie. Alternativ dazu kann Affinitätschromatographie, basierend auf Bindung von Antikörper an Protein A oder Protein G, verwendet werden.
BEISPIEL 11: Reinigung von PRO-Polypeptiden unter Verwendung spezifischer Antikörper
Native oder rekombinante PRO-Polypeptide können mittels zahlreicher verschiedener Verfahren zur Proteinreinigung, die auf dem Gebiet der Erfindung Standard sind, gereinigt werden. Beispielsweise wird Pro-PRO-Polypeptid, reifes PRO-Polypeptid, oder Prä-PRO-Polypeptid durch Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung von Antikörpern, die für das PRO-Polypeptid von Interesse spezifisch sind, gereinigt. Im Allgemeinen wird eine Immunaffinitätssäule durch kovalentes Binden des Anti-PRO-Polypeptid-Antikörpers an ein aktiviertes chromatographisches Harz konstruiert.
Polyklonale Immunglobuline werden aus Immunseren entweder durch Fällung mit Ammoniumsulfat oder durch Reinigung an immobilisiertem Protein A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.) hergestellt. In ähnlicher Weise werden monoklonale Antikörper aus Maus-Ascitesflüssigkeit durch Ammoniumsulfatfällung oder Chromatographie über immobilisiertes Protein A gebildet. Teilweise gereinigtes Immunglobulin wird kovalent an ein chromatographisches Harz wie z.B. CnBr-aktivierte SEPHAROSE^TM (Pharmacia LKB Biotechnology) gebunden. Der Antikörper wird an das Harz gebunden, das Harz wird blockiert, und das abgeleitete Harz wird gemäß den Anweisungen des Herstellers gewaschen.
Solch eine Immunaffinitätssäule wird zur Reinigung von PRO-Polypeptid durch Herstellen einer Fraktion aus Zellen, die PRO-Polypeptid enthalten, in einer löslichen Form verwendet. Dieses Präparat wird durch Löslichmachung der ganzen Zelle oder einer subzellulären Fraktion, erhalten mittels Differenzialzentrifugation durch den Zusatz von Detergens oder mittels anderer Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, abgeleitet. Alternativ dazu kann lösliches PRO-Polypeptid, das eine Signalsequenz enthält, in einer nützlichen Menge in das Medium, in dem die Zellen gezüchtet werden, sekretiert werden.
Ein lösliches PRO-Polypeptid-hältiges Präparat wird über die Immunaffinitätssäule geführt, und anschließend wird die Säule unter Bedingungen gewaschen, die die präferenzielle Absorption von PRO-Polypeptid (z.B. Puffer mit hoher Ionenstärke in Gegenwart von Detergens) ermöglichen. Dann wird die Säule unter Bedingungen eluiert, die Antikörper/PRO-Polypeptid-Bindung aufbrechen (z.B. ein Puffer mit niedrigem pH, wie etwa pH 2-3, oder eine hohe Konzentrationen eines chaotropen Ions wie z.B. eines Harnstoff- oder Thiocyanations), und PRO-Polypeptid wird gesammelt.
BEISPIEL 12: Wirkstoff-Screenen
Diese Erfindung ist besonders nützlich zu Screenen von Verbindungen unter Verwendung von PRO-Polypeptiden oder Bindungsfragmenten davon in jedem beliebigen von zahlreichen verschiedenen Wirsktoff-Screening-Verfahren. Das in solch einem Test verwendete PRO-Polypeptid oder Fragment kann entweder frei in Lösung, fixiert an einem festen Träger, getragen von einer Zelloberfläche oder intrazellulär vorliegen. Ein Verfahren zum Wirkstoff-Screenen verwendet eukaryotische oder prokaryotische Wirtszellen, die stabil mit rekombinanten Nucleinsäuren transformiert sind, die das PRO-Polypeptid oder Fragment exprimieren. Wirkstoffe werden gegen solche transformierten Zellen in kompetitiven Bindungstests gescreent. Solche Zellen können, entweder in lebensfähiger oder fixierter Form, für herkömmliche Bindungs tests verwendet werden. Es kann beispielsweise die Bildung von Komplexen zwischen PRO-Polypeptid oder einem Fragment und dem zu testenden Mittel gemessen werden. Alternativ dazu kann ein Rückgang der Komplexbildung zwischen dem PRO-Polypeptid und seiner/n Target-Zelle oder Target-Rezeptoren, verursacht durch das zu testende Mittel, untersucht werden.
Somit stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Screenen auf Wirkstoffe oder andere Mittel bereit, die eine PRO-Polypeptid-assoziierte Erkrankung oder Störung beeinflussen. Diese Verfahren umfassen das Kontaktieren solch eines Mittels mit einem PRO-Polypeptid oder Fragment davon und das Testen (I) auf die Gegenwart eines Komplexes zwischen dem Mittel und dem PRO-Polypeptid oder Fragment oder (II) auf die Gegenwart eines Komplexes zwischen dem PRO-Polypeptid oder Fragment und der Zelle mittels Verfahren, die nach dem Stand der Technik bekannt sind. In solchen kompetitiven Bindungstests wird das PRO-Polypeptid oder das Fragment typischerweise markiert. Nach geeigneter Inkubation wird freies PRO-Polypeptid oder -Fragment von jenem, das in gebundener Form vorliegt, getrennt, und die Menge an freier oder nicht in einen Komplex eingebundener Markierung ist ein Maß für die Fähigkeit des bestimmten Mittels, sich an PRO-Polypeptid zu binden oder den PRO-Polypeptid/Zell-Komplex zu stören.
Ein anderes Verfahren zum Wirkstoff-Screenen stellt Screenen mit hohem Durchsatz auf Verbindungen mit geeigneter Bindungsaffinität zu einem Polypeptid bereit und wird im Detail in der WO 84/03564, veröffentlicht am 13. September 1984, beschrieben. Kurz zusammengefasst werden große Mengen an verschiedenen Testverbindungen kleiner Peptide an einem festen Substrat, wie z.B. an Kunststoffstiften oder einer anderen Oberfläche, synthetisiert. Nachdem sie auf ein PRO-Polypeptid aufgetragen wurden, werden die Peptid-Testverbindungen mit PRO-Polypeptid umgesetzt und gewaschen. Gebundenes PRO-Polypeptid wird mittels Verfahren nachgewiesen, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Gereinigtes PRO-Polypeptid kann zur Verwendung in den oben genannten Wirkstoff-Screening-Verfahren auch direkt auf Platten aufgeschichtet werden. Darüber hinaus können nicht-neutralisierende Antikörper verwendet werden, um das Peptid einzufangen und es am festen Träger zu immobilisieren.
Diese Erfindung zieht auch die Verwendung von kompetitiven Wirkstoff-Screening-Tests in Betracht, in denen neutralisierende Antikörper, die in der Lage sind, PRO-Polypeptid spezifisch zu binden, mit einer Testverbindung um Bindung an PRO-Polypeptid oder Fragmente davon konkurrieren. Auf diese Weise können die Antikörper verwendet werden, um die Gegenwart jeden beliebigen Peptids nachzuweisen, das eine oder mehrere antigene Determinanten mit PRO-Polypeptid gemeinsam hat.
BEISPIEL 13: Rationaler Wirkstoffentwurf
Das Ziel von rationalem Wirkstoffentwurf ist die Bildung struktureller Analoga von biologisch aktivem Polypeptid von Interesse (d.h. von einem PRO-Polypeptid) oder von kleinen Molekülen, mit denen sie wechselwirken, z.B. Agonisten, Antagonisten oder Inhibitoren. Jedes dieser Beispiele kann verwendet werden, um Wirkstoffe zu entwerfen, die aktivere oder stabilere Formen des PRO-Polypeptid sind oder die die Funktion des PRO-Polypeptid in vivo fördern oder stören (siehe Hodgson, Bio/Technology 9, 19-21 (1991)).
In einem Ansatz wird die dreidimensionale Struktur des PRO-Polypeptids oder eines PRO-Polypeptid-Inhibitor-Komplexes durch Röntgenkristallographie, durch Computermodellbildung oder, am typischsten, durch eine Kombination dieser zwei Ansätze, bestimmt. Sowohl die Form als auch die Ladungen des PRO-Polypeptids müssen ermittelt werden, um die Struktur zu erklären und um aktive Stelle(n) des Moleküls zu bestimmen. Weniger häufig kann wertvolle Information bezüglich der Struktur des PRO-Polypeptids durch Modellierung basierend auf der Struktur homologer Proteine gewonnen werden. In beiden Fällen wird relevante strukturelle Information verwendet, um analoge PRO-Polypeptid-ähnliche Moleküle zu entwerfen oder um wirksame Inhibitoren zu identifizieren. Nützliche Beispiele für rationalen Wirkstoffentwurf können Moleküle umfassen, die verbesserte Fähigkeit oder Stabilität aufweisen, wie von Braxton & Wells, Biochemistry 31, 7796-7801 (1992) gezeigt wurde, oder die als Inhi bitoren, Agonisten oder Antagonisten von nativen Peptiden wirken, wie von Athauda et al., J. Biochem. 113, 742-746 (1993), gezeigt wurde.
Auch ist es möglich, einen Target-spezifischen Antikörper, ausgewählt mittels des funktionellen Tests, wie zuvor beschrieben zu isolieren und anschließend seine Kristallstruktur zu identifizieren. Dieser Ansatz ergibt, im Prinzip, einen Pharmacore, auf den darauf folgende Wirkstoffentwurf aufgebaut werden kann. Es ist möglich, Proteinkristallographie durch Bilden von anti-idiotypischen Antikörpern (anti-ids) gegen einen funktionellen, pharmakologisch aktiven Antikörper vollständig zu umgehen. Es wird angenommen, dass als ein Spiegelbild eines Spiegelbildes die Bindungsstelle der anti-ids zu jener des ursprünglichen Rezeptors analog ist. Die anti-ids könnten dann verwendet werden, um Peptide aus Banken chemisch oder biologisch gebildeter Peptide zu identifizieren und zu isolieren. Die isolierten Peptide würden dann als der Pharmacore wirken.
Dank der vorliegenden Erfindung können ausreichend große Mengen an PRO-Polypeptid zur Verfügung gestellt werden, um solche analytischen Studien wie Röntgenchromatographie durchzuführen. Darüber hinaus liefert das Wissen über die hierin bereitgestellte PRO-Polypeptid-Aminosäuresequenz einen Leitfaden für jene, die anstelle von oder zusätzlich zu Röntgenkristallographie mit Computer-Modellierungsverfahren arbeiten.
Hinterlegung von Material
Die folgenden Materialien wurden bei der American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC) hinterlegt: Tabelle 2
Diese Hinterlegung erfolgte gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und die darin enthaltenen Regelungen (Budapester Vertrag). Dies stellt die Erhaltung von lebensfähigen Kulturen der Hinterlegung 30 Jahre lang nach der Hinterlegung sicher. Die Hinterlegungen werden durch ATCC unter den Bestimmungen des Vertrags von Budapest zugänglich gemacht und unterliegen einem Abkommen zwischen Genentech, Inc., und ATCC, das permanente und uneingeschränkte öffentliche Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit bei Erteilung des gemäßen US-Patents oder bei Offenlegung jeglicher US- oder ausländischen Patentanmeldung sicherstellt, welche auch immer zuerst vorliegt, und das die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für jemanden sicherstellt, der vom US-Commissioner of Patents and Trademarks bestimmt wird, gemäß 35 USC § 122 und den demgemäßen Bestimmungen des Commissioners (umfassend 37 CFR § 1.14, unter besonderem Verweis auf 886 OG 638) dazu befugt zu sein.
Der Zessionar der vorliegenden Anmeldung hat sich bereit erklärt, die Materialien unverzüglich nach Kenntnisnahme durch eine andere oder dieselbe Kultur zu ersetzen, sofern eine Kultur der hinterlegten Materialien ansterben, verloren gehen oder zerstört werden sollte, obwohl sie unter geeigneten Bedingungen kultiviert wurde. Die Verfügbarkeit des hinterlegten Materials ist nicht als eine Lizenz zur praktischen Durchführung der Erfindung zu sehen, die einen Verstoß gegen die unter der Befugnis jeder beliebigen Regierung gemäß ihren Patentrechten zuerkannten Rechte darstellen würde.
Die obige Beschreibung wird als ausreichend erachtet, um Fachleute in die Lage zu versetzen, die Erfindung durchzuführen. Die vorliegende Erfindung ist durch das hinterlegte Konstrukt nicht in ihrem Schutzumfang eingeschränkt, da die hinterlegte Ausführungsform lediglich als eine Veranschaulichung bestimmter Aspekte der Erfindung zu betrachten ist, und jegliche Konstrukte, die mit diesem hinterlegten Konstrukt funktionell äquivalent sind, sind ebenfalls durch den Schutzumfang dieser Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, abgedeckt. Die Hinterlegung von Material hierin ist nicht mit einem Zugeständnis gleichzusetzen, dass die hierin festgehaltene Beschreibung inadäquat sei, die praktische Durchführung jedes Aspekts der Erfindung, umfassend den besten Modus davon, zu ermöglichen, noch ist sie als eine Einschränkung des Schutzumfangs der Ansprüche in Bezug auf die spezifischen Darstellungen, die sie darstellt, zu betrachten. Verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu jenen, die hierin gezeigt und beschrieben wurden, werden für Fachleute aus der obigen Beschreibung ersichtlich sein und fallen in den Schutzumfang der beiliegenden Ansprüche.

Claims

Isolierte Nucleinsäure, umfassend DNA, die für ein Polypeptid mit zumindest 80 % Sequenzidentität zur Sequenz der Aminosäurereste von 1 oder 20 bis 105, einschließlich, der in 2 (Seq.-ID Nr. 4) gezeigten Aminosäuresequenz kodiert, oder ihr Komplement, worin die Sequenzidentität über die volle Länge der verglichenen Sequenzen bestimmt wird.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, worin der Identitätsgrad zumindest 90 % beträgt.
Nucleinsäure nach Anspruch 2, worin der Identitätsgrad zumindest 95 % beträgt.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, die für ein Nativsequenz-Polypeptid kodiert, das die Aminosäuren 1 oder 20 bis 105, einschließlich, der in 2 (Seq.-ID Nr. 4) gezeigten Aminosäuresequenz umfasst.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, die die Codiersequenz voller Länge der in 1 (Seq.-ID Nr. 3) gezeigten Sequenz umfasst, oder ihr Komplement.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, die die in 1 (Seq.-ID Nr. 3) gezeigte Nucleotidsequenz umfasst, oder ihr Komplement.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das zumindest 80 % Sequenzidentität mit der Codiersequenz voller Länge der in 1 (Seq.-ID Nr. 3) gezeigten Nucleotidsequenz oder mit der Sequenz der Nucleotide 148 bis 405, einschließlich, aus 1 (Seq.-ID Nr. 3) aufweist, oder ihr Komplement, worin die Sequenzidentität über die volle Länge der verglichenen Sequenzen bestimmt wird.
Isolierte Nucleinsäure, die die Codiersequenz voller Länge des in der Zugriffsnummer ATCC 203091 enthaltenen Nucleinsäureinserts, DNA 60621-1516, umfasst.
Vektor, umfassend die Nucleinsäure nach einem der vorangehenden Ansprüche.
Vektor nach Anspruch 9, der operabel an Kontrollsequenzen gebunden ist, die durch eine mit dem Vektor transformierte Wirtszelle erkannt werden.
Wirtszelle, umfassend den Vektor nach Anspruch 9 oder Anspruch 10.
Wirtszelle nach Anspruch 11, worin die Zelle eine CHO-Zelle, ein E. coli oder eine Hefezelle ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 11 oder Anspruch 12 unter für Expression des Polypeptids geeigneten Bedingungen und das Gewinnen des Polypeptids aus der Zellkultur.
Isoliertes Polypeptid mit zumindest 80 % Sequenzidentität mit der Sequenz der Aminosäurereste von 1 oder 20 bis 105, einschließlich, der in 2 (Seq.-ID Nr. 4) gezeigten Aminosäuresequenz.
Polypeptid nach Anspruch 14, das aus der Sequenz der Aminosäurereste von 1 oder 20 bis 105, einschließlich, der in 2 (Seq.-ID Nr. 4) gezeigten Aminosäuresequenz besteht.
Isoliertes Polypeptid mit zumindest 80 % Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz, für die das in der Zugriffsnummer ATCC 203091 enthaltene Volllängen-Nucleinsäureinsert, DNA 60621-1516, kodiert, mit seinem oder ohne sein Signalpeptid.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 16, das aus der Aminosäuresequenz besteht, für die die Volllängen-Codiersequenz des in der Zugriffsnummer ATCC 203091 enthaltenen Nucleinsäureinserts, DNA 60621-1516, kodiert, mit seinem oder ohne sein Signalpeptid.
Polypeptid nach Anspruch 14 oder Anspruch 16, worin der Identitätsgrad zumindest 90 % beträgt.
Polypeptid nach Anspruch 18, worin der Identitätsgrad zumindest 95 % beträgt.
Hybridmolekül, umfassend ein an eine heterologe Aminosäuresequenz fusioniertes Polypeptid nach einem der Ansprüche 14 bis 19.
Hybridmolekül nach Anspruch 20, worin die heterologe Aminosäuresequenz eine Epitopmarkierungs-Sequenz ist.
Hybridmolekül nach Anspruch 20, worin die heterologe Aminosäuresequenz eine Fc-Region eines Immunglobulins ist.
Antikörper, der sich spezifisch an das Polypeptid nach Anspruch 15 oder Anspruch 17 bindet.
Antikörper nach Anspruch 23, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 23, worin der Antikörper ein humanisierter Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 23, worin der Antikörper ein zu Antigenbindung fähiges Antikörperfragment ist.
Zusammensetzung, umfassend den Antikörper nach einem der Ansprüche 23 bis 26 in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.