ES2287020T3

ES2287020T3 - Procedimiento y composiciones para inhibir el crecimiento de celulas neoplasicas.

Info

Publication number: ES2287020T3
Application number: ES00941164T
Authority: ES
Inventors: Kevin P. Baker; Audrey Goddard; Austin L. Gurney; Caroline Hebert; William Henzel; Rhona C. Kabakoff; David L. Shelton; Victoria Smith; Colin K. Watanabe; William I. Wood
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-06-02
Filing date: 2000-05-30
Publication date: 2007-12-16
Anticipated expiration: 2020-05-30
Also published as: JP2007029098A; CA2373915A1; WO2000073348A2; JP4074645B2; DK1185648T3; JP2006025793A; EP1185648A2; PT1185648E; JP2007029097A; WO2000073348A3; JP4145314B2; JP4072181B2; JP2007014346A; ATE357518T1; EP1185648B1

Abstract

Polipéptido aislado para utilizar en un procedimiento de tratamiento médico, teniendo dicho polipéptido: (i) la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Fig. 2 (SEC ID NO:2); (ii) la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc de longitud completa depositado bajo el número de accesso a la ATCC 203963; (iii) como mínimo un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de (i) o (ii), donde la identidad de secuencia se determina utilizando el programa de ordenador ALIGN-2 y donde el polipéptido es capaz de inhibir la proliferación de células tumorales.

Description

Procedimientos y composiciones para inhibir el crecimiento de células neoplásicas.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones para inhibir el crecimiento de células neoplásicas. En particular, la presente invención se refiere a composiciones y procedimientos antitumorales para el tratamiento de tumores. La invención se refiere además a procedimientos de cribado para identificar compuestos inhibidores del crecimiento, es decir, compuestos antitumorales.

Estado de la técnica anterior a la invención

Los tumores malignos (cánceres) son la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos después de la cardiopatía (Boeing et al., CA Cancel J. Clin., 43:7 (1993)).

El cáncer se caracteriza por un aumento en el número de células anormales o neoplásicas derivadas de un tejido normal que proliferan para formar una masa tumoral, la invasión de tejidos adyacentes por dichas células tumorales neoplásicas y la generación de células malignas que eventualmente se propagan vía la sangre o el sistema linfático a nódulos linfáticos regionales y a localizaciones distantes (metástasis). En el estado cancerígeno, una célula prolifera bajo condiciones en las cuales las células normales no crecerían. El cáncer se manifiesta propiamente en una amplia variedad de formas, caracterizadas por diferentes grados de carácter invasivo y de agresividad.

A pesar de los recientes avances en la terapia del cáncer, hay una gran necesidad de nuevos agentes terapéuticos capaces de inhibir el crecimiento de células neoplásicas. Por consiguiente, es objeto de la presente invención identificar compuestos capaces de inhibir el crecimiento de las células neoplásicas, por ejemplo las células cancerígenas.

Descripción resumida de la invención A. Realizaciones

La presente invención se refiere a composiciones para la inhibición del crecimiento de células neoplásicas. Más particularmente, la invención se refiere a composiciones para el tratamiento de tumores, incluyendo cánceres, por ejemplo de pecho, de próstata, de colon, de pulmón, de ovario, renal y los cánceres del SNC, leucemia, melanoma, etc, en paciente mamíferos, preferentemente humanos.

En un aspecto, la presente invención se refiere a composiciones de materia útil para la inhibición del crecimiento de células neoplásicas que comprende una cantidad efectiva de un polipéptido PRO tal como se define en el presente documento, mezclado con un transportador farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida, la composición de materia comprende una cantidad inhibidora del crecimiento de un polipéptido PRO. En otra realización preferida, la composición comprende un cantidad citotóxica de un polipéptido PRO. Opcionalmente, las composiciones de materia pueden contener uno o más agentes inhibidores del crecimiento y/o agentes citotóxicos y/o otros agentes quimioterapéuticos adicionales.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a composiciones de materia útiles para el tratamiento de un tumor en un mamífero que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido PRO tal como se define en el presente documento. El tumor es preferentemente un cáncer.

Las composiciones de la invención pueden utilizarse en un procedimiento para inhibir el crecimiento de una célula tumoral que comprende exponer la célula a una cantidad efectiva de un polipéptido PRO tal como se define en el presente documento. El procedimiento puede realizarse in vitro o in vivo.

En otra realización, la invención se refiere a un artículo de fabricación que comprende:

(a) Un recipiente;

(b) una composición que comprende una gente activo contenido en el recipiente; donde la composición es efectiva inhibiendo el crecimiento de la célula neoplásica, es decir, el crecimiento de células tumorales, y el agente activo en la composición es un polipéptido PRO tal como se ha definido en el presente documento; y

(c) una etiqueta pegada a dicho recipiente o un prospecto incluido en dicho recipiente, donde se hace referencia a la utilización de dicha composición en la inhibición del crecimiento de células neoplásicas.

Algunos artículos similares de fabricación que comprenden un polipéptido PRO tal como se definen en el presente documento en una cantidad que es terapéuticamente efectiva para el tratamiento de tumor se encuentran también dentro del alcance de la presente invención. También se encuentra dentro del alcance de la presente invención artículos de fabricación que comprenden un polipéptido PRO tal como se define en el presente documento y un agente adicional inhibidor del crecimiento, citotóxico o quimioterapéutico.

B. Realizaciones adicionales

En otras realizaciones de la presente invención, la invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PRO.

En un aspecto, la molécula aislada de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que tiene como mínimo aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 81% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 82% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 83% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 84% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 86% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 87% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 88% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 89% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 90% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 91% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 92% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 93% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 94% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 96% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 97% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 98% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 99% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos respecto a (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido PRO que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa tal como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos a la cual le falta el péptido señal, tal como se describe en el presente documento, un dominio extracelular de una proteína transmembrana, con o sin el péptido señal, tal como se describe en el presente documento o cualquier otro fragmento de la secuencia de aminoácidos de longitud completa definido de forma específica, tal como se describe en el presente documento, o (b) la cadena complementaria de la molécula de ADN de (a).

En otros aspectos, la molécula aislada de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que tiene como mínimo aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 81% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 82% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 83% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 84% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 86% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 87% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 88% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 89% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 90% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 91% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 92% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 93% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 94% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 96% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 97% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 98% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 99% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos respecto a (a) una molécula de ADN que comprende la secuencia codificante de un ADNc de un polipéptido PRO de longitud completa tal como se describe en el presente documento, la secuencia codificante de un polipéptido PRO a la cual le falta el péptido señal, tal como se describe en el presente documento, la secuencia que codifica un dominio extracelular de una proteína transmembrana, con o sin el péptido señal, tal como se describe en el presente documento o la secuencia que codifica cualquier otro fragmento de la secuencia de aminoácidos de longitud completa definido de forma específica, tal como se describe en el presente documento, o (b) la cadena complementaria de la molécula de ADN de (a).

En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene como mínimo aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 81% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 82% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 83% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 84% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 86% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 87% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 88% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 89% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 90% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 91% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 92% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 93% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 94% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 96% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 97% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 98% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 99% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos respecto a (a) una molécula de ADN que codifica el mismo polipéptido maduro codificado por cualquiera de los ADNc de proteínas humanas depositados en la ATCC, tal como se describe en el presente documento, o (b) la cadena complementaria de la molécula de ADN de
(a).

Otro aspecto de la invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PRO, en el cual, o bien se ha eliminado el dominio transmembrana o bien se ha inactivado el dominio transmembrana o bien es una secuencia complementaria a dicha secuencia de nucleótidos codificante, donde el (los) dominio(s) de dichos polipéptidos se describen en el presente documento. Por lo tanto, se contemplan los dominios extracelulares solubles de los polipéptidos PRO descritos en el presente documento.

Otra realización se centra en fragmentos de una secuencia codificante de un polipéptido PRO, o a la secuencia complementaria de la misma, que puede utilizarse, por ejemplo, como sonda de hibridación, parar codificar fragmentos de un polipéptido PRO que pueden codificar opcionalmente un polipéptido que comprende un sitio de unión para un anticuerpo anti-PRO o como sondas de oligonucleótidos antisentido. Dichos fragmentos de ácidos nucleicos tienen habitualmente como mínimo 20 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 40 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 60 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 80 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 90 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 110 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 120 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 130 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 140 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 150 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 160 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 170 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 180 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 190 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 200 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 250 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 300 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 350 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 400 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 450 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 500 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 600 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 700 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 800 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 900 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, significando en este contexto el término "aproximadamente" la secuencia de nucleótidos de referencia más o menos un 10% de dicha longitud referenciada. Se observa que puede determinarse de forma rutinaria novedosos fragmentos de una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido PRO, alineando la secuencia de nucleótidos que codifican el polipéptido PRO con otras secuencias de nucleótidos conocidas, utilizando cualquier programa entre una variedad de programas de alineación de secuencias conocidos, y determinando qué secuencia de nucleótidos que codifica el (los) fragmento(s) del polipéptido PRO son novedosas. Se contempla en el presente documento todas las secuencias que codifican polipéptidos PRO de este tipo. También se contempla los fragmentos de polipéptido PRO codificados por dichos fragmentos de moléculas de nucleótidos, preferentemente aquellos fragmentos de polipéptido PRO que comprenden un sitio de unión para un anticuerpo anti-PRO.

En otra realización, la invención proporciona un polipéptido aislado PRO codificado por cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos identificadas más arriba.

En un determinado aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado PRO que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene como mínimo aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 81% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 82% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 83% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 84% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 86% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 87% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 88% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 89% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 91% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 92% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 93% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 94% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 96% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 97% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 98% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 99% de identidad en la secuencia de aminoácidos respecto a un polipéptido PRO que tenga la secuencia de aminoácidos de longitud completa tal como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos a la cual le falta el péptido señal, tal como se describe en el presente documento, un dominio extracelular de una proteína transmembrana, con o sin el péptido señal, tal como se describe en el presente documento o cualquier otro fragmento de la secuencia de aminoácidos de longitud completa definido de forma específica, tal como se describe en el presente documento.

En otros aspectos, la invención se refiere a un polipéptido aislado PRO que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene como mínimo aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 81% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 82% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 83% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 84% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 86% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 87% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 88% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 89% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 91% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 92% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 93% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 94% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 96% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 97% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 98% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 99% de identidad en la secuencia de aminoácidos respecto a una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de los ADNc de proteínas humanas depositados en la ATCC, tal como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos a la cual le falta el péptido señal, tal como se describe en el presente documento, un dominio extracelular de una proteína transmembrana, con o sin el péptido señal, tal como se describe en el presente documento o cualquier otro fragmento de la secuencia de aminoácidos de longitud completa definido de forma específica, tal como se describe en el presente documento.

En otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado PRO que comprende una secuencia de aminoácidos que puntúa como mínimo aproximadamente un 80% de positivos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 81% de positivos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 82% de positivos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 83% de positivos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 84% de positivos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 85% de positivos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 86% de positivos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 87% de positivos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 88% de positivos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 89% de positivos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 90% de positivos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 91% de positivos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 92% de positivos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 93% de positivos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 94% de positivos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 95% de positivos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 96% de positivos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 97% de positivos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 98% de positivos y alternativamente como mínimo aproximadamente un 99% de positivos cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido PRO que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa, tal como se describe en el presente documento.

En un aspecto específico, la invención proporciona un polipéptido aislado PRO sin la secuencia señal N-terminal y/o la metionina iniciadora y que está codificado por una secuencia de nucleótidos que codifica dicha secuencia de aminoácidos tal como se ha descrito anteriormente. También se describen en el presente documento procedimientos para producir el mismo, donde dichos procedimientos comprenden cultivar una célula huésped que comprende un vector que comprende la molécula de ácido nucleico codificante apropiada en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido PRO y recuperar el polipéptido PRO a partir del cultivo celular.

Otro aspecto de la invención proporciona un polipéptido aislado PRO en el cual bien se ha eliminado el dominio transmembrana o se inactivado el dominio transmembrana. en el presente documento se describen también algunos procedimientos para producir el mismo, comprendiendo dichos procedimientos el cultivo de una célula huésped que comprende un vector que comprende la molécula de ácido nucleico codificante apropiada bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido PRO y la recuperación del polipéptido PRO a partir del cultivo celular.

También se contempla un procedimiento para identificar agonistas de un polipéptido PRO que comprende poner en contacto el polipéptido PRO con una molécula candidata y monitorizar una actividad biológica mediada por dicho polipéptido PRO. Preferentemente, el polipéptido PRO es un polipéptido PRO nativo.

En otra realización adicional, la invención se refiere a una composición de materia que comprende un polipéptido PRO en combinación con un transportador. Opcionalmente, el transportador es un transportador farmacéuticamente aceptable.

Otra realización de la presente invención se dirige a la utilización de un polipéptido PRO para la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de una enfermedad de la cual es responsable el polipéptido PRO.

En realizaciones adicionales de la presente invención, la invención proporciona vectores que comprenden ADN que codifica cualquiera de los polipéptidos descritos en el presente documento. También se proporcionan células huésped que comprenden cualquiera de dichos vectores. A modo de ejemplo, las células huésped pueden ser células CHO, de E. coli, de levadura o células de insecto infectadas con Baculovirus. Se proporciona también un procedimiento para obtener cualquiera de los polipéptidos descritos en el presente documento y comprende cultivar las células de huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido deseado y recuperar el polipéptido deseado a partir del cultivo celular.

En otras realizaciones, la invención proporciona moléculas quiméricas que comprenden cualquiera de los polipéptidos descritos en el presente documento fusionados a un polipéptido heterólogo o a una secuencia de aminoácidos heteróloga. Un ejemplo de dichas moléculas quiméricas comprenden cualquiera de los polipéptidos descritos en el presente documento fusionados a una secuencia tag de epítopo o a una región Fc de una inmunoglobulina.

También se contempla un anticuerpo que se une específicamente a cualquiera de los polipéptidos descritos más arriba o más abajo. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de cadena sencilla.

En otras realizaciones, la invención proporciona sondas de oligonucleótidos útiles para el aislamiento de secuencias de nucleótidos genómicas y de ADNc o como sondas antisentido, donde dichas sondas pueden derivarse de cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas más arriba o más abajo.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 1) de una secuencia nativa de un ADNc de PRO4400, donde la SEC ID NO: 1 es un clon designado en el presente documento como "DNA87974-2609".

La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 2) derivada de la secuencia codificante de la SEC ID NO: 1 mostrada en la Figura 1.

Descripción detallada de la invención

Los términos "polipéptido PRO" y "PRO", tal como se utilizan en el presente documento y siempre que vayan seguidos inmediatamente por una designación numérica, se refieren a diferentes polipéptidos, donde la designación completa (es decir, PRO/número) se refiere a secuencias de polipéptidos específicas, tal como se describe en el presente documento. Los términos "polipéptido PRO/número" y "PRO/número", donde el término "número" se proporciona como una designación numérica real tal como se utiliza en el presente documento, comprende secuencias de polipéptidos nativas y variantes de polipéptidos nativas (que se definirán con más detalle). Los polipéptidos PRO descritos en el presente documento pueden aislarse de una variedad de fuentes, por ejemplo de tipos de tejido humano o de otra fuente, o prepararse mediante procedimientos recombinantes o sintéticos.

Una "polipéptido PRO de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que la correspondiente al polipéptido PRO derivado de la naturaleza. Dicha secuencia nativa de polipéptidos PRO puede aislarse de la naturaleza o puede producirse vía métodos recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido PRO de secuencia nativa" comprende específicamente formas truncadas o formas secretadas presentes en la naturaleza del polipéptido PRO específico (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular), formas variantes presentes en la naturaleza (por ejemplo formas alternativas del proceso de corte y empalme) y variantes alélicas del polipéptido presentes en la naturaleza. En varias realizaciones de la invención, los polipéptidos PRO de secuencia nativa descritos en el presente documento son polipéptidos de secuencia nativa de longitud completa que comprenden las secuencias de aminoácidos de longitud completa mostradas en las figuras adjuntas. Los codones de inicio y terminación se indican en negrita y subrayados en las figuras. Sin embargo, aunque en las figuras adjuntas se muestra que el polipéptido PRO descrito comienza con residuos de metionina designados en el presente documento como la posición de aminoácido 1 en las figuras, es concebible y posible que otros residuos de metionina localizados secuencia arriba o secuencia debajo de la posición de aminoácido indicada como 1 en las figuras, puedan emplearse como el residuo de aminoácido inicial para los polipéptidos PRO.

El término "dominio extracelular" o "ECD" del polipéptido PRO se refiere a una forma del polipéptido PRO que se encuentra esencialmente libre de los dominios transmembrana y citoplasmático. Normalmente, un polipéptido PRO ECD tendrá menos de un 1% de dichos dominios transmembrana y/o citoplasmático y preferentemente tendrá menos del 0,5% de dichos dominios. Se entenderá que cualquier dominio transmembrana identificado para los polipéptidos PRO de la presente invención se identifica según criterios empleados rutinariamente en el estado de la técnica para identificar dicho tipo de dominio hidrofóbico. Los límites exactos de un domino transmembrana pueden variar pero más probablemente no en más de aproximadamente 5 aminoácido en cualquier extremo del dominio tal como se ha identificado inicialmente en el presente documento. Por lo tanto, opcionalmente, un dominio extracelular de un polipéptido PRO puede contener de aproximadamente 5 aminoácidos o menos en cada lado de la frontera dominio transmembrana / dominio extracelular, tal como se ha identificado en los ejemplos o en la descripción y dichos polipéptidos, con o sin el péptido señal asociado, y el ácido nucleico que los codifica, se contemplan en la presente invención.

La localización aproximada de los "péptidos señal" de los diferentes polipéptidos PRO descritos en el presente documento se muestran en la presente descripción y/o en las figuras adjuntas. Se observa, sin embargo, que el límite C terminal de un péptido señal puede variar, pero más probablemente no en más de aproximadamente 5 aminoácidos en cada lado del límite C terminal del péptido señal tal como se ha identificado inicialmente en el presente documento, donde el límite C-terminal del péptido señal puede identificarse según criterios empleados rutinariamente en el estado de la técnica para identificar dicho tipo de elemento de la secuencia de aminoácidos (véase por ejemplo Nielsen et al., Prot. Eng., 10:1-6 (1997) y von Heinje et al., Nucl. Acids Res., 14:4683-4690 (1986)). Además, se reconoce que, en algunos casos, la escisión de una secuencia señal a partir de un polipéptido secretado no es completamente uniforme, dando como resultado más de una especie secretada. Dichos polipéptidos maduros, donde el péptido señal se escinde dentro de una región de no más de aproximadamente 5 aminoácidos a ambos lados del límite C-terminal del péptido señal tal como se ha identificado en el presente documento, y los polipéptidos que lo codifican, se contemplan en la presente invención. El término "variante de polipéptido PRO" significa un polipéptido PRO activo tal como se define más arriba o más abajo, que tiene como mínimo aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos respecto a un polipéptido PRO que tenga la secuencia de aminoácidos de longitud completa tal como se describe en el presente documento, una secuencia polipeptídica PRO que carece del péptido señal, tal como se describe en el presente documento, un dominio extracelular de una polipéptido PRO, con o sin el péptido señal, tal como se describe en el presente documento o cualquier otro fragmento de la secuencia de polipéptido PRO de longitud completa definido de forma específica, tal como se describe en el presente documento. Dichas variantes de polipéptido PRO incluyen, por ejemplo, polipéptidos PRO donde se añaden o se eliminan uno o más residuos de aminoácido en el extremo N-terminal o C-terminal de la secuencia de aminoácidos nativa de longitud completa. Normalmente, una variante de polipéptido PRO tendrá como mínimo un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 81% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 82% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 83% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 84% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 86% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 87% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 88% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 89% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 91% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 92% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 93% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 94% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 96% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 97% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 98% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 99% de identidad en la secuencia de aminoácidos respecto a un polipéptido PRO que tenga la secuencia de aminoácidos de longitud completa tal como se describe en el presente documento, una secuencia polipeptídica PRO que carece del péptido señal, tal como se describe en el presente documento, un dominio extracelular de una polipéptido PRO, con o sin el péptido señal, tal como se describe en el presente documento o cualquier otro fragmento de la secuencia de polipéptido PRO de longitud completa definido de forma específica, tal como se describe en el presente documento. Normalmente, las variantes de polipéptidos PRO tienen como mínimo aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 30 aminoácidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 40 aminoácidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 60 aminoácidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 70 aminoácidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 80 aminoácidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 90 aminoácidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 150 aminoácidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 200 aminoácidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 300 aminoácidos de longitud, o más. El término "porcentaje (%) de identidad en la secuencia de aminoácidos" en relación a las secuencias polipeptídicas PRO identificadas en el presente documento se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido en una secuencia PRO, después de alinear las secuencias y de introducir intervalos de separación, si fuera necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia y sin considerar las sustituciones conservativas como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento, con el objetivo de determinar el porcentaje de identidad en la secuencia de aminoácidos, puede conseguirse de varias maneras que se encuentran dentro del conocimiento medio en la técnica, por ejemplo, utilizando software de ordenador comercial como por ejemplo el software BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR). Los expertos medios en la técnica podrán determinar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir un alineamiento máximo a lo largo de la longitud completa de las secuencias a comparar. Sin embargo, para los fines de la presente invención, los valores de % de identidad en la secuencia de aminoácidos se obtienen tal como se describe más abajo, utilizando el programa de ordenador para la comparación de secuencias ALIGN-2, proporcionándose el código fuente completo para el programa ALIGN-2 en la Tabla 1. Genentech, Inc. es el autor del programa de ordenador para la comparación de secuencias ALIGN-2 y el código fuente mostrado en la Tabla 1 se ha registrado con la documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los EEUU, Washington D.C., 20559, donde se ha registrado bajo el número de registro de derechos de autor de los EEUU No. TXU510087. El programa ALIGN-2 lo comercializa Genentech, Inc. South San Francisco, Califormia o puede recopilarse a partir del código fuente proporcionado en la Tabla 1. El programa ALIGN-2 debe recopilarse para su utilización en un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX digital V4.0D. Todos los parámetros comparativos de secuencia son asignados por el programa ALIGN-2 y no se varían.

Para los propósitos de la presente invención, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de una determinada secuencia de aminoácidos A respecto a o contra una determinada secuencia de aminoácidos B (la cual puede formularse alternativamente como una determinada secuencia de aminoácidos A que tiene o comprende un determinado % de identidad en la secuencia de aminoácidos respecto a, o contra una determinada secuencia de aminoácidos B) se calcula como se indica a continuación:

100 veces la fracción X / Y

donde X es el número de residuos de aminoácido que ha puntuado correspondencias idénticas mediante el programa de alineación de secuencia ALIGN-2 en el alineamiento de A y B con dicho programa, y donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se observará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de A respecto a B no será igual al % de identidad en la secuencia de aminoácidos de B respecto a A. Como ejemplos de cálculos de porcentajes de identidad en la secuencia de aminoácidos, las Tablas 2-3 demuestran cómo calcular el porcentaje de identidad en la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácido designada "Proteína Comparativa" respecto a la secuencia de aminoácidos designada "PRO".

A menos que de forma específica se indique lo contrario, todos los valores de porcentajes de identidad en la secuencia de aminoácidos utilizados en el presente documento se obtienen tal como se ha descrito más arriba, utilizando el programa de ordenador para la comparación de secuencias ALIGN-2. Sin embargo, también puede determinarse el porcentaje de identidad en la secuencia de aminoácidos utilizando el programa para la comparación de secuencias NCBI-BLAST-2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)). El programa para la comparación de secuencias NCBI-BLAST-2 puede descargarse a partir de http://www.ncbi.nlm.nih.gov o también puede obtenerse del Insituto Nacional de la Salud de los EEUU, Bethesda, MD. NCBI-BLAST-2 utiliza diversos parámetros de búsqueda, donde todos dichos parámetros de búsqueda se ajustan a valores por defecto que incluyen, por ejemplo no enmascarados = sí, cadena = todos, coincidencias esperadas = 10, longitud de baja complejidad mínima = 15/5, e-valor de paso múltiple = 0,01, constante de paso múltiple = 25, caída para la alineación final con intervalos de separación = 25 y matriz de puntuación = BLOSUM62.

En situaciones en las cuales se utiliza NCBI-BLAST2 para las comparaciones de las secuencias de aminoácidos, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de una determinada secuencia de aminoácidos A respecto a o contra una determinada secuencia de aminoácidos B (la cual puede formularse alternativamente como una determinada secuencia de aminoácidos A que tiene o comprende un determinado % de identidad en la secuencia de aminoácidos respecto a, o contra una determinada secuencia de aminoácidos B) se calcula como se indica a continuación:

100 veces la fracción X / Y

donde X es el número de residuos de aminoácido que ha puntuado correspondencias idénticas mediante el programa de alineación de secuencia NCBI-BLAST2 en el alineamiento de A y B con dicho programa, y donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se observará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de A respecto a B no será igual al % de identidad en la secuencia de aminoácidos de B respecto a A.

Adicionalmente, el porcentaje de identidad en la secuencia de aminoácidos puede determinarse también utilizando el programa de ordenador WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)). La mayoría de los parámetros de búsqueda de WU-BLAST-2 se ajustan a valores por defecto. Aquellos parámetros que no se ajustan a valores por defecto, es decir, los parámetros variables, se ajustan dentro de los siguientes valores: intervalo de solapamiento = 1, fracción de solapamiento = 0.125, umbral de palabra (T) = 11 y matriz de puntuación = BLOSUM62. Para los propósitos de la presente invención, un valor de porcentaje de identidad en la secuencia de aminoácidos se determina dividiendo (a) el número de residuos de aminoácidos que encajan de forma idéntica entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO de interés (es decir, la secuencia contra la cual se comparar el polipéptido PRO de interés, el cual puede ser una variante de polipéptido PRO) según se determina mediante WU-BLAT-2 por (b) el número total de residuos de aminoácido del polipéptido PRO de interés. Por ejemplo, en la frase "un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos A que tiene como mínimo un 80% de identidad de secuencia respecto a la secuencia de aminoácidos B", la secuencia de aminoácidos A es la secuencia de aminoácidos de comparación de interés y la secuencia de aminoácidos B es la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO de interés.

El término "polinucleótido variante PRO" o "secuencia de ácidos nucleicos variante PRO" significa una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO activo, tal y como se define más abajo y que tiene que tiene como mínimo aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de nucleótidos respecto a una secuencia que codifique una secuencia de polipéptido PRO nativo de longitud completa tal como se describe en el presente documento, una secuencia polipeptídica PRO nativa de longitud completa que carece del péptido señal, tal como se describe en el presente documento, un dominio extracelular de un polipéptido PRO, con o sin el péptido señal, tal como se describe en el presente documento o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptido PRO de longitud completa, tal como se describe en el presente documento. Normalmente, polinucleótido variante PRO tendrá como mínimo un 80% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 81% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 82% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 83% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 84% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 86% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 87% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 88% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 89% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 91% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 92% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 93% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 94% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 96% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 97% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 98% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente como mínimo aproximadamente un 99% de identidad en la secuencia de aminoácidos respecto a un polipéptido PRO que tenga la secuencia de aminoácidos de longitud completa tal como se describe en el presente documento, una secuencia polipeptídica PRO que carece del péptido señal, tal como se describe en el presente documento, un dominio extracelular de un polipéptido PRO, con o sin el péptido señal, tal como se describe en el presente documento o cualquier otro fragmento de la secuencia de polipéptido PRO de longitud completa definido de forma específica, tal como se describe en el presente documento.

Normalmente, los polinucleótidos variantes PRO tienen como mínimo aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 60 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 90 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 120 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 150 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 180 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 210 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 240 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 270 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 300 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 450 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 600 nucleótidos de longitud, alternativamente como mínimo aproximadamente 900 nucleótidos de longitud, o más. El término "porcentaje (%) de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos" en relación a las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido PRO identificadas en el presente documento se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los nucleótidos en una secuencia PRO, después de alinear las secuencias y de introducir intervalos de separación, si fuera necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia y sin considerar las sustituciones conservativas como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento, con el objetivo de determinar el porcentaje de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, puede conseguirse de varias maneras que se encuentran dentro del conocimiento medio en la técnica, por ejemplo, utilizando software de ordenador comercial como por ejemplo el software BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR). Los expertos medios en la técnica podrán determinar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir un alineamiento máximo a lo largo de la longitud completa de las secuencias a comparar. Sin embargo, para los fines de la presente invención, los valores de % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos se obtienen tal como se describe más abajo, utilizando el programa de ordenador para la comparación de secuencias ALIGN-2, proporcionándose el código fuente completo para el programa ALIGN-2 en la Tabla 1. Genentech, Inc. es el autor del programa de ordenador para la comparación de secuencias ALIGN-2 y el código fuente mostrado en la Tabla 1 se ha registrado con la documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los EEUU, Washington D.C., 20559, donde se ha registrado bajo el número de registro de derechos de autor de los EEUU No. TXU510087. El programa ALIGN-2 lo comercializa Genentech, Inc. South San Francisco, California o puede recopilarse a partir del código fuente proporcionado en la Tabla 1. El programa ALIGN-2 debe recopilarse para su utilización en un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX digital V4.0D. Todos los parámetros comparativos de secuencia son asignados por el programa ALIGN-2 y no se varían.

Para los propósitos de la presente invención, el % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de una determinada secuencia de ácidos nucleicos C respecto a, con o contra una determinada secuencia de ácidos nucleicos D (la cual puede formularse alternativamente como una determinada secuencia de ácidos nucleicos C que tiene o comprende un determinado % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos respecto a, o contra una determinada secuencia de ácidos nucleicos D) se calcula como se indica a continuación:

100 veces la fracción W / Z

donde W es el número de nucleótidos que ha puntuado correspondencias idénticas mediante el programa de alineación de secuencia ALIGN-2 en el alineamiento de C y D con dicho programa, y donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se observará que si la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de C respecto a D no será igual al % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de D respecto a C. Como ejemplos de cálculos de porcentajes de identidad en la secuencia de aminoácidos, las Tablas 4-5 demuestran cómo calcular el porcentaje de identidad en la secuencia de aminoácidos de la secuencia de ácidos nucleicos designada "ADN Comparativo" respecto a la secuencia de ácidos nucleicos designada "PRO-ADN".

A menos que de forma específica se indique lo contrario, todos los valores de porcentajes de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos utilizados en el presente documento se obtienen tal como se ha descrito más arriba, utilizando el programa de ordenador para la comparación de secuencias ALIGN-2. Sin embargo, también puede determinarse el porcentaje de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos utilizando el programa para la comparación de secuencias NCBI-BLAST-2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)). El programa para la comparación de secuencias NCBI-BLAST-2 puede descargarse a partir de http://www.ncbi.nlm.nih.gov o también puede obtenerse del Insituto Nacional de la Salud de los EEUU, Bethesda, MD. NCBI-BLAST-2 utiliza diversos parámetros de búsqueda, donde todos dichos parámetros de búsqueda se ajustan a valores por defecto que incluyen, por ejemplo no enmascarados = sí, cadena = todos, coincidencias esperadas = 10, longitud de baja complejidad mínima = 15/5, e-valor de paso múltiple = 0,01, constante de paso múltiple = 25, caída para la alineación final con intervalos de separación = 25 y matriz de puntuación = BLOSUM62.

En situaciones en las cuales se utiliza NCBI-BLAST2 para las comparaciones de las secuencias de ácidos nucleicos, el % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de una determinada secuencia de ácidos nucleicos C respecto a, con o contra una determinada secuencia de ácidos nucleicos D (la cual puede formularse alternativamente como una determinada secuencia de ácidos nucleicos C que tiene o comprende un determinado % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos respecto a, con o contra una determinada secuencia de ácidos nucleicos D) se calcula como se indica a continuación:

100 veces la fracción W / Z

donde W es el número de nucleótidos que ha puntuado correspondencias idénticas mediante el programa de alineación de secuencia NCBI-BLAST2 en el alineamiento de C y D con dicho programa, y donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se observará que si la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de C respecto a D no será igual al % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de D respecto a C.

Adicionalmente, el porcentaje de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos puede determinarse también utilizando el programa de ordenador WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)). La mayoría de los parámetros de búsqueda de WU-BLAST-2 se ajustan a valores por defecto. Aquellos parámetros que no se ajustan a valores por defecto, es decir, los parámetros variables, se ajustan dentro de los siguientes valores: intervalo de solapamiento = 1, fracción de solapamiento = 0,125, umbral de palabra (T) = 11 y matriz de puntuación = BLOSUM62. Para los propósitos de la presente invención, un valor de porcentaje de identidad en la secuencia de aminoácidos se determina dividiendo (a) el número de nucleótidos que encajan de forma idéntica entre la secuencia de ácidos nucleicos del polipéptido PRO de interés (es decir, la secuencia contra la cual se comparar el polipéptido PRO de interés, el cual puede ser una variante de polipéptido PRO) según se determina mediante WU-BLAST-2 por (b) el número total de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO de interés. Por ejemplo, en la frase "una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos A que tiene como mínimo un 80% de identidad de secuencia respecto a la secuencia de ácidos nucleicos B", la secuencia de ácidos nucleicos A es la secuencia de ácidos nucleicos de comparación de interés y la secuencia de ácidos nucleicos B es la secuencia de la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO de interés.

En otras realizaciones, los polinucleótidos variantes PRO son moléculas de ácidos nucléicos que codifican un polipéptido PRO activo y que son capaces de hibridizar, preferentemente en condiciones de hibridación y de lavado astringentes, a secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido PRO de longitud completa mostrado en las figuras que acompañan el presente documento. Los polipéptido variantes PRO pueden ser aquellos codificados por un polinucleótido variante PRO.

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El término "positivos", en el contexto de las comparaciones de identidad de secuencia de aminoácidos llevadas a cabo tal como se describe más arriba, incluye no sólo residuos de aminoácidos en las secuencias comparadas que son idénticos, sino también aquellos que tienen propiedades similares. Los residuos de aminoácidos que puntúan un valor positivo respecto a un residuo de aminoácido de interés son aquellos que o bien son idénticos al residuo de aminoácido de interés o que son una sustitución preferida (tal como se define en la Tabla 6 más abajo) del residuo de aminoácido de interés.

Para los propósitos de la presente invención, el valor del % de positivos de una determinada secuencia de aminoácidos A respecto a, con o contra una determinada secuencia de aminoácidos B (la cual puede formularse alternativamente como una determinada secuencia de aminoácidos A que tiene o comprende un determinado % de positivos respecto a, o contra una determinada secuencia de aminoácidos B) se calcula como se indica a continuación:

100 veces la fracción X / Y

donde X es el número de residuos de aminoácido que ha puntuado un valor positivo mediante el programa de alineación de secuencia ALIGN-2 en el alineamiento de A y B con dicho programa, y donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se observará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de positivos de A respecto a B no será igual al % de positivos de B respecto a A.

El término "aislado" cuando se utilizad para describir los diferentes polipéptidos descritos en el presente documento, significa un polipéptido que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Preferentemente, el polipéptido aislado se encuentra libre de asociación con todos los componentes con los cuales se encuentra asociado en la naturaleza. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirán típicamente con los usos diagnóstico o terapéutico del polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos, En algunas realizaciones preferidas, el polipéptido se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener como mínimo 15 residuos de una secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante la utilización de un secuenciador de taza giratoria o (2) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. Los polipéptidos aislados incluyen polipéptidos in situ dentro de células recombinantes, dado que como mínimo un componente del entorno natural del polipéptido PRO no estará presente. Sin embargo, normalmente se prepararan los polipéptidos aislados mediante como mínimo una etapa de purificación.

Una molécula "aislada" de ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO o una molécula "aislada" de ácido nucleico que codifica un anticerpo anti-PRO es una molécula de ácido nucleico que se ha identificado y separado de cómo mínimo una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual se encuentra asociada normalmente en la fuente natural del ácido nucleico que codifica PRO o en la fuente natural del ácido nucleico que codifica anti-PRO. Preferentemente, el ácido nucleico aislado se encuentra libre de asociación con todos los componentes con los cuales se encuentra asociado en la naturaleza. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un PRO o una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un anti-PRO es diferente que en la forma o entorno en el cual se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas aisladas de ácido nucleico se distinguen de la molécula de ácido nucleico que codifica PRO o de la molécula de ácido nucleico que codifica anti-PRO tal como existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO o una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-PRO incluye moléculas de ácido nucleico PRO o moléculas de ácido nucleico anti-PRO contenidas en las células que expresan normalmente polipéptidos PRO o anticuerpos anti-PRO donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se encuentra en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.

El término "secuencias control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencias operadora y un sitio de unión a cromosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

Un ácido nucleico se encuentra "unido operativamente" cuando se encuentra situada en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o de un líder secretor se encuentra unido operativamente al ADN de un polipéptido PRO si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador se encuentra unido operativamente a un secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma se encuentra unido operativamente a una secuencia codificante si está colocado de tal manera que facilita la traducción. Generalmente, el término "unido operativamente" quiere decir que las secuencias de ADN unidas son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que se contiguos. La unión se consigue mediante ligación en los sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, los adaptadores de oligonucleótidos sintéticos o conectores se utilizan de acuerdo con la práctica convencional.

El término "anticuerpo" se utiliza en su sentido más amplio y cubre específicamente, por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-PRO (incluyendo anticuerpos agonistas), composiciones de anticuerpos anti-PRO con especificidad poliepitópica, anticuerpos anti-PRO de cadena sencilla y fragmentos de anticuerpos anti-PRO (véase más abajo). El término "anticuerpo monoclonal" en el sentido utilizado en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por el hecho de pueden estar presentes posibles mutaciones existentes en la naturaleza, en cantidades menores.

La "astringencia" de una reacción de hibridación puede ser fácilmente determinada por un experto medio en la técnica y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, de la temperatura de lavado y de la concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más elevadas para una correcta hibridación, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado de rehibridar cuando se encuentran presentes cadenas complementarias en un entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto más elevado sea el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridizable, mayor será la temperatura relativa que puede utilizarse. Como resultado, se deduce que temperaturas relativas mayores tenderán a hacer las condiciones de reacción más astringentes, mientras que las temperaturas más bajas menos. Para obtener información sobre detalles adicionales y una explicación de la astringencia de las reacción de hibridación, véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Wiley Interscience Publishers, 1995).

El término "condiciones astringentes" o "condiciones de alta astringencia", tal como se define en el presente documento, pueden ser identificadas por aquellas condiciones que: (1) emplean una fuerza iónica baja y una elevada temperatura de lavado, por ejemplo cloruro sódico 0,015 M / citrato sódico 0,0015 M / dodecil sulfato de sodio al 0,1% a 50ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, por ejemplo formaida, por ejemplo un 50% (v/v) de formamida con un 0,1% de albúmina de suero bovino / Ficoll al 0,1% / polivinilpirrolidona al 1% / tampón de fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o (3) emplean formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextran al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico / citrato sódico) y un 50% de formamida a 55ºC, seguido de un lavado de alta astringencia que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.

Las condiciones moderadamente astringentes'' pueden identificarse tal como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (NewYork: Cold Spring Harbor Press, 1989) e incluyen la utilización de solución de lavado y de condiciones de hibridación (por ejemplo temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos astringentes que las descritas más arriba. Un ejemplo de condiciones moderadamente astringentes es una incubación a 37ºC en una disolución que comprende: un 20% de formamide, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7.6), 5 x disolución de Denhardt, 10% de sulfato de dextran y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón sonicado, seguido de un lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37º-50ºC. el experto medio en la técnica identificará cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc, de la forma necesaria para acomodar factores tipo longitud de sonda y similares.

El término "etiquetado con epítopo" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido PRO fusionado a un "polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el cual puede realizarse un anticuerpo, pero es suficientemente corto para no interferir con la actividad del polipéptido al cual se encuentra fusionado. El polipéptido etiqueta es preferentemente bastante único, de manera que el anticuerpo no se entrecruzará sustancialmente con otros epítopos. Algunos polipéptidos etiqueta adecuados tienen generalmente como mínimo seis residuos de aminoácido y habitualmente entre 8 y 50 residuos de aminoácido (preferentemente, entre aproximadamente 10 y 20 residuos de aminoácido).

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "inmunoadhesina" designa moléculas tipo ab que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de dominios constantes de inmunoglobulinas. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácido con la especificidad de unión deseada diferente del sitio de reconocimiento y unión a antígeno de un ab (es decir, es "heteróloga") y una secuencia del dominio constante de inmunoglobulina. La parte adhesina de una molécula de inmunoadhesina es típicamente una secuencia contigua de aminoácidos que comprende como mínimo el sitio de unión de un receptor o un ligando. La secuencia del dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse a partir de cualquier inmunoglobulina, por ejemplo los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o Inmunoglobulina-4, IgA (incluyendo IgA-1 y IgA-2), IgE, IgD o IgM.

Los términos "activo" o "actividad" en el presente documento se refiere a una forma(s) de polipéptidos PRO que retiene una actividad biológica y/o inmunológica de polipéptidos PRO nativos o existentes en la naturaleza, donde el término actividad "biológica" se refiere a una función biológica (bien inhibidora o estimuladora) provocada por un polipéptido PRO nativo o existente en la naturaleza diferente de la capacidad de inducir la producción de un ab contra un epítopo antigénico existente en un polipéptido PRO nativo o existente en la naturaleza y una actividad "inmunológica" se refiere a la capacidad de inducir la producción de un ab contra un epítopo antigénico existente en un polipéptido PRO nativo o existente en la naturaleza.

El término "actividad biológica" en el contexto de un ab y otro agonista que puede identificarse mediante ensayos de cribado descritos en el presente documento (por ejemplo una molécula pequeña orgánica o inorgánica) se utiliza en el sentido de la capacidad de dichas moléculas de invocar uno o más de los efectos que se enumeran en el presente documento en conexión con la definición de una "cantidad terapéuticamente efectiva". En una realización específica, el término "actividad biológica" es la capacidad de inhibir el crecimiento o proliferación de células neoplásicas. Una actividad biológica preferida es la inhibición, incluyendo la retardación o la parada completa, del crecimiento de una célula diana tumoral (por ejemplo cáncer).

La frase "actividad inmunológica" significa reactividad cruzada inmunológica con como mínimo un epítopo de un polipéptido PRO. El término "reactividad cruzada inmunológica" tal como se utilizada en el presente documento significa que el polipéptido candidato es capaz de inhibir completamente la actividad biológica cualitativa de un polipéptido PRO activo ante antisuero policlonal obtenido contra el polipéptido PRO activo conocido. Dichos antisueros se preparan de la manera convencional inyectando cabras o conejos, por ejemplo subcutáneamente con el análogo activo conocido en adyuvante de Freund completo, seguido de una inyección intraperitoneal o subcutánea con impulsión en adyuvante de Freund completo. La reactividad cruzada inmunológica es preferentemente "específica", lo cual significa que la afinidad de unión de la molécula con reactividad cruzada inmunológica (por ejemplo anticuerpo) identificada, por el polipéptido PRO correspondiente, es significativamente mayor (preferentemente como mínimo aproximadamente 2 veces, más preferentemente como mínimo aproximadamente 4 veces, incluso más preferentemente como mínimo aproximadamente 6 veces, más preferentemente como mínimo aproximadamente 8 veces mayor) que la afinidad de unión de dicha molécula por cualquier otro polipéptido nativo conocido.

El término "tumor" tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a todo crecimiento y proliferación de células neoplásicas, sean malignas o benignas y a todas las células y tejidos cancerosos y pre-cancerosos.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen el estado fisiológico en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Algunos ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Algunos ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen el cáncer de pecho, el cáncer de próstata, el cáncer de colon, el cáncer de células escamosas, el cáncer de pulmón de células pequeñas, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el cáncer de ovario, el cáncer cervical, el cáncer gastrointestinal, el cáncer pancreático, el gliobastoma, el cáncer de hígado, el cáncer de vejiga, el hematoma, el cáncer colorectal, el carcinoma endometrial, el carcinoma de glándulas salivares, el cáncer de riñón, el cáncer de vulva, el cáncer tiroideo, el carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello.

El término "tratamiento" es una intervención llevada a cabo con la intención de prevenir el desarrollo o alterar la patología de una enfermedad. Así pues, el término "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. Los individuos que necesitan un tratamiento incluyen individuos que ya tienen la enfermedad así como individuos en los cuales la enfermedad debe prevenirse. En un tratamiento de un tumor (por ejemplo cáncer), un agente terapéutico puede disminuir directamente la patología de las células tumorales o rendir las células tumorales más susceptibles al tratamiento con otros agentes terapéuticos, por ejemplo radiación y/o quimioterapia.

La "patología" del cáncer incluye todos los fenómenos que comprometen el bienestar del paciente. Esto incluye, sin limitación, un crecimiento celular anormal o incontrolable, la metástasis, la interferencia con el funcionamiento normal de células vecinas, la liberación de citoquinas u otros productos secretores a niveles anormales, la supresión o agravación de una respuesta inflamatoria o inmunológica, etc.

Una "cantidad efectiva" de un polipéptido descrito en el presente documento o un agonista del mismo, en referencia a la inhibición del crecimiento de células neoplásicas, es una cantidad capaz de inhibir, en cierta medida, el crecimiento de las células diana. El término incluye una cantidad capaz de invocar un efecto inhibidor del crecimiento, un efecto citostático y/o citotóxico y/o la apoptosis de las células diana. Una "cantidad efectiva" de un polipéptido PRO o de un agonista del mismo con el objetivo de inhibir el crecimiento celular neoplásico puede determinarse empíricamente y de una forma rutinaria.

Una "cantidad terapéuticamente efectiva", en referencia al tratamiento del tumor, se refiere a una cantidad capaz de provocar uno o más de los siguientes efectos: (1) una inhibición, en cierto grado, del crecimiento tumoral, incluyendo la retardación o la completa detención del crecimiento; (2) una reducción del número de células tumorales; (3) una reducción del tamaño del tumor; (4) una inhibición (es decir, una reducción, una retardación o una detección completa) de la infiltración de células tumorales en los órganos periféricos; (5) la inhibición (es decir, una reducción, una retardación o una detección completa) de la metástasis; (6) un aumento de una respuesta inmune anti-tumoral, que puede, pero no tiene por qué, provocar la regresión o el rechazo del tumor; y/o (7) una liberación, en cierto grado, de uno o más síntomas asociados con la enfermedad. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un polipéptido PRO o de un agonista del mismo con fines de tratamiento de un tumor pueden determinarse empíricamente y de una manera rutinaria.

Una "cantidad inhibidora del crecimiento" de un polipéptido PRO o de un agonista del mismo es una cantidad capaz de inhibir el crecimiento de una célula, especialmente un tumor, por ejemplo una célula cancerígena, bien in vitro o in vivo. Una "cantidad inhibidora del crecimiento" de un polipéptido PRO o de un agonista del mismo con fines de tratamiento de un tumor pueden determinarse empíricamente y de una manera rutinaria.

Una "cantidad citotóxica" de un polipéptido PRO o de un agonista del mismo es una cantidad capaz de provocar la destrucción de una célula, especialmente un tumor, por ejemplo una célula cancerígena, bien in vitro o in vivo. Una "cantidad citotóxica" de un polipéptido PRO o de un agonista del mismo con fines de tratamiento de un tumor pueden determinarse empíricamente y de una manera rutinaria.

El término "agente citotóxico" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o provoca la destrucción de las células. Se pretende que el términ incluya isótopos radioactivos (por ejemplo I^{131}, I^{125}, Y^{90} y Re^{186}), agentes quimioterapéuticos o toxinas, por ejemplo toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal o fragmentos de los mismos.

Un "agente quimoterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de un tumor, por ejemplo cáncer. Algunos ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen adriamicina, doxorubicina, epirubicina, 5-fluorouracilo, arabinosida de citosina ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, busulfano, citoxina, taxoides, por ejemplo paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), y doxetaxel (Taxotere, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Rnace), toxotere, metotrexato, cisplatino, melfalano, vinblastina, bleomicina, etoposido, ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatino, teniposido, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, esperamicinas (véase la patente EEUU No. 4,675,187), melfalano y otras mostazas de nitrógeno relacionadas. También se incluye en esta definición los agentes hormonales que actúan regulando o inhibiendo la acción hormonal sobre tumores, como por ejemplo tamoxifeno y onapristona.

Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se utiliza en el presente documento se refiere a un compuesto o una composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente un tumor, por ejemplo una célula cancerígena, bien in Vitro o in vivo. Por lo tanto, el agente inhibidor del crecimiento es aquel que reduce significativamente el porcentaje de las células diana en fase S. Algunos ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen los agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un punto diferente de fase S), como por ejemplo los agentes que inducen el arresto de G1 y el arresto de la fase M. Algunos bloqueadores clásicos de fase M incluyen los vincas (vincristina y vinblastina), taxol e inhibidores topo II como por ejemplo doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposido, y bleomicina. Los agentes que detienen G I y que también desbordar la detención de la fase S-phase, for example, agentes alquilantes de ADN como por ejemplo tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C. Puede encontrarse más información en The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn y Israel, eds., Chapter 1, titulado "Regulación del ciclo celular, oncogenes, y drogas antineoplásicas" por Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente p. 13.

El término "citoquina" es un término genérico para las proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otra célula como mediador intercelular. Algunos ejemplos de dichas citoquinas son las linfoquinas, las monoquinas, y las hormonas peptídicas tradicionales. Entre las citoquinas se incluyen las hormonas de crecimiento, por ejemplo la hormona del crecimiento humano, la hormona de crecimiento humano N-metionilo, y la hormona del crecimiento bovino; la hormona paratiroidea; la tiroxina; la insulina; la proinsulina; la relaxina; la prorelaxina; las hormonas glicoproteicas como por ejemplo la hormona estimuladora del folículo (FSH), la hormona estimuladora del tiroides (TSH), y la hormona luteinizante (LH); el factor de crecimiento hepático; el factor de crecimiento del fibroblasto; la prolactina; el lactógeno de placenta; el factor \alpha y \beta de la necrosis tumoral; la sustancia inhibidora de mullerian; el péptido asociado a la gonadotropina de ratón; la inhibina; la activina; el factor de crecimiento endotelial vascular; la integrina; la trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nerviosos como por ejemplo NGF-\beta; el factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento transformadores (TGFs) como por ejemplo TGF-\alpha y TGF-\beta: factor de crecimiento similar a insulina I y II; la eritropoyetina (EPO); los factores osteoinductores; los interferones, por ejemplo el interferón \alpha, \beta, y \gamma; los factores estimuladores de colonias (CSFs), por ejemplo el CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de granulocitos-macrófagos(GM-CSF); y CSF de granulocitos (G-CSF); las interleuquinas (ILs), por ejemplo IL-1, IL-I\alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, un factor de necrosis tumoral, ejemplo TNF-\alpha o TNF-\beta; y otros factores polipeptídicos, incluyendo LIF y el ligando kit (KL). En el sentido utilizado en el presente documento, el término citoquina incluye proteínas de Fuentes naturales o de cultivos de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citoquinas de secuencia nativa.

El término "profármaco" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica a las células tumorales en comparación con el fármaco parental y que es capaz de ser activada o convertida enzimáticamente en la forma parental más activa. Véase, por ejemplo Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) and Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos glicosilados o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que pueden derivatizarse a una forma de profármaco para su utilización en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los agentes quimioterapéuticos descritos más arriba.

El término "agonista" se utiliza en su sentido más amplio e incluye cualquier molécula que mimetiza una actividad biológica de un polipéptido PRO descrito en el presente documento. Algunas moléculas de agonistas adecuadas incluyen específicamente ab agonistas o fragmentos de ab agonistas, fragmentos o variantes de la secuencia de aminoácidos de polipéptidos PRO nativos, péptidos, moléculas orgánicas pequeñas, etc. Algunos procedimientos de identificación de agonistas de un polipéptido PRO pueden comprender poner en contacto una célula tumoral con una molécula agonista candidata y medir la inhibición del crecimiento de las células tumorales.

El término administración "crónica" se refiere a la administración del agente(s) en un modo continuo, de manera opuesta a un modo agudo, de manera que se mantenga el efecto (actividad) terapéutico(a) inicial durante un largo período de tiempo. La administración "intermitente" es un tratamiento que no se realiza de manera consecutiva sin interrupción, sino que por naturaleza es cíclico.

El término "mamífero" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoo, animales para deporte o mascotas, por ejemplo perros, gatos, ganado, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferentemente, el mamífero es humano.

La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.

El término "transportador" en el sentido utilizado en el presente documento incluye transportadores farmacéuticamente aceptables, excipientes o estabilizadores que no sean tóxicos para la célula o para el mamífero expuesto al mismo a las dosis y concentraciones empleadas. A menudo, es transportador farmacéuticamente aceptable es una disolución de pH tamponado acuosa. Algunos ejemplos de transportadores fisiológicamente aceptables incluyen tampones, por ejemplo fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos: antioxidantes, incluyendo el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menor de aproximadamente 10 residuos); proteínas, por ejemplo la albúmina del suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, por ejemplo polivinilpirrolidona; aminoácidos, por ejemplo glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo la glucosa, la manosa o las dextrinas; agentes quelantes, por ejemplo EDTA; alcoholes de azúcar, por ejemplo manitol o sorbitol; contrapones formadores de sales, por ejemplo sodio; y/o surfactantes no iónicos, por ejemplo TWEEN^{TM}, polietilenglicol (PEG) y PLURONIC^{TM}.

El término "abs nativos" e "inmunoglobulinas nativas" se refiere habitualmente a glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de uniones disulfuro varía entre las cadenas pesadas de los diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V_{H}) seguido de una diversidad de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un domino variable en un extremo (V_{L}) y un dominio constante en el otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el domino variable de la cadena pesada. Se cree que algunos residuos de aminoácido particulares forman una interfaz entre los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren en gran medida en la secuencia de los diferentes abs y se utilizan en la unión y especificidad de cada ab particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye de forma equitativa entre los dominios variables de los abs. Se concentran en tres segmentos denominados regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) o regiones hipervariables, tanto en el dominio variable de la cadena ligera como en el dominio variable de la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan las regiones armazón (FR). Los dominios variables de las cadenas nativas pesada y ligera comprenden, cada una de ellas, cuatro regiones FR, la cuales adoptan mayoritariamente una configuración de lámina \beta, conectadas por tres CDRs, que forman lazos que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina \beta. Los CDRs en cada cadena se mantienen juntos en cercana proximidad por las regiones FR y contribuyen, con los CDRs de la otra cadena, a la formación del sitio de unión a antígeno de los abs (véase Kabat et al., NIH Publ. No.91-3242, Vol. I, páginas 647-669 (1991)). Los dominios constantes no se encuentran directamente implicados en la unión de un ab a un antígeno, pero muestran diversas funciones efectoras, por ejemplo la paticipación del ab en la toxicidad celular dependiente de ab.

El término "región hipervariable" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a los residuos de aminoácido de un ab responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (por ejemplo los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD. [1991]) y/o aquellos residuos de un "lazo hipervariable" (por ejemplo, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Clothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 [1987]). Los residuos "armazón" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable, tal como se ha definido en el presente documento.

El término "fragmentos de anticuerpo" comprende una porción de un ab intacto, preferentemente la región de unión a antígeno o la región variable del ab intacto. Algunos ejemplos de fragmentos de ab incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; diacuerpos; ab lineales (Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de ab de cadena sencilla; y ab multiespecíficos formados a partir de fragmentos de ab.

La digestión de ab con papaína da como resultado dos fragmentos de unión a antígenos idénticos, denominados fragmentos "Fab", cada uno de los cuales posee un único sitio de unión a antígeno, y un fragmentos "Fc" residual, designación que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina rinde un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos sitios de combinación de antígeno y que incluso es capaz de entrecruzar antígeno.

"Fv" es el fragmento de ab mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento y unión a antígeno. Esta región consiste en un dímero de un domino variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación estrecha no covalente. Es en esta configuración que los tres CDRs de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a antígeno sobre la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, los seis CDRs confieren especificidad de unión a antígeno al ab. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDRs específicos para antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unir antígeno, aunque a menor afinidad que el sitio de unión completo.

El fragmento Fab contiene también el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab' en la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxi Terminal del dominio de la cadena pesada CH1, incluyendo una o más cisteínas de la región de la bisagra de anticuerpo. Fab'-SH es la designación en el presente documento de Fab' en el cual el residuo(s) de cisteína de los dominios constante lleva un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tiene cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie vertebrada pueden asignarse a uno entre dos tipos claramente diferentes, denominados kappa y lambda, en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a dos clases diferentes. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: y varias de ellas pueden dividirse a su vez en subclases (isotipos), por ejemplo,

El término "ab monoclonal" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a un ab obtenido a partir de una población de abs substancialmente homogéneos, es decir, la población comprende abs individuales idénticos excepto por el hecho de que pueden encontrarse mutaciones existentes en la naturaleza en cantidades mínimas. Los abs monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un único sitio antigénico. Además, en contaste con las preparaciones de ab (policlonaes) convencionales, que incluyen típicamente diferentes abs dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada ab monoclonal se dirige contra un único determinante sobre el antígeno. Además de su especificidad, los abs monoclonales son ventajosos en el sentido que se sintetizan por el cultivo de hibridoma, libres de contaminación por otras Inmunoglobulinas. El adjetivo "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo, que se ha obtenido a partir de una población de abs sustancialmente homogénea y no debe interpretarse que se requiere la producción del ab por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los abs monoclonales que se utilizarán según la presente invención pueden prepararse por el procedimiento del hibridoma descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 [1975], o pueden prepararse por procedimientos de ADN recombinante (véase por ejemplo la patente EEUU No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de bibliotecas de ab en fagos, por ejemplo utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352:624-628 [1991] y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).

Los abs monoclonales descritos en el presente documento incluyen específicamente abs (inmunoglobulinas) "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica o homóloga a las secuencias correspondientes en abs derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase particular de ab, mientras que el resto de la cadena(s) e idéntica o homóloga a las secuencias correspondientes en abs derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de ab, así como fragmentos de dichos abs, mientras muestren la actividad biológica deseada (patente US No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 [1984]).

Las formas "humanizadas" de abs no humanos (por ejemplo murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (por ejemplo Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de abs de unión a antígeno) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Por lo general, los abs humanizados son inmunoglobulinas humanas (ab receptor) en los cuales los residuos de un CDR del receptor se substituyen por residuos de un CDR de una especie no humana (ab donador), por ejemplo ratón, rata o conejo, que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos Fv FR de la inmunoglobulina humana se substituyen por los residuos no humanos correspondientes, Además, los abs humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el ab receptor ni en el CDR o secuencias de la región armazón importadas. Dichas modificaciones se realizan para refinar mejor y maximizar el rendimiento del ab. En general, el ab humanizado comprenderá substancialmente como mínimo uno, y típicamente dos, dominios variables en los cuales todas o substancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o substancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El ab humanizado comprenderá también, óptimamente, una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 [1988]; y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992). El ab humanizado incluye un anticuerpo PRIMATIZED^{TM} donde la región de unión a antígeno del ab derivado de un ab producido inmunizando monos macacos con el antígeno de interés.

Los fragmentos de ab "Fv" o "sFv de cadena sencilla" comprenden los dominios V_{H} y V_{L} de ab, encontrándose presentes dichos dominios en una cadena polipeptídica sencilla. Preferentemente, el polipéptido Fv comprende además una secuencia de unión polipeptídica entre los dominios V_{H} y V_{L} que permite que sFv forme la estructura deseada para la unión de antígeno. Como revisión, véase Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 1 13, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de ab pequeños con dos sitios de unión a antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio de cadena variable (V_{H}) conectado a un dominio de cadena ligera (V_{L}) en la misma cadena polipeptídica (V_{H}-V_{L}). Utilizando una secuencia de unión que sea demasiado corta para permitir el emparejamiento entre dos dominios de la misma cadena, se fuerza a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen con mayor detalle en EP 404,097; WO 93/11161: and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993), por ejemplo.

Un ab "aislado" es aquel se se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del ab, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En algunas realizaciones preferidas, el ab se purifica (1) hasta más del 95% en peso de ab, según se determina por el procedimiento de Lowry y más preferentemente más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener como mínimo 15 residuos de una secuencia de aminoácido N-terminal o interna, utilizando un secuenciador dosificador de spinning, o (39) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o preferentemente, tinción de plata. El ab aislado incluye el ab in situ dentro de células recombinantes, dado que como mínimo un componente del entorno natural del ab no estará presente. Sin embargo, normalmente, el ab aislado se preparará mediante como mínimo una etapa de purificación.

El término "etiqueta" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente con el ab de manera que se genera un ab "etiquetado". La etiqueta puede ser detectable por sí sola (por ejemplo etiquetas radioisotópicas o etiquetas fluorescentes) o, en el caso de una etiqueta enzimática, puede catalizar una alteración química de un compuesto o composición substrato que es detectable. La etiqueta puede ser también una entidad no detectable, por ejemplo una toxina.

Por "fase sólida" se entiende una matriz no acuosa a la cual puede adherirse al ab de la presente invención. Algunos ejemplos de fases sólidas incluidas en el presente documento incluyen las formadas parcial o completamente por vidrio (por ejemplo vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, polivinil alcohol y siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pozo de una placa de ensayo; en otros, es una columna de purificación (por ejemplo una columna de cromatografía de afinidad). Este término incluye también una fase sólida discontinua de partículas discretas, por ejemplo las descritas en la patente EEUU No. 4,275,149.

Un "liposoma" es una pequeña vesícula compuesta por diferentes tipos de lípidos, fosfolípicos y/o surfactantes, que es útil para transportar un fármaco (por ejemplo un polipéptido PRO o un ab para el mismo) a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen comúnmente en una formación de bicapa, de forma similar a la disposición lipídica de las membranas biológicas.

Una "molécula pequeña" se define en el presente documento como una molécula que tiene un peso molecular por debajo de aproximadamente 500 Daltons.

Tal como se muestra más abajo, la Tabla I proporciona el código fuente completo del programa de ordenador para la comparación de secuencias ALIGN-2. Este código fuente puede compilarse rutinariamente para su utilización en un sistema operativo UNIX para proporcionar el programa de ordenador para la comparación de secuencias ALIGN-2.

Adicionalmente, las Tablas 2-5 muestran ejemplos hipotéticos de utilización del procedimiento descrito más abajo para determinar el % de identidad en la secuencia de aminoácidos (Tablas 2-3) y el % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos (Tablas 4-5) utilizando el programa de ordenador para la comparación de secuencias, donde "PRO" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido PRO hipotético de interés, la "Proteína comparativa" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido frente el cual se compara el polipéptido "PRO" de interés, "PRO-ADN" representa una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un PRO hipotético, "ADN comparativo" representa la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácidos nucleicos frente a la cual se compara la molécula de ácidos nucleicos "PRO-ADN", "X", "Y" y "Z" representan, independientemente, diferentes residuos de aminoácido hipotéticos y "N", "L" y "V" representan, independientemente, diferentes residuos de aminoácido hipotéticos.

TABLA 1

1

TABLA 1 (continuación)

2

TABLA 1 (continuación)

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TABLA 1 (continuación)

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TABLA 1 (continuación)

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TABLA 1 (continuación)

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TABLA 3

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TABLA 4

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TABLA 5

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II. Composiciones y procedimientos de la invención A. Polipéptidos PRO de longitud completa

La presente invención proporciona secuencias de nucleótidos recién identificadas y aisladas que codifican polipéptidos a los cuales se hace referencia en la presente invención como polipéptidos PRO. En particular, se han identificado y aislado los ADNc que codifican el polipéptido PRO, tal como se describe con mayor detalle en los Ejemplos más abajo.

Tal como se describe en los Ejemplos más abajo, se han depositado clones de ADNc que codifican los polipéptidos PRO en la ATCC. Las secuencias reales de los clones pueden ser fácilmente determinados por el experto medio en la técnica mediante la secuenciación de los clones depositados utilizando procedimientos rutinarios del estado de la técnica. Las secuencias de aminoácidos predecidas pueden determinarse a partir de las secuencias de nucleótidos utilizando habilidades rutinarias. Para los polipéptidos PRO y los ácidos nucleicos codificadores descritos en el presente documento, los solicitantes han identificado lo que se cree que es el marco de lectura mejor que puede identificarse con la información sobre la secuencia disponible hasta el momento.

B. Variantes PRO

Además de los polipéptidos PRO de secuencia nativa de longitud completa descritos en el presente documento, se contempla la preparación de las variantes PRO. Las variantes PRO pueden prepararse introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN PRO y/o por síntesis del polipéptido PRO deseado. Los expertos medios en la técnica observarán que los cambios de aminoácido pueden alterar los procesos post-traducción del polipéptido PRO, por ejemplo modificar el número o posición de los sitios de glicosilación o alterar las características de anclaje a membrana.

Pueden realizarse variaciones en el polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud completa o en diferentes dominios del polipéptido PRO descritos en el presente documento, por ejemplo utilizando cualquiera de las técnicas y especificaciones para llevar a cabo mutaciones conservativas y no conservativas, como se describe, por ejemplo, en la patente EEUU No. 5,364,934. Las variaciones pueden ser una substitución, una deleción o una inserción de uno o más codones que codifican el polipéptido PRO que da como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO en comparación con el polipéptido PRO de secuencia nativa. Opcionalmente, la variación es por substitución de cómo mínimo un aminoácido por cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios del polipéptido PRO. Para determinar qué residuo de aminoácido puede insertarse, substituirse o seleccionarse sin afectar de forma adversa la actividad deseada, puede obtenerse ayuda comparando la secuencia del polipéptido PRO con la de las moléculas de proteína homólogas conocidas y minimizando el número de cambios de la secuencia de aminoácido realizados en regiones de alta homología. Las substituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de la substitución de una leucina por una serina, es decir, substituciones de aminoácidos conservativas. Las inserciones o deleciones pueden ser opcionalmente en el rango de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida puede determinarse realizando sistemáticamente inserciones, deleciones o substituciones de aminoácidos en la secuencia y evaluando las variantes resultantes en cuanto a la actividad que muestra la secuencia nativa de longitud completa o madura.

En el presente documento se proporcionan fragmentos de polipéptidos PRO. Dichos fragmentos pueden truncarse en el extremo N-terminal o C-terminal, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo en comparación con una proteína nativa de longitud completa. Algunos fragmentos carecen de residuos de aminoácido que no son esenciales para la actividad biológica deseada del polipéptido PRO.

Pueden prepararse fragmentos PRO mediante diversas técnicas convencionales. Puede sintetizarse químicamente fragmentos peptídicos deseados. Una aproximación alternativa implica generar fragmentos PRO por digestión enzimática, por ejemplo tratando la proteína con una enzima que se sabe que corta proteínas en sitios definidos por residuos de aminoácidos determinados, o digiriendo el ADN con enzimas de restricción adecuadas y aislando el fragmento deseado. Otra técnica adecuada implica aislar y amplificar un fragmento de ADN que codifica un fragmento polipeptídico deseado, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se emplean oligonucleótidos que definen los extremos deseados del fragmento de ADN como cebadores 3' y 5' en la PCR. Preferentemente, los fragmentos polipeptídicos PRO comparten como mínimo una actividad biológica y/o inmunológica con el polipéptido PRO nativo mostrado en las figuras adjuntas.

En algunas realizaciones particulares, las substituciones conservativas de interés se muestran el la Tabla 6, bajo el encabezamiento "substituciones preferidas". Si dichas substituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, se introducen cambios más substanciales, denominados a modo ilustrativo substituciones en la Tabla 6, o tal como se describe más abajo en referencia a las clases de aminoácidos, y se criban los productos.

TABLA 6

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Algunas modificaciones substanciales en la función o en la identidad inmunológica del polipéptido PRO se consiguen seleccionando las substituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto de polipéptido en el área de la substitución, por ejemplo como una conformación en lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) la voluminosidad de la cadena natural. Los residuos existentes en la naturaleza se dividen en grupos en base a propiedades comunes de la cadena lateral:

(1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;

(3) acídicos: asp, glu;

(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5) residuos que tienen influencia sobre la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Las substituciones no conservativas implicarán cambiar un miembro de una de dichas clases por otra clase. Dichos residuos substituidos pueden introducirse también en los sitios de substitución conservativa o, más preferentemente, en los sitios (no conservados) remanentes.

Las variaciones pueden realizarse utilizando procedimientos conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo mutagénesis mediada por oligonucleótidos (mutagénesis dirigida), barrido alanina y mutagénesis por PCR. La mutagénesis dirigida [Carter et al.. Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], la mutagénesis en cassette [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], la mutagénesis de selección por restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas pueden realizarse sobre el ADN clonado para producir el ADN variante de PRO.

Puede utilizarse también un análisis de barrido de aminoácidos para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos para barrido preferidos se encuentran los aminoácidos neutros relativamente pequeños. Dichos aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína [Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]. La alanina es un aminoácido de barrido típicamente preferido entre este grupo, dado que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante. También se prefiere típicamente la alanina porque es el aminoácido más común Además, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones escondidas como expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la substitución por alanina no rinde cantidades adecuadas de variante, puede utilizarse un aminoácido isotérico.

C. Modificaciones de los polipéptidos PRO

Las modificaciones covalentes de los polipéptidos PRO se incluyen dentro del alcance de la invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar residuos de aminoácido diana de un polipéptido PRO con un agente de derivatización orgánico capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o con los residuos N- o C-terminales del polipéptido PRO. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para entrecruzar polipéptidos PRO con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para ser utilizados en el procedimiento para la purificación de abs anti-PRO y viceversa. Algunos agentes de entrecruzamiento comúnmente usados incluyen, por ejemplo 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con 4-ácido azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, que incluyen disuccinimidil ésteres tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.

Otras modificaciones incluyen la deamidación de residuos de glutaminilo y asparaginilo para dar los correspondientes residuos glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, la mutilación de los grupos de las cadenas laterales de \alpha-amino de lisina, arginina y histidina, [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], la acetilación de la amina N-terminal y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente del polipéptido PRO incluida dentro del alcance de la invención comprende alterar el patrón de glicosilación nativo del polipéptido. Con el término "alterar el patrón de glicosilación nativo del polipéptido" se entiende, según los propósitos del presente documento, eliminar una o más estructuras de carbohidrato que se encuentran en los polipéptidos PRO de secuencia nativa (bien suprimiendo el sitio de glicosilación responsable o eliminando la glicosilación vía química y/o enzimática, y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el polipéptido PRO de secuencia nativa. Adicionalmente, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas, que implican un cambio en la naturaleza y proporciones de las diferentes estructuras de carbohidrato presentes.

La adición de sitios de glicosilación al polipéptido PRO puede llevarse a cabo alterando la secuencia de aminoácidos. La alteración puede realizarse, por ejemplo, mediante la adición o de, o substitución por, uno o más residuos de serina o treonina en el polipéptido Pro de secuencia nativa (por sitios de glicosilación mediante unión vía O). La secuencia de aminoácido del polipéptido PRO puede alterarse opcionalmente mediante cambios a nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido PRO en bases preseleccionadas, de manera que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

Otra manera de aumentar el número de estructuras de carbohidrato en el polipéptido PRO es mediante el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido. Dichos métodos están descritos en el estado de la técnica, por ejemplo en WO 87/05330, publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin and Wriston. CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

La eliminación de las estructuras de carbohidrato presentes en el polipéptido PRO puede llevarse a cabo química o enzimáticamente o mediante la substitución por mutación de los codones que codifican residuos de aminoácido que actúan como dianas de glicosilación. Las técnicas de deglicosilación químicas son conocidas en el estado de la técnica y han sido descritas, por ejemplo por Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). La ruptura enzimática de las estruturas de carbohidrato en polipéptidos puede llevarse a cabo mediante la utilización de una diversidad de endo- y exo-glicosidases, tal como se describe en Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).

Otro tipo de modificación covalente de los polipéptidos PRO comprende unir el polipéptido PRO a un polímero no proteinogénico seleccionado entre una diversidad de polímeros, por ejemplo, polietilen glicol (PEG), polipropilen glicol, o polioxialquilenos, tal como se describe en la patente EEUU Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 o 4,179,337.

El polipéptido PRO de la presente invención puede modificarse también de manera que forme una molécula quimérica que comprende un polipéptido PRO fusionado a otro polipéptido heterólogo o a otra secuencia de aminoácidos heteróloga.

En una realización, dicha molécula quimérica comprende una fusión del polipéptido PRO con un polipéptido etiqueta que proporciona un epítopo al cual puede unirse selectivamente un ab anti-etiqueta. El epítopo etiqueta se sitúa generalmente en el extremo amino o carboxilo terminal del polipéptido PRO. La presencia de dichas formas etiquetadas por epítopo del polipéptido PRO pueden detectarse utilizando un ab contra el polipéptido etiqueta. Así pues, proporcionando el epítopo etiqueta se posibilita que el polipéptido PRO pueda purificarse fácilmente mediante una purificación de afinidad utilizando un ab anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se una al epítopo etiqueta. Se conocen en el estado de la técnica diversos polipéptidos etiqueta y sus correspondientes abs. Algunos ejemplos incluyen etiquetas de polipéptido-histidina (poly-His) o polipéptido-histidina-glicina (poly-His-gly) tags; el polipéptido etiqueta HA de la gripe y su ab 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; la etiqueta c-myc y los abs correspondientes 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 and 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; y la etiqueta de la glicoproteína D (gD) del virus del Herpes Simplex y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Otros polipéptidos etiqueta incluyen el péptido Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]: the KT3 epitope peptide [Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)]; un péptido epítopo de la \alpha-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)]; y la etiqueta peptídica de la proteína del gen 10 de T7 gene [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397
(1990)].

En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del polipéptido PRO con una inmunoglobulina o con una región particular de una inmunoglobulina. En el aso de una forma bivalente de la molécula quimérica (a la cual se hace referencia como "inmunoadhesina"), dicha fusión podría ser en la región Fc de una molécula de IgG. Las fusiones de inmunoglobulina incluyen preferentemente la substitución de una forma soluble (domino transmembrana eliminado o inactivado) de un polipéptido PRO en cómo mínimo una región variable en una molécula de inmunoglobulina. En una realización particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye la región de la bisagra, CH2 y CH3, o la región de la bisagra, y las regiones CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgG I. Para la producción de fusiones de inmunoglobulinas, véase también la patente EEUU No. 5,428.130 publicada el 27 de junio del 1995.

D. Preparación de Polipéptidos PRO

La descripción más abajo se refiere primariamente a la producción de polipéptidos PRO mediante cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene un ácido nucleico de polipéptido PRO. Evidentemente, se contempla que procedimientos alternativos bien conocidos en el estado de la técnica pueden emplearse para preparar polipéptidos PRO. Por ejemplo, la secuencia del polipéptido PRO, o las porciones del mismo, pueden producirse mediante síntesis peptídico directa utilizando técnicas de fase sólida [véase, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteínas in vitro puede llevarse a cabo utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada puede llevarse a cabo, por ejemplo, utilizando un Sintetizador de Péptidos de Applied Biosystems (Foster City, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Varias porciones del polipéptido PRO pueden sintetizarse químicamente separadamente y combinarse utilizando procedimientos químicos o enzimáticos para producir el polipéptido PRO de longitud completa.

1. Aislamiento de ADN que codifica polipéptidos PRO

El ADN que codifica polipéptidos PRO se puede obtener de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se cree que posee ARNm de PRO y se puede expresar a un nivel detectable. Por consiguiente, ADN de PRO humano se puede obtener de forma conveniente de una biblioteca de ARNm preparada a partir de tejido humano, tal como se describe en los Ejemplos. El gen que codifica PRO también se puede obtener a partir de una biblioteca genómica o mediante procedimientos sintéticos conocidos (por ejemplo, síntesis de ácidos nucleicos automatizada).

Las bibliotecas se pueden cribar con sondas (tales como anticuerpos para el polipéptido PRO u oligonucleótidos de por lo menos 20-80 bases) diseñados para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el mismo. El cribado del ADNc o la biblioteca genómica con la sonda seleccionada se puede realizar utilizando procedimientos estándar, tales como los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen que codifica el polipéptido PRO es utilizar la metodología de PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

Los Ejemplos siguientes describen técnicas para cribar una biblioteca de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deberían tener una longitud suficiente y suficientemente inequívocas de manera que se minimizan los falsos positivos. El oligonucleótido se marca preferiblemente de manera que se puede detectar tras la hibridación a ADN en la biblioteca que se criba. Los métodos de marcado son bien conocidos en la técnica, e incluyen la utilización de radiomarcadores como por ejemplo ATP marcado con ^{32}P, biotinilación o marcaje enzimático. Las condiciones de hibridación, incluyendo una astringencia moderada y una astringencia elevada, se proporcionan en Sambrok et al., supra.

Las secuencias identificadas en dicho métodos de cribado de bibliotecas se pueden comparar y alinear con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas, tales como el Banco de Genes u otras bases de datos de secuencias privadas. La identidad de secuencias (a nivel de aminoácido o secuencia) en las regiones definidas de la molécula o a través de la secuencia de longitud completa se puede determinar utilizando métodos conocidos en la técnica y tal como se describen en el presente documento.

El ácido nucleico que tiene la secuencia de codificación de proteínas se puede obtener mediante el cribado de ADNc seleccionado o bibliotecas genómicas utilizando la secuencia de aminoácidos deducida descrita en el presente documento por primera vez y, si es necesario, utilizando procedimientos convencionales de extensión del cebador, tal como se describen en Sambrook et al., supra., para detectar precursores e intermedios de procesamiento de ARNm que quizás no se han transcrito de forma inversa en ADNc.

2. Selección y transformación de células huésped

Las células huésped se transfectan o transforman con vectores de expresión o clonación descritos en el presente documento para la producción de polipéptidos PRO y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados para que sean adecuados para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como el medio, la temperatura, el pH y similares, se pueden seleccionar por un experto en la materia sin una experimentación excesiva. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos celulares se pueden encontrar en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook et al., supra.

Los procedimientos de transfección de células eucariotas y transformación de células procariotas son conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, CaCl_{2}, CaPO_{4}, mediados por liposomas y electroporación. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar adecuadas a dichas células. El tratamiento de calcio que utiliza cloruro cálcico, tal y como se describe en Sambrook et al., supra, o la electroporación se utilizan generalmente para procariotas. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de ciertas células vegetales, tal como describe Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y WO 89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamíferos sin dichas paredes celulares, se puede utilizar el procedimiento de precipitación con fosfato cálcico de Graham y van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978). En la Patente de Estados Unidos No. 4.399.216 se han descrito aspectos generales de transfecciones de sistemas de células huésped de mamíferos. Las transformaciones en la levadura se llevan a cabo habitualmente según el procedimiento de Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979). Sin embargo, también se pueden utilizar otros procedimientos para introducir ADN en células, tales como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplasto bacteriano con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para varias técnicas para transformar células de mamífero, ver Keown et al., Methods in enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour et al., Nature, 336. 348-352 (1988).

Entre las células huésped adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente invención se incluyen células procariotas, de levadura, o eucariotas superiores. Entre las procariotas adecuadas se incluyen, pero so se limitan a, eubacterias, tales como organismos Gram-negativo o Gram-positivo, por ejemplo, Enterobacteriaceae, tal como E. coli. Varias cepas de E. coli están disponibles públicamente, tales como la cepa de E. coli K 12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); cepa de E. coli W31 10 (ATCC 27.325) y K5 772 (ATCC 53.635). Entre otras células huésped procariotas adecuadas se incluyen Enterobacteriaceae, tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli, tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41 P descrito en DD 266.710 publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas, tal como P. aeruginosa, y Streptomyces. Estos ejemplos son más ilustrativos que limitantes. La cepa W31 10 es un huésped o huésped parental particularmente preferible ya que es una cepa huésped común para fermentaciones de productos de ADN recombinantes. Preferiblemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticos. Por ejemplo, la cepa W31 10 se puede modificar para realizar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas al huésped, con ejemplos de dichos huéspedes incluyendo la cepa de E. coli W31 10 1A2, que tiene el genotipo completo tonA; la cepa de E. coli W3110 9E4, que tiene el genotipo completo tonA ptr3; la cepa de E. coli W3110 27C7 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kan^{r}; la cepa de E. coli W3110 37D6, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kan^{r}; la cepa de E. coli W3110 40B-1, que es una cepa 37D6 con una mutación de deleción degP no resistente a kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene proteasa periplásmica mutante descrita en la Patente de Estados Unidos No. 4.946.783 concedida el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, son adecuados procedimientos de clonación in vitro, por ejemplo, PCR u otras reacciones de ácido nucleico polimerasa.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como hongos o levaduras filamentosos, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican PRO. El Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariótico inferior utilizado habitualmente. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139.383 publicada el 2 de mayo de 1985); huéspedes Kluyveromyces (Patente de Estados Unidos No. 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tal como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS574; Louvencourt et al. J. Bacterial., 154(2):737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135(1990)), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic. Microbiol. 28:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces, tales como Schwanniomyces occidentalis (EP 394.538, publicada el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos, tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicada el 10 de enero de 1991), y huéspedes Aspergillus, tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilbum et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) y A. Niger (Kelly y Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]). Las levaduras metilotrópicas son adecuadas en la presente invención e incluyen, pero no se limitan a, levadura capaz del crecimiento en metanol seleccionado del género que consiste en Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Sacckaromyces, Torulopsis, y Rhodotorula. Una lista de especies específicas que son ejemplos de esta clase de levaduras se puede encontrar en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).

Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos PRO glicosilados se derivan de organismos multicelulares. Entre los ejemplos de células de invertebrados se incluyen células de insectos, tales como Droshophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células vegetales. Entre los ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos útiles se incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) y células COS. Algunos ejemplos más específicos incluyen línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón de embrión humano (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO. Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); y tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCl51). La selección de la célula huésped apropiada se considera que está dentro de la técnica.

3. Selección e utilización de un vector replicable

El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico), que codifica polipéptidos PRO se puede insertar en un vector replicable para la clonación (amplificación del ADN) o para la expresión. Existen varios vectores disponibles públicamente. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de plásmido, cósmido, partícula viral, o fago. La secuencia de ácidos nucleicos apropiada se puede insertar en el vector mediante una serie de procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio o sitios de endonucleasa de restricción apropiados utilizando técnicas conocidas en la técnica. Los componentes de los vectores incluyen generalmente, pero no se limitan a, una o más secuencias señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes utiliza técnicas de unión estándar que son conocidas por un experto en la materia.

El polipéptido PRO se puede producir recombinantemente no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de división específico en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN que codifica el PRO que se inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o enterotoxinaII estable térmicamente líderes. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal puede ser, por ejemplo, la invertasa de levadura líder, el factor alfa líder (incluyendo \alpha-factor de Saccharomyces y Kluyveromyces líderes, el último descrito en la Patente de Estados Unidos No. 5.010.182), o fosfatasa ácida líder, la C. Albicans glucoamilasa líder (EP 362.179 publicada el 4 de abril de 1990) o la señal descrita en WO 90/13646, publicada el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de células de mamíferos, las secuencias señal de mamíferos se pueden utilizar para dirigir la secreción de la proteína, tales como secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o especies relacionadas, así como líderes virales secretores.

Ambos vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite la replicación del vector en una o más células huésped seleccionadas. Dichas secuencias son conocidas para un conjunto de bacterias, levadura, y virus. El origen de la replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias gram-negativas, el origen del plásmido 2 \mu es adecuado para la levadura, y orígenes virales varios (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamíferos.

Los vectores de clonación y expresión contendrán habitualmente un gen de selección, también denominado como marcador seleccionable. Los genes de selección habituales codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicillina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli.

Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son aquéllos que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico que codifica PRO, tal como DHFR o timidina quinasa. Una célula huésped apropiada cuando se utiliza DHFR de tipo salvaje es la línea de células CHO deficiente en actividad de DHFR, preparada y propagada tal y como se describe por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección adecuado para su utilización en la levadura es el gen trp1 presente en el plásmido de la levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trp proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].

Los vectores de clonación y expresión contienen habitualmente un promotor unido operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica PRO para dirigir la síntesis de ARNm. Los promotores reconocidos por un conjunto de células huésped potenciales son conocidos. Entre los promotores adecuados para utilizar con huéspedes procariotas se incluyen los sistemas de promotores de \beta-lactamasa y lactosa [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema de promotor de triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36.776], y promotores híbridos, tales como el promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]. Los promotores para utilizar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgamo (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica el polipéptido PRO.

Entre los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su utilización con huéspedes de levadura se incluyen promotores para 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otros enzimas glucolíticos [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tal como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de una transcripción controlada mediante condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativos asociados con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para la utilización en la expresión en levaduras se describen en detalle en EP 73.657.

La transcripción de PRO de vectores en células huésped de mamíferos está controlada, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus, tales como virus del polioma, virus de la viruela aviar (Patente del Reino Unido 2.211.504 publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como el Adenovirus 2), el virus de papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis-B y virus de simio 40 (SV40), de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y de promotores de choque térmico, siempre y cuando dichos promotores sean compatibles con los sistemas de célula huésped.

Se puede incrementar la transcripción de un ADN que codifica el polipéptido PRO por eucariotas superiores mediante la inserción de una secuencia de potenciador en el vector. Los potenciadores son elementos que actúan en cis de ADN, habitualmente aproximadamente de 10 a 300 pb, que actúan en un promotor para aumentar su transcripción. Muchas secuencias de potenciador se conocen actualmente de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Habitualmente, sin embargo, se utilizará un potenciador de un virus de célula eucariota. Entre los ejemplos se incluyen el potenciador de SV40 en la cara tardía del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en la cara tardía del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus. El potenciador se puede cortar y empalmar ("splice") en el vector en una posición 5' ó 3' con respecto a la secuencia codificante del polipéptido PRO, pero se sitúa preferiblemente en un sitio 5' desde el promotor.

Los vectores de expresión utilizados en células huéspedes eucariotas (levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Dichas secuencias están disponibles habitualmente desde las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente 3', de ADNs o ADNcs eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica el polipéptido PRO.

En Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117.060 y EP 117.058 se describen adicionalmente otros procedimientos, vectores, y células huésped adecuados para la adaptación a la síntesis de polipéptidos PRO en cultivos de células de vertebrados recombinantes.

4. Detección de la amplificación/expresión de los genes

La amplificación y/o expresión de los genes se puede medir en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia Southern convencional, transferencia Northern convencional para cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], transferencia de puntos (análisis de ADN), o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada apropiadamente, basadas en las secuencias proporcionadas en la presente invención. Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN, dúplex de híbridos ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez se pueden marcar y el ensayo se puede llevar a cabo cuando el dúplex está unido a una superficie, de manera que tras la formación del dúplex en la superficie, se puede detectar la presencia de anticuerpos unidos al dúplex.

Alternativamente, la expresión génica se puede medir mediante procedimientos inmunológicos, tales como tinción inmunohistoquímica de células o secciones de tejido y ensayo de cultivo de células o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de fluidos de ejemplo pueden ser monoclonales o policlonales, y se puede preparar en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos se pueden preparar contra un polipéptido PRO de secuencia nativa o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en la presente invención o contra una secuencia exógena fusionada a ADN de PRO y que codifica un epítopo de anticuerpo específico.

5. Purificación de polipéptidos PRO

Las formas de polipéptidos PRO se pueden recuperar del medio de cultivo o de los lisatos de células huésped. Si está unido a membrana, se puede liberar de la membrana utilizando una solución de detergente adecuada (por ejemplo, Triton X-100) o mediante división enzimática. Las células utilizadas en la expresión de polipéptidos PRO se pueden interrumpir mediante diversos medios físicos o químicos, tales como ciclo congelación-descongelación, sonicación, interrupción mecánica, o agentes para lisar células.

Se puede desear purificar polipéptidos PRO a partir de proteínas o polipéptidos de células recombinantes. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o una resina de intercambio catiónico, tal como DEAE; "cromatofocusing"; SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico; filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A sefarosa para eliminar contaminantes, tales como IgG, y columnas quelantes de metales para unir formas etiquetadas con epítopo del polipéptido PRO. Se pueden utilizar varios métodos de purificación de proteína y dichos métodos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles ad Practice, Springer-Verlag, Nueva York (1982). La etapa o etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y el polipéptido PRO concreto producido.

E. Anticuerpos

Algunos candidatos de fármacos para su utilización en las composiciones y procedimientos de la presente invención son anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que mimetizan la actividad biológica de un polipéptido PRO.

1. Anticuerpos policlonales

Los procedimientos de preparación de anticuerpos policlonales son conocidos por el experto en la materia. Los anticuerpos policlonales se pueden desarrollar en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Habitualmente, el agente inmunizante y/o adyuvante se inyectarán en el mamífero mediante inyecciones múltiples subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir el polipéptido PRO o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante a una proteína conocida para que sea inmunogénica en el mamífero que se inmuniza. Entre los ejemplos de dichas proteínas inmunogénicas se incluyen, pero no se limitan a hemocianina de la lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, e inhibidor de tripsina de soja. Entre los ejemplos de adyuvantes se pueden incluir el adyuvante completo de Freund y el adyuvante MPL-TDM (monofosforil Lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético). El protocolo de inmunización puede ser seleccionado por un experto en la materia sin una gran experimentación.

2. Anticuerpos monoclonales

Alternativamente, los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando procedimientos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256: 495 (1975). En un procedimiento de hibridoma, se inmuniza habitualmente un ratón, un hámster u otro animal huésped apropiado con un agente inmunizante para obtener linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro.

El agente inmunizante incluirá habitualmente el polipéptido PRO o una proteína de fusión del mismo. Generalmente, se utilizan linfocitos de sangre periférica ("PLBs") si se desean células de origen humano, o células de bazo o se utilizan células de nódulos linfáticos si se desean fuentes de mamíferos no humanos. A continuación, los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academia Press, (1986), páginas 59-103]. Las líneas celulares inmortalizadas son habitualmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Habitualmente, se utilizan líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma se pueden cultivar en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá habitualmente hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquéllas que se fusionan de manera eficaz, soportan un nivel de expresión elevado estable del anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma murino, que se pueden obtener, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano se han descrito también para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) páginas, 51-63].

A continuación, se puede analizar el medio de cultivo en el que las células de hibridoma se cultivan para la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipéptido PRO. Preferiblemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA). Dichas técnicas y ensayos se conocen en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard de Munson y Poliard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).

Después de identificar las células de hibridoma deseadas, los clones se pueden subclonar limitando los procedimientos de dilución y se pueden desarrollar mediante procedimientos estándar [Goding, supra]. Entre los medios de cultivo adecuados para este objetivo se incluyen, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma se pueden desarrollar in vivo como ascitis en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se pueden aislar o purificar del medio de cultivo o fluido de ascitis mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales, tales como, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía en hidroxilapatito, eletroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales también se pueden fabricar mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como los descritos en la Patente U.S. No. 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la presente invención se pueden aislar fácilmente y secuenciar utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante la utilización de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la presente invención sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede situar en vectores de expresión, que a continuación se transfectan en células huésped, tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de ningún modo proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias homólogas murinas [Patente de Estados Unidos No. 4.816.567; Morrison et al., supra] o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido que no es inmunoglobulina. Dicho polipéptido que no es inmunoglobulina se puede sustituir por los dominios constantes de un anticuerpo de la presente invención, o se pueden sustituir por los dominios variables de un sitio de combinación a antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo quimérico bivalente.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos monovalentes son conocidos en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera y la cadena pesada modificada de la inmunoglobulina. La cadena pesada se trunca generalmente en cualquier punto en la región Fc para evitar la reticulación de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisteína pertinentes se sustituyen por otro residuo de aminoácido o se eliminan para evitar la reticulación.

Los procedimientos in vitro también son adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente, fragmentos Fab, se puede realizar utilizando técnicas rutinarias conocidas en la técnica.

3. Anticuerpos humanos y humanizados

Los anticuerpos de la invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de unión a antígeno de los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Entre los anticuerpos humanizados se incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo destinatario) en las que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del destinatario se sustituye por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo dador), tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos del armazón de Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo destinatario ni en las secuencias de la CDR o el armazón importados. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno, y habitualmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones de FR son las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá de forma óptima por lo menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), habitualmente la de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].

Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en el mismo de un origen no humano. Estos residuos de aminoácidos no humanos se indican frecuentemente como residuos "importados", que se adquieren de un dominio variable "importado". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)], mediante la sustitución de CDRs o secuencias de CDR de roedor por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567), en los que sustancialmente menos de un dominio variable intacto humano ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son habitualmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de DCR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

Los anticuerpos humanos también se pueden producir utilizando varias técnicas conocidas en la técnica, incluyendo las bibliotecas de expresión de fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. Las técnicas de Cole et al. y Boerner et al. están también disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, página 77 (1985) y Boerner et al., J. Inmunol., 147(1): 86-95 (1991)]. De forma similar, los anticuerpos humanos se pueden fabricar mediante la introducción de loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógena han sido parcial o completamente inactivados. Tras la estimulación, se observa la producción de anticuerpos humanos, que se parecen estrechamente a los observados en humanos en todos los aspectos, incluyendo el reajuste de genes, el ensamblaje, y el repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las Patentes U.S. Nos. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al., BioTechnology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368, 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51, (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995).

4. Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión para por lo menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para el polipéptido PRO, el otro es para cualquier otro antígeno, y preferiblemente para una proteína o receptor o subunidad del receptor de la superficie celular.

Los procedimientos para fabricar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Habitualmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos parejas de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, en las que las dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes [Millstein y Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)]. Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas diferentes de anticuerpos, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se realiza habitualmente mediante etapas de cromatografía de afinidad. En WO 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991) se describen procedimientos similares.

Los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se pueden fusionar a secuencias de dominios constantes de inmunoglobulinas. La fusión preferiblemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de la bisagra, CH2, y regiones CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión a cadena ligera presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Para mayores detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzimology, 121: 210 (1986).

Según otro enfoque descrito en WO 96/27011, se puede diseñar la interfase entre una pareja de moléculas de anticuerpos para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfase preferida comprende por lo menos una parte de la región de CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se sustituyen por cadenas laterales mayores (por ejemplo, tirosina o triptófano). Las "cavidades" compensatorias de tamaño similar o idéntico a la cadena o cadenas laterales grandes se crean en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo mediante la sustitución de cadenas laterales grandes de aminoácidos por más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.

Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}). Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos se han descrito en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar utilizando uniones químicas. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describen un procedimiento en el que los anticuerpos intactos se dividen proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol, arsenito sódico, para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación de disulfuro intermolecular. A continuación, los fragmentos Fab' generados se convierten en derivados de nitrobenzoato (TNB). A continuación, uno de los derivados de Fab'-TNB se reconvierte al Fab'-tiol mediante la reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Los fragmentos Fab' se pueden recuperar directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico totalmente humanizado F(ab')_{2}. Cada fragmento de Fab' se secretó por separado de E. coli y se sometió a un acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. Dicho anticuerpo biespecífico formado de esta manera era capaz de unirse a células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y las células T humanas normales, así como desencadenar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra tumores de mama humana dianas.

Se han descrito también varias técnicas para fabricar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de cultivos de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Los péptidos cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las partes de Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y, a continuación, se reoxidaron para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este procedimiento también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diabody" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios V_{L} y V_{H} complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios de unión a antígeno. También se ha descrito otra estrategia para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante la utilización de dímeros de Fv de cadena única (sFv). Ver Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994).

Se consideran los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).

Los anticuerpos biespecíficos de ejemplo se pueden unir a dos epítopos diferentes en un polipéptido PRO determinado de la presente invención. Alternativamente, un brazo de polipéptido anti-PRO se puede combinar con un brazo que se une a una molécula desencadenante en un leucocito, tal como una molécula receptora de células T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28, o B7), o receptores Fc para IgG (Fc\gammaR), tales como Fc\gammaRI (CD64), Fc\gammaRII (CD32) y Fc\gammaRIII (CD16) para centrar los mecanismos de defensa celular en la célula que expresa el polipéptido PRO particular. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden utilizar para confinar agentes citotóxicos a células que expresan un polipéptido PRO particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a PRO y un brazo que se une a un agente citotóxico o un radionúcleo quelante, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés se une al polipéptido PRO y además se une al factor tisular (TF).

5. Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados están también dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmune a células no deseadas [Patente U.S. No. 4.676.980] y para el tratamiento de la infección por VIH [WO 91/00360: WO 92/300373; EP 03089]. Se considera que los anticuerpos se pueden preparar in vitro utilizando procedimientos conocidos en la química sintética de proteínas, incluyendo los que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas se pueden construir utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o mediante la formación de un enlace tioéter. Entre los ejemplos de reactivos adecuados para este objetivo se incluyen el iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los descritos, por ejemplo, en la Patente U.S. No. 4.676.980.

6. Diseño de la función efectora

Se puede desear modificar el anticuerpo de la presente invención con respecto a la función efectora con el fin de aumentar, por ejemplo, la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, el residuo o residuos de cisteínas se pueden introducir en la región Fc, permitiendo de esta manera la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede mejorar la capacidad de internalización y/o incrementar la citólisis mediada por el complemento y la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Véase Caron et al., J. Exp. Med., 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con una actividad anti-tumoral aumentada también se pueden preparar utilizando reticuladores heterobifuncionales tal y como se describe en Wolf et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, un anticuerpo se puede diseñar para que tenga regiones Fc duales y, de esta manera, pueda aumentar la lisis complementaria y las capacidades de ADCC. Véase, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989).

7. Inmunoconjugados

La presente invención también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radioactivo (es decir, radioconjugados).

Los agentes quimioterapéuticos útiles para la generación de dichos inmunoconjugados se han descrito anteriormente. Entre las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden utilizar se incluyen la cadena A de difteria, fragmentos activos no enlazantes de toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAPS), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Existe un conjunto de radionúcleos disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados. Algunos ejemplos son ^{212}Bi, ^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y y ^{186}Re.

Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se fabrican utilizando un conjunto de agentes bifuncionales acopladores de proteínas, tales como N-succinimidil-3-(2-piridiiditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluen 2,6-diisocianato) y compuesto de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar tal y como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de radionúcleos al anticuerpo. Ver WO94/11026.

En otra realización, el anticuerpo se puede conjugar a un "receptor" (tal como estreptavidina) para la utilización en el premarcado de tumores en los que el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido de la eliminación de conjugado no enlazado de la circulación utilizando un agente clarificador y, a continuación, la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionúcleo).

8. Inmunoliposomas

Los anticuerpos descritos en la presente invención también se pueden formular como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 77: 4030 (1980); y las Patentes U.S. Nos. 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con un mayor tiempo de circulación se describen en la Patente U.S. No. 5.013.556.

Se pueden generar liposomas particularmente útiles mediante el procedimiento de evaporación de fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol, y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para obtener liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención se pueden conjugar a los liposomas tal y como se describen en Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) mediante la reacción de intercambio de enlaces disulfuro. Opcionalmente, el liposoma contiene un agente quimioterapéutico (tal como Doxorubicina). Véase Gabizon et al., J. Nacional Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989).

F. Identificación de proteínas capaces de inhibir el crecimiento o la proliferación celular neoplásica

Las proteínas descritas en la presente invención se han ensayado en un panel de 60 líneas de células tumorales utilizadas actualmente en el cribado de investigación para el descubrimiento de fármacos in vitro orientado hacia enfermedades del National Cancer Institute (NCI). El objetivo de este cribado es identificar moléculas que tienen una actividad citotóxica y/o citoestática contra diferentes tipos de tumores. El NCI criba más de 10.000 moléculas nuevas al año (Monks et al., J. Natl. Cancer Inst., 83: 757-766 (1991); Boyd, Cancer: Princ. Pract. Oncol. Update, 3(10) : 1-12 ([1989]). Las líneas de células tumorales utilizadas en este estudio se han descrito en Monks et al., supra. Las líneas celulares el crecimiento de las cuales se ha inhibido de forma significativa por las proteínas de la presente solicitud se especifican en los Ejemplos.

Los resultados han mostrado que las proteínas ensayadas muestran actividades citoestáticas y, en algunos casos concentraciones, y actividades citotóxicas en un conjunto de líneas de células cancerígenas y, por lo tanto, son candidatos útiles para la terapia de tumores.

También se pueden utilizar otros ensayos basados en células y modelos animales para tumores (por ejemplo, cáncer) para verificar los hallazgos del cribado de cáncer del NCI, y para entender en detalle la relación entre la proteína identificada en la presente invención y el desarrollo y patogénesis del crecimiento de células neoplásicas. Por ejemplo, se pueden utilizar cultivos primarios derivados de tumores en animales transgénicos (tal como se describe a continuación) en los ensayos basados en células de la presente invención, aunque se prefieren líneas celulares estables. Las técnicas para derivar líneas celulares continuas de animales transgénicos son conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Small et al., Mol. Cell. Biol., 5:642-648 [1985]).

G. Modelos de animales

Se puede utilizar un conjunto de modelos animales conocidos para entender en detalle la función de las moléculas identificadas de la presente invención en el desarrollo y patogénesis de tumores y para ensayar la eficacia de agentes terapéuticos candidatos, incluyendo anticuerpos, y otros agonistas de los péptidos nativos, incluyendo agonistas de moléculas pequeñas. La naturaleza in vivo de dichos modelos los hace particularmente predictivos de las respuestas en pacientes humanos. Entre los modelos de animales de tumores y cánceres (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, etc.) se incluyen animales no recombinantes y recombinantes (transgénicos). Entre los modelos de animales no recombinantes se incluyen, por ejemplo, roedores, por ejemplo, modelos murinos. Dichos modelos se pueden generar mediante la introducción de células tumorales en ratones singeneicos utilizando técnicas estándar, por ejemplo, inyección subcutánea, inyección en vena de cola, implante en el bazo, implante intraperitoneal, implante bajo la cápsula renal o implante de "orthopin", por ejemplo, células de cáncer de colon implantadas en tejido colónico. (Ver, por ejemplo, publicación de PCT No. WO 97/33551, publicada en 18 de septiembre de 1997).

Probablemente, las especies animales utilizadas más frecuentemente es estudios oncológicos son ratones inmunodeficientes y, en particular, ratones desnudos. La observación de que el ratón desnudo con hipoaplasia podría actuar de manera satisfactoria como un huésped para xenoinjertos de tumores humanos ha conducido a su amplio uso para este objetivo. El gen nu autosómico recesivo se ha introducido en un gran número de cepas congénicas distintas de ratón desnudo, incluyendo, por ejemplo, ASW, A/He, AKR, BALB/c, B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, l/st, NC.NFR, NFS. NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII y SJL. Además, se han desarrollado una gran variedad de otros animales con defectos inmunológicos heredados diferentes del ratón desnudo y se han utilizado como receptores de xenoinjertos de tumores. Para más detalles, ver, por ejemplo, The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven y B. Winograd, eds., CRC Press, Inc., 1991.

Las células introducidas en dichos animales se pueden derivar de líneas de células de tumor/cáncer conocidas, tales como, cualquiera de las líneas de células tumorales indicadas anteriormente, y, por ejemplo, la línea celular B 104-1-1 (línea celular NIH-3T3 estable transfectada con el protooncógeno neu); células NIH-3T3 ras-transfectadas; Caco-2 (ATCC HTB-37); una línea celular de adenocarcinoma de colon humano de grado II bien moderadamente bien diferenciada, HT-29 (ATCC HTB-38), o de tumores y cánceres. Las muestras de células de tumores o cánceres se pueden obtener de pacientes que sufren cirugía, utilizando condiciones estándar, que implican la congelación y almacenamiento de nitrógeno líquido (Karmali et al., Br. J. Cancer, 48 : 689-696 [1983]).

Las células tumorales se pueden introducir en animales, tales como ratones desnudos, mediante un conjunto de procedimientos. El espacio subcutáneo (s.c.) en ratones es muy adecuado para el implante de tumores. Los tumores se pueden transplantar s.c. como bloques sólidos, como biopsias con agujas mediante la utilización de un trócar, o como suspensiones celulares. Para el implante como bloques sólidos o con trócar, se introducen fragmentos de tejido tumoral de tamaño adecuado en el espacio s.c. Se preparan suspensiones celulares nuevas a partir de tumores primarios o líneas de células tumorales estables y se inyectan subcutáneamente. Las células tumorales también se pueden inyectar como implantes subdérmicos. En esta localización, el inóculo se deposita entre la parte inferior del tejido conectivo dérmico y el tejido s.c. Boven y Winograd (1991), supra. Los modelos de animales de cáncer de mama se puedne generar, por ejemplo, mediante el implante de células de neuroblastoma de rata (de las que el oncógeno neu se aisló inicialmente) o células NIH-3T3 neutransformadas en ratones desnudos, esencialmente como se ha descrito por Drebin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 9129-9133 (1986).

De manera similar, los modelos de animales de cáncer de colon se pueden generar mediante el pase de células de cáncer de colon en animales, por ejemplo, ratones desnudos, conduciendo a la aparición de tumores en estos animales. Se ha descrito un modelo de transplante ortotópico de cáncer de colon humano en ratones desnudos, por ejemplo, por Wang et al., Cancer Research, 54: 4726-4728 (1994) y Too et al., Cancer Research, 55: 681-684 (1995). Este modelo está basado en el denominado "METAMOUSE^{TM}" comercializado por AntiCancer, Inc., (San Diego, California).

Los tumores que crecen en animales se pueden extraer y cultivar in vitro. A continuación, las células de los cultivos in vitro se pueden pasar a animales. Dichos tumores pueden servir como dianas para posteriores ensayos o cribados de fármacos. Alternativamente, los tumores resultantes del pase se pueden aislar y se pueden analizar el ARN de las células previas al pase y las células aisladas después de uno o más ciclos de pases para la expresión diferencial de los genes de interés. Dichas técnicas de pases se pueden realizar con cualquier línea de células tumorales o cáncer conocida.

Por ejemplo, Meth A, CMS4, CMS5, CMS21 y WEHI-164 son fibrosarcomas inducidos químicamente de ratones hembras BALB/c (DeLeo et al., J. Exp. Med., 146: 720 [1977]), que proporcionan un sistema modelo altamente controlable para estudiar las actividades antitumorales de varios agentes (Palladito et al., J. Immunol., 138: 4023-4032 [1987]). Brevemente, las células tumorales se propagan in vitro en cultivos celulares. Antes de la inyección en los animales, las líneas celulares se lavan y se suspenden en tampón, en una densidad celular de aproximadamente 10x10^{6} a 10x10^{7} células/ml. A continuación, los animales se infectan subcutáneamente con 10 a 100 \mul de la suspensión celular, dejando que el tumor aparezca en una a tres semanas.

Además, se puede utilizar como modelo de tumor para investigación el carcinoma de pulmón de Lewis (3LL) de ratones, que es uno de los tumores experimentales más ampliamente estudiados. La eficacia en este modelo tumoral se ha correlacionado con los efectos beneficiosos en el tratamiento de pacientes humanos diagnosticados con carcinoma de célula pequeña de pulmón (SCCL). Este tumor se puede introducir en ratones normales tras la inyección de fragmentos de tumores de un ratón afectado o de células mantenidas en cultivo (Zupi et al., Br. J. Cancer, 41, suppl. 4:309 [1980]) y la evidencia indica que los tumores pueden iniciarse desde la inyección de incluso una única célula y que una proporción muy elevada de células tumorales infectadas sobreviven. Para más información sobre este modelo tumoral, ver, Zacharski, Haemostasis, 16: 300-320 (1986).

Una manera de evaluar la eficacia de un compuesto de prueba en un modelo de animal en un tumor implantado es medir el tamaño del tumor antes y después del tratamiento. Tradicionalmente, el tamaño de los tumores implantados se ha medido con un pie de rey en dos o tres dimensiones. La medición limitada a dos dimensiones no refleja con precisión el tamaño del tumor, por lo tanto, se convierte habitualmente en el correspondiente volumen mediante la utilización de una fórmula matemática. Sin embargo, la medición del tamaño del tumor es muy imprecisa. Los efectos terapéuticos de un fármaco candidato se pueden describir mejor como un retraso del crecimiento inducido por el tratamiento y un retraso del crecimiento específico. Otra variable importante en la descripción del crecimiento del tumor es el tiempo de duplicación del volumen del tumor. También están disponibles programas informáticos para el cálculo y la descripción del crecimiento tumoral, tales como el programa descrito por Rygaard y Spang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop in Immune-Deficient Animals, Wu y Sheng eds., Basilea, 1989, 301. Sin embargo, se indica que la necrosis y las respuestas inflamatorias que siguen al tratamiento pueden realmente dar lugar a un incremento en el tamaño tumoral, al menos inicialmente. Por lo tanto, estos cambios deben monitorizarse cuidadosamente mediante una combinación de un método morfométrico y análisis citométrico de flujo.

Los modelos de animales recombinantes (transgénicos) se pueden diseñar mediante la introducción de la parte codificante de los genes identificados en la presente invención en el genoma de animales de interés, utilizando técnicas estándar para producir animales transgénicos. Entre los animales que pueden servir como diana para la manipulación trasngénica se incluyen, sin limitación, ratones, ratas, conejos, cobayas, ovejas, cabras, cerdos y primates no humanos, por ejemplo, babuinos, chimpancés y monos. Las técnicas conocidas en el sector para introducir un transgén en dichos animales incluyen microinyección pronucleica (Hoppe y Wanger, Patente de Estados Unidos No. 4.873.181); transferencia de genes mediada por retrovirus en líneas germinales (por ejemplo, Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 6148-615 [1985]); marcaje de genes en células madre embrionarias (Thompson et al., Cell, 56: 313-321 [1989]); electroporación de embriones (Lo, Mol. Cell. Biol., 3: 1803-1814 [1983]); transferencia de genes mediada por esperma (Lavitrano et al., Cell, 57: 717-73 [1989]). Para una revisión, ver por ejemplo, Patente de Estados Unidos No. 4.736.866.

Para los objetivos de la presente invención, los animales transgénicos incluyen aquellos que transportan el transgén sólo en parte de sus células ("animales mosaico"). El transgén se puede integrar como un transgén individual, o en concatámeros, por ejemplo, los tándems cabeza con cabeza o cabeza con cola. La introducción selectiva de un transgén en un tipo de célula concreta también es posible mediante, por ejemplo, la técnica de Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6232-636 (1992).

La expresión del transgén en animales trasngénicos se puede monitorizar mediante técnicas estándar. Por ejemplo, el análisis de transferencia Southern o la amplificación por PCR se pueden utilizar para verificar la integración del transgén. El nivel de la expresión de ARNm se puede analizar a continuación utilizando técnicas, tales como hibridación in situ, análisis de transferencia Northern, PCR o inmunocitoquímica. Los animales se examinan en profundidad para hallar signos del desarrollo de tumores o cáncer.

La eficacia de los anticuerpos que se unen específicamente a los polipéptidos identificados en la presente invención y a otros fármacos candidatos, se pueden probar también en el tratamiento de tumores animales espontáneos. Una diana adecuada para dichos estudios es el carcinoma de células escamosas (SCC) oral felino. El SCC oral felino es un tumor maligno altamente invasivo que es el tumor oral de gatos más habitual, representando sobre un 60% de los tumores orales observados en estas especies. Raramente se produce metástasis a puntos distantes, aunque esta baja incidencia de metástasis puede ser simplemente un reflejo de los tiempos de supervivencia cortos para gatos con este tumor. Estos tumores no son susceptibles habitualmente de cirugía, principalmente debido a la anatomía de la cavidad oral felina. Actualmente, no existe un tratamiento eficaz para este tumor. Antes de entrar en estudio, cada gato experimenta un examen clínico completo, biopsia, y se escanea mediante tomografía computerizada (CT). Los gatos diagnosticados con tumores de células escamosas orales sublinguales están excluidos del estudio. La lengua se puede paralizar como resultado de dicho tumor e incluso si el tratamiento mata el tumor, los animales no son capaces de alimentarse por sí mismos. Cada gato se trata repetidamente, durante un periodo de tiempo más largo. Las fotografías de los tumores se tomarán diariamente durante el periodo de tratamiento, y en cada posterior rechequeo. Después del tratamiento, cada gato experimenta otra exploración CT. Desde este momento, las exploraciones CT y los radiogramas torácicos se evalúan cada 8 semanas. En los datos se evalúan las diferencias en la supervivencia, respuesta y toxicidad en comparación con los grupos de control. Una respuesta positiva puede requerir la evidencia de una regresión tumoral, preferiblemente con una mejora de la calidad de vida y/o aumento de la esperanza de vida.

Además, también se pueden analizar otros tumores espontáneos de animales, tales como fibrosarcoma, adenocarcinoma, linfoma, crondroma, leiomiosarcoma de perros, gatos y babuinos. De éstos, el adenocarcinoma mamario en perros y gatos es un modelo preferido ya que su apariencia y comportamiento son muy similares a los de los humanos. Sin embargo, la utilización de este modelo está limitado por la escasa aparición de este tipo de tumor en animales.

H. Ensayos de cribado para fármacos candidatos

Los ensayos de cribado para fármacos candidatos se diseñan para identificar compuestos que se unen competitivamente o forman complejos con el receptor o receptores de los polipéptidos identificados en la presente invención, o en cualquier caso producen señales a través de dicho receptor o receptores. Dichos ensayos de cribado incluirán ensayos susceptibles de cribado de alto rendimiento de quimiotecas, siendo particularmente adecuados para identificar fármacos candidatos de molécula pequeña. Entre las moléculas pequeñas contempladas se incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos, incluyendo péptidos, preferiblemente péptidos solubles, fusiones (poli)péptido-inmunoglobulina y, en particular, anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos policlonales y monoclonales y fragmentos de anticuerpo, anticuerpos de cadena única, anticuerpos anti-idiotípicos, y versiones quiméricas o humanizadas de dichos anticuerpos o fragmentos, así como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos. Los ensayos se pueden realizar en una serie de formatos, incluyendo ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de cribado bioquímico, inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien caracterizados en la técnica.

En ensayos de unión, la interacción es la unión y el complejo formado se puede aislar o detectar en la mezcla de reacción. En una realización particular, un receptor de un polipéptido codificado por el gen identificado en la presente invención o el fármaco candidato se inmoviliza sobre una fase sólida, por ejemplo, una placa de microtítulos, mediante enlaces covalentes o no covalentes. La unión no covalente se realiza generalmente mediante el recubrimiento de la superficie sólida con una solución del polipéptido y el secado. Alternativamente, se puede utilizar un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido a inmovilizar, para anclarlo a la superficie sólida. El ensayo se realiza mediante la adición del componente no inmovilizado, que se puede marcar mediante un marcador detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Cuando se completa la reacción, se extraen los componentes no reaccionados, por ejemplo, mediante lavado, y se detectan los complejos anclados a la superficie sólida. Cuando el componente originalmente no inmovilizado transporta una marca detectable, la detección del marcador inmovilizado en la superficie indica que tuvo lugar la complejación. Cuando el componente originalmente no inmovilizado no transporta un marcador, se puede detectar la complejación, por ejemplo, utilizando un anticuerpo marcado que se une específicamente al complejo inmovilizado.

Si el compuesto candidato interacciona con un receptor concreto, pero no se une al mismo, su interacción con ese polipéptido se pueden ensayar mediante procedimiento conocidos para detectar interacciones proteína-proteína. Dichos ensayos incluyen enfoques tradicionales, tales como, por ejemplo, reticulación, coinmunoprecipitación y copurificación a través de gradientes o columnas cromatográficas. Además, las interacciones proteína-proteína se pueden monitorizar mediante la utilización de sistemas genéticos basados en levaduras descritos por [Fields y colaboradores (Fields y Song, Nature (London), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9578-9582 (1991)] tal como se describe por Chevray y Nathans [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 5789-5793 (1991)]. Muchos activadores transcripcionales, tales como GAL4 de levadura, consisten en dos dominios modulares físicamente discretos, uno actuando como el dominio de unión a ADN, el otro actuando como el dominio de activación de la transcripción. El sistema de expresión en las levaduras descrito en las publicaciones anteriores (referido generalmente como "el sistema de dos híbridos") saca ventaja de esta propiedad y utiliza dos proteínas híbridas, una en la que se fusiona la proteína diana al dominio de unión a ADN de GAL4, y otra, en la que las proteínas activadoras candidatas se fusionan al dominio de activación. La expresión de un gen informador GAL1-lacZ bajo el control de un promotor activado por GAL4 depende de la reconstitución de la actividad de GAL4 a través de la interacción de proteína-proteína. Las colonias que contienen polipéptidos que interaccionan se detectan con un sustrato cromatogénico para \beta-galactosidasa. En Clontech se encuentra disponible comercialmente un equipo completo (MATCHMAKER^{TM}) para identificar interacciones proteína-proteína entre dos proteínas específicas utilizando la técnica de dos híbridos. Este sistema también se puede extender para mapear dominios de proteínas implicados en las interacciones de proteínas específicas así como para precisar los residuos de aminoácidos que son cruciales para estas interacciones.

I. Composiciones farmacéuticas

Los polipéptidos de la presente invención, anticuerpos agonistas que se unen específicamente a proteínas identificadas en la presente invención, así como otras moléculas identificadas por los ensayos de cribado descritos en la presente invención, se pueden administrar para el tratamiento de tumores, incluyendo cánceres, en forma de composiciones farmacéuticas.

Cuando se utilizan fragmentos de anticuerpos, se prefiere el fragmento inhibidor más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína diana. Por ejemplo, en base a las secuencias de la región variable de un anticuerpo, las moléculas de péptido se pueden diseñar para que mantengan la capcidad de unir la secuencia de la proteína diana. Dichos péptidos se pueden sintetizar químicamente y/o se pueden producir mediante tecnología de ADN recombinante (ver, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7892 [1993]).

La formulación de la presente invención puede también contener más de un compuesto activo según sea necesario para la enfermedad concreta a tratar, preferiblemente aquéllos con actividades complementarias que no se afectan de forma adversa entre sí. Alternativamente, o adicionalmente, la composición puede comprender un agente que potencia su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, citoquina, agente quimioterapéutico o agente inhibidor del crecimiento. Dichas moléculas están presentes de forma adecuada combinadas en cantidades que son eficaces para el objetivo deseado.

Las formulaciones terapéuticas de los polipéptidos identificados en la presente invención, o agonistas de los mismos se preparan para su almacenamiento mediante la mezcla del principio activo que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizantes opcionales fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16^{a} Edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como, cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabens, tales como metil o propil paraben; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de peso molecular bajo (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos de metales (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensoactivos no iónicos, tales como TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} o polietilenglicol (PEG).

La formulación de la presente invención también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la enfermedad concreta a tratar, preferiblemente aquéllos con actividades complementarias que no se afectan de forma adversa entre sí. Alternativamente, o adicionalmente, la composición puede comprender un agente citotóxico, una citoquina o un agente inhibidor del crecimiento. Dichas moléculas están presentes de forma adecuada combinadas en cantidades que son eficaces para el objetivo deseado.

Los principios activos también pueden estar contenidos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16^{a} Edición, Osol, A. Ed. (1980).

Las formulaciones a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o después de la liofilización y reconstitución.

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Las composiciones terapéuticas de la presente invención se colocan generalmente en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa o un vial de solución intravenosa que tiene un tapón penetrable por una aguja de inyección hipodérmica.

Se pueden preparar preparaciones de liberación controladas. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación controlada se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación controlada se incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (Patente U.S.A. No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma etil-L-glutamato, copolímeros de etileno-acetato de vinilo no degradables, copolímeros de ácido lático-ácido glicólico, tales como el LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que polímeros, tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico, permiten la liberación de moléculas durante 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos más cortos de tiempo. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un periodo largo de tiempo, se desnaturalizan o agregan como resultado de la exposición a humedad a 37ºC, dando lugar a una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden idear varias estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre que es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio de tio-disulfuros, se puede conseguir la estabilización mediante la modificación de residuos sulfhidrilos, la liofilización de soluciones ácidas, el control del contenido de humedad, la utilización de aditivos adecuados y el desarrollo de composiciones de matriz de polímeros específicas.

J. Procedimientos de tratamiento

Se considera que los polipéptidos de la presente invención y sus agonistas, incluyendo anticuerpos, péptidos, agonistas de molécula pequeña, se pueden utilizar para tratar varios tumores, por ejemplo, cánceres. Entre las enfermedades o trastornos a tratar de ejemplo se incluyen tumores benignos o malignos (por ejemplo, (por ejemplo, renal, hígado, vejiga, mama, gástrico, ovárico, colorrectal, próstata, pancreático, pulmón, vulva, tiroides, carcinomas hepáticos; sarcomas; glioblastomas; y varios tumores de cabeza y cuello); leucemias y tumores de linfoide; otros trastornos, tales como neuronales, gliales, astrocitales, hipotalámicos y otros trastornos glandulares, macrofágicos, epiteliales, estromales y blastocoélicos; y trastornos inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos. Los agentes antitumorales de la presente invención (incluyendo los polipéptidos descritos en la presente invención y agonistas que mimetizan su actividad, por ejemplo, anticuerpos, péptidos y moléculas orgánicas pequeñas) se administran a un mamífero, preferiblemente un humano, de acuerdo con procedimientos conocidos, tales como la administración intravenosa como un bolo o mediante la infusión continua durante un periodo de tiempo, o mediante rutas intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, intraocular, intraarterial, intralesional, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o inhalación.

Otras pautas terapéuticas se pueden combinar con la administración de los agentes anticancerígenos de la presente invención. Por ejemplo, el paciente a tratar con dichos agentes anticancerígenos también puede recibir terapia por radiación. Alternativamente, o adicionalmente, se puede administrar un agente quimioterapéutico al paciente. La preparación y la pauta de dosificación para dichos agentes quimioterapéuticos se pueden utilizar según las instrucciones del fabricante o según se determina empíricamente por un técnico experto. La preparación y la pauta de dosificación para dicha quimioterapia también están descritas en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). El agente quimioterapéutico puede preceder o seguir a la administración del agente antitumoral de la presente invención, o se puede administrar simultáneamente con el mismo. Los agentes anticancerígenos de la presente invención se pueden combinar con un compuesto anti-estrógeno, tal como tamoxifeno, o una anti-progesterona, tal como onapristona (ver, PE 616812) en las dosis conocidas para dichas moléculas.

Puede ser deseable administrar también anticuerpos contra antígenos asociados a tumores, tales como anticuerpos que se unen a ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 o el factor endotelial vascular (VEGF). Alternativamente, o adicionalmente, se pueden coadministrar al paciente dos o más anticuerpos que se unen al mismo o dos o más diferentes antígenos asociados al cáncer. Algunas veces puede ser beneficioso administrar también una o más citoquinas al paciente. En una realización preferida, los agentes anticancerígenos de la presente invención se administran conjuntamente con un agente inhibidor del crecimiento. Por ejemplo, se puede administrar en primer lugar el agente inhibidor del crecimiento, seguido de la administración de un agente anticancerígeno de la presente invención. Sin embargo, también se contempla la administración simultánea o la administración del agente anticancerígeno de la presente invención en primer lugar. Las dosis adecuadas para el agente inhibidor del crecimiento son aquellas utilizadas actualmente y pueden disminuirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y el anticuerpo de la presente invención.

Para la prevención o el tratamiento de enfermedades, la dosis apropiada de un agente antitumoral de la presente invención dependerá del tipo de enfermedad a tratar, tal y como se ha definido anteriormente, la gravedad y el transcurso de la enfermedad, si el agente se administra con objetivos de prevención o terapéuticos, terapia previa, el historial clínico del paciente y la respuesta al agente, y la discreción del médico responsable. El agente se administra de forma adecuada al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Los experimentos con animales proporcionan una guía fiable para la determinación de las dosis eficaces para terapia humana. El escalado entre especies de dosis eficaces se puede llevar a cabo siguiendo los principios establecidos por Mordenti, J. y Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" en Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, Nueva York, 1989, páginas 42-96.

Por ejemplo, dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 \mug/kg hasta 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1-20 mg/kg) de un agente antitumoral es una dosis candidata inicial para la administración al paciente, mediante, por ejemplo, uno o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Una dosis diaria habitual podría variar desde, aproximadamente, 1 \mug/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionadas anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la enfermedad, el tratamiento se mantiene hasta que tiene lugar la desaparición deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas de dosificación. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales. En la literatura se proporciona una guía relacionada con las dosis concretas y los procedimientos de liberación; ver, por ejemplo, las Patentes U.S.A. Nos. 4.657.760; 5.206.344 o 5.225.212. Se indica que diferentes formulaciones serán eficaces para diferentes compuestos de tratamiento y diferentes trastornos, que la administración dirigida a un órgano o tejido, por ejemplo, puede necesitar la liberación de una manera diferente a otro órgano o tejido.

K. Artículos de fabricación

En otra realización del a presente invención, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el diagnóstico o tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y un marcador. Entre los recipientes adecuados se incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes pueden estar formados de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz para el diagnóstico o el tratamiento de la enfermedad y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa o un vial de solución intravenosa que tiene un tapón penetrable por una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en la composición es un agente antitumoral de la presente invención. El marcador en el recipiente o asociado con el mismo indica que la composición se utiliza para el diagnóstico o el tratamiento de la enfermedad de elección. El artículo de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como una solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Pueden incluir también otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones para su uso.

Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo con objetivos ilustrativos, y no pretenden limitar de ningún modo el alcance de la presente invención.

Ejemplos

Los reactivos disponibles comercialmente a los que se hace referencia en los ejemplos se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante a menos de que se indique lo contrario. El origen de estas células identificadas en los siguientes ejemplos, y a lo largo del documento, por los números de acceso de la ATCC pertenecen a la American Type Culture Collection, Manassas, VA.

Ejemplo 1 Cribado de la homología del dominio extracelular para la identificación de polipéptidos nuevos y el ADNc codificante correspondiente

Las secuencias del dominio extracelular (ECD) (incluyendo la secuencia señal de secreción, si la hay) de aproximadamente 950 proteínas de secreción conocidas de la base de datos pública Swiss-Prot se utilizaron para buscar bases de datos EST. Las bases de datos EST incluían bases de datos públicas (por ejemplo, Dayhoff, Banco de Genes), y bases de datos privadas (por ejemplo LIFESEQ^{TM}, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). La búsqueda se realizó mediante la utilización del programa informático BLAST o BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)) como una comparación entre las secuencias ECD de las proteínas y la traducción de seis fragmentos de las secuencias EST. Las comparaciones con un marcador BLAST de 70 (o en algunos casos de 90) o superior que no codificaban proteínas conocidas se agruparon y ensamblaron en secuencias de ADN de consenso con el programa "phrap" (Phil Green, Universidad de Washington, Seattle, WA).

Utilizando este cribado de homología del dominio extracelular, las secuencias de ADN de consenso se ensamblaron en relación a las otras secuencias identificadas de EST utilizando phrap. Además, las secuencias de ADN de consenso obtenidas se ampliaron frecuentemente (pero no siempre) utilizando ciclos repetidos de BLAST o BLAST-2 y phrap para ampliar la secuencia de consenso tanto como fuera posible utilizando los orígenes de secuencias EST anteriormente explicadas.

En base a las secuencias de consenso obtenidas tal y como se ha explicado anteriormente, a continuación los oligonucleótidos se sintetizaron y utilizaron para identificar mediante PCR una biblioteca de ADNc que contuviese la secuencia de interés y para utilizarlos como sondas para aislar un clon de la secuencia codificante de longitud completa para un polipéptido PRO. Los cebadores de PCR directos e inversos generalmente varían entre 20 y 30 nucleótidos y frecuentemente están diseñados para producir un producto de PCR de aproximadamente 100-1000 pares de bases de longitud. Las secuencias de la sonda tienen habitualmente una longitud de 40-55 pares de bases. En algunos casos, se sintetizan oligonucleótidos adicionales cuando la secuencia de consenso es mayor de 1-1,5 kpb. Con el fin de cribar diversas bibliotecas para un clon de longitud completa, el ADN de las bibliotecas se cribó mediante amplificación de PCR, como por Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, con la pareja del cebador de PCR. A continuación se utilizó una biblioteca positiva para aislar clones que codificaran el gen de interés utilizando el oligonucleótido de la sonda y una de las parejas de cebadores.

Las bibliotecas de ADNc utilizadas para aislar clones de ADNc se construyeron mediante procedimientos convencionales utilizando reactivos disponibles comercialmente tales como los de Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc se cebó con oligo dT que contenía un sitio NotI, se unió por extremo romo a adaptadores con hemiquinasa de SalI, se dividieron con NotI, se separaron por tamaño apropiadamente mediante electroforesis en gel, y se clonó en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pRKB o pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio de SfiI; véase, Homes et al., Science, 253:1278-1280 (1991)) en los sitios únicos de XhoI y NotI.

Ejemplo 2 Aislamiento de clones de ADNc mediante cribado con Amilasa 1. Preparación de la biblioteca de ADNc cebado con oligo dT

Se aisló ARNm de un tejido humano de interés utilizando reactivos y protocolos de Invitrogen, San Diego, CA (Fast Track 2). Este ARN se utilizó para generar una biblioteca de ADNc cebado con oligo dT en el vector pRK5D utilizando reactivos y protocolos de Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script Plasmid System). En este procedimiento, la doble cadena de ADNc se ajustó para que fuera mayor de 1000 pares de bases y el ADNc unido a SalI/NotI se clonó en el vector dividido por XhoI/NotI. pRK5D es un vector de clonación que tiene un sitio de iniciación de la trascripción sp6 seguido de un sitio para enzima de restricción SfiI que precede a los sitios de clonación del ADNc de XhoI/NotI.

2. Preparación de la biblioteca de ADNc cebado aleatorio

Se generó una biblioteca de ADNc secundaria para representar preferentemente los extremos 5' de los clones de ADNc primario. El ARN de sp6 se generó a partir de la biblioteca primaria (descrita anteriormente), y este ARN se utilizó para generar una biblioteca de ADNc cebado aleatorio en el vector PSST-AMY.O utilizando reactivos y protocolos de Life Technologies (Super Script Plasmid System, mencionado anteriormente). En este procedimiento, el ADNc de cadena doble se ajustó a 500-1000 pares de bases, se unió por los extremos romos a adaptadores de NotI, se dividió con SfiI, y se clonó en el vector dividido de SfiI/NotI. pSST-AMY.O es un vector de clonación que tiene un promotor de alcohol deshidrogenada de levadura que precede a los sitios de clonación del ADNc y la secuencia de la amilasa de ratón (la secuencia madura sin la señal de secreción) seguida por el fragmento finalizador de alcohol deshidrogenasa de levadura, después de los sitios de clonación. De esta manera, los ADNcs clonados en este vector que están fusionados en su marco con la secuencia de amilasa conducirán a la secreción de amilasa desde colonias de levadura apropiadamente transfectadas.

3. Transformación y Detección

El ADN de la biblioteca descrita en el párrafo 2 anterior se enfrió sobre hielo al que se había añadido la bacteria DH10B electrocompetente (Life Technologies, 20 ml). La mezcla de vector y bacteria se electroporó a continuación tal y como recomendaba el fabricante. Posteriormente, se añadió un medio SOC (Life Technologies, 1 ml) y la mezcla se incubó a 37ºC durante 30 minutos. Los transformantes se colocaron en 20 placas LB estándar de 150 mm que contenían ampicilina y se incubaron durante 16 horas (37ºC). Las colonias positivas fueron descartadas en las placas y el ADN se aisló del residuo bacteriano utilizando los protocolos convencionales, por ejemplo gradiente de CsCl. A continuación, el ADN purificado continuó con los protocolos de la levadura siguientes.

Los procedimientos de las levaduras se dividieron en tres categorías: (1) Transformación de la levadura con el vector combinado plásmido/ADNc; (2) Detección y aislamiento de los clones de levadura que secretan amilasa; y (3) amplificación por PCR de la inserción directamente desde la colonia de levadura y la purificación del ADN para la secuenciación y el análisis posterior.

La cepa de levadura utilizada fue la HD-56-5A (ATCC-90785). Esta cepa tiene el siguiente genotipo: MAT alfa, ura3-52, leu2-3, leu2-112, his3-11, his3-15, MAL^{-}, SUC^{+}, GAL^{+}. Preferiblemente, se pueden utilizar levaduras mutantes que tienen mecanismos post-traduccionales deficientes. Dichos mutantes pueden tener alelos deficientes de traslocación en sec71, sec72, sec62, siendo sec71 truncado el más preferido. Alternativamente, se pueden utilizar también preferiblemente los antagonistas (que incluyen nucleótidos antisentido y/o ligandos) que interfieren en el normal funcionamiento de estos genes, otras proteínas implicadas en este mecanismo posterior a la traducción (por ejemplo, SEC61p, SEC72p, SEC62p, SEC63p, TDJ1p o SSA 1p-4p) o la formación del complejo de estas proteínas en combinación con la levadura que expresa la amilasa.

La transformación se realizó basándose en el protocolo descrito por Gietz y otros, Nucl. Acid. Res., 20: 1425 (1992). A continuación, las células transformadas se inocularon del agar en el caldo de cultivo de complejo YEPD (100 ml) y se desarrollaron durante toda la noche a 30ºC. El caldo de cultivo YEPD se preparó tal y como se describe en Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, pág. 207 (1994). A continuación, el cultivo de toda la noche se diluyó hasta aproximadamente 2 x 10^{6} células/ml (aprox. DO_{600}=0,1) en caldo de cultivo YEPD nuevo (500 ml) y se redesarrolló hasta 1 x 10^{7} células/ml (aprox. DO_{600}=0,4-0,5).

A continuación, las células se recogieron y prepararon para la transformación mediante la transferencia en botellas de rotación GS3 en un rotor Sorval GS3 a 5.000 rpm durante 5 minutos, se descartó el sobrenadante y, a continuación, se resuspendieron en agua estéril, y se centrifugaron de nuevo en tubos falcon de 50 ml a 3.5000 rpm en una centrífuga Beckman GS-6KR. El sobrenadante se descartó y las células se lavaron posteriormente con LiAc/TE (10 ml, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA pH 7,5, 100 mM de Li_{2}OOCCH_{3}), y se resuspendió en LiAc/TE (2,5 ml).

La transformación se realizó mezclando las células preparadas (100 \mul) con ADN de cadena única recientemente desnaturalizado de salmón de prueba (Lofstrand Labs, Gaithersburg, MD) y transformando el ADN (1 \mug, vol. < 10 \mul) en tubos de microfuga. La mezcla se mezcló brevemente por centrifugación, a continuación se le añadió PEG/TE al 40% (600 \mul, polietilenglicol-4000 al 40%, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, 100 mM de Li_{2}OOCCH_{3}, pH 7,5). Esta mezcla se mezcló suavemente y se incubó a 30ºC mientras se agitaba durante 30 minutos. A continuación, las células fueron sometidas a un golpe de calor de 42ºC durante 15 minutos, y el recipiente de reacción se centrifugó en un tubo de microfuga a 12.000 rpm durante 5-10 segundos, se decantó y se resuspendió en TE (500 \mul, 10 mM de TRis-HCl, 1 mM de EDTA pH 7,5) seguido de recentrifugación. A continuación, las células se diluyeron en TE (1 ml) y se extendieron alicuotas (200 \mul) en el medio selectivo previamente preparado en placas de crecimiento de 150 mm (VWR).

Alternativamente, en lugar de múltiples reacciones pequeñas, la transformación se realizó utilizando una reacción única a gran escala, en la que las cantidades de los reactivos se adaptaron a la escala.

El medio selectivo utilizado fue un agar de dextrosa completo sintético con ausencia de uracilo (SCD-Ura) preparado tal y como se describe en Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, pág. 208-210 (1994). Los transformantes se desarrollaron a 30ºC durante 2-3 días.

La detección de colonias que secretan amilasa se realizó incluyendo almidón rojo en el medio de crecimiento selectivo. El almidón se acopló a colorante rojo (Reactive Red-120, Sigma) según el procedimiento descrito por Biely et al., Anal. Biochem. 172:176.-179 (1988). El almidón acoplado se incorporó en las placas de agar SCD-Ura en una concentración final de 0,15% (p/v), y a continuación se tamponó con fosfato potásico hasta un pH de 7,0 (50-100 mM de concentración final).

Las colonias positivas se recogieron y se dispusieron en rayas en medio selectivo nuevo (en placas de 150 mm) con el fin de obtener colonias individuales bien aisladas e identificables. Las colonias individuales positivas bien aisladas para la secreción de amilasas se detectaron mediante la incorporación directa de almidón rojo en agar SCD-Ura tamponado. Las colonias positivas se determinaron por su capacidad para romper el almidón resultante en una clara aureola alrededor de la colonia positiva directamente visualizada.

4. Aislamiento de ADN mediante amplificación por PCR

Cuando se aisló una colonia positiva, una parte de la misma se recogió con un palillo y se diluyó en agua estéril (30 \mul) en una placa de 96 pocillos. En este punto, las colonias positivas se congelaron y guardaron para un posterior análisis o bien se amplificaron inmediatamente. Una alicuota de las células (5 \mul) se utilizó como plantilla para la reacción de PCR en un volumen de 25 \mul que contenía: 0,5 \mul de Klentaq (Clontech, Palo Alto, CA); 4,0 \mul 10 mM de dNTP's (Perkin Elmer-Cetus); 2,5 \mul de tampón Kentaq (Clontech); 0,25 \mul de oligo directo 1; 0,25 \mul de oligo inverso 2; 12,5 \mul de agua destilada. La secuencia del oligonucleótido directo 1 fue:

5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3' (SEC. ID. No: 57)

La secuencia del oligonucleótido inverso 2 fue:

5'-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3' (SEC. ID. No: 58)

A continuación, se realizó la PCR de la siguiente manera:

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Las regiones subrayadas de los oligonucleótidos se hibridaron a la región promotora ADH y la región de amilasa, respectivamente, y se amplificó una región de 307 pares de bases del vector pSST-AMY.0 cuando no presentaba inserción. Normalmente, los primeros 18 nucleótidos del extremo 5' de estos oligonucleótidos contenían sitios de hibridación para los cebadores de la secuenciación. De esta manera, el producto total de la reacción PCR desde un vector vacío fue de 343 pares de bases. Sin embargo, el ADNc fusionado a la secuencia señal dio lugar a secuencias de nucleótidos considerablemente más largas.

Tras la PCR, se examinó una alícuota de la reacción (5 \mul) mediante electroforesis en gel de agarosa con un 1% de gel de agarosa utilizando un sistema tamponador Tris-Borato-EDTA (TBE) tal y como describen Sambrook et al., supra. Los clones que dieron lugar a un producto de PCR único y firme mayor de 400 pares de bases se analizaron adicionalmente mediante la secuenciación del ADN tras la purificación con una columna de limpieza de PCR Qiaquick 96 (Quiagen, Inc., Chatsworth, CA).

Ejemplo 3 Aislamiento de los clones del ADNc utilizando el análisis algorítmico de señal

Se identificaron diversas secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos mediante la aplicación de un algoritmo patentado que halla una secuencia señal desarrollado por Genentech, Inc. (South San Francisco, CA) sobre ESTs así como fragmentos de EST agrupados y ensamblados de las bases de datos públicas (por ejemplo, Banco de Genes) y/o privadas (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA). El algoritmo de la secuencia señal calcula una puntuación de la señal de secreción basada en el carácter de los nucleótidos del ADN que rodean al primer codón de metionina (ATG), y de manera opcional al segundo, en el extremo 5' de la secuencia o el fragmento de secuencia en consideración. Los nucleótidos que siguen al primer ATG deben codificar por lo menos 35 aminoácidos inequívocos sin ningún codón de parada. Si el primer ATG tiene los aminoácidos requeridos, el segundo no se examina. Si ninguno reúne los requisitos, la secuencia candidata no se contabiliza. Con el fin de determinar si la secuencia EST contiene una secuencia señal auténtica, el ADN y las correspondientes secuencias de aminoácidos que rodean el codón ATG son contabilizados utilizando un dispositivo de siete sensores (parámetros de evaluación) que se sabe que se asocian con las señales de secreción. El uso de este algoritmo dio lugar a la identificación de numerosas secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos.

Ejemplo 4 Aislamiento de clones de ADNc que codifican PRO440 humano

Una secuencia de ADN de consenso se ensambló en relación a otras secuencias EST utilizando el phrap, tal y como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1. Las bases de datos EST incluían bases de datos públicas (por ejemplo, Banco de Genes) y bases de datos EST privadas (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA) y ESTs patentadas de Genentech. Esta secuencia de consenso se designa en la presente invención como DNA77634. En base a la secuencia de consenso DNA77634, se sintetizaron los oligonucleótidos: 1) para identificar mediante PCR una biblioteca de ADNc que contenía la secuencia de interés, y 2) para utilizar como sondas para aislar un clon de la secuencia codificante de longitud completa para PRO4400.

Se sintetizaron una pareja de cebadores del PCR (directos e inversos):

cebador de PCR directo

5'-GCTGCTGCCGTCCATGCTGATG-3' (SEC. ID. No: 3)

cebador de PCR inverso

5'-CTCGGGGAATGTGACATCGTCGC-3' (SEC. ID. No: 4)

Adicionalmente, se construyó una sonda sintética de hibridación de oligonucleótidos a partir de la secuencia de consenso DNA77634 que tenía la siguiente secuencia de nucleótidos

sonda de hibridación

5'-GCTGCCGTCCA TGCTGA TGTTTGCGGTGATCGTGG-3' (SEC. ID. No: 5)

El ARN para la construcción de las bibliotecas de ADNc se aisló de una línea de células de adenocarcinoma humano. Las bibliotecas de ADNc utilizadas para aislar los clones de ADNc se construyeron mediante procedimientos estándar utilizando reactivos comercialmente disponibles, tales como los de Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc se cebó con oligo dT que contenía un sitio NotI, se unió por extremo romo a adaptadores con hemiquinasa de SalI, se dividieron con NotI, se separaron por tamaño apropiadamente mediante electroforesis en gel, y se clonó en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pRKB o pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio de SfiI; véase, Holmes et al., Science, 253:1278-1280 (1991)) en los sitios únicos de XhoI y NotI.

La secuenciación del ADN de los clones aislados tal y como se ha descrito anteriormente produjo la secuencia de ADN de longitud completa para PRO4400 (designada en la presente invención como DNA87974-2609 [Figura 1, SEC. ID. No: 1]) y la secuencia de proteína derivada para ese polipéptido PRO4400.

La secuencia de codificación completa de DNA87974-2609 se incluye en la Figura 1 (SEC. ID. No: 1). El clon DNA87974-2609 contiene un único marco de lectura abierto con un sitio de iniciación de traducción claro en las posiciones de nucleótidos 27-29 y un codón de parada claro en las posiciones de nucleótidos 1026-1028. El precursor estimado del polipéptido tiene 333 aminoácidos de longitud y tiene un peso molecular estimado de aproximadamente 38.618 Daltons y un pI de aproximadamente 9,27. El análisis de la secuencia de longitud completa de PRO4400 mostrada en la Figura 2 (SEC. ID. No: 2) pone de manifiesto la presencia de un conjunto de dominios del polipéptido importantes, donde las localizaciones dadas para estos dominios del polipéptido importantes son aproximadamente como se han descrito anteriormente. El análisis del polipéptido de longitud completa PRO4400 mostrado en la Figura 2 pone de manifiesto la presencia de lo siguiente: un péptido señal que va desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 23, sitios de N-glicosilación desde aproximadamente el aminoácido 67 hasta aproximadamente el aminoácido 71 y desde aproximadamente el aminoácido 325 hasta aproximadamente el aminoácido 329; sitios de fosforilación de tirosina quinasa desde aproximadamente el aminoácido 152 hasta aproximadamente el aminoácido 159 y en aproximadamente el aminoácido 183; y sitios de N-miristoilación desde aproximadamente el aminoácido 89 hasta aproximadamente el aminoácido 95 y desde aproximadamente el aminoácido 128 hasta aproximadamente el aminoácido 134. El clon DNA87974-2609 ha sido depositado en ATCC a fecha de 27 de abril de 1999 y tiene asignado el depósito de ATCC nº 203963.

Un análisis de la base de datos de Dayhoff (versión 35.45 SwissProt 35), utilizando un análisis de alineación de secuencias WU-BLAST2 de la secuencia de longitud completa mostrada en la Figura 2 (SEC. ID. No. 2), puso de manifiesto la homología significativa entre la secuencia de aminoácidos PRO4400 y las siguientes secuencias Dayhoff: AF033827_1, AF070594_1, AF022729_1, CEC34F6_4, SYFB_THETH, G70405, SD_DROME, S64023, ALK1_YEAST y VG04_HSVII.

Ejemplo 5 Hibridación in situ

La hibridación in situ es una técnica potente y versátil para la detección y localización de secuencias de ácidos nucleicos en preparaciones de células o tejido. Puede ser útil, por ejemplo, para identificar sitios de expresión génica, analizar la distribución en el tejido de la transcripción, identificar y localizar la infección viral, seguir los cambios en la síntesis de ARNm específico y ayudar en el mapeo de los cromosomas.

La hibridación in situ se lleva a cabo siguiendo una versión optimizada del protocolo por Lu y Gillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994)), utilizando ribosondas marcadas con ^{33}P generadas por PCR. Brevemente, se seccionan tejidos humanos adultos y fetales bañados en parafina y fijados a formalina, se desparafinan, se desproteínan en proteinasa K (20 g/ml) durante 15 minutos a 37ºC, y se procesan posteriormente para una hibridación in situ tal y como se describe por Lu y Gillett, supra. Se genera una ribosonda antisentido marcada con [^{33}-P] UTP a partir de un producto de PCR y se hibrida a 55ºC durante toda la noche. Los portaobjetos se sumergen en una emulsión nuclear Kodak NTB2 y se exponen durante 4 semanas.

Síntesis de ribosondas con ^{33}P

Se secan con concentradores centrífugos de tipo Speed-Vac 6,0 \mul (125 mCi) de ^{33}P-UTP (Amersham BF 1002, SA < 2000 Ci/mol). A cada tubo que contenía ^{33}P-UTP secado, se añaden los siguientes ingredientes:

2,0 \mul 5x de tampón de transcripción

1,0 \mul de DTT (100 mM)

2,0 \mul de mezcla de NTP (2,5 mM: 10 \mul; cada uno de 10 mM de GTP, CTP y ATP + 10 \mul de H_{2}O)

1,0 \mul de UTP (50 \muM)

1,0 \mul Rnasina

1,0 \mul de plantilla de ADN (1 \mug)

1,0 \mul de H_{2}O

1,0 \mul de ARN polimerasa (para productos de PCR T3 = AS, T7 = S, normalmente)

Los tubos se incuban a 37ºC durante una hora. Se añade un total de 1,0 \mul de RQ1 ADNasa, seguido de incubación a 37ºC durante 15 minutos. Se añade un total de 90 \mul de TE (Tris 10 mM pH 7,6/ 1 mM EDTA pH 8,0), y la mezcla se pipetea sobre papel DE81. La solución remanente se carga en una unidad de ultrafiltración MICROCON-50^{TM}, y se centrifuga utilizando el programa 10 (6 minutos). La unidad de filtración se invierte sobre un segundo tubo y se centrifuga utilizando el programa 2 (3 minutos). Después del giro final de recuperación, se añaden un total de 100 \mul de TE, a continuación se pipetea 1 \mul del producto final sobre papel DE81 y se cuentan en 6 ml de BIOFLUOR II^{TM}.

La sonda se extiende sobre un gel de TBE/urea. Se añaden 1-3 \mul de la sonda o 5 \mul de ARN MrkII a 3 \mul de solución tampón de carga. Después de calentar sobre un bloque de calor a 95ºC durante 3 minutos, el gel se coloca inmediatamente sobre hielo. Los pocillos del gel se nivelan, se carga la muestra y se opera a 180-245 voltios durante 45 minutos. El gel se envuelve en un envoltorio de plástico (marca SARAN^{TM}) y se expone a una película XAR con una pantalla intensificadora en un congelador a -70ºC desde una hora hasta toda la noche.

Hibridación de ^{33}-P A. Pretratamiento de las secciones congeladas

Los portaobjetos se extraen del congelador, se colocan sobre bandejas de aluminio y se descongelan a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las bandejas se colocan en una incubadora a 55ºC durante cinco minutos para reducir la condensación. Los portaobjetos se fijan durante 10 minutos en paraformaldehído al 4% sobre hielo en la campana de extracción, y se lavan en 0,5 x SSC durante 5 minutos a temperatura ambiente (25 ml 20 x SSC + 975 ml SQ H_{2}O). Después de la desproteinación en 0,5 \mug/ml de proteinasa K durante 10 minutos a 37ºC (12,5 \mul de 10 mg/ml de reserva en 250 ml de tampón de ARNasa sin ARNasa precalentado), las secciones se lavan en 0,5 x SSC durante 10 mi-
nutos a temperatura ambiente. Las secciones se deshidratan en etanol al 70%, 95%, 100% durante 2 minutos cada una.

B. Pretratamiento de las secciones bañadas en parafina

Los portaobjetos se desparafinan, se colocan en SQ H_{2}O, y se enjuagan dos veces en 2 x SSC a temperatura ambiente, durante 5 minutos casa vez. Las secciones se desproteínan en 20 \mug/ml de proteinasa K (500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón de ARNasa sin ARNasa; 37ºC, 15 minutos) para tejido de embrión humano, u 8 x proteinasa K (100 \mul en 250 ml de tampón de ARNasa, 37ºC, 30 minutos) para tejidos en formalina. El posterior enjuague en 0,5 x SSC y deshidratación se llevan a cabo tal y como se ha descrito anteriormente.

C. Prehibridación

Los portaobjetos se disponen en una caja de plástico recubierta por papel de filtro saturado con tampón de Caja (4 x SSC, formamida al 50%). El tejido se recubre con 50 \mul de tampón de hibridación (3,75 g de sulfato de dextrano + 6 ml de SQ H_{2}O), se centrifuga y se calienta en el microondas durante 2 minutos con la tapa aflojada. Después de enfriar sobre hielo, se añaden 18,75 ml de formamida, 3,75 ml de 20 x SSC y 9 ml de SQ H_{2}O, y el tejido se centrifuga bien y se incuba a 42ºC durante 1-4 horas.

D. Hibridación

Se calientan a 95ºC durante 3 minutos 1,0 x 10^{6} cpm de sonda y 1,0 \mul de ARNt (50 mg/ml reserva) por portaobjetos. Los portaobjetos se enfrian sobre hielo, y se añaden 48 \mul de tampón de hibridación por portaobjeto. Después de centrifugar, se añaden 50 \mul de una mezcla de ^{33}P a 50 \mul de prehibridación en el portaobjetos. Los portaobjetos se incuban durante toda la noche a 55ºC.

E. Lavados

El lavado se realiza durante 2 x 10 minutos con 2 x SSC, EDTA a temperatura ambiente (400 ml de 20 x SSC + 16 ml de EDTA 0,25 M, V_{f}=4 L), seguido de un tratamiento con ARNasaA a 37ºC durante 30 minutos (500 \mul de 10 mg/m en 250 ml de tampón de ARNasa = 20 \mug/ml). Los portaobjetos se lavan 2 x 10 minutos con 2 x SSC, EDTA a temperatura ambiente. Las condiciones de lavado de astringencia fueron las siguientes: 2 horas a 55ºC, 0,1 x SSC, EDTA (20 ml 20 x SSC + 16 ml de EDTA, V_{f}=4 L).

Ejemplo 6 Utilización de PRO como sonda de hibridación

El siguiente procedimiento describe el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica PRO como sonda de hibridación. El ADN que comprende la secuencia codificante PRO de longitud completa o madura tal y como se describe en la presente invención o un fragmento de la misma se utiliza como sonda para cribar los ADNs homólogos (tales como aquéllos que codifican variantes naturales de PRO) en bibliotecas de ADNc de tejido humano o bibliotecas genómicas de tejido humano.

La hibridación y el lavado de filtros que contienen cualquier ADN de biblioteca se realizan según las siguientes condiciones de elevada. La hibridación de la sonda radiomarcada derivada del gen que codifica un polipéptido PRO a los filtros se realiza en una solución al 50% de formamida, 5x SSC, SDS al 0,1%, pirofosfato de sodio al 0,1%, 50 mM de fosfato de sodio, pH 6,8, 2x de solución de Denhardt, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC durante 20 horas. El lavado de los filtros se realiza en una solución acuosa de 0,1x SSC y SDS al 0,1% a 42ºC.

A continuación, se pueden identificar los ADNs que tienen una identidad secuencial deseada con el ADN que codifica el PRO de secuencia nativa de longitud completa utilizando las técnicas estándar conocidas en la literatura.

Ejemplo 7 Expresión de PRO en E. coli

Este ejemplo ilustra la preparación de una forma no glicosilada de PRO mediante expresión recombinante en E. coli.

La secuencia de ADN que codifica PRO se amplifica inicialmente utilizando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores deberían contener sitios para las enzimas de restricción que se correspondan con los sitios para enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado. Se puede utilizar una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo de vector adecuado es el pBR322 (derivado del E. coli, véase Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)) que contiene genes para la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina. El vector se digiere con una enzima de restricción y se desfosforila. A continuación, las secuencias amplificadas por PCR se unen en el vector. El vector preferiblemente incluirá secuencias que codifican un gen resistente a un antibiótico, un promotor trp, un líder poli-His (incluyendo los primeros seis codones STII, secuencia poli-His, y sitio de división para la enteroquinasa), la región codificante de PRO, el finalizador transcripcional lambda, y un gen argU.

A continuación, la mezcla de unión se utiliza para transformar una cepa seleccionada de E. coli utilizando los procedimientos descritos en Sambrook et al., supra. Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer en placas de LB y, a continuación, se seleccionan las colonias resistentes a los antibióticos. El ADN plásmido se puede aislar y confirmar mediante el análisis de restricción y la secuenciación del ADN.

Los clones seleccionados se pueden desarrollar durante toda la noche en un medio de cultivo líquido tal como el caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo de toda la noche se puede utilizar posteriormente para inocular un cultivo a mayor escala. A continuación, las células se desarrollan hasta una densidad óptica deseada, durante la cual el promotor de la expresión se activa.

Después de cultivar las células durante muchas más horas, las células se pueden recoger mediante centrifugación. El residuo de células obtenido mediante la centrifugación se puede solubilizar utilizando diversos agentes conocidos en la técnica, y la proteína PRO solubilizada se puede a continuación purificar utilizando una columna quelante de metal en condiciones que permiten la unión fuerte de la proteína.

El PRO puede expresarse en E. coli en forma de etiqueta de poli-His, utilizando el siguiente procedimiento. El ADN que codifica PRO se amplifica inicialmente utilizando cebadores del PCR seleccionados. Los cebadores contendrán sitios para las enzimas de restricción que se corresponden con los sitios para enzimas de restricción del vector de expresión seleccionado, y otras secuencias útiles que proporcionan una iniciación de la traducción eficaz y fiable, una purificación rápida en una columna quelante metálica, y la eliminación proteolítica con enteroquinasa. Las secuencias etiquetadas de poli-His amplificadas por PCR se unen a continuación en un vector de expresión que se utiliza para transformar un E. coli huésped basado en la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts) clpP(laclq). Los transformantes se cultivan en primer lugar en LB que contiene 50 mg/ml de carbenicilina a 30ºC con agitación hasta alcanzar una D.O._{600} de 3-5. Los cultivos se diluyen a continuación 50-100 veces en un medio CRAP (preparado mezclando 3,57 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,71 g de citrato de sodio\cdot2H_{2}O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de extracto de levadura Difco, 5,36 g de Sheffield hycase SF en 500 ml de agua, además de 110 mM de MPOS, pH 7,3, glucosa al 0,55% (p/v) y 7 mM de MgSO_{4}) y se cultivan durante aproximadamente 20-30 horas a 30ºC con agitación. Las muestras se extraen para verificar la expresión mediante un análisis SDS-PAGE, y el volumen del cultivo se centrifuga hasta que las células son residuos de centrifugación. Los residuos de centrifugación de las células se congelan hasta la purificación y el repliegue.

La masa de E. coli de fermentaciones de 0,5 a 1 L (6-10 g de residuo) se resuspende en 10 volúmenes (p/v) de 7 M de guanidina, 20 mM de Tris, tampón de pH 8. Se añade sulfito sódico sólido y tetrationato de sodio para que las concentraciones finales sean de 0,1 M y 0,02 M, respectivamente, y la solución se agita durante toda la noche a 4ºC. Este paso da lugar a una proteína desnaturalizada con todos los residuos de cisteína bloqueados por la sulfitolización. La solución se centrifuga a 40.000 rpm durante 30 minutos en una ultracentrífuga Beckman. El sobrenadante se diluye con 3-5 volúmenes de tampón de columna quelante metálica (6 M de guanidina, 20 mM de Tris, pH 7,4) y se filtra a través de filtros de 0,22 micras para aclarar. El extracto aclarado se carga en una columna quelante metálica Quiagen Ni^{2+}-NTA de 5 ml equilibrada con el tampón de columna quelante metálica. La columna se lava con un tampón adicional que contiene 50 mM de imidazol (Calbiochem, grado Utrol), pH 7,4. La proteína se eluye con un tampón que contiene 250 mM de imidazol. Las fracciones que contienen la proteína de interés se agrupan y se guardan a 4ºC. La concentración de la proteína se estima según su absorbancia a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción calculado en base a su secuencia de aminoácidos.

Las proteínas se repliegan mediante la dilución lenta de la muestra en tampón de repliegue preparado nuevo consistente en: 20 mM de Tris, pH 8,6, 0,3 M de NaCl, 2,5 M de urea, 5 mM de cisteína, 20 mM de glicina y 1 mM de EDTA. Los volúmenes de repliegue se escogen de manera que la concentración final de proteína esté entre 50 y 100 microgramos/ml. La solución de repliegue se agita suavemente a 4ºC durante 12-36 horas. La reacción de repliegue se detiene mediante la adición de TFA hasta una concentración final del 0,4% (pH aproximadamente de 3). Antes de otra purificación de la proteína, la solución se filtra a través de un filtro de 0,22 micras y se añade acetonitrilo hasta una concentración final del 2-10%. La proteína replegada se somete a una columna de cromatografía de fase inversa Poros R1/H utilizando un tampón móvil de TFA al 0,1% con elución con un gradiente de acetonitrilo del 10 al 80%. Las alícuotas de fracciones con una absorbancia A280 se analizan en geles de SDS poliacrilamida y las fracciones que contienen proteína replegada homogénea se agrupan. Generalmente, las especies replegadas correctamente de la mayoría de las proteínas se eluyen a las concentraciones más bajas de acetronitrilo, ya que esas especies son las más compactas con sus interiores hidrofóbicos protegidos de la interacción con la resina de fase inversa. Las especies agregadas se eluyen normalmente a concentraciones de acetonitrilo superiores. Además de solucionar las formas desplegadas de proteínas de la manera deseada, la etapa de la fase inversa también elimina la endotoxina de las muestras.

Las fracciones que contienen el polipéptido PRO plegado deseado se agrupan y se elimina el acetonitrilo utilizando una corriente suave de nitrógeno dirigida a la solución. Las proteínas se formulan en 20 mM Hepes, pH 6,8 con 0,14 M de cloruro sódico y manitol al 4% por diálisis o por filtración en gel utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el tampón de formulación y filtradas de forma estéril.

Muchos de los polipéptidos PRO descritos en la presente invención se expresaron de forma satisfactoria tal y como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 8 Expresión de PRO en células de mamíferos

Este ejemplo ilustra la preparación de una forma potencialmente glicosilada de PRO mediante la expresión recombinante en células de mamíferos.

El vector pRK5 (véase EP 307.247, publicada el 15 de marzo de 1989) se utiliza como vector de expresión. Opcionalmente, el ADN de PRO está ligado en el pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción del ADN de PRO utilizando procedimientos de unión tales como los descritos en Sambrook et al., supra. El vector resultante se denomina pRK5-PRO.

En una realización, las células huésped seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC CCL 1573) se cultivan para unirse en placas de cultivo de tejidos en un medio tal como DMEM suplementado con suero de ternera fetal y opcionalmente, componentes nutricionales y/o antibióticos. Se mezclan aproximadamente 10 \mug de ADN de pRK5-PRO se mezcla con 1 \mug de ADN que codifica el gen del ARN de VA [Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)] y se disuelve en 500 \mul de 1 mM de Tris-HCl, 0,1 nM de EDTA, 0,227 M de CaCl_{2}. A esta mezcla se le añade, gota a gota, 500 \mul de 50 mM de HEPES (ph 7,35), 280 mM de NaCl, 1,5 mM de NaPO_{4}, y se deja formar un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se suspende y se añade a células 293 y se deja reposar durante aproximadamente cuatro horas a 37ºC. El medio de cultivo se aspira y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. A continuación, las células 293 se lavan con medio sin suero, se añade medio nuevo y las células se incuban durante aproximadamente 5 días.

Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, el medio de cultivo se extrae y se reemplaza por medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 200 \muCi/ml de ^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml ^{35}S- metionina. Tras una incubación de 12 horas, se recoge el medio acondicionado, se concentra en un filtro de giro y se carga en un gel SDS al 15%. El gel procesado puede secarse y exponerse a una película durante un período de tiempo concreto para revelar la presencia del polipéptido PRO. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden experimentar una incubación adicional (en medio sin suero) y el medio se examina en bioensayos concretos.

En una técnica alternativa, se puede introducir PRO en células 293 transitoriamente utilizando el procedimiento del sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 1575 (1981). Las células 293 se desarrollan hasta la máxima densidad en un frasco giratorio y se añaden 700 \mug de ADN de pRK5-PRO. En primer lugar, las células se concentran en el frasco giratorio mediante centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano es incubado en el residuo de centrifugación durante cuatro horas. Las células se tratan con glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de tejido, y se reintroducen en el frasco giratorio que contiene el medio de cultivo de tejidos, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Después de aproximadamente cuatro días, el medio acondicionado se centrifuga y se filtra para eliminar las células y los debris. La muestra que contiene el PRO expresado se puede concentrar a continuación y purificar mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como la diálisis y/o cromatografía en columna.

En otra realización, PRO puede expresarse en células CHO. El pRK5-PRO puede transfectarse en células CHO utilizando reactivos conocidos, tales como CaPO_{4} o DEAE-dextrano. Tal y como se ha descrito anteriormente, los cultivos celulares pueden incubarse, y el medio remplazarse por medio de cultivo (solo) o medio que contiene un radiomarcador, tal como la ^{35}S-metionina. Después de determinar la presencia de un polipéptido PRO, el medio de cultivo puede remplazarse por medio sin suero. Preferiblemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días y, a continuación, se recoge el medio acondicionado. A continuación, el medio que contiene el polipéptido PRO expresado puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado.

El PRO etiquetado con epítopo puede expresarse también en células CHO huésped. El PRO puede subclonarse fuera del vector pRK5. La inserción del subclon puede experimentar PCR para fusionarse en el marco con una etiqueta de epítopo concreta, tal como una etiqueta de poli-His en un vector de expresión de Baculovirus. La inserción de PRO etiquetado con poli-His puede subclonarse a continuación en un vector conductor SV40 que contiene un marcador de selección, tal como DHFR, para seleccionar clones estables. Finalmente, las células CHO pueden transfectarse (tal y como se ha descrito anteriormente) con el vector conductor SV40. El marcaje puede realizarse, tal y como se ha descrito anteriormente, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene el PRO etiquetado con poli-His expresado puede a continuación concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como mediante cromatografía de afinidad de quelante-Ni^{2+}.

PRO puede expresarse también en células CHO y/o células COS mediante un procedimiento de expresión transitoria o en células CHO mediante otro procedimiento de expresión estable.

La expresión estable en células CHO se realiza utilizando el siguiente procedimiento. Las proteínas se expresan como una construcción IgG (inmunoadhesina), en la que las secuencias codificantes para las formas solubles (por ejemplo, los dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan a una secuencia de región constante de IgG1 que contiene la bisagra, CH2 y los dominios de CH2 y/o como una forma etiquetada de poli-His.

Tras la amplificación por PCR, los ADNs respectivos se subclonan en un vector de expresión de CHO utilizando técnicas estándar descritas en Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unidad 3.16, John Wiley and Sons (1997). Los vectores de expresión de CHO se construyen para que tengan sitios de restricción 5' y 3' compatibles del ADN de interés para permitir el traslado adecuado de los de ADNc. El vector utilizado en la expresión en las células CHO es tal y como se describe en Lucas et al., Nucl. Acid Res. 24:9 (1774-1779 (1996), y utiliza el promotor/potenciador temprano de SV40 para dirigir la expresión del ADNc de interés y la dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la selección para el mantenimiento estable del plásmido tras la transfección.

Se introducen doce microgramos del ADN plásmido deseado en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando reactivos de transfección Superfect® (Qiagen), Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim) disponibles comercialmente. Las células se desarrollan tal y como se describe en Lucas et al., supra. Aproximadamente se congelan 3 x 10^{-7} células en una ampolla para un crecimiento y producción posterior tal y como se describe a continuación.

Las ampollas que contienen el ADN plásmido se descongelan mediante un baño de agua y se mezclan mediante centrifugación. El contenido se pipetea en un tubo de centrífuga que contiene 10 ml de medio y se centrifuga a 1000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se aspira y las células se resuspenden en 10 ml de medio selectivo (PS20 filtrado a 0,2 \mum con un 5% de suero bovino fetal dialfiltrado a 0,2 \mum). A continuación, las células se fraccionan en un centrifugador de 100 ml que contiene 90 ml del medio selectivo. Después de 1-2 días, las células se transfieren a un centrifugador de 250 ml lleno con 150 ml de medio de cultivo selectivo y se incuban a 37ºC. Después de otros 2-3 días, se siembran centrifugadores de 250 ml, 500 ml y 2000 ml se siembran con 3 x 10^{5} células/ml. El medio celular se cambia por medio nuevo mediante centrifugación y resuspensión en el medio de producción. Aunque se puede utilizar cualquier medio de CHO adecuado, en realidad se puede utilizar un medio de producción descrito en la patente U.S.A. No. 5.122.469, concedida el 16 de junio de 1992. Un centrifugador de 3 L de producción se siembra a 1,2 x 10^{6} células/ml. En el día 0, se determinan el pH y el número de células. En el día 1, se toman muestras en el centrifugador y se inicia el burbujeo con aire filtrado. En el día 2, se toman muestras en el centrifugador, la temperatura se varía hasta 33ºC, y se toman 30 ml de glucosa a 500 g/l y 0,6 ml de antiespuma al 10% (por ejemplo 35% de emulsión de polidimetilsiloxano, Dow Coming 365 Medical Grade Emulsion). Durante toda la producción, el pH se ajusta según la necesidad manteniéndose en valores alrededor de 7,2. Después de 10 días, o hasta que la viabilidad caiga por debajo del 70%, el cultivo celular se recoge mediante centrifugación y se filtra a través de un flitro de 0,22 \mum. El filtrado se guarda a 4ºC o se carga inmediatamente en columnas para la purificación.

Para las construcciones etiquetadas de poli-His, las proteínas se purifican utilizando una columna de Ni^{2+}-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se añade imidazol al medio acondicionado hasta una concentración de 5 mM. El medio acondicionado se bombea en una columna de 6 ml de Ni^{2+}-NTA equilibrada en 20 mM Hepes, pH 7,4, tampón que contiene 0,3 M de NaCl y 5 mM de imidazol a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min. a 4ºC. Tras cargarse, la columna se lava con un tampón de equilibrio adicional y la proteína se eluye con el tampón de equilibrio que contiene 0,25 M de imidazol. La proteína altamente purificada se desala posteriormente en un tampón de almacenamiento que contiene 10 mM Hepes, 0,14 M de NaCl y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna G25 Superfine (Pharmacia) de 25 ml y se guarda a -80ºC.

Las construcciones de inmunoadhesinas (que contienen Fc) se purifican a partir del medio acondicionado tal y como se indica a continuación. El medio acondicionado se bombea a una columna de Proteína A (Pharmacia) de 5 ml que ha sido equilibrada en un tampón de 20 mM de fosfato sódico, pH 6,8. Después de cargarse, la columna se lava ampliamente con tampón de equilibrio antes de la elución con 100 mM de ácido cítrico, pH 3,5. La proteína eluída se neutraliza inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275 \muL de tampón de Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada se desala posteriormente en un tampón de almacenamiento, tal como se ha descrito anteriormente, para las proteínas etiquetadas con poli-His. La homogeneidad se calcula mediante geles de poliacrilamida SDS y mediante la secuenciación de los aminoácidos N-terminales mediante la degradación Edman.

Ejemplo 9 Expresión de PRO en levadura

El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante de PRO en levadura.

En primer lugar, los vectores de expresión de levadura se construyen para la producción o secreción intracelular de PRO a partir del promotor ADH2/GAPDH. El ADN que codifica PRO y el promotor se insertan en los sitios para enzimas de restricción adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular de PRO. Para la secreción, el ADN que codifica PRO puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto con el ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, un péptido señal de PRO nativo u otro péptido señal de mamífero, o, por ejemplo, un factor alfa de levadura o la secuencia señal/líder secretora de la invertasa, y secuencias enlazadoras (si se necesitan) para la expresión de PRO.

Las células de levadura, tales como la cepa AB110 de la levadura, pueden a continuación transformarse con los plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivarse en medios de fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de levadura transformados pueden analizarse mediante precipitación con ácido tricloroacético al 10% y una separación mediante SDS-PAGE, seguido de la tinción de los geles con azul de Coomassie.

El PRO recombinante puede aislarse posteriormente y purificarse mediante la extracción de las células de levadura del medio de fermentación por centrifugación y, a continuación, la concentración del medio utilizando filtros de cartucho específicos. El concentrado que contiene PRO puede purificarse adicionalmente utilizando resinas de cromatografía en columna concretas.

Ejemplo 10 Expresión de PRO en células de insectos infectadas de Baculovirus

El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante de PRO en células de insectos infectadas de Baculovirus.

La secuencia que codifica PRO se fusiona en dirección 5' a un epítopo etiqueta contenido en un vector de expresión de baculovirus. Dichas epítopo etiquetas incluyen etiquetas de poli-His y etiquetas de inmunoglobulina (como las regiones Fc de IgG). Pueden utilizarse una variedad de plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de los plásmidos disponibles comercialmente, tales como pVL1393 (Novagen). Brevemente, la secuencia que codifica PRO o la parte deseada de la secuencia que codifica PRO (tal como la secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína transmembrana o la secuencia que codifica la proteína madura si la proteína es extracelular) se amplifica mediante PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar sitios para enzimas de restricción flanqueantes (seleccionados). El producto se digiere a continuación con todas esas enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en el vector de expresión.

El baculovirus recombinante se genera mediante la cotransfección del plásmido anterior y el ADN del virus BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Después de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se recogen y se utilizan para amplificaciones adicionales. La infección viral y la expresión de la proteína se realizan tal y como se describe en O'Reilley et al., Baculovirus expresion vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).

A continuación, el PRO etiquetado con poli-His expresado puede purificarse, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad de Ni^{2+}-quelato tal y como se indica a continuación. Los extractos se preparan a partir de las células recombinantes Sf9 infectadas del virus tal y como se ha descrito por Rupert et al., Nature, 362: 175-179 (1993). Brevemente, las células Sf9 se lavan, se resuspenden en el tampón de sonicación (25 ml Hepes, pH 7,9; 12,5 mM de MgCl_{2}; 0,1 mM de EDTA; glicerol al 10%; NP-40 al 0,1%; 0,4 M de KCl), y se sonican dos veces durante 20 segundos en hielo. Los sonicados se aclaran por centrifugación, y el sobrenadante se diluye 50 veces en el tampón de carga (50 mM de fosfato, 300 mM de NaCl, glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtra a través de un filtro de 0,45 \mum. Se prepara una columna de agarosa Ni^{2+}-NTA (comercialmente disponible de Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se equilibra con 25 ml del tampón de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a 0,5 ml por minuto. La columna se lava hasta la línea base a A_{280} con el tampón de carga, en cuyo punto se inicia la recogida de la fracción. A continuación, la columna se lava con un tampón de lavado secundario (50 mM fosfato: 300 mM de NaCl, glicerol al 10%, pH 6,0), que eluye las proteínas unidas no específicamente. Después de alcanzar la línea base a A_{280} de nuevo, la columna se desarrolla con un gradiente de 0 a 500 mM de imidazol en el tampón de lavado secundario. Se recogen fracciones de un ml y se analizan mediante SDS-PAGE y tinción con plata o transferencia Western con Ni^{2+}-NTA-conjugado a fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen PRO etiquetado con His_{10} eluído se agrupan y se dializan contra el tampón de carga.

Alternativamente, la purificación del PRO etiquetado con IgG (o con Fc) puede realizarse usando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo, por ejemplo, cromatografía en columna con Proteína A o proteína G.

Ejemplo 11 Preparación de anticuerpos que se unen a PRO

Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a PRO.

Las técnicas para producir los anticuerpos monoclonales son conocidas en la técnica y están descritas, por ejemplo, en Goding, supra. Entre los inmunogenes que se pueden utilizar se incluyen PRO purificado, proteínas de fusión que contienen PRO, y células que expresan PRO recombinante en la superficie celular. La selección del inmunogen puede realizarse según el técnico en la materia sin una gran experimentación.

Los ratones, tal como Balb/c, se inmunizan con el inmunogen de PRO emulsionado en adyuvante completo de Freund y se injecta subcutáneamente o intraperitonealmente en una cantidad de 1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunogen se emulsiona en el adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en las bases de las patas traseras del animal. A continuación, los ratones inmunizados se estimulan de 10 a 12 días después con inmunogen adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. A continuación, durante diversas semanas, los ratones también se pueden estimular con inyecciones de inmunización adicionales. Las muestras de suero se pueden obtener periódicamente de los ratones mediante muestras de sangre retro-orbitales para ser analizadas en ensayos ELISA para detectar anticuerpos anti-PRO.

Después de detectar un título de anticuerpo adecuado, a los animales "positivos" para anticuerpos se les puede inyectar una inyección intravenosa final de PRO. De tres a cuatro días más tarde, los ratones se sacrifican y las células del bazo se recogen. A continuación, las células del bazo se fusionan (usando polietilenglicol al 35%) a una línea celular de mieloma murino seleccionada, tal como la P3X63AgU.1, disponible de ATCC, No. CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que se pueden colocar a continuación en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos que contienen un medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células de bazo.

Las células de hibridomas se cribarán en un ELISA por la reactividad contra PRO. La determinación de células de hibridomas "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra PRO está dentro de la técnica.

Las células de hibridomas positivas se pueden inyectar intraperitonialmente en ratones singeneicos Balb/c para producir ascitis que contiene los anticuerpos monoclonales anti-PRO. Alternativamente, las células de hibridomas pueden desarrollarse en matraces de cultivos de tejidos o en botellas en rodillo. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en la ascitis se puede realizar usando precipitación con sulfato de amonio, seguido por cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, puede usarse la cromatografía por afinidad basada en la unión del anticuerpo a la proteína A o la proteína G.

Ejemplo 12 Purificación de polipéptidos PRO usando Anticuerpos Específicos

Los polipéptidos PRO nativos o recombinantes se pueden purificar mediante una variedad de técnicas estándar en la técnica de purificación de proteínas. Por ejemplo, se purifica el polipéptido pro-PRO, el polipéptido PRO maduro, o el polipéptido pre-PRO mediante cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para el polipéptido PRO de interés. En general, una columna de inmunoafinidad está construida mediante el acoplamiento covalente de anticuerpos de polipéptidos anti-PRO y una resina de cromatografía activada.

Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a partir de sueros inmunes mediante precipitación con sulfato de amonio o mediante purificación en la Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J). Asimismo, los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de los fluidos de ascitis de ratón mediante la precipitación con sulfato de amonio o cromatografía en Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina parcialmente purificada se une covalentemente a una resina cromatográfica, tal como la SEPHAROSE^{TM} activada con CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se acopla a la resina, la resina se bloquea y la resina derivada se lava de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Dicha columna de inmunoafinidad se utiliza en la purificación del polipéptido PRO mediante la preparación de una fracción a partir de células que contienen el polipéptido PRO en una forma soluble. Esta preparación se deriva por solubilización de toda la célula o de una fracción subcelular obtenida mediante centrifugación diferencial por adición de detergente o mediante otros procedimientos conocidos en la técnica. Alternativamente, el polipéptido PRO soluble que contiene una secuencia señal podría secretarse en una cantidad útil en el medio en el que las células crecen.

Una preparación que contiene polipéptido PRO soluble se pasa por la columna de inmunoafinidad, y la columna se lava en condiciones que permiten la absorbancia preferencial del polipéptido PRO (por ejemplo, tampones de fuerza iónica elevada en presencia de detergente). A continuación, la columna se eluye en condiciones que interrumpen la unión anticuerpo/polipéptido PRO (por ejemplo, un tampón de pH bajo, tal como aproximadamente un pH de 2-3, o una alta concentración de caótropo, tal como urea o ión tiocianato), y se recoge el polipéptido PRO.

Ejemplo 13 Cribado de fármacos

La presente invención es particularmente útil para cribar compuestos mediante la utilización de polipéptidos PRO o fragmentos de unión de los mismos en cualquier variedad de técnica de cribado de fármacos. El polipéptido PRO o el fragmento utilizado en dicha prueba puede estar libre en solución, fijado a un soporte sólido, adsorbido en una superficie celular o situado intracelularmente. Un procedimiento de cribado de fármacos utiliza células huésped eucariotas o procariotas, las cuales se transforman de forma estable con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido PRO o un fragmento. Los fármacos se criban contra dichas células transformadas en ensayos de unión competitiva. Dichas células, tanto en forma viable como fija, se pueden utilizar para ensayos de unión estándar. Se puede medir, por ejemplo, la formación de complejos entre un polipéptido PRO o un fragmento y el agente que se está probando. Alternativamente, se puede examinar la disminución en la formación del complejo entre el polipéptido PRO y su célula diana o receptores diana causado por el agente que se está probando.

De este modo, la presente invención proporciona procedimientos de cribado para fármacos o cualquier otro agente que puede afectar a una enfermedad o un trastorno asociados al polipéptido PRO. Estos procedimientos comprenden el contacto de dicho agente con un polipéptido PRO o un fragmento del mismo y el ensayo (i) para la presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido PRO o un fragmento, o (ii) para la presencia de un complejo entre el polipéptido PRO o un fragmento y la célula, mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. En dichos ensayos de unión competitiva, el polipéptido PRO o un fragmento está normalmente marcado. Después de una incubación adecuada, el polipéptido PRO o un fragmento libres se separan de la forma unida, y la cantidad de marca libre o no complejada es una medida de la capacidad del agente concreto para unirse al polipéptido PRO o para interferir en el complejo polipéptido PRO/célula.

Otra técnica para el cribado de fármacos proporciona un alto rendimiento cribando compuestos que tienen una afinidad de unión adecuada a un polipéptido y se describe en detalle en WO 84/03564, publicado el 13 de septiembre de 1984. Brevemente, una gran cantidad de compuestos de diferentes péptidos pequeños de prueba se sintetizan en un sustrato sólido, tal como agujas de plástico o alguna otra superficie. Tal y como se aplica a un polipéptido PRO, las compuestos de péptidos de prueba se hacen reaccionar con el polipéptido PRO y se lavan. Se detecta el polipéptido PRO unido mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. El polipéptido PRO purificado también puede recubrirse directamente en placas para utilizar en las técnicas de cribado de fármacos mencionadas anteriormente. Además, se pueden utilizar anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo en el soporte
sólido.

La presente invención también contempla la utilización de ensayos de cribado de fármacos competitivos en los cuales los anticuerpos neutralizantes capaces de unirse a polipéptidos PRO compiten específicamente con un compuesto de prueba para unirse al polipéptido PRO o fragmentos del mismo. De esta manera, pueden utilizarse los anticuerpos para detectar la presencia de cualquier péptido que comparte uno o más determinantes antigénicos con un polipéptido PRO.

Ejemplo 14 Diseño racional de fármacos

El objetivo del diseño racional de fármacos es producir análogos estructurales de un polipéptido biológicamente activos de interés (es decir, un polipéptido PRO) o de pequeñas moléculas con las cuales interactúan, por ejemplo, agonistas, antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos se puede utilizar para fármacos de moda que son formas más activas o estables del polipéptido PRO o que potencian o interfieren con la función del polipéptido PRO in vivo (c.f. Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)).

En un enfoque, la estructura tridimensional del polipéptido PRO, o de un complejo polipéptido PRO-inhibidor, se determina mediante cristalografía de rayos X, mediante modelación por ordenador o, más habitualmente, mediante una combinación de los dos enfoques. Deben comprobarse la forma y las cargas del polipéptido PRO para elucidar la estructura y para determinar el sitio o sitios activos de la molécula. Con menor frecuencia, podría obtenerse la información útil con respecto a la estructura del polipéptido PRO mediante la modelación basada en la estructura de proteínas homólogas. En ambos casos, la información estructural pertinente se utiliza para diseñar moléculas análogas de tipo polipéptido PRO o para identificar inhibidores eficaces. Entre los ejemplos útiles de diseño racional de fármacos se pueden incluir moléculas que han mejorado la actividad o la estabilidad, tal como se muestra por Braxton y Wells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992) o que actúan como agonistas inhibidores, o antagonistas de péptidos nativos tal y como se muestra por Athauda et al., J. Biochem., 113: 742-746 (1993).

También es posible aislar un anticuerpo específico de diana, seleccionado mediante un ensayo funcional, tal y como se ha descrito anteriormente y, a continuación solucionar su estructura cristalina. Este enfoque, en principio, produce un fármaco inicial en el que puede basarse el diseño de fármacos posterior. Es posible evitar una cristalografía de toda la proteína mediante la generación de anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ids) para un anticuerpo funcional farmacológicamente activo. Como imagen especular de una imagen especular, el sitio de unión del anti-ids se espera que sea un análogo del receptor original. A continuación, el anti-id podría utilizarse para identificar y aislar péptidos de bancos de péptidos producidos química o biológicamente. Los péptidos aislados actuarían entonces como el fármaco inicial.

En virtud de la presente invención, se pueden disponer de cantidades suficientes del polipéptido PRO para realizar dichos estudios analíticos, tales como en cristalografía de rayos-X. Además, el conocimiento de la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO proporcionada en la presente invención proporcionará una guía para los usuarios de técnicas de modelación por ordenador en lugar de o adicionalmente a la cristalografía de rayos-X.

Ejemplo 15 Ensayo antitumoral in vitro

La actividad antiproliferativa del polipéptido se determinó en el ensayo de investigación para el descubrimiento de fármacos anticancerígenos in vitro orientado hacia enfermedades del National Cancer Institute (NCI), utilizando un ensayo de unión con colorante sulforrodamina B (SRB) esencialmente como se describe por Skehan et al., J. Natl. Cancer Inst., 82 1107-1112 (1990). Las 60 líneas de células tumorales utilizadas en este estudio (el panel NCI), así como las condiciones para su mantenimiento y cultivo in vitro se han descrito por Monks et al., J. Natl. Cancer Inst., 83: 757-766 (1991). El objetivo de este cribado es evaluar inicialmente la actividad citotóxica y/o citoestática de los compuestos de prueba contra diferentes tipos de tumores (Monks et al., supra.: Boyd, Cancer: Prine, Pract. Oncol. Update, 3(10): 1-12 [1989]).

Se recogieron células de aproximadamente 60 líneas de células tumorales humanas cpn tripsina/EDTA (Gibco), se lavaron una vez, se resuspendieron en IMEM y se determinó su viabilidad. Las suspensiones celulares se añadieron mediante pipeta (volumen de 100 \mul) en placas de microtítulos separadas de 96 pocillos. La densidad de células para la incubación de 6 días era inferior que para la incubación de 2 días para evitar el sobrecrecimiento. Los inoculados se dejaron durante un periodo de preincubación de 24 horas a 37ºC para su estabilización. Se añadieron diluciones de dos veces la concentración de prueba deseada a tiempo cero en alícuotas de 100 \mul a los pocillos de de placas de microtítulos (dilución 1:2). Los compuestos de prueba se evaluaron a cinco diluciones semilogarítmicas (1000 a 100.000 veces). Las incubaciones tuvieron lugar durante dos días y seis días en una atmósfera de CO_{2} al 5% y 100% de humedad.

Después de la incubación, se extrajo el medio y las células se fijaron en 0,1 ml de ácido tricloroacético al 10% a 40ºC. Las placas se enjuagaron cinco veces con agua desionizada, se secaron, se tiñeron durante 30 minutos con 0,1 ml de colorante sulforrodamina B al 0,4% (Sigma) disuelto en ácido acético al 1%, se enjuagaron cuatro veces con ácido acético al 1% para eliminar el colorante no unido, se secaron y el tinte se extrajo durante 5 minutos con 0,1 ml de base Tris [tris(hidroximetil)aminometano] 10 mM, pH 10,5. La absorbancia (DO) de sulforrodamina B a 492 nm se midió utilizando un lector de la placa de microtítulos de 96 pocillos conectado a un ordenador.

Una muestra de prueba se considera positiva si muestra por lo menos un 40% de efecto inhibidor del crecimiento en una o más concentraciones. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 7, en la que las abreviaturas del tipo de células tumorales son las siguientes:

NSCL = carcinoma de pulmón de células no pequeñas; SNC = sistema nervioso central

TABLA 7

25

26

Depósito de material

Los siguientes materiales se han depositado con la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):

27

Estos depósitos se realizaron según lo estipulado en el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes y el Reglamento bajo el mismo (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha de ldepósito. Los depósitos estarán disponibles mediante la ATCC según los términos del Tratado de Budapest, y están sujetos a un acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegura la disponibilidad permanente y sin restricción de la progenie del cultivo del depósito al uso público tras la concesión de la respectiva patente estadounidense o tras ponerse abierta a la inspección pública de cualquier solicitud de patente estadounidense o extranjera, la que sea primera, y asegura la disponibilidad de la progenie para alquien determinado por la U.S. Commissioner of Patents and Trademarks para tener el derecho a la misma de acuerdo con 35 USC \NAK 122 y las normas de la Commissioner según las mismas (incluyendo 37 CFER \NAK 1.14 con referencia concreta a 886 OG 638).

El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si un cultivo de los materiales en el depósito mueriera o se perdiera o se destruyera cuando se cultiva en las condiciones adecuadas, los materiales serán inmediatamente reemplazados en una notificación por otros iguales. La disponibilidad del material depositado no se interpreta como una licencia para realizar la invención contraviniendo los derechos concedidos bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patente.

El documento escrito anterior se considera que es suficiente para permitir a un experto en la materia realizar la invención. La presente invención no se limita en su alcance por la construcción depositada, ya que la realización depositada pretende ser una ilustración individual de ciertos aspectos de la presente invención y otras construcciones que son funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la presente invención. El depósito del material de la presente invención no constituye una admisión de que la descripción escrita contenida en la presente invención sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el modo óptimo de la misma, ni se interpreta como limitante del alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representa. De hecho, las diversas modificaciones además de las mostradas y descritas en la presente invención serán evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripción anterior y caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

<110> Genentech, Inc.

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<120> PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES PARA INHIBIR EL CRECIMIENTO DE CÉLULAS NEOPLÁSICAS

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<130> CMD/FP5967989

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<140> EP 00941164.6

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<141> 2000-05-30

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<150> PCT/US99/12252

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<151> 1999-06-02

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<150> US 60/140,650

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<151> 1999-06-22

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<151> 1999-06-23

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<151> 1999-07-20

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<150> PCT/US99/20111

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<151> 1999-09-08

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<151> 1999-10-29

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<151> 1999-11-30

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<151> 1999-12-20

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<151> 2000-02-11

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<150> PCT/USOO/06319

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<151> 2000-03-10

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<150> PCT/US00/06884

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<151> 2000-03-15

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<150> PCT/US00/08439

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<151> 2000-03-30

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<150> PCT/US00/13705

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<151> 2000-05-17

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<160> 5

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<210> 1

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<211> 1840

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<212> ADN

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<213> Homo Sapien

\newpage

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<400> 1

28

29

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<210> 2

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<211> 333

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<212> PRT

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<213> Homo Sapien

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<400> 2

30

31

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<210> 3

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Sonda de oligonucleótidos sintéticos

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

gctgctgccg tccatgctga tg

\hfill

22

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<210> 4

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Sonda de oligonucleótidos sintéticos

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctcggggaat gtgacatcgt cgc

\hfill

23

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<210> 5

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<211> 35

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Sonda de oligonucleótidos sintéticos

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

gctgccgtcc atgctgatgt ttgcggtgat cgtgg

\hfill

35

Claims

1. Polipéptido aislado para utilizar en un procedimiento de tratamiento médico, teniendo dicho polipéptido:

(i) la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Fig. 2 (SEC ID NO:2);

(ii) la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc de longitud completa depositado bajo el número de accesso a la ATCC 203963;

(iii) como mínimo un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de (i) o (ii), donde la identidad de secuencia se determina utilizando el programa de ordenador ALIGN-2 y donde el polipéptido es capaz de inhibir la proliferación de células tumorales.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, para su utilización en la inhibición del crecimiento de células neoplásicas.

3. Polipéptido según la reivindicación 2, para su utilización en el tratamiento de tumor.

4. Polipéptido según la reivindicación 3, donde el tumor es un cáncer.

5. Polipéptido según la reivindicación 4, donde el cáncer es un cáncer de mama, un cáncer de ovario, un cáncer renal, un cáncer colorectal, un cáncer uterino, un cáncer de próstata, un cáncer de pulmón, un cáncer de vejiga, un cáncer del sistema nervioso central, un melanoma o leucemia.

6. Ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido tal como se ha definido en la reivindicación 1, para su utilización en un procedimiento de tratamiento médico.

7. Ácido nucleico según la reivindicación 6, donde la utilización es tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.

8. Composición farmacéutica que comprende un polipéptido según la reivindicación 1, o un ácido nucleico tal como se ha definido en la reivindicación 6, mezclado con un transportador farmacéuticamente aceptable.

9. Composición según la reivindicación 8, que comprende además un agente adicional inhibidor del crecimiento, citotóxico o quimioterapéutico.

10. Composición según la reivindicación 8 ó 9, para su utilización en un procedimiento de tratamiento.

11. Composición según la reivindicación 10, para su utilización tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5.

12. Utilización de un polipéptido tal como se ha definido en la reivindicación 1, o un ácido nucleico tal como se ha definido en la reivindicación 7, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.

13. Utilización según la reivindicación 12, donde el tumor es tal y como se ha definido en la reivindicación 4 o en la reivindicación 5.

14. Artículo de fabricación que comprende:

(1) la composición farmacéutica de la reivindicación 8 o la reivindicación 9;

(2) un recipiente que contiene dicha composición; y

(3) una etiqueta pegada a dicho recipiente o un prospecto incluido en dicho recipiente, donde se hace referencia a la utilización de dicha composición en la inhibición del crecimiento de células neoplásicas.