ES2252927T3 - Dispositivo de cultivo y procedimiento para cultivar celulas o componentes tisulares. - Google Patents

Abstract

Dispositivo de cultivo con al menos un recipiente de cultivo (12), que presenta al menos una conexión (22) para la alimentación y evacuación de medio de cultivo (30), respectivamente con un inserto para cultivo celular (15; 122) para cada uno de los recipientes de cultivo (12), que está sujeta en el interior del mismo, y con un mecanismo de provisión (24 a 28; 24¿, 48, 50) para la alimentación de medio de cultivo (30) a los recipientes de cultivo (12) y/o para la evacuación del medio de cultivo de estos, caracterizado porque a los recipientes de cultivo (12) está/n asignado/s uno o dos sensores de nivel (38; 98) dirigido(s) al nivel del medio de cultivo (30) y porque el mecanismo de provisión (24 a 28; 24¿, 28, 48, 50) se controla en función de la señal de salida de un sensor de nivel o de dos sensores de nivel (38; 98), de modo que es posible tanto un cultivo de células sumergido como también basal.

Description

Dispositivo de cultivo y procedimiento para cultivar células o componentes tisulares.

La invención se refiere a un dispositivo de cultivo según el preámbulo de la reivindicación 1 y a un procedimiento para el cultivo de células o componentes de tejidos.

Los dispositivos de cultivo conocidos de este tipo sirven para el cultivo de células aisladas o componentes de tejidos. Estos dispositivos de cultivo conocidos están limitados al uso en sistemas de cultivos sumergidos, es decir, sobre la membrana de un inserto para cultivo celular se proveen las células cultivadas mediante cubrimiento de una solución de cultivo con las sustancias alimenticias correspondientes.

Para la mayoría de los estudios experimentales, por ejemplo estudios con células epiteliales del párpado o pulmón diferenciadas, sería deseable que para la solución de requerimientos especiales se pudiera variar las condiciones de crecimiento del tejido. Con los dispositivos de cultivo usuales no se puede llevar a cabo, por ejemplo, un cultivo de células del tracto respiratorio en una capa límite aire/líquido (Air-Liquid), aunque se usen membranas porosas, que son ofrecidas por distintas compañías como los denominados sistemas transpocillo.

Mediante la presente invención se debe reconstruir un dispositivo de cultivo según el preámbulo de la reivindicación 1 de modo que sea posible una pluralidad de distintas condiciones de cultivo y exposición.

Este objetivo se consigue de acuerdo con la invención mediante un dispositivo de cultivo con las características indicadas en la reivindicación 1.

En el dispositivo de cultivo de acuerdo con la invención se puede fijar la altura del nivel del medio de cultivo en el interior del recipiente de cultivo, especialmente de modo que este se encuentre sobre la parte superior de la membrana del inserto para cultivo celular (cultivo sumergido) o que contacte justo con la membrana (o se encuentre aproximadamente entre los mismos), con lo que se tiene una provisión de sustancia alimenticia basal, que se realiza desde
abajo.

El cambio de cultivo sumergido a cultivo basal se puede realizar con el dispositivo de cultivo de acuerdo con la invención de forma sencilla mediante control del mecanismo de provisión, que suministra cantidades predeterminadas de medio de cultivo al recipiente de cultivo y/o las extrae de este, hasta que la señal de salida del sensor de nivel emite un valor nominal respectivamente regulado.

Esta regulabilidad del nivel del medio de cultivo en el recipiente de cultivo se puede efectuar claramente de forma muy práctica y sencilla sin lectura de marcas o similares. Las partes del equipo necesarias para la puesta en práctica de las distintas condiciones de cultivo son sencillas y económicas.

Se dan en las reivindicaciones subordinadas variantes ventajosas de la invención.

Con la variante de la invención según la reivindicación 2 se consigue que la diferencia entre la alimentación sumergida y basal sea muy finamente regulable. Las distintas zonas de un cultivo celular soportado por un inserto para cultivo celular crecen bajo exactamente las mismas condiciones.

En un dispositivo de cultivo según la reivindicación 3 se puede analizar el medio de cultivo que se encuentra en los recipientes de cultivo individuales durante la fase de crecimiento y a partir de la composición del medio de cultivo evitar la finalización del crecimiento de los cultivos celulares por sus productos de metabolismo.

En un dispositivo de cultivo según la reivindicación 4 se puede criar una gran número de cultivos celulares en exactamente las mismas condiciones. Igualmente es sencillo el diseño del equipo de un dispositivo de cultivo de este tipo para un gran número de cultivos celulares. Asimismo el dispositivo de cultivo necesita poco espacio.

Con la variante de la invención según la reivindicación 5 se consigue que para los distintos recipientes de cultivo sólo sea necesario un sensor de nivel único para la regulación del nivel.

La variante de la invención según la reivindicación 6 permite que el nivel se fije dentro del recipiente de cultivo de forma sencilla desde el exterior. Con ello los recipientes pueden presentar una superficie lisa y están libres de piezas complementarias, que influirían negativamente en la limpieza. También se pueden esterilizar los recipientes de cultivo de modo sencillo a temperaturas elevadas.

La variante de la invención según la reivindicación 7 permite también ajustar de forma manual el nivel nominal para el medio de cultivo.

Según la reivindicación 8 es posible emprender el ajuste del nivel nominal eléctricamente de forma sencilla. El propio sensor de nivel mide sobre un gran intervalo de altura del recipiente de cultivo y la especificación de nivel se realiza mediante ajuste de la señal de valor nominal del nivel.

Se usa para la detección de nivel según la reivindicación 9 barreras de luces, especialmente una barrera de luz de gálibo, de modo que se pueden usar componentes que presentan precios admisibles como constituyentes convencionales.

La variante de la invención según la reivindicación 10 es ventajosa respecto a una ampliación más del número de cultivos celulares que se pueden llevar a cabo de forma conjunta. El coste en equipos para un dispositivo multi-cultivo de este tipo es bajo. Este se compone de componentes estándar (módulos) que se pueden montar en grandes series.

La variante de la invención según la reivindicación 11 permite en caso deseado, también una retirada libre de residuo del medio de cultivo uniforme de todos los módulos del dispositivo de cultivo.

Con un dispositivo de cultivo según la reivindicación 12 se puede criar en los distintos módulos diferentes cultivos celulares, sin embargo con todo se tiene la posibilidad de estudiar por separado el progreso del crecimiento mediante los productos del metabolismo para los distintos cultivos (los distintos módu-
los).

La variante de la invención según la reivindicación 13 es ventajosa respecto a un templado idéntico de los distintos cultivos.

Con la variante de la invención según la reivindicación 14 se asegura, sin uso de agitadores, que no se forma dentro de los recipientes templados individuales gradiente de temperatura alguno.

En un dispositivo de cultivo según la reivindicación 15 la conexión entre los módulos individuales del dispositivo de cultivo es especialmente sencilla. También se puede lograr de forma sencilla una disposición modular de este tipo.

En un dispositivo de cultivo según la reivindicación 16 el espacio interior de los recipientes de cultivo está separado de la atmósfera circundante.

En un dispositivo de cultivo de este tipo se puede rellenar según la reivindicación 17 el espacio interior de la carcasa exterior también con otro medio en estado gaseoso y estudiar la influencia sobre el crecimiento de los cultivos.

La variante de la invención según la reivindicación 18 es ventajosa respecto a la puesta en práctica de condiciones de partida sin gérmenes y sin coste para los cultivos celulares. Se usa a este respecto como material esterilizable vidrio, de modo que se tiene también un buen contacto visual con los cultivos celulares. También es ventajoso el vidrio como material respecto a una solubilización indeseable del material del recipiente de cultivo.

En un dispositivo de cultivo según la reivindicación 19 se realiza tanto la alimentación como también la evacuación del medio de cultivo obligatoriamente mediante una disposición de bomba para operar bidireccionalmente. Esto es ventajoso respecto a una consecución rápida del valor del nivel nominal, también en cuanto a evitar oscilaciones de nivel.

En un dispositivo de cultivo según la reivindicación 20 se puede exponer los cultivos a determinadas estimulaciones, de las que resulta un cambio de las condiciones de crecimiento. Además se puede exponer de esta forma los cultivos a determinadas sustancias que no se encuentran en la fase líquida de los medios de alimentación, como sustancias en estado gaseoso o sustancias sólidas que no se dispersan en la fase líquida.

En un dispositivo de cultivo según la reivindicación 21 se cambia periódicamente la alimentación sumergida y la alimentación basal.

Con una variante de la presente invención se controla el dispositivo de cultivo mediante un programa. Este programa funciona especialmente con el sistema operativo MS-DOS.

El programa es adecuado para controlar todas las funciones del sistema de bombeo. De forma típica el sistema de bombeo está conectado mediante una interfaz en serie al equipo informático. Además de lo anterior, el programa detecta y procesa la señal de salida de las fotocélulas. En una forma de realización especialmente preferida se protocoliza el desarrollo del experimento.

A continuación se aclara detalladamente la invención a partir de los ejemplos de realización con referencia a los dibujos. Estos muestran:

Fig. 1: una vista esquemática de un dispositivo de cultivo sencillo, que comprende sólo un recipiente de cultivo, con altura de nivel del medio de cultivo controlable;

Fig. 2: una vista similar a la de la figura 1, en la que se reproduce un dispositivo de cultivo modificado;

Fig. 3: una vista de otro dispositivo de cultivo modificado, que presenta una pluralidad de módulos de cultivo dispuestos unos junto a otros en paralelo, que por su parte presentan cada uno una pluralidad de recipientes de cultivo;

Fig. 4: un vista longitudinal a través de uno de los módulos de cultivo del dispositivo de cultivo según la figura 3;

Fig. 5: un corte transversal angulado a través del módulo de cultivo según la figura 4 a lo largo de la línea de corte V-V que se encuentra en el mismo;

Fig. 6: un corte longitudinal a través del dispositivo de cultivo según la figura 3;

Fig. 7: un corte transversal a través del dispositivo de cultivo según la figura 3 a lo largo de la línea de corte IV-IV que se encuentra en el mismo; y

Fig. 8: un diagrama de bloques de un control de altura de nivel, que es de uso en relación con los dispositivos de cultivo según las figuras 1 a 6.

En la figura 1 se designa con 10 en conjunto una unidad de cultivo. La unidad de cultivo 10 comprende un recipiente de cultivo 12, que grosso modo responde a la forma de una botella invertida, en donde en el fondo de la botella se está provista una abertura 14 en forma en forma de círculo.

En el interior del recipiente de cultivo 12 se emplaza un inserto para cultivo celular 15, que está fabricada un material de plástico poroso, por ejemplo, de poli(tereftalato de etileno). El inserto para cultivo celular 15 representa una estructura soporte permeable a líquidos para una membrana 16, que se puede fabricar, según cada requerimiento de las células que se van a cultivar, de distintos materiales de plástico, por ejemplo, igualmente poli(tereftalato de etileno). La membrana 16 porta, como se representa en la ampliación del detalle de la figura 1, un cultivo celular 18.

El recipiente de cultivo 12 está soportado por un dispositivo de sujeción 20, que en la figura 1 sólo se indica de forma esquemática.

La conexión 22 del recipiente de cultivo 12 que se encuentra en la parte inferior se encuentra unida mediante un conducto 23 con una conexión de trabajo de una bomba 24 bidireccional, que en la práctica puede ser una bomba peristáltica. La otra conexión de la bomba 24 se encuentra unida mediante un conducto 26 con el interior de un depósito de almacenamiento 28, que contiene un líquido de cultivo 30. Este contiene aquellas sustancias alimenticias, que deben estar a disposición del cultivo celular 18 para el crecimiento.

Los dos bornes de control de la bomba 24 están unidos por amplificadores de potencia 32, 34 con las salidas de un circuito de accionamiento 36. El circuito de accionamiento 36 produce una señal dependiendo de la señal de salida de un sensor de nivel 38 que trabaja en continuo, que está representado como sensor emplazado en la superficie exterior del recipiente de cultivo 12 (pero dado el caso también puede estar emplazado en la superficie interior del recipiente de cultivo 12) y en la práctica puede ser un sensor óptico, y dependiendo de una, otra o ninguna de las salidas de un indicador de valor nominal 40, que se representa como resistencia ajustable, para provocar que la bomba 24 alimente al interior del recipiente de cultivo 12 desde el depósito de almacenamiento 28 líquido de cultivo adicional o devuelva líquido de cultivo desde el interior del recipiente de cultivo 12 al depósito de almacenamiento 28.

El indicador de valor nominal 40 se puede ajustar a partir de una regulación programada 42, como se indica en la figura 1 mediante una línea a trazos.

La regulación programada 42 conmuta en el ejemplo de realización aquí contemplado el indicador de valor nominal 40 entre dos posiciones. Una posición del indicador de valor nominal 40 corresponde a una altura del nivel de líquido de cultivo 30 en el interior del recipiente de cultivo 12, como se indica en el dibujo: el líquido de cultivo 30 contacta ya con la parte inferior del inserto para cultivo celular 15. En estas condiciones se alimenta al cultivo celular 18 líquido de cultivo sólo desde el líquido de cultivo inferior (alimentación basal).

La segunda posición del valor nominal de nivel ajustada por la regulación programada 42 corresponde a una situación del nivel como se indica en la figura 1 mediante la línea a trazos 44. En esta posición el nivel de líquido se encuentra por encima de la cima del cultivo celular 18; por tanto este se nutre de forma sumergida.

El ejemplo de realización mostrado en la figura 2 corresponde al de la figura 1 pero más amplio, se dan componentes correspondientes de nuevo con los mismos números de referencia y en lo sucesivo no se detallan más.

En lugar de la bomba 24 que opera bidireccionalmente se dispone una bomba de suministro 24' que opera unidireccionalmente, que está unida por una válvula de retención 46 con la conexión 22 del recipiente de cultivo 12. Este está unido además por una válvula magnética 2/2 48 con una conducción de purga 50. La válvula magnética 48 se encuentra elásticamente en la posición de cierre, y se puede llevar a la posición de paso mediante activación de sus imanes. El imán de la válvula magnética 48 y la bomba 24' están unidos nuevamente por los amplificadores de potencia 32, 34 con el circuito de accionamiento 36, como se describió anteriormente, lo que forma un circuito de regulación.

Las figuras 3 a 7 muestran un dispositivo de cultivo con el que se puede llevar a cabo un gran número de cultivos celulares de forma simultánea.

El dispositivo de cultivo mostrado en las figuras 3 a 7 tiene una carcasa exterior 52 que se puede cerrar herméticamente, que se compone de una pieza de carcasa 54 inferior, en forma de caja compuesta por placas y una cubierta 56 retirable colocada sobre esta hermética, de la que se prolongan perpendicularmente desde abajo a lo largo de las líneas 55-1, 55-2 y 55-3 tres resaltes de vidrio 57 hasta el borde superior de los recipientes de cultivo 12, para fijar los insertos para cultivo celular 122 emplazadas en su interior.

En el interior de la carcasa exterior 52 están dispuestos cuatro módulos de cultivo 58-1, 58-2, 58-3 y 58-4. En tanto en lo sucesivo no es necesaria ninguna distinción de los módulos de cultivo, se hace referencia a estos con la designación 58.

Cada uno de los módulos de cultivo 58 comprende una carcasa templada designada con 60, que es hermética y se compone de distintas placas. En el interior de un recipiente de cultivo 60 están dispuestos respectivamente tres unidades de cultivo 10, como se evidencia en el dibujo. Las conexiones 22 de los distintos recipientes de cultivo 12 de estas unidades de cultivo están unidas con una conducción de provisión 60 conjunta.

Las conducciones de provisión 62 de los distintos módulos de cultivo 58 están unidas respectivamente por un conducto 64 representado sólo esquemáticamente de silicona con una tubuladura de purga 66 dispuesta de un distribuidor de medio de cultivo. El distribuidor de medio de cultivo 68 se encuentra unido con una tubuladura de alimentación 70 para el medio de cultivo, que de forma similar al ejemplo de realización según la figura 1 ó 2 está unido con la salida de una bomba de medio de cultivo 24 y/o 24' por un conducto de silicona no representado.

Las conducciones de provisión 62 tienen respectivamente una derivación 72 para conexión que se encuentra en el exterior de la carcasa templada 60 dispuesta, que está unida por un conducto de silicona 74 con un racor de toma 76 dispuesto de la carcasa exterior 52. De esta forma se puede extraer por separado para fines de ensayo líquido de cultivo 30 de los distintos módulos 58.

Los recipientes de cultivo 12 de un módulo de cultivo 58 son recorridos de forma uniforme por el medio de templado alimentado por una tubuladura de purga 78 del medio de templado (por ejemplo, agua templada). La evacuación del medio templado alimentado se realiza mediante un rebosadero 80, que está provisto en la proximidad del ángulo de la carcasa templada 60 que se encuentra diametralmente opuesto a la tubuladura de conexión 78.

El rebosadero 80 se encuentra unido por un tramo de tubo 82 en forma de ángulo con una tubuladura de purga 84 de la carcasa templada 60. La tubuladura de purga 84 de un módulo de cultivo 58 está unida respectivamente con la tubuladura de conexión 78 del siguiente módulo de cultivo 58 que se encuentra paralelo, por ejemplo, mediante un conducto 86. De esta forma las carcasas templadas 60 son recorridas unas tras otras por el mismo medio de templado.

La primera tubuladura de conexión 72 está unida con una tubuladura de alimentación 88 del líquido de templado, que está soportada por la carcasa exterior 52. La tubuladura de purga 84-1 de un módulo se encuentra unida por un conducto 86 con la tubuladura de conexión del siguiente módulo. La última tubuladura de purga 84-2 de la disposición modular se encuentra unida por un conducto 90 y un tramo de tubo 92 con una tubuladura de purga 94 del medio de templado.

Como se evidencia en el dibujo, con el extremo de la conducción de provisión 62 se encuentra unido un tubo ascendente 96. Este se encuentra perpendicular al plano del dibujo de la figura 3, como se hace especialmente bien apreciable en la figura 7.

De la figura 7 es además bien apreciable que el distribuidor del medio de cultivo 68 presenta en vista frontal la forma de una "V" muy abierta, en donde está dispuesta la tubuladura de alimentación 70, que sirve a la vez también para la toma de líquido de cultivo en exceso, en el lugar más bajo del distribuidor del medio de cultivo 68.

Los dos brazos de una barrera de luces de gálibo designada en su conjunto con 98 se extienden sobre la pared exterior del tubo ascendente 96. La barrera de luces de gálibo 98 ajustable en dirección vertical se encuentra portada por un soporte 100, que se prolonga paralelo a una de las placas exteriores de la carcasa exterior 52 en dirección vertical.

En los brazos de la barrera de luces de gálibo 98 se usa de igual forma una fuente de luz IR 102 (véase la figura 8) en forma de un diodo IR y/o un detector IR 104 en forma de un fototransistor sensible a IR. Si se encuentra el nivel de líquido en el tubo ascendente 96, que corresponde al nivel de líquido de los distintos recipientes de cultivo 12 alineados exactamente en horizontal, por debajo de la barrera de luz IR anteriormente descrita, el fototransistor 104 recibe corriente y controla en consecuencia. Si la columna de líquido en el tubo ascendente 96 asciende hasta la altura del eje de la barrera de luz formada por la fuente de luz IR 102 y el detector IR 104, desaparece la señal de salida del fototransistor. Esto es reconocido por un amplificador diferencial 106, que recibe en su entrada lateral la señal de salida de un indicador de valor nominal 108 representado de nuevo como resistencia ajustable.

Mediante la señal de salida del amplificador diferencial se activa mediante un transistor conmutador 110 la bobina de relé 112 de un relé de láminas 114 designado en su conjunto con 114. Mediante esto se cierra el contacto del relé116, que es un contacto libre de potencial y por ejemplo controla el trabajo de la bomba 24 en dirección de una alimentación de más líquido de cultivo 30.

En una realización sencilla del dispositivo de cultivo se realiza el cambio de alimentación sumergida a alimentación basal, por ejemplo, de modo que la barrera de luces de gálibo 98 se desplaza correspondientemente hacia abajo, entonces el líquido de cultivo en exceso disminuye mediante vaciado manual hasta un nivel que se encuentre claramente por debajo del nivel deseado para alimentación basal y luego el nivel de líquido se deja subir, bajo control mediante la señal de salida de la barrera de luces de gálibo 98, que ahora está graduado, hasta el nivel para alimentación basal.

Sin embargo para una conmutación automática entre estas dos variantes de alimentación se provee preferiblemente una segunda barrera de luces de gálibo, que se ajusta al nivel para alimentación basal. Para esta segunda barrera de luces de gálibo está provisto un segundo circuito regulador, que corresponde al de la figura 8, con la diferencia de que entonces el contacto del relé 116 controla la evacuación de líquido de cultivo, por tanto la actividad de una bomba bidireccional en el sentido de una evacuación de líquido de cultivo.

Los distintos componentes mecánicos del dispositivo de cultivo descrito anteriormente son, en tanto sean componentes rígidos, preferiblemente de vidrio. Con ello estos componentes se pueden esterilizar a temperaturas de 120ºC sin problemas y se pueden incorporar antes de la realización de ensayos en una situación de partida libre de gérmenes sin coste. Las distintas conexiones de conductos anteriormente descritas se componen preferiblemente de material para conductos de silicona, que se puede esterilizar igualmente a 120ºC sin problemas.

Como se representó anteriormente, se usa para la regulación del nivel del líquido de cultivo en los distintos recipientes de cultivo 12 sólo un sensor de nivel único. Por este motivo es necesario alinear los distintos recipientes de cultivo 12 exactamente, de modo que las botellas, sobre las que crecen los cultivos celulares, se encuentren en un plano horizontal común. Para un posicionamiento forzado de los distintos módulos de cultivo y para una disposición de los módulos de cultivo en la carcasa exterior están previstas dos formas de posicionamiento 118 y 120, que cooperan con los bordes anteriores y/o posteriores de las placas inferiores de la carcasa templada 60.

En las representaciones principales de las figuras 1 y 2 los insertos para cultivo celular 15 se representaban de forma esquemática como sustratos incorporados. En la práctica los insertos para cultivo celular 15 no se tratan de componentes incorporados de forma fija en los recipientes de cultivo 12, más bien de partes que se pueden retirar de estos. Los insertos para cultivo celular comerciales tienen, como se indica en la figura 4 con 122 para uno de los recipientes de cultivo 12, la forma de un cubilete cilíndrico con una pared de fondo 124 plana y una pared rodeante cilíndrica 126. Mediante el uso de los insertos para cultivo celular 122 en el recipiente para cultivo 12 y fijación mediante el resalte de vidrio 57 se asegura que las distintas paredes de fondo 124 se encuentren en un plano horizontal común. Los insertos para cultivo celular 122 se fabrican todas ellas de un material plástico poroso, como también los insertos para cultivo celular 15 de las figuras 1 y 2.

Como se representó anteriormente, se puede cambiar en el dispositivo de cultivo descrito muy fácilmente de alimentación sumergida a basal de los cultivos celulares. Mediante la variación de temperatura del líquido de templado alimentado se puede emprender una variación adicional de las condiciones de crecimiento. Finalmente se puede exponer los cultivos celulares a condiciones dañinas o terapéuticas determinadas, de modo que se alimente al interior de la carcasa exterior 52 por una conducción 128 sustancias en forma de gas. De igual forma se puede realizar también una exposición con aerosoles.

De forma análoga al tratamiento directo con gases y/o aerosoles se pueden poner en contacto directamente con los cultivos celulares también principios activos particulados. Para ello se espolvorean las partículas, cuyo efecto nocivo se debe investigar, sobre los cultivos celulares. Si se sincronizan las densidades de las partículas y del líquido de cultivo una tras otra de modo que las partículas sean más ligeras que el líquido de cultivo, las partículas ascienden con la subida del nivel del líquido de cultivo del cultivo celular. Si el líquido de cultivo por el contrario desciende (alimentación basal), las partículas permanecen en contacto con el cultivo celular. Partículas adecuadas de este tipo son polvos muy finos, por ejemplo, polvo de madera o también partículas hidrófobas, que en suspensión sólo sedimentan de forma insuficiente o a penas lo hacen.

Para la gasificación directa de las células con sustancias como, por ejemplo, ozono o para la admisión de las células con partículas y mezclas de sustancias complejas directamente en el límite aire/líquido con retención de la técnica de cultivo por pulso se pueden usar para el montaje adicional de la unidad de cultivo piezas especiales para los módulos de cultivo.

También se pueden adaptar en los módulos de cultivo biosensores para la detección continua o discontinua de constituyentes (por ejemplo, calcio) y productos celulares especiales así como sondas de medida y dispositivos de medida para la medida continua o discontinua de constituyentes en estado gaseoso (por ejemplo, CO_{2}, NO_{x}) o particulados ("materia particulada total", TPM) de sustancias que porta el aire en la atmósfera de exposición de las células.

Estas distintas posibilidades del cultivo celular se obtienen con diseño sencillo del dispositivo de cultivo.

Los dispositivos de cultivo descritos anteriormente son adecuados para el uso universal de insertos para cultivo celular comerciales. El modo de construcción modular del dispositivo permite también una adaptación sin problemas al recipiente de cultivo ("pocillos") en tamaños de insertos específicos.

La realización de los ensayos es muy flexible, se pueden realizar tres experimentos en paralelos por módulo. Con uso de todos los módulos del dispositivo de cultivo según las figuras 3 a 7 se pueden realizar cuatro veces tres experimentos en paralelo respectivamente. Esto permite, por ejemplo, determinar reacciones celulares en función de la concentración y/o tiempo.

Por ejemplo, distintos planteamientos biológicos celulares especiales, que se pueden resolver con un dispositivo celular de acuerdo con la invención son los siguientes:

1.

Tratamiento de células con, por ejemplo, gases, aerosoles o polvos directamente en la capa límite aire/líquido.

2.

Interacciones celulares mediante co-cultivo de distintos tipos de células, por ejemplo, de células epiteliales y fibroplastos.

3.

Comportamiento de adhesión de células en un sistema, que se provee con líquido de cultivo por pulsos.

4.

Diferenciación de células de cultivos en provisión de líquido de cultivo basal (polarización).

5.

Estudio de células ciliadas en provisión basal y/o intermitente con líquido de cultivo.

6.

Análisis continuo de productos de excreción celular durante el ensayo.

7.

Adición intermitente de principios activos que estimulan el crecimiento y que inhiben el crecimiento sin interrupción del cultivo.

8.

Adición intermitente de las sustancias mencionadas en el punto 6 durante la exposición de células a principios activos o sustancias dañinas.

En las figuras 3 a 7 se mostró un dispositivo de cultivo, que tiene un mecanismo de templado propio. Sin embargo este, al igual que los dispositivos de cultivo sin mecanismo de templado, como se muestran en las figuras 1 y 2, se puede colocar para el templado simplemente en una estufa de templado.

La preparación del dispositivo de cultivo para un ensayo transcurre detalladamente como sigue:

El dispositivo de cultivo montado se somete a autoclave, pero sin insertos para cultivo celular, mecanismo de provisión y sensor de nivel, a 120ºC en autoclave durante 30 minutos, así como materiales necesarios tales como conductos de bomba, pinzas para la introducción de los insertos para cultivo celular, botellas para captación del medio de cultivo y similares. Tras el proceso de autoclave se monta el sensor de nivel en un banco de trabajo en sala limpia. Luego se realiza la conexión del conducto para el medio a la bomba y el ajuste de la velocidad de la bomba para las condiciones de ensayo previstas. Antes de la introducción de los insertos para cultivo celular, que se suministran envasadas individualmente y en condiciones de esterilidad por parte del fabricante, se rellana el dispositivo de cultivo una vez con el medio de cultivo específico del tipo de célula y se vacía de nuevo (lavado), tras lo cual se desecha el medio usado a este respecto. A continuación se rellena todo el dispositivo de cultivo hasta por debajo del recipiente de cultivo con el medio específico del tipo de célula, y se incorporan los insertos para cultivo celular preparadas en el banco de trabajo en sala limpia mediante una pinza. A continuación se inicia el programa seleccionado para el control de bomba, y el dispositivo de cultivo se transfiere dado el caso a una estufa de templado.

El programa controla un ciclo que se compone de los pasos (1) pre-bombeo y tiempo de cultivo y (2) re-bombeo y espera.

Tras la inicialización la bomba lleva a cabo su función de pre-bombeo de forma autónoma. Para este fin se selecciona previamente según cada tipo de célula y modo de cultivo la velocidad de la bomba adecuada. El programa vigila la señal de salida de las fotocélulas y regula la finalización de la actividad de la bomba, tan pronto se alcance el estado de nivel deseado. De forma típica tiene lugar la finalización de la actividad de la bomba ya tras dos o varias veces por parte del programa de vigilancia de detección de señal. Esto permite impedir la detección de señales falsas que, por ejemplo, se pueden producir mediante formación de burbujas y que conducen en detección de señal individual a una finalización prematura e indeseada de la actividad de la bomba. El consiguiente tiempo de cultivo es preferiblemente seleccionable y ajustable.

Tras expirar el tiempo de cultivo se inicializa el proceso de vaciado con bomba del medio, en donde de nuevo es seleccionable y ajustable la velocidad de la bomba. De la velocidad de vaciado con bomba seleccionada y del volumen del medio resulta el tiempo de espera requerido para el proceso de vaciado con bomba.

Lo anteriormente mencionado sobre el ciclo controlado por el programa, se puede llevar a cabo una, dos o varias veces.

Los insertos para cultivo celular se pueden retirar en cualquier momento en el banco de trabajo en sala limpia. Para ello se detiene el programa informático. En caso de retirar sólo algunos insertos, se puede iniciar de nuevo el programa.

Para la purificación se limpia el dispositivo de cultivo completo varias veces con agua destilada. Las piezas de vidrio se pueden limpiar sin problemas también con alcohol u otro agente de limpieza.

Se acaba de describir la invención en función de sensores de nivel especiales. Se entiende que también son adecuados otros sensores de nivel, que pueden reconocer la situación del nivel de líquido momentáneo en el recipiente de cultivo 12 y proporcionan una señal de salida correspondiente. A estos pertenecen sensores controlados por luz, sensores que operan según el principio dieléctrico, sensores que presentan una pluralidad de electrodos distanciados en dirección vertical y sensores por infrarrojo y ultrasonidos.

Claims (25)

1. Dispositivo de cultivo con al menos un recipiente de cultivo (12), que presenta al menos una conexión (22) para la alimentación y evacuación de medio de cultivo (30), respectivamente con un inserto para cultivo celular (15; 122) para cada uno de los recipientes de cultivo (12), que está sujeta en el interior del mismo, y con un mecanismo de provisión (24 a 28; 24', 48, 50) para la alimentación de medio de cultivo (30) a los recipientes de cultivo (12) y/o para la evacuación del medio de cultivo de estos, caracterizado porque a los recipientes de cultivo (12) está/n asignado/s uno o dos sensores de nivel (38; 98) dirigido(s) al nivel del medio de cultivo (30) y porque el mecanismo de provisión (24 a 28; 24', 28, 48, 50) se controla en función de la señal de salida de un sensor de nivel o de dos sensores de nivel (38; 98), de modo que es posible tanto un cultivo de células sumergido como también basal.

2. Dispositivo de cultivo según la reivindicación 1, caracterizado porque el inserto para cultivo celular (15; 122) proporciona respectivamente una superficie de cultivo horizontal.

3. Dispositivo de cultivo según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado por conducciones de recogida (74, 76) asignadas a los recipientes de cultivo individuales (12) o grupos de recipientes de cultivo (12).

4. Dispositivo de cultivo según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque una pluralidad de recipientes de cultivo (12) están conectados a una conducción de provisión (62) común de modo tal que las superficies de cultivo de los insertos para cultivo celular (15; 122) se encuentran en un plano horizontal común.

5. Dispositivo de cultivo según la reivindicación 4, caracterizado porque las condiciones de provisión (62) comunican con un tubo ascendente (96), en el que está provisto el sensor de nivel (38; 98).

6. Dispositivo de cultivo según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque uno o ambos sensores de nivel (38, 98) comprenden uno y/o respectivamente una barrera de luces de gálibo.

7. Dispositivo de cultivo según la reivindicación 5 ó 6, caracterizado porque el o uno de ambos sensores de nivel (38; 98) es ajustable sobre el tubo ascendente (96).

8. Dispositivo de cultivo según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque uno o ambos sensores de nivel (38; 98) es/son un y/o respectivamente un sensor que mide el nivel de forma continua.

9. Dispositivo de cultivo según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque uno o ambos sensores de nivel (38; 98) es un y/o respectivamente un conmutador de nivel que responde a un nivel determinado.

10. Dispositivo de cultivo según una de las reivindicaciones 5 a 9, caracterizado porque presenta varios módulos (58), que por su parte comprenden respectivamente una pluralidad de recipientes de cultivo (12), que están dispuestos paralelamente orientados a una carcasa exterior (52), en donde está provisto un distribuidor de provisión (68), que está conectado con conducciones de provisión (62) de los módulos individuales (58).

11. Dispositivo de cultivo según la reivindicación 10, caracterizado porque una conexión (70) para unión única con el mecanismo de provisión (24 a 28; 24', 28, 48, 50) del distribuidor de provisión (68) se encuentra en el lugar más bajo del mismo.

12. Dispositivo de cultivo según la reivindicación 10, caracterizado porque la carcasa exterior (52) presenta conexiones separadas (76) para conducciones de recogida (74), que conducen respectivamente a uno de los módulos de cultivo (58).

13. Dispositivo de cultivo según la reivindicación 12, caracterizado porque los recipientes de cultivo (12) están dispuestos en módulos (58) que comprenden respectivamente al menos un recipiente de cultivo (12), que presenta respectivamente una carcasa templada (60) que rodea la disposición de recipientes de cultivo, que presenta una entrada para el medio de templado (78) y una salida para el medio de templado (84).

14. Dispositivo de cultivo según la reivindicación 13, caracterizado porque la salida del medio de templado (84) permanece en unión con un rebosadero (80) que se encuentra en la zona superior de la carcasa templada (60), que preferiblemente se encuentra diametralmente opuesto a la entrada de medios de templado (78).

15. Dispositivo de cultivo según la reivindicación 14, caracterizado porque la carcasa templada (60) de los distintos módulos (58) son conmuntados en serie conforme a la corriente del medio de templado.

16. Dispositivo de cultivo según una de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque los recipientes de cultivo (12) están rodeados de una carcasa exterior (52) con cierre hermético.

17. Dispositivo de cultivo según la reivindicación 16, caracterizado porque la carcasa exterior (52) está provista con una conexión (128) para un medio en forma de gas.

18. Dispositivo de cultivo según una de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque este se compone, a excepción del sensor de nivel y piezas del dispositivo de provisión, esencialmente de un material que se puede esterilizar, en especial vidrio y material de silicona.

19. Dispositivo de cultivo según una de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque el dispositivo de provisión (24 a 28) presenta una disposición de bomba para trabajar bidireccionalmente (24), en especial una bomba peristáltica.

20. Dispositivo de cultivo según una de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado por una regulación programada 42, que controla en función del tiempo un indicador de nivel nominal 40.

21. Dispositivo de cultivo según la reivindicación 20, caracterizado porque la regulación programada 42 conmuta periódicamente el valor de nivel nominal entre dos valores, de los cuales uno corresponde a un nivel de líquido que se encuentra a una distancia dada sobre la parte superior de la superficie de cultivo y el otro a un nivel que se encuentra a una distancia dada por debajo de la parte superior de la superficie de cultivo.

22. Procedimiento para el cultivo de células o componentes de tejido usando un dispositivo de cultivo según una de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque el nivel de líquido de una solución de sustancia nutritiva para las células o partes de tejido se encuentra alternativamente a una distancia dada sobre la parte superior de un cultivo de células o de partes de tejido (cultivo sumergido) y a una distancia dada por debajo de la parte superior del cultivo (cultivo basal).

23. Procedimiento según la reivindicación 22, caracterizado porque en un periodo de tiempo, en el que el nivel de líquido se encuentra por debajo de la parte superior del cultivo, se suspende en el cultivo sustancias sólidas, en forma de gas o en forma de aerosol.

24. Procedimiento según la reivindicación 22 ó 23, caracterizado porque la situación del nivel de líquido se acomete con ayuda de un sensor de nivel y un dispositivo de bombeo controlado con este.

25. Procedimiento según una de las reivindicaciones 22 a 24, caracterizado porque se acomete un ajuste temporal de la situación del nivel de líquido con ayuda de una regulación programada.