ES2233474T3 - Derivado del acido hidroxamico como inhibidor de la formacion de cd23 soluble humana. - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula (I): **(Fórmula)** en la que R es isopropilo; n es 0; R1 es naftilmetilo; R2 es terc-butilo; y R3 es metilo.

Description

Derivados de ácido hidroxámico como inhibidor de la formación de CD23 soluble humana.

Esta invención se refiere a un nuevo inhibidor de la formación de CD23 humana soluble y su uso en el tratamiento de afecciones asociadas con un exceso de producción de CD23 soluble (s-CD23) tales como enfermedad autoinmune, inflamación y alergia. La CD23 (el receptor de IgE de baja afinidad FceRII, blasto 2), es una proteína integral de tipo II de 45 KDa expresada sobre la superficie de una diversidad de células maduras, incluyendo los linfocitos B y T, macrófagos, células asesinas naturales, células de Langerhans, monocitos y plaquetas (Delespesse y col., Adv. Immunol., 49 [1991] 149-191). Existe también una molécula del tipo CD23 sobre los eosinófilos (Grangette y col., J. Immunol., 143 [1989] 3580-3588). Se ha implicado a la CD23 en la regulación de la respuesta inmune (Delespesse y col., Immunol. Rev., 125 [1992] 77-97). La CD23 humana existe como dos isoformas reguladas de forma diferenciada, a y b, que sólo difieren en los aminoácidos en el extremo N terminal intracelular (Yokota y col., Cell, 55 [1988] 611-618). En el hombre la isoforma a constitutiva sólo se encuentra en los linfocitos B, mientras que el tipo b, inducible por IL-4, se encuentra en todas las células capaces de expresar la CD23.

Se sabe que la CD23 intacta y ligada a la célula (i-CD23) experimenta una escisión respecto de la superficie celular dando lugar a la formación de un número de fragmentos solubles bien definidos (s-CD23), que se producen como resultado de una compleja secuencia de acontecimientos proteolíticos, cuyo mecanismo está todavía escasamente comprendido (Bourget y col., J. Biol. Chem, 269 [1994] 6927-6930). Aunque todavía no está demostrado, se postula que los fragmentos solubles principales (Mr 37, 33, 29 y 25 kDa) de estos acontecimientos proteolíticos, los cuales retienen todos el dominio de lectina C terminal común a i-CD23, aparecen secuencialmente a través de la formación inicial del fragmento de 37 kDa (Letellier y col., J. Exp. Med., 172 [1990] 693-700). Una ruta de escisión intracelular alternativa conduce a un fragmento estable de 16 kDa que difiere en el dominio C terminal respecto a i-CD23 (Grenier-Brosette y col., Eur. J. Immunol., 22 [1992] 1573-1577).

A la i-CD23 ligada a membrana en humanos se le han atribuido varias actividades, las cuales se ha demostrado que desempeñan un papel en la regulación de IgE. Entre las actividades particulares se incluyen: a) presentación del antígeno, b) citotoxicidad de eosinófilos mediada por IgE, c) retorno de la célula B a los centros germinales de los nódulos linfáticos y del bazo, y d) regulación a la baja de la síntesis de IgE (Delespesse y col., Adv. Immunol., 49, [1991] 149-191). Los tres fragmentos de CD23 solubles con mayor peso molecular (Mr 37, 33 y 29 kDa) presentan propiedades de citoquina multifuncionales que parecen desempeñar un papel importante en la producción de IgE. De esta forma, se ha implicado la formación excesiva de s-CD23 en la sobreproducción de IgE, el sello de las enfermedades alérgicas tales como asma extrínseca, rinitis, conjuntivitis alérgica, eccema, dermatitis atópica y anafilaxis (Sutton y Gould, Nature, 366, [1993] 421-428). Otras actividades biológicas atribuidas a s-CD23 incluyen la estimulación del crecimiento de células B y la inducción de la liberación de mediadores desde los monocitos. De esta forma, se han observado niveles elevados de s-CD23 en el suero de pacientes que presentan leucemia linfocítica crónica de tipo B (Sarfati y col., Blood, 71 [1988] 94-98) y en los fluidos sinoviales de pacientes con artritis reumatoide (Chomarat y col., Arthritis and Rheumatism, 36, [1993] 234-242). Varias fuentes sugieren que la CD23 desempeña un papel en la inflamación. En primer lugar, se ha reseñado que la s-CD23 se une a receptores extracelulares que cuando se activan están implicados en acontecimientos de inflamación mediados por células. De esta forma, se ha reseñado que la sCD23 activa directamente la liberación de TNF, IL-1, y de IL-6 desde el monocito (Armant y col., vol 180, J. Exp. Med., 1005-1011 (1994)). Se ha reseñado que la CD23 interactúa con las moléculas de adhesión de integrina-B2, CD11b y CD11c sobre monocito/macrófago (S. Lecoanet-Henchoz y col., Immunity, vol. 3; 119-125 (1995)) que desencadenan la liberación de NO_{2}^{-}, peróxido de hidrógeno y citoquina (IL-1, IL-6 y TNF). Finalmente, IL-4 o IFN inducen la expresión de CD23 y su liberación como sCD23 por parte de los monocitos humanos. El ligado del receptor de CD23 unido a membrana con los complejos inmunes IgE/anti-IgE o anticuerpo monoclonal anti-CD23 activa la producción de AMPc y de IL-6 y la formación de tromboxano B2, demostrando un papel de CD23 en la inflamación mediado por el receptor.

Debido a estas diversas propiedades de CD23, los compuestos que inhiben la formación de s-CD23 deberían tener acciones duplicadas de a) potenciación de la inhibición por retroalimentación negativa de la síntesis de IgE manteniendo niveles de i-CD23 en la superficie de las células B, y b) inhibición de las actividades de citoquina inmunoestimuladoras de los fragmentos solubles de s-CD23 de mayor peso molecular (Mr 37, 33 y 29 kDa). Además, la inhibición de la escisión de CD23 debería mitigar la formación de mediador y la activación de monocitos inducida por s-CD23, reduciendo de esta forma la respuesta inflamatoria.

La Solicitud de Patente Internacional nº WO 96/02240 (Smithkline Beecham plc) describe que compuestos que inhiben la acción de metaloproteasas de matriz (por ejemplo colagenasa, estromelisina y gelatinasa) son inhibidores eficaces de la liberación de CD23 soluble humana transfectada en sistemas de cultivo de células de mamífero.

La Solicitud de Patente Internacional nº WO 97/02239 (British Biotech Pharmaceuticals Limited) describe que ciertos compuestos de fórmula (A) presentan actividad de metaloproteasa de matrix:

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La Solicitud de Patente Internacional nº WO 99/67201 (Smithkline Beecham plc) describe que ciertos compuestos de fórmula (I) son inhibidores eficaces de la liberación de CD23 soluble humana transfectada en sistemas de cultivo de células de mamífero:

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Se ha descubierto sorprendentemente en la actualidad que ciertos compuestos de fórmula (I) presentan de forma inesperada una buena biodisponibilidad.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (I) anterior, en la que:

n es 0;

R es isopropilo;

R^{1} es naftilmetilo;

R^{2} es terc-butilo; y

R^{3} es metilo.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso del compuesto de la invención para la producción de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de trastornos tales como alergia, trastornos inflamatorios y enfermedades autoinmunes en los que está implicada la sobreproducción de s-CD23.

En un aspecto adicional la invención proporciona un procedimiento para el tratamiento o la profilaxis de trastornos tales como alergia, trastornos inflamatorios y enfermedades autoinmunes en los que está implicada la sobreproducción de s-CD23, comprendiendo el procedimiento la administración del compuesto de la invención, a un mamífero humano o no humano que lo necesite.

La invención proporciona también una composición farmacéutica para el tratamiento o profilaxis de trastornos tales como la alergia, trastornos inflamatorios y enfermedades autoinmunes en los que está implicada la sobreproducción de s-CD23 que comprende el compuesto de la invención y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo.

Entre los trastornos inflamatorios particulares se incluyen trastornos del SNC tales como enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, y demencia multi-infarto, así como las secuelas mediadas por la inflamación de apoplejía y traumatismo craneal.

Ha de entenderse que las sales farmacéuticamente aceptables, solvatos y otros derivados farmacéuticamente aceptables del compuesto de la invención están incluidos también en la presente invención.

Entre las sales de los compuestos de fórmula (I) se incluyen por ejemplo sales de adición de ácidos derivadas de ácidos orgánicos o inorgánicos, tales como clorhidratos, bromhidratos, yodhidratos, p-toluensulfonatos, fosfatos, sulfatos, acetatos, trifluoroacetatos, propionatos, citratos, maleatos, fumaratos, malonatos, succinatos, lactatos, oxalatos, tartratos y benzoatos.

Las sales pueden formarse también con bases. Tales sales incluyen sales derivadas de bases orgánicas o inorgánicas, por ejemplo sales de metales alcalinos tales como sales de sodio o potasio, y sales de amina orgánica tales como sales de morfolina, piperidina, dimetilamina o dietilamina.

Se ha descubierto sorprendentemente que el compuesto de la presente invención exhibe propiedades de absorción in vivo ventajosas a través de la vía oral así como también demuestra ser un inhibidor potente y selectivo del procesamiento de la CD23.

El compuesto de la invención puede prepararse mediante el uso de cualquier procedimiento convencional apropiado, por ejemplo por analogía con los procedimientos descritos en la publicación de patente WO 97/02239 (British Biotech Pharmaceuticals Limited).

De acuerdo con lo anterior, un aspecto adicional de la invención proporciona un procedimiento para preparar el compuesto de la invención tal y como se ha definido anteriormente en la presente memoria, comprendiendo el procedimiento:

(a) la desprotección de un compuesto de fórmula (II)

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en la que X es un grupo protector tal como bencilo o trimetilsililo o

(b) hacer reaccionar un compuesto de fórmula (III):

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en la que el grupo hidroxi está protegido opcionalmente, con hidroxilamina o una sal de la misma.

Los compuestos de fórmulas (II) y (III) son nuevos y forman un aspecto adicional de la invención.

El compuesto de fórmula (II) puede prepararse a partir del compuesto de fórmula (III) por reacción con una hidroxilamina protegida. El compuesto de fórmula (III) que presenta un grupo hidroxi protegido puede convertirse por hidrólisis en el compuesto desprotegido de fórmula (III).

Los grupos protectores adecuados para un ácido hidroxámico son bien conocidos en la técnica e incluyen bencilo, trimetilsililo, terc-butilo y terc-butildimetilsililo.

Los grupos protectores adecuados para un ácido carboxílico son bien conocidos en la técnica e incluyen terc-butilo, bencilo y metilo.

El compuesto de fórmula (III) puede prepararse por reacción de un compuesto de fórmula (IV) o (IVa):

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en la que Y es un grupo protector para el grupo carboxilo, con un compuesto de fórmula (V):

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Si se usa el compuesto de fórmula (IVa) puede requerirse posteriormente una alquilación subsiguiente del grupo hidroxilo.

El compuesto de fórmula (IV) puede prepararse protegiendo un compuesto correspondiente en el que Y es hidrógeno, que a su vez se puede preparar:

(a) haciendo reaccionar un compuesto de fórmula (VI):

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en la que R^{1} es tal y como se ha definido anteriormente en la presente memoria y Z es un grupo protector para el grupo carboxilo, con un agente alquilante; y

(b) retirando los grupos protectores.

El compuesto de fórmula (VI) en la que Z es hidrógeno puede prepararse haciendo reaccionar un diéster (tal como el éster dimetílico o el éster dietílico) del ácido 2-hidroxi succínico con un compuesto de fórmula R^{1}X' en presencia de una base fuerte tal como diisopropilamiduro de litio, donde R^{1} es naftilmetilo, X' es un grupo saliente tal como bromo o yodo, y después hidrolizando el compuesto resultante para retirar los grupos éster.

Los isómeros, incluyendo los estereoisómeros, del compuesto de la presente invención pueden prepararse como mezclas de tales isómeros o como isómeros individuales. Los isómeros individuales pueden prepararse mediante cualquier procedimiento apropiado, por ejemplo los estereoisómeros individuales pueden prepararse mediante síntesis química estereoespecífica comenzando a partir de sustratos quirales o mediante la separación de mezclas de diastereoisómeros usando procedimientos conocidos. En un aspecto preferido, la invención proporciona compuestos de fórmula (IA):

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Se prefiere que los compuestos se aíslen en forma sustancialmente pura.

Tal y como se ha mencionado en la presente memoria un inhibidor de la formación de la CD23 humana soluble presenta propiedades médicas útiles. Preferiblemente los compuestos activos se administran en forma de composiciones farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones se adaptan preferiblemente para administración oral. Sin embargo, pueden adaptarse para otros modos de administración, por ejemplo en la forma de un pulverizador, aerosol u otro procedimiento convencional para inhalación, para el tratamiento de trastornos del tracto respiratorio; o administración parenteral para pacientes que sufren insuficiencia cardíaca. Otros modos de administración alternativos incluyen administración sublingual o transdérmica.

Las composiciones pueden estar en la forma de comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, grageas, supositorios, polvos reconstituibles, o preparaciones líquidas, tales como soluciones o suspensiones orales o parenterales estériles.

Con el fin de obtener consistencia de administración se prefiere que una composición de la invención esté en la forma de una dosis unitaria.

Las formas de presentación de dosis unitaria para la administración oral pueden ser comprimidos y cápsulas y pueden contener excipientes convencionales tales como agentes aglutinantes, por ejemplo jarabe, goma arábiga, gelatina, sorbitol, tragacanto, o polivinilpirrolidona; cargas, por ejemplo lactosa, azúcar, almidón de maíz, fosfato cálcico, sorbitol o glicina; lubricantes para la formación de comprimidos, por ejemplo estearato de magnesio; disgregantes, por ejemplo almidón, polivinilpirrolidona, almidón glicolato sódico o celulosa microcristalina; o agentes humectantes farmacéuticamente aceptables tales como lauril sulfato sódico.

Las composiciones orales sólidas pueden prepararse mediante procedimientos convencionales de combinación, carga o formación de comprimidos. Se pueden usar operaciones repetidas de mezclado para distribuir el agente activo completamente por todas aquellas composiciones que emplean grandes cantidades de cargas. Dichas operaciones son, por supuesto, convencionales en la técnica. Los comprimidos pueden recubrirse de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la práctica farmacéutica normal, en particular con un recubrimiento entérico.

Las preparaciones líquidas orales pueden estar en la forma de, por ejemplo, emulsiones, jarabes, o elixires, o pueden presentarse como un producto seco para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Dichas preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales, tales como agentes de suspensión, por ejemplo sorbitol, jarabe, metil celulosa, gelatina, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, gel de estearato de aluminio, grasas comestibles hidrogenadas; agentes emulsionantes, por ejemplo lecitina, monooleato de sorbitano, o goma arábiga; vehículos no acuosos (que pueden incluir aceites comestibles), por ejemplo aceite de almendra, aceite de coco fraccionado, ésteres oleosos tales como ésteres de glicerina, propilenglicol, o alcohol etílico; conservantes, por ejemplo p-hidroxibenzoato de metilo o propilo o ácido sórbico; y si se desea, agentes aromatizantes o colorantes convencionales.

Para la administración parenteral, se preparan formas de dosificación unitaria fluidas utilizando el compuesto y un vehículo estéril, y, dependiendo de la concentración usada, pueden suspenderse o disolverse en el vehículo. En la preparación de las soluciones, el compuesto puede disolverse en agua para inyección y esterilizarse por filtración antes de cargarse en un vial o ampolla adecuado y de cerrarlo herméticamente. De forma ventajosa, pueden disolverse en el vehículo adyuvantes, tales como un anestésico local, un conservante y agentes de tamponación. Para potenciar la estabilidad, la composición puede congelarse después de cargarla en el vial y el agua puede retirarse a vacío. Las suspensiones parenterales se preparan sustancialmente de la misma forma, excepto por el hecho de que el compuesto se suspende en el vehículo en lugar de disolverse, y la esterilización no puede llevarse a cabo mediante filtración. El compuesto puede esterilizarse por exposición ante óxido de etileno antes de suspenderlo en el vehículo estéril. De forma ventajosa, se incluye en la composición un agente tensioactivo o humectante para facilitar la distribución uniforme del compuesto.

Las composiciones de esta invención pueden presentarse también de forma adecuada para su administración al tracto respiratorio en forma de rapé o un aerosol o solución para un nebulizador, o como un polvo microfino para insuflación, solas o en combinación con un vehículo inerte tal como lactosa. En tal caso las partículas del compuesto activo presentan de forma adecuada diámetros de menos de 50 micrómetros, preferiblemente menos de 10 micrómetros, por ejemplo diámetros en el intervalo de 1-50 micrómetros, 1-10 micrómetros o 1-5 micrómetros. Cuando sea apropiado, pueden incluirse pequeñas cantidades de otros agentes anti-asmáticos y broncodilatadores, por ejemplo aminas simpaticomiméticas tales como isoprenalina, isoetarina, salbutamol, fenilefrina y efedrina; derivados de xantina tales como teofilina y aminofilina y corticoesteroides tales como prednisolona y estimulantes adrenales tales como ACTH.

Las composiciones pueden contener desde un 0,1% a un 99% en peso, preferiblemente desde 10-60% en peso, del material activo, dependiendo del procedimiento de administración. Un intervalo preferido para la administración inhalada es 10-99%, especialmente un 60-99%, por ejemplo 90, 95 o 99%.

Pueden administrarse de forma adecuada formulaciones de polvo microfino en un aerosol como una dosis medida o por medio de un dispositivo adecuado activado por el aliento.

Las formulaciones de aerosol de dosis medida adecuadas comprenden propelentes convencionales, codisolventes, tales como etanol, tensioactivos tales como alcohol oleico, lubricantes tales como alcohol oleico, desecantes tales como sulfato de calcio y modificadores de la densidad tales como cloruro sódico.

Las soluciones adecuadas para un nebulizador son soluciones esterilizadas isotónicas, opcionalmente tamponadas, a por ejemplo entre pH 4-7, que contienen hasta 20 mg/ml de compuesto pero más generalmente de 0,1 a 10 mg/ml, para usar con un equipo de nebulización convencional.

Una cantidad eficaz dependerá de la eficacia relativa de los compuestos de la presente invención, la gravedad del trastorno que se está tratando y el peso del paciente. De forma adecuada, una forma de dosis unitaria de una composición de la invención puede contener desde un 0,1 a 1000 mg de un compuesto de la invención (0,001 a 10 mg por inhalación) y de forma más usual desde 1 a 500 mg, por ejemplo 1 a 25 o 5 a 500 mg. Dichas composiciones pueden administrarse desde 1 a 6 veces al día, más usualmente desde 2 a 4 veces al día, de una manera tal que la dosis diaria es desde 1 mg a 1 g para un humano adulto de 70 kg y de forma más particular desde 5 a 500 mg. Esto está en el intervalo de aproximadamente 1,4 x 10^{-2} mg/kg/día a 14 mg/kg/día y de forma más particular en el intervalo de aproximadamente 7 x 10^{-2} mg/kg/día a 7 mg/kg/día.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención pero no la limitan en modo alguno.

Procedimientos de ensayo biológico

Procedimiento 1

La capacidad de los compuestos de ensayo de inhibir la liberación de CD23 soluble se investigó mediante el uso del siguiente procedimiento.

Ensayo de la actividad de escisión de CD23 de la membrana de células RPMI 8866

Se purifican membranas plasmáticas de células RPMI 8866, una línea de células B humanas transformada por el virus Epstein-Barr (Sarfati y col., Immunology 60 [1987] 539-547) que expresa niveles elevados de CD23, usando un procedimiento de extracción acuosa. Las células resuspendidas en tampón de homogenización (HEPES 20 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, DTT 1mM) se rompen mediante cavitación con N_{2} en una bomba Parr y la fracción de membrana plasmática mezclada con otras membranas se recupera por centrifugación a 10.000 x g. El aglomerado ligero se resuspende en fosfato potásico 0,2 M, pH 7,2 usando 2 ml por 1-3 g de células húmedas y se desecha el aglomerado nuclear. Las membranas se fraccionan adicionalmente mediante el reparto entre Dextrano 500 (6,4% p/p) y polietilenglicol (PEG) 5000 (6,4% p/p) (ref.), en sacarosa 0,25 M en un total de 16 g por 10-15 mg de proteínas de membrana [Morre y Morre, BioTechniques 7, 946-957 (1989)]. Las fases se separan mediante una breve centrifugación a 1000 X g y la fase del PEG (superior) se recoge, se diluye de 3 a 5 veces con tampón fosfato potásico 20 mM pH 7,4, y se centrifuga a 100.000 X g para recuperar membranas en esa fase. El aglomerado se resuspende en solución salina tamponada con fosfato y consiste en membranas plasmáticas enriquecidas de 3 a 4 veces así como algunas otras membranas celulares (por ejemplo lisosomas, Golgi). Las membranas se dividen en alícuotas y se almacenan a -80ºC. El fraccionamiento entre Dextrano al 6,6%/PEG da lugar a membranas plasmáticas enriquecidas 10 veces.

Las membranas fraccionadas se incuban a 37ºC durante tiempos de hasta 4 horas para producir fragmentos de CD23 que se separan de la membrana por filtración en placas filtro Durapore de 0,2 micrómetros (Millipore) después de inactivar el ensayo con una preparación 1 de concentración 5 \muM que procede de P 30994. La sCD23 liberada de la membrana se determina usando el equipo EIA de The Binding Site (Birmingham, Reino Unido) o uno similar que utilice el anticuerpo monoclonal (mAb) anti-CD23 MHM6 [Rowe y col., Int. J. Cancer, 29, 373-382 (1982)] u otro anticuerpo monoclonal (mAb) anti-CD23 como el anticuerpo de captura en un EIA de tipo sándwich. La cantidad de CD23 soluble preparado mediante 0,5 \mug de proteína de membrana en un volumen total de 50 \mul de solución salina tamponada con fosfato se mide mediante EIA y se compara con la cantidad preparada en presencia de diversas concentraciones de inhibidores. Los inhibidores se preparan en soluciones de agua o dimetilsulfóxido (DMSO) y la concentración final de DMSO no es más de un 2%. Los valores de CI_{50} se determinan mediante el ajuste de la curva como la concentración donde se observa una inhibición de la producción de sCD23 de un 50% respecto a la diferencia en sCD23 entre los controles incubados sin inhibidor.

Resultados

N'-[4-(N-Hidroxiamino)-3S-isopropoxi-2R-(2-naftilmetil)succinil]-S-terc-leucina metilamida proporcionó un valor de CI_{50} de 60 nm en el anterior ensayo.

Procedimiento 2

La capacidad de los compuestos de ensayo de inhibir la colagenasa se investigó usando el siguiente procedimiento.

Ensayo de inhibición de la colagenasa

La potencia de los compuestos para actuar como inhibidores de la colagenasa se determinó mediante el procedimiento de Cawston y Barrett (Anal. Biochem. 99, 340-345, 1979), incorporado en la presente memoria como referencia, por el cual una solución 1mM del inhibidor que se esté evaluando o diluciones del mismo, se incubó a 37ºC durante 18 horas con colágeno y colagenasa recombinante humana, a partir de fibroblastos sinoviales clonados, expresados y purificados a partir de E. coli, (tamponado con Tris 150 mM, pH 7,6, que contiene cloruro cálcico 15 mM, Brij 35 al 0,05%, cloruro sódico 200 mM y azida sódica al 0,02%). El colágeno era colágeno bovino de tipo 1 ^{3}H acetilado preparado mediante el procedimiento de Cawston y Murphy (procedimientos en Enzymology 80, 711, 1981). Las muestras se centrifugaron para sedimentar el colágeno no digerido y se retiró una alícuota del sobrenadante radiactivo para su ensayo en un contador por centelleo como una medida de la hidrólisis. La actividad colagenasa en presencia de un inhibidor 1 mM, o una dilución del mismo, se comparó con la actividad en un control desprovisto de inhibidor y los resultados se proporcionaron como la concentración a la que se observa el 50% de la inhibición de la colagenasa (CI_{50}).

Procedimiento 3

Usando el siguiente procedimiento se investigó la capacidad de los compuestos de ensayo para inhibir la liberación de TNF.

Ensayo de la inhibición de la liberación de TNF\alpha a partir de monocitos humanos estimulada mediante la endotoxina lipopolisacárido (LPS)

Se centrifugan a 1000 x g y durante cinco minutos monocitos humanos, cultivados en medio RPMI 1640 suplementado con suero de ternera fetal al 10%, y después se resuspenden en medio a 2 x 10^{6} células/ml. La suspensión celular se divide en alícuotas en placas de 24 pocillos, con 1 ml por pocillo. Los compuestos a ensayar se disuelven en dimetilsulfóxido (DMSO) puro y se añaden al cultivo con la concentración final de DMSO al 0,1%. Los compuestos se añaden a las células en pocillos por triplicado. La liberación de TNF\alpha se estimula mediante la adición de LPS a las células a una concentración final de 200 ng/ml. Los cultivos de control apropiados también se establecen por triplicado. Las placas se incuban durante 18-20 horas a 37ºC, CO_{2} al 5%, y después se centrifugan a 1000 x g durante 5 minutos. Se usa un ensayo ELISA específico para TNF\alpha humano (SmithKline Beecham) para medir los niveles de TNF en los sobrenadantes del cultivo exento de células.

Resultados

N'-[4-(N-Hidroxiamino)-3S-isopropoxi-2R-(2-naftilmetil)succinil]-S-terc-leucina metilamida no mostró ningún efecto sobre la liberación de TNF a 10 \muM.

Procedimiento 4

Se investigó la biodisponibilidad de los compuestos de ensayo usando los siguientes estudios de bio-equivalencia.

Un estudio para estimar los parámetros farmacocinéticos i.v. y la biodisponibilidad oral en rata Sprague Dawley macho

Este estudio se realizó usando un diseño entrecruzado en cuatro días de estudio diferentes. A tres ratas se les implantaron quirúrgicamente catéteres en las venas femorales para la infusión de las moléculas de ensayo al menos tres días antes del comienzo del estudio. Todas las dosis en este estudio se prepararon usando compuesto de ensayo cristalino.

En el día de estudio número uno, los animales (alimentados) recibieron compuesto de ensayo en forma de una infusión intravenosa de 30 minutos a una dosificación diana de 4,0 \mumol/kg (4,0 ml/kg). La solución de la dosis se preparó en Encapsin® acuoso al 20% (pH = 8,0) y contenía DMSO al 1%. Encapsin® (Cerestar EE.UU. Inc., Hammond, IN) es hidroxipropil-beta-ciclodextrina, un oligosacárido cíclico usado para potenciar la solubilidad de los compuestos que de lo contrario requerirían una formulación usando disolventes no acuosos.

En el día de estudio número dos, los animales (en ayunas) recibieron compuesto de ensayo en forma de una solución a una dosificación diana de 8 \mumol/kg mediante sonda oral (16 ml/kg). La solución de la dosis se preparó en gelatina porcina succinada acuosa al 5% (pH = 7,5) y contenía DMSO al 1%.

Las muestras de sangre se recogieron a partir de una vena lateral de la cola. Se añadió una alícuota de 25 \mul de cada muestra de sangre completa a 25 \mul de agua y se dejó reposar sobre hielo durante aproximadamente 5 minutos para facilitar la hemolisis completa; posteriormente las muestras se almacenaron congeladas hasta el análisis. Las concentraciones del compuesto de ensayo en sangre se cuantificaron mediante CL/EM/EM (LLQ (límite inferior de cuantificación) = 10,0 ng/ml). Se realizaron sobre estos datos análisis farmacocinéticos tanto compartimentados como no compartimentados usando WinNonlin para recuperar los parámetros farmacocinéticos i.v. apropiados. Se emplearon diversos modelos compartimentados y paradigmas de ponderación; un modelo de dos compartimientos con eliminación de primer orden desde el compartimiento central y ponderación iterativa por mínimos cuadrados con un coeficiente de ponderación de 1/Y^{2} proporcionó el mejor ajuste para los datos observados, de acuerdo con un criterio de selección de modelo convencional (en concreto, Criterio de Información Akaike, Schwartz Criterion, y suma de los restos al cuadrado). Los parámetros de la farmacocinética se calcularon usando el modelo compartimentado de mejor ajuste; todos los cálculos que requerían el uso de valores de AUC (incluyendo la biodisponibilidad) se llevaron a cabo usando el AUC recuperado del análisis no compartimentado.

Un estudio para estimar los parámetros farmacocinéticos i.v. y la biodisponibilidad oral en perros beagle macho

Este estudio se realizó usando un diseño entrecruzado en dos días de estudio diferentes separados entre sí siete días. Se usaron tres perros Beagle macho en este estudio. Cada día de estudio, se implantó temporalmente un catéter en una vena cefálica para la toma de muestras de sangre; sólo en el día de estudio número uno, se implantó también temporalmente un catéter en una vena safena para la infusión intravenosa (i.v.).

En el día de estudio número uno, cada animal recibió compuesto de ensayo (a una dosis diana de 2,0 \mumol/kg) en forma de una infusión intravenosa de 1 hora (4,0 ml/kg). La solución de la dosis se preparó en Encapsin® acuoso al 20% (pH = 8,0) y contenía DMSO al 1%. Encapsin® (Cerestar EE.UU. Inc., Hammond, IN) es hidroxipropil-beta-ciclodextrina, un oligosacárido cíclico (7 unidades de glucosa) usado para potenciar la solubilidad en la preparación de las soluciones de las dosis que de lo contrario requerirían una formulación usando disolventes no acuo-
sos.

En el día de estudio número dos, cada animal recibió compuesto de ensayo (a una dosis diana de 6,0 \mumol/kg) mediante sonda oral (8,0 ml/kg). La solución de la dosis se preparó en gelatina porcina succinada acuosa al 5% (pH = 7,5) y contenía DMSO al 1%.

Las concentraciones en plasma de los compuestos de ensayo se cuantificaron mediante CL/EM/EM (LLQ = 10 ng/ml). Se usaron procedimientos no compartimentados para el análisis de los datos de concentración en plasma frente a tiempo.

Un estudio para estimar los parámetros farmacocinéticos i.v. y la biodisponibilidad oral en monos Cynomolgus macho

Este estudio se realizó usando un diseño entrecruzado en dos días de estudio diferentes separados entre sí siete días. Se usaron tres monos Cynomolgus macho en este estudio. Ambos días de estudio, se implantó un catéter en una vena safena para la toma de muestras de sangre. En el día de estudio número uno, se implantó también temporalmente un catéter en una vena safena contralateral para la infusión intravenosa (i.v.).

En el día de estudio número uno, cada animal (en ayunas) recibió compuesto de ensayo (a una dosis diana de 2,0 \mumol/kg) en forma de una infusión intravenosa de 1 hora (4,0 ml/kg). La solución de la dosis se preparó en Encapsin® acuoso al 20% (pH = 8,0) y contenía DMSO al 1%. Encapsin® (Cerestar EE.UU. Inc., Hammond, IN) es hidroxipropil-beta-ciclodextrina, un oligosacárido cíclico (7 unidades de glucosa) usado para potenciar la solubilidad en la preparación de las soluciones de las dosis que de lo contrario requerirían una formulación usando disolventes no acuosos.

En el día de estudio número dos, cada animal (en ayunas) recibió compuesto de ensayo (a una dosis diana de 6,0 \mumol/kg) mediante sonda oral (8,0 ml/kg). La solución de la dosis se preparó en gelatina porcina succinada acuosa al 5% (pH = 8,0) y contenía DMSO al 1%.

Las muestras de sangre se obtuvieron a partir del catéter de la vena femoral; el plasma se aisló mediante centrifugación. Las concentraciones en plasma del compuesto de ensayo se cuantificaron mediante CL/EM/EM (LLQ = 10 ng/ml). Se usaron procedimientos no compartimentados para el análisis farmacocinético de los datos de concentración en plasma frente a tiempo.

Resultados

Los resultados para N'-[4-(N-hidroxiamino)-3S-isopropoxi-2R-(2-naftilmetil)succinil]-S-terc-leucina metilamida se comparan con aquellos para N'-[4-(N-hidroxiamino)-3S-propoxi-2R-(2-naftilmetil)succinil]-S-terc-leucina metoxiamida (descritos en el documento WO 99/67201 (SmithKline Beecham).

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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \begin{minipage}[t]{145mm} Abreviaturas:
C _{max} -Concentración máxima conseguida después de
una infusión i.v. (intravenosa); T _{1/2} -semivida,
MRT-tiempo de residencia medio de la molécula de
ensayo; CL-eliminación plasmática sistémica;
Vd _{ss} -volumen de distribución en estado
estacionario; F-porcentaje de
biodisponibilidad\end{minipage} \cr
 \begin{minipage}[t]{145mm}  ^{a}  La biodisponibilidad se
calculó dividiendo la AUC _{0-t}  de dosis
normalizada (donde t es el último punto temporal con concentraciones
de compuesto de ensayo observables del segmento oral (en el caso del
estudio de la rata) o concentraciones de fármaco medibles en la pata
oral o intraduodenal de estudio (estudios del perro y mono)) entre
la AUC _{0-t}  de dosis normalizada del segmento
i.v. y multiplicando por 100.\end{minipage} \cr
 \begin{minipage}[t]{145mm}  ^{b}  Valores individuales
enumerados debido a una gran variabilidad; los animales siempre se
enumeran en el mismo
orden.\end{minipage} \cr}

\newpage

Preparación

3S-t-Butoxicarbonil-2R-(2-naftilmetil)propiolactona

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Se agitó (3R)-carboxi-4-(2-naftil)butirato de terc-butilo (10 g, 31,9 mmoles) en THF (160 ml) a -70ºC en atmósfera de argón y se añadió gota a gota bis(trimetilsilil)amiduro de litio (63,7 ml de una solución 1 M en THF, 63,7 mmoles). La mezcla se agitó a entre -60ºC y -70ºC durante una hora y después se enfrió a -80ºC y se añadió mediante una cánula N-yodosuccinimida (7,17 g, 31,9 mmoles) en THF (20 ml). La mezcla se dejó calentar a aproximadamente -30ºC durante una hora y posteriormente se inactivó con una solución saturada de cloruro amónico. Se añadió acetato de etilo y la mezcla de dos fases se agitó rápidamente a temperatura ambiente durante una hora y media. Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x) y las fases orgánicas combinadas se lavaron con una solución de tiosulfato sódico al 5% y salmuera y después se secaron (Na_{2}SO_{4}) y se evaporaron. La purificación mediante cromatografía sobre gel de sílice (elución con acetato de etilo al 10% en hexano) y la trituración del producto recuperado con hexano proporcionó 5,70 g de un sólido de color blanco (63%).

EM (PA +vo) M + Na = 335.

^{1}H-RMN (CDCl_{3}): 1,31 (9H, s), 3,29 (1H, dd, J = 8,5, 14,6 Hz), 3,38 (1H, dd, J = 6,1, 14,6 Hz), 4,06 (1H, m), 4,45 (1H, d, J = 4,4 Hz), 7,34 (1H, dd, J = 1,7, 8,5 Hz), 7,48 (2H, m), 7,68 (1H, s), 7,82 (3H, m).

Ejemplo N'-[4-(N-hidroxiamino)-3S-isopropoxi-2R-(2-naftilmetil)succinil]-S-terc-leucina metilamida a) Éster bencílico de N'-[4-(t-butoxi)-3S-hidroxi-2R-(2-naftilmetil)succinil]-S-terc-leucina

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Se agitó la sal TFA del éster bencílico de terc-leucina (6,49 g) con carbonato potásico anhidro (2,89 g) en THF (100 ml) durante 20 minutos. Se añadieron HOAT (2,24 g) y 3S-t-butoxi-carbonil-2R-(2-naftilmetil)propiolactona (4,66 g, 14,94 mmoles) y la mezcla se agitó durante 72 horas más (se añadió HOAT adicional (1,02 g) después de 48 horas). Los sólidos se filtraron, y se lavaron bien con THF. Los filtrados combinados se evaporaron para dar una espuma que se disolvió en AcOEt y se lavó con HCl 0,5 M, una disolución acuosa saturada de NaHCO_{3} (2 x), agua y salmuera; se secó (MgSO_{4}) y se evaporó para dar una goma que se cristalizó en hexano/Et_{2}O para dar lugar al producto en forma de un sólido de color blanco (6,35 g, 80%).

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}): 0,88 (9H, s), 1,40 (9H, s), 2,88 (1H, dd, J = 13,5, 6 Hz), 3,00 (1H, dd, J = 13,5, 8,5 Hz), 3,19 (1H, m), 3,92 (1H, t, J \approx 6,5 Hz), 4,18 (1H, d, J = 8,5 Hz), 4,77 (1H, d, J = 12,5 Hz), 4,84 (1H, d, J = 12,5 Hz), 5,53 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,24 (2H, m), 7,30-7,37 (4H, m), 7,45 (2H, m), 7,65 (1H, s), 7,77-7,87 (3H, m), 8,09 (1H, d, J \approx 9 Hz).

b) Éster bencílico de N'-[4-(t-butoxi)-3S-isopropoxi-2R-(2-naftilmetil)succinil]-S-terc-leucina

\vskip1.000000\baselineskip

14

A una solución del éster bencílico de N'-[4-(t-butoxi)-3S-hidroxi-2R-(2-naftilmetil)succinil]-S-terc-leucina (3,0 g, 5,62 mmoles) en 1,2-dietoxietano (75 ml) se le añadió NaH (suspensión al 60% en parafina; 0,27 g), después de agitar durante 2-3 minutos, se añadió una solución de ^{i}PrOTf en pentano (aproximadamente 30% p/p; 6 ml). La mezcla se agitó durante 25 minutos a temperatura ambiente y se añadieron más NaH (0,054 g) y más solución de ^{i}PrOTf (3 ml). Después de agitar durante 25 minutos más, se añadió una carga adicional tanto de NaH (0,054 g) como de ^{i}PrOTf (3 ml). Después de agitar durante otros 20 minutos, se añadió HCl 0,5 M, y la mezcla se extrajo (dos veces) con AcOEt. Los extractos combinados se lavaron con una solución acuosa saturada de NaHCO_{3}, agua y salmuera; se secó (MgSO_{4}) y se evaporó para dar una goma, que se purificó mediante cromatografía sobre gel de sílice (hexano/Et_{2}O) para dar lugar al producto en forma de una goma casi incolora (1,33 g, 41%).

EM (EP +vo) M + H = 576, M + Na = 598.

^{1}H-RMN (CDCl_{3}): 0,87 (9H, s), 1,09 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,21 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,49 (9H, s), 2,87-3,00 (2H, m), 3,10-3,22 (1H, m), 3,69 (1H, 7-tet, J = 6,0 Hz), 4,00 (1H, d, J = 6,5 Hz), 4,36 (1H, d, J = 9 Hz), 4,57 (1H, d, J aparente = 12,5 Hz), 4,63 (1H, d, J aparente = 12,5 Hz) (dos mitades de cAb), 6,50 (1H, d, J = 9 Hz), 7,15-7,19 (2H, m), 7,27-7,40 (4H, m), 7,40-7,45 (2H, m), 7,60 (1H, s), 7,72-7,80 (3H, m).

c) N'-[4-(t-butoxi)-3S-isopropoxi-2R-(2-naftilmetil)succinil]-S-terc-leucina

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El éster bencílico de N'-[4-(t-butoxi)-3S-isopropoxi-2R-(2-naftilmetil)succinil]-S-terc-leucina (1,33 g, 2,31 mmoles) se hidrogenó a presión atmosférica en MeOH (38 ml), con catalizador de Pd-BaSO_{4} (0,67 g) durante una hora. El catalizador se retiró por filtración y se lavó bien con MeOH. Los filtrados combinados se evaporaron para dar el producto en forma de una espuma (1,09 g, 97%).

EM (EP +vo) M + H = 486, M + Na = 508.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}): 0,92 (9H, s), 1,02 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,08 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,42 (9H, s), 2,75 (1H, dd, J = 14, 4 Hz), 3,00 (1H, dd, J = 14, 9,5 Hz), 3,21 (1H, m), 3,57 (1H, 7-tet, J = 6,0 Hz), 3,93 (1H, d, J = 8,5 Hz), 4,10 (1H, d, J = 9 Hz), 7,29 (1H, m), 7,44 (2H, m), 7,62 (1H, s), 7,74-7,84 (3H, m), 7,90 (1H, d, J \approx 9 Hz), 12,35 (1H, muy ancho).

d) N'-[4-(t-butoxi)-3S-isopropoxi-2R-(2-naftilmetil)succinil]-S-terc-leucina metilamida

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La N'-[4-(t-butoxi)-3S-isopropoxi-2R-(2-naftilmetil)succinil]-S-terc-leucina (1,09 g, 2,24 mmoles) se disolvió en DMF (29 ml) y se trató con HOAT (0,61 g) y DEC (0,86 g). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 20 minutos y posteriormente se añadieron clorhidrato de metilamina (0,61 g) y N-metilmorfolina (0,74 ml). La mezcla se agitó durante dos horas más, y posteriormente se concentró a vacío. El residuo se disolvió en AcOEt y se lavó sucesivamente con HCl 0,5 M, una disolución acuosa saturada de NaHCO_{3}, agua y salmuera; se secó (MgSO_{4}) y se evaporó para dar una goma que se purificó mediante cromatografía sobre gel de sílice (hexano/AcOEt). El producto se obtuvo en forma de una goma (0,77 gramos, 69%).

EM (EP +vo) M + H = 499, M + Na = 521.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}): 0,84 (9H, s), 1,02 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,09 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,45 (9H, s), 2,16 (3H, d, J = 4,5 Hz), 2,74 (1H, dd, J = 13,5, 4,5 Hz), 2,93 (1H, dd, J = 13,5, 10 Hz), 3,17 (1H, m), 3,56 (1H, 7-tet, J = 6,0 Hz), 3,94 (1H, d, J = 8,5 Hz), 4,06 (1H, d, J = 9,5 Hz), 7,25 (1H, m a), 7,28 (1H, dd, J = 8,5, 1,5 Hz), 7,44 (2H, m), 7,59 (1H, m), 7,67 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,74-7,86 (3H, m).

e) N'-[4-hidroxi-3S-isopropoxi-2R-(2-naftilmetil)succinil]-S-terc-leucina metilamida

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La N'-[4-(t-butoxi)-3S-isopropoxi-2R-(2-naftilmetil)succinil]-S-terc-leucina metilamida (0,77 g, 1,544 mmoles) se disolvió en TFA (11 ml) y DCM (22 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 2,5 horas. La solución se evaporó al vacío y se volvió a evaporar con tolueno. La trituración del residuo con éter/hexano proporcionó el producto en forma de un sólido de color blanquecino (0,67 g, 98%).

EM (EP +vo) M + H = 443, M + Na = 465.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}): 0,85 (9H, s), 1,02 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,09 (3H, d, J = 6,0 Hz), 2,16 (3H, d, J = 4,5 Hz), 2,78 (1H, dd, J = 14, 5 Hz), 2,95 (1H, dd, J = 14, 10,5 Hz), 3,18 (1H, m), 3,58 (1H, 7-tet, J = 6,0 Hz), 4,00 (1H, d, J = 8,5 Hz), 4,05 (1H, d, J = 9,5 Hz), 7,20 (1H, c, J = 4,5 Hz), 7,29 (1H, dd, J = 8,5, 1,5 Hz), 7,42-7,46 (2H, m), 7,59 (1H, d, J = 9 Hz), 7,60 (1H, s), 7,74-7,84 (3H, m), 12,87 (1H, s a).

f) N'-[4-(N-hidroxiamino)-3S-isopropoxi-2R-(2-naftilmetil)succinil]-S-terc-leucina metilamida

18

Se disolvió en DMF (20 ml) la N'-[4-hidroxi-3S-isopropoxi-2R-(2-naftilmetil)succinil]-S-terc-leucina metilamida (0,67 g, 1,514 mmoles) y se trató con HOAT (0,41 g) y DEC (0,58 g). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos y se añadieron clorhidrato de hidroxilamina (0,32 g) y N-metilmorfolina (0,5 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, y después se concentró a vacío. El residuo se repartió entre AcOEt y una solución acuosa saturada de NaHCO_{3} (2 X), agua (2 x) y salmuera; se secó (MgSO_{4}) y se evaporó para dar un sólido que se trituró con éter para dar el producto en forma de un sólido de color blanco (0,51 g, 74%).

EM (EP +vo) M + H = 458, M + Na = 480.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}): 0,84 (9H, s), 1,00 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,04 (3H, d, J = 6,0 Hz), 2,02 (3H, d, J = 5 Hz), 2,65 (1H, dd, J = 14, 4 Hz), 2,83 (1H, dd, J = 14, 11,5 Hz), 3,18 (1H, m), 3,52 (1H, 7-tet, J = 6,0 Hz), 3,90 (1H, d, J = 9 Hz), 4,01 (1H, d, J = 9 Hz), 6,93 (1H, c, J = 5 Hz), 7,25 (1H, dd, J = 8,5, 1,5 Hz), 7,44 (2H, m), 7,53 (1H, d, J = 9 Hz), 7,57 (1H, s), 7,75-7,85 (3H, m), 9,08 (1H, s), 10,89 (1H, s a).

Claims (7)

1. Un compuesto de fórmula (I):

\vskip1.000000\baselineskip

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en la que

R es isopropilo;

n es 0;

R^{1} es naftilmetilo;

R^{2} es terc-butilo; y

R^{3} es metilo.

2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que es un compuesto de fórmula (IA):

\vskip1.000000\baselineskip

20

3. El uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para la producción de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de trastornos tales como alergia, trastornos inflamatorios y enfermedad autoinmune en los que está implicada la sobreproducción de s-CD23.

4. Una composición farmacéutica para el tratamiento o la profilaxis de trastornos tales como alergia, trastornos inflamatorios y enfermedad autoinmune en los que está implicada la sobreproducción de s-CD23, comprendiendo la composición un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo.

5. Un procedimiento para la preparación de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) la desprotección de un compuesto de fórmula (II):

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en la que X es un grupo protector tal como bencilo o trimetilsililo o

(b) hacer reaccionar un compuesto de fórmula (III):

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en la que el grupo hidroxi está opcionalmente protegido, con hidroxilamina o una sal de la misma.

6. Un compuesto de fórmula (II) como se define en la reivindicación 5.

7. Un compuesto de fórmula (III) como se define en la reivindicación 5.