ES2227938T3 - Sistema huesped/vector de eschericha coli en la seleccion libre de antibioticos por complementacion de un auxotrofo. - Google Patents
Sistema huesped/vector de eschericha coli en la seleccion libre de antibioticos por complementacion de un auxotrofo.Info
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Abstract
Un vector de expresión mínima procariótica que no puede ser recombinado homólogamente con el genoma de organismos procarióticos que contienen e) un origen de replicación, f) un gen marcador de auxotropia g) un promotor que está funcionalmente activo en procariótas y h) un gen foráneo a expresar que está bajo el control de dicho promotor es particularmente apropiado para la selección libre de antibióticos.
Description
Sistema huésped/vector de Escherichia coli
basado en la selección libre de antibióticos por complementación de
un auxótrofo.
La invención concierne a nuevos sistemas de
expresión procariótica que permiten una selección libre de
antibióticos y su uso para la producción de proteínas
recombinantes.
Los plásmidos de expresión procariota conocidos
contienen además uno o varios genes que confieren resistencia a
antibióticos, secuencias adicionales de DNA que no son necesarias y
sobrecargan el metabolismo celular. Éstas, incluyen secuencias de
DNA que resultan de un proceso de clonación, segmentos de DNA que
son reliquias de los vectores múltiples cómo p.ej. promotores
específicos para la síntesis in vitro de mRNA y la
replicación de fagos específicos para la síntesis de DNA sencillo y
extenderlo a las secuencias del vector rudimentario duplicado que
puede ser la causa de la reorganización de un plásmido no
deseado.
La presencia de un plásmido y en concreto de un
vector de expresión causa una carga metabólica adicional para la
célula. Esto resulta en una presión selectiva que favorece la
formación de células sin plásmidos que puedan evitarse ampliamente
mediante la selección antibiótica.
Los antibióticos tales cómo ampicilina,
tetraciclina, kanamicina y cloramfenicol se utilizan normalmente
para la selección. Especialmente el uso de antibióticos
\beta-lactámicos tales cómo ampicilina es
problemático en la producción (fermentación) de productos
terapéuticos.
Por las razones discutidas anteriormente en la
selección antibiótica de plásmidos, a través de antibióticos
\beta-lactámicos no se utiliza en los métodos
recientes. En algunos casos el sistema huésped/vector que fue
utilizado para dar evidencia de ser tan estable que fue posible
omitir la selección del plásmido durante el
pre-cultivo y durante la fermentación principal
(Weir, A.N.C. y Mountain, A., EP 0651803). Sin embargo, en general
esto se asocia con una pureza reducida del producto. En los casos
en los que la selección antibiótica es indispensable, se utiliza la
tetraciclina normalmente cómo alternativa a la ampicilina (Carter,
P. et al., 1992). En contraposición con los antibióticos
\beta-lactámicos, las tetraciclinas no son
compuestos reactivos químicamente y no se pueden inactivar mediante
la modificación enzimática durante la fermentación. El gen de
resistencia a tetraciclina codifica para una proteína que modifica
la membrana bacteriana y de esta forma previene a los antibióticos
de su entrada a las células.
Struhl, K. y colaboradores (Struhl, K. et
al., 1976) utilizando la imidazol glicerofosfato dehidratasa
(IGP)cómo ejemplo, se observa que un mutante apropiado de
E. coli (hisB) puede ser directamente complementado por medio
de plásmidos que contengan DNA de levadura y el enzima de la
levadura codificado por IGP está funcionalmente expresado en E.
coli. Esta habilidad de los genes para complementar las
mutaciones en E. coli se utilizó cómo criterio de selección
para clonar por ejemplo (clonación complementaria) otros genes de
levadura (LEU2, URA3, TRP5 y ARG4).
Las cepas de E. coli hospedadoras, con una
mutación estable (índice de reversión > 10^{-10};
preferiblemente mutantes de delección no revertibles) son
necesarios para la selección mediante complementación. Sin embargo,
el índice de reversión de las mutaciones conocidas es del orden de
la magnitud de < 10^{-10} (Schlegel, H.G., 1981).
El laboratorio conocido de cepas de E.
Coli, difiere respecto a sus genotipos en mutaciones
individuales que en muchos casos fueron producidas por mutaciones
sin dirección mediante la radiación (rayos X o radiación UV),
mutágenos químicos (p.ej. bases análogas, ácido nítrico y
compuestos alquilados) o técnicas biológicas (p.ej. fagos Mu y
mutagénesis del transposón (Bachman, B.J., 1986).
El objetivo de la invención fue desarrollar
sistemas (sistemas de expresión) huésped/vector procarióticos
(preferiblemente E. coli) estables que eviten la selección de
plásmidos mediante antibióticos. El fundamento de la selección se
basa en la complementación de una auxotrofia estable de las células
huésped procarióticas mediante genes de levaduras adecuados.
La invención concierne un vector de expresión
procariota mínimo que no puede ser homólogamente recombinado con el
genoma de los organismos procariotas que contienen:
- a)
- un origen de la replicación,
- b)
- un gen marcador de auxotrofía eucariótica
- c)
- un promotor que sea funcionalmente activo en procariotas y
- d)
- un gen extraño (secuencia extraña) para ser expresado bajo el control de dicho promotor
El gen marcador de auxotrofía eucariótica
compensa el defecto (mutación) en una ruta esencial metabólica del
organismo.
En este contexto la transcripción del gen
marcador auxotrófico y la transcripción del gen extraño a ser
expresados están preferiblemente en direcciones opuestas. Es
también preferible, que la expresión del gen marcador sea
heterológo con el organismo procariótico utilizado cómo célula
hospedadora. Es adicionalmente preferible que la expresión del gen
marcador auxotrófico en el sistema hospedador/vector descrito en la
invención sea un 1% o menos del total de la proteína expresada en
la célula hospedadora cuando se complementa la auxotrofía en la
célula hospedadora.
En un ámbito preferible, el vector de expresión
de acuerdo con la invención se caracteriza en que el marco de
lectura del gen marcador de auxotrofía y del gen para ser expresado
están situados de forma opuesta y terminan con el mismo terminador
de la transcripción o con varios terminadores de la transcripción
dispuestos en serie.
Un gen marcador auxotrófico se entiende cómo un
gen que facilita el crecimiento celular de las cepas de
hospedadores auxotróficos bajo condiciones selectivas del cultivo.
Particularmente, los genes marcadores preferidos proceden de genes
de levaduras. Con E. coli cómo organismo hospedador, son
preferibles los mutantes con un defecto biosintético en el
triptófano, leucina o uracilo, que pueden ser complementados
después con el marcador genético.
Por otro lado un tema con importancia de la
invención es el hospedador celular procariótico auxotrófico que
contiene el vector de acuerdo con la invención dónde la célula
hospedadora tiene una mutación (delección) en un gen que está
complemetado por el gen marcador de selección del vector de
expresión y la delección o mutación tiene el efecto de producto no
funcional de dicho gen de célula hospedadora que se expresa. La
delección está preferiblemente localizada en un gen cromosómico
esencial que corresponde al gen marcador de auxotrofía del vector
de expresión. Otro tema con importancia de la invención es un método
para producir un sistema de expresión procariótica que comprende la
introducción de un vector de expresión de acuerdo con la invención
en la célula procariota auxotrófica con una delección en el gen que
corresponde al marcador auxotrófico del vector de expresión dónde
la mutación o delección tiene el efecto de un producto no funcional
de dicho gen de célula huésped que se expresa.
Otro tema con importancia de la invención es un
procedimiento para la producción de una proteína heteróloga mediante
la expresión heteróloga de una proteína deseada utilizando un
vector de expresión en la célula hospedadora de acuerdo con la
invención y aislando el producto de expresión de las células o el
sobrenadante en dónde se lleva a cabo la fermentación en un medio
mínimo o en un medio sintético completo.
Otro tema con importancia de la invención es un
procedimiento para la producción de un sistema de expresión
procariótica que está caracterizado en que un vector de expresión
de acuerdo con la invención es introducido a las células
hospedadoras procariotas con una mutación en un gen cromosomal que
está complementado por el gen marcador auxotrófico del vector de
expresión y la mutación cromosomal tiene el efecto de un producto
no funcional de dicho gen de célula hospedadora que se puede
expresar.
En la actual invención se desarrolló un nuevo
sistema huésped/vector de E. coli basado en la
complementación de un gen cromosómico esencial auxotrófico de E.
coli (trpC, pyrF), mediante la expresión codificada por el
plásmido de un gen de levadura adecuado (TRP1, URA3), en lugar de
la selección actual con antibióticos. Además:
- i)
- Se construyeron nuevos vectores de expresión optimizados (minimizados) respecto al tamaño utilizando elementos funcionales mínimos (marcadores de selección, origen de replicación y casete de expresión),
- ii)
- Se aislaron cepas de huéspedes no revertibles mediante la recombinación homóloga (delección) de un gen cromosómico deseado de E. coli (trpC, pyrF) y
- iii)
- los componentes del nuevo sistema huésped/vector (plásmidos de expresión y las cepas de huéspedes) fueron comprobados por su función y funcionamiento basándose en la expresión de un gen modelo (interferón-\alpha-2b).
Por esto:
- i)
- Las cepas huéspedes de E. coli con mutaciones estables (delecciones) de genes cromosómicos trpC y pyrF y
- ii)
- se construyeron vectores que contienen los genes de levaduras complementarios TRP1 (Tschumper, G., 1980) o URA3 (Rose, M., 1984).
Los mutantes duplicados o mutantes deleccionados
son construidos preferiblemente cómo cepas de huéspedes
estables.
Los vectores mínimos de acuerdo con la invención
son preferiblemente muy pequeños (inferiores a 2000 bp) y tan sólo
contienen elementos absolutamente esenciales de un plásmido de
expresión, esto es, un origen de replicación, un gen marcador de la
selección heterólogo y un casete de expresión heterólogo y éstos
tienen el tamaño más pequeño posible para evitar la recombinación
homóloga con el genoma de las células hospedadoras procariotas. La
recombinación homóloga, dentro del sentido de la invención, es
entendida cómo el intercambio de secuencias de DNA entre el vector
y el genoma de la célula hospedadora, de acuerdo con la invención.
La recombinación homóloga puede ocurrir cuando haya una secuencia
considerable (cómo mínimo 50 a 1000 pb) compatible entre el vector
y el genoma. Una baja concordancia en la secuencia (inferior a 50
pb) no conduce a la recombinación homóloga a un grado detectable
dentro del sentido de la invención.
Los ejemplos de células hospedadoras adecuadas
son mutantes de E. coli TrpC que están caracterizadas por
tener una isomerasa
N-(5'-fosforibosil)-antranilato
inactivada (EC 5.3.1.24) y mutantes pyrF que se caracterizan por
tener una decarboxilasa
orotidina-5'-fosfato inactivada (EC
4.1.1.23). Los mutantes son incapaces de sintetizar triptófano o
uracilo y por ello no pueden crecer en un medio nutritivo que
carezca de estos compuestos. En contraposición, éstos exhiben un
crecimiento normal en un medio completo ya que el triptófano y el
uracilo están presentes en las cantidades adecuadas.
Los mutantes auxotróficos trpC y pyrF se
complementan mediante un plásmido, de acuerdo con la invención, que
contiene el gen ausente o defectivo para la biosíntesis respectiva
sin una mutación. Sin embargo, los genes complementarios no derivan
de E. coli, sino de la levadura Saccharomyces
cerevisiae. Éstos codifican para los mismos enzimas, cómo los
genes correspondientes de E. coli. Debido a la pobre función
de los promotores de las levaduras, su transcripción en E.
coli es menor que la transcripción de los genes de E.
coli análogos endógenos del huésped. La expresión del plásmido
del gen de la levadura URA3 (pBR322 derivado del plásmido) es por
ejemplo tan sólo un tercio de la expresión del gen cromosómico
análogo pyrF (Rose, M., 1984). Esto tiene la ventaja de que los
genes marcadores no se sobreexpresan a pesar del efecto de la dosis
genética y adicionalmente, la célula no se estresa
metabólicamente.
Los plásmidos son moléculas de DNA de doble
cadena circulares extracromosomales (episomales) que tienen una
longitud de varios miles de bloques de nucleótidos y aparecen en
varios centenares de copias por célula. Éstos tienen un segmento de
DNA, el así llamado origen de replicación, que facilita la
replicación/amplificación autónoma del plásmido independiente de la
replicación cromosómica del DNA.
Se desarrolló un sistema estable huésped/vector
de E. coli que permite la selección de plásmidos por
antibióticos. El principio de selección se basa en la
complementación de una E. coli estable auxótrofo mediante un
gen de levadura adecuado.
Las cepas huésped de E. coli,
preferiblemente contienen una mutación estable, preferiblemente no
reversible (delección) en los genes cromosomales trpC y/o pyrF y/o
un plásmido de expresión que contiene los genes complementarios de
levaduras TRP1 y/o URA3.
Los plásmidos de expresión básica se caracterizan
por:
- i)
- la ausencia de genes de resistencia a antibióticos
- ii)
- su reducido tamaño (< 2000 pb).
Éstos sólo contienen los elementos absolutamente
esenciales para la replicación en E. coli y la expresión del
gen deseado:
- i)
- un origen de la replicación,
- ii)
- un gen marcador de selección y
- iii)
- un casete de expresión procariótico o eucariótico (terapia génica), y el tamaño de estos elementos plasmídicos es lo mínimo posible.
El origen de la replicación para la replicación
autónoma del plásmido en la célula deriva del plásmido procariota,
preferiblemente del plásmido natural de E. Coli. La mayor
parte de los plásmidos de E. coli utilizados hoy en día son
derivados del vector de clonaje pBR322 (Boliver, F. et al.,
1979) el replicón del cuál (origen de la replicación de DNA) se
basa en el plásmido pMB1 (Sutcliffe, G. et al. 1979) que
sólo difiere ligeramente del plásmido ColE1. La replicación del
plásmido pBR_{322} se refiere también a la replicación del tipo
ColE1 (Backman, K. et al., 1978). La secuencia mínima de DNA,
que es responsable de una replicación autónoma del plásmido
pBR_{322} se redujo Backman, K. et al. 1978 a
580-650 mediante una larga secuencia de DNA. El
número de copias de plásmidos por célula se determina mediante el
tipo de origen replicativo. Dependiendo del número de copias por
célula que puede ser alcanzado, se clasifican en bajo número de
copias (ca. 10 copias, plásmidos pACYC), a un medio número de
copias (ca. 50 copias, plásmidos pBR) y a un elevado número de
copias (ca. 500 copias, plásmidos pUC) de plásmidos. Un elevado
número de copias del origen de la replicación de los plásmidos pUC
se basa solamente en una mutación puntual del origen pBR de
replicación (Chambers, S. P. et al., 1988). El rendimiento
de la expresión de un gen generalmente se asocia con el número de
copias de un gen a ser expresado.
Un casete de expresión (unidad heteróloga de
transcripción) se compone de:
- i)
- un promotor,
- ii)
- un sitio de unión al ribosoma,
- iii)
- sitio de escisión de clonaje múltiple y
- iv)
- un terminador de la transcripción (terminación rho-independiente).
El sitio de escisión de clonaje múltiple sirve
para insertar el gen (gen estructural) para expresarse y por este
propósito éste está compuesto de cómo mínimo dos sitios de escisión
de endonucleasas de restricción que están presentes sólo una vez en
el vector. Los sitios de escisión son preferiblemente utilizados
para los sitios de escisión que están orientados hacia el promotor
que contiene la secuencia de nucleótidos para un codón de inicio de
ATG en su secuencia de reconocimiento tal cómo p.ej. las secuencias
de reconocimiento para los enzimas de restricción Ncol, BspHl, SpHI
y Ndel. Esto facilita la conexión precisa entre el promotor y el
gen estructural.
Un promotor es un fragmento de DNA que contiene
las señales de control para empezar la síntesis de mRNA y la
frecuencia con que esta molécula de mRNA se va a producir y es
funcionalmente activo en un casete de expresión. Un promotor
natural y típico de E. coli tiene de 80-300
pares de bases de longitud y contiene varias regiones
características (homólogas) que son comunes a varios promotores y
que han sido determinados mediante la comparación de secuencias
(Rosenberg, M. y Court, D., 1979; Harley, C.B. y Reynolds, R.P.,
1987). Las regiones más conservadas son:
- i)
- El sitio de reconocimiento para la RNA polimerasa con el motivo 5'-TTGACA-3', que está 35 pares de bases antes del comienzo de la síntesis del mRNA,
- ii)
- El Pribnow Schaller box o también llamado TATA box con la secuencia prototipo codónica 5'-TATAAT-3' que está localizada 10 pares de bases antes del inicio de la síntesis de mRNA y
- iii)
- una región rica en AT alrededor de la posición "43" en los promotores fuertes.
Dependiendo de la frecuencia con que el promotor
se lee, existen promotores débiles o fuertes. Se hace una distinción
también entre los promotores constitutivos y regulables
(inducibles, desreprimible). Un buen promotor, en términos de
producción industrial de proteínas, es normalmente fuerte,
estrictamente el promotor regulado está inactivado durante la
multiplicación celular y puede ser específicamente puesto en marcha
según se necesite p.ej. al final de la fermentación. Estos
requisitos de la alta y al mismo tiempo estrictamente controlable
actividad de un promotor, ha dirigido a la construcción de
promotores híbridos que son más utilizados hoy en día. En el caso
del promotor híbrido tac puede ser fácilmente regulado, la región
"-35" del promotor constitutivo fuerte trp se fusionó con la
región "-10" del promotor inducible lac (DeBoer, H.A. et
al., 1983; Amann, E. et al., 1983). Otro ejemplo es el
promotor híbrido T5-PN2&o3/04 (Sti ber, D. et
al., 1990) que se basa en un promotor baceteriófago T5
constitutivo fuerte y fue reconstruído mediante la
combinación/inserción de dos operadores lac (lac0) para formar un
promotor fuerte que pueda ser fácilmente regulado. El tac, también
cómo el promotor híbrido T5-P_{N25/03/04}, son
regulados negativamente por el represor lacl que previene la
transcripción del promotor mediante la interacción con el
operador(es) lac. Además del inductor natural lactosa o de un
análogo de lactosa no metabolizable muy potente,
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido
(IPTG), lleva a la desunión del represor lacl y así a la formación
del mRNA deseado y a la síntesis proteica.
Los terminadores de la transcripción son
secuencias de DNA de 50 a 100 pares de bases de longitud que da la
señal a la RNA polimerasa para terminar la síntesis de mRNA. Éstos
se caracterizan estructuralmente, por la formación de una
estructura secundaria de conformación de horquilla resultado de
pares de bases complementarias (la mayoría G/C). Funcionalmente
ellos actúan independientemente de su orientación. Son aconsejables
los terminadores muy eficientes (fuertes) en el extremo 3' de un
casete de expresión, para prevenir a la RNA polimerasa de la
lectura hasta el final particularmente cuando se utilizan promotores
fuertes. Los terminadores de la transcripción ineficientes pueden
conducir a la formación de operones análogos a mRNA que pueden ser
la razón de una expresión del gen codificado en el plásmido no
deseada. Además, la estructura secundaria en el extremo 3' del
mRNA, provocada por el terminador, impide la degradación mediante
las 3' exonucleasas, (Higgins, C.F. et al., 1993) que, pueden
incrementar la vida media del mRNA y consecutivamente también
aumentar el número de proteina sintetizada. Varios ejemplos de
terminadores de la transcripción utilizados frecuentemente, son el
terminador TO del bacteriófago X (Schwarz, E. et al., 1978),
el terminador del bacteriófago fd (Beck E. and Zink, B., 1981) y el
terminador T1 del operón rrnB de E. coli (Brosius, J. et
al., 1981).
Un sitio de unión ribosomal (RBS), es necesario
también, para el eficiente comienzo de la biosíntesis proteica.
Éste, comprende la secuencia desde el codón de inicio ATG hasta la
conocida secuencia de Shine Dalgarno con el motivo de consenso
AGGA. La distancia entre el codón de inicio ATG y la secuencia SD
varia entre 5-15 pares de bases y es rico en A/T. La
distancia entre el punto de inicio de la síntesis de mRNA y el
codón de inicio ATG varia por norma entre 15-80
pares de bases.
Cualquier secuencia es adecuada cómo secuencia
extraña en el sentido de la invención. Dichas secuencias de ácidos
nucleicos preferiblemente codifican para polipéptidos que tienen un
efecto en el metabolismo en el cuerpo humano. Dichas proteinas o
polipéptidos son preferiblemente polipéptidos terapéuticos
relevantes cómo las citocinas, proteínas o hormonas proteicas.
Hay un gran número de técnicas adecuadas para
producir mutantes de E. coli que son adecuadas para la
construcción de cepas hospedadoras de E. coli. Éstas ponen
en orden desde la mutagénesis de una célula entera, seguida de una
selección del fenotipo deseado hasta la mutagénesis específica de
las bases individuales, o del gen definido exactamente, o de las
secciones del genoma. Los métodos son descritos en Miller, J.H.
(1972), Neidhardt, F.C. et al. (1987) and Winnacker, E.-L.
(1985).
Se introdujo un marcador auxotrófico
no-revertible estable en las cepas hospedadoras
mediante la delección dirigida del gen completo o del fragmento del
gen mediante la recombinación homóloga de acuerdo con el método de
Hamilton C.M. et al., 1989. El genotipo original se conserva
en esta técnica, esto es no se introducen mutaciones adicionales en
el genoma de E. coli. El principio de la técnica de
intercambio genético está explicado con mayor detalle utilizando la
construcción del mutante deleccionado tryC como ejemplo.
Esto va dirigido a, por ejemplo, suprimir el gen
completo trpC (1355 pb) del operón de triptófano de E. coli
(Yanofsky, C. et al., 1981). Por esto, las regiones
flanqueadas (700-800 pb en cada caso) del gen trpC
son amplificadas mediante una PCR utilizando los cebadores
apropiados y DNA de E. coli cromosomal cómo molde. La
proyección de los cebadores contiene sitios de escisión singulares
para los enzimas de restricción con propósito de ligar los
fragmentos de DNA amplificados de los genes trpD y trpB en los
vectores pMAK705 en una fusión directa. El vector pMAK705 se
caracteriza por un origen sensible a la temperatura de replicación
(origen de replicación de pSC101) que es inactiva a 44ºC y mediante
un gen de resistencia a cloramfenicol. Con el propósito de suprimir
el gen trpC cromosomal, el plásmido pMAK705-trpD/B
se transforma en la cepa de E. coli deseada. Un prerequisito
para una recombinación homóloga entre el plásmido y el cromosoma de
E. coli es una cepa de E. coli de
recombinación-competente (genotipo recA+). Las cepas
con un genotipo recA- no pueden llevar a cabo una recombinación
homóloga y son inadecuadas por ello. Las células transformadas se
cultivan a 44ºC en presencia de cloramfenicol. Entonces el plásmido
no se replica a 44ºC debido a su origen de replicación sensible a
la temperatura (ori^{ts}), sólo sobreviven aquellas células que
tengan integrado un vector en el cromosoma por ejemplo mediante una
recombinación homóloga. Los co-integrantes son
aislados y cultivados bajo la selección de cloramfenicol después de
varios pasos a 30ºC. El origen localizado cromosomalmente de la
replicación del plásmido pMAK705-trpD/B, que es
activo a esta temperatura, da lugar a, una reducción drástica en el
índice de crecimiento de los co-integrantes. Las
células que se les ha quitado el plásmido del cromosoma mediante una
segunda recombinación crecen normalmente otra vez. Éstas contienen
el plásmido aislado del cromosoma que se replica a 30ºC en
presencia de cloramfenicol. El resultado es que las células que
contienen plásmidos, sobreexpresan los
co-integrantes y son dominantes en el cultivo
después de varios pasos. Cómo lo mencionado en la Figura 1, el
plásmido integrado puede ser separado del cromosoma de dos formas
diferentes A y B. El plásmido entonces contiene el gen trpC (B)
para ser deleccionado o éste está presente otra vez en su forma
original en la célula (A) dependiendo de la recombinación homóloga.
Las células que contienen un plásmido con el gen cromosomal trpC
muy probablemente tienen la delección deseada en trpC. Éstas, son
identificadas mediante el análisis de restricción de los plásmidos y
se las preserva del plásmido, mediante un cultivo singular a 44ºC y
varios cultivos a 30ºC en ausencia de cloramfenicol. Posteriormente
los clones son ensayados en especial la auxotrofía de trpC mediante
el revestimiento de colonias individuales en un medio con y sin
triptófano (copia de revistimiento).
Se desarrolló un sistema hospedador/vector
regulado extremadamente de forma estricta, especialmente para la
expresión de proteinas que son tóxicas para E. coli para
prevenir la expresión basal de un gen que puede causar
interferencias. El sistema de polimerasa T7 de Studier, F. et
al., 1990 se basa en una RNA polimerasa especial del
bacteriófago T7 que es absolutamente selectivo y específico para el
promotor T7. Puesto que, la RNA polimerasa del hospedador de E.
coli no reconoce este promotor T7, la polimerasa T7 se
proporciona al mismo tiempo de la inducción mediante
- i)
- la infección del cultivo con un fago adecuado tal cómo p.ej. el derivado CE6 del bacteriófago \lambda o
- ii)
- la inducción de una polimerasa T7 cromosomalmente integrada bajo el control del promotor lacUV5/lacl.
Se construyeron las cepas hospedadoras de E.
coli especiales BL21(DE3) y HMS174(DE3), que
contienen un gen de la polimerasa T7, mediante la inserción
cromosomal de un derivado DE3 del bacteriófago lisogénico \lambda.
Este sistema, que es normalmente utilizado en los laboratorios de
investigación, es menos adecuado para propósitos industriales
debido a:
- i)
- sólo un número limitado de cepas hospedadoras (2) son adecuadas,
- ii)
- el lisogen DE3 no es absolutamente estable en un fermentador y
- iii)
- el crecimiento de las células se frena después de la inducción y por lo tanto un crecimiento para aumentar la densidad celular es difícil.
Los siguientes ejemplos, publicaciones,
protocolos de secuencias y figuras clarifican la invención, con el
propósito protectivo, de reivindicar los resultados de la patente.
Los métodos descritos están para ser entendidos cómo ejemplos que a
pesar de todo describen el contenido de la invención incluso
después de las modificaciones.
Las figuras muestran:
Figura 1: Construcción de mutantes de delección
de E. coli trpC mediante una técnica de intercambio de
genes. Las secuencias que flanquean el gen trpC para ser
deleccionadas son integradas dentro del vector pMAK705. Sólo las
cepas de E. coli transformadas mediante una recombinación
homóloga e integración del plásmido dentro del cromosoma y
cultivadas a 44ºC con la adición de cloramfenicol, sobreviven
puesto que el plásmido no se puede replicar (formación
co-integrantes) a 44ºC. Un cultivo subsiguiente a
30ºC bajo la selección de cloramfenicol, lleva a una segunda
recombinación homóloga en la que el plásmido se corta del
cromosoma. Esta rotura del co-integrante puede
llevar al plásmido inicial pMAK705-trpD/B (A) o al
plásmido derivado pMAK705-trpD/C/B que
adicionalmente contiene el gen trpC (B). El gen trpC en el cromosoma
de E. coli sólo se delecciona en el caso B.
Figura 2: La construcción de los vectores base
OripBR-TRP1, OripBR-URA3 y
OripBR-TET: los plásmidos
OripBR-TRP1 (1497 pb), OripBR-URA3
(1697 pb) y OripBR-TET (2012 pb) se forman
utilizando los sitios de escisión Sfil y Xhol mediante el
ligamiento de los genes marcadores TET, URA3 y TRP1 aislados de los
plásmidos pBR_{322}, yEP24 y yRP7 con un segmento de DNA que
contiene el origen de la replicación de pBR_{322}.
Figura 3: La secuencia de nucleótidos del casete
de expresión está compuesta del promotor híbrido
T5-P_{N25/03/04}, el sitio de unión ribosomal
RBSII, un sitio de escisión de clonaje múltiple
(Ndel/Sall/Xmal/EcoRV/Celll) y el terminador
\lambda-TO.
Los métodos estándar fueron utilizados para
manipular el DNA cómo lo descrito en Sambrook, J. et al.
(1989) En: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold, Spring Harbor, New York. Los
reactivos biológicos moleculares fueron utilizados de acuerdo con
las instrucciones del fabricante.
El origen de la replicación del vector pBR322
(número medio de copias) y del vector pUC20 (número elevado de
copias) fueron utilizados cómo el origen de la replicación. La
secuencia de DNA mínima para la replicación autónoma de estos
plásmidos está entre 580-650 pb (Backman, K. et
al., 1978).
Los genes de levadura TRP1 y URA3 fueron
seleccionados cómo genes marcadores de la selección. El gen de
resistencia a la tetraciclina se utilizó para construir plásmidos
de referencia estándar isogénicos.
El plásmido OripBR-TRP1 fue
compuesto de dos fragmentos de DNA que fueron obtenidos mediante la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de acuerdo con el método
de Mullis, K.B. y Faloona, F.A., 1987. En una primera reacción de
PCR, el origen de replicación del plásmido pBR_{322} desde la
posición 2517-3160 de acuerdo con la publicación de
Sutcliffe J.G., 1979 fue amplificado utilizando los cebadores N1
(ID de SEC Nº: 1) y N2 (ID de SEC Nº: 2)
Y pBR_{322} cómo la plantilla de DNA. Se
introdujo un sitio singular de escisión de endonucleasa de
restricción Sfil mediante la proyección del extremo 5' del cebador
N1 PCR y un sitio de escisión de endonucleasa de restricción se
introdujo mediante la proyección del extremo 5' del cebador N2
PCR.
El gen TRP1 de levadura (región flanqueada 5' y
el gen estructural TRP1) desde la posición 22-777
pb de acuerdo con la publicación de Tschumper, G. y Carbon, J.,
1980 se amplificó con una segunda reacción de PCR utilizando los
cebadores N3 (ID de SEC Nº: 3) y N4 (ID de SEC Nº: 4)
y YRP7 (Kopetzki, E. et al.,
1989) cómo la plantilla de DNA. Un sitio de escisión singular Sfil
y un sitio de escisión Notl fueron introducidos mediante la
proyección del extremo 5' del cebador N3 PCR y un segundo codón de
parada de la traducción, el terminador de la transcripción fd del
bacteriófago fd desde la posición 1522-1570 (Beck,
E. y Zink, B., 1981) y dos sitios de escisión de endonucleasa
singulares (MAKHI y Xhol) se introdujeron en el extremo 3' de la
región codificada del gen estructural TRP1 mediante la proyección
del extremo 5' del cebador N4
PCR.
Los dos fragmentos de PCR digeridos con Sfil y
Xhol fueron ligados después de una purificación mediante una
electroforesis con gel de agarosa. Después las cepas de E.
coli K12 JA300 (thr, leuB6, thi, thyA, trpC1117, hsrK, HsmK,
strR; DSMZ 4776) (fuente: ``Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen
und Zellkulturen GmbH) se transformaron por medio de cloruro
cálcico de acuerdo con el método de Hanahan, D., 1983 o mediante la
electroporación de acuerdo con el protocolo de Fiedler, S. y Wirth,
R., 1988. Los transformantes se seleccionaron en placas de agar en
un medio mínimo M9 (preparación: mirar Sambrook, J. et al.,
1989) y 0,5% (peso/volumen) casaminoácidos (caseína hidrolizada con
ácido, que no contiene triptófano) de la compañía Difco y
subsiguiente crecimiento en un cultivo líquido. El plásmido deseado
OripBR-TRP1 (1497 pb) fue identificado mediante el
mapeo de restricción.
El plásmido OripBR-URA3 se
compuso de dos fragmentos de PCR cómo el plásmido
OripBR-TRP1. Sin embargo, el gen de levadura URA3 se
utilizó en lugar del gen marcador de la elección TRP1. Primera
reacción de PCR: mirar por ejemplo 1.1.
El gen de levadura URA3 (con la región 5'
flanqueada y el gen estructural URA3) desde la posición
75-1030, de acuerdo con la publicación de Rose, M.,
1984 fue amplificado en una segunda reacción de PCR utilizando los
cebadores N5 (ID de SEC Nº:5) y N6 (ID de SEC Nº.6)
y YEp24 (Botstein, D. et
al., 1979) cómo la plantilla de DNA. Un sitio de escisión
singular Sfil y el sitio de escisión Notl se introdujeron mediante
la proyección del extremo 5' del cebador N5 PCR y un segundo codón
de parada de la traducción, el terminador de la transcripción fd
del bacteriófago fd (orientación anti-nativa) desde
la posición 1522-1570 (Beck, E. and Zink, B., 1981)
y dos sitios de escisión de endonucleasa de restricción singular
(BamHl y Xhol) se introdujeron en el extremo 3' de la región de
codificación del gen estructural TRP1 mediante la proyección del
extremo 5' del cebador N6
PCR.
Los dos fragmentos PCR digeridos con Sfii y Xhol
se ligaron después de la purificación mediante electroforesis en gel
de agarosa. Acto seguido, la cepa CSH28 de E. coli K12
(\Deltalacpro, supF, trp, pyrF, his, strA, thi) (fuente: Cold
Spring Harbor Laboratory, New York; Miller, J.H., 1972) se
transformó por medio de cloruro cálcico de acuerdo con el método de
Hanahan, D., 1983 o mediante electroporación de acuerdo con el
protocolo de Fiedler, S. y Wirth, R., 1988. Los transformantes se
seleccionaron en placas de agar en un medio mínimo M9 (preparación:
ver Sambrook, J. et al., 1989) conteniendo 0,5%
(peso/volumen) de casamino ácidos de la compañía Difco y 5 mg/ml de
triptófano y seguidamente se hicieron crecer en un cultivo líquido.
El plásmido deseado OripBR-URA3 (1697 pb) se
identificó mediante el mapeo de restricción.
El plásmido OripBR-TET se compuso
de dos fragmentos PCR cómo los plásmidos
OripBR-TRP1 y OripBR-URA3. Sin
embargo, el gen de resistencia al antibiótico tetraciclina (TET) del
plásmido pBR_{322} se utilizó en lugar de los genes marcadores de
la selección TRP1 o URA3. La primera reacción de PCR: mirar ejemplo
1.1.
El gen de resistencia TET (promotor y el gen
estructural TET) desde la posición 3-1275, de
acuerdo con la publicación de Sutcliffe J.G., 1979 se amplificó en
una segunda reacción PCR utilizando los cebadores N7 (ID de SEC Nº:
7) y N8 (ID de SEC Nº: 8)
y pBR_{322} (Sutcliffa, J.G.,
1979) cómo molde de DNA. Un sitio de escisión singular Sfil y un
sitio de escisión Notl se introdujeron mediante la proyección del
extremo 5' del cebador N7 PCR y el terminador fd de la transcripción
del bacteriófago fd (orientación anti-nativa) desde
la posición 1522-1570 (Beck, E. and Zink, B., 1981)
y dos sitios de escisión de endonucleasa de restricción singulares
(Xhol y Xbal) se introdujeron en el extremo 3' de la región
codificante del gen estructural TET mediante la proyección del
extremo 5' del cebador N8
PCR.
Los dos fragmentos de PCR digeridos con Sfil y
Xhol fueron ligados después de la purificación mediante
electroforesis con gel de agarosa. Seguidamente la cepa JA300 de
E. coli K12 (thr, leuB6, thi, thyA, trpC1117, hsrK, HsmK,
strR; DSMZ 4776) (fuente: ``Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen
and Zeilkulturen GmbH) se transformó por medio de cloruro cálcico
de acuerdo con el método de Hanahan, D., 1983 o mediante la
electroporación de acuerdo con el protocolo de Fiedler, S. y Wirth,
R., 1988. Los transformantes se seleccionaron (placas de agar) en
medio completo LB (preparación: mirar Sambrook, J. et al.,
1989) que contiene 12,5 \mug/ml de tetraciclina y
subsiguientemente crecieron en un cultivo líquido. El plásmido
deseado OripBR-TET (2012 bp) se identificó por mapeo
de restricción.
Un sitio de escisión Ndel no deseado, que se
formó de 2 fragmentos PCR entre los sitios de escisión Notl y Sfil,
durante la unión de los vectores base OripBR-TRP1,
OripBR-URA3 y OripBR-TET, fue
subsecuentemente eliminado por medio de un adaptador de nucleótidos
Notl/Sfil.
Por esto, los plásmidos
OripBR-TRP1, OripBR-URA3 y
Orip-BR-TET se digerieron con Notl
y Sfil, los fragmentos del vector se purificaron mediante
electroforesis con gel de agarosa y se ligaron con un adaptador de
nucleótidos Notl/Sfil. Los plásmidos deseados se identificaron
mediante mapeo de restricción (perdiendo el sitio de escisión
Ndel).
El adaptador Notl/Sfil se preparó mediante la
hibridización de oligonucleótidos complementarios mutuamente N9 (ID
de SEC Nº: 9) y N10 (ID de SEC Nº: 10). Por esto se mezclaron 10
nmol de cada uno de los oligonucleótidos N9 y N10 en 100 \mul de
12,5 mmol/I Tris-HCl, pH 7,0 y 12,5 mmol/l
MgCl_{2}, la mezcla se calentó durante 5 min a 95ºC y
seguidamente se enfrió lentamente a temperatura ambiente.
El casete de expresión que fue utilizado (unidad
heteróloga de transcripción) se compuso de los siguientes
elementos:
- i)
- el promotor regulado híbrido T5-P_{N25/03/04} (Bujard, H. et al, 1987; Stuber, D. et al, 1990),
- ii)
- un sitio de unión ribosomal sintético RBSII (Stüber, D. et al., 1990),
- iii)
- un sitio de escisión de clonaje mútiple con los sitios de escisión singulares Ndel, Sail, Xmal, EcoRV y Celll y iv) el terminador de la transcripción bacteriófago \lambda-T0 (Schwarz, E. et al., 1978).
El promotor híbrido
T5-P_{N25/03/04} (Fig. 3: mediante la posición:
1-87 pb) se conectó con el terminador
\lambda-T0 (Fig. 3: posición:
146-241 pb) por medio de un conectador
EcoRl-RBSII-Ndel/Sall/Xmal/EcoRV/Celll
El casete de expresión se obtuvo mediante la
reconstrucción de un plásmido pDS56/RBSII (Stuber, D. et al.,
1990). Por esto, un derivado del plásmido pDS56/RBSII se digerió
con EcoRl y Celll y el fragmento del vector
EcoRl/Celll-pDS56 purificado mediante electroforesis
con gel de agarosa se ligó con un conectador
EcoRl-RBSII-Ndel/Sall/Xmal/EcoRV/Celll.
El conectador
EcoRl-RBSII-Ndel/Sall/Xmal/EcoRV/Celll
se preparó mediante la hibridación de los oligonucleótidos
complementarios mutuamente N11 (ID DE SEC Nº:11) y N12 (ID DE SEC
Nº:12). Se mezclaron 10 nmol de cada uno de los oligonucleótidos N11
y N12 en 100 \mul 12,5 mmol/l Tris-HCI, pH 7,0 and
12,5 mmol/l MgCl2, la mezcla se calentó durante 5 min a 95ºC y
después se enfrió lentamente a temperatura ambiente.
El plásmido deseado p16074a se identificó por
mapeo de restricción y el casete de expresión se comprobó mediante
la secuenciación del DNA.
El casete de expresión (Fig. 3) del plásmido
p16074a compuesto de un promotor híbrido regulado
T5-P_{N25/03/04}, el sitio de unión ribosomal
sintético RBSII, un sitio de escisión de clonaje múltiple con los
sitios de escisión singular Ndel, Sall, Xmal, EcoRV y Celll y el
terminador \lambda-T0 se amplificó por PCR y se
insertó en los plásmidos OripBR-TRP1,
OnpBR-URA3 y OripBR-TET.
El casete de expresión (Fig.3) se amplificó por
medio de PCR utilizando los cebadores N13 (ID DE SEC Nº:13) y N14
(ID DE SEC Nº:14)
y el plásmido p16074a cómo molde de
DNA. Se introdujo un sitio de escisión BamHl singular al extremo 3'
del casete de expresión (terminador \lambda-T0)
por medio del cebador N14
PCR.
El producto PCR se digerió con endonucleasas de
restricción Xhol y BamHl y el fragmento largo ca. 255 pb Xhol/BamHl,
se ligó después de una purificación por electroforesis en gel de
agarosa en el fragmento largo ca. 1490 pb del vector
Xhol/BamHl-OripBR-TRP1 (ejemplo 2).
El plásmido deseado OripBR-TRP1-EK
(1728 pb) se identificó mediante el mapeo de restricción y la
secuencia del casete de expresión amplificada por PCR se verificó
mediante la secuenciación del DNA.
El plásmido de expresión
OripBR-URA3-EK (1928 pb) se preparó
análogamente al plásmido
OripBR-TRP1-EK. Sin embargo, el
vector base OripBR-URA3 se usó en lugar del vector
base OripBR-TRP1.
El casete de expresión (Fig. 3) se amplificó por
medio del PCR usando los cebadores N13 (ID DE SEC Nº:13) y N14 (ID
DE SEC Nº:15)
y el plásmido p16074a cómo molde de
DNA. Un sitio de escisión Xbal singular fue introducido en el
extremo 3' del casete de expresión (\lambda-T0
terminador) por medio del cebador N15
PCR.
El producto PCR se digerió con las endonucleasas
de restricción Xhol y Xbal y el fragmento largo ca. 255 pb Xhol/Xbal
fue ligado después de la purificación por electroforesis en gel de
agarosa en el fragmento del vector largo ca. 2000 pb
Xhol/Xbal-OripBR-TET (ejemplo 2). El
plásmido deseado OripBR-TET-EK (2243
pb) se identificó por mapeo de restricción y la secuencia del
casete de expresión amplificado por PCR fue verificada mediante la
secuenciación de DNA.
El número medio de copias del origen de la
replicación del plásmido pBR322 se sustituyó por el número elevado
de copias del origen de la replicación de un plásmido pUC en los
plásmidos OripUC-TRP1-EK,
OripUC-URA3-EK y
OripUC-TET-EK,
Por esto, el origen pUC de la replicación se
amplificó por medio de PCR utilizando los cebadores N1 (ID DE SEC
Nº:1) y N2 (ID DE SEC Nº:2) (ejemplo 1) y el plásmido pUC20 cómo
molde del DNA. El fragmento de origen de replicación largo ca. 650
pb Sfii/Notl-pUC digerido con Sfil and Notl, se ligó
después de la purificación mediante la electroforesis con gel de
agarosa en los correspondientes fragmentos del vector
Sfil/Notl-OripBR-TRPI-EK,
Sfil/Notl-OripBR-URA3-EK
y
Sfil/Noti-OripBR-TET-EK.
Los plásmidos deseados
OripUC-TRP1-EK,
OripUC-URA3-EK y
OripUC-TET-EK se identificaron en
las bases de su número de copias de plásmidos incrementados
(incremento de 3-5-veces en el
rendimiento del plásmido después de la preparación estándar).
Los vectores de expresión se ensayaron en
consideración con la estabilidad del plásmido y la síntesis de
IFN-\alpha2b utilizando un gen de interferón
\alpha2b (gen estructural
Met-IFN-\alpha2b sin una secuencia
de señal) cómo modelo genético que tiene que ser expresado de forma
heteróloga.
El gen estructural
Met-IFN-\alpha2b químicamente
preparado se basa en la secuencia de aminoácidos declarada en el
Index Nominum (Directorio Internacional de fármacos 1992/1993) para
IFN-\alpha2b maduro. El gen estructural
Met-IFN-\alpha2b adicionalmente
contiene un codón de inicio ATG. El sitio de unión ribosomal RBSII
sintético y el sitio de escisión singular EcoRl están localizados
corriente arriba en el extremo 5' del gen estructural
Met-IFN-\alpha2b (Stüber D. et
al., 1990). Los codones que son preferentemente utilizados en
E. coli (uso del codón de E. Coli) fueron tomados en
consideración en el diseño del gen
Met-IFN-\alpha2b. En adición, los
sitios de escisión endonucleasa de restricción singular adecuados
fueron introducidos dentro de la región de codificación y en el
extremo del gen estructural
Met-IFN-\alpha2b (EcoRl y HindIII)
en consideración con la construcción de genes variantes y reclonando
el segmento Met-IFN-\alpha2b de
DNA.
El gen IFN-\alpha2b
(RBSII-Met-IFN-\alpha2b
gen) se preparó mediante la compañía Genosys (Genosys
Biotechnologies Inc. Cambridge, England) a partir de
oligonucleótidos hechos por síntesis química. El gen de doble cadena
RBSll-Met-IFN-\alpha2b
se ensambló por hibridación y ligamiento de los oligonucleótidos y
subsecuentemente clonados en sitio de escisión EcoRl y Hindlll del
vector estándar de E. coli pBluescriptSK(+) de la compañía
Stratagene (Stratagene GmbH, Heidelberg, Alemania). La secuencia de
DNA predeterminada del gen estructural clonado
RBSII-Met-IFN-\alpha2b
se confirmó por secuenciación del DNA. Seguidamente el segmento
largo ca. 535 pb
EcoRl/Hindlll-RBSII-Met-IFN-\alpha2b
fue reclonado dentro del plásmido pDS56/RBSII digerido con EcoRl e
Hindlll (pDS-IFN). Esto facilita la transferencia
del gen
RBSII-Met-IFN-\alpha2b
en la forma de un fragmento ca. 540 pb
EcoRl/Celll-RBSII-Met-IFN-\alpha2b.
El gen
RBSII-Met-IFN-\alpha2b
se aisló del plásmido pDS-IFN en la forma de
fragmento largo ca. 540 pb
EcoRl/Celll-RBSII-Met-IFN-\alpha2b
y seguidamente se ligo en cada uno de los plásmidos
OripBR-TRP1-EK,
OripBR-URA3-EK,
OripBR-TET-EK,
OripUC-TRPI-EK,
OripUC-URA3-EK y
OripUC-TET-EK que fueron digeridos
con EcoRl y Celll. Los plásmidos deseados
OripBR-TRP1-EK-IFN,
OripBR-URA3-EK-IFN,
OripBR-TET-EK-IFN,
OripUC-TRPI-EK-IFN,
OripUC-URA3-EK-IFN y
OripUC-TET-EK-IFN
fueron identificados mediante el mapeo de restricción.
Los marcadores auxotróficos deseados trpC and
pyrF se introdujeron en las cepas de laboratorio ya disponibles aún
mediante la delección dirigida de los genes completos o de un
fragmento largo del gen a través de una recombinación homóloga de
acuerdo con el método de Hamilton C.M. et al. 1989.
Con el propósito de suprimir el gen cromosomal
completo trpC (1355 pb), 700-800 pb de la región 5'
flanqueada (trpD) y de la región 3' flanqueada (trpB) se clonaron
cada uno por medio de PCR y éstos se ligaron en el vector pMAK705
(Hamilton C.M. et al., 1989) en fusión directa (trpD/B) por
medio de un sitio de escisión común (Notl) introducido mediante
cebadores PCR. La secuencia de DNA del operon de triptófano de
E. coli se da en Yanofsky, C. et al., 1981.
La región 5' flanqueada del gen trpC (trpD) se
amplificó utilizando los cebadores N16 (ID DE SEC Nº:1 6) y N17 (ID
DE SEC Nº:17)
y el DNA cromosómico de E.
coli cómo molde. Se introdujo un sitio de escisión singular
BamHl al extremo 5' por medio del cebador N16 y se introdujo un
sitio de escisión singular Notl en el extremo 3' del fragmento
amplificado trpD por medio de un cebador N
17.
La región 3' flanqueada del gen trpC (trpB) se
amplificó utilizando los cebadores N18 (ID DE SEC Nº:18) y N19 (ID
DE SEC Nº:19)
y el DNA cromosomal de E.
coli cómo molde. Se introdujo un sitio de escisión singular
NotI en el extremo 5' por medio del cebador N18 y se introdujo un
sitio de escisión SpHI singular en el extremo 3' del fragmento
amplificado trpB por medio del cebador
N19.
El fragmento de PCR trpD se digerió con BamHl y
Notl (ca. 710 pb) y el fragmento de PCR trpB se digerió con Notl y
SpHI (ca. 820 bp). Después de la purificación por electroforesis en
gel de agarosa, el fragmento de DNA se ligó en un fragmento de
vector largo ca. 5650 pb BamHl/SpHI-pMAK705 por
medio de un ligamiento de tres fragmentos en una vía de fusión
directa al sitio de escisión común Notl. El plásmido deseado
pMAK705-trpDB (7104 pb) se identificó por mapeo de
restricción y la secuencia trpD/B amplificada por PCR fue verificada
mediante la secuenciación del DNA.
Con el propósito de suprimir ca. 260 pb de la
región de codificación del gen cromosómico pyrF, cerca de
700-800 pb de la región flanqueada pyrF fue clonada
en cada caso por medio de PCR y ligada en una fusión directa
(\DeltapyrF) dentro del vector pMAK705 por medio de un sitio de
escisión común (Xbal) introducido por los cebadores PCR. La
secuencia de DNA del operón pyrF de E. coli fue publicado en
Turnbough, C. L. Jr. et al., 1987. La región 5' flanqueada
del gen \DeltapyrF se amplificó utilizando los cebadores N20 (ID
DE SEC Nº:20) y N21 (ID DE SEC Nº:21)
y DNA cromosomal de E. coli
cómo molde. Se introdujo un sitio de escisión singular BamHI en el
extremo 5' por medio de un cebador N20 y se introdujo un sitio de
escisión Xbal singular al extremo 3' del fragmento de DNA
amplificado por medio del cebador
N21.
La región 3' flanqueada del gen ApyrF se
amplificó usando los cebadores N22 (ID DE SEC Nº:22) y N23 (ID DE
SEC Nº:23)
y DNA cromosomal de E. coli
cómo molde. Un sitio de escisión Xbal singular se introdujo en el
extremo 5' por medio de un cebador N22 y se introdujo un sitio de
escisión singular SpHl en el extremo 3' del fragmento de DNA
amplificado por medio de un cebador
N23.
El fragmento \DeltapyrF 5'flanqueado se digerió
con BamHl y Xbal (ca. 600 pb) y el fragmento 3' flanqueado
\DeltapyrF se digerió con Xbal y SpHI (ca. 690 pb). Después de la
purificación por electroforesis con gel de agarosa, los fragmentos
de DNA se ligaron en una fusión directa en el fragmento del vector
ca. 5650 pb BamHl/SpHI-pMAK705 por medio de un
ligamiento de tres fragmentos mediante el sitio de escisión común
Xbal. El plásmido deseado pMAK705-\DeltapyrF (6788
bp) se identificó por mapeo de restricción y la secuencia pyrF se
amplificó por PCR y fue verificado por secuenciación del DNA.
El vector pMAK705 se caracteriza por un origen de
replicación sensible a temperatura (origen de replicación desde
pSC101) que es inactivo a 44ºC y mediante un gen de resistencia al
cloramfenicol. Con el propósito de deleccionar un gen cromosómico el
derivado del plásmido pMAK705 apropiado se transforma en la cepa
deseada de E. coli. Un prerequisito para la recombinación
homóloga entre el plásmido y el cromosoma de E. coli es una
recombinación-competente de la cepa de E.
coli (genotipo recA+). Las cepas cuyos genotipos son recA- no
pueden llevar a cabo una recombinación homóloga y por esto no son
adecuados.
La cepa UT5600 de E. coli K12,(ara,
proC-14, IeuB6, azi-6, lacYl,
tsx-67, entA403, trpE38+, rpsL109,
xyl-5, mtl-1, thi-1,
\DeltaompT) (Grodberg, J. y Dunn, J.J., 1988) fue transformada
con el plásmido pMAK705-trpD/B y con el plásmido
pMAK705-\DeltapyrF. Después de la adición del DNA
del plásmido, la preparación de la transformación fue incubada
durante 30 minutos en hielo, a 37ºC durante 5 minutos (choque de
calentamiento) y a 30ºC durante 30 minutos. La preparación de la
transformación se transfirió a 3 ml de medio de LB que contiene 20
\mug/ml de cloramfenicol y las células se cultivaron allí durante
toda la noche.
Con el propósito de seleccionar los cointegrantes
del plásmido, esto es para las células que tienen integrado el
plásmido en el cromosoma por medio de una recombinación homóloga,
300 \mul de una dilución 10^{-5} del cultivo durante toda la
noche, se colocó en unas placas de agar de LB que contienen 20
\mug/ml de cloroamfenicol. Las placas de agar fueron
precalentadas a 50-60ºC en un incubador y, después
se colocaron las células, que fueron inmediatamente incubadas a
44ºC exactamente. Puesto que el plásmido pMAK705 no se replica a
esta temperatura, sólo crecen aquéllas células en las colonias que
tienen cromosomalmente integrado el plásmido. Los candidatos a
cointegrantes fueron colocados seguidamente de 2 a 3 veces en
placas de agar LB que contienen 20 \mug/ml de cloramfenicol a
44ºC para su purificación (dilución).
Con el propósito de romper los cointegrantes y de
encurtir el plásmido que se ha desintegrado del cromosoma, un clon
cointegrado purificado se cultivó durante varios pasos (2 a 6) en
medio LB a 30ºC en ausencia de cloramfenicol. Acto seguido las
células se separaron por dilución en medio LB y se ensayaron para
los genotipos deseados.
Las células/clones separadas por dilución en
medio LB se analizaron en consideración con el trp auxotrófico
deseado mediante la colocación en un medio (medio mínimo M9 que
contiene un 0,5% de casaminoácidos) con triptófano (50 mg/ml) y sin
triptófano (réplica de la colocación). Además, la sensibilidad al
cloramfenicol de los clones, se verificó mediante su colocación en
medio LB con cloramfenicol (20 \mug/ml) y sin cloramfenicol.
Además la delección cromosomal trpC, se confirmó con análisis
comparativos de PCR entre la cepa inicial y la cepa con la mutación
de delección, usando los cebadores N1 PCR, y N4, y los
correspondientes DNA cromosomales cómo moldes de DNA. El producto de
PCR de la cepa inicial fue ca. 2900 pb de longitud, calculado
teóricamente, y el mutante de delección fue de ca. 1430 pb de
longitud.
Las células/clones separadas por dilución en
medio LB, fueron analizadas en consideración con el auxotrofico
deseado pyrF, mediante su colocación en un medio (medio mínimo M9
que contiene 0,5% de casaminoácidos) con uracilo (20 mg/ml) y en
medio sin uracilo. Además la sensibilidad al cloramfenicol de los
clones, se comprobó colocándolos en medio LB con cloramfenicol (20
\mug/ml) y en medio sin cloramfenicol. Además la delección
cromosomal pyrF, se confirmó mediante el análisis comparativo de
PCR entre la cepa inicial y el mutante de delección utilizando los
cebadores de PCR N5 y N8 y los correspondientes DNA cromosomales
cómo molde de DNA. El producto de PCR de la cepa inicial fue ca.
1550 pb de longitud, calculado teóricamente y el mutante de
delección de pyrF fue ca. 1290 pb.
El nuevo sistema hospedador/vector basado en la
selección libre de antibiótico mediante la complementación de un
auxotrofo, fue evaluado en consideración con su función y
cumplimiento utilizando el interferón-\alpha2b
cómo gen modelo que tiene que ser expresado heterólogamente.
Con el propósito de expresar el gen
IFN-\alpha2b, se transformó la cepa UT5600 de
E. coli K12 (\DeltatrpC) (ejemplo 6) en cada caso con uno
de los plásmidos de expresión
OripBR-TRPI-EK-IFN,
OripUC-TRPI-EK-IFN,
OripBR-TET-EK-IFN y
OripUC-TET-EK-IFN
descritas en el ejemplo 5. Las células transformadas UT5600
(\DeltatrpC)/OripBR-TRP1-EK-IFN
y UT5600
(trpC)/OripUC-TRPI-EK-IFN
crecieron a 37ºC en un cultivo de agitación en un medio mínimo M9
que contiene 0,5% de casamino ácidos (Difco) y las células de
referencia UT5600
(\DeltatrpC)/OripBR-TET-EK-IFN
y OripUC-TET-EK-IFN
crecieron en un medio mínimo M9 que contiene un 0,5% de casamino
ácidos (Difco) y 50 mg/ml de triptófano y 12,5 \mug/ml de
tetraciclina a 37ºC hasta una densidad óptica a 550 nm (OD550) de
0,6-0,9 y seguidamente inducida con IPTG
(1-5 mmol/l de concentración final). Después de la
fase de inducción de 4-8 horas (h) a 37ºC, las
células se cultivaron por centrifugación (Sorvall
RC-5B centrífuga, GS3 rotor, 6000 rpm, 15 min), se
lavaron con 50 mmol/l de tampón Tris-HCl, pH 7,2 y
se almacenaron a -20ºC hasta acabar el proceso.
Con el propósito de expresar el gen
IFN-\alpha2b, la cepa UT5600 de E. coli
K12 (\DeltapyrF) (ejemplo 6) se transformó en cada caso con uno de
los plásmidos de expresión
OripBR-URA3-EK-IFN,
OripUC-URA3-EK-IFN,
OripBR-TET-EK-IFN y
OripUC-TET-EK-IFN
descritos en el ejemplo 5. Las células transformadas UT5600
(\DeltatrpC)/OripBR-URA3-EK-IFN
y UT5600
(\DeltatrpC)/OripUC-URA3-EK-IFN
crecieron a 37ºC en un medio en agitación en medio mínimo M9, que
contiene 0,5% de casaminoácidos (Difco) y las células de referencia
UT5600
(\DeltatrpC)/OripBR-TET-EK-IFN
y OripUC-TET-EK-IFN
crecieron en un medio mínimo M9, que contiene un 0,5% de casamino
ácidos (Difco) y 20 mg/ml de uracilo y 12,5 \mug/ml de
tetraciclina a 37ºC hasta una densidad óptica de 550 nm
(DO_{550}) de 0,6-0,9 y seguidamente inducida con
IPTG (1-5 mmol/l de concentración final). Después
de la fase de inducción de 4-8 horas (h) a 37ºC,
las células se cultivaron mediante centrifugación (Sorvall
RC-5B centrífuga, GS3 rotor, 6000 rpm, 15 min), se
lavaron con 50 mmol/l de tampón Tris-HCl, pH 7,2 y
se almacenó a -20ºC hasta acabar el proceso.
La síntesis de IFN-\alpha2b se
analizó en las células transformadas UT5600 (\DeltatrpC) o UT5600
(\DeltapyrF) con los plásmidos de expresión
OripBR-TRP1-EK-IFN,
OripUC-TRP1-EK-IFN,
OripBR-URA3-EK-IFN,
OriUC-URA3-EK-IFN,
OripBR-TET-EK-IFN y
OripUC-TET-EK-IFN.
Por esto los pellets de células de 3 unidades DO_{550} (1
DO_{550}= 1 ml de suspensión celular con una DO_{550} de 1) del
medio de cultivo centrifugado se resuspendió en 0,25 ml de 10 mmol/l
Tris-HCl, pH 7,2 y las células se lisaron con
tratamiento ultrasónico (2 pulsos de 30 s a 50% de intensidad) con
un disruptor Sonifier® Celular B15 de la compañía Branson
(Heusenstamm, Germany). Los componentes celulares insolubles
sedimentaron (Eppendorf 5415 centrífuga, 14000 rpm, 5 min) y el
sobrenadante se dosificó con 1/5 volúmenes (vol) 5xSDS tampón de
muestra (1xSDS muestra de intermediario: 50 mmol/l
Tris-HCl, pH 6,8, 1% SDS, 1% mercaptoetanol, 10%
glicerol, 0,001% bromofenol azul). Las fracciones de desecho de las
células insolubles (pellet) se resuspendieron en 0,3 ml de 1xSDS
muestra tampón, que contiene 6-8 M urea, las
muestras se incubaron durante 5 min a 95ºC y se centrifugaron otra
vez. Seguidamente las proteínas se separaron mediante
electroforesis SDS con gel de poliacrilamida (PAGE) (Laemmli, U.K.,
1970) y se tiñeron con tinte Coomassie Brilliant Azul R.
La proteina sintetizada
IFN-\alpha2b era homogénea y se encontró
exclusivamente en las fracciones desechables celulares en la forma
insoluble de los agregados de proteína, también llamados cuerpos de
inclusión (IBs). El rendimiento de la expresión fue comparable
dentro de la exactitud de medida en todos los clones/células y
entre un 30-50% relativo a la proteína total de
E. coli.
Se tomó una muestra antes de la inducción de las
células (ejemplo 7) y se llevó a cabo un test de estabilidad del
plásmido. Por esto, las muestras se diluyeron directamente con medio
mínimo M9 que contiene 0,5% de casaminoácidos y 300 \mul de cada
paso de la dilución, y se colocaron en una placa de agar
no-selectiva (medio mínimo M9 suplementado con 0,5%
casamino ácidos, 50 mg/ml de triptófano, y 20 mg/l de uracilo).
Seguidamente se picaron 400 colonias individuales de cada clon con
un palillo en la placa de agar selectiva apropiada (medio mínimo M9
que contiene 0,5% casaminoácidos o en medio mínimo M9 suplementado
con 0,5% casaminoácidos, 50 mg/l de triptófano, 20 mg/ml de uracilo
y 12,5 \mug/ml de tetraciclina) y después en una placa de agar
no-selectiva (medio mínimo M9 suplementado con 0,5%
casaminoácidos, 50 mg/l de triptófano y 20 mg/l uracilo).
El número de células que contienen plásmidos se
determinó a partir del número de células que forma una colonia en
varias placas de agar. Las células que no crecen en una placa de
agar selectiva han perdido el plásmido para complementar la
auxotrofía o dar la resistencia al antibiótico. (Plásmidos
referencia TET). Antes de la inducción de las células la
estabilidad del plásmido fue del 100% para todos los cultivos
independientes del método de selección e independientes del tipo de
plásmido.
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaaggcc atataggccg gccgcgttgc tggcgttttt c
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
<211 > 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaactcg aggagcgtca gaccccgtag aaaag
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
<211 > 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaaggcc atataggcca tatgcggccg cggagagggc caagagggag ggc
\hfill53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaactcg agatatggat cctctccaaa aaaaaaggct ccaaaaggag cctttaattg
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatcggttta tttactattt cttagcattt ttgacgaaat ttgc
\hfill104
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaaggcc atataggcca tatgcggccg ccggtaatct ccgaacagaa ggaagaac
\hfill58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaactcg agacgaggat ccataaaccg atacaattaa aggctccttt tggagccttt
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttttggag aactttagtt ttgctggccg catcttctca aa
\hfill102
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaaggcc atataggcca tatgcggccg cctcatgttt gacagcttat catcgataag
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaactcg agatattcta gaataaaccg atacaattaa aggctccttt tggagccttt
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttttggag atcaggtcga ggtggcccgg ctcc
\hfill94
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggccggggg ggggc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400>10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccgccccc ccccggccta ta
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcattaaagag gagaaattaa ctatggtatg gtcgaccccg gggatatcgc
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcagcgatat ccccggggtc gaccatacca tagttaattt ctcctcttta atgaatt
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaagtaa aggggctttt cacgg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artifial:
cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaaggat ccgattctca ccaataaaaa acgcccg
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaatcta gagattctca ccaataaaaa acgcccg
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400>16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaaggat ccgggctgaa agtggcgaaa cacggc
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaagcgg ccgcttaccc tcgtgccgcc agtgcg
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencias artificiales
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaagcgg ccgcggaaag gaacaatgac aacattactt aac
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencias artificiales
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaagcat gccggtgcgc cgtgctcgcc agtttcg
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencias artificiales
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaaggat ccgtacgtag taagcctcgt tatcgttg
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaatcta gacacacgcc taagtcagct gcagc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencias artificiales
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaatcta gaggtcagga gttcaaactg gttacg
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencias artificiales
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaagcat gccagctgtc ggaggtgtta ttggtc
\hfill36
Claims (7)
1. El vector de expresión procariótico mínimo,
que no puede ser homólogamente recombinado con el genoma de los
organismos procariotas contiene:
- a)
- un origen de la replicación,
- b)
- un gen marcador auxotrófico eucariota,
- c)
- un promotor que es funcionalmente activo en procariotas y
- d)
- un gen extraño, que para ser expresado, está bajo el control de dicho promotor.
2. El vector de expresión, tal cómo se reivindica
en la reivindicación 1, en donde el gen marcador de auxotrofía y el
gen para ser expresado están orientados en direcciones opuestas y
terminan con el mismo terminador.
3. El vector de expresión tal cómo se reivindica
en las reivindicaciones 1 a 2, en dónde el marcador de auxotrofía
compensa una deficiencia de triptófano, leucina o de uracilo.
4. El vector de expresión tal cómo se reivindica
en las reivindicaciones 1 a 3, en donde el rendimiento de la
expresión del gen marcador de auxotrofía es del 1% o menos de la
proteina total en la célula hospedadora cuando la auxotrofía es
complementada en dicha célula hospedadora.
5. La célula hospedadora procariótica, que
contiene un vector, cómo se reivindica en las reivindicaciones 1 a
4, la célula hospedadora contiene una mutación en un gen cromosomal
que corresponde al gen marcador auxotrófico del vector de expresión
y el resultado de la mutación es que ningún producto funcional de
dicho gen de la célula hospedadora cromosomal puede ser
expresado.
6. El procedimiento para la construcción de un
sistema de expresión procariótico, en dónde un vector de expresión,
tal cómo se reivindica en las reivindicaciones 1 a 4, es introducido
en una célula hospedadora procariota, con una mutación en un gen
cromosomal que se complementa mediante un gen marcador de auxotrofía
del vector de expresión y el resultado de la mutación cromosomal es
que ningún producto funcional de dicho gen de la célula hospedadora
cromosomal.
7. El procedimiento para la producción de una
proteína heteróloga de expresión heteróloga de un gen extraño en un
vector de expresión tal cómo se reivindica en las reivindicaciones 1
a 4 que está contenido en una célula hospedadora, cómo se reivindica
en la reivindicación 5, y el aislamiento del producto de expresión
de la célula hospedadora o del sobrenadante, en dónde la
fermentación de la célula hospedadora se lleva a cabo en un medio
mínimo o en un medio completo sintético.
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| EP98113156 | 1998-07-15 | ||
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