ES2225951T5

ES2225951T5 - Composicion farmaceutica para la modulacion inmunitaria basada en peptidos y coadyuvantes.

Info

Publication number: ES2225951T5
Application number: ES97905068T
Authority: ES
Inventors: Walter Schmidt; Max Birnstiel; Peter Steinlein; Michael Buschle; Tamas Schweighoffer
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 1996-02-24
Filing date: 1997-02-21
Publication date: 2009-06-15
Anticipated expiration: 2017-02-21
Also published as: PL328455A1; HRP970100B1; SI0881906T2; ID16038A; IL125361A0; CZ295396B6; JP2000506125A; RS50101B; PT881906E; BG63682B1; IL125361A; DK0881906T4; SK114598A3; AU722264B2; NO983850L; HUP9901186A2; US7105162B1; NO983850D0; HRP970100A2; CN1177610C

Abstract

LA INVENCION TRATA DE UNA COMPOSICION FARMACEUTICA QUE CONTIENE AL MENOS UN PEPTIDO QUE ACTUA INMUNOMODULATORIAMENTE O UNA PROTEINA (FRAGMENTO) JUNTO CON UN COMPLEMENTO. EL PEPTIDO ES DERIVADO DE UN EXCITADOR PATOGENO O UN ANTIGENO TUMOROSO. EL COMPLEMENTO TIENE LA CAPACIDAD DE AUMENTAR LA LIGAZON DEL PEPTIDO A LAS CELULAS DEL INDIVIDUO A TRATAR O LA ENTRADA DEL PEPTIDO EN LAS CELULAS Y DE INTENSIFICAR EL EFECTO INMUNOMODULATORIO DEL PEPTIDO. SON COMPLEMENTOS PREFERENTES ACIDOS POLIAMINICOS BASICOS, POR EJEMPLO, LA POLIARGININA O POLILISINA, QUE SON OPCIONALMENTE CONJUGADOS CON UN LIGANTE CELULAR, POR EJEMPLO, UN RADICAL DE HIDRATO DE CARBONO O TRANSFERRINA. LA COMPOSICION ES USADA SOBRE TODO COMO VACUNA, EN PARTICULAR, COMO VACUNA PARA TUMORES.

Description

Composición farmacéutica para la modulación inmunitaria basada en péptidos y coadyuvantes.

La invención se refiere al sector de la modulación inmunitaria.

La invención es un desarrollo de una vacuna terapéutica sobre la base de células tumorales, que se basa, esencialmente, en las siguientes premisas: existen diferencias cualitativas o cuantitativas entre células tumorales y células normales; el sistema inmune tiene, en principio, la capacidad para reconocer estas diferencias; el sistema inmune puede mediante la inmunización específica activa con vacunas estimularse para reconocer células tumorales con ayuda de estas diferencias y provocar su rechace.

Con el fin de provocar una respuesta anti-tumores, deben cumplirse al menos dos premisas: en primer lugar, las células tumorales deben expresar antígenos que no se presentan en células normales o sólo lo hacen de forma limitada, de manera que es posible una diferenciación cualitativa por parte del sistema inmune entre tejido normal y tejido tumoral. En segundo lugar, el sistema inmune debe ser activado correspondientemente con el fin de reaccionar ante estos antígenos. Un impedimento esencial en la terapia inmune de tumores es su escasa inmunogenicidad, sobre todo en el ser humano.

Recientemente, se descubrieron antígenos asociados a tumores y específicos de tumores que representan neo-epítopos de este tipo y, por consiguiente, deben representar dianas potenciales para un ataque del sistema inmune. El hecho de que, a pesar de ello, el sistema inmune no consiga eliminar tumores que expresen estos neo-epítopos, no debería, por consiguiente, basarse evidentemente en la ausencia de neo-epítopos, sino en que la respuesta inmunológica a estos neo-antígenos es insuficiente.

Para la inmunoterapia de cáncer sobre una base celular se desarrollaron dos estrategias generales: por una parte, la inmunoterapia adoptiva que se sirve de la expansión in vitro de linfocitos T reactivos a tumores y su reincorporación en el paciente; por otra parte, la inmunoterapia activa que utiliza células tumorales con la esperanza de que con ello se provoquen respuestas inmunes nuevas o reforzadas contra antígenos de tumores que conduzcan a una respuesta sistémica del tumor. Vacunas contra tumores sobre la base de la inmuno-terapia activa se prepararon de diferentes maneras; un ejemplo de ello son células tumorales irradiadas que se mezclaron con adyuvantes inmunoestimulantes, tales como Corynebacterium parvum o Bacillus Calmette Guerin (BCG) con el fin de provocar reacciones inmunes contra antígenos de tumores (Oettgen y Old, 1991).

En los últimos años se utilizaron sobre todo células tumorales genéticamente modificadas para una inmunoterapia activa contra el cáncer. Una perspectiva sobre estos diferentes intentos, en los que células tumorales son extrañadas, en relación con una inmunogenicidad reforzada, por introducción de diferentes genes, se proporciona por Zatloukal et al., 1993. Una de las estrategias empleadas hasta ahora utiliza células tumorales que son genéticamente modificadas con el fin de producir citoquinas. "Immunomodulation by adjuvants", véase NATO ASI SER.A, 215 (VACCINES), 25-32, 1991.

La identificación y el aislamiento de antígenos de tumores y de antígenos asociados a tumores (TA's) o de péptidos derivados de los mismos (por ejemplo descritos por Wölfel et al., 1994 a) y 1994 b); Carrel et al., 1993, Lehmann et al., 1989, Tibbets et al., 1993, o en las solicitudes internaciones publicadas WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031, WO 95/00159) era la premisa para otra estrategia en la que se utilizan antígenos de tumores como inmunogenes para vacunas contra tumores, a saber tanto en forma de proteínas como también de péptidos. Mediante los trabajos de Boon et al., 1992; Boon et al., 1994; Boon et al., 1995; van Peel et al., 1995; Van der Eynde, 1995; se conoció que melanomas malignos presentan péptidos derivados de antígenos de tumores en el contexto MHC-I. Sin embargo, con una vacuna contra tumores en forma de antígenos de tumores como tales no se alcanzó hasta ahora ninguna inmunogenicidad suficiente como para desencadenar una respuesta inmune celular, tal como la que se requeriría para la eliminación de células tumorales portadoras de un antígeno de tumores (Marchand et al., 1995). Con el fin de conseguir que células presentadoras de antígenos (en inglés "Antigen-presenting cells", "APCs") presenten antígenos de péptidos definidos sobre su superficie, se propuso "pulsar" los péptidos, lo que, sin embargo, dio como resultado una carga ineficaz de las células con péptidos (Tykocinski et al., 1996); se demostró también que la co-aplicación de adyuvantes reforzaba sólo de forma condicionada la respuesta inmune (Oettgen y Old, 1991).

Una tercera estrategia de la inmunoterapia activa para incrementar la eficacia de vacunas contra tumores se basa en células tumorales autólogas xenogenizadas (extrañadas). La suposición de este concepto se basa en que el sistema inmune reacciona sobre células tumorales que expresan una proteína extraña y en que en el transcurso de esta reacción se provoca también una respuesta inmune contra aquellos antígenos de tumores (TA's) que son presentados por las células tumorales de la vacuna.

Un papel central en la regulación de la respuesta inmune específica lo juega un complejo trimolecular consistente en los componentes receptor antigénico de células T, molécula MHC ("complejo principal de histocompatibilidad") y sus ligandos, que es un fragmento de péptido derivado de una proteína.

Las moléculas MHC (o las correspondientes moléculas humanas, las HLA's) son receptores de péptidos que permiten, en el caso de una especificidad restrictiva, la fijación de numerosos diferentes ligandos. La premisa para ello la representan residuos de péptidos específicos de alelos que presentan los siguientes criterios de especificidad: los péptidos tienen, en función del haplotipo de MHC, una longitud definida, en el caso del haplotipo de MHC-I por norma general ocho a diez restos de aminoácidos. Típicamente, dos de las posiciones de aminoácidos representan los denominados "anclajes" que sólo pueden ser ocupados por un único aminoácido o por restos de aminoácidos con cadenas laterales estrechamente relacionadas. La posición exacta de los aminoácidos de anclaje en el péptido y los requisitos exigidos a sus propiedades varían con los haplotipos de MHC. El extremo C de los ligandos de péptidos es a menudo un radical alifático o un radical cargado. Tales residuos de ligandos de péptidos de MHC-I son conocidos hasta ahora, entre otros, para los haplotipos H-2K^{d}, K^{b}, K^{k}, K^{km1}, D^{b}, HLA-A*0201, A*0205 y B*2705.

En el marco de la conversión de proteínas dentro de la célula, productos génicos regulares, degenerados y extraños, por ejemplo proteínas virales o antígenos de tumores, se descomponen en pequeños péptidos; algunos de ellos representan ligandos en potencia para moléculas MHC. Con ello, se da la premisa para su presentación por parte de moléculas MHC y, como consecuencia de ello, el desencadenamiento de una respuesta inmune celular, no habiéndose aclarado todavía en particular la forma en que los péptidos son producidos en la célula en forma de ligandos de MHC. Proteínas extrañas o extrañadas y sus fragmentos pueden también ser reconocidas, fijadas y eliminadas por inmunoglobulinas que representan la respuesta inmune humoral. Esto es válido para todos los antígenos de tumores: en el ejemplo de los antígenos MUC1, CEA y HER2/neu asociados a tumores se ha demostrado que las inmunoglobulinas, que presentan especificidad para estas proteínas, reconocen y pueden exterminar a células portadoras de proteínas. Con el fin de desencadenar una respuesta inmune humoral específica de antígenos de tumores, se sometieron a ensayo por lo tanto diferentes formas de MUC1 y CEA en calidad de inmunogenes (por ejemplo en vectores de viruela recombinantes; Bronte et al., J. Immunol. 154:5282, 1995) en modelos con animales y en ensayos previos clínicos.

En el marco de la presente invención se prosiguió con consideraciones que se establecieron en el desarrollo de una vacuna contra tumores celular; mientras que células corporales normales, no malignas, son toleradas por el sistema inmune, el cuerpo reacciona frente a una célula normal cuando ésta, en virtud de una infección vírica, sintetiza proteínas extrañas al cuerpo con una respuesta inmune. El origen de ello estriba en que las moléculas MHC presentan péptidos extraños que proceden de proteínas extrañas del cuerpo. Como consecuencia de ello, el sistema inmune registra que ha ocurrido algo indeseado, algo extraño con esta célula. APC's (a ellas pertenecen macrófagos, células dentríticas, células de Langerhans, células B, así como, posiblemente, las células bifenotípicas recientemente descubiertas que presentan tanto propiedades de células B como también de macrófagos; Tykocinski et al., 1996) son activadas, se genera una nueva inmunidad específica y la célula se elimina.

Células tumorales contienen ciertamente los respectivos antígenos de tumores específicos de tumores, pero, como tales, son vacunas insuficientes, ya que, en virtud de su escasa inmunogenicidad, son ignoradas por el sistema inmune. Si no se carga una célula tumoral con una proteína extraña, sino con un péptido extraño, entonces son reconocidos como extraños por esta célula, adicionalmente a los péptidos extraños, también los antígenos de tumores propios de la célula. Mediante el extrañamiento con un péptido se puede conseguir que se dirija contra los antígenos de tumores la respuesta inmune celular desencadenada por los péptidos extraños.

El origen de la escasa inmunogenicidad de células tumorales no puede ser un problema cualitativo, sino uno cuantitativo. Para un péptido derivado de un antígeno de tumores, esto puede significar que ese péptido sea presentado ciertamente por moléculas MHC, pero en una concentración que es demasiado escasa como para desencadenar una respuesta inmune celular, específica de tumores. Un aumento del número de péptidos específicos de tumores en la célula tumoral debería determinar, por consiguiente, asimismo un extrañamiento de la célula tumoral que conduce al desencadenamiento de una respuesta inmune celular. Se propuso presentar el antígeno de tumores o el péptido derivado del mismo es presentado sobre la superficie de la célula, debido a que es transfectado con un ADN codificador de la proteína o el péptido correspondientes, tal como se describe en las publicaciones internacionales WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031 y WO 95/00159.

En la solicitud de patente alemana P 195 43 649.0 se da a conocer una vacuna celular que, como componente activo, contiene células tumorales que están cargadas con uno o varios péptidos, de modo que las células tumorales son reconocidas como extrañas por el sistema inmune del paciente en el contexto con los péptidos y desencadenan una respuesta inmune celular. Una característica esencial de los péptidos es que son ligandos para el haplotipo MHC del paciente. Por lo tanto, los péptidos son reconocidos como extraños por el sistema inmune del paciente ya que, por una parte, pueden ser "péptidos extraños" o "xenopéptidos", es decir, se diferencian de péptidos que se derivan de proteínas que son expresadas por células tumorales del paciente. Otra categoría de péptidos se deriva de antígenos de tumores que son expresados por células del paciente. Estos determinan un aumento de la inmunogenicidad, debido a que se encuentran en una concentración en las células tumorales de la vacuna que es mayor que la concentración del mismo péptido en las células tumorales del paciente.

La presente invención se propuso poner a disposición una nueva composición farmacéutica de acción inmunomoduladora, en particular una vacuna.

En el desarrollo del concepto de la vacuna celular dada a conocer en la solicitud de patente alemana P 195 43 649.0 se desarrolló en el marco de la presente invención una composición farmacéutica que contiene péptidos que actúan de forma inmunomoduladora, no en el contexto con células, sino junto con un adyuvante, con el fin de desencadenar o reforzar una respuesta inmune celular y/o humoral, preferiblemente sistémica contra agentes patógenos o una respuesta anti-tumoral, o provocar una tolerancia frente a proteínas que actúan de forma autoinmune.

Sorprendentemente, se comprobó que determinados coadyuvantes, por ejemplo policationes, de los que por primera vez ya en 1965 se pudo demostrar que pueden determinar un aumento del transporte de proteínas en células (Ryser et al., 1965; Ryser et al., 1978; Shen et al., 1981), aumentan la inmunogenicidad de péptidos.

La invención se refiere a una composición farmacéutica que está caracterizada en las reivindicaciones 1 a 14. La composición se caracteriza porque el adyuvante presenta la capacidad de determinar la fijación del péptido o de la proteína o fragmento de proteína a células APC del individuo a tratar o de aumentar la entrada en las células y determinar un refuerzo de la acción inmunomoduladora del péptido o de la proteína o fragmento de pro-
teína.

En lo que sigue, y por motivos de simplicidad, se denominan "péptidos", en general, a representantes de los péptidos, proteínas o fragmentos de proteínas de acción inmunomoduladora. El término "péptido" representa, cuando no se refiera expresamente al ligando, también a fragmentos de proteínas o proteínas mayores de los que se deriva el péptido o representa un producto de degradación celular.

Por "acción inmunomoduladora" se entiende, por una parte, el desencadenamiento o el refuerzo de una reacción inmune celular y/o humoral, preferiblemente sistémica. En esta forma de realización, la composición farmacéutica de acuerdo con la invención actúa como vacuna.

En una forma de realización preferida, los péptidos son ligandos para al menos una molécula MHC que es expresada por el individuo a tratar.

Las moléculas MHC humanas se designan en lo que sigue, de acuerdo con el uso tradicional internacional también como "HLA" (del inglés "Human Leucocyte Antigen", "antígeno de leucocitos humanos").

Por "respuesta inmune celular" se entiende, sobre todo, la inmunidad de células T citotóxica que, como consecuencia de la generación de células T CD8-positivas citotóxicas específicas de tumores y células T cooperadoras CD4-positivas, determina la destrucción de las células atacadas por el agente patógeno.

Por "respuesta inmune humoral" se ha de entender la producción de inmunoglobulinas que reconocen selectivamente estructuras derivadas de agentes patógenos y, como consecuencia, pueden determinar, junto con otros sistemas, tales como por ejemplo el complemento, ADCC (citotoxicidad dependiente de anticuerpos) o la fagocitosis, la destrucción de estas células tumorales o de los agentes patógenos o de las células atacadas por los mismos.

El péptido contenido en la vacuna se deriva de un antígeno o, en el caso de proteínas, representa un antígeno, contra el que se ha de desencadenar una respuesta inmune celular y/o humoral. Con ello, se determina que se generen células T u otras células efectoras citotóxicas que reconocen el agente patógeno de la enfermedad que presentan el antígeno, y/o anticuerpos.

Para la inmunización frente a agentes patógenos de la enfermedad, tales como bacterias, virus, parásitos, se utilizan proteínas o péptidos que representan una proteína del o de los agentes patógenos respectivos o se derivan de ellos. En este caso, son adecuadas, sobre todo proteínas que no son afectadas por la generalmente elevada tasa de mutación de estos agentes patógenos. Ejemplos publicados son HPV16/17 (papilomavirus humano; Feltkamp et al., 1995), antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B (Vitiello et al., 1995), Plasmodium Bergheii (Widmann et al., 1992), nucleoproteína del virus de la influenza, virus de la hepatitis C.

En una forma de realización de la invención, la composición farmacéutica sirve para provocar una tolerancia contra proteínas o sus fragmentos que desencadenan enfermedades inducidas autoinmunológicamente, es decir para la terapia de enfermedades autoinmunes. Los péptidos utilizados en esta forma de realización de la invención se derivan de proteínas que provocan enfermedades autoinmunes.

En contraposición a la aplicación como vacuna contra agentes patógenos en la que los péptidos con un segmento de la proteína origen (proteína del agente patógeno) coinciden esencialmente, de modo que el péptido es reconocido como el "antígeno original", se utilizan en la aplicación de la invención para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, entre otros, péptidos que presentan diferencias críticas con respecto a la secuencia de aminoácidos de la proteína origen. Estos péptidos se fijan ciertamente, en virtud de sus posiciones de anclaje, a la molécula MHC, pero presentan mutaciones en su secuencia que determinan que estos péptidos funcionen como antagonistas que desconectan de nuevo las células T específicas activadas (Kersh y Allen, 1996).

Como antagonistas peptídicos son adecuados tanto antagonistas "naturales" que fueron descubiertos en virus (Bertoletti et al., 1994), como también antagonistas que se encontraron por investigación sistemática, por ejemplo por evaluación de genotecas de péptidos. Un ejemplo de antagonistas de péptidos son péptidos que pueden desconectar células T que son específicas para la proteína básica mielina, y éstos se sometieron a ensayo en cuanto a su actividad en experimentos con animales (Brocke et al. 1996).

Un péptido que ha de desencadenar una respuesta inmune celular se ha de poder fijar a una molécula MHC. Con el fin de que la respuesta inmune sea desencadenada en el paciente, el individuo a tratar debe presentar, por consiguiente, una correspondiente molécula HLA en su repertorio. La determinación del subtipo HLA del paciente representa, por lo tanto, en relación con el desencadenamiento de una respuesta inmune celular, una de las premisas esenciales para la aplicación eficaz de un péptido en este paciente.

El subtipo HLA del paciente se puede determinar con métodos estándares, tales como el ensayo de micro-linfotoxicidad (Practical Immunol., 1989). Este ensayo se basa en el principio de mezclar linfocitos aislados de la sangre del paciente primeramente con antisuero o un anticuerpo monoclonal contra una determinada molécula HLA en presencia de complemento de conejo (C). Las células positivas son usadas y absorben un colorante indicador, mientras que las células no dañadas permanecen sin teñir.

Para la determinación del haplotipo HLA-I o HLA-II de un paciente se puede recurrir también al RT-PCR ("Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction" - reacción en cadena de transcriptasa inversa-polimerasa) (Curr. Prot. Mol. Biol. Capítulos 2 y 15). Para ello, se extrae sangre de un paciente y de ella se aísla ARN. Este ARN se somete primeramente a una transcripción inversa, con lo que se forma ADNc del paciente. El ADNc sirve como matriz para la reacción en cadena de polimerasa con pares de cebadores que determinan específicamente la amplificación de un fragmento de ADN que representa un determinado haplotipo HLA. Si después de electroforesis en gel de agarosa aparece una banda de ADN, el paciente expresa la correspondiente molécula HLA. Si no aparece la banda, el paciente es negativo para ello.

La definición de un péptido utilizado de acuerdo con la invención por parte de una molécula HLA determina a éste en relación con sus aminoácidos de anclaje y su longitud; posiciones de anclaje y una longitud definidas garantizan que un péptido pueda introducirse en el surco de fijación del péptido de la respectiva molécula HLA del paciente. Esto tiene como consecuencia que el sistema inmune es estimulado y que se genera una reacción inmune celular que, en el caso de la utilización de un péptido derivado de un antígeno de tumores, se orienta contra las células tumorales del paciente.

Péptidos que son adecuados para la aplicación en el marco de la presente invención están disponibles en una amplia anchura de banda. Su secuencia puede derivarse de proteínas inmunógenas que se presentan en la naturaleza o de sus productos de degradación celulares, por ejemplo de péptidos víricos o bacterianos, de antígenos de tumores, o pueden ser antagonistas a péptidos que se derivan de proteínas que inducen enfermedades autoinmunes.

Péptidos adecuados pueden elegirse, por ejemplo, en base a secuencias peptídicas conocidas por la bibliografía.

En relación con el desencadenamiento de una respuesta inmune celular, los péptidos pueden definirse, por ejemplo, con ayuda de los péptidos descritos por Rammensee et. al. 1993, Rammensee et al., 1995, Falk et al., 1991 para los diferentes residuos de HLA, derivados de proteínas inmunógenas de distinto origen, que se adaptan en los surcos de fijación de las moléculas de los respectivos subtipos HLA.

Para péptidos que presentan una secuencia parcial de una proteína con efecto inmunógeno, se puede establecer, con ayuda de las secuencias polipeptídicas ya conocidas o eventualmente todavía por determinar, mediante comparación de las secuencias teniendo en cuenta los requisitos específicos de HLA, qué péptidos representan candidatos adecuados. Ejemplos de péptidos adecuados se encuentran, por ejemplo, en Rammensee et al., 1993, Falk et al., 1991, y Rammensee, 1995; así como en el documento WO 91/09869 (péptidos de VIH); péptidos derivados de antígenos de tumores se describieron, entre otros, en las solicitudes de patente internacionales publicadas WO 95/00159, WO 94/05304. Se hace referencia a la divulgación de estas citas bibliográficas y de los artículos citados en ellas con relación con péptidos. A candidatos preferidos pertenecen péptidos cuya inmunogenicidad ya se demostró, es decir, péptidos que se derivan de inmunogenes conocidos, por ejemplo proteínas víricas o bacterianas.

En lugar de utilizar los péptidos originales que se adaptan a los surcos de fijación de moléculas MHC-I o MHC-II, es decir péptidos que se derivan sin modificar de proteínas naturales, se pueden efectuar variaciones, con ayuda de los requisitos mínimos indicados en base a la secuencia peptídica original en relación con las posiciones de anclaje y la longitud, siempre que estas variaciones no perjudiquen, sino que, preferiblemente, refuercen la inmunogenicidad eficaz del péptido que se compone de su afinidad de fijación a la molécula MHC y de su capacidad para estimular receptores de células T. Por lo tanto, en este caso se utilizan péptidos artificiales de acuerdo con la invención que han sido desarrollados de manera correspondiente a los requisitos de la capacidad de fijación a una molécula MHC. Así, por ejemplo partiendo de ligandos H2-K^{d} Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe IIe (LFEAIEGFI) pueden modificarse los aminoácidos que no representan aminoácidos de anclaje, con el fin de obtener el péptido con la secuencia Phe Phe Ile Gly Ala Leu Glu Glu Ile (FFIGALEEI); además, el aminoácido de anclaje Ile en la posición 9 puede ser reemplazado por Leu. La determinación de epítopos de ligandos MHC-I o MHC-II o de sus variaciones puede efectuarse por ejemplo según el principio descrito por Rammensee et al., 1995. La longitud del péptido corresponde, en el caso de su adaptación a moléculas MHC-I, preferiblemente a una secuencia mínima de 8 a 10 aminoácidos con los aminoácidos de anclaje necesarios. El residuo de fijación de MHC-II, que se prolonga a lo largo de nuevos aminoácidos, presenta un mayor grado de degeneración en las posiciones de anclaje. Recientemente, se desarrollaron métodos partiendo del análisis estructural por rayos X de moléculas MHC-II, que permiten el análisis exacto del residuo de fijación de MHC-II y, partiendo
del mismo, variaciones de la secuencia peptídica (Rammensee et al., 1995, y la bibliografía original allí citada).

Eventualmente, el péptido también se puede prolongar en el extremo C y/o en el extremo N, siempre que esta prolongación no perjudique la capacidad de fijación a la molécula MHC o que el péptido prolongado pueda procesarse de forma celular a la secuencia mínima.

En una forma de realización de la invención, el péptido está cargado negativamente. En esta forma de realización, el péptido puede prolongarse con aminoácidos cargados negativamente, o en el péptido pueden incorporarse aminoácidos cargados negativamente, preferiblemente en posiciones que no son necesarias para el reconocimiento por parte de CTL's específicos o como aminoácidos de anclaje, con el fin de conseguir una fijación electrostática del péptido a un adyuvante policatiónico, tal como polilisina.

En una forma de realización de la invención, el antígeno no se emplea en forma de un péptido, sino como proteína o fragmento de proteína o como mezcla de proteínas o fragmentos de proteínas. En el marco de la presente invención son adecuados fragmentos de proteínas mayores o proteínas completas, de los que se garantiza que, después de la aplicación, sean procesadas por las APC's del paciente para dar péptidos que se adaptan a la molécula
MHC.

La proteína representa un antígeno del que se derivan los fragmentos obtenidos después del procesamiento. En esta forma de realización, el adyuvante sirve para posibilitar o reforzar la carga ("transcarga") de células, en particular APC's tales como células dendríticas o macrófagos con el o los fragmentos. Las proteínas o los fragmentos de proteínas así absorbidos son procesados por las células y después pueden ser presentados, en el contexto de MHC, a las células inmunoefectoras y, por consiguiente, desencadenar o reforzar una respuesta inmune (Braciale y Braciale, 1991; Kovacsovics Bankowski y Rock, 1995; York y Rock, 1996).

La forma de realización de la invención, en la que se emplean proteínas o fragmentos de proteínas mayores como antígenos, tiene la ventaja de que existe una menor dependencia por parte del paciente del tipo HLA, ya que la proteína se procesa en varios fragmentos, por consiguiente, se da una mayor variabilidad en relación con la "forma adaptada" de los péptidos.

En el caso de la administración de proteínas o fragmentos de proteínas se puede detectar la identidad del producto final procesado mediante análisis químico (degradación de Edman o espectrometría de masas de fragmentos procesados; véase el artículo perspectivo de Rammensee et al., 1995, así como la bibliografía original en él citada) o análisis biológicos (capacidad de las APC's para la estimulación de células T que son específicas para los fragmentos procesados).

La elección de candidatos de péptidos que son adecuados para desencadenar una respuesta inmune celular se efectúa en principio en varias etapas: en general, los candidatos, convenientemente en ensayos en serie, se someten primero a ensayo en un ensayo de fijación de péptidos en cuanto a su capacidad de fijación a una molécula MHC.

Un método de investigación adecuado para ello se basa en la capacidad de péptidos de poder estabilizar moléculas MHC vacías, tal como se describe por ejemplo por Stuber et al., 1994, y Mclntyre et al., 1996. En este caso, el péptido se aplica sobre células que están capacitadas para expresar la respectiva molécula MHC, pero que, debido a un defecto genético, no fijan ningún péptido endógeno en el contexto de MHC. Líneas de células adecuadas de este tipo son RMA-S (de ratón) y T2 (humana) o sus variantes transfectadas. Entonces, sólo se pueden detectar las moléculas MHC estabilizadas por el respectivo péptido, preferiblemente mediante el análisis FACS que se basa en la citometría de flujo (Flow Cytometry, 1989; FACS Vantage^{R} User's Guide, 1994; CELL Quest^{R} User's Guide, 1994). Moléculas MHC estables se detectan con un anticuerpo anti-MHC adecuado y con un segundo anticuerpo (por ejemplo policlonal) marcado con un colorante de fluorescencia, por ejemplo FITC (isotiocianato de fluoresceína). Durante su paso, las células individuales son excitadas entonces por un láser de una determinada longitud de onda; se mide la fluorescencia emitida y depende de la cantidad de péptido fijada a la célula.

Otro método para la determinación de la cantidad de péptido fijada es el gráfico de Scatchard, tal como se describe por Sette et al., 1994. Para ello, se utiliza el péptido que está por ejemplo marcado con I^{125}, y se incuba durante una noche con moléculas MHC aisladas o preparadas por vía recombinante a 4ºC con diferentes concentraciones definidas de péptido. Para la determinación de la interacción inespecífica del péptido se añade a algunas muestras un exceso de péptido no marcado, que impide la interacción no específica del péptido marcado. A continuación, se retira el péptido fijado de manera no específica, por ejemplo mediante cromatografía en gel. La cantidad del péptido fijado se determina entonces en un contador de centelleo con ayuda de la radiactividad emitida. La valoración de los datos así obtenidos se efectúa según métodos estándares.

Una perspectiva sobre métodos para la caracterización de la interacción MHC/péptido, el análisis de ligandos de MHC y ensayos de fijación de péptidos que se pueden utilizar en el marco de la presente invención, se proporcionó por Rammensee et al., 1995.

En una siguiente etapa se examinan candidatos de péptidos con buenas cualidades de fijación en cuanto a su imunogenicidad:

El desencadenamiento de una respuesta inmune celular puede confirmarse mediante la detección de CTL's específicas de péptidos, por ejemplo mediante el método descrito en Current Protocols in Immunology, Capítulo 3, o von Blomberg et al., 1993. Otra prueba para la presencia de una respuesta inmune celular se da cuando en ausencia de células T en un animal de ensayo (que se consigue tratando al animal con anticuerpos que agotan a células CD4 o CD8) no se manifiesta ninguna respuesta inmune (Current Protocols in Immunology, Capítulo 3).

Una respuesta inmune celular también se puede mostrar en animales inmunizados mediante la detección de una reacción (DTH) "hipersensibilidad de tipo retardado". Para ello, se pueden inyectar péptidos en la planta de la pata de ratones, tras lo cual se mide la hinchazón del lugar inyectado (Grohman et al., 1995; Puccetti et al., 1994).

La inducción de una respuesta inmune humoral por parte de péptidos, que son antígenos extraños para el organismo o bien antígenos que son expresados en menor concentración por el organismo a tratar, se puede determinar mediante la detección de anticuerpos específicos en el suero. Un método adecuado para la determinación del título de anticuerpos en el suero es el análisis con enzima unida a inmunosorbente (ELISA). En este caso, los anticuerpos específicos se detectan, después de la fijación al péptido utilizado para la inmunización, con una reacción de color. Un método alternativo es la transferencia Western. En este caso, anticuerpos del suero específico se fijan al péptido inmovilizado sobre una membrana. Los anticuerpos fijados se detectan por último de nuevo con una reacción de color (referencia para los dos métodos: Current Protocols in Immunology. Editores: Coligan et al., 1991).

Ante todo después de la vacunación con antígenos extraños, por ejemplo de origen viral, se ha de esperar una formación de anticuerpos.

El desencadenamiento de una respuesta inmune celular por parte de péptidos que se derivan de proteínas, cuyo efecto inmunógeno es desconocido, se puede por ejemplo ensayar tal como se describe por Rivoltini et al. 1995, o Kawakami et al 1994a. Para ello, se requieren células T que puedan reconocer el péptido deseado cuando es presentado por las moléculas MHC. En el caso de péptidos extraños, células T de este tipo se obtienen análogamente a partir de la sangre periférica. Las células T son incubadas con líneas de células tales como T2 (Alexander et al., 1989) o RMA-S (Kärre et al., 1986), que han sido mezcladas con el respectivo péptido y lisan a éstas en el caso de que se trate de un péptido inmunógeno.

Otra posibilidad para el ensayo de candidatos de péptidos fijadores de MHC en cuanto a su inmunogenicidad consiste en investigar la fijación de los péptidos a células T2. Un ensayo de este tipo se basa en la particularidad de células T2 (Alexander et al., 1989) o células RMA-S (Kärre et al., 1986) de ser defectuosas en el mecanismo de transporte de péptidos TAP y sin presentar establemente moléculas MHC cuando sobre ellas se aplican péptidos que son presentados en el contexto de MHC. Para el ensayo se utilizan por ejemplo células T2 o células RMA-S que son transfectadas de forma estable con un gen HLA, por ejemplo con genes HLA-A1 y/o HLA-A2. Si las células se mezclan con péptidos que son buenos ligandos de HLA, presentándose en el contexto de HLA de modo que puedan ser reconocidas como extrañas por el sistema inmune, péptidos de este tipo determinan que las moléculas HLA aparezcan en cantidad importante sobre la superficie de la célula. La detección de las HLA's sobre la superficie de la célula, por ejemplo mediante anticuerpos monoclonales, permite la identificación de péptidos adecuados (Malnati et al., 1995; Sykulev et al., 1994). También en este caso se utiliza convenientemente un péptido estándar con una buena capacidad de fijación a HLA conocida.

En relación con una aplicabilidad lo más amplia posible de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención se utiliza convenientemente una mezcla de varios péptidos, de los que cada uno se puede fijar a una molécula MHC diferente, preferiblemente a uno de dos o de tres de los subtipos MHC más frecuentemente representados. Con una vacuna basada en una mezcla de péptidos que pueden fijarse a estos haplotipos, se puede abarcar una amplia población de pacientes.

En una forma de realización de la invención, la vacuna puede presentar varios péptidos de frecuencia diferente. Los péptidos utilizados se pueden diferenciar en este caso, por una parte, debido a que se fijan a diferentes subtipos HLA. Con ello, se puede conseguir que se puedan abarcar varios o todos los subtipos HLA de un paciente o de un mayor grupo de pacientes.

Otra variabilidad, eventualmente adicional, en relación con los péptidos utilizados puede consistir en que los péptidos que se fijan a un determinado subtipo HLA, se diferencian con relación a su secuencia no determinante para la fijación a HLA, debido a que se derivan por ejemplo de diferentes proteínas del mismo agente patógeno o de diferentes agentes patógenos. De una variabilidad de este tipo se puede alcanzar un refuerzo de la estimulación de la respuesta inmune o una inmunización frente a diferentes agentes patógenos.

La cantidad de péptido activo en la composición de acuerdo con la invención puede variar en un amplio intervalo. La cantidad de péptido depende, entre otros, del tipo de administración y de la respectiva formulación. La cantidad de péptido a administrar puede ascender a aproximadamente 1,0 \mug hasta aproximadamente 5.000 \mug por dosis, por lo general 1,0 \mug hasta aproximadamente 1.000 \mug, en particular aproximadamente 10 \mug hasta aproximadamente. 500 \mug. La administración se puede efectuar una o varias veces, y en el caso de la administración durante varias veces, convenientemente al menos durante tres veces. En particular, en la aplicación terapéutica puede efectuarse una aplicación a intervalos, (por ejemplo de 1 vez por semana hasta 1 vez al mes) a lo largo de un espacio de tiempo arbitraria-
mente largo, que está condicionado por el estado inmune específico del paciente o por el transcurso de la enfermedad.

La composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede aplicarse también ex vivo: el principio de una posible aplicación ex vivo estriba en cultivar APC's, por ejemplo células dendríticas, ex vivo, incubar el cultivo de células con la composición de acuerdo con la invención y administrar al individuo a tratar las APC's que ahora presentan el péptido en el contexto de MHC. Para esta posibilidad de aplicación pueden utilizarse métodos conocidos por la bibliografía, tal como se describen por ejemplo por Porgador y Gilboa, 1995; Young e Inabe, 1996.

El adyuvante contenido en la composición de acuerdo con la invención tiene la propiedad de facilitar la entrada del péptido en las células o la fijación del péptido a las células del paciente y de reforzar la inmunogenicidad del péptido. El adyuvante puede permeabilizar, al menos durante un breve espacio de tiempo, por ejemplo las membranas de células dianas, a las que ha de acceder el péptido, con el fin de transportar de este modo el péptido a la célula. Para ello, debería ser ventajoso, pero no absolutamente necesario, el que el péptido se fije al adyuvante, por ejemplo a través de una interacción electrostática entre el péptido electronegativo y el adyuvante policatiónico. También se puede determinar una importación del péptido a la célula debido a que el péptido, en virtud de su proximidad en el espacio a la membrana celular, pueda penetrar a través de ésta tan pronto como el adyuvante haya determinado su permeabilidad. La acción del adyuvante también puede basarse en que éste aumenta la concentración del péptido en la superficie celular, crítica para la absorción en la célula, o que determine la fagocitosis o el transporte de líquido (pinocitosis) del péptido en la célula.

Sorprendentemente, la presencia del adyuvante de acuerdo con la invención no sólo refuerza la absorción del péptido a la célula, sino que resulta también en un refuerzo del efecto inmunomodulador del péptido que debería atribuirse a una correcta presentación del péptido por parte de moléculas MHC.

El adyuvante de acuerdo con la invención es un poliaminoácido de carácter básico.

El grado de polimerización de los poliaminoácidos puede variar a lo largo de un amplio intervalo. Asciende a aproximadamente 5 hasta aproximadamente 1000, en particular a aproximadamente 15 hasta aproximadamente 500.

Preferiblemente, en el marco de la presente invención se utiliza poliarginina como adyuvante.

Con el fin de investigar el mecanismo del transporte de péptidos inducido por poliaminoacidos de carácter básico, en el marco de la presente invención se midió la liberación de lactato-deshidrogenasa (LDH). Mientras que en muestras tratadas con poliarginina las concentraciones de LDH liberada no eran prácticamente detectables, después de la incubación con polilisina se detectaron en los materiales sobrenadantes de las células elevadas concentraciones de LDH. Estos resultados permiten sacar la conclusión de que la actividad de polilisina podría atribuirse a una permeabilización de la membrana celular.

Sin desear estar ligados por la teoría, el efecto de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención debería estribar en que el péptido penetra en las células dianas con ayuda del adyuvante o se fija a células que se presentan en la zona endodérmica de la piel. Células dianas son, entre otras, células presentadoras de antígenos de las que el péptido, eventualmente después del procesamiento, es presentado a las células B y/o T. Ejemplos de células dianas son macrófagos, fibroblastos, queratinocitos, células de Langerhans, células dendríticas o células B.

En el marco de la presente invención se investigó si péptidos pequeños en presencia de poliaminoacidos de carácter básico o formas glicosiladas de policatión son absorbidos en medida reforzada por células presentadoras de antígenos (APC's) a modo de macrófagos. De los restos de azúcar utilizados se sabe que son absorbidos por macrófagos a través de endocitosis inducida por receptor. (De las APC's se supone que, in vivo, representan el tipo de célula que absorbe los péptidos y les presenta a otras células inmunes. Resultados de ensayo in vitro que muestran que las APC's endocitan, en presencia de los adyuvantes sometidos a ensayo, cantidades incrementadas de antígenos de péptidos, son una indicación de que estos adyuvantes son también adecuados in vivo para reforzar la presentación de los péptidos con respecto a las células efectoras citotóxicas así como su activación, lo que conduce a una respuesta inmune en conjunto reforzada contra la diana contenida en la vacuna).

El ensayo de adyuvantes puede efectuarse en principio según los mismos métodos que el ensayo de los péptidos, eventualmente en varias etapas:

La capacidad de un adyuvante de aumentar la fijación y/o internalización de un péptido en APC's puede medirse, por ejemplo, en una primera etapa, incubando APC's con péptidos marcados fluorescentemente y adyuvante. Una absorción o fijación incrementada, determinada por el adyuvante, puede determinarse mediante citometría de flujo por comparación con células que se mezclaron sólo con péptidos.

En una segunda etapa, los adyuvantes a ensayar se pueden investigar in vitro si y en que medida resulta su presencia en una presentación de un péptido sobre APC's, pudiéndose medir, según los métodos descritos antes para el ensayo de los péptidos, la concentración de MHC sobre las células.

Otra posibilidad para ensayar la eficacia de un adyuvante es el empleo de uno en un sistema modelo in vitro. En este caso, se incuban APC's junto con adyuvante y péptido y se mide la activación relativa de un clon de células T que reconoce específicamente el péptido utilizado (Coligan et al., 1991; López et al., 1993).

La eficacia de la formulación también se puede demostrar en animales inmunizados a través de la respuesta inmune celular mediante la detección de una reacción de (DTH) "hipersensibilidad de tipo retardado".

Por último, el efecto inmunomodulador de la formulación se mide en un ensayo con animales. Para ello, pueden emplearse, entre otros, modelos de tumores establecidos en los que son conocidas secuencias peptídicas reconocidas por células inmunes. La vacuna, que contiene péptido y adyuvante, se aplica en relaciones variables referidas al péptido a adyuvante y cantidad total. La protección del desarrollo de tumores es una medida para la eficacia de una vacuna contra tumores.

La composición farmacéutica puede administrase por vía parenteral, tópica, oral o local. Preferiblemente, se administra por vía parenteral, por ejemplo subcutánea, intradermal o intramuscular, preferiblemente por vía subcutánea o intradermal, con el fin de acceder, sobre todo, a células de la piel (queratinocitos, fibroblastos), células dendríticas, células de Langerhans o macrófagos como células dianas. En el marco de una terapia de tumores, la vacuna contra tumores también se puede administrar por vía intratumoral.

La composición de acuerdo con la invención para la administración parenteral se encuentra, por lo general, en forma de solución o suspensión del péptido y del adyuvante en un soporte farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un soporte acuoso. Como soportes acuosos pueden utilizarse por ejemplo agua, agua tamponada, solución salina (al 0,4%), solución de glicina (al 0,3%), ácido hialurónico y soportes conocidos similares. Junto a soportes acuosos también se pueden utilizar disolventes, tales como dimetilsulfóxido, propilenglicol, dimetilformamida y mezclas de los mismos. Además, la composición puede contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como sustancias tampón, así como sales inorgánicas con el fin de conseguir una presión osmótica normal y/o una liofilización eficaz. Ejemplos de aditivos de este tipo son sales de sodio y potasio, por ejemplo cloruros y fosfatos, sacarosa, glucosa, hidrolizados de proteínas, dextrano, polivinilpirrolidona o polietilenglicol. Las composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas habituales, por ejemplo mediante filtración en condiciones estériles. La composición puede envasarse de esta forma directamente o también liofilizarse y mezclarse antes del uso con una solución estéril.

En una forma de realización, la composición farmacéutica de acuerdo con la invención se encuentra en forma de una formulación tópica, por ejemplo para la aplicación dermal o transdermal. La composición farmacéutica puede presentarse por ejemplo en forma de hidrogel sobre una base de ácido poliacrílico o poliacrilamida (tal como por ejemplo Dolobene^{R}, Merckle), como pomada, por ejemplo con polietilenglicol (PEG) como vehículo, tal como la pomada estándar DAB 8 (50% de PEG 300, 50% de PEG 1500) o como emulsión, sobre todo como microemulsión a base de agua en aceite o aceite en agua, eventualmente también con adición de liposomas. Como aceleradores de la permeación ("agentes de arrastre") son adecuados, entre otros, derivados de sulfóxido, tal como dimetilsulfóxido (DMSO) o decilmetilsulfóxido (decil-MSO), así como transcutol (dietilenglicolmonoetiléter) o ciclodextrinas, y además pirrolidonas, por ejemplo 2-pirrolidona, N-metil-2-pirrolidona, ácido 2-pirrolidona-5-carboxílico o la N-(2-hidroxietil)-2-pirrolidona biológicamente degradable y sus esteres de ácidos grasos, derivados de urea, tales como dodecilurea, 1,3-didodecilurea y 1,3-difenilurea, terpenos, por ejemplo D-limoneno, mentona, a-terpinol, carvol, óxido de limoneno ó 1,8-cineol.

Otras formas de aplicación son aerosoles, por ejemplo para la administración en forma de atomizador para la nariz o para la inhalación.

La composición de acuerdo con la invención también se puede administrar mediante liposomas que pueden presentarse en forma de emulsiones, espumas, micelios, monocapas insolubles, dispersiones de fosfolípidos, capas lamelares y similares. Estas sirven como vehículo con el fin de transportar de forma dirigida a los péptidos a un tejido determinado, por ejemplo el tejido linfoide o tejido tumoral, o bien prolongar el tiempo de semidesintegración de los péptidos.

En el caso de la presencia de la composición de acuerdo con la invención como una formulación tópica, ésta también puede contener absorbedores de UV, para actuar, por ejemplo, en la aplicación profiláctica contra melanoma, al mismo tiempo como agente protector solar.

El experto en la materia puede deducir sustancias auxiliares y formulaciones adecuadas de obras estándares, tales como "Remington's Pharmaceutical Sciences", 1990.

Perspectiva de figuras

Fig. 1: Vacunación de ratones DBA/2 contra mastocitoma P815 con péptido KYQAVTTTL

Fig. 2: Vacunación de ratones DBA/2 contra mastocitoma P815 con péptido SYFPEITHI

Fig. 3: Vacunación de ratones DBA2 contra mastocitoma P815 con péptido SYFPEITHI

Fig. 4: Vacunación de ratones DBA/2 contra melanoma M-3 con una mezcla de péptidos

Fig. 5: Vacunación de ratones DBA/2 contra melanoma M-3 mediante aplicación tópica

Fig. 6: Vacunación de ratones DBA/2 contra metástasis de melanoma M-3

Fig. 7: Curación de ratones portadores de micrometástasis M-3 después de vacunación con una mezcla de péptidos

Fig. 8: Carga inducida por polilisina de células con tirosinasa

Fig. 9: Activación de células T después de la vacunación en un modelo terapéutico (liberación de IFN-\gamma de células del bazo de animales vacunados como reacción sobre células M-3)

Fig. 10: Inducción de la inmunidad antiviral mediante el péptido de la nucleocápsida de la influenza ASNENMETM y polilisina fucosilada como adyuvante (activación de CTL)

Fig. 11: Refuerzo de la fijación de péptidos a APC's mediante poliaminoácidos de carácter básico

Fig. 12: Permeabilización de la membrana celular mediante poliaminoácidos de carácter básico (liberación de LDH después del tratamiento de células con polilisina o poliarginina)

Fig. 13: Internalización de los péptidos mediante poliarginina

Fig. 14: Transporte de péptidos en células presentadoras de antígenos de la médula ósea

Fig. 15: Aumento del transporte de péptidos en células presentadoras de antígenos mediante poliaminoácidos policatiónicos e histonas

Fig. 16: Eficacia del transporte en función del grado de polimerización de aminoácidos de carácter básico

Fig. 17: Transporte de péptidos con poliargininas de bajo peso molecular

Fig. 18: Influencia de la eficacia del transporte en función de la carga del péptido.

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En los siguientes ejemplos se utilizaron, si no se indica otra cosa, los siguientes materiales y métodos:

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A) Células a) Líneas de células

La línea de células de melanoma de ratón Cloudman S91 (clon M-3; ATCC nº CCL 53.1), la línea de células de mastocitoma P815 (ATCC nº TIB 64) y la línea de células de monocitos-macrófagos P388D1 (ATCC TIB 63) se adquirieron de ATCC. Las células se cultivaron en medio DMEM con un elevado contenido en glucosa ("High Glucose DMEM", Life Technologies), completado con FCS al 10%, L-glutamina 2 mM y 20 \mug/ml de gentamicina. Las células se sometieron a ensayo rutinariamente en cuanto a la carencia de contaminación por micoplasmas (estuche de detección de micoplasmas por PCR, Stratagene).

La líneas de células RMA/S murínica (linfoma de ratón) se describió por Kärre et al., 1986 y por Ljunggren et al., 1990.

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b) Células presentadoras de antígenos de la médula ósea

Primeramente, se lavaron los fémures de ratones DBA/2. Las células de la médula ósea se cultivaron en medio DMEM con elevado contenido en glucosa, que contenía FCS al 10%, suero de caballo al 5%, L-glutamina 2 mM y 20 \mug/ml de gentamicina en presencia de 200 unidades/ml de GM-CSF de ratón (Li et al., 1989; Genzyme, Cambridge, MA, EE.UU.). Durante los primeros cinco días se cambiaron cada 24 h dos tercios del medio con el fin de separar granulocitos no adherentes y células B (Inaba et al., 1992). Tanto las células adherentes como también las células que se adhieren sueltas se recolectaron entre los días 8 y 10 mediante incubación con PBS/EDTA 5 mM y se sembraron con una densidad de células de 3 x 10^{4} células por pocillo en portaobjetos de microscopio de 8 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca). Más del 90% de las células mostró una reacción positiva con el anticuerpo F4/80 (Endogen, Cambridge, MA, EE.UU.).

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B) Síntesis de péptidos

Los péptidos se sintetizaron en un sintetizador de péptidos (modelo 433 A con monitor de retroalimentación, Applied Biosystems, Foster City, Canadá) con empleo de TentaGel S PHB (Rapp, Tübingen) como fase sólida según el método Fmoc (activación con HBTU, Fastmoc^{R}, escala 0:25 mmol). Los péptidos se disolvieron en TEAA 1 M, pH 7,3 y se purificaron mediante cromatografía inversa en una columna Vydac C 18. Las secuencias se confirmaron mediante espectrometría de masas en tiempo volátil sobre un Lasermat MAT (Finnigan, San José, Canadá).

C) Lista de los péptidos utilizados

1

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Mezclas de péptidos

\quad: Mezcla de péptidos I para la vacuna de melanoma M-3: kpep143, kpep145, kpep146, kpep150.

\quad: Mezcla de péptidos III para la vacuna de mastocitoma P815: kpep117, kpep118, Kpep162, Kpep163, Kpep164

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D) Preparación de las vacunas D1) Vacunas con un solo péptido

a): Se prepararon vacunas testigo con un solo péptido sin coadyuvante, absorbiendo el péptido en una concentración de 1 mg/ml en PBS. El tiempo de incubación hasta la inyección ascendió a 4 h a la temperatura ambiente.

b): Se prepararon vacunas con un solo péptido con polilisina (si en lo que sigue no se indica otra cosa, se utilizó polilisina de una longitud de cadena de 200) como coadyuvante, mezclando el péptido y la polilisina en las cantidades indicadas en HBS. El tiempo de incubación hasta la inyección ascendió a 4 h a la temperatura ambiente.

i): Con el fin de obtener una vacuna con un contenido de 16 \mug de péptido activo, se mezclaron 11,8 \mug de polilisina con 160 \mug de péptido kpep117 en un volumen total de 1 ml.

ii): Con el fin de obtener una vacuna con un contenido de 100 \mug de péptido activo, se mezclaron 74 \mug de polilisina con 1 mg de péptido kpep117 en un volumen total de 1 ml de HBS.

c): Se prepararon vacunas testigo con un solo péptido con adyuvante incompleto de Freund (IFA) emulsionando el péptido e IFA en las cantidades indicadas. El tiempo de incubación hasta la inyección ascendió a 30 min a la temperatura ambiente.

i): Para una vacuna testigo, que contenía 16 \mug de péptido activo, se emulsionaron 192 \mug de péptido kpep117 en 600 /xl de HBS con 600 \mul de IFA.

ii): Para una vacuna testigo, que contenía 100 \mug de péptido activo, se emulsionaron 1,2 mg de péptido kpep117 en 600 \mul de HBS con 600 \mul de IFA.

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D2) Mezclas de péptidos como vacuna

a): Mezcla de péptidos I como vacuna testigo sin adyuvante contenía 250 /xg de cada uno de los péptidos kpep143, kpep145, kpep146, kpep150 en un volumen total de 1 ml de PBS.

b): Mezcla de péptidos III como vacuna testigo sin adyuvante contenía 250 \mug de cada uno de los péptidos kpep117, kpep118, Kpep162, Kpep163, Kpep164 en un volumen total de 1 ml de PBS.

c): Se preparó la mezcla de péptidos I como vacuna con polilisina como adyuvante, mezclando 1 mg de mezcla de péptidos I (que contenía 250 \mug de cada péptido) con 74 \mug de polilisina en HBS. El tiempo de incubación hasta la inyección ascendió a 4 h a la temperatura ambiente.

d): Se preparó la mezcla de péptidos III como vacuna con polilisina como adyuvante, mezclando 1,25 mg de la mezcla de péptidos III (que contenía 250 \mug de cada péptido) con 93 \mug de polilisina en HBS. El tiempo de incubación hasta la inyección ascendió a 4 h a la temperatura ambiente.

e): Se preparó la mezcla de péptidos I como vacuna testigo con adyuvante incompleto de Freund, emulsionando 1,2 mg de la mezcla de péptidos I en 600 \mul de HBS (que contenía 300 \mug de cada péptido) con 600 /xl de IFA. El tiempo de incubación hasta la inyección ascendió a 30 min a la temperatura ambiente.

f): Se preparó la mezcla de péptidos III como vacuna testigo con adyuvante incompleto de Freund, emulsionando 1,5 mg de la mezcla de péptidos III en 600 \mul de HBS (que contenía 300 \mug de cada péptido) con 600 \mul de IFA. El tiempo de incubación hasta la inyección ascendió a 30 min a la temperatura ambiente.

g): Para la administración tópica con polilisina como adyuvante se incubaron 1 mg de la mezcla de péptidos I (que contenía 250 \mug de cada péptido) con 74 \mug de polilisina durante 4 h en un volumen total de 400 \mul de HBS. La mezcla obtenida se incorporó con agitación en 1,6 g del hidrogel DOLOBENE (Merckle).

h): Para la administración tópica de una vacuna testigo sin adyuvante se incorporaron con agitación 1 mg de la mezcla de péptido I (que contenía 250 \mug de cada péptido) en un volumen total de 200 \mul de HBS en 1,8 g del hidrogel DOLOBENE (Merckle).

i): La preparación de polilisina acoplada a fucosa (longitud de cadena: 240 ó 200) se efectuó según el método descrito por MacBroom et al., 1992, lográndose una sustitución de aproximadamente el 40% (los materiales de partida \beta-fucopiranosilfenil-isotiocianato y polilisina se adquirieron de Sigma).

j): Cuando se utilizaron conjugados de transferrina/polilisina (preparados como se describe en el documento WO 93/07283), la cantidad se ajustó de modo que la cantidad absoluta de polilisina fuese 75 \mug por mg de péptido. Cuando se integró ADN de plásmido (plásmido vacío pSP65, exento de LPS, Boehringer Mannheim) en los complejos, la relación ascendió a 37,5 \mug de ADN/75 \mug de polilisina/1 mg de péptido. En el caso de utilizar 160 \mug en lugar de 1 mg de péptido, las cantidades de los otros componentes se redujeron en el mismo factor (6,25).

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E) Inyección de la vacuna

Antes de la inyección subcutánea, los ratones se anestesiaron en grupos de hasta ocho animales en una cámara de aire aislada. Después de un tratamiento con Halothan durante 3,5 min (4% en O_{2}, caudal 4), los ratones se mantuvieron anestesiados durante aproximadamente 1 min; en este tiempo, se les inyectó subcutáneamente la vacuna.

La inyección intraperitoneal se efectuó sin anestesia previa. El volumen de inyección fue para cada vacuna de 100 \mul por animal, lo que corresponde a 100 \mug de péptido individual o de mezcla de péptidos I por animal. En el caso de la mezcla de péptidos III, se aplicaron 125 \mug de la cantidad de péptidos total por ratón.

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F) Aplicación tópica de la vacuna

Por ratón se untaron 200 mg de pomada, que contenían 100 \mug de péptido o la mezcla de péptidos I o bien 125 \mug de la mezcla de péptidos I en la piel de los animales rasurados, a saber en todo el dorso y en las orejas. La cantidad correcta se calculó con una balanza.

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G) Aplicación de la vacuna contra el desarrollo de tumores en el modelo con ratones

El protocolo del ensayo de la actividad de la vacuna contra el cáncer en el modelo con ratones profiláctico o en el terapéutico correspondía, si no se indica otra cosa, al principio descrito en el documento WO 94/21808, utilizándose como modelo de ratón el modelo DAB/2.

Ejemplo 1 Vacunación de ratones DBA/2 contra mastocitoma P815

160 \mug del péptido con la secuencia KYQAVTTTL (kpep118), derivado del antígeno de tumores P815 descrito por Lethe et al., 1992, un ligando de H2-K^{d}, se mezclaron con 11,8 \mug de polilisina 300 en 500 \mul de HBS y se incubaron durante 4 h a la temperatura ambiente. Después, se añadieron 500 \mul de EBSS (solución salina tamponada de Earl). En cada caso 100 \mul de la mezcla obtenida se administraron por vía subcutánea a 8 ratones a intervalos de una semana. Después de esta preinmunización, se establecieron tumores después de otra semana, inyectando a cada ratón, de forma contralateral, 5 x 10^{4} células de la línea de células de mastocitoma P815 (ATCC nº TIB 64; estas células expresan el antígeno de tumores del que se deriva el péptido P815) en 100 \mul de EBSS. El resultado de estos ensayos está representado en la figura 1 (cuadrados negros).

En un ensayo paralelo se mezclaron 200 \mug de péptido con 500 \mul de HBS y a continuación se emulsionaron con 500 \mul de adyuvante de Freund. En cada caso con 100 \mul de la emulsión obtenida se preinmunizaron 8 ratones y a continuación se establecieron tumores con células P815, tal como se ha indicado antes (figura 1: círculos negros).

Para otro ensayo paralelo se preparó una vacuna contra tumores celular, como sigue:

160 \mug del péptido kpep118 se mezclaron con 3 \mug de transferrina-polilisina (TfpL), 10 \mug de pL y 6 \mug de psp65 (exento de LPS) en 500 \mul de tampón HBS. Después de 30 min a la temperatura ambiente, la solución anterior se añadió a un frasco de cultivo de células T75 con 1,5 x 10^{6} células de la línea de células de fibroblastos alógena NIH3T3 (ATCC nº CRL 1658) en 20 ml de medio DMEM (FCS al 10%, glucosa 20 mM) y se incubó a 37ºC. Después de 3 h, las células se mezclaron con 15 ml de medio de reciente aportación y se incubaron durante una noche a 37ºC y 5% de CO_{2}. 4 h antes de la aplicación, se irradiaron las células con 20 Gy. La elaboración de la vacuna se efectuó tal como se describe en el documento WO 94/21808. La preinmunización de esta vacuna se efectuó en un intervalo de una semana con 10^{5} células; después de otra semana, se llevó a cabo el establecimiento de tumores tal como se ha descrito antes (figura 1: triángulos negros). Se demostró que la vacuna que contenía reunidos el péptido con polilisina, protegía óptimamente a los ratones frente a la formación de tumores.

Ejemplo 2 Vacunación de ratones DBA/2 contra mastocitoma P815 con una vacuna con un solo péptido

a) Tres vacunas con un solo péptido, que contenían el péptido kpep117 solo en PBS (figura 2a), el péptido kpep117 emulsionado en IFA (figura 2b) o el péptido kpep117 con polilisina (longitud de cadena: 240) como adyuvante (figura 2c) se ensayaron en cuanto a su efecto protector contra un enfrentamiento a tumores P815. Las vacunas se prepararon tal como se describe en el apartado D. El volumen de inyección ascendió en cada vez a 100 \mul; la inyección se efectuó por vía subcutánea (sc) o intraperitoneal (ip). Como testigo negativo servían ratones inocentes, una vacuna de células completa consistente en células P815 secretoras de GM-CSF como testigo positivo (P815-GM-CSF; se inyectaron por vía subcutánea 10^{5} células en 100 \mul por animal). Cada grupo de ensayo consistía en ocho animales y se efectuaron tres vacunaciones (sc) a intervalos de siete días. Una semana después de la última vacunación, los animales recibieron un enfrentamiento a tumores contralateral con 5 x 10^{4} células P815. Los animales se inspeccionaron diariamente y la aparición de tumores se controló a intervalos de una semana.

El péptido kpep117 con polilisina como adyuvante consiguió el mejor efecto antitumoral cuando se inyectaron por vía subcutánea 100 \mug por animal (protegidos tres de ocho animales). Este efecto era casi tan bueno como el conseguido con la vacuna de células completas (protegidos cuatro de ocho animales). 16 \mug de péptido junto con polilisina por animal eran menos eficaces (protegidos dos animales), pero claramente mejor que 100 \mug de péptido en PBS (figura 2a, ningún efecto protector). Tampoco emulsionado con IFA el péptido alcanzó el efecto que proporciona junto con polilisina (figura 2c).

b) en otro experimento en el modelo de mastocitoma P815 se compararon entre sí dos polilisinas no modificadas de diferente longitud de cadena, una corta con sólo 16 restos lisina (pL16) y una larga con 240 restos (pL240). A los animales de los grupos testigo se les inyectaron 100 \mug de péptido kpep 117, disuelto en PBS, o emulsionado en IFA. Dos vacunas testigo celulares secretoras de GM-CSF se utilizaron como testigo positivo (véase el apartado a)), obteniéndose una vacuna a base de células P815 transfectadas estables y la segunda vacuna mediante transfección transitoria con utilización del método (AVET) descrito por Wagner et al., 1992. Las dos vacunas de células completas proporcionaron protección a cuatro o cinco de un total de ocho animales. Las vacunas a base de péptidos, que consistían en péptido solo o en el péptido emulsionado en IFA, no mostraron ningún efecto protector; todos los animales desarrollaron pronto tumores después del establecimiento del tumor. Sin embargo, cuando el péptido se administró junto con polilisina, la vacuna peptídica protegía a los animales contra el establecimiento del tumor: estaban protegidos dos de ocho animales cuando se utilizó la polilisina larga (pL240), y cuatro de ocho animales en el caso de la polilisina corta. Estos resultados, que están representados en la figura 3, demuestran que un péptido individual, cuando se administra con polilisina como adyuvante, determina una protección eficaz antitumores que es equiparable con la de una vacuna de células completas secretora de citoquina totalmente activa, a la que en la bibliografía se recurre como patrón para la vacunación antitumores (Dranoff et al., 1993; Schmidt et al., 1995).

Ejemplo 3 Vacunación de ratones DBA/2 contra mastocitoma P815 con una vacuna contra tumores que contiene péptidos individuales P815 o mezclas de péptidos P815

Para la preparación de la vacuna, se utilizaron los siguientes péptidos:

Kpep118 (100 \mug por inyección)

Mezcla de péptidos III (kpep117, kpep118, kpep162, kpep163, kpep164), esta mezcla de péptidos contenía todos los péptidos P815 hasta ahora conocidos; por inyección se administraron 25 \mug de cada péptido).

Como testigo positivo se utilizaron células P815 secretoras de GM-CSF.

En ensayos previos, kpep117 se había manifestado como el péptido con el mejor efecto protector contra un establecimiento de tumores de P815 cuando se utilizaron 100 \mug de péptido con polilisina (7,5 \mug de polilisina/100 \mug de péptido, correspondiente a la relación estándar; polilisina: longitud de cadena = 200). Una menor cantidad (16 \mug) de kpep117 había sido menos eficaz. En este ejemplo se inyectaron 100 \mug de kpep118 por animal, a saber una vez sólo con polilisina (grupo B), una vez con transferrina-polilisina (grupo C) y una vez con transferrrina-polilisina/ADN (grupo D). Como testigo se utilizó kpep118 con IFA. En este experimento kpep118 solo no mostró ningún efecto protector contra el establecimiento de tumores.

En los ensayos realizados en el Ejemplo 4 se demostró que una vacuna que contenía una mezcla de péptidos a base de péptidos de melanoma presenta un efecto protector contra melanoma. Por lo tanto, en este ejemplo se ensayó si el concepto de la mezcla de péptidos es también adecuado para P815.

La mezcla de péptidos III se administró una vez sólo con polilisina (grupo E), una vez con transferrina-polilisina (grupo F) y una vez con transferrina-polilisina/ADN (grupo G). Como testigo se utilizó la mezcla de péptidos III en IFA. Como testigo negativo se utilizaron ratones inexpertos; como testigo positivo se utilizaron células P815 transfectadas con GM-CSF (10^{5} células por ratón).

Los ensayos llevados a cabo en este ejemplo se desarrollaron, en comparación con otros ensayos, más bien de forma atípica: en el grupo testigo positivo, (células secretoras de GM-CSF), todos los animales desarrollaron pronto tumores después del establecimiento de tumores, desapareciendo la mayoría de estos tumores con la misma rapidez que se habían formado. Una posible explicación de ello es que el tumor se desarrollaba durante un tiempo antes de que fuese destruido. Una segunda posible explicación sería que la hinchazón diagnosticada como tumor no procediera del desarrollo del tumor, sino de un fuerte infiltrado de células inmunes (granuloma). Ya que no se diseccionó a los animales, no se pudo establecer de forma definitiva la causa; en cualquier caso, los tumores establecidos fueron destruidos en última instancia. Otro resultado interesante se obtuvo en el grupo G en el que los animales fueron tratados con un combinación a base de la mezcla de péptidos III y polilisina. Todos los animales desarrollaron tumores, pero en dos de los animales el tamaño de la hinchazón del tumor (o del infiltrado de células inmunes) era relativamente pequeño, no aumentaba y los ratones no parecían estar enfermos. No se sacrificó a estos dos animales, sino que se siguieron manteniendo en observación. Sorprendentemente, los tumores ya no se podían detectar nueve semanas después del establecimiento de tumores, un resultado hasta ahora no observado. Dos de ocho animales destruyeron por último su carga tumoral. La destrucción de los tumores podría atribuirse al contenido de kpep117 en la mezcla de péptidos, lo que estaría en analogía al Ejemplo 2 en donde dos de ocho animales estaban protegidos con 16 \mug de kpep117 y tres de ocho animales estaban protegidos con 100 \mug de kpep117. El efecto protector podía haber sido sin embargo también provocado por más de un péptido de la mezcla.

Ejemplo 4 Protección de ratones DBA/2 frente a melanoma M-3 por preinmunización con una vacuna contra tumores que contiene una mezcla de péptidos

Se utilizó una vacuna profiláctica que contenía una mezcla de péptidos de melanoma (mezcla de péptidos I, apartado D2).

El protocolo de la inmunización previa con la vacuna así como el establecimiento de los tumores correspondía al protocolo descrito en el Ejemplo 2, con la diferencia de que el establecimiento de tumores se efectuó con células M-3 (10^{5} células) por animal. Como vacuna testigo se utilizó una vacuna de células completas a base de células M-3 que secreta una cantidad óptima de IL-2 (1000 - 2000 unidades por 10^{5} células) y que se preparó tal como se describe por Schmidt et. al. 1995. En las condiciones del ensayo elegidas, esta vacuna logró una protección del 100% (figura 4). Las vacunas con la mezcla de péptidos se administraron a cuatro grupos de animales de ensayo. Dos grupos recibieron, s.c. o i.p., los péptidos emulsionados en IFA. Los otros dos grupos recibieron, s.c. o i.p., los péptidos junto con polilisina.

La figura 4 ilustra el efecto protector de la vacuna peptídica con polilisina (pL240) como adyuvante; el 50% de los ratones tratados estaban protegidos contra el enfrentamiento a tumores M-3 en comparación con animales no tratados, en los que rápidamente se desarrollaban tumores sólidos. Este efecto se pudo conseguir cuando la vacuna de péptido-polilisina se inyectó por vía subcutánea o se aplicó sobre la piel en forma de hidrogel (figura 5). En los otros tres grupos testigo, que se trataron con i.p. con las vacunas de polipéptido/polilisina o con péptidos en IFA, las vacunas eran esencialmente ineficaces. En este caso, los tumores establecidos no fueron eliminados, y los tumores se desarrollaban, en comparación con los animales testigo no tratados, con sólo una ligera demora. Estos resultados demuestran que la vacuna que contiene una mezcla de péptidos consigue un efecto protector antitumores cuando contiene polilisina. En las condiciones de ensayo elegidas, esta vacuna peptídica era sólo la mitad de eficaz que la vacuna de IL-2 celular, la cual, en coincidencia con informes recientemente aparecidos (Zatloukal, 1993, Zatloukal, 1995), protegía hasta en un 100% a los animales contra el establecimiento del tumor con 10^{5} células M-3 vivas.

Ejemplo 5 Protección de ratones DBA/2 frente a metástasis M-3

a) Se utilizó una vacuna terapéutica que contenía una mezcla de péptidos de melanoma (mezcla de péptidos I, descrita en el apartado D2). Se administraron tres vacunas (s.c.) a intervalos de una semana. La primera vacunación se efectuó cinco días después del establecimiento de la metástasis y después se inoculó contra una metástasis de cinco días. Para el establecimiento de la metástasis se inyectaron 1,2 x 10^{4} células M-3 y se utilizó el protocolo descrito en el documento WO 94/21808 y en Schmidt et al., 1996.

Como vacuna se utilizó la mezcla de péptidos I: sin adyuvante (pepmixl PBS), con IFA como adyuvante (IFA pepmixl) o con polilisina modificada con fucosa (fpL pepmixl). Los grupos testigos no recibieron ninguna vacuna (inexpertos) o la vacuna de células completas M-3 productora de IL-2 indicada en el Ejemplo 4. La figura 6 muestra que se consiguió la mejor protección en el grupo que fue tratado con la mezcla de péptidos I con polilisina modificada con fucosa como adyuvante (figura 6a). El 50% de los ratones pudieron rechazar las metástasis (4/8). Este tratamiento era incluso más eficaz que aquel con la vacuna de células completas que sólo protegía al 33% de los ratones (3/9). La vacuna peptídica con IFA o sin adyuvante conducía únicamente a una demora en el desarrollo de las metástasis para dar el tumor (figura 6b).

b) En otro experimento se investigó, en el modelo terapéutico, el efecto protector de una vacuna que contenía la mezcla de péptidos I y que se administró por vía subcutánea. Grupos testigo recibieron la mezcla de péptidos en PBS (sin adyuvante) o con IFA. Como adyuvante se utilizó polilisina 240 no modificada. Además, como adyuvante se utilizó polilisina 2 00 modificada con fucosa (fpL 200). Como testigo se tomó en este experimento un grupo de animales con la vacuna celular que expresa IL-2. Tal como se muestra en la figura 7a, la vacuna de péptidos/polilisina era eficaz en el tratamiento de metástasis M3. Una tasa de curación significativa se alcanzó en este ensayo sólo con la polilisina modificada con fucosa. En el caso de este tratamiento, el 50% de los animales rechazó las metástasis, lo que, en comparación con la vacuna de IL-2, que en este caso curaba al 70% de los animales, es un buen valor.

c) En otro experimento se sometió a ensayo en el modelo terapéutico cómo actúan sobre el efecto antitumores variaciones y modificaciones del policatión. En este caso, adicional-mente a la polilisina 200 no modificada y modificada con fucosa, se sometió a ensayo la polilisina pL16 corta y no modificada, una polilisina pL450 larga y otro policatión, a saber poliarginina (pArg720). Como testigo positivo se utilizó una cantidad celular óptima (> 10 \mug por 10 células) de vacuna M3 secretora de GM-CSF (Schmidt, 1995). También en este ensayo, los grupos testigo recibieron la mezcla de péptidos en IFA o sin cualquier adyuvante. Al igual que en el Ejemplo 5b), el mejor efecto se alcanzó cuando se utilizó fucosa-polilisina como adyuvante, figura 7b. En estos grupos, el 40% de los animales rechazó las metástasis, en comparación con el 30% en el grupo con la polilisina pL16 corta. Además del grupo que había recibido los péptidos junto con poliarginina, los animales de los otros grupos, a los que se había administrado una vacuna de péptidos, mostraron sólo una corta demora en la formación de tumores. La poliarginina no modificada tenía en este ensayo la misma actividad que la polilisina modificada con fucosa, y conducía al rechazo de las metástasis en cuatro de diez animales.

La figura 7c muestra la repetición de este efecto conseguido mediante poliarginina en un experimento independiente. También aquí, la vacunación con la mezcla de péptidos en unión con poliarginina mostró un efecto antitumores en cuatro de ocho animales tratados.

Ejemplo 6 Transcarga de células con tirosinasa con utilización de polilisina como adyuvante

Este ejemplo servía como ensayo que debía demostrar que la polilisina como adyuvante es adecuada para la carga de células con fragmentos de proteínas mayores o proteínas completas, utilizándose como células de forma supletoria células M-3.

Para la carga de las células se mezclaron primeramente 160 \mug de tirosinasa marcada con FITC (EC 1.14.18.1; Sigma) con 3 \mug de polilisina (pL240) y se incubaron durante 3 h a la temperatura ambiente. Después, la solución obtenida se añadió a un frasco de cultivo de células T 75 con 2 x 10^{6} células M-3 y se incubó a 37ºC. Después, las células se lavaron dos veces con PBS, se desprendieron con PBS/EDTA 2 mM y se recogieron en 1 ml de PBS/FCS al 5% para el análisis FACS. La figura 8 muestra la carga de células M-3 con tirosinasa (la curva de la izquierda muestra el testigo, la de la derecha, la carga con tirosinasa).

Ejemplo 7 Determinación de la activación de células T después de inmunización en el modelo terapéutico

Después de que la vacuna de péptidos/policatión había demostrado en el modelo terapéutico con ratones (véase el Ejemplo 5) claramente un efecto, se investigó si este tratamiento conduce también a la activación de células T. Para ello, se recurrió a la secreción de citoquina después de co-incubación de células del bazo de animales vacunados con células M3 parentales de forma supletoria como marcador (Kawakami et al., 1994b).

Se prepararon suspensiones de bazo de células individuales procedentes de animales vacunados y no tratados, seguido de la lisis de eritrocitos con tampón hipotónico (NH_{4}Cl 0,15 M, KHCO_{3} 1 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,4). Se retiraron las células adherentes, incubando 3 x 10^{6} células del bazo por ml de medio DMEM (FCS al 10%) en placas de Petri durante 90 min a 37ºC. Las células no adherentes se co-cultivaron mediante un cuidadoso pipeteado y co-cultivo con 1 x 10^{3} células parentales en diferentes relaciones cuantitativas. Las células se cultivaron en 20 \mul de medio DMEM (FCS al 10%), L-glutamina 2 mM y 20 \mug/ml de gentamicina en placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pocillos. Al 9º día se recolectaron 100 \mul de material sobrenadante y se midió el respectivo contenido en IFN-\gamma con utilización de un estuche de ensayo ELISA adquirible en el comercio (Endogen, Cambridge, MA, EE.UU.) según la prescripción del fabricante. Se demostró que después de nueve días de incubación, sólo las células del bazo de animales vacunados secretaban al medio cantidades mayores de IFN-\gamma, mientras que en los co-cultivos de células del bazo de animales no tratados y células M3 no se podía detectar prácticamente nada de IFN-\gamma. El resultado de estos ensayos está representado en la figura 9.

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Ejemplo 8 Inducción de inmunidad antiviral mediante el péptido de la nucleocápsida de influenza ASNENMETM y polilisina fucosilada como adyuvante

Se empleó una vacuna que contenía 75 \mug de fpLys por 1 mg de péptido ASNENMETM. La vacuna se administró mediante inyección única, tal como se indica en la parte del método, inyectándose por cada animal 100 \mug de péptido/7,5 \mug de fpLys. Para el control, la inyección de 100 \mug de péptido se realizó sola (PBS) o bien no se efectuó ningún tipo de inyección (testigo nativo).

Células del linfoma de ratón RMA-S se incubaron durante una noche en medio exento de suero a 26ºC con 10 \mug/ml de péptido ASNENMETM.

10 días después de la vacunación se aislaron células del bazo a partir de los animales vacunados, se mezclaron con las células RMA-S cargadas de péptido en la relación 5:1 y se continuaron cultivando durante cinco días (Stuber et al., 1994). Se determinó el número de las células del bazo efectoras supervivientes en los distintos cultivos, luego las células se mezclaron, para la determinación de la actividad CTL mediante el ensayo de liberación de europio estándar 4h (Blomberg et al., 1993), en diferentes relaciones con células RMA-S que previamente se habían mezclado con el péptido ASNENMETM y con quelato de europio. Tal como muestra la figura 10, la inmunidad específica en este ensayo sólo se consiguió mediante vacunación con el péptido y fpLys, pero no cuando el péptido se administró solo.

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Ejemplo 9 Ensayo de diferentes poliaminoácidos de carácter básico en cuanto a su capacidad de reforzar la internalización y/o fijación de péptidos a APC's

Para estos ensayos se utilizó un análisis de fluorescencia: un antígeno peptídico modelo de la secuencia LFEAIEGFI (MHC-K^{d} restringido) se marcó el colorante de fluorescencia isotiocianato de fluoresceína (FITC) según la prescripción del fabricante (Molecular Probes). La absorción o fijación de péptido marcado con FITC solo ("pulsado") o junto con diferentes concentraciones de aminoácidos de carácter básico (polilisina con una longitud de cadena de 16 a 490, poliarginina con una longitud de cadena de 15 a 720) por parte de la línea de monocitos-macrófagos P3 88D1 MHC-K^{d} restringida se midió mediante citometría de flujo. Para ello, 1 x 10^{6} células P388D1 se incubaron durante 30 min a 37ºC en un volumen final de 1 ml de medio (DMEM/FCS al 10%) en tubitos de centrífuga con 5 \mug de péptido marcado con FITC solo o con una mezcla a base de péptido y poliaminoácido, y a continuación se lavaron intensamente con el fin de separar el péptido libre. Los poliaminoácidos se añadieron en una concentración de 50, 25, 12, 6 y 3 \mug por ml de medio que contenía 5 \mug de péptido marcado con FITC. La intensidad de fluorescencia relativa de las diferentes muestras se comparó con el fin de enjuiciar la eficacia de la absorción y/o fijación del péptido. El resultado de estos ensayos está representado en la figura 11; los ensayos se llevaron a cabo en cada caso con 25 \mug de pL450 o pArg450. En las condiciones elegidas, la poliarginina se manifestó aproximadamente cinco veces más eficaz que la polilisina.

Ejemplo 10 Investigación del mecanismo a través del cual los péptidos son recogidos por APC's

Los péptidos pueden ser absorbidos por APC's mediante mecanismos específicos tales como macropinocitosis o endocitosis inducida por receptor (Lanzavecchia, 1996). Un mecanismo alternativo puede consistir en que los poliaminoácidos pueden permeabilizar la membrana de la célula y, de este modo, posibilitar la difusión de péptidos del medio al interior del citoplasma.

a) Se sometió a ensayo si tiene lugar una permeabilización de la membrana celular, midiendo la liberación de la enzima citoplasmática lactato-deshidrogenasa (LDH) después de incubación de células P388D1 con poliaminoácidos (polilisina o poliarginina) en condiciones isotónicas con utilización del estuche de ensayo adquirible en el comercio (Cytotox 96, Promega, Madison, Wisconsin, EE.UU.) según la prescripción del fabricante. En virtud de los resultados obtenidos en la figura 12a, se ha de suponer que el efecto de pLys consiste en que permeabiliza las membranas celulares, lo que se traduce en elevadas concentraciones de enzima citoplasmática liberada en condiciones isotónicas. En contraposición a ello, después del tratamiento con pArg (figura 12b) no se detectó prácticamente nada de LDH. Al comparar muestras que habían sido tratadas con poliaminoácidos solos, no se comprobó ninguna diferencia en la liberación de LDH en comparación con el tratamiento con una mezcla de polilisina o poliarginina con péptido. Después de la incubación con péptido solo, no se detectó ninguna actividad de LDH medible.

b) En base al principio publicado por Midoux et al., 1993, se investigó si tiene lugar una internalización de péptidos marcados con FITC en presencia o ausencia de poliaminoácidos de carácter básico: partículas internalizadas por células se transportaron en endosomas. En comparación con el citoplasma o el medio del cultivo celular, que presentan valores neutros del pH, estas organelas son de carácter ácido con un valor del pH de aproximadamente 5. La fluorescencia emitida por FITC depende fuertemente del pH. En un entorno con condiciones del pH como se encuentran en endosomas, se suprime la fluorescencia. Por lo tanto, péptidos marcados con FITC, que son recogidos por las células en los endosomas, muestran una fluorescencia reducida. En el caso de la adición de monensina, se neutraliza el bajo valor del pH de los endosomas, lo que conduce a una fluorescencia reforzada medible de los péptidos marcados con FITC internalizados.

Las células se incubaron a 4ºC o a 37ºC con una mezcla a base de poliarginina (intervalo de pesos moleculares medio 100.000, longitud de cadena 4 90) y péptido marcado por fluorescencia. Se retuvo una parte alícuota de las muestras incubadas a 37ºC y se trató a 4ºC con 50 \muM de monensina antes del análisis de citometría de flujo.

Se demostró que la incubación de APC's con determinados poliaminoácidos de carácter básico, tales como polilisina (pLys) y poliarginina (pArg) refuerza la absorción o la fijación de los péptidos a APC's.

Tal como resulta de la figura 13, en células que habían sido tratadas con péptido solo y con monensina, sólo se observó un ligero aumento de la fluorescencia. En contraposición a ello, las señales de fluorescencia estaban fuertemente incrementadas en muestras que habían -sido tratadas con monensina y una mezcla a base de poliarginina y péptido. No se observó ninguna absorción de péptidos cuando las muestras se incubaron a 4ºC. Un aumento significativo de la fluorescencia después del tratamiento con monensina apunta a que la carga de los péptidos determinada con pArg conduce a que éstos se acumulen en vesículas dentro de la célula (Midoux et al., 1993; figura 13). Como era de esperar, después del tratamiento con monensina de muestras cargadas con polilisina sólo se observó un ligero aumento de la fluorescencia. La carga con polilisina a 4ºC determinó un aumento medible de la fluorescencia, lo que es un indicio adicional de que el efecto de polilisina se ha de atribuir principalmente a una permeabilización de las membranas celulares (figura 12b).

Ejemplo 11 Investigación de la carga de APC's con péptidos cortos

APC's procedentes de la médula ósea, con contenido en GM-CSF, se investigaron con una combinación de un péptido marcado por fluorescencia más polilisina (pL200; Sigma) o con péptido solo mediante microscopía de fluorescencia. Para la detección microscópica de la recogida de péptidos, las APC's se sembraron sobre portaobjetos y se incubaron durante 30 min a 37ºC con 40 \mug de péptido LFEAIEGFI solo marcado con fluoresceína, o con una mezcla con 50 \mug/ml de polilisina (pL200) y 40 \mug/ml de péptido LFEAIEGFI. Después de un abundante lavado, las células se fijaron con para-formaldehído al 4%, se cubrieron con anti-Fadent (Dako, Glostrup, Dinamarca) y se observaron al microscopio de fluorescencia (Zeiss). Los núcleos se contratiñeron con 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Sigma). Como se muestra en las microfotografías de fluorescencia de la figura 14, las células que habían sido incubadas con péptido y polilisina (A) presentan, con respecto a las células que habían sido tratadas con el péptido solo (B), una recogida claramente reforzada del péptido. Mientras que la fluorescencia en las células que sólo habían sido tratadas ("pulsadas") con péptido solo se manifestaba de forma individualizada y en partículas, la intensa fluorescencia de las células cargadas con péptido en presencia de polilisina se manifestó como no localizada y, en general, distribuida más uniformemente por toda la célula.

Ejemplo 12 Determinación cuantitativa de la carga de células con péptido mediante citometría de flujo ("Ensayo de transcarga")

a) Después de que en los ensayos llevados a cabo en el Ejemplo 11 se había demostrado que las APC's son células diana extraordinarias para la carga con pequeños péptidos, se llevaron a cabo ensayos FACS in vitro con el fin de identificar adyuvantes adecuados para vacunas de péptidos. Este análisis permite un ensayo rápido cuantitativo de péptidos marcados por fluorescencia; como péptido modelo se utilizó el péptido de la secuencia LFEAIEGFI. En estos ensayos se utilizó como APC's la línea de células de ratón P388D1. 1 x 10^{6} células se incubaron en un volumen final de 1 ml de medio DMEM con un elevado contenido en glucosa y FCS al 10% durante 30 min a 37ºC con 5 \mug de péptido a una concentración final de fluoresceína de 5 nmol/ml. Las células se trataron con péptido solo o con una combinación de péptido y policationes o de péptido e histonas a concentraciones crecientes (3 a 50 \mug/ml), tal como se indica en la figura 15. Se utilizaron los siguientes compuestos: A: poliornitina (intervalo medio de pesos moleculares 110.000, longitud de cadena 580); B: histona rica en arginina; C: histona rica en lisina; D: poliarginina (intervalo medio de pesos moleculares 100.000, longitud de cadena 490); E: polilisina (intervalo medio de pesos moleculares 94.000, longitud de cadena 450). En ensayos previos se determinó que un tiempo de incubación de 30 min proporcionaba una recogida máxima de péptidos. Un tratamiento más prolongado (4 u 8 h) no proporcionó ningún aumento significativo de la señal fluorescente. Antes del análisis, las células se lavaron 5 veces con un gran volumen de PBS, que contenía BSA al 0,2%. Las células se recogieron de nuevo en 1 ml de PBS enfriado con hielo/BSA al 0,2% y se investigaron mediante citometría de flujo (FACScan; Becton Dickinson, San José, CA, EE.UU.).

La poliarginina y polilisina se manifestaron como los adyuvantes más eficaces; la poliornitina mostró un efecto citotóxico en las condiciones elegidas. El aumento de la recogida de péptidos por parte de poliarginina y polilisina se correlaciona con la concentración (figuras 15 d, e); la recogida aumenta con la longitud de cadena (figura 16).

Se observó que poliarginina, con un aumento de 3 potencias de diez con respecto al testigo, presenta un intervalo de concentraciones adecuado más amplio que la polilisina, que mostraba un aumento máximo de menos de 2 potencias de diez y, que en el caso de todas las longitudes de cadena utilizadas para el transporte de proteínas, es más eficaz que la polilisina (figura 16): la poliarginina posibilita un transporte eficaz a concentraciones tan bajas como 3 \mug/ml, mientras que para la polilisina eran necesarias concentraciones de > 25 \mug/ml con el fin de determinar un aumento significativo de la fluorescencia (figuras 15 d, e).

b) Para comprobar si para el transporte de péptidos existe un límite inferior de longitud de cadena, se sintetizaron poliargininas de diferente longitud de cadena (10-30 restos) y se investigó su capacidad de aumentar el transporte de péptidos a elevadas concentraciones de los policationes (figura 17). Para estos ensayos se utilizó el péptido LFEAIEGFI, y los polímeros de poliarginina sometidos a ensayo se emplearon en una concentración de 100 \mug/ml.

Ya con la poliarginina sometida a ensayo más corta se observó un aumento, aun cuando escaso, del transporte de péptidos.

c) Los aminoácidos de carácter básico son moléculas cargadas positivamente. Por lo tanto, se puede suponer que péptidos cargados negativamente podrían fijarse a estos policationes a través de interacciones electrostáticas, lo que posiblemente conduce a una recogida reforzada de péptidos. Con el fin de someter a ensayo esta hipótesis, se comparó la capacidad de poliaminoácidos catiónicos de recoger en células P388D1 cortos péptidos en función de su carga. En la siguiente Tabla se listan los péptidos utilizados negativamente cargados que cumplen todos las condiciones necesarias para la fijación de MHC-I (Rammensee et al., 1995). El péptido 1 se deriva de la TRP ("proteína relacionada con tirosinasa") de ratón, el péptido 2 procede de la hemaglutinina de la influenza (Schmidt et al., 1996), el péptido 3 de la tirosinasa de ratón, el péptido 4 del antígeno de tumores P198 y el péptido 5 de la beta-galactosidasa (Gavin et al., 1993). ("Mr" representa intervalo de pesos moleculares, "flúor" representa fluoresceína).

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TABLA

2

En virtud del método utilizado para la marcación del péptido con fluoresceína, se incorporan dos cargas negativas. Se demostró que después de la incubación con poliarginina, los péptidos (5 nmol por muestra) con el mayor número de cargas negativas, son transportados de la forma más eficaz en células P388D1, lo que apunta a que una interacción iónica entre el péptido y el policatión aumenta todavía más el transporte de péptidos en células (figura 18). A pesar de ello, en comparación con células que fueron tratadas con péptido solo, también en el caso de péptidos neutros en presencia de los policationes se recogieron cantidades mayores. El tratamiento con péptido solo dio como resultado en todos los péptidos sometidos a ensayo señales fluorescentes casi idénticas; por motivos de representación, en la figura 18 se muestra como "péptido solo" de forma supletoria la señal fluorescente obtenida con el péptido LFEAIEGFI.

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Claims

1. Composición farmacéutica que contiene

-: al menos un péptido, proteína o fragmento de proteína de acción inmuno-moduladora, exceptuados péptidos, que se derivan de antígenos de tumores del paciente a tratar con la composición y que se fijan a una molécula MHC-I o a una molécula MHC-II del paciente,

-: junto con un coadyuvante, en donde el coadyuvante es poliarginina.

2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido o el producto de degradación celular de la proteína o fragmento de proteína se fija a al menos una molécula de MHC que es expresado por el individuo a tratar.

3. Composición farmacéutica según la reivindicación 2, caracterizada porque el péptido o el producto de degradación celular de la proteína o fragmento de proteína se fija a una molécula de MHC-I.

4. Composición farmacéutica según la reivindicación 2, caracterizada porque el péptido o el producto de degradación celular de la proteína o fragmento de proteína se fija a una molécula de MHC-II.

5. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque contiene un péptido que se deriva de una proteína de un agente patógeno.

6. Composición farmacéutica según la reivindicación 5, caracterizada porque el péptido se deriva de una proteína bacteriana.

7. Composición farmacéutica según la reivindicación 5, caracterizada porque el péptido se deriva de una proteína viral.

8. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizada porque contiene varios péptidos que se diferencian en que se fijan a diferentes subtipos MHC del individuo a tratar.

9. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 2 a 8, caracterizada porque contiene uno o varios péptidos que se derivan de una proteína inmunógena que se presenta en la naturaleza o de un producto de degradación celular del mismo.

10. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 2 a 8, caracterizada porque contiene uno o varios péptidos que son diferentes de péptidos que se derivan de proteína(s) inmunógena(s) que se presentan en la naturaleza o antígeno(s) de tumores o de productos(s) de degradación celulares de los mismos.

11. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido es un antagonista de un péptido que se deriva de una proteína que provoca una enfermedad autoinmune.

12. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque se presenta en forma de solución o suspensión del péptido y poliarginina en un soporte farmacéuticamente aceptable.

13. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 12, para la administración tópica.

14. Composición farmacéutica según la reivindicación 13, en forma de un hidrogel.