CN110870912A - 亚甲蓝类染料作为疫苗佐剂的应用、包含该佐剂的疫苗及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及亚甲蓝类染料作为疫苗佐剂的应用、包含该亚甲蓝类染料佐剂的疫苗、以及使用该疫苗预防和治疗局部病变相关疾病、尤其是实体肿瘤的方法。

Description

亚甲蓝类染料作为疫苗佐剂的应用、包含该佐剂的疫苗及其 应用

技术领域

本发明涉及亚甲蓝类染料作为疫苗佐剂的应用、包含该亚甲蓝类染料佐剂的疫苗、以及使用该疫苗预防和治疗局部病变相关疾病、尤其是实体肿瘤的方法。

背景技术

局部病变、尤其是顽固性局部病变疾病(例如实体肿瘤、顽固性微生物感染、顽固性皮肤病等)的治疗，一直是一个艰难的科学问题。由于有大量研究工作支持，实体肿瘤常被用作局部病变疾病、尤其是难治性局部病变疾病的研究模型。实体肿瘤是一种具有瘤体征状的肿瘤疾病，瘤体是包含有肿瘤细胞的一种特征性病变组织，肿瘤细胞是肿瘤成因的一种特征性病变细胞，肿瘤相关分子则是与肿瘤成因相关的具有一定特异性的分子水平物质。以胰腺癌瘤体为例，胰腺癌细胞在其中仅占约30％的体积比。可见，除了肿瘤细胞及其中的肿瘤相关分子，瘤体组织中往往还存在更大量的其它组成(有时亦被称作肿瘤细胞的微环境)，包括其它多种细胞、多种细胞间质、多种管道等。

药物治疗是实体肿瘤、尤其是晚期恶性实体肿瘤的一种主要治疗手段。按照不同的作用靶标，抗肿瘤药物可分为肿瘤细胞靶向药物(通常称为细胞毒药物)、瘤体组织靶向药物(通常称为局部药物)和(肿瘤相关)分子靶向药物。自20世纪50年代起的近半个世纪里，抗肿瘤药物开发的主流是细胞毒药物(癌细胞增殖抑制剂)。直到今日，这类药物仍然占据重要地位。20世纪80年代，日本科学家将无水乙醇经皮介入肝癌瘤体，造成蛋白质变性和细胞脱水，使瘤体发生凝固性坏死而化学消融。此后，多国研究者开发了更有效的化学消融剂(高浓度酸、碱)。小分子靶向药物的靶区，则主要是以下肿瘤相关分子：膜受体、细胞信号转导途径的成分、细胞周期调节蛋白以及参与血管生成的重要蛋白或因子等。

免疫治疗药物方兴未艾。单克隆抗体主要是通过靶向以下肿瘤相关分子产生疗效：肿瘤生存的某些关键分子(例如CD20、VEGF/VEGFR2、HER2、EGFR、CD19、CD25、SLAMF7、CD38等)、肿瘤免疫固有性和适应性相关分子(例如抑制某些免疫细胞因子)、尤其是肿瘤免疫抑制/激活调节分子(例如靶向免疫抑制分子如CTLA-4、PD-1及PD-L1、靶向免疫激活分子如CD137/OX40等)。尽管其适应症和疗效仍然有限，却使人们对免疫治疗史无前例地热切期待起来。

抗肿瘤疫苗是另一个热门方向。其利用含有肿瘤抗原(肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原)的肿瘤细胞、胞外体、多肽及核酸序列等诱发患者自身免疫应答，意图克服免疫抑制状态，以期抑制肿瘤生长甚至清除肿瘤。然而，肿瘤抗原的抗原性通常较弱，加入疫苗佐剂似乎是一种好的策略。可是，在现有技术中，可供选择的疫苗佐剂不多，限制了更多疫苗的开发。因而，仍然需要开发新的抗肿瘤疫苗佐剂及新的疫苗，以满足现有技术尚不能满足的各种临床需求。实际上，其它局部病变、尤其是顽固性局部病变疾病的防治也都有这个急迫需要。

发明内容

本发明专利申请的目的在于提供亚甲蓝类染料作为疫苗佐剂的应用，包含该亚甲蓝类染料作为佐剂的疫苗，以及用该疫苗治疗实体肿瘤的方法和应用。

根据本申请公开的一个方面，其提供亚甲蓝类染料作为疫苗佐剂的应用。根据一个实施方案，所述疫苗还包含一种或多种抗原以及药物学可接受的液体载体。

根据本申请公开的另一个方面，其提供一种疫苗，其包含作为佐剂的亚甲蓝类染料、一种或多种抗原以及药物学可接受的液体载体。

根据本申请公开的再一个方面，其提供一种预防和治疗实体肿瘤的方法，该方法包括向有此需要的个体局部给药治疗有效量的根据本申请公开的疫苗。

根据一个实施方案，所述亚甲蓝类染料包括以下化合物及其衍生物：亚甲蓝、专利蓝、异硫蓝，优选为亚甲蓝。

根据一个实施方案，所述亚甲蓝类染色剂在所述疫苗中的浓度(w/v)≤2％、优选为0.3-2％、更优选为0.5-1.5％。

根据本发明的亚甲蓝类染料应用技术方案与现有技术的亚甲蓝类染料应用相比具有以下优点：其能够作为佐剂参与特异性免疫作用；与现有疫苗佐剂相比具有以下优点：在本发明的动物实验条件下可以更好地增强免疫效果。

根据本发明的包含亚甲蓝类染料佐剂的疫苗与现有技术其它疫苗相比具有以下优点：显示出更快更高的疗效。

根据本发明的实施方案与局部病变疾病治疗的现有技术相比具有以下优点：与现有细胞毒药物相比，显示出几乎无毒的全身安全性和明显较高的局部病变疗效；与现有分子靶向药物相比，显示出不那么苛刻的适应症筛选，以及针对快速生长瘤体、大瘤体和乏血供瘤体的巨大潜力；与现有化学消融剂相比，显示出更高的特异性，即在显示出对局部病变的有效性的同时，也显示出对非病变组织明显低得多的局部刺激性，从而可以有较大的介入适应范围和较高的应用体积；与现有硬化剂相比，显示出更高的疗效和安全性。本发明的应用和疫苗也不受现有细胞毒性药物和现有分子靶向药物遭遇的耐药性问题的困扰。此外，该应用和疫苗制备方便、成本便宜，特别有助于使难以承受高额费用的广大人群也享受到安全、有效治疗。

具体实施方式

本发明的发明人在一个荷瘤动物试验中发现了亚甲蓝类染料可以作为佐剂应用于实体肿瘤的治疗疫苗，然后进一步制备了一种包含亚甲蓝类染料佐剂的疫苗。

在本发明的范围中，术语“疫苗”是指任何能够特异性地诱发机体针对目标抗原的免疫应答，从而有效预防或治疗目标抗原相关疾病的药物。术语“疫苗佐剂”(简称佐剂)是指能够增强疫苗的特异性免疫功能的物质。疫苗佐剂与通常意义上的免疫增强剂有所不同，后者往往通过吸收作用来增强机体的非特异性免疫功能。

根据本申请公开的一个方面，其提供亚甲蓝类染料作为疫苗佐剂的应用。根据一个实施方案，所述疫苗还包含一种或多种抗原以及药物学可接受的液体载体。

根据本申请公开的另一个方面，其提供一种疫苗，其包含作为佐剂的亚甲蓝类染料、一种或多种抗原以及药物学可接受的液体载体。

根据本申请公开的再一个方面，其提供一种预防和治疗实体肿瘤的方法，该方法包括向有此需要的个体局部给药治疗有效量的根据本申请公开的疫苗。

在本发明的范围内，术语“治疗有效量”是指用于治疗疾病(例如肿瘤)并获得有效效果(例如降低或/和缓解疾病症状)的药物的量。

在本申请公开中，所用术语“亚甲蓝类染料”是指亚甲蓝及其类似物、尤其是活体染色类似物。术语“类似物”是指与指定化合物虽不相同、但结构或/和指定性质上相似的物质，其包括例如指定化合物的复合物、衍生物、水合物、盐(包括酸合物或碱合物)等。术语“衍生物”是指指定化合物所含的原子或原子团被其他原子或原子团置换而生成的较复杂的化合物。在现有技术中，亚甲蓝类染料在制备局部病变疾病的治疗药物中有多种应用，例如其可作为解毒剂、作为化学消融剂等。作为解毒剂时，其为极低浓度(小于0.05％)静脉注射。作为化学消融剂时，其为高浓度(大于2％)局部给药。在本发明的实施例中，本发明的发明人发现当亚甲蓝的局部给药浓度(w/v)在某一个区间时(例如0.3％-2％)时，其明显增强疫苗抑制肿瘤组织生长的效果。这个局部给药浓度也许就是那个临界浓度，其使得亚甲蓝类染料由化学消融剂转变为佐剂参于疫苗对瘤组织的破坏。根据本发明的应用，所述疫苗应当在其使用说明书中明确亚甲蓝类染料佐剂的局部给药浓度，以保证其被作为佐剂、而非化学消融剂使用，以避免风险。

根据一个实施方案，所述亚甲蓝类染料例如可以包括以下化合物及其衍生物：亚甲蓝、专利蓝、异硫蓝，优选为亚甲蓝。

根据一个实施方案，所述亚甲蓝类染色剂在所述疫苗中的浓度(w/v)≤2％、优选为0.3-2％、更优选为0.5-1.5％。

在本申请公开中，包含于所述疫苗中的所述抗原选自针对实体肿瘤的抗原。所述实体肿瘤例如包括分泌腺肿瘤和皮肤肿瘤。

在本发明的范围内，术语“分泌腺肿瘤”是指分泌腺或包含分泌腺的组织或器官中的恶性或非恶性肿瘤；术语“分泌腺”是指由腺细胞或腺细胞群组成的、执行分泌功能(secretion)的结构，包括外分泌腺和内分泌腺。外分泌腺是一类有导管的分泌腺，包括胰腺(不包括胰岛)、小肠腺、汗腺、皮脂腺、大肠腺、大汗腺、腮腺、下颌下腺、乳腺、胃腺、肝等。内分泌腺是人体内一些无输出导管的分泌腺，包括甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、垂体、松果体、胰岛、胸腺和性腺等。分泌腺肿瘤例如包括乳腺癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、前列腺癌、肺癌、头颈癌、鼻咽癌，其典型代表为乳腺癌、肝癌、结肠癌。

在本发明的范围内，术语“皮肤肿瘤”是指皮肤组织或器官中的恶性或非恶性肿瘤，其典型代表为黑色素瘤。

在本申请公开中，所述疫苗还可包含氨基酸类营养素作为另外一种疫苗佐剂，以增强所述疫苗的效力。

在本申请公开中，所用术语“氨基酸类营养素”是指具有营养保健效应的氨基酸类化合物，优选为选自具有营养保健效应的氨基酸、氨基酸聚合物及氨基酸衍生物，更优选为选自中国、美国或欧洲官方药典或指南所载的氨基酸类营养药和具有营养保健作用的氨基酸类辅料。在本发明的范围中，所用术语“营养保健效应”是指由以下之一种或多种生物作用产生的体内效应：提供能量、参与生物活性物质(例如蛋白质)的合成、参与部分新陈代谢、维持动物肠道微生态平衡、以及参与有利于机体健康的其它生理调节(例如调节蛋白质合成、调节免疫反应)。

在本发明的范围内，作为所述氨基酸类营养素的氨基酸、氨基酸聚合物及氨基酸衍生物优选为选自以下组中的氨基酸、或者包含以下组中的氨基酸的氨基酸聚合物、或者以下组中的氨基酸或者包含以下组中的氨基酸的氨基酸聚合物的氨基酸衍生物：蛋白氨基酸和非蛋白氨基酸。

在本发明的范围中，术语“蛋白氨基酸”是指构成蛋白质的主要氨基酸；而术语“非蛋白氨基酸”是指蛋白氨基酸之外的、也可在营养保健品、传统饮食及功能性饮食(例如保健饮食)中用作营养保健功能组分的其它氨基酸。

具体而言，在本申请公开中，所述蛋白氨基酸包括选自以下组中的氨基酸：非极性氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸)，极性中性氨基酸(例如色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸)，碱性氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)。以上除甘氨酸以外均为L型α-氨基酸。所述非蛋白氨基酸可包括以下氨基酸：β-丙氨酸、牛磺酸、γ-氨基丁酸(GABA)、茶多酚(茶氨酸)、南瓜子氨基酸(3-氨基-3-羧基吡烷酸)、谷氨酰胺、瓜氨酸、鸟氨酸等。

所述氨基酸聚合物可以为选自包含如上所述之氨基酸的寡肽和多肽。

在本申请公开中，所用术语“寡肽”是指包含2-10个相同或不同的以肽键相连的氨基酸的氨基酸聚合物；而术语“多肽”是指包含11-100个相同或不同的以肽键相连的氨基酸聚合物。对于组成所述寡肽或多肽的氨基酸，可以全部是上述一种或多种氨基酸，也可以额外包含其他氨基酸。在一个实施方案中，所述寡肽可以为选自以下之一种或多种：甘氨酰-L-酪氨酸、甘氨酰丙氨酸、双甘氨肽、赖氨酸-甘氨酸二肽、丙谷二肽、肌肽(β-丙氨酸组氨酸共聚物)、谷胱甘肽、胶原蛋白寡肽、酪蛋白水解肽、大豆寡肽、寡聚精氨酸、寡聚甘氨酸、寡聚赖氨酸。在一个实施方案中，所述多肽可以为选自以下之一种或多种：聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚赖氨酸。

所述氨基酸衍生物例如可以是选自包含如上所述之氨基酸的氨基酸盐。在本发明的范围中，所用术语“氨基酸盐”是指如上所述之氨基酸与酸或碱所形成的盐，例如与碱形成的钠盐、钙盐、钾盐、铁盐、镁盐、锌盐、镁盐等，以及与酸形成的盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、乙酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乳酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、氨基酸盐等。更具体地例如有赖氨酸盐酸盐、组氨酸盐酸盐、谷氨酸盐酸盐、半胱氨酸盐酸盐、精氨酸盐酸盐、硫酸甘氨酸、硫酸甘氨酸铁、赖氨酸盐酸盐、天冬氨酸盐酸盐等。

在本申请公开中，所述氨基酸类营养素包括具有营养保健效应的以下氨基酸类化合物之一种或多种：氨基酸、氨基酸盐、寡肽和多肽。在本发明的药物组合物中，所述氨基酸类营养素可以是氨基酸、氨基酸盐、寡肽和多肽中的一种或多种，例如是2种、3种、4种或5种或者更多种。

在本申请公开中，作为所述氨基酸类营养素的氨基酸、氨基酸盐、寡肽和多肽优选为选自以下组中的氨基酸或其盐或者包含或由以下氨基酸构成的寡肽和多肽：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、β-丙氨酸、牛磺酸、γ氨基丁酸(GABA)、茶氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸；更优选为选自以下组中的氨基酸或其盐或者包含或由以下氨基酸构成的寡肽和多肽：精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。

在一个实施方案中，所述氨基酸类营养素选自精氨酸、精氨酸盐、或含有精氨酸的寡肽或多肽。

在一个实施方案中，所述氨基酸类营养素选自赖氨酸、赖氨酸盐、或含有赖氨酸的寡肽或多肽。

在一个实施方案中，所述氨基酸类营养素选自甘氨酸、甘氨酸盐、或含有甘氨酸的寡肽或多肽。

在一个实施方案中，所述氨基酸类营养素选自谷氨酸、谷氨酸盐、或含有谷氨酸的寡肽或多肽。

在一个实施方案中，所述氨基酸营养素在所述疫苗中的浓度(w/v)为2-40％、5-40％、7.5-30％、10-25％或18-25％，优选为15％-25％或20％-25％。

在一个实施方案中，所述氨基酸类营养素选自具有营养保健效应的氨基酸或氨基酸盐，且所述氨基酸或氨基酸盐在所述疫苗中的浓度(w/v)为大于≥5％、优选为≥7.5％、10-25％或18-25％，更优选为15％-25％或20％-25％。

在一个实施方案中，所述氨基酸类营养素选自具有营养保健效应的寡肽和多肽，且所述寡肽和多肽在所述疫苗中的浓度(w/v)为大于≥5％、优选为7.5-25％、更优选为10％-25％。

在一个实施方案中，所述氨基酸类营养素为所述氨基酸和/或氨基酸盐与所述寡肽和/或多肽的组合，且该组合在所述疫苗中的浓度(w/v)为大于≥5％、优选为7.5％-25％、更优选为10-25％。

在本发明的范围中，除非另有说明，术语“浓度”是指所述局部药物组合物中指定组分的重量/体积百分比浓度％(w/v)。术语“局部给药浓度”是指指定组分在药物实施局部给药时的浓度，其可以是指定组分在药物接触靶区处(例如注射针孔或灌注管出口)的浓度。

在根据本申请公开的疫苗中，其还可进一步任选包含止痛剂。所述止痛剂用以减轻患者的疼痛感，其可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如苯甲醇、盐酸普鲁卡因、三氯叔丁醇、盐酸利多卡等。所述止痛剂在所述疫苗中的浓度例如可以是0.1-4％(重量)。例如苯甲醇的浓度可以为1-4％，盐酸普鲁卡因、三氯叔丁醇、盐酸利多卡的浓度可以分别为1-3％。

根据本申请公开的疫苗还可进一步任选包含缓释载体。所述缓释载体可以是本领域技术人员已知的任意合适者，包括例如凝胶基质、微粒载体、胶束基质等。所述缓释载体在所述疫苗中的浓度(w/v)例如可以为0.5-13％、优选为1-12％或1-15％。

根据本发明的疫苗，其中还可进一步任选包含多价金属化合物。所述多价金属化合物可以是本领域技术人员已知的任意合适者，其例如可以是金属盐(例如铁盐、铜盐、镁盐、锌盐、锰盐、铝盐、钙盐等)，也可以是多价金属化合物(例如含铁血红素、水溶性酸络合铁等)。所述多价金属化合物在所述疫苗中的浓度(w/v)例如为0.02-2％，其优选为0.05-1.5％，更优选为0.1-1.2％或0.1-1.6％。

根据本发明的疫苗，其中还可进一步任选包含解偶联剂，例如二硝基苯酚(DNP)，其在疫苗中的浓度(w/v)例如可以是0.1-15％。

根据本发明的疫苗，其中还可进一步任选包含生物提取物及其类似物，所述生物提取物及其类似物可以是本领域技术人员已知的任意合适者，包括例如：多糖(例如藻类多糖、药用植物多糖、真菌多糖)、苷(例如人参皂苷、三七总皂苷、皂角苷、虎杖皂苷、海参总皂苷等)、多酚(例如类黄酮、水解单宁、原花青素、茶多酚、白藜芦醇、苹果多酚等)、萜(例如青蒿素、大花旋覆花内酯、倍半萜烯内酯等)、黄酮(例如葛根素、木犀草素、水飞蓟宾、白杨素、氨基酸木素、川陈皮素、甘草总黄酮等)、生物碱(例如喜树碱类生物碱、苦参碱类生物碱、长春花类生物碱、石蒜科生物碱、小檗碱类生物碱等)。所述生物提取物及其类似物在所述疫苗中的浓度例如可以为0.1-15％w/v。

根据本申请公开的疫苗可以是可包含活性成分(所述亚甲蓝类染料、一种或多种抗原)和液体载体的任何可局部给药的剂型，优选为注射剂，更优选为局部注射剂。

在本发明的范围中，术语“注射剂”是指含活性成分和液体载体(例如水、乙醇、或者水/乙醇混合物)并供体内给药的无菌制剂。注射剂按给药方式分为局部注射剂、静脉注射剂等，静脉注射剂只有在给定局部给药浓度后方可作为局部注射剂使用。注射剂按商品形式分为液体注射剂、注射用粉针剂等。注射用粉针剂包含无菌干粉和溶媒，无菌干粉中包含部分或全部活性成分，溶媒中包含全部液体载体。注射剂中所述活性成分的浓度均为其与全部所述液体载体的混合物中的活性成分浓度，通常是局部给药器械(注射器、穿刺器、注入导管等)终点(例如针孔、导管出口等)的液体药物中的活性成分浓度。对注射用粉针剂而言，所述活性成分的浓度即为无菌干粉和溶媒(或所述药物学可接受的液体载体)的混合物(例如复溶液)中的活性成分浓度。

因此，根据本申请公开的疫苗可以为注射剂的剂型，所述注射剂包括液体注射剂和注射用粉针剂。

对于所述注射用粉针剂，其可包括无菌干粉和溶媒，且所述亚甲蓝类染料以及一种或多种抗原之一部或全部包含于所述无菌干粉，以及所述液体载体包含于所述溶媒，而且所述亚甲蓝类染料以及一种或多种抗原的浓度分别为它们在无菌干粉和溶媒混合物中的浓度。

根据本申请公开的另一个方面，其提供一种冻干或半冻干形式的用于治疗实体肿瘤的疫苗，其是通过冻干或半冻干根据本申请公开的包含所述作为疫苗佐剂的所述亚甲蓝类染料、一种或多种抗原以及药物学可接受的载体的疫苗之一部分或全部而得到的。

根据本申请公开的疫苗还可进一步任选地包含赋形剂。所述赋形剂可以是本领域技术人员已知的任意合适者，其可包括例如以下之一种或多种：分散介质、防腐剂、稳定剂、湿润剂和/或乳化剂、增溶剂、增粘剂等。所述增粘剂例如为羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、聚乙烯毗咯烷酮或明胶。所述防腐剂例如抗氧化剂例(如抗坏血酸)。

本领域技术人员会理解，根据本申请公开的疫苗应被制成可向所述靶区局部给药的剂型、优选为注射剂、更优选为局部注射剂。

根据本申请公开的疫苗可如下制备：制备含所述作为疫苗佐剂的亚甲蓝类染料、一种或多种抗原、溶媒(药物学可接受的液体载体)和任选存在的其它物质(如氨基酸类营养素)的液体药物。该液体药物可以是包含局部活性成分的溶液(例如为亲水溶媒的溶液、优选为水溶液)、悬浮液、或乳浊液。当所述液体药物为悬浊液时，其中的分散介质可以本领域技术人员已知的任意合适者，例如微米材料或纳米材料。当所述液体药物为乳浊液时，其中的分散介质可以本领域技术人员已知的任意合适者，例如可用于注射的植物油、合成油或半合成油。所述植物油可以是例如棉籽油、杏仁油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油、大豆油和花生油。

根据本发明的制备方法，所述作为疫苗佐剂的亚甲蓝类染料、一种或多种抗原、以及任选存在的其它成分的浓度大于或等于其在本发明的疫苗中的局部给药浓度。当大于在本发明之药物组合物中的浓度时，可进一步被稀释使用。

根据本申请公开的一个实施方案，本发明的疫苗液体注射剂可通过包括以下步骤的方法制备：1)将根据局部给药浓度所需量的所述作为疫苗佐剂的亚甲蓝类染料、一种或多种抗原加入溶媒中制备为液体；2)将根据局部给药浓度所需量的任选存在的其它组分(例如氨基酸类营养素、止痛剂等)加入至在步骤1)中制备的液体混合均匀获得液体药物；3)将步骤2)中制备的液体药物除菌后制成液体注射剂。使用时，液体注射剂中的除菌液体药物可直接或稀释后用作局部给药液体药物。

根据本申请公开的一个实施方案，本发明的疫苗液体注射剂可通过包括以下步骤的方法制备：1)将根据局部给药浓度所需量的所述作为疫苗佐剂的亚甲蓝类染料、一种或多种抗原以及任选存在的其他组分加入溶媒(或者药物学可接受的液体载体)中混合均匀并经除菌后制备为除菌液体I；2)将根据局部给药浓度所需量的任选存在的其他组分(例如氨基酸类营养素)加入溶媒(或者药物学可接受的液体载体)中混合均匀并经除菌后制备为除菌液体II。使用时，除菌液体I和除菌液体II在进入局部给药器械前或后形成混合液，其即可直接或稀释后用作局部给药液体药物。

根据本申请公开的一个实施方案，本发明的疫苗之注射用粉针剂可通过包括以下步骤的方法制备：制备含根据局部给药浓度所需量的所述作为疫苗佐剂的亚甲蓝类和抗原的无菌干粉；和制备包含根据局部给药浓度所需量的所述其它组分(例如氨基酸类营养素、止痛剂)的无菌溶媒。所述除菌干粉优选为除菌冻干干粉，其制备方法包括：1)制备包含所述作为疫苗佐剂的亚甲蓝类染料、一种或多种抗原、以及任选存在的其他组分的溶液；2)除菌过滤和分装；3)冷冻干燥；4)压塞、轧盖。所述冷冻干燥的工艺条件例如包括：预冻条件为在预冻温度-45℃保持4小时；升华干燥条件为升温速率为0.1℃/分钟、且升至-15℃时至少保持10小时；解吸附干燥条件为30℃保持6小时。使用时，将注射用粉针剂的无菌干粉复溶于无菌溶媒中形成复溶液体药物，其即可直接或稀释后用作局部给药液体药物。

在本申请公开中，所述疫苗主要是作为治疗疫苗，用于预防或治疗实体肿瘤。根据一个实施方案，所述实体肿瘤包括分泌腺肿瘤、皮肤肿瘤和肉瘤。

根据一个实施方案，所述分泌腺肿瘤包括乳腺肿瘤、肝肿瘤、结肠肿瘤、胰腺肿瘤、甲状腺肿瘤、前列腺肿瘤、肺肿瘤、头颈肿瘤、鼻咽肿瘤、睾丸肿瘤、阴道肿瘤、子宫肿瘤、卵巢肿瘤。

根据一个实施方案，所述皮肤肿瘤包括黑色素瘤。

根据本发明的另一个方面，其还提供根据本发明的疫苗在制备局部病变疾病的免疫预防和免疫治疗药物中的应用。

本领域技术人员会理解，根据本发明的疫苗的技术方案及其有效性和安全性，该疫苗除了可应用于制备实体肿瘤的免疫治疗药物，也可应用于制备其它局部病变疾病、尤其是难治性局部病变疾病的免疫治疗药物，这些药物都可以局部给药至不同的局部病变靶区。

根据本发明的应用，其为根据本发明的疫苗在制备治疗实体肿瘤的免疫治疗药物中的应用。

在本发明的范围内，术语“瘤体”是指由于细胞或变异的细胞异常增殖形成的肿块；术语“实体肿瘤”是指具有瘤体的肿瘤，其可以是由于任何病理(恶性和非恶性)和处于任何阶段的肿瘤，包括例如按照肿瘤细胞类型进行分类的以下组：上皮细胞肿瘤、肉瘤、淋巴瘤、生殖细胞肿瘤、胚细胞瘤；以及包括按照肿瘤细胞集中区所在的器官或组织来命名的肿瘤，包括例如按照以下器官或组织来命名的肿瘤：皮肤、骨、肌肉、乳腺、肾、肝、肺、胆囊、胰腺、脑、食道、膀肌、大肠、小肠、脾、胃、前列腺、睾丸、卵巢或子宫。

所述恶性肿瘤包括例如乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、食道癌、胃癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌等。所述非恶性肿瘤包括例如乳腺瘤、胰腺瘤、甲状腺瘤、前列腺瘤、肝瘤、肺瘤、肠瘤、口腔瘤、食道瘤、胃瘤、鼻咽瘤、喉瘤、睾丸瘤、阴道瘤、子宫瘤、输卵管瘤、卵巢瘤等。

在本申请公开中，根据本发明的疫苗还可作为免疫治疗药物用于治疗非瘤肿大。

在本发明的范围内，术语“非瘤肿大”是指肿瘤以外的肿大，包括例如增生(例如乳腺、胰腺、甲状腺、甲状旁腺、前列腺等的增生)、囊肿(例如乳腺、甲状腺、甲状旁腺等的囊肿)、结节(例如乳腺、甲状腺、甲状旁腺等的结节)、异常静脉团(例如痔疮等)、局部炎症发肿、微生物感染发肿等。所述痔疮包括内痔、外痔、混合痔。

在本申请公开中，根据本发明的疫苗还可作为免疫治疗药物用于治疗局部炎症、尤其是难治性炎症。

在本发明的范围内，术语“局部炎症”是指局部部位的非瘤性发炎，包括例如变质性炎(alterative inflammation)、渗出性炎(exudative inflammation)和增生性炎，其可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如可以是包括以下一种或多种：关节炎、乳腺炎、胰腺炎、甲状腺炎、前列腺炎、肝炎、肺炎、肠炎、口腔炎、咽炎、牙周炎、食道炎、胃炎、胃溃疡、鼻炎、鼻窦炎、喉炎、气管炎、支气管炎、阴道炎、子宫炎、输卵管炎、卵巢炎等。

在本申请公开中，根据本发明的疫苗还可作为免疫治疗药物用于治疗皮肤病、尤其是难治性皮肤病。

在本发明的范围内，术语“皮肤病”是指原生或继生在皮肤或皮肤附属器官的病变，其可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如可以是包括以下一种或多种：皮肤癌、皮肤非恶性肿瘤、病毒性皮肤病(例如疱疹、疣、风疹、手足口病)、细菌性皮肤病(例如脓疱病、疖、麻风)、真菌性皮肤病(例如各种癣)、性传播疾病(例如梅毒、淋病及尖锐湿疣)、过敏性与自身免疫性皮肤病(例如接触性皮炎、湿疹、荨麻疹)、物理性皮肤病(例如日光性皮肤病、冻疮、鸡眼、手足皲裂、压疮)、结缔组织疾病(例如红斑狼疮)、色素障碍性皮肤病(例如雀斑、色素痣、各种斑)、皮肤附属器疾病(例如痤疮、酒渣鼻、脂溢性皮炎、斑秃、秃发、多汗症及臭汗症)。

在本申请公开中，根据本发明的疫苗还可作为免疫治疗药物用于治疗分泌腺分泌功能异常。

在本发明的范围内，术语“分泌腺”是指由腺细胞或腺细胞群组成的、执行分泌功能(secretion)的结构，其包括外分泌腺和内分泌腺。分泌腺分泌功能异常包括分泌腺功能亢进症(例如甲状腺功能亢进症)和分泌腺功能减退症(例如甲状腺功能減退症、胰岛功能減退症(糖尿病之一种)等)。

在本申请公开中，根据本发明的疫苗还可作为免疫治疗药物用于介入治疗心血管疾病。介入治疗己经成为心血管疾病的一种重要治疗手段。所述心血管疾病包括例如血管瘤、肥厚型梗阻性心肌病、心房颤动、心律失常、动脉栓塞等。

本发明的疫苗以及包含该疫苗的医用制剂，当其用于预防和治疗局部病变疾病时，还可与其它介入疗法、全身化疗、免疫疗法、光动力疗法、声动力疗法、手术干预或此类疗法的组合相组合施用，以进一步提高疗效。

本申请公开包括以下项目：

项目1、亚甲蓝类染料作为疫苗佐剂的应用。

项目2、根据项目1的应用，其中所述疫苗还包含一种或多种抗原以及药物学可接受的液体载体。

项目3、一种疫苗，其包含作为佐剂的亚甲蓝类染料、一种或多种抗原以及药物学可接受的液体载体。

项目4、根据项目1-3之一的应用或疫苗，其中所述亚甲蓝类染料包括以下化合物及其衍生物：亚甲蓝、专利蓝、异硫蓝，优选为亚甲蓝。

项目5、根据项目4的应用或疫苗，其中所述亚甲蓝类染色剂在该疫苗中的浓度(w/v)≤2％、优选为0.3-2％、更优选为0.5-1.5％。

项目6、根据项目2或3的应用或疫苗，其中所述抗原选自针对实体肿瘤的抗原。

项目7、根据项目6的应用或疫苗，其中所述实体肿瘤包括分泌腺肿瘤和皮肤肿瘤。

项目8、根据项目7的应用或疫苗，其中所述分泌腺肿瘤包括乳腺癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、前列腺癌、肺癌、头颈癌、鼻咽癌。

项目9、根据项目7的应用或疫苗，其中所述皮肤肿瘤是黑色素瘤。

项目10、根据项目2-9之一的应用或疫苗，其中所述疫苗还包含氨基酸类营养素作为另外一种佐剂。

项目11、根据项目10的应用或疫苗，其中所述氨基酸类营养素包括具有营养保健效应的以下氨基酸类化合物之一种或多种：氨基酸、氨基酸盐、寡肽和多肽；优选为选自以下组中的氨基酸或其盐或者包含或由以下氨基酸构成的寡肽和多肽：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、β-丙氨酸、牛磺酸、γ氨基丁酸(GABA)、茶多酚(茶氨酸)、南瓜子氨基酸(3-氨基-3-羧基吡烷酸)、谷氨酰胺、瓜氨酸、鸟氨酸；更优选为选自以下组中的氨基酸或其盐或者包含或由以下氨基酸构成的寡肽和多肽：精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、谷氨酸。

项目12、根据项目11的应用或疫苗，其中所述氨基酸类营养素选自具有营养保健效应的氨基酸或氨基酸盐，且所述氨基酸或氨基酸盐在所述疫苗中的浓度(w/v)为大于≥5％、优选为10-25％或18-25％。

项目13、根据项目11的应用或疫苗，其中所述氨基酸类营养素选自具有营养保健效应的寡肽和多肽，且所述寡肽和多肽在所述疫苗中的浓度(w/v)为大于≥5％、优选为7.5-25％。

项目14、根据项目11的应用或疫苗，其中所述氨基酸类营养素为所述氨基酸和/或氨基酸盐与所述寡肽和/或多肽的组合，且该组合在该局部药物组合物中的浓度(w/v)为大于≥5％、优选为10-25％。

项目15、根据项目11的药物组合物或应用，其中所述寡肽为选自以下组之一种或多种：甘氨酰-L-酪氨酸、甘氨酰丙氨酸、双甘氨肽、赖氨酸-甘氨酸二肽、丙谷二肽、肌肽(β-丙氨酸组氨酸共聚物)、谷胱甘肽、胶原蛋白寡肽、酪蛋白水解肽、大豆寡肽、寡聚精氨酸、寡聚甘氨酸、寡聚赖氨酸；所述多肽为选自以下组之一种或多种：聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚赖氨酸。

项目16、一种疫苗，其是通过冻干或者半冻干部分或全部根据项目3-15之一的疫苗而制备的。

项目17、根据项目1-16之一的疫苗，其为治疗疫苗。

项目18、根据项目1-17之一的应用或疫苗，其中所述疫苗是用于预防或治疗实体肿瘤。

项目19、一种预防和治疗实体肿瘤的方法，其包括向有此需要的个体局部给药根据项目3-18之一的疫苗。

项目20、根据项目18或19的应用、疫苗或方法，其中所述实体肿瘤包括分泌腺肿瘤、皮肤肿瘤和肉瘤。

项目21、根据项目20的疫苗、应用或方法，其中所述分泌腺肿瘤包括乳腺肿瘤、肝肿瘤、结肠肿瘤、胰腺肿瘤、甲状腺肿瘤、前列腺肿瘤、肺肿瘤、头颈肿瘤、鼻咽肿瘤、睾丸肿瘤、阴道肿瘤、子宫肿瘤、卵巢肿瘤。

项目22、根据项目20的疫苗、应用或方法，其中所述皮肤肿瘤包括黑色素瘤。

基于在下文中更详细描述的研究，尽管具体机理尚待进一步研究，本发明的疫苗显示出促进局部病变所在组织的相关结构(例如病变组织、病变细胞及参与构成它们的任一结构)的有效破坏、同时对患者正常组织仅有最小化的损害，从而达到安全、有效治疗局部病变疾病的药学效果。

实施例

通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为对本发明的限制。在以下实施例中，所有的试验动物均依照相关法规及行业自律进行。如无特殊说明，所有试验均按常规方法进行。

以下具体实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中所用的部分亚甲蓝类染料和氨基酸类营养素列于表1中。

表1

在本发明中，L-氨基酸均简写为氨基酸(例如L-精氨酸均简写为精氨酸)，还原型谷胱甘肽简写为谷胱甘肽，丙氨酰-谷氨酰胺二肽简写为丙谷二肽。

在以下实施例中，除非另有说明，皮下移植瘤动物试验均按药管当局颁发的试验指南进行。试验动物为6-8周龄、体重17.5-20.5g的Balb/c裸鼠或小鼠。皮下移植均按常规的肿瘤细胞皮下接种方法进行。除非另有说明，待肿瘤长至所需体积(例如75-500mm³)，采用PEMS 3.2软件(四川大学华西公共卫生学院编制)随机分为若干个组，每组6只动物。试验观察、测量和分析的项目，包括一般状态、体重、摄食量、肿瘤体积、瘤重、胸腺重量、脾脏重量等。

肿瘤体积计算公式如下：

肿瘤体积(V)＝l/2×a×b²，其中a表示肿瘤长，b表示肿瘤宽。

肿瘤生长抑制率(本发明中简记为抑瘤率)计算公式如下：

抑瘤率Y(％)＝(TW-CW)/CW×100％，其中TW为研究组的平均瘤重；CW为阴性对照组的平均瘤重。

在以下实施例中，试验均采用重复测量方差分析(Repeated Measμres ANOVA)分别对指标均数的组别差异进行统计学检验。组别差异有统计学意义时(P≤0.05)，采用最小显著差异法对各组与阴性对照组间差异进行比较。定量指标采用均数±标准误(X±SEM)描述。当LEVENE方差齐性检验提示方差不齐时(P≤0.05)，采用Mann-WhitneyΜ秩和检验(M-W法)比较组间差异。所有的统计分析，均在SPSS for Windows 13.0软件下完成。

实施例1：疫苗制备

本实施例制备的部分本发明的包含亚甲蓝类染料佐剂的疫苗列于表2。

表2

以下列出本发明的制备试验的几个例子。

1、佐剂的制备

1)、亚甲蓝类染料佐剂的制备

按所需浓度量取亚甲蓝类染料(例如2.35g亚甲蓝)、任选存在的其他组分、及配制总体积50％-80％的注射用水(例如76ml)进行溶解，再将溶解液加水定容至总体积(例如100ml)混合均匀后备用(例如2.35％亚甲蓝水溶液)。

2)、亚甲蓝类染料/氨基酸类营养素组合物佐剂的制备

按所需浓度量取亚甲蓝类染料(例如2.36g亚甲蓝)、氨基酸类营养素(例如23.5g赖氨酸盐酸盐)、任选存在的其他组分、及定容至总体积(例如100ml)的注射用水混合在20℃-90℃溶解，制备物(例如2.35％亚甲蓝/23.5％赖氨酸盐酸盐水溶液)在室温下储存备用。

2、疫苗抗原的制备

将肿瘤细胞(例如黑色素瘤B16-f10细胞)悬液接种于6只BALB/c小鼠左前肢腋部皮下，每只接种2×10⁶个细胞，16天后处死小鼠，剥取瘤块，剔除坏死组织，经200目滤网研磨后收集获得细胞悬液并测定和稀释至所需细胞数目，再加入1/10体积DNase(0.01mg/mL)，经反复冻融(-20℃冻存30min再37℃融化10min)直至肿瘤细胞被完全裂解(台盼兰蓝染后显微镜观察)，且经验证(接种BALB/c小鼠)其己丧失致瘤性。在本发明中，该制备物记为细胞裂解物(2×10⁷个细胞/ml)，可用作特异性抗原用于疫苗制备。

3、疫苗的制备

将疫苗抗原与所需的佐剂混合，即为疫苗。其制备包括3种方法：将抗原干粉分散到佐剂溶液(例如上述1制备的佐剂溶液)中；将佐剂干粉分散到含抗原液体(例如上述2制备的含抗原液体)；或将含抗原液体(例如上述2制备的含抗原液体)与佐剂溶液(例如上述1制备的佐剂溶液)混合。

例如，在2.97ml或2.7ml细胞裂解物(2×10⁷个细胞/ml)中加入30mg亚甲蓝、或30mg亚甲蓝和300mg精氨酸，可制得细胞裂解物(2×10⁷个细胞/ml)/1％亚甲蓝疫苗、或细胞裂解物(1×10⁷个细胞/ml)/1％亚甲蓝/10％精氨酸疫苗。

实施例2：佐剂效应研究

1、佐剂效应

将小鼠随机分为13组，每组6只，其中2个阴性对照组和11个研究组。造模细胞为黑色素瘤B16-f10细胞，按前述方法(2×10⁶个细胞/0.1ml)进行移植瘤建模。阴性对照物为生理盐水，其分别行腹腔注射和行皮下注射。6个研究药物及其用药方式如下表所示。药物均为水溶液，按实施例1的制备方法配置而成。各组均在接种肿瘤后第2、8、15日进行1次注射，每次100μl/只。用药结束后5日，对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从各用药方式的阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表3。

表3

在上表腹腔注射各组中，阳性对照组符合以下预期：抗肿瘤细胞药物可以靶向肿瘤细胞从而抑制瘤体生长，而亚甲蓝组、精氨酸组、黑色素瘤细胞裂解物组、黑色素瘤细胞裂解物/亚甲蓝组、黑色素瘤细胞裂解物/亚甲蓝/精氨酸组均未显示出抑制瘤体生长的作用。在皮下注射各组中，与阴性对照组相比，亚甲蓝组、精氨酸组、黑色素瘤细胞裂解物组均没有显著差异(P>0.05)，而黑色素瘤细胞裂解物/亚甲蓝组、黑色素瘤细胞裂解物/亚甲蓝/精氨酸组则显示出显著性差异(P<0.05)。据此结果，亚甲蓝、亚甲蓝/精氨酸显示出明显的佐剂效应。

2、佐剂的更多应用例

以下实验研究了亚甲蓝类染料佐剂在多种疫苗中的应用。在以下实验中，阴性对照物均为生理盐水，药物均为水溶液，均按实施例1的制备方法配置而成。实验均在用药结束后5日，对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从各自阴性对照组计算抑瘤率。

1)、在抗乳腺肿瘤疫苗中的应用

将小鼠随机分为6组，每组6只，其中1个阴性对照组和5个研究组(A、B、C、D、E组)。造模细胞为乳腺瘤4T1细胞，按前述方法(0.1×10⁶个细胞/0.1ml)进行移植瘤建模。阴性对照物为生理盐水，5个研究药物分别为：1％亚甲蓝、20％赖氨酸、4T1细胞裂解物(2×10⁷个细胞/ml)、4T1细胞裂解物(2×10⁷个细胞/ml)/1％亚甲蓝、4T1细胞裂解物(2×10⁷个细胞/ml)/1％亚甲蓝/20％赖氨酸。药物均为水溶液，按实施例1的制备方法配置而成。各组均在接种肿瘤后第2、8、15日进行1次皮下注射，每次100μl/只。用药结束后5日，对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重并计算抑瘤率。

A、B、C、D、E组的抑瘤率分别为3％、1％、8％、26％、34％。与阴性对照组相比，A、B、C组均没有显著差异(P>0.05)，而D、E组则显示出显著性差异(P<0.05)，亚甲蓝、亚甲蓝/赖氨酸显示出明显的佐剂效应。

2)、在抗肝肿瘤疫苗中的应用

将小鼠随机分为6组，每组6只，其中1个阴性对照组和5个研究组(A、B、C、D、E组)。造模细胞为鼠肝癌H22细胞，按前述方法(2×10⁶个细胞/0.1ml)进行移植瘤建模。阴性对照物为生理盐水，5个研究药物分别为：1％亚甲蓝、20％赖氨酸、H22细胞裂解物(2×10⁷个细胞/ml)、H22细胞裂解物(2×10⁷个细胞/ml)/1％亚甲蓝、H22细胞裂解物(2×10⁷个细胞/ml)/1％亚甲蓝/20％赖氨酸。药物均为水溶液，按实施例1的制备方法配置而成。各组均在接种肿瘤后第2、8、15日进行1次皮下注射，每次100μl/只。用药结束后5日，对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重并计算抑瘤率。

A、B、C、D、E组的抑瘤率分别为4％、5％、13％、27％、33％。与阴性对照组相比，A、B、C组均没有显著差异(P>0.05)，而D、E组则显示出显著性差异(P<0.05)，亚甲蓝、亚甲蓝/赖氨酸显示出明显的佐剂效应。

3)、在抗结肠肿瘤疫苗中的应用

将小鼠随机分为6组，每组6只，其中1个阴性对照组和5个研究组(A、B、C、D、E组)。造模细胞为鼠结肠癌CT26细胞，按前述方法(1×10⁶个细胞/0.1ml)进行移植瘤建模。阴性对照物为生理盐水，5个研究药物分别为：1％亚甲蓝、20％精氨酸、乳腺瘤细胞裂解物(2×10⁷个细胞/ml)、乳腺瘤细胞裂解物(2×10⁷个细胞/ml)/1％亚甲蓝、乳腺瘤细胞裂解物(2×10⁷个细胞/ml)/1％亚甲蓝/20％精氨酸。药物均为水溶液，按实施例1的制备方法配置而成。各组均在接种肿瘤后第2、8、15日进行1次皮下注射，每次100μl/只。用药结束后5日，对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重并计算抑瘤率。

A、B、C、D、E组的抑瘤率分别为1％、3％、10％、23％、31％。与阴性对照组相比，A、B、C组均没有显著差异(P>0.05)，而D、E组则显示出显著性差异(P<0.05)，亚甲蓝、亚甲蓝/精氨酸显示出明显的佐剂效应。

使用实施例1的方法制备的其它疫苗(例如表2中的的疫苗)，也可以观察到类似疫苗免疫效应。

除本文中描述的那些外，根据前述描述，本发明的多种修改对本领域技术人员而言会是显而易见的。这样的修改也意图落入所附权利要求书的范围内。本申请中所引用的各参考文献(包括所有专利、专利申请、期刊文章、书籍及任何其它公开)均以其整体援引加入本文。

Claims (10)

1.亚甲蓝类染料作为疫苗佐剂的应用。

2.根据权利要求1的应用，其中所述疫苗还包含一种或多种抗原以及药物学可接受的液体载体。

3.一种疫苗，其包含作为佐剂的亚甲蓝类染料、一种或多种抗原以及药物学可接受的液体载体。

4.根据权利要求1-3之一的应用或疫苗，其中所述亚甲蓝类染料包括以下化合物及其衍生物：亚甲蓝、专利蓝、异硫蓝，优选为亚甲蓝。

5.根据权利要求4的应用或疫苗，其中所述亚甲蓝类染色剂在该疫苗中的浓度(w/v)≤2％、优选为0.3-2％、更优选为0.5-1.5％。

6.根据权利要求2或3的应用或疫苗，其中所述抗原选自针对实体肿瘤的抗原。

7.根据权利要求6的应用或疫苗，其中所述实体肿瘤包括分泌腺肿瘤和皮肤肿瘤。

8.根据权利要求7的应用或疫苗，其中所述分泌腺肿瘤包括乳腺癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、前列腺癌、肺癌、头颈癌、鼻咽癌。

9.根据权利要求7的应用或疫苗，其中所述皮肤肿瘤是黑色素瘤。

10.一种疫苗，其是通过冻干或者半冻干部分或全部根据权利要求3-9之一的疫苗而制备的。