CZ268998A3 - Farmaceutický prostředek - Google Patents

Description

Vynález se týká farmaceutického prostředku, který Obsahuje nejméně jeden imunomodulační peptid, bílkovinu nebo její fragment spolu s pomocným prostředkem.

Dosavadní stav techniky < / ⁱ⁽ Existují kvalitativní a kvantitativní rozdíly mezi nádorovými buňkami a normálními buňkami. Imunitní systém má v zásadě schopnost rozeznat tyto rozdíly a může být aktivní specifickou imunizací vakcínami stimulován k tomu, aby rozpoznával nádorové buňky na základě uvedených rozdílů a vyvolal jejích zničení.

Aby bylo možno vyvolat protinádorovou reakcí uvedeného typu, musí být splněny nejméně dvě podmínky. Především musí u nádorových buněk docházet k expresi antigenu, k jehož expresi u normálních buněk nedochází nebo k ní dochází jen tak omezeně, že je možné kvalitativní rozlišení mezi normální a nádorovou tkání imunitním systémem. Druhou z podmínek je, že imunitní systém musí být odpovídajícím způsobem aktivován, aby mohl reagovat na tyto antigeny. Podstatnou brzdou imunitního léčení nádorů je jejich malá imunogenita, především u lidí. V časném stadiu je možno prokázat antigeny, apojené s ^k nádorem nebo specifické pro nádory, které vytvářejí tak zvaλ né neoepitopy a měly by tedy být potenciálním cílem pro záv sah imunitního systému. Skutečnost, že imunitní systém není schopen nádory zničit nespočívá zřejmě v tom, že by chyběly neoepitopy, nýbrž v tom, že imunologická odpověď na tyto neoantigeny je nedostatečná.

Pro imunitní léčení zhoubných nádorů na buněčné bázi byly vyvinuty dva obecné postupy. Jeden z těchto postupů

- 2 • ·· · ··

spočívá v tom, že se při tak zvané adoptivní imunoterapii pomnoží in vitro T-lymfocyty, reagující na nádor a pak se znovu vrátí do oběhu nemocného. Druhou možností je aktivní imunoterapie, při níž se užívají nádorové buňky v očekávání, že bude vyvolána zesílená odpověS imunitního systému proti nádorovému antigenu, která povede k systemické reakci. Vakcíny pro aktivní imunoterapii již byly připraveny různým způsobem. Jedním z příkladů mohou být ozářené nádorové buňky, •x podávané ve směsi s materiálem, stimulujícím imunitní systém, / jako je Corynebacterium parvum nebo Bacillus Calmette Guerin,

GCG tak, aby byla vyvolána imunitní reakce proti nádorovému antigenu, jak bylo popsáno v publikaci Oettgen H. F. a Old L. J., 1991, Biologie Therapy of Cancer, Ed. DeVita,V. T. Jr. Hellman S., Rosenberg S. A., Verlag J. B. Lippincott Company, Philadelphia, New York, Londýn, Hagerstown, 87 až 119.

V posledních létech byly užity pro aktivní imunoterapii proti nádorům především geneticky modifikované nádorové buňky. Přehled postupů, při nichž byly nádorové buňky učiněny cizorodými k zesílení imunogenity, je možno nalézt v publikaci Zatloukal a další, 1993, Gene, 135, 199 až 220. Podle jednoho z použitých postupů produkovaly geneticky modifikované nádorové buňky cytokiny.

Identifikace a izolace nádorových antigenů a antigenů, spojených s nádory, TA a také od nich odvozených peptidů, tak jak byly popsány například v publikacích Wolfel T. a dal» ší, 1994a), Int. J. Cancer, 57, 413 až 418 a Wolfel T. a další, 1994b), Eur. J. Immunol., 24, 759 až 754, Carrel S. a ’ Johnson J. P., 1993, Current Opinion in Oncology, 5, 383 až

389, Lehmann J. M. a další, 1989, Proč. Nati. Acad. Sci.,

USA, 86, 9891 až 9895, Tibbets L. M. a další, 1993, Cancer, leden 15, sv. 71, 2, 315 až 321, a ve zveřejěnných mezinárodních patentových přihláškách WO 92/20365, WO 94/05304,

WO 94/23031, WO 95/00159, vedla k navržení dalšího postupu, • · · · • · <

• · « ···· ·« ·· · • · · · · · • · · · · · · • · ··· ····· • · · · · ·· · • · · · · · · při němž byly nádorové antigeny použity jako imunogeny pro přípravu vakcín proti nádorům, a to jak ve formě bílkovin, tak ve formě peptidů. Z publikací Boon T., 1992, Adv. Cancer Res., 58, 177 až 210, Boon T. a další, 1994, Annu. Rev. Immunol., 12, 337 až 365, Boon T. a van der Bruggen 0., 1996,

J. Exp. Med., 183, 725 až 729, Van Pel A. a další, 1995, Immunological Reviews, 145, 229 až 250, Van der Eynde B. a Brichard V. G., 1995, Current Opinion Immunol., 7, 674 až 681, , je známo, že maligní melanomy vylučují peptidy, odvozené od / nádorového antigenu v kontextu MHC-I. Protinádorovou vakcinou < ve formě nádorového antigenu jako takového nebylo až dosud dosaženo dostatečné imunogenity k vyvolání buněčné imunitní odpovědi, jíž by bylo zapotřebí ke zničení nádorových buněk, nesoucích nádorové antigeny, jak je uvedeno v Marchand M. a další, 1995, Int. J. of Cancer, 63, 883 až 885. Aby bylo dosaženo toho, aby buňky, presentující antigen, APC, měly na svém povrchu definované peptidové antigeny, bylo navrhováno, vyvolat zmnožení těchto peptidů, což však vedlo k neúčinnému zatížení buněk peptidy podle Tykocinski M. L. a další,

1996, Am. J. Pathol., 148, 1 až 16. Mimoto bylo také prokázáno, že současné aplikace pomocných prostředků zvýšila imunitní odpověď jen velmi omezeně, jak bylo rovněž uvedeno ve svrchu zmíněné publikaci Oettgen H. F. a Old L.J., 1991.

Třetí postup pro aktivní imunoterapii ke zvýšení účinnosti protinádorových vakcín je založen na xenogenizaci autologních nádorových buněk, které pak vlastní imunitní » systém vnímá jako cizorodé. Imunitní systém totiž reaguje ‘ na nádorové buňky, u nichž dochází k expresi cizorodých bílkovin, čímž se vyvolá imunitní reakce.

Ústřední úlohu při řízení specifické imunitní odpovědi hraje komplex, tvořený třemi molekulami, a to složky receptorů T-buněk pro antigen, molekulou hlavního komplexu pro histokompatibilitu, MHC a ligandy, kterými jsou peptidové ······ ·· · fl· ·· ··· ··· ···· • · · flflflfl flflflfl • · · · · · flflflfl · flflfl ··· ······· · · •fl flfl flfl · ·· flfl

- 4 fragmenty, odvozené od bílkoviny.

Molekula MHC (popřípadě odpovídající lidská molekula HLA) je peptidový receptor, který dovoluje při omezené specifičnosti vazbu různých ligandů. Předpoklad pro tuto vazbu tvoří peptidové sekvence, specifické pro allely, které mohou splnit následující kriteria specifičnosti: peptidy mají v závislosti na halotypu MHC definovanou délku, při haplotypu MHC-I jde zpravidla o 8 až 10 zbytků aminokyselin. V typických případech představují zbytky aminokyselin ve dvou polohách tak zvanou kotvu, na níž mohou být vázány pouze určité zbytky aminokyselin s omezenými postranními řetězci. Přesná poloha těchto zakotvujících aminokyselin v peptidech a požadavky na vlastnosti těchto zbytků se v závislosti na haplotypu MHC mění. C-zakončením peptídových ligandů je často alifatický zbytek nebo zbytek, nesoucí náboj. Takové ligandy pro peptidy MHC-I jsou až dosud známé například pro haplotypy H-2K^d, K^b, K^k, K^kml, D^b, HLA-A*0201, A*O2O5 a B*2705.

V rámci metabolismu bílkovin v buňkách se rozkládají normální, cizorodé a umělé produkty genů, například virové bílkoviny nebo nádorové antigeny na malé peptidy. Některé z těchto malých peptidů představují potenciální ligandy pro molekuly MHC. Z tohoto důvodu je k vyvolání buněčné imunitní odpovědi zapotřebí presentace molekulou MHC, přičemž dosud není zcela vysvětleno, jak dochází v buňkách k produkci peptidů jako ligandů pro MHC.

Cizorodé bílkoviny a bílkoviny, modifikované tak, aby byly vnímány jako cizorodé a také fragmenty těchto bílkovin mohou být rozpoznány, vázány a odstraněny také imunoglobuliny, které představují humorální imunitní reakci. To platí také pro nádorové antigeny. Například v případě antigenů MUC1, CEA a HER2/neu, spojených s nádory bylo prokázáno, že

- 5 ···· ·· ·· · ·· ·· • · · φ · · φ · · * • · · φφφφ φφφφ • Φ φφφ φφφφφ φ φφφ φφφ • •••φφφ φ φ imunoglobuliny, které jsou pro tyto bílkoviny specifické, jsou schopné rozpoznat buňky, produkující tuto bílkovinu a zničit ji. K vyvolání humorální imunitní odpovědi, specifické pro určitý nádorový antigen byly z tohoto důvodu zkoušeny různé formy MUC1 a CEA jako imunogenní látky, například v rekombinantních vektorech na zvířecím modelu i při klinických předběžných zkouškách, jak bylo popsáno v publikaci Bronte a další, 1995, J. Immunol., 154, 5282.

s

V rámci vynálezu byly sledovány předpoklady, které by * bylo možno využít při vývoji buněčné vakcíny proti nádorům.

Jde o to, že v normálním organismu jsou normální buňky imunitním systémem tolerovány, avšak v případě virové infekce, kdy dochází v těchto buňkách k produkci cizorodých bílkovin, imunitní systém na tyto buňky reaguje a zničí je. Molekuly MHC v těchto případech totiž presentují cizorodé peptidy, odvozené od cizorodých bílkovin. V důsledku toho registruje imunitní systém uvedenou buňku jako nežádoucí. Dochází k aktivaci systému APC (do tohoto systému náleží makrofágy, dendritické buňky, Langerhansovy buňky, B-buňky a patrně také nedávno objevené bifenotypické buňky, které v sobě spojují vlastnosti B-buněk a makrofágů podle svrchu uvedené publikace Tykocinski a další, 1996), dojde ke tvorbě specifické imunitní reakce a ke zničení buňky.

Nádorové buňky vytvářejí antigeny, specifické pro určité nádory, avšak tyto antigeny jsou vzhledem ke své malé imunogenitě imunitním systémem ignorovány. Avšak v případě, že se do nádorové buňky zavede nikoliv cizorodá bílkovina, nýbrž cizorodý peptid, budou kromě tohoto cizorodého peptidu vnímány jako cizorodé také vlastní nádorové antigeny takové buňky Tímto způsobem je možno dosáhnout vyvolání buněčné imunitní odpovědi proti nádorovému antigenu.

• ·

- 6 Malá imunogenita nádorových buněk nemusí být pouze kvalitativní, nýbrž také kvantitativní problém. Pro peptid z nádorového antigenu, který je presentován molekulami MHC může být koncentrace při presentaci příliš nízká k vyvolání buněčné imunitní odpovědi, specifické pro nádor. Zvýšení počtu peptidů, specifických pro nádor na povrchu nádorové buňky by tedy mělo způsobit, že buňka bude vnímána jako cizorodá a mělo by to vést k vyvolání buněčné imunitní odpovědi. Bylo navrhováno, aby nádorový antigen nebo peptid, odvozený od tohoto antigenu byl presentován přímo na povrchu buněk, předem podrobených transfekcí kódovou DNA pro tuto bílkovinu nebo peptid, jak je popsáno ve zveřejněných mezinárodních patentových přihláškách WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031 a WO 95/00159.

V SRN patentové přihlášce P 195 43 649.0 se popisuje buněčná vakcína, která jako svou účinnou složku obsahuje nádorové buňky, obsahující jeden nebo větší počet peptidů v takovém množství, že jsou imunitním systémem nemocného vnímá ny jako cizorodé a vyvolávají buněčnou imunitní odpoved. Pod statným znakem použitých peptidů je skutečnost, že běží o ligandy pro MHC-haplotyp nemocného. Peptidy jsou tedy rozpoznávány imunitním systémem nemocného jako cizorodé, i když jsou odlišné od peptidů, odvozených od bílkovin, k jejichž expresi dochází v nádorových buňkách nemocného. Další kategorie peptidů může být odvozena od nádorových antigenů, k jejichž expresi dochází v buňkách nemocného. Tyto peptidy vedou ke zvýšení imunogenity tím způsobem, že jsou na povrchu buněk vakcíny k dispozici v takové koncentraci, která je vyšší než koncentrace téhož peptidu na nádorových buňkách nemocného.

Vynález si klade za úkol navrhnout nový farmaceutický prostředek s imunomodulačním účinkem, zvláště vakcínu.

• φ

Koncepce, uvedená v SRN patentové přihlášce P 195 43 649.0 je pokud jde o vakcínu rozvinuta tak, že se navrhuje farmaceutický prostředek, který obsahuje imunomodulačně účinné peptidy nikoliv v souvislosti s buněčným materiálem, nýbrž spolu s pomocným prostředkem s cílem vyvolat buněčnou a/nebo humorální, s výhodou systemickou odpověď imunitního systému proti původci onemocnění nebo proti nádoru, popřípadě takovou odpověď zesílit. Prostředek je popřípadě možno využít také k vyvolání tolerance proti autoimunitně účinným bílkovinám.

Nyní bylo neočekávaně zjištěno, že imunogenitu peptidu mohou zvýšit některé pomocné prostředky, například polykationty, u nichž bylo poprvé již v r. 1965 prokázáno, že mohou zvýšit transport bílkovin do buněk podle publikací Ryser H.

J. a Hancock R., 1965, Science, 150, 501 až 503, Ryser H. J. a Shen W. C., 1978, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 75, 3867 až 3870, a Shen W. C. a Ryser H. J., 1981, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 78, 7589 až 7593.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří farmaceutický prostředek, který obsahuje jeden nebo větší počet imunomodulačně účinných peptidu, bílkovin nebo fragmentů bílkovin spolu s pomocným prostředkem. Použitý pomocný prostředek má schopnost zvýšit vazbu bílkovin, peptidu nebo bílkovinných fragmentů na buňky nemocného nebo zvýšit vstup těchto materiálů do buněk a tím zesílit imunomodulační účinek peptidů, bílkovin nebo fragmentů bílkovin.

V následujícím popisu přihlášky budou peptidy, bílkoviny nebo fragmenty bílkovin, vyvolávající imunomodulační účinek, označovány pouze jako peptidy. Tento výraz, pokud se nevztahuje výslovně na ligandy, může zahrnovat také větší

fl · • · · fl · · • · · fl fragmenty bílkovin nebo bílkoviny, z nichž je .peptid odvozen nebo také produkty odbourávání buněčných bílkovin.

Pod pojmem imunomodulační účinnost se rozumí vyvolání nebo zesílení buněčné a/nebo humorální, s výhodou systemické reakce imunitního systému. V tomto provedení účinkuje farmaceutický prostředek podle vynálezu jako vakcína.

V jednom z výhodných provedení jsou uvedené peptidy ligandy pro nejméně jednu molekulu MHC, k jejíž expresi dochází v organismu nemocného.

Lidské molekuly MHC budou dále podle mezinárodní úmluvy uváděny také jako HLA (antigen lidských leukocytů).

Buněčná imunitní odpověď je především cytotoxická imunita T-buněk, která v důsledku vzniku cytotoxických CD8-pozitivních T-buněk a CD4-pozitivních pomocných T-buněk vyvolá rozrušení nádorových buněk nebo buněk, napadených původcem onemocnění.

Pod pojmem humorální imunitní odpověď se rozumí produkce imunoglobulinu, které selektivně rozpoznávají nádorové buňky nebo struktury, odvozené od původce onemocnění a v důsledku toho spolu s dalšími systémy, například s komplementem, ADCC (cytotoxicita, závislá na protilátkách) nebo fagocytosou zajistí rozrušení nádorových buněk nebo původce onemocnění nebo jím napadených buněk.

Peptid, obsažený ve vakcíně je odvozen od antigenu nebo v případě bílkovin představuje antigen, proti němuž má být vyvolána buněčná a/nebo humorální imunitní odpověď. Působením vakcíny dochází k tomu, že T-buňky nebo jiné cytotoxické efektorové buňky, rozpoznávající původce onemoc• φφ · φφ φφ · φφ φφ • · · φ·· φφφφ φφφ φφφφ φφφφ ·· φφφ φφφφφ φ φφφ φφφ φφφφφφφ φ φ φφ φφ φφ φ φφ φφ

- 9 není nebo nádorové buňky, produkující antigen jsou vytvářeny nebo zmnoženy nebo dochází k produkci protilátek.

Pro imunizaci proti různým původcům onemocnění, jako jsou bakterie, viry, paraziti a podobně, se užívají bílkoviny nebo peptidy těchto organismů nebo bílkoviny nebo peptidy, od těchto organismů odvozené. Výhodné jsou především bílkoviny, které nejsou ovlivněny obecně vysokými mutacemi těchto mikroorganismů. Ze zveřejněných příkladů je možno uvést například lidský virus papilomu HPV16/17 podle publikace Feltkamp M. C. a další, 1995, Eur. J. Immunoi., 25(9), 2638 až 2642, antigen jádra viru hepatitidy B podle Vitiello A. a další, 1995, J. Clin.Inv., 95, 1, 341 až 349, Plasmodium Bergheii podle Widmann C. a další, 1992, J. Immunoi. Methods, 155 (1), 95 až 99, bílkoviny jádra chřipkového viru a virus hepatitidy Č.

V jednom z možných provedení vynálezu je bílkovina při vyvolávání odpovědi proti nádorům nádorový antigen nebo peptid, odvozený od nádorového antigenu a farmaceutický prostředek se užívá jako vakcína proti nádorům. V tomto případě je při léčebném použití vakcíny peptid odvozen od nádorového antigenu, k jehož expresi dochází v nádorových buňkách nemocného. Může jít například o antigeny, které jsou v organismu nemocného produkovány v koncentraci, která je příliš malá k tomu, aby nádorové buňky byly vnímány jako cizorodé.

Nádorové antigeny nemocného mohou být v průběhu diagnosy a stanovení léčení určeny běžnými postupy. Mohou být prokazovány jednoduchým způsobem imunohistochemicky pomocí protilátek. V případě, že nádorovými antigeny jsou enzymy, například tyrosinázy, je možno je prokazovat enzymatickými reakcemi. V případě nádorového antigenu se známou sekvenci je možno použít postupu RT-PCR podle publikací Boon T. a další 1994 svrchu, Coulie P. G. a další, 1994, Int. J. Exp. Med., φφ φ φ φ φ

Φ'ΥΦΦ ·· φφ · • ' φ · φ φ φ φ φ φ φ φφφ φ φ φφφ φ ΦΦΦΦ

ΦΦΦΦ φ φ φ φφ φφφ φφφ

- 10180, 35 až 42 a Weynants Ρ. a další, 1994, Int. J. Cancer, 56, 826 až 829. Dalšími vhodnými postupy jsou'postupy na bázi CTL se specifičností pro stanovované nádorové antigeny. Zkoušky tohoto typu byly popsány například v publikacích Hérin M. a další, 1987, Int. J. Cancer, 39, 390, Coulle P.

G. a další, 1992, Int. J. Cancer, 50, 290 až 296, Cox A. L. a další, 1994, Science, 264, 5159, 716 až 719, Rivoltlni L. a další, 1995, The Journal of Immunology, 154, 5, 2257 až 2265, Kawakami a další, 1995, The Journal of Immunol., 154, 3961 až 3968, a ve WO 94/14459. V uvedených literárních citacích jsou uvedeny některé nádorové antigeny a od nich odvozené peptidové epltopy, vhodné pro použití ve farmaceutickém prostředku podle vynálezu. Příklady vhodných nádorových antigenů je také možno nalézt v souhrnných publikacích Rosenberg S. A., 1996, Annual Reviews of Medicine, 47, 481 až 491 a Genderson R. A. a Finn 0. J., 1996, Advances in Immunology, 62, 217 až 256. Vynález není omezen na použití určitých nádorových antigenů.

Vakcína proti nádorům, která obsahuje nádorové antigeny nebo od nich odvozené peptidy může být použita nejen k léčebným účelům, nýbrž také k prevenci. Při tomto použití se s výhodou užívá směs peptidů, odvozených od často se vyskytujících nádorových antigenů. Při léčebném použití vakcíny podle vynálezu proti nádorům se užívá jednoho nebo většího množství peptidů, při jejichž použití je možno očekávat, že jsou obsaženy v nádorových antigenech nemocného.

Vakcína proti nádorům podle vynálezu má proti buněčné vakcíně na bázi autologních nádorových buněk tu výhodu, že může být využita k léčebným účelům také v poměrně časném sta diu, stadiu I a II onemocnění, v nichž není k dispozici dostatečné množství nádorových buněk pro výrobu autologní buněčné vakcíny.

• · • · ·

- 11 V jednom z výhodných provedení vynálezu se peptid, který je užit k vyvolání buněčné imunitní odpovědi, shoduje s podtypem MHC-I nebo MHC-II jednotlivce, kterému má být vakcína podávána. Peptid má tedy sekvenci nebo obsahuje sekvenci, která zajistí jeho vazbu na molekulu MHC.

V dalším možném provedení obsahuje farmaceutický prostředek, který má být použit jako vakcína proti nádorům kromě imunostimulačně účinného polypeptidu ještě další obdobný polypeptid, zvláště cytokin. Ve výhodném provedení je tímto cytokinem interleukin 2, IL-2 nebo GM-CSF, například v dávce přibližně 1000 jednotek. Jako příklady dalších cytokinů je možno uvést IL-4, IL-12, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, IFN-omega, TNF-alfa, použít je možno také kombinace těchto látek, například IL-2 + IFN-gamma, IL-2 + IL-4, IL-2. + TNF-alfa nebo TNF-alfa + IFN-gamma.

V jednom z provedení vynálezu může sloužit farmaceutický prostředek k vyvolání tolerance proti bílkovinám nebo jejich fragmentům, vyvolávajícím autoimunitní onemocnění, to znamená k léčení těchto onemocnění. Peptidy, užité v tomto případě, jsou odvozeny od bílkovin, které vyvolávají autoimunitní onemocnění.

Na rozdíl od použití peptidů ve vakcíně proti nádorům nebo proti původcům onemocnění, při němž jsou peptidy shodné s úsekem původní bílkoviny, to znamená nádorového antigenu nebo bílkoviny pathogenního organismu, takže peptid je rozpoznáván jako originální antigen dochází při použití k léčení autoimunitních onemocnění k použití takových peptidů, které mají kritické rozdíly v sekvenci aminokyselin ve srovnání s původními bílkovinami. Tyto peptidy se vzhledem ke svým zakotvujícím polohám jsou schopné se vázat na molekulu MHC, avšak ve své sekvenci obsahují mutace, které způsobují, ···· ·· BB · «Β ··· »·· · Β · Β ··· Β Β Β Β Β Β Β B • · Β Β B «··«·· B·· · ·B ······· Β B

BB BB ·· · BB BB

- 12 že uvedené peptidy mají antagonistický účinek a potlačují již aktivované specifické T-buňky, jak je uvedeno v publikaci Kersh G. J. a další, 1996, Nátuře, 380, 6574, 496 až 498.

Jako antagonizující peptidy jsou vhodné tak peptidy s přirozeným antagonismem, které byly zjištěny u některých virů podle Bertoletti A. a další, 1994, Nátuře, 369, 407 až 410 a také látky, které byly nalezeny systematickým sledováním například v peptidových bankách. Jako příklady antagonlzujících peptidů je možno uvést peptidy, schopné potlačit činnost T-buněk, specifických pro základní bílkovinu myelinu tyto peptidy již byly podrobeny zkouškám na svou účinnost na pokusných zvířatech podle Brocke S. a další, 1996, Nátuře, 379, 6563, 343 až 346.

Peptid, který má vyvolat buněčnou imunitní odpověď, se musí vázat na molekulu MHC. Aby došlo k vyvolání imunitní od povědí u nemocného, musí tedy mít tento nemocný v sestavě svých bílkovin odpovídající molekulu HLA. Stanovení podtypu HLA u nemocného je tedy podstatným předpokladem pro možnost vyvolání buněčné imunitní odpovědi a tedy i pro účinné použití peptidů u tohoto nemocného.

Podtyp HLA nemocného je možno stanovit běžnými postupy na toxicitu lymfocytů, například podle Practical Immunology, Ed. Leslie Hudson a Frank C. Hay, Blackwell Sclentific Publications, Oxford, London, Edinburgh, Boston, Melbourne. Tato zkouška je založena na izolaci lymfocytů z krve nemocného, tyto lymfocyty se nejprve uvádějí do styku s antiserem nebo s monoklonální protilátkou proti určité molekule HLA v přítomnosti králičího komplementu C. Positivní buňky se rozruší a barví se indikátorem, kdežto nepoškozené buňky se nebarví.

o *

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 · · · » · ·»<« · ·«« ««« *······ * , ·· ·· 99 9 99 99

- 13 Ke stanovení haplotypu HLA-I nebo HLA-II u nemocného je možno využít také RT-PCR podle publikace Current Protocol in Molecular Biology, 1995, vyd. Ausubel F. M. a další, John Wiley and Sons, Inc., kapitola 2 a 15. K tomuto účelu se ode bere nemocnému krev a z ní se izoluje RNA. Tato RNA se nejprve podrobí reverzní transkripci, čímž se získá cDNA nemocného, která se pak užije jako matrice pro PCR-reakci při použití párů primerů, specifických pro amplifikaci fragmentů DNA pro určitý haplotyp HLA. Při elektroforéze na agarosovém gelu se pak prokazuje pás DNA, k jehož expresi dochází u nemocného v případě, že obsahuje jeho organismus určitou molekulu HLA. V případě nepřítomnosti takového pásu je nemocný negativní.

Definice peptidu, použitého podle vynálezu pomocí molekuly HLA určuje tento peptid, pokud jde o jeho zakotvující aminokyseliny a jeho délku. Pomocí těchto dvou prvků je možno zajistit, aby peptid odpovídal příslušné molekule HLA v organismu nemocného. V důsledku toho pak dochází ke stimulaci imunitního systému a k vyvolání buněčné imunitní reakce, namířené v případě použití peptidu, odvozeného od nádorového antigenu, proti nádorovým buňkám nemocného.

Peptidy, které jsou vhodné pro použití v rámci vynálezu mohou být vybrány ze široké škály látek. Mohou být odvoze ny od přírodně se vyskytujících imunogenních bílkovin nebo produktů jejich odbourávání v buňkách, například od virových nebo bakteriálních peptidů, od nádorových antigenu nebo může jít o antagonisty proti peptidům, odvozeným od bílkovin, kte ré vyvolávají autoimunitní onemocnění.

Vhodné peptidy je možno vybírat například na základě peptidových sekvenci, známých z literatury.

• * · * * ·· *«

- 14 Z hlediska vyvolání buněčné imunitní odpovědi je možno peptidy definovat například podle publikací Rammensee H.

G. a další, 1993, Current Opinion in Immunology, 5, 35 až 44, Rammensee H. G. a další, 1995, Current Biology, 7, 85 až 96 a Falk K. a další, 1991, Nátuře, 351, 290 až 296, v těchto publikacích jsou popsány peptidy pro odlišné motivy HLA, odvozené od bílkovin s imunogenním účinkem různého původu, tyto peptidy jsou schopné se vázat na příslušné podtypy HLA.

Pro peptidy, které obsahují část sekvence bílkoviny s imunogenním účinkem je možno na základě jíž známých polypeptidových sekvencí srovnáváním sekvence s ohledem na HLA-specifické požadavky stanovit, které z peptidů budou vhodné pro použití. Příklady vhodných peptidů je možno nalézt například ve svrchu uvedených publikacích Rammensee a další, 1993, Falk a další, 1991 a Rammensee, 1995 a také v případě peptidů HIV v WO 91/09869. Z peptidů, odvozených od nádorových antigenů jsou některé látky popsány ve zveřejněných mezinárodních patentových přihláškách WO 95/00159, WO 94/05304. K velmi vhodným látkám náleží peptidy, jejichž imunogeníta jíž byla prokázána, to znamená zejména peptidy, odvozené od virových nebo bakteriálních bílkovin.

Místo původních peptidů, které mají schopnost vazby na příslušné místo molekuly MHC-I nebp MHC-II, to znamená peptidů, které jsou bezezměn odvozeny od přírodních bílkovin je možno použít peptidy, které více odpovídají požadavkům na zakotvující polohy a na délku než původní peptidová sekvence a je tedy možno uskutečnit variace, pokud tyto variace neovlivní účinnou imunogenitu peptidu, která je tvořena kombinací vazné afinity na molekulu MHC a schopnosti stimulovat receptory T-buněk, nebo pokud tyto variace imunogenitu peptidu naopak zesílí. K tomuto účelu je podle vynálezu možno použít také uměle syntetizované peptidy, které odpovídají

- 15 ··· · ·· požadavku na schopnost vazby na molekulu MHC. Je tedy například možno vycházet z H2-K^-ligandu Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile (LFEAIEGFI) a pozměnit aminokyseliny, odlišné od zakotvujících aminokyselin za vzniku peptidu se sekvencí Phe Phe Ile Gly Ala Leu Glu Glu Ile (FFIGALEEI), mimoto je možno zakotvující aminokyselinu Ile v poloze 9 nahradit Leu. Určování epitopů ligandu MHC-I a MHC-II a jejich variací je možno uskutečnit například podle publikace Rammensee H. G., 1995, Current Opinion in Immunology, 7, 85 až 96. Délka peptidu odpovídá při jeho úpravě pro molekulu MHC-I s výhodou minimální sekvenci 8 až 10 zbytků aminokyselin s požadovanými zakotvujícími aminokyselinami. Vazná skupina MHC-II, zasahující přes nové zbytky aminokyselin má vysoký stupeň degenerace v zakotvujících polohách. V poslední době byly na základě analýzy struktury pomocí rtg-paprsků vyvinuty pro molekuly MHC-II postupy, které dovolují přesnou analýzu vazných motivů MHC-II a na základě této analýzy i variace peptidové sekvence podle Rammensee a další, 1995, Immunogenetics, 41, 178 až. 228.

Peptid může být popřípadě na C- a/nebo na N-konci prodloužen, pokud toto prodloužení nepříznivě neovlivní schopnost vazby na molekulu MHC a pokud je možno prodloužený peptid v buněčném materiálu zpracovat na minimální sekvenci.

V jednom z provedení vynálezu může peptid nést negativní náboj. V tomto provedení může být peptid prodloužen aminokyselinami s negativním nábojem nebo je možno negativně nabité aminokyseliny do peptidu zabudovat, s výhodou v polohách, které nejsou nezbytné pro rozpoznání specifickými CTL nebo pokud nejde o zakotvující aminokyseliny tak, aby bylo možno dosáhnout elektrostatické vazby peptidu na polykationtový pomocný prostředek, například na polylysin.

• · · · · · • · · · * ·· • · · · · · ···· ··· ···· 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4444 4 444 444

4 4 4 4 4 4 4 4

9 9 9 9 9 4 4 4 4 9

- 16 V dalším provedení vynálezu není antigen použit ve formě peptidu, nýbrž ve formě bílkoviny nebo jejího fragmentu nebo ve formě bílkoviny ve směsi s bílkovinnými fragmenty.

V rámci vynálezu jsou pro použití vhodné větší fragmenty bílkovin nebo úplné bílkoviny, které jsou po aplikaci zpracovány pomocí APC nemocného na peptidy, schopné vazby na molekulu MHC.

Bílkovina představuje antigen nebo nádorový antigen, od něhož je možno odvodit fragmenty, získané zpracováním.

V tomto provedení slouží pomocný prostředek k tomu zvýšit množství tohoto materiálu, to znamená nádorového antigenu nebo jeho fragmentů v buňkách, zvláště APC, jako jsou dendritické buňky nebo makrofágy nebo alespoň přítomnost tohoto materiálu umožnit. Bílkoviny nebo jejich fragmenty, přijaté do buněk pak podléhají uvnitř buněk zpracování a mohou být presentovány efektorovým buňkám imunitního systému v rámmci MHC a tak vyvolat nebo zesílit odpověď imunitního systému, jak bylo popsáno v publikacích Braciale T. J. a Braciale V. L., 1991, Immunol. Today, 12, 124 až 129, Kovacsovics Bamkowski M. a Rock K. L., 1995, Science, 267, 243 až 246,

York I. A. a Rock K. L., 1996, Ann. Rev. Immunol., 14,

369 až 396.

Při provedení vynálezu, v němž jsou jako antigeny užity bílkoviny nebo větší fragmenty bálkoviny, je možno pozorovat výhodu v tom, že vzniká menší závislost na typu HLA nemocného vzhledem k tomu, že bílkovina je zpracovávána ve formě většího počtu různých fragmentů a tak je k dispozici vyšší variabilita peptidových forem.

V případě podávání bílkovin nebo bílkovinných fragmentů je možno identifikovat konečné produkty zpracování chemickou analýzou, jako Edmanový odbouráním nebo hmotovou spektrometrií

- 17 9999 99 ·

I · » · • · · zpracovaných fragmentů podle svrchu uvedené souhrnné publikace Rammensee a další, 1995 nebo podle biologických zkoušek, to znamená na základě schopnosti APC stimulovat T-buňky, specifické pro zpracované fragmenty.

Vybírání peptidů, které jsou schopné vyvolat buněčnou imunitní odpověď probíhá zásadně v několika stupních. Obecně jsou tyto peptidy, obvykle v sériových zkouškách najprve zkoumány na svou schopnost se vázat na molekuly MHC.

Vhodný postup spočívá ve schopnosti peptidů, stabilizovat neobsazené molekuly MHC, jak bylo popsáno například v publikacích Stuber G. a další, 1994, Eur. J. Immunol., 24,

765 až 768, Mclntyre C. A. a další, 1996, Cancer Immunol. Immunother., 42, 246 až 250. K tomuto účelu se peptid nanese na buňky, u nichž dochází k expresi příslušné molekuly MHC, avšak vzhledem ke genetickému defektu se v této souvislosti nevytváří žádný endogenní peptid. Vhodnou buněčnou linií tohoto typu je například RMA-S (myš) a T2 (člověk) a varianty těchto linií po transfekci. Pak již zbývá pouze prokázat přítomnost molekuly HMC, stabilizované peptidem, s výhodou průtokovou cytometrií, založenou na analýze FACS podle publikací Flow Cytometry, Acad. Press, Methods in Cell Biology, 1989, sv. 33, vyd.: Darzynkiewicz T. a Crissman H. A., FACS Vantage x TM

TM User s Guide, 1994, CELL Quest User s Guide, 1994. Stabilní molekuly MHC je možno prokázat pomocí příslušné protilátky proti MHC a fluorescenčního barviva, například FITC (fluoresceinisothiokyanát) tak, že se tímto fluorescenčním barvivém značí druhá, například polyklonální protilátka. Při průtoku buněk se pak jednotlivé buňky zasáhnou laserem určité vlnové délky. Pak se měří emitovaná fluorescence, která závisí na množství peptidu, vázaného na buňce.

Další metodou pro stanovení množství vázaného peptidu je postup, uvedený v publikaci Sette A. a další, 1994, Mol.

• · A ···· ·· • · · ··· ··«· ··· · · · · β··· ·· ··· ······ ··· ···

A···#·· · · • · · · ·· · ·· ··

- 18 Immunol., 31(11), 813 až 822. K tomuto účelu se užije peptid, 125 značený například I, který se inkubuje přes noc s izolovanými nebo rekombinantním způsobem získanými molekulami MHC při teplotě 4 °C za přítomnosti různých definovaných koncentrací tohoto peptidu. Ke stanovené nespecifické výměny tohoto peptidu se k některým vzorkům přidá přebytek neznačeného peptidu, který potlačí nespecifickou interakci značeného peptidu. Pak se nespecificky vázaný peptid odstraní například chromatografií na gelu. Množství vázaného peptidu se pak stanoví na základě radioaktivity pomocí scintilačního počítače a výsledky se vyhodnotí běžným způsobem.

Přehled postupů pro charakterizaci interakce mezi MHC a peptidy, analýzy ligandů MHC a vazby peptidu je možno nalézt ve svrchu uvedené publikaci Rammensee a další, 1995.

V následujícím stupni se zkoumají jednotlivé peptidy s dobrou schopností vazby na svou imunogenitu.

Vyvolání buněčné imunitní odpovědi je možno ověřit sledováním CTL se specifičností pro peptid, například podle svrchu uvedené publikace Current Protocols in immunology,

Kap. 3, nebo podle publikace Blomberg K. a Ulfstedt A. C., 1993, J. Immunol. Methods, 160, 27 až 34. Další sledování buněčné imunitní odpovědi může probíhat tak, že se prokazuje, že v nepřítomnosti T-buněk u pokusného zvířete (které bylo předem zpracováno tak, že mu byly podány protilátky, vyvolávající vymizení buněk CD4 nebo CD8) nedochází k žádné imunitní odpovědi, jak je rovněž popsáno ve svrchu uvedené publikaci Current Protocols in Immunology, kap. 3.

Buněčná imunitní odpověď se může prokazovat také sledováním reakce typu opožděných projevů přecitlivosti,

DHT u imunizovaných zvířat. K tomuto účelu je například fc · · · fc · • ·

9· · · · · «···

9· fcfcfc 9····« fcfcfc ··« ······· · · • 9 · · fcfc · ·· **

- 19 možno vstřiknout definované množství peptidu do tlapek myší a pak měřit vzniklý otok, jak bylo popsáno v publikacích Grohmann U. a další, 1995, Eur. J. Immunol., 25, 2797 až 2802 a Puccetti P. a další, 1995. Eur. J. Immunol., 24, 1446 až 1452.

Indukce humorální imunitní odpovědi peptidy, které jsou pro organismus cizorodými antigeny nebo antigeny, k jejichž expresi dochází v organismu jen v malé koncentraci, může být prokázána sledováním specifických protilátek v krevním séru. Vhodným postupem pro stanovení titru protilátek v séru je imunologická zkouška na bázi vázaného enzymu, ELISA. Postup spočívá v tom, že se specifické protilátky po vazbě na peptid, použitý k imunizaci, prokazují pomocí barevné reakce. Alternativním postupem je Western blot. V tomto případě se specifické protilátky v séru navazují na peptid, imobilizovaný na membráně. Vázaná protilátka se pak prokazuje opět barevnou reakcí, jak je také popsáno ve svrchu uvedené publikaci Current Protocols in Immunology, 1991.

Především po vakcinaci cizorodým antigenem, například virového původu, je možno očekávat tvorbu protilátek. Není však možno vyloučit, že specifické protilátky budou vytvořeny také proti mutovaným peptidům, odvozeným od antigenu nádorových buněk. Rozrušení nádoru těmito protilátkami může probíhat tak, že protilátky jsou schopné se vázat na nádorové buňky přes další složky imunitního systému, například přes komplement, v důsledku cytotoxicity protilátky, ADCC nebo fagocytosou pomocí makrofágu podle publikace Roit I. Μ., Brostoff J., Male D. K., Immunology, Churchil Livingstone.

Vyvolání buněčné imunitní odpovědi působením peptidu, odvozených od bílkovin, jejichž imunogenní účinnost není známa, je možno sledovat například způsobem podle publikace • · · · · · ···· • · · · · · · · · · · ·· · · · ······ · · · ·· · ······· · · ·· 99 99 9 99 99

- 20 Kawakami Y. a další, 1994a, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 91, 9, 3515 až 3519 a podle svrchu uvedené publikace Rivoltini a další, 1995. K tomuto účelu se užijí T-buňky, které mohou rozpoznat požadovaný peptid v případe, že je presentován molekulami MHC. V případě peptidu, pocházejících z nádorových buněk se odpovídající T-buňky získávají z lymfocytů, infiltrujících nádor, TIL, jak bylo popsáno v publikaci Kawakami Y. a další, 1994b, J. Exp. Med., 180, 1, 347 až 352. V případě cizorodých peptidu se T-buňky získávají analogicky z periferní krve. Tyto T-buňky byly uvedeny do styku s buněčnými liniemi, například T2 podle publikace Alexander J. a další, 1989, Immunogenetics, 29, 380 nebo RMA-S podle publikace Kárre K. a další, 1986, Nátuře, 319, 20. února, 675, po inkubaci a rozrušení buněk, k němuž dochází v případě imunogenního peptidu.

Další možností pro sledování peptidu, schopných se vázat na MHC, na jejich imunogenitu je sledování vazby peptidů na buňky T2. Zkouška je založena na přítomnosti defektu buněk T2 nebo RMA-S v mechanismu transportu TAP-peptidu, tyto buňky mohou presentovat stabilní molekuly MHC teprve po nanesení peptidů, které mohou být v této souvislosti presentovány. Pro tuto zkoušku je možno použít například buňky T2 nebo RMA-S po stabilní transfekci genem HLA, například HLA-A1 a/nebo HLA-A2. V případě, že se buňky smísí s peptidy, které jsou dobrými ligandy HLA a jsou tedy presentovány v kontextu HLA tak, že jsou vnímány imunitním systémem jako cizorodé, způsobí tyto peptidy výstup molekul HLA ve významném množství na povrch buněk. Průkaz HLA na povrchu buněk, například pomocí monoklonální protilátky pak dovoluje identifikaci takových peptidů podle publikace Malnati M. S. a další, 1995, Science, 267, 1016 až 1018 nebo Sykulev Y. a další, 1994, Immunity 1, 15 až 22. Také v tomto případě se účelně použije peptid s dobrou schopností vazby na HLA.

···· ·· • · Λ flfl····

S ohledem na možnost širokého použití farmaceutického prostředku podle vynálezu se účelně používá směs většího .

množství peptidů, z nichž má každý z těchto peptidů schopnost vázat se na jinou molekulu MHC, a to s výhodou také na jeden ze dvou nebo tří nejčastěji se vyskytujících podtypů MHC. Vakcína na bázi směsi peptidů, schopných se vázat na uvedené haplotypy může být vhodná pro širokou škálu nemocných

Podle jednoho provedení vynálezu může vakcína obsahovat peptidy s různými sekvencemi. Použité peptidy se mohou na jedné straně odlišovat tím, že jsou schopné se vázat na odlišné podtypy HLA. Tím je možno dosáhnout ovlivnění většího počtu podtypů HLA u jednoho nemocného nebo je možno ovlivnit větší skupinu nemocných.

Další variabilita použitých peptidů může spočívat v tom, že se peptidy, schopné vazby na určitý podtyp HLA liší sekvencí, která není podstatná pro vazbu na HLA. Může jít například o rozdílné bílkoviny téhož původce infekce nebo různých mikroorganismů. V důsledku takové variability je možno dosáhnout zesílení nebo stimulace odpovědi imunitního systému nebo imunizace proti různým pathogenům.

Množství účinného peptidu se ve farmaceutickém prostředku podle vynálezu může měnit v širokém rozmezí. Použité množství závisí na způsobu podání a použitém typu prostředku. Množství peptidu pro jednotlivou dávku se může pohybovat například v rozmezí 1,0 až 5000, s výhodou 1,0 až 1000 a zvláště 10 až 500 mikrogramů. Tuto dávku je možno podávat jednou nebo vícekrát denně, v případě opakovaného podávání účelně nejméně třikrát. Zvláště při léčebném podání může dojít také k aplikaci v různých intervalech, například lx týdně až Ix měsíčně po libovolně dlouhou dobu tak, aby bylo možno ovlivnit stav imunitního systému nemocného a tím také průběh jeho choroby.

··«·«· 9 · 9 9 9 ·· • 99 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 999999 99 9 ·9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 9 99 99

- 22 Farmaceutický prostředek podle vynálezu může být použit také ex vivo. Princip tohoto použití spočívá v tom, že se pěstují ex vivo elementy APC, například dendritické buňky v buněčné kultuře spolu s prostředkem podle vynálezu a elementy APC, které nyní presentují použitý peptid v MHC se podávají nemocným. Pro toto použití již byly popsány v literatuře různé postupy, například v publikaci Porgador A., Gilboa E.,

1995, J. Exp. Med., 182, 255 až 260, a Young J. W., Inaba K.,

1996, J. Exp. Med., 183, 7 až 11.

Pomocný prostředek obsažený ve farmaceutickém prostředku podle vynálezu má usnadnit vstup peptidů do buněk nebo vazbu peptidů na buňky nemocného a tím zesílit imunogenitu peptidu. Pomocný prostředek může například učinit alespoň na krátkou dobu propustnými membrány buněk, do nichž má být peptid uložen tak, aby se peptid snáze dostal do buněk. K tomuto účelu může být výhodné vázat peptid na pomocný prostředek, například vazbou elektronegativního peptidu na polykationtový pomocný prostředek. Přenos peptidů do buněk je možno uskutečnit také tak, aby byl peptid k dispozici v blízkosti buněčné membrány, jakmile pomocný prostředek ovlivní její propustnost. Účinek pomocného prostředku může spočívat také v tom, že dojde ke zvýšení kritické koncentrace peptidů na povrchu buněk nebo dojde k fagocytose nebo pinocytoze peptidů do buněk.

Je překvapující, že pomocný prostředek nejen zesiluje pronikání peptidu do buněk, nýbrž zesiluje také imunomodulační účinnost peptidů, pravděpodobně správnou presentací peptidů molekulami MHC.

V jednom z možných provedení je možno použít jako pomocné prostředky obecně všechny látky, zvyšující propustnost membrán, tak jak jsou užívány pro transport nukleových kyselin do buněk. Postup je popsán například v WO 93/19768.

φφ φφ φ φ φ φ • φφφ ·· φ

φ φ φ φφ φφφ φ φ φ φ φ φ

Podle jednoho z výhodných provedení vynálezu se jako pomocný prostředek užije bazická polyaminokyselina nebo směs bazických polyaminokyselin.

Stupeň polymerace polyaminokyselin se může měnit v širokém rozmezí 5 až 1000, s výhodou 15 až 500.

Dalším výhodným pomocným prostředkem pro použití v prostředků podle vynálezu je polyarginin.

Výhodným pomocným prostředkem, užitým v prostředku podle vynálezu je také polylysin.

Jako příklady dalších vhodných, zvláště polykationtových organických sloučenin ze skupiny bazických aminokyselin je možno uvést polyornizhin, histon, protamin, polyethylenimin nebo směsi těchto látek.

Pomocný prostředek je popřípadě konjugován s některým z buněčných ligandů, například s transferinem, gp 120, LDL (lipoprotein s nízkou hustotou), alfa-fetuinem, EGF (epidermální růstový faktor) nebo s jiným buněčným ligandem, tak jak jsou tyto látky popsány pro transort DNA při použití endocytosy, zprostředkované receptory v mezinárodní patentové přihlášce WO 93/07283. Použít je možno také zbytky uhlohydrátů, jako mannosy nebo fukosy, které jsou ligandy pro makrofágy nebo také protilátky a jejich fragmenty proti bílkovinám na povrchu buněk.

Polykationtové pomocné prostředky, například polyarginin nebo polylysin, popřípadě konjugované s buněčnými ligandy mohou také mít formu části komplexu s DNA, například plasmidové DNA.

··

9 • · • · · • · • 9 ·

*··· ··

99

- 24 Kódová DNA může obsahovat kódové sekvence pro imunomodulaění bílkoviny, zejména cytokiny, například IL-2, interferon nebo GM-CSF.

DNA však může být také prostá kódových sekvencí pro funkční bílkoviny, v tomto případě jde o prázdný plasmid.

Aby bylo možno sledovat mechanismus transportu peptidu, zprostředkovaný bazickými polyaminokyselinami, bylo měřeno uvolňování laktátdehydrogenázy LDH. Ve vzorcích, zpracovaných polyargininem téměř nebylo možno uvolněnou LDG prokázat, kdežto při inkubaci s polylysinem bylo možno v supernatantech buněk prokázat vysoké koncentrace uvedeného enzymu.

Z těchto výsledků je možno uzavřít, že polylysin patrně zvyšuje permeabilitu buněčných membrán.

Aniž by bylo nutno se vázat na jakékoliv teoretické úvahy, mohla by účinnost farmaceutického prostředku podle vynálezu spočívat v tom, že peptid pronikne s pomocí pomocného prostředku do cílových buněk nebo dochází k jeho vazbě na tyto buňky, uložené v endodermální oblasti pokožky. Cílovými buňkami jsou mimo jiné buňky, presentující antigen, jimiž je presentován také přiváděný peptid, po případném zpracování buňkami B a/nebo T. Jako příklad cílových buněk je možno uvést makrofágy, fibroblasty, keratinocyty, Langerhansovy buňky, dendritické buňky nebo B-buňky.

V rámci vynálezu bylo sledováno, zda mohou být malé peptidy v přítomnosti bazických polyaminokyselin nebo v přítomnosti glykosylovaných forem polykationtu ve větší míře přijímány buňkami, presentujícími antigen, APC typu makrofágů. Je známo, že zbytky cukrů jsou makrofágy přijímány endocytosou, zprostředkovanou přes receptory. 0 APC je současně známo, že in vivo představují typ buněk, které • · · * · « ♦ ♦ ♦ t * · · · ♦ · • · ··· ···*· * * · · · · ♦ • · · · ·· · ···· ** ·· ·· • * * * . · ♦ · ··· ··· • · ·· ··

- 25 přijímají peptidy a presentují je dalším buňkám imunitního systému. Výsledky pokusu in vitro prokazují, že APC v přítomnosti sledovaných pomocných prostředků přijímají endocytosou vyšší množství antigenních peptidů.Důsledkem je patrně skutečnost, že pomocné prostředky také in vivo zvyšují presentaci peptidů cytotoxickým efektorovým buňkám a aktivaci těchto buněk, což vede k celkově zesílené imunitní odpovědi proti antigenu, přiváděnému vakcinou.

Jako pomocné prostředky je možno použít některé složky i v částicové formě, popřípadě kromě svrchu uvedených pomocných prostředků. Pro tyto částice jsou zásadně vhodné takové materiály, které se užívají také při syntéze peptidů, například jde o silikagel nebo umělé pryskyřice, pokud jdou tyto materiály přijatelné z fyziologického hlediska a pokud z nich je možno vytvořit částice, které jsou dostatečně malé k tomu, aby mohly proniknout do buněk. Při použití pomocných prostředků v částicové formě je možno dosáhnout vysokých místních koncentrací peptidů, což opět může usnadnit příjem peptidů do buněk.

Povahu použitého pomocného prostředku, účelnost jeho modifikace buněčnými ligandy nebo vazbou na DNA a potřebné množství pomocného prostředku vzhledem k peptidů je možno určit předběžnými pokusy, například titrací. Obvykle se může množství použitého pomocného prostředku pohybovat ve velmi širokém rozmezí.

Zkoušky s pomocnými prostředky mohou být zásadně prováděny stejnými postupy jako zkoušky s peptidy, popřípadě v několika stupních.

Schopnost pomocného prostředku zvýšit příjem peptidů nebo jeho vazbu na APC je možno v prvním stupni měřit například tak, že se APC inkubují s fluorescenčně značenými φ φ φφ φ φ φ φ φ φ φ φ φφφ φφφ φ φ φ φ φ φ

ΦΦΦΦ 1« *· · φ φ φ φ φ φ • · · φ · φ φ φ φ φφφ φ φφφ φφφφ φ φ φ φφ φφ φφ ·

- 26 peptidy a pomocným prostředkem. Vyšší příjem peptidu nebo vazbu působením pomocného prostředku je možno prokázat srovnáním s buňkami, které byly inkubovány pouze s peptidem, obvykle se užije průtoková cytometrie.

Ve druhém stupni mohou být pomocné prostředky sledovány in vitro na presentaci peptidu elementy APC v přítomnosti pomocného prostředku, přičemž je možno použít postupů, které byly uvedeny svrchu pro peptidy.

Další možností sledování účinnosti pomocného prostředku je použití modelového systému in vitro. V tomto případě se elementy APC inkubují spolu s pomocným prostředkem a peptidem a měří se relativní aktivace klonu T-buněk, specificky rozpoznávajícího použitý peptid, postup byl popsán v publikaci Coligan J. E. a další, 1991, Nátuře, 351, 290 až 296 a Lopez J. A. a další, 1993, Eur. J. Immunol., 23, 217 až 223.

Účinnost prostředku podle vynálezu je možno prokázat také přes buněčnou imunitní reakci sledováním tak zvané opožděné přecitlivělosti DTH u imunizovaných zvířat.

Konečně je možno imunomodulační účinek měřit také v pokusech na zvířatech. Užívá se například standardních modelů pro nádory, při nichž se používá známých peptidových sekvencí, rozpoznávaných buňkami imunitního systému. Vakcina, která obsahuje peptid a pomocný prostředek se podává v různých poměrech peptidu a pomocného prostředku a v různém celkovém množství. Ochrana před růstem nádoru je pak mírou účinnosti vakcíny.

Farmaceutický prostředek podle vynálezu je možno podávat parenterálně, perorálně nebo místně. S výhodou se • · ·

9999 99

9 8

9

9 9

9 9 9

99 »·

- 27 podává parenterálně, například podkožně, intradermálně nebo nitrosvalově, výhodné je zejména podkožní nebo intradermální podání, jímž je možno zasáhnout jako cílové buňky především buňky pokožky, jako keratinocyty a fibroblasty, dendritické buňky, Langerhansovy buňky nebo makrofágy. V rámci léčení nádorů může být vakcína proti nádorům podávána také přímo do místa, v němž se nádor nachází.

Pro parenterální podání padá v úvahu především roztok nebo suspenze peptidu a pomocného prostředku ve farmaceutickém nosiči, s výhodou s nosiči vodné povahy. Může jít například o vodu, vodu s přísadou pufru, 0,4% roztok chloridu sodného, 0,3% roztok glycinu, roztok kyseliny hyaluronové a podobné známé nosiče. Kromě vodných nosičů je možno použít také rozpouštědla, jako jsou dimethylsulfoxid, propylenglykol, dimethyiformamid a směsi těchto látek. Farmaceutický prostředek může mimoto obsahovat běžně užívané pomocné látky, například pufry nebo anorganické soli pro vyrovnání osmotického tlaku a/nebo k dosažení účinné lyofilizace. Jako příklad je možno uvést sodné a draselné soli, jako chloridy a fosfáty, sacharosu, glukosu, hydrolyzáty bílkovin, dextran, polyvinylpyrrolidon nebo polyethylenglykol. Farmaceutický prostředek je možno sterilizovat běžnými postupy, například filtrací. Pak je prostředek možno plnit do ampulí nebo také lyofilizovat a dodávat ve formě prášku, určeného ke smísení se sterilním roztokem těsně před použitím.

Podle jednoho z možných provedení je farmaceutický prostředek podle vynálezu prostředek pro místní podání, například pro dermální nebo transdermální aplikaci. Může jít například o hydrogel na bázi polyakrylové kyseliny nebo polyakrylamídu, například Dolobene (Merckle), dále může jít o mast, například s obsahem polyethylenglykolu PEG jako nosného prostředí, může jít o standardní mast DAB 8, obsahující ·· 0 ·· ··

000 000 0004 • 44 4444 «444

4 4 4 04444 4 440 444

4444444 0 0

00 00 0 40 00 % PEG 300 a 50 % PEG 1500, nebo může mít prostředek formu emulze, především mikroemulze typu voda v oleji nebo olej ve vodě, popřípadě s přidáním liposomů. Jako pomocné látky, zvyšující průnik, může prostředek obsahovat sulfoxidové deriváty, jako jsou dimethylsulfoxid DMSO nebo decylmethylsulfoxid decyl-MSO nebo také diethylenglykolmonoethylether, Transcutol nebo také cyklodextriny, další pyrrolidony, jako

2-pyrrolidon, N-methyl-2-pyrrolidon, kyselinu 2-pyrrolidon-5-karboxylovou nebo biologicky odbouratelný N-(2-hydroxyethyl)-2-pyrrolidon a estery těchto látek s mastnými kyselinami, deriváty močoviny, jako jsou dodecylmočovina, 1,3-didodecylmočovina a 1,3-difenylmoěovina, terpeny, jako D-limonen, menthon, alfa-terpinol, carvol, limonenoxid nebo 1,8-cineol.

Dalším možným způsobem podávání je podávání ve formě aerosolu, například na nosní sliznici nebo inhalací.

Prostředek podle vynálezu může být podáván také ve formě liposomů, které mohou mít formu emulze, pěny, micel, nerozpustných souvislých vrstev, disperzí fosfolipídů, lamelárních vrstev a podobně. Tyto struktury jsou nosným prostředím pro cílený přívod peptidu k určité tkáni, například lymfoidní tkáně nebo nádorové tkáně nebo mohou sloužit k prodloužení poločasu peptidu v organismu.

V případě, že je prostředek určen pro místní podání, může obsahovat také látky, absorbující UV záření například při preventivním použití proti melanomu.

Vhodné pomocné prostředky jsou podrobně popsány v souhrnné publikaci Remingstonís Pharmaceutical Sciences,

18. vydání, 1990, Mack Publishing Company, Easton, Penn., ·····* · * * · · ·· t · · · · ♦ » » · · • · · ·«·· · · · · « · φ · · * »··· * «·· ··· ······· » · ·· ·· <*· · ·· ··

- 29 Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je znázorněn průběh vakcinace myší DBA/2 proti mastocytomu P815 při použití peptidů KYQAVTTTL.

Na obr. 2 je znázorněn průběh vakcinace myší DBA/2 proti mastocytomu P815 při použití peptidů SYFPEITHI.

Na obr. 3 je znázorněn průběh vakcinace myší DBA/2 proti mastocytomu P815 při použití peptidů SYFPEITHI.

Na obr. 4 je znázorněn průběh vakcinace myší DBA/2 proti melanomu M-3 při použití směsi peptidů.

Na obr. 5 je znázorněn průběh vakcinace myší DBA/2 proti melanomu M-3 při místním podání vakcíny.

Na obr. 6 je znázorněn průběh vakcinace myší DBA./2 proti metastázám melanomu M-3.

Na obr. 7 je znázorněna vakcinace myší s mikrometastázami melanomu M-3 při použití směsi peptidů.

Na obr. 8 je znázorněn příjem tyrosinázy buňkami, zprostředkovaný polylysinem.

Na obr. 9 je znázorněna aktivace T-buněk po vakcinaci na modelu (uvolňování IFN-gamma ze slezinných buněk očkovaných zvířat jako reakce na přítomnost buněk M-3).

Na obr. 10 je znázorněna Indukce protlvirové Imunity při použití kapsidového peptidů jádra chřipkového viru ASNENMETM a fukosylovaného polylysinu jako pomocného prostředku (aktivace CPL).

·· • · · • · · • ··« « » • ♦ · • · · · • · · ··· · • · · ·· ··· ···· ·· • · · • · · * · · · · · ·· ·· • tt

Na obr. 11 je znázorněno zesílení vazby peptidů na APC bazickými polyaminokyselinami.

Na obr. 12 je znázorněno zvýšení permeability buněčné membrány bazickými,polyaminokyselinami (uvolnění LDH po zpracování buněk polylysinem nebo polyargininem).

Na obr. 13 je znázorněna internalizace peptidu působením polyargininu.

Na obr. 14 je znázorněn transport peptidů do buněk, presentujících antigen, z kostní dřeně.

Na obr. 15 je znázorněno zvýšení transportu peptidů do buněk, presentujících antigen působením polykationtových polyaminokyselin a histonů.

Na obr. 16 je znázorněna účinnost transportu v závislosti na stupni polymerace bazických aminokyselin.

Na obr. 17 je znázorněn transport peptidů prostřednictvím polyargininu s níukou molekulovou hmotností.

Na obr. 18 je znázorněno ovlivnění účinnosti transportu v závislosti na náboji peptidu.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu. Nejprve budou popsány materiály a postupy, použité v průběhu příkladové části přihlášky.

··· ··· ···· • 44 9 9 9 9 0 0 0 0

0 999 999999 000 000

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 9 0 0 0 0 0 0

- 31 A) Buňky

a) Buněčné linie

Buněčná linie myšího melanomu Cloudman S91 (klon M-3, ATCC č. CCL 53.1), buněčná linie mastocytomu P815 (ATCC č.

TIB 54) a buněčná linie monocytů-makrofágů P388D1 (ATCC č.

TIB 53) byly odebrány ze sbírky ATCC. Buňky byly pěstovány v prostředí DMEM s vysokým obsahem glukosy (Life Technologies), doplněném 10 % FCS, 2 mM L-glutaminu a 20 mikrogramů/ml gentamycinu. Buněčný materiál byl běžným způsobem sledován na nepřítomnost kontaminace mycoplasmaty (PCR-Mycoplasma Detection Kit, Stratagene).

Buněčná linie myšího lymfomu RMA/S byla popsána ve svrchu uvedené publikaci Kárre K. a další, 1986 a v publikaci Ljunggren H. G. a další, 1990, Nátuře, 346, 476 až 480.

b) Buňky kostní dřeně, presentující antigen

Nejprve byly vypláchnuty stehenní kosti myší DBA/2 k získání kostní dřeně. Buňky kostní dřeně pak byly pěstovány v prostředí DMEM s vysokým obsahem glukosy, obsahujícím 10 %

FCS, 5 % koňského séra, 2 mM L-glutaminu a 20 mikrogramů/ml gentamycinu v přítomnosti 200 jednotek/ml GM-CSF myši, podle

Li H. a další, 1989, J. Exp. Med., 169, 973 až 986. V průběhu prvních pěti dnů byly každých 24 hodin.vyměněny dvě třetiny živného prostředí za účelem odstranění neadherujících granulocytů a B-buněk podle Inaba K. a další, 1992, J. Exp. Med.,

176, 1693 až 1702. Jak adherující, tak volně lnoucí buňky byly mezi 8 až 10 dnem izolovány Inkubací s PBS/5 mM EDTA a 4 naneseny při hustotě 3 x 10 buněk na jedno vyhloubení na nosič objektu pro mikroskop s 8 vyhloubeními (Nunc, Roskilde,

Dánsko). U více než 90 % buněk bylo možno pozorovat pozitivní reakci s protilátkou F4/80 (Endogen, Cambridge, MA, USA).

···· ··

- 32 B) Syntéza peptidu

Peptidy byly syntetizovány při použití syntetizátoru peptidů, model 433 A s monitorem se zpětnou vazbou (Applied

Biosystems, Foster City, Kanada) při použití prostředku

TentaGel S PHB (Rapp, Tiibingen) jako pevné fáze metodou z TM

Fmoc s aktivaci HBTU, Fastmoc , 0 : 25 mmol) . Peptidy byly rozpuštěny v 1 Μ TEAA při pH 7,3 a byly čištěny chromatografií v reverzní fází při použití sloupce Vydac C 18. Sekvence byly ověřeny hmotovou spektrometrií při použití zařízení MAT Lasermat (Finnigan, San Jose, Kanada).

C) Seznam použitých peptidů

Peptid označení	sekvence	příslušný antigen	číšlování aminokys. v bílkovině	MHC- Haplotyp
kpepl17	SYFPEITHI	Tyrosin-kinasa JAK1	355-363	H2-Kd
kpepl18	KYQAVTTTL	Tum-P198	14-22	H2-Kd
Kpep162	GPPHSNNF GY	Tum-P35B	4-13	H2-Dd
Kpep163	ISTQNHRAL	P91A .	12-20	H2-Ld
Kpepl64	LPYLGWLVF	P815	35-43	H2-Ld
kpep143	RYAEDYEEL	trp-1		H2-Kd
kpep145	PYLEQASRI	tyrosinas a		H2-Kd
kpep146	YYVSRDTLL	tyrosinasa		H2-Kd
kpepl50	YYSVKKTFL	trp-1		H2-Kd
	ASNENMETM	Influenza- nukieokapsid- Peptid		H2-Kb

······ · · » ·· ·· • » · · · · · · · · • · · * · · · · · · · • · · « · · ···· · ··· ··· ······« · · «4 ·· ·· · ·· ··

- 33 Směsi peptidů:

Směs peptidů pro vakcínu proti melanomu M-3: kpepl43, kpepl45, kpepl46 a kpeplSO (směs I).

Směs peptidů pro vakcínu proti mastocytomu P815:

:kpepll7, kpepll8, Kpepl62, Kpepl63 a Kpepl64 (směs III).

D) Výroba vakcín

Dl) vakcíny, obsahující jediný peptid:

a) vakcíny s obsahem jediného peptidu bez pomocného prostředku je možno připravit tak, že se peptid v koncentraci 1 mg/ml smísí s PBS. Doba inkubace do podání injekce je 4 hodiny při teplotě místnosti.

b) Vakcína s obsahem peptidu a polylysinu se připraví tak, že se smísí peptid a polylysin jako pomocný prostředek v uvedeném množství v HBS. Pokud není uve.deno jinak, užije se polylysin s délkou řetězce 200. Doba inkubace do podání injekce je 4 hodiny při teplotě místnosti.

i) Při přípravě vakcíny s obsahem 16 mikrogramů účinného peptidu se smísí 11,8 mikrogramů polylysinu a 160mikrogramů peptidu kpepll7 v celkovém objemu ml HBS.

ii) Při přípravě vakcíny s obsahem 100 mikrogramů účinného peptidu se smísí 74 mikrogramů polylysinu s mg peptidu kpepll7 v celkovém objemu 1 ml HBS.

c) Vakcína s obsahem peptidu a neúplného Freundova pomocného prostředku, IFA se připraví tak, že se peptid a IFA emulgují v uvedeném množství nosného prostředí.

Doba inkubace do podání injekce je 30 minut při teplotě místnosti.

• · · • · ©· • · « • · · * • · · · · · · • « « «· · ··· • · · · · · · •β ·· ·· ·

- 34 ··»· ·· • »

i) Při přípravě vakcíny s obsahem 16 mikrogramů účinného peptidu se emulguje 192 mikrogramů peptidu kpepl!7 a 600 mikrolitrů IFA v 600 mikrolitrech HBS.

ii) Při přípravě vakcíny s obsahem 100 mikrogramů účinného peptidu se emulguje 1,2 mg peptidu kpepll7 a 600 mikrolitrů IFA v 600 mikrolitrech HBS.

D2) Vakcína s obsahem směsi peptidů

a) Směs peptidů I jako vakcíny bez pomocného prostředku obsahuje 250 mikrogramů každého z peptidů kpepl43, kpepl45, kpepl46 a kpepl50 v celkovém objemu 1 ml PBS.

b) Směs peptidů III jako vakcíny bez pomocného prostředku obsahuje 250 mikrogramů každého z peptidů kpepll7, kpepll8, Kpepl62, Kpepl63 a Kpepl64 v celkovém objemu 1 ml PBS.

c) Směs peptidů I jako vakcíny s polylysinem jako pomocným prostředkem se připraví tak, že se 1 mg směsi peptidů s obsahem 250 mikrogramů každého peptidu smísí se 74 mikrogramů pólylysinu v HBS. Doba inkubace do podání injekce je 4 hodiny při teplotě místnosti.

d) Směs peptidů III jako vakcíny s polylysinem jako pomocným prostředkem se připraví tak, že se 1,25 mg směsi peptidů III s obsahem 250 mikrogramů každého peptidu smísí s 93 mikrogramy pólylysinu v HBS. Doba inkubace do podání injekce je 4 hodiny při teplotě místnosti.

e) Směs peptidů I jako vakcíny s neúplným Freudovým pomocným prostředkem se získá tak, že se 1,2 mg směsi peptidů I v 600 mikrolitrech HBS s obsahem 300 mikrogramů každého peptidu emulguje se 600 mlkrolitry IFA. Doba inkubace do podání injekce je 30 minut při teplotě místnosti.

000000 0 0 0 ·· 00 • •0 0 0 0 0000

000 0000 0000 0 0 0 0 0 0 0000 0 000 000

0000000 0 0 00 00 0« 0 0 9 00

- 35 f) Směs peptidů III jako vakcíny s neúplným Freundovým pomocným prostředkem se připraví tak, že se emulguje

1.5 mg směsi peptidů III v 600 mikrolitrech HBS s obsahem 300 mikrogramů každého peptidu se 600 mikrolitry IFA. Doba inkubace do podání injekce je 30 minut při teplotě místnosti.

g) Pro místní podání při použití polylysinu jako pomocného prostředku se inkub.uje 1 mg směsi peptidů I s obsahem 250 mikrogramů každého peptidu se 74 mikrogramy polylysinu 4 hodiny v celkovém objemu 400 mikrolitrů HBS. Takto získaná směs se vmíchá do 1,6 g hydrogelu Dolobene (Merckle).

h) Pro místní podání vakcíny bez pomocného prostředku se vmíchá 1 mg směsi peptidů I s obsahem 250 mikrogramů každého peptidu do celkového objemu 200 mikrolitrů HBS v 1,8 g hydrogelu Dolobene (Merckle).

i) Přípravu polylysinu, konjugovaného s fukosou při délce řetězce polylysinu 240 nebo 200 je možno uskutečnit způsobem podle publikace MacBroom C. R., a další, 1992, Meth. Enzymol., 28, 212 až 219. Bylo dosaženo substituce přibližně 40 %, výchozími látkami byly beta-L-fukopyranosylfenylisothiokyanát a polylysin (Sigma).

j) Při použití konjugátu transferrinu a polylysinu, připraveného podle WO 93/07283 se množství upravuje tak, aby absolutní množství polylysinu bylo 75 mikrogramů na mg peptidu. V případě, že se do komplexu integruje plasmidová DNA, například ve formě prázdného plasmidu pSP65 bez LPS (Boehringer Mannheim) je příslušný poměr

37.5 mikrogramů DNA/75 mikrogramů polylysinu/1 mg peptidu V případě použití 160 mikrogramů místo 1 ml peptidu se množství ostatních složek sníží při použití stejného faktoru (6,25).

···· ·· • · · · · · flflflfl • · · · · · · flflflfl • · · · · ······ · · · ··· • · · ♦ β · fl · fl ·· ·» *· ♦ «· flfl

- 36 E) Injekce vakcíny

Před podkožní injekcí byly myši anestetizovány po skupinách až 8 zvířat v izolované ..komoře. Po 3,5 minutách působení Halothanu (4 % v kyslíku, rychlost průtoku 4) jsou myši přibližně na 1 minutu omámeny. V tomto okamžiku se podkožně podá vakcína.

Intraperitoneální injekce byly prováděny bez předchozí anestezie. Injekční objem byl pro každou vakcínu 100 mikrolitrů pro jedno zvíře, což odpovídá 100 mikrogramů jednotlivých peptidů?.nebo peptidové směsi I pro zvíře. V případě použití směsi peptidů III bylo podáno celkové množství peptidů 125 mikrogramů na jednu myš.

F) Místní podávání vakcíny

Na jednu myš bylo užito 200 mg masti s obsahem 100 mikrogramů peptidu nebo směsi peptidů I nebo 125 mikrogramů směsi peptidů III, mast se vetře do oholeného místa na pokožce myši, obvykle na zádech a v oblasti uší. Správné množství se ověří zvážením.

G) Použití vakcíny proti nádorům na myším modelu

Sledování účinnosti vakcíny proti nádorům k prevenci nebo léčení nádorů na myším modelu bylo prováděno, v případě, že není uvedeno jinak, podle mezinárodní patentové přihlášky WO 94/21808, přičemž jako myší model byly použity myši DBA/2.

···· ·· • · · ··« · · · · • · · · · « · · · · ·

4 949 994449 944 494

9 4 9 9 9 9 4 4

4 4 9 4 4 4 4 4 4 9

- 37 Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Vakcinace myší DBA/2 proti mastocytomu P815

160 mikrogramů peptidu se sekvencí KYQAVTTTL (kpepll8), odvozeného od nádorového antigenu P815, popsaného v publikaci Lethe B. a další, 1992, Eur. J. Immunol., 22, 2283 až 2288 a známého jako ligand pro H2-K^d se smísí s 11,8 mikrogramy polylysinu 300 v 500 mikrolitrech HBS a směs se inkubuje 4 hodiny při teplotě místnosti. Pak se přidá 500 mikrolitrů Earlova roztoku solí s obsahem pufru, EBSS. Vždy 100 mikrolitrů vzniklé směsi se podává osmi myším podkožně v týdenních intervalech. Po této předběžné imunizaci se po dalším týdnu baočkují nádory, každé myši se naočkuje kontralaterálně 5 x 10⁴ buněk buněčné linie mastocytomu P815 ve 100 mikrolitrech EBSS. Buněčná linie je také označována ATCC č. TIB 64, u těchto buněk dochází k expresi nádorového antigenu, od nějž je odvozen peptid P815. Výsledek těchto pokusů je znázorněn na obr. 1 (plné čtverce).

V paralelním pokusu bylo smíseno 200 mikrogramů peptidu s 500 mlkrolltry HBS a po přidání 500 mikrolitrů Freundova pomocného činidla byla vytvořena emulze. Vždy 100 ml získané emulze bylo předběžně imunizováno osm myší a nakonec byly naočkovány nádory z buněk P815 stejným způsobem jako svrchu. Výsledky jsou rovněž znázorněny na obr. 1 (plné kruhy).

Pro další souběžný pokus byla vyrobena buněčná vakcína proti nádoru následujícím způsobem:

160 mikrogramů peptidu kpepll8 bylo smíseno se 3 mikrogramy konjugátu transferrin-polylysin, TfpL, 10 mikrogramů » ·

9999 ·· ··· · · · 9 9 9 9 · 9 · · 9 · 9 9 9 9 • 9 9 9 9 99999 9 9 9 · · 9 9

9999999 · Φ

99 9· 9 99 99

- 38 polylysinu a 6 mikrogramů plasmidu psp65, prostého LPS v 500 mikrolitrech HBS, obsahujícího pufr. Po 30 minutách při teplotě místnosti byl svrchu získaný roztok přidán do lahve pro z* pěstování buněčné kultury T75 s obsahem 1,5 x 10° buněk allogenní buněčné linie fibroblastů NIH3T3, ATCC č. CRL 1658, ve 20 ml prostředí DMEM s obsahem 10 % FCS a 20 mM glukosy a pak se láhev inkubuje při 37 °C. Po 3 hodinách bylo prostředí zaměněno za 15 ml čerstvého prostředí a buněčný materiál byl inkubován přes noc při teplotě 37 °C v přítomnosti 5 % oxidu uhličitého. 4 hodiny před aplikací byl buněčný materiál ozářen 20 Gy. Vakcína byla zpracována způsobem, popsaným ve WO 94/21808. Vakcína byla užita k předběžné imunizaci v týdenním odstupu při použití 10 buněk. Po dalším týdnu byly naočkovány nádorové buňky stejným způsobem jako svrchu. Výsledky jsou znázorněny na obr. 1 (plné trojúhelníky). Je zřejmé, že vakcína, obsahující peptid s polylysinem nejlépe chránila myši před tvorbou nádoru.

Příklad 2

Vakcinace myší DBA/2 proti mastocytomu P815 podáváním vakcíny s obsahem jediného peptidu

a) Na svoji ochrannou účinnosti proti tvorbě nádoru P815 byly sledovány tři vakcíny s obsahem jediného peptidu, které obsahovaly pouze peptid kpepll7 v PBS (obr. 2a), peptid kpepll7, emulgovaný v IFA (obr. 2b), nebo peptid kpepll7 s polylysinem s délkou řetězce 240 jako pomocným činidlem (obr. 2c). Vakcíny byly připraveny způsobem, uvedeným svrchu v odstavci D. Objem injekce byl vždy 100 mikrolitrů. Injekce byly podávány podkožně (sc) nebo intraperitoneálně (ip). Neošetřené myši sloužily jako negativní kontroly, jako pozitivní kontroly byly použity myši, jimž byla vstřiknuta vakcína z celých buněk P815, vylučujících GM-CSF, bylo použito 10⁵ buněk podkožně

A A AA

A A A A

A A A A

AAA AAA

A A

A A A A ♦ · • A A · · • · • · · · A β · A · ·

A A AAA · • · · · « A ·

AA AA AA A

AAAA ·Α

- 39 ve 100 mikrolitrech Injekčního objemu na jedno zvíře. Každá pokusná skupina byla tvořena osmi zvířaty, byly provedeny tři podkožní vakcinace vždy v odstupu 7 dnů. Týden po poslední vakcinaci byla zvířatům naočkována nádorová buněčná linie P815 kontralaterálně v množství 5 x 10⁴ buněk. Zvířata byla denně kontrolována a vznik nádorů byl hodnocen v časovém odstupu vždy jeden týden.

Nejlepší protinádorové účinnosti bylo dosaženo při použití peptidu kpepll7 s polylysinem jako pomocným prostředkem v případě podkožního podání 100 mikrogramů každému zvířeti, v tomto případě byla chráněna tři zvířata z osmi. Tento účinek je srovnatelný s účinkem vakcíny z celých buněk, která chrání čtyři zvířata z osmi. Podání 16 mikrogramů peptidu s polylysinem na jedno zvíře již bylo méně účinné a chránilo pouze dvě zvířata, přesto však byl výsledek podstatně lepší než při použití 100 mikrogramů peptidu v PBS, porpodání tohoto materiálu nebylo chráněno žádné zvíře, jak je zřejmé z obr. 2a. Po emulgaci v IFA nebylo dosaženo účinku, srovnatelného s podáním peptidu s polylysinem, jak je zřejmé z obr. 2c.

b) V dalším pokusu na modelu pro mastocytom P815 byly srovnávány účinnosti dvou nemodifikovaných polylysinů s různou délkou řetězce. Šlo o krátký řetězec, obsahující pouze 16 zbytků lysinu, pL16 a o dlouhý řetězec, obsahující 240 zbytků, pL240. Zvířatům kontrolní skupiny bylo injekčně podáno 100 mikrogramů peptidu kpepll7, rozpuštěného v PBS nebo emulgovaného v IFA. Jako pozitivní kontroly byly použity dvě buněčné vakcíny buněk, vylučujících GM-CSF, přičemž jedna z těchto vakcín byla připravena ze stabilních buněk P815 po transfekci a druhá vakcína byla připravena při použití buněk po přechodné transfekci způsobem podle publikace Wagner E. a další, 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 89, φφφφ φφ • · · φφφ φφφφ φφφ φφφφ φφφφ φφ φφφ ΦΦΦΦΦ· φ·φ φφφ φφφφφφφ φ φ φφ φφ φφ φ φφ φφ

- 40 6099 až 6103 (metoda AVET). Obě buněčné vakcíny chránily celkem 4 nebo 5 zvířat z osmi. Vakcíny na bázi samotného peptidu nebo peptidu, emulgovaného v IFA neměly žádnou ochrannou účinnost a u všech zvířat se brzy po naočkování vytvořily nádory. Avšak v případě, že byl peptid podán společně s polylysinem, měla vakcína ochranný účinek proti tvorbě nádorů. Dvě zvířata z osmi byla chráněna při použití polylysinu s dlouhým řetězcem, pL240 a čtyři z osmi zvířat byla chráněna při použití polylysinu s krátkým řetězcem.

Tyto výsledky, které jsou také znázorněny na obr. 3 prokazují, že jediný peptid, podaný s polylysinem jako pomocným prostředkem může mít ochrannou účinnost proti nádoru, srovnatelnou s účinností vakcíny z celých buněk, vylučujících cytokiny, která je považována v literatuře za standard pro vakcinaci proti nádorům, například podle publikace Dranoff G. a další, 1993, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90, 3539 až 3543, a také Schmidt W. a další, 1995 květen, Proč. Nati. Acad.

Sci. USA, 92, 4711 až 4714.

Příklad 3

Vakcinace myší DBA/2 proti mastocytomu P815 vakcínou, obsahující jediný peptid P815 nebo směs těchto peptidů

Pro výrobu vakcíny byly použity následující peptidy:

kpepll8, 100 mikrogramů na injekci, směs peptidů III (kpepll7, kpepll8, Kpepl62, Kpepl63, Kpepl64), která obsahuje všechny dosud známé peptidy P815. Na jednu injekci bylo použito 25 mikrogramů každého peptidu.

Jako pozitivní kontrola byly použity buňky P815, vylučující GM-CSF.

9

ΦΦΦΦ

- 41 • φ · · φφ

9

9 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

99 99

9 99

9 9 9

9 9 9

999 999

9 9 • · · 9 9

V předběžných pokusech se jevil kpep 117 jako peptid s nejlepší ochrannou účinností proti nádoru P815 v případě, že bylo podáno 100 mikrogramů peptidů spolu se 7,5 mikrogramů polylysinu na 100 mikrogramů peptidů při délce řetězce polylysinu 200; Menší množství 16 mikrogramů kpepll7 bylo méně účinné. V tomto příkladu bylo také injekčně podáno 100 mikrogramů kpepll8 na jedno pokusné zvíře, a to pouze s polylysinem ve skupině B, s transferinem a polylysinem ve skupině C a s transferinem a konjugátem polylysinu a DNA ve skupině D. Kontrolním zvířatům byl podán kpepll8 spolu s IFA. Bylo prokázáno, že samotný peptid kpepll8 nemá žádnou ochrannou účinnost proti tvorbě nádoru.

V pokusech, provedených v příkladu 4 bylo prokázáno, že vakcína s obsahem směsi peptidů z melanomu má ochrannou účinnost proti vzniku melanomu. Bylo proto sledováno, zda by směs peptidů mohla být účinná také v případě P815.

Směs peptidů III byla podána pouze s polylysinem ve skupině E, se směsí transferinu a polylysinu ve skupině F a spolu s tranferinem a konjugátem polylysinu a DNA ve skupině G. Kontrolní skupině byla podána směs peptidů III v IFA. Negativní kontrolou byly myši, jimž nebyl podán žádný peptid, jako pozitivní kontrola byly užity myši, jimž byly podány buňky P815 po transfekci GM-CSF (icú buněk/myš).

Pokusy, prováděné v tomto příkladu se vyvíjely ve srovnání s jinými pokusy poněkud netypicky. U pozitivní kontrolní skupiny, jíž byly podány buňky, vylučující GM-CSF se u všech zvířat brzy vyvinuly nádory, přičemž většina těchto nádorů vymizela tak rychle, jak se vytvořily. Možné vysvětlení by mohlo spočívat v tom, že nádor rostl určitou dobu před svým zničením. Další možné vysvětlení spočívá v tom, že otok, diagnostikovaný jako nádor, nebyl ve skutečnosti nádor, nýbrž infiltrát imunitních buněk, to znamená granulom.

φ φ φφφ φ φφφφ φ φ φ φφφ φ φ φφφφ φφ φ φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ φ φφ φφ φ φ φφ * · φ φ φ φ φ φ φφφ φφφ φφφ φ

Vzhledem k tomu, že zvířata nebyla usmrcena, nebylo možno příčinu definitivně určit. Další zajímavý výsledek byl získán ve skupině G. U všech zvířat se vyvinuly nádory, avšak u dvou z těchto zvířat byla velikost nádoru nebo otoku poměrně malá, nádor rostl velmi pomalu a myši se nechovaly jako nemocná zvířata. Tato dvě zvířata nebyla usmrcena, nýbrž byla dále pozorována. Nádory se počaly zmenšovat a zcela neočekávaně po 9 týdnech již nebylo možno nádory pozorovat, což až dosud nebylo nikdy možno dokázat. Rozrušení nádorů mohlo být vyvoláno přítomností kpepll7 v podané směsi peptidů, analogicky jako v příkladu 2, v němž dvě zvířata z osmi při podání 16 mikrogramů kpepll7 a tři zvířata z osmi při podání 100 mikrogramů kpepll7 byla chráněna. Ochranná účinnost však mohla být vyvolána také více než jedním peptidem ve směsi.

Příklad 4

Ochrana myší DBA/2 proti melanomu M-3 předběžnou imunizací vakcínou s obsahem směsi peptidů

Byla užita profylaktická vakcína, která obsahovala směs peptidů z melanomu (směs peptidů I, odstavec D2).

Postup předběžné imunizace vakcínou a naočkování nádoru odpovídalo postupu z příkladu 2 s tím rozdílem, že k na5 očkování nádoru byly užity buňky MS v množství 10 buněk na jedno zvíře. Jako kontrolní vakcína byla užita vakcína z celých buněk M3, vylučující optimální množství IL-2, to znamená 1000 až 2000 jednotek na 10 buněk a vyrobená způsobem podle svrchu uvedené publikace Schmidt a další, 1995. Podle prokázaných výsledků je za uvedených pokusných podmínek možno dosáhnout 100% ochrany, jak je zřejmé z obr. 4. Čtařem skupinám pokusných zvířat byly podány vakcíny, obsahující směs peptidů. Dvěma skupinám byly tyto peptidy podány pod-

·· ·

9 9

9 «

999 999

9

99 kožně nebo intraperitoneálně ve formě emulze v IFA. Druhé dvě skupiny obdržely podkožně nebo intraperitoneálně peptidy spolu s polylysinem pL24O.

Na obr. 4 je znázorněn ochranný účinek vakcíny s obsahem peptidů a polylysinu pL240 jako pomocného prostředku.

% ošetřených myší bylo chráněno proti vzniku nádoru M3, kdežto u neošetřených zvířat se rychle vyvinuly pevné nádory. Tohoto účinku mohlo být dosaženo v případě, že vakcína byla vstřiknuta podkožně nebo nanesena ve formě gelu na pokožku, jak je zřejmé z obr. 5. V dalších třech kontrolních skupinách, jimž byla podána vakcína s obsahem peptidu a polylysinu intraperitoneálně nebo vakcíny s obsahem peptidů a IFA, bylo očkování v podstatě neúčinné. Vyvinuly se nádory, které pouze ve srovnání s neošetřenými kontrolami rostly poněkud pomaleji. Tyto výsledky ukazují, že při použití vakcíny s obsahem směsi peptidů je možno dosáhnout při doplnění vakcíny polylysinem ochranného účinku proti nádorům. Při zvolených pokusných podmínkách měla uvedená vakcína s obsahem peptidů přibližně 50 % účinnosti buněčné IL-2-vakcíny, která chrání až 100 % zvířat proti vzniku nádoru při naočkování 10 živých buněk M3, jak je uvedeno v publikaci Zatloukal K. a další, 1995,

J. Immun., 154, 3405 až 3419.

Příklad 5

Ochrana myší DBA/2 proti metastázám M-3

a) Byla použita léčebná vakcína, obsahující směs peptidů melanomu, šlo o směs peptidů I, odstavec D2. Byla provedena trojí vakcinace vždy podkožně v týdenních odstupech. První vakcinace byla provedena 5 dnů po vzniku metastáz. K vyvolá4 ní metastáz bylo injekčně podáno 1,2 x 10 buněk M-3 podle mezinárodní přihlášky WO 94/31808 a podle publikace Schmidt

W. a další, 1996, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 93, 9759-63.

*4 4 • ·

Jako vakcína byla užita směs peptidů I bez pomocného prostředku (pepmix 1 PBS), s IFA jako pomocným prostředkem (IFA pepmixl) nebo s polylysinem, modifikovaným fukosou (fpL pepmixl). Kontrolním skupinám nebyla podána žádná vakcína nebo byla podána vakcína z celých buněk M-3, produkujících IL-2 podle příkladu 4. Z obr. 6 je zřejmé, še nejlepšího ochranného účinku bylo dosaženo ve skupině, jíž byla podána směs peptidů I s polylysinem, modifikovaným fukosou jako pomocným prostředkem (obr. 6a). U 50 % myší, to znamená u čtyř myší z osmi, byly potlačeny metastázy. Toto ošetření bylo dokonce účinnější než použití vakcíny z celých buněk, která chránila pouze třetinu myší, to znamená tři myši z devíti.

Při podání vakcíny se směsí peptidů spolu s IFA nebo bez pomocného prostředku došlo ke zhoršení stavu a zvětršení metastáz na pevné nádory, jak je zřejmé z obr. 6b.

b) V dalším pokusu byla zkoumána ochranná účinnost vakcíny, obsahující směs peptidů I, vakcína byla podána podkožně. Kontrolní skupině byla podána směs peptidů v PBS bez pomocného prostředku nebo směs peptidů s IFA. Jako pomocný prostředek byl použit nemodifikovaný polylysin 240 nebo polylysin 200, modifikovaný fukosou, fpL200. Kontrolní skupinou byla skupina zvířat, očkovaná vakcínou z buněk, u nichž dochází k expresi IL-2. Jak je zřejmé z obr. 7a, byla vakcína s obsahem peptidu a polylysinu při ošetření metastáz M-3 účinná. Významného výsledku bylo dosaženo zejména při použití polylsinu, modifikovaného fukosou. Při tomto ošetření došlo u % zvířat k potlačení všech metastáz, což je ve srovnání s vakcínou IL-2, která v tomto případě potlačila metastázy u 70 % zvířat, dobrý výsledek.

c) V dalším pokusu byl sledován vliv změn a modifikací polykationtů na protinádorovou účinnost. Za tímto účelem byl sledován účinek nemodifikovaného polylysinu 200, dále polylysinu 200, modifikovaného fukosou a mimoto účinek krátkého, ···· ·· ♦ · fl flfl flfl • · · · · · · · · · • · · * · · fl fl · fl fl ♦ · flfl· · ···· fl flflfl fl·· • ••••«fl · · ·· ·· fl· fl flfl flfl

- 45 nemodifikovaného polylysinu pL16, polylysinu s dlouhým řetězcem pL45O a dalšího polykationtu, polyargininu pArg720. Jako positivní kontrola byla použita buněčná vakcína s optimálním 5 počtem buněk M3, vylučujících GM-CSF (nejméně 10 ng na 10 buněk), jak je popsáno ve svrchu uvedené publikaci Schmidt, 1995. Také v tomto pokusu byla kontrolním skupinám podána směs peptidů v IFA nebo bez pomocného prostředku. Stejně jako v příkladu 5b) bylo dosaženo nejlepšího účinku v případě, že byl jako pomocný prostředek užit polylysin, modifikovaný fukosou. Výsledky jsou zřejmé z obr. 7b. U 40 % zvířat došlo k vymizení metastáz ve srovnání s 30 % v případě skupiny, v níž byl užit polylysin pL16 s krátkým řetězcem. Kromě skupiny, jíž byly podány peptidy spolu s argininem, došlo u zvířat v ostatních skupinách pouze ke krátkodobému zpomalení vzniku nádorů. Nemodifikovaný polyarginin byl v tomto pokusu stejně účinný jako polylysin, modifikovaný fukosou, po jeho podání došlo k vymizení metastát z čtyř z deseti zvířat.

Na obr. 7c je znázorněno opakování pokusu s polyargininem v nezávislém pokusu. Také v tomto případě došlo po vakcinaci směsí peptidu s polyargininem k protinádorovému účinku u čtyř z osmi zvířat.

Příklad 6

Zavedení tyrosinázy do buněk při použití polylysinu jako pomocného prostředku

V tomto příkladu byl proveden pokus s cílem prokázat, zda je polylysin vhodný jako pomocný prostředek pro zavedení velkých fragmentů bílkovin nebo úplných bílkovin do buněk, k tomuto účelu byly užity buňky M-3.

··· · φφ

Φ · · • · · * · 9 Φ • · · ·· ·« ·· · • · Φ • 9 9 9

9 9999

9 9

9

99 • Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ

999 999

9

ΦΦ ΦΦ

Κ zavedení do buněk bylo nejprve smíseno 160 mikrogramů tyrosinázy, značené FITC (EC 1.14.18.1, Sigma) s 3 mikrogramy polylysinu pL240 a směs byla inkubována 3 hodiny při teplotě místnosti. Pak byl roztok přidán do lahve T75 pro 6 pěstování tkáňové kultury s obsahem 2 x 10 buněk M-3 a láhev byla inkubována při teplotě 37 °C. Pak byl buněčný materiál dvakrát promyt PBS, rozrušen přidáním PBS/2 mM EDTA a rozpuštěn v 1 ml PBS/5 % FCS pro analýzu FACS. Na obr. 8 je znázorněno zavedení tyrosinázy do buněk M-3, levá křivka je kontrolní, pravá znamená zavedení tyrosinázy do buněk.

Příklad 7

Stanovení aktivace T-buněk po imunizaci na myším modelu

Vzhledem k tomu, že podle příkladu 5 má vakcina s obsahem peptidu a polykationtu na myším modelu zcela zřejmě ochrannou účinnost, bylo sledováno, zda po podání vakcíny dochází také k aktivaci T-buněk. K tomuto účelu byla sledována sekrece cytokinů po inkubaci slezinných buněk očkovaných zvířat s buňkami M-3 způsobem podle publikace Kawakami Y. a další, 1994, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 91, 6458-62.

Byla připravena suspenze jednotlivých slezinných buněk z očkovaných a neočkovaných zvířat a červené krvinky byly rozrušeny pomocí hypotonického pufru s obsahem 0,15 mM NH^Cl, mM KHC0„ a 0,1 mM EDTA o pH 7,4. Adherující buňky byly odO θ straněny a 3 x 10° slezinných buněk/ml prostředí DMEM s 10 % FCS bylo inkubováno v Petriho miskách 90 minut při 37 °C. Neadherující buňky byly po opatrném přenesení pipetou pěstovány společně s 1 x 10 parentálních buněk v různých poměrech. Buňky byly pěstovány ve 200 mikrolitřech prostředí DMEM s 10 % FCS, 2 mM L-glutaminu a 20 mikrogramů/ml gentamycinu • ΦΦΦ φφ ··· φφφ «φφφ • ΦΦ φφφ φ «φφφ φ φ φφφ φ φφφφ · φφφ φφφ • φφφφφφ φ φ • ΦΦΦ φφ · φφ ··

- 47 na plotnách pro pěstování tkáňových kultur s 96 vyhloubeními. Devátého dne bylo odebráno 100 mikrolitrů supernatantu a byl měřen obsah. IFN-gamma při použití běžně dodávaného kitu ELISA (Endogen, Cambridge, MA, USA) podle návodu výrobce. Bylo prokázáno, že po 9 dnech inkubace vylučovaly do prostředí IFN-gamma ve větším množství pouze slezinné buňky očkovaných zvířat, kdežto ve společných kulturách slezinných buněk z neočkovaných zvířat a v kulturách buněk M-3 nebylo možno prokázat téměř žádný IFN-gamma. Výsledky těchto pokusů jsou graficky znázorněny na obr. 9.

Příklad 8

Indukce imunity proti virům při použití peptidu ASNENMETM z nukleokapsidu chřipkového viru při použití fukosylovaného polylsinu jako pomocného prostředku

Byla použita vakcína, obsahující na 1 mg peptidu ASNENMETM 75 mikrogramů fpLys. Vakcína byla podána jednorázovou injekcí svrchu uvedeným způsobem, přičemž pro jedno zvíře bylo užito 100 mikrogramů peptidu a 7,5 mikrogramů fpLys. Kontrolní skupině bylo podáno pouze 100 mikrogramů samotného peptidu v PBS nebo nebyl zvířatům podán žádný peptid.

Buňky myšího lymfomu RMA-S byly inkubovány přes noc v prostředí, prostém séra při teplotě 26 °C spolu s 10 mikrogramy/ml peptidu ASNENMETM.

Deset dnů po vakcinaci byly z očkovaných zvířat izolovány slezinné buňky, tyto buňky byly smíseny v poměru 5 : 1 s buňkami RMA-S, do nichž byl zaveden peptid a směs byla pět dnů dále pěstována podle publikace Stuber G. a další, 1994 svrchu. Byl stanoven počet přežívajících efektorových slezinných buněk v různých kulturách, načež byly buňky pro stanovení

4

4 4 4 •040 4*

- 48 CTL-aktivity pomocí standardu pro uvolnění Europia podle svrchu uvedené publikace Blomberg a další, 1993 smíseny v různých poměrech s buňkami RMA-S, předem smíšenými s peptidem ASNENMETM a s chelátem Europia. Jak je zřejmé z obr. 10, bylo v tomto pokusu dosaženo specifické imunity pouze při vakcinaci peptidem spolu s fpLys, avšak nikoliv v případě, že byl podán pouze peptid.

Příklad 9

Zkoušky s různými bazickými polyaminokyselinami na jejich schopnost zesílit internalizaci a/nebo vazbu peptidů na APC

Při tomto pokusu byla použita fluorescenční zkouška. Modelový peptidový antigen se sekvencí LFEAIEGFI (MNH po restrikci Kd) se označí fluorescenčním barvivém, fluoresceinísothiokyanátem FITC podle návodu výrobce (Molecular Probes)v Příjem nebo vazba samotného peptidu, značeného FITC nebo peptidu spolu s různými koncentracemi bazických aminokyselin, a to polylysinu s délkou řetězce 16 až 490, polyargininu s délkou řetězce 15 až 720 byl měřen průtokovou cytometrií při použití buněčné linie P388D1 monocytů a makrofágů po restrikci MHC Kd. K tomuto účelu bylo inkubováno 1 x 10θ buněk P388D1 v konečném objemu 1 ml prostředí DMEM s 10 % FCS ve zkumavkách pro odstředivku spolu s 5 mikrogramy peptidu, značeného FITC nebo se směsí peptidu a polyaminokyseliny 30 minut při teplotě 37 °C, pak byl buněčný materiál důkladně promyt k odstranění volného peptidu. Polyaminokyseliny byly přidávány v množství 50, 25, 12, 6 a 3 mikrogramy/ml prostředí, obsahujícího 5 mikrogramů peptidu, značeného FITC. Relativní intenzita fluorescence různých vzorků byla srovnávána ke stanovení účinnosti příjmu a/nebo vazby peptidu. Výsledky tohoto pokusu jsou shrnuty na obr. 11. Všechny pokusy byly provedeny s 25 mikrogramy pL450 nebo pArg450. Za uvedených podmínek byl polyarginin přibližně 5x účinnější než polylysin.

flflflfl flfl ·· fl flfl ·» * · · t « e flflflfl • flfl · · · · flflflfl flfl · · · fl flflflfl fl ··· fl·· fl······ · · • «flfl flfl · flfl flfl

- 49 Příklad 10

Sledování mechanismu jímž jsou peptidy přijímány APC

Peptidy mohou být přijímány APC specifickými mechanismy, jako jsou makropinocytosa nebo endocytosa, zprostředkovaná přes receptory podle publikace Lanzavecchia A., 1996, Curr.

Opin. Immunol., 8, 348 až 354. Alternativní mechanismus může spočívat v tom, že polyaminokyseliny učiní buněčnou membránu propustnou a tím umožní difúzi peptidů z prostředí do cytoplasmy.

a) Sledování, zda došlo ke zvýšení permeability buněčné membráby, bylo provedeno tak, že bylo měřeno uvolnění cytoplasmatického enzymu laktátdehydrogenázy LDH po inkubaci buněk P388D1 s polyaminokyselinami polylysinem nebo polyargininem v isotonickém prostředí při použití běžně dodávaného zkušebního balíčku Cytotox 96, (Promega, Madison, Wisconsin, USA) podle návodu výrobce. Z výsledků, znázorněných na obr. 12a je zřejmé, že účinek pLys spočívá v tom, že se buněčná membrána stává propustnou, což se projevuje vysokými koncentracemi cytoplasmatického enzymu, uvolněného v isotonickém prostředí. Naproti tomu nebylo po použití pArg možno prokázat prakticky žádnou LDH, jak je zřejmé z obr. 12b. Při srovnávání vzorků, zpracovaných pouze působením aminokyselin nebylo možno pozorovat ve srovnání s působením polylysinu nebo polyargininu spolu s peptidem žádný rozdíl v uvolnění LDH. Po inkubaci se samotným peptidem nebylo možno prokázat žádnou měřitelnou účinnost LDH.

b) Způsobem podle publikace Midoux P. a další, 1993, NATO ASI Series H67, 49 až 64, bylo sledováno, zda v přítomnosti nebo nepřítomnosti bazických polyaminokyselin dochází k internalizaci peptidů, značených FITC. Částice, internalizované buňkami byly transportovány do endosomů. Na rozdíl od cytoplasmy ««·· ·· »· * ·· »· • · · · ·· ···« • · · ···· ···· • » · « · · ···· « »·· ·«· ······· · · ·· »« *· · ·« ·» nebo buněčného prostředí s neutrálním pH mají tyto organelly kyselé pH 5. Fluorescence, vysílaná FITC je velmi závislá na pH. Při podmínkách pH v endosomech je fluorescence potlačena.

Z tohoto důvodu vykazují peptidy, značené FITC po transportu do endosomů sníženou fluorescenci. Přidáním monensinu je nízká hodnota pH v endosomech neutralizována, což vede k měřitelnému zesílení fluorescence internalizovaného peptidu, značeného FITC.

Buňky byly inkubovány se směsí polyargininu s průměrnou molekulovou hmotností 100 000 a délkou řetězce 490 a peptidu, značeného fluorscencí při teplotě 4 °C nebo 37 °C. Podíl vzorku, inkubovaného při 37 °C byl uchován a před analýzou průtokovou cytometrií byl při teplotě 4 °C smísen s 50 mlkroM monensinu.

Bylo možno prokázat, že inkubace APC s některými bazickými polyaminokyselinami, jako polylysinem pLys a polyargininem pArg zesiluje příjem nebo vazbu peptidů na APC.

Jak je zřejmé z obr. 13, bylo možno pozorovat v buňkách, zpracovaných pouze pomocí peptidů nebo monensinu jen malý vzestup fluorescence. Naproti tomu došlo k zesílení fluorescenčních signálů ve vzorcích, které byly zpracovány působením monensinu a směsi polyargininu a peptidu. Žádný příjem peptidu nebylo možno pozorovat při inkubaci vzorků při teplotě 4 °C. Podstatný vzestup fluorescence po působení monensinu ukazuje na to, že se po působení pArg peptidy hromadí ve vesikulách uvnitř buněk, jak je zřejmé z obr. 13 a jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci Mídoux a další, 1993. Jak bylo možno očekávat, došlo po zpracování vzorků s polylysinem působením monensinu jen k malému vzestupu fluorescence. Při zavedení polylysinu při teplotě 4 °C došlo k měřitelnému vzestupu fluorescence, což je dalším důkazem toho, že polylysin působí zvýšením prostupnosti buněčné membrány, jak je zřejmé také z obr. 12b.

·· · · • · · · · * · · · · • · · · · · · ···· ·· · · · ·····« ··· ··· ······· · · • » ·· · · · ·· · ·

- 51 Příklad 11

Pokusy se zavedením krátkých peptidů do buněk APC

Buňky APC z kostní dřeně, získané tak, že u nich dochází k sekreci GM-CSF byly sledovány při použití kombinace fluorescenčně značeného peptidu s polylysinem pL2OO (Sigma) nebo při použití samotného peptidu pomocí fluorescenční mikroskopie. Pro mikroskopické sledování příjmu peptidu byly buňky APC naneseny na podložní misku a inkubovány se 40 mikrogramy peptidu LFEAIEGFI, značeného fluoresceinem nebo s 50 mikrogramy/ml polylyslnu pL200 a 40mikrogramy/ml peptidu LFEAIEGFI 30 minut při teplotě 37 C. Po důkladném promytí byl buněčný materiál fixován 4% p-formaldehydem, překryt prostředkem anti-Fadent (Dako, Glostrup, Dánsko) a pak byl buněčný materiál sledován pomocí fluorescenčního mikroskopu (Zeiss). Jádra byla kontrastně zbarvena 4,4-diaminodino-2-fenylindolem, DAPI (Sigma). Jak je zřejmé z fluorescenčních mikrofotografií na obr. 14, dochází u buněk, které byly inkubovány s peptidem a polylysinem, to znamená u buněk A, ve srovnání s buňkami B, které byly inkubovány pouze s peptidem, k podstatně vyššímu příjmu peptidu Fluorescence je pozorovatelná u buněk, Inkubovaných pouze s peptidem jen částečně a jen u některých buněk, kdežto v případě buněk, inkubovaných s peptidem v přítomnosti polylysinu je možno pozorovat intenzivní fluorescenci, která se rovnoměrně projevuje u všech buněk.

Příklad 12

Kvantitativní stanovení příjmu peptidu do buněk pomocí průtokové cytometrie

a) Na základě pokusů z příkladu 11 bylo prokázáno, že buňky APC jsou vhodnými cílovými buňkami pro příjem malých peptidů. Pak byly in vitro provedeny pokusy FACS k identifikaci vhodných pomocných prostředků pro vakcíny s obsahem φ φ φ φ φ φ φφφ · · φφ • · · φφφ ΦΦΦ· φφφ ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ φ φ φφφ φ ΦΦΦΦ φ φφφ φφφ φφφφφφφ φ φ φφ φφ φφ φ φφ φφ

- 52 peptidů. Tyto zkoušky dovolují rychlé kvantitativní stanovení fluorescenčně značených peptidů. Jako modelový peptid byl použit peptid se sekvencí LFEAIEGFI. V těchto pokusech byla jako buňky ATC použita myší buněčná linie P388D1.

x 10 buněk bylo Inkubováno ve výsledném objemu 1 ml prostředí DMEM s vysokým obsahem glukosy a 10 % FCS 30 minut při 37 C s 5 mikrogramy peptidů při konečné koncentraci fluoresceinu 5 nmol/ml. Buněčný materiál byl zpracován samotným peptidem nebo kombinací peptidů a polykationtů nebo kombinací peptidů a histonů při stoupající koncentraci 3 až 50 mikrogramů/ml, jak je uvedeno na obr. 15. Byly použity následující sloučeniny: A: polyornithin se střední molekulovou hmotností 110 000 a délkou řetězce 580, B: histon, bohatý na arginin, C: histon, bohatý na lysin, D: polyarginin se střední molekulovou hmotností 100 000 a délkou řetězce 490 a E: polylysin se střední molekulovou hmotností 94 000 a délkou řetězce 450. V předběžných pokusech bylo zjištěno, že k maximálnímu příjmu peptidů dochází při době inkubace 30 minut Při delším působení 4 až 8 hodin již nedochází k žádnému podstatnému zvýšení fluorescenčního signálu. Před analýzou byl buněčný materiál 5x promyt velkým objemem PBS s obsahem 0,2 % BSA. Pak byl buněčný materiál přenesen do 1 ml PBS s 0,2 %

BSA po zchlazení ledem, měření bylo prováděno průtokovou cytometrlí při použití přístroje FACScan (Becton Dickinson,

San Jose, CA, USA).

Bylo prokázáno, že nejúčinnějšími pomocnými prostředky jsou polyarginin a polylysin. Polyornitin měl za zvolených podmínek cytotoxický účinek. Zesílení příjmu peptidů působením polyargininu a polylysinu je v korelaci s koncentrací, jak je zřejmé z obr. 15d a 15e, příjem také stoupá s délkou řetězce, jak je zřejmé z obr. 16.

Bylo pozorováno, že polyarginin má širší vhodnou oblast koncentrace pro zvýšení až o 3 desetinásobky oproti ·· 44 • · · 4 4 4 · · · · • · 4 4 4 4 4 4 4 · 4 • · · 4 · · 4444 4 444 444

44444·· 4 4 <4 44 4 44 44

- 53 polylysinu, u nějž bylo možno dosáhnout maximálního zvýšení o méně než dvacetinásobek. Mimoto bylo pozorováno, že polyarglnin je pri všech použitých délkách řetězce pro transport bílkovin účinnější něž polylysin, jak je zřejmé z obr. 16. Polyarginin umožní účinný transport i při velmi nízkých koncentracích, jako 3 mikrogramy/ml , kdežto v případě polylysinu je nutno použít koncentraci vyšší než 25 mikrogramů/ml k dosažení podstatného zvýšení fluorescence, jak je možno pozorovat na obr. 15d a 15e.

b) Aby bylo možno stanovit, zda existuje pro transport peptidů spodní hranice délky řetězce, byly syntetizovány polyargininy s různou délkou řetězce 10 až 30 zbytků a tyto látky pak byly podrobeny zkouškám na schopnost zvýšit transport peptidů při vysokých koncentracích polykationtů, jak je znázorněno na obr. 17. Pro tyto pokusy byl použit peptid se sekvencí LFEAIEGFI, zkoumané polymery polyargininu byly použity v koncentraci 100 mikrogramů/ml.

Zesílení transportu peptidů bylo možno pozorovat již při použití nejkratšího sledovaného polyargininu, i když toto zvýšení bylo poměrně malé.

c) Bazické aminokyseliny jsou molekuly s kladným nábojem.

Je tedy možno předpokládat, že se negativně nabité peptidy mohou na tyto polykationty vázat elektrostaticky, což může vést ke zvýšenému příjmu peptidů. Aby bylo možno tento předpoklad potvrdit, byla srovnávána schopnost kationtových polyamlnokyselln, zesílit příjem krátkých peptidů buňkami P388D1 v závislosti na jejich náboji. V následující tabulce jsou shrnuty použité peptidy s negativním nábojem, které jinak splňují všechny podmínky pro vazbu MHC-I podle svrchu uvedené publikace Rammensee a další, 1995. Peptid 1 je odvozen od myší bílkoviny, příbuzné tyrosináze, TRP. Peptid 2 je odvozen od hemaglutinlnu chřipkového viru podle svrchu uvedené publi0000 *0

- 54 kace Schmidt a další, 1996. peptid 3 je odvozen od myší tyrosinázy, peptid 4 od nádorového antigenu P198 a peptid 5 od beta-galaktosidázy (Gavin a další, 1993). Mr znamená rozsah molekulové hmotnosti, fluor znamená fluorescein.

Tabulka

sekvence	Mr	Mr fluor	náboj	náboj + fluo
YAEDYEEL	1031	1389	4x negativní	6x negativní
LFEAIEGFI	1038	1396	2x negativní	4x negativní
IFMNGTMSQV	1127	1485	neutrální	2x nagativní
KYQAVTTTL	1024	1382	Ix positivní	lx negativní
TPHPARIGL	961	1319	2x positivní	neutrální

Při značení peptidu fluoresceinem dochází k zavedení dvou negativních nábojů. Ukázalo se, že po inkubaci s polyargininem byly peptidy v množství 5 nmol na vzorek transportovány v nejvyšší míře do buněk P388D1, což ukazuje na iontovou výměnu mezi peptidem a polykationtem a na jejich další zvýšení v průběhu transportu peptidu do buněk, jak je zřejmé z obr. 18. Ve srovnání s buňkami, které byly uvedeny do styku pouze s peptidem, došlo však v případě neutrálních peptidů v přítomnosti polykationtů rovněž k příjmu vyššího množství. Působení samotného peptidu poskytuje u všech zkou maných peptidů přibližně identické fluorescenční signály. Z tohoto důvodu je na obr. 18 pod názvem samotný peptid uve den výsledek, to znamená fluorescenční signál, který byl zí kán při použití peptidu se sekvencí LFEAIEGFI.

Claims (33)

1. Farmaceutický prostředek, obsahující nejméně jeden peptid, bílkovinu nebo fragment bílkoviny s imunomodulačním účinkem spolu s pomocným prostředkem, vyznačující se t í m, že jako pomocný prostředek obsahuje prostředek se schopností zvýšit vazbu peptidu, proteinu nebo jeho fragmentu na buňky organismu příjemce nebo vstup těchto materiálů do uvedených buněk a se schopností zvýšit imunomodulační účinnost peptidu, proteinu nebo jeho fragment' .

2. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako peptid obsahuje produkt buněčného odbourávání proteinu nebo proteinového fragmentu jako ligand pro nejméně 1 molekulu MHC, k jejíž expresi dochází v organismu příjemce.

3. Farmaceutický prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že peptid nebo produkt buněčného odbourávání bílkovin nebo jejich fragmentů je ligandem pro molekulu MHC-I.

4. Farmaceutický prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že peptid nebo produkt buněčného odbourávání bílkovin nebo jejich fragmentů je ligandem pro molekulu MHC-II.

5. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 4,vyznačující se tím, že obsahuje peptid odvozený od bílkoviny pathogenního organismu.

6. Farmaceutický prostředek podle nároku 5, vyznačující se tím, že obsahuje peptid, odvozený od bílkoviny bakterií.

···· ·· ·· · ·· ·· ··· · · 9 · · · · ··· · · · · · · · · ·· · · · ···«·· ··· · · · *···«»· · ·

99 44 44 4 44 49

- 56

7. Farmaceutický prostředek podle nároku 5, vyznačující se tím, že obsahuje peptid, odvozený od virové bílkoviny.

8. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků

1 až 4, pro použití jako vakcína proti nádorům, vyznačující se tím, že jako bílkovinu obsahuje nádorový antigen nebo bílkovinný fragment, peptid nebo peptidy, odvozené od nádorových antigenu.

9. Farmaceutický prostředek podle nároku 8, určený pro léčebné použití, vyznačující se tím, že nádorový antigen nebo antigeny jsou odvozeny od nádorových antigenů, k jejichž expresi dochází v organismu příjemce.

10. Farmaceutický prostředek podle nároku 8, pro preventivní použití, vyznačující se tím, že obsahuje nádorové antigeny, které jsou odvozeny od často se vyskytujících nádorových antigenu.

11. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 8 až 10,vyznačující se tí m , že jako nádorový antigen nebo nádorové antigeny obsahuje antigeny melanomu.

12. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků

8 až 11,vyznačující se tím, že navíc obsahuje cytokin.

13. Farmaceutický prostředek podle nároku 12, vyznačující se tím, že se obsažený cytokin volí ze skupiny IL-2, IL-4, IL-12, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma IFN-omega, TFN-alfa, GM-CSF nebo ze směsi těchto látek.

14. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků

2 až 11,vyznačující se tím, že obsahuje ·* · fc······ · · • · · · ·· · · · ··

- 57 větší množství peptidu, které se od sebe liší tím, že jsou schopné se vázat na různé podtypy MHC příjemce.

15. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 2 až 14,vyznačující se tím, že obsahuje jeden nebo větší množství peptidů, odvozených od přírodně se vyskytujících imunogenních bílkovin nebo nádorových antigenů nebo od produktu buněčného odbourávání těchto látek.

16. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků

2 až 14, vyznačující se tím, že obsahuje jeden nebo větší počet peptidů, které jsou odlišné od peptidů, odvozených od přírodně se vyskytujících imunogenních bílkovin nebo nádorových antigenů nebo od produktu buněčného odbourávání těchto látek.

17. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje peptid, antagonizující peptid, odvozený od bílkoviny, vyvolávající autoimunitní onemocnění .

18. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 17,vyznačující se tím, že jako pomocný prostředek obsahuje organický polykation nebo směs organických polykationtů.

19. Farmaceutický prostředek podle nároku 18, v y z načující se tím, že obsahuje peptid, nesoucí negativní náboj.

20. Farmaceutický prostředek podle nároku 18 nebo 19, vyznačující se tím, že jako pomocný prostředek obsahuje bazickou polyaminokyselinu nebo směs bazických pólyaminokyselin.

4444 44

4 4 4 ··· · · · 4

4 4 · 4 4 4 4 · 4 · 4

44 444 4 4444 4 444 444

4444444 4 4

44 44 44 4 44 44

- 58

21. Farmaceutický prostředek podle nároku 20, vyznačující se tím, že jako pomocný prostředek obsahuje polyarginin.

22. Farmaceutický prostředek podle nároku 20, vy značující se tím, že jako pomocný prostředek obsahuje polylysin.

23. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 18 až 21,vyznačující se tím, že pomocný pro středek je konjugován s buněčným ligandem.

24. Farmaceutický prostředek podle nároku 23, vy značující se tím, že uvedeným ligandem je zbytek uhlohydrátu.

25. Farmaceutický prostředek podle nároku 24, vyznačující se tím, že uvedeným ligandem je zbytek fukosy.

26. Farmaceutický prostředek podle nároku 23, vyznačující se tím, že uvedeným ligandem je transferrin.

27.

18 až 26, huje DNA,

28.

18 až 26, huje DNA

Farmaceutický prostředek podle některého z nároků vyznačující se tím, že navíc obsaprostou kódových sekvencí pro funkční bílkoviny.

Farmaceutický prostředek podle některého z nároků vyznačující se tím, že navíc obsas kódovou sekvencí pro imunomodulační bílkovinu.

29. Farmaceutický prostředek podle nároku 28, vyznačující se tím, že obsahuje DNA s kódovou sekvencí pro cytokin ze skupiny IL-2, IL-4, IL-12, IFN-alfa,

IFN-beta, IFN-gamma, IFN-omega, TNF-alfa, GM-CSF.

»·· · ·· • ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 999 999999 999 999

9 9 9 9 9 9 9 9 · ·· ·· Α· » ·· »β

- 59

30. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 29,vyznačující se tím, že je upraven pro parenterální podání.

31. Farmaceutický prostředek podle nároku 30, vyznačující se tím, že obsahuje roztok nebo suspenzi peptidu a pomocného prostředku ve farmaceuticky přijatelném nosiči.

32. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 29,vyznačující se tím, že je upraven pro místno podání.

33. Farmaceutický prostředek podle nároku 32, vy značující se tím, že má formu hydrogelu.