ES2220066T3

ES2220066T3 - Metodo y dispositivo para inmunoensayo electroquimico de analitos multiples.

Info

Publication number: ES2220066T3
Application number: ES99925979T
Authority: ES
Inventors: Harvey B. Buck, Jr.; Zhi D. Deng; Eric R. Diebold
Original assignee: Roche Diagnostics Corp
Current assignee: Roche Diagnostics Corp
Priority date: 1998-06-01
Filing date: 1999-05-28
Publication date: 2004-12-01
Anticipated expiration: 2019-05-28
Also published as: AU4215799A; WO1999062918A1; US6262264B1; CA2333875A1; DE69917258D1; CA2333686C; US6352824B1; EP1084132B1; DE69917258T2; ATE221076T1; AU4215999A; DE69902265T2; AU4217899A; EP1084133B1; WO1999062919A1; EP1084409A1; ATE222915T1; EP1084132A1; DE69902662T2; CA2333732C

Abstract

Un método para medir la concentración de uno o más analitos en una muestra líquida, comprendiendo dicho método poner en contacto un volumen de dicha muestra líquida con 1) cantidades predeterminadas de al menos una primera y una segunda especies reversibles rédox, teniendo cada especie respectiva un potencial rédox que difiere al menos en 50 milivoltios del de cada una de las otras especies, comprendiendo al menos una especie un conjugado difusible de muestra líquida de un análogo de ligando de un analito en la muestra líquida y un marcador reversible rédox, siendo dicho conjugado susceptible de fijación competitiva con una pareja de fijación específica para dicho analito, y 2) una cantidad predeterminada de al menos una pareja de fijación específica para cada analito a medir; y determinar electroquímicamente la concentración de cada una de dichas especies reversibles rédox difusibles en la muestra líquida por puesta en contacto dicha muestra con una estructura de electrodos que incluye unelectrodo de referencia y al menos primero y segundo electrodos de trabajo dimensionados para permitir el reciclado difusional de la especie reversible rédox difusible en la muestra cuando se aplica un potencial catódico predeterminado dependiente de la especie reversible rédox a un electrodo de trabajo y se aplica un potencial anódico predeterminado dependiente de la especie reversible rédox a un segundo electrodo de trabajo, siendo dicho reciclado difusional de dichas especies suficiente para mantener una corriente medible a través de dicha muestra, aplicación de un primer potencial catódico al primer electrodo de trabajo y un primer potencial anódico al segundo electrodo de trabajo, correspondiendo dichos primeros potenciales catódico y anódico a los potenciales respectivos necesarios para establecer el flujo de corriente a través de la muestra debido al reciclado difusional de la primera especie reversible rédox sin interferencia significativa de dicha segunda especie reversible rédox,medición del flujo de corriente para dichos primeros potenciales anódico y catódico, aplicación de un segundo potencial catódico a dicho primer o segundo electrodo de trabajo y un segundo potencial anódico al otro electrodo de trabajo, correspondiendo dichos segundos potenciales catódico y anódico a los potenciales respectivos necesarios para establecer el flujo de corriente a través de la muestra debido al reciclado difusional de la segunda especie reversible rédox sin interferencia significativa de la primera especie reversible rédox, medición del flujo de corriente para dichos segundos potenciales anódico y catódico, y correlación de los flujos de corriente respectivos medidos con el correspondiente para concentraciones conocidas de las especies reversibles rédox difusibles respectivas.

Description

Método y dispositivo para inmunoensayo electroquímico de analitos múltiples.

Esta invención se refiere a un método y dispositivo para detección y cuantificación de analitos biológicamente importantes en una muestra líquida. Más particularmente, la invención está dirigida a un biosensor y método de utilización del mismo para inmunoensayos electroquímicos de especies múltiples de analitos en una sola muestra líquida.

Antecedentes y sumario de la invención

Los protocolos terapéuticos utilizados hoy en día por los especialistas médicos en el tratamiento de su población de pacientes requieren métodos exactos y cómodos de observación de los estados de enfermedad de los pacientes. Se han dedicado muchos esfuerzos a la investigación y el desarrollo de métodos para medida de la presencia y/o concentración de sustancias biológicamente importantes indicativas de una condición clínica o un estado de enfermedad, particularmente en fluidos corporales tales como sangre, orina o saliva. Dichos métodos se han desarrollado para detectar la existencia o gravedad de una gran diversidad de estados de enfermedad tales como diabetes, trastornos metabólicos, trastornos hormonales, y para la observación de la presencia y/o concentración de fármacos éticos o ilegales. Más recientemente, se han hecho avances significativos en el uso de técnicas electroquímicas de detección/medida basadas en afinidad que dependen, al menos en parte, de la formación de un complejo entre la especie química que se ensaya (el "analito") y otra especie a la cual aquélla se fijará específicamente (una "pareja de fijación específica"). Tales métodos emplean típicamente un análogo de ligando marcado del analito diana, seleccionándose el análogo de ligando de tal manera que el mismo se fija competitivamente con el analito a la pareja de fijación específica. El análogo de ligando está marcado de modo que el grado de fijación del análogo de ligando marcado con la pareja de fijación específica pueda medirse y correlacionarse con la presencia y/o concentración del analito diana en la muestra biológica.

Se han empleado numerosos marcadores en tales técnicas de análisis de muestras basadas en afinidad, con inclusión de marcación con enzimas, marcación con radioisótopos, marcación fluorescente, y marcación con especies químicas sujetas a oxidación y/o reducción electroquímica. El uso de especies reversibles rédox, a las que se refiere algunas veces como agentes de transferencia de electrones o mediadores de electrones como marcadores para análogos de ligandos, ha demostrado proporcionar resultados prácticos y fiables en los ensayos electroquímicos basados en afinidad. Sin embargo, el uso de técnicas electroquímicas en la detección y cuantificación de las concentraciones de tales especies reversibles rédox (correlacionadas con las concentraciones de analitos) no deja de presentar problemas. Las medidas electroquímicas están sujetas a muchas influencias que afectan a la exactitud de las medidas, con inclusión de aquéllas que están relacionadas con variaciones en la estructura del propio electrodo y/o los efectos de matriz que se derivan de la variabilidad en las muestras líquidas.

La presente invención se refiere a inmunosensores basados en la medida electroquímica directa de especies químicas detectables con electrodos de tipo microconjunto bajo control bipotenciostático. Un marcador electroquímico, por ejemplo un mediador de Os, se fija covalentemente a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos del epítope de fijación para el anticuerpo. Cuando el conjugado indicador/péptido se fija al anticuerpo, el indicador no funciona electroquímicamente o se dice que está "inhibido". El analito presente en la muestra competirá con el conjugado indicador/péptido por el número limitado de sitios de fijación en el anticuerpo. Cuando está presente más analito, quedará más conjugado indicador/péptido libre, produciendo mayor intensidad de corriente en un electrodo sensor, es decir, uno de los electrodos de trabajo en el cual están teniendo lugar los sucesos medidos (oxidación o reducción). En el caso opuesto, cuando está presente menos analito, más conjugado indicador/péptido se fijará al anticuerpo, dando como resultado menos conjugados libres y produciendo niveles de corriente inferiores en los electrodos de trabajo. Por consiguiente, la corriente detectada en uno cualquiera de los electrodos de trabajo será función de la concentración de analito.

Con frecuencia se desea medir más de una especie de analito en una muestra líquida. La medida de especies múltiples en una mezcla se ha realizado con fotometría y fluorescencia, por la vía de la selección de las longitudes de onda apropiadas. Las medidas electroquímicas de una sola especie en una mezcla compleja se realizan rutinariamente por selección de un potencial para el cual solamente la especie deseada se oxida o se reduce (amperometría) o por escalonamiento o variación del potencial a lo largo de un intervalo en el cual solamente la especie deseada cambia sus propiedades electroquímicas (métodos AC y de pulsos). Estos métodos presentan desventajas que incluyen falta de sensibilidad y falta de especificidad, interferencia por corrientes de polarización de carga y de matriz (métodos de pulsos) y orientación ("routing") de los electrodos debido a la incapacidad de aplicar una sobretensión adecuada. Además, las medidas electroquímicas se complican por interferencia entre la multiplicidad de especies electroactivas existentes comúnmente en las muestras biológicas.

Se conocen estructuras de electrodo que generan corriente de estado estacionario por la vía de realimentación difusional, que incluyen electrodos en conjunto interdigitados (IDAs) (Figs. 1 y 2) y disposiciones de placas paralelas con control bipotenciostático. Dichas estructuras se han utilizado para medir especies reversibles basadas en la corriente de estado estacionario alcanzada por sometimiento a ciclos de las especies reversibles. Un mediador reversible (especie reversible rédox) se oxida y reduce alternativamente en los dedos de los electrodos interdigitados. La corriente de estado estacionario se ajusta proporcionalmente a la concentración de mediador (Fig. 3) y está limitada por la difusión del mediador. Una corriente de estado estacionario se alcanza en cuestión de segundos de aplicación de los potenciales anódico (más positivo) y catódico (menos positivo o negativo) (Fig. 6) al conjunto de microelectrodos. La pendiente de una gráfica de la corriente IDA frente a la concentración de mediador depende de las dimensiones del IDA, y la pendiente aumenta con las separaciones más estrechas entre los electrodos (Fig. 7).

Una realización de la presente invención proporciona un método para medir especies múltiples de analitos en la misma muestra, y óptimamente en la misma estructura de electrodos, mejorando así la exactitud de las medidas relativas. Esta invención proporciona también un biosensor electroquímico con capacidad para proporcionar exactitud mejorada por el uso de auto-compensación. La concentración de analito puede medirse/calcularse a partir de datos electrométricos obtenidos sobre la misma muestra líquida con la misma estructura de electrodos (los electrodos de trabajo), minimizando de este modo las perturbaciones debidas a la variabilidad en la estructura de la muestra o de los electrodos.

Las diversas realizaciones de esta invención utilizan el principio del reciclado difusional, en el cual una especie reversible rédox y difusible se oxida y reduce alternativamente en electrodos próximos, generando con ello una corriente medible. Dado que se requiere oxidación y reducción alternativas para la medida, únicamente las especies electroactivas que son electroquímicamente reversibles se miden de esta manera, eliminando, o al menos reduciendo, el impacto o interferencia de especies electroactivas no reversibles en la muestra. Las especies reversibles rédox que tienen potenciales de oxidación diferentes pueden medirse independientemente en una mezcla por selección y control bipotenciostático de los potenciales de oxidación de reducción para pares de electrodos próximos de tal manera que únicamente la especie de interés se oxida en el ánodo (en el electrodo con el potencial más positivo) y se reduce en el cátodo (el electrodo con el potencial menos positivo o negativo): Cuando los electrodos de trabajo (los conjuntos ánodo/cátodo) están dimensionados para permitir el reciclado difusional de la especie rédox reversible a los potenciales de oxidación y reducción seleccionados apropiados para dicha especie, se establece rápidamente a través de la muestra y la estructura de los electrodos una corriente de estado estacionario en los electrodos de trabajo en los que están teniendo lugar los sucesos de oxidación y reducción medibles. La magnitud de la corriente es proporcional a la concentración de la especie reversible rédox difusible contenida en la muestra. Cuando se utilizan dos o más especies reversibles rédox, las mismas se seleccionan de modo que tengan potenciales rédox que difieran en al menos 50 milivoltios, muy preferiblemente al menos 200 milivoltios, para minimizar la interferencia entre una especie y la otra en las medidas de las corrientes de estado estacionario respectivas.

Cualquier estructura de electrodos que permita el reciclado difusional para alcanzar la corriente de estado estacionario en respuesta a la aplicación de potenciales anódico y catódico pre-seleccionados específicos de la especie puede utilizarse en la realización de la invención. Estructuras de electrodos adecuadas incluyen microelectrodos de conjuntos interdigitados y electrodos de placas paralelas separados por distancias comprendidas dentro de la distancia de difusión de la especie reversible rédox respectiva. Las estructuras de electrodos incluyen típicamente un electrodo de referencia (v.g., Ag/AgCl), al menos dos electrodos de trabajo (uno a potencial positivo y otro a un potencial menos positivo o negativo con relación al electrodo de referencia), y opcionalmente un electrodo auxiliar para control de la corriente. Durante el uso, se dispone un bipotenciostato programable en comunicación eléctrica con la estructura de los electrodos para aplicación de los potenciales anódico y catódico respectivos específicos para cada una de las especies reversibles rédox respectivas utilizadas en el método/biosensor. Se han desarrollado varios complejos nuevos de osmio como marcadores para preparar conjugados con el análogo de ligando que tienen diferencias de potencial suficientes para permitir el uso de dos complejos de osmio (en oposición a un complejo de osmio y un ferroceno u otro marcador reversible rédox) en esta invención.

De acuerdo con ello, una realización de la invención proporciona un dispositivo para detectar o cuantificar uno o más analitos en una muestra líquida. El dispositivo comprende al menos dos especies reversibles rédox que tienen potenciales rédox respectivos que difieren al menos en 50 milivoltios, y una estructura de electrodos para contacto con la muestra líquida. En una realización, el dispositivo comprende adicionalmente una cámara para contener la muestra líquida, dimensionada opcionalmente para llenado capilar. La estructura de electrodos incluye un electrodo de referencia y un ánodo y un cátodo (electrodos de trabajo) dimensionados para permitir el reciclado difusional de la especie reversible rédox en la muestra cuando se aplica un potencial catódico dependiente de la especie reversible rédox a un electrodo de trabajo y un potencial anódico dependiente de la especie reversible rédox a un segundo electrodo para permitir y mantener una corriente medible a través de la muestra. El dispositivo incluye también conductores que comunican con los electrodos respectivos para aplicación de los potenciales y para el transporte de la corriente conducida entre la muestra y los electrodos respectivos.

El dispositivo de acuerdo con esta invención se utiliza típicamente en combinación con un medidor que incluye una fuente de potencia, por ejemplo una batería, un microprocesador, un registrador para almacenar los valores de corriente medidos, y una pantalla para presentar las concentraciones de analito calculadas sobre la base de los valores de corriente medidos. La construcción y configuración de tales medidores son bien conocidas en la técnica. Medidores para uso de acuerdo con el presente dispositivo comprenden adicionalmente un bipotenciostato bajo control del microprocesador o programable por separado para aplicar potenciales predeterminados a los conjuntos de los microelectrodos componentes del dispositivo durante el análisis de la muestra líquida. Mejoras en la construcción del medidor y el diseño para sistemas biosensores se describen en las patentes U.S. Núms. 4.999.632; 5.243.516; 5.366.609; 5.352.351; 5.405.511; y 5.48.271.

En otra realización de la invención se proporciona un método para medir la concentración de uno o más analitos en una muestra líquida. El método incluye poner en contacto una porción de la muestra con cantidades predeterminadas de al menos una primera y una segunda especies reversibles rédox que tienen un potencial rédox que difiere al menos en 50 milivoltios del de cada una de las otras especies. Cada especie respectiva comprende un conjugado difusible de muestra líquida de un análogo de ligando de un analito de la muestra líquida y un marcador reversible rédox. La muestra líquida está en contacto también con una cantidad predeterminada de al menos una pareja de fijación específica para cada analito a medir. El conjugado difusible se selecciona de tal modo que el mismo es susceptible de fijación competitiva con la pareja de fijación específica para dicho analito.

La concentración de especies reversibles rédox difusibles en la muestra líquida se determina luego electroquímicamente. La muestra se pone en contacto con una estructura de electrodos, que incluye un electrodo de referencia y al menos electrodos de trabajo primero y segundo dimensionados para permitir el reciclado difusional de al menos una de las especies reversibles rédox difusibles en la muestra, cuando se aplica un potencial catódico predeterminado dependiente de la especie reversible rédox a un electrodo de trabajo y se aplica un potencial anódico predeterminado dependiente de la especie reversible rédox al segundo electrodo de trabajo. Típicamente, se aplica un primer potencial catódico al primer electrodo de trabajo y se aplica un primer potencial anódico al segundo electrodo de trabajo para establecer el flujo de corriente a través de la muestra debido al reciclado difusional de la primera especie reversible rédox sin interferencia significativa de la segunda especie reversible rédox. Se mide el flujo de corriente a través de uno o más de los electrodos para los primeros potenciales anódico y catódico. Análogamente, se mide el flujo de corriente de respuesta a la aplicación de los segundos potenciales catódico y anódico a los electrodos en contacto con la muestra y se correlaciona con los flujos de corriente medidos para concentraciones conocidas de las especies reversibles rédox respectivas, siendo dichas concentraciones proporcionales a las concentraciones respectivas de analito para un potencial predeterminado dependiente de la especie reversible rédox (anódico o catódico). Alternativamente, el potencial de uno de los electrodos de trabajo puede mantenerse constante y se observa el flujo de corriente a medida que se modifica el potencial del otro electrodo de trabajo y se barre a través del potencial dependiente de la otra especie reversible rédox.

Los componentes reactivos para la invención, con inclusión de la especie reversible rédox y las parejas de fijación específica, pueden proporcionarse en la forma de un estuche de ensayo para medir el o los analitos diana en una muestra líquida, sea como reactivos separados o, más preferiblemente, combinados como una composición de
multi-reactivos, v.g. especies reversibles rédox combinadas, parejas de fijación específica combinadas, o especies reversibles rédox y parejas de fijación específica combinadas. El estuche incluye, opcional pero preferiblemente, una estructura de electrodos dimensionada para permitir el reciclado rédox difusional de las especies reversibles rédox difusibles en la muestra líquida. La estructura de electrodos incluye conductores para conectar el bipotenciostato de estructura programado para aplicar los potenciales anódico y catódico dependientes de la especie reversible rédox a la estructura de electrodos y para detectar y medir el flujo de corriente, típicamente en uno o ambos de los electrodos de trabajo, en respuesta a dichos potenciales aplicados.

Se describe también en esta memoria la preparación y el uso de complejos de osmio electroquímicamente detectables y conjugados covalentes de dichos complejos que tienen potenciales de oxidación que difieren suficientemente para permitir su uso conjunto en las realizaciones respectivas de método y dispositivo de la invención. Se preparan análogos de ligando marcados con osmio capaces de fijarse a una pareja de fijación específica de un analito biológicamente significativo. Un grupo de conjugados electroquímicamente detectables comprenden un complejo de bis(bipiridil)-imidazolil-cloroosmonio, caracterizado por cinética de mediación rápida y potencial rédox bajo (+150 mV frente a Ag/AgCl). Otro grupo de conjugados marcados con complejos de osmio electroquímicamente detectables incluyen complejos de tris(bipiridil)-osmio, los cuales, al igual que los complejos de bis(bipiridil)-imidazolil-cloroosmio se caracterizan por cinética de mediación rápida, pero los complejos de tris(bipiridilo) tienen un potencial rédox suficientemente diferente de los complejos de bis(piridil)-imidazolil-cloroosmio para permitir su uso conjunto en las diversas realizaciones de esta invención a fin de hacer posible el uso de conjuntos de microelectrodos para medir más de un analito en una sola muestra líquida por corrientes dependientes de la concentración amplificadas por reciclado rédox difusional.

En una realización preferida de la invención, se utiliza al menos un conjugado complejo de osmio en combinación con otra especie reversible rédox conjugada para la medida a la vez de hemoglobina glicosilada y hemoglobina en una muestra de sangre lisada. Una especie reversible rédox comprende preferiblemente un complejo de osmio enlazado covalentemente a un análogo de ligando de hemoglobina o hemoglobina glicosilada, y la segunda especie reversible rédox comprende un segundo marcador reversible rédox enlazado covalentemente a un análogo de ligando del otro de los dos analitos diana. El método permite la medida de la concentración tanto de la hemoglobina glicosilada (HbA1c) y la concentración, o bien de la hemoglobina total, o de la hemoglobina no glicosilada (HbA_{0}), haciendo posible con ello el cálculo de los resultados como relación de las dos medidas (% HbA1c). Es ventajoso ensayar a la vez HbA1c y hemoglobina total (o HbA_{0}) utilizando el mismo principio en una sola muestra.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una vista en planta aumentada de un electrodo interdigitado de conjunto para medida por un mediador reversible de acuerdo con la presente invención.

La Fig. 2 es una vista parcial en corte transversal del electrodo de la Fig. 1 que ilustra las condiciones de corriente de estado estacionario limitada por la difusión del mediador reversible (M) que se oxida y reduce alternativamente en los dedos de los electrodos interdigitados.

La Fig. 3 es una presentación gráfica de las corrientes de respuesta a la dosis para un mediador de bis-(bipiridil)-imidazolil-cloroosmonio en un conjugado peptídico de dicho mediador.

La Fig. 4 es una ilustración gráfica del flujo de corriente en función de la concentración de hemoglobina glicosilada (HbA1c) en muestras de sangre utilizando un conjugado de osmio y amperometría DC amplificada enzimáticamente.

La Fig. 5 es una ilustración gráfica de la inhibición del flujo de corriente debida al conjugado libre en función de la concentración de anticuerpos (C_{n}) tal como se mide utilizando amperometría DC amplificada enzimáticamente
[C_{1} > C_{2} > C_{3}].

La Fig. 6 es una ilustración gráfica de flujos de corriente en función del tiempo utilizando un electrodo interdigitado de conjunto.

La Fig. 7 es una ilustración gráfica del efecto de las dimensiones de la estructura de electrodos interdigitado de conjunto sobre el flujo de corriente en función de la concentración de un conjugado de osmio (Os-DSG-Alc).

La Fig. 8 es una ilustración gráfica del flujo de corriente en función del potencial aplicado para una muestra líquida que contiene cantidades equimolares (50 \muM) de un complejo de bis-(bipiridil)-imidazolil-cloroosmio y un complejo de tris(bipirid-il)-osmio.

La Fig. 9 es una presentación gráfica del flujo de corriente en función de la concentración de un conjugado ferroceno-biotina en presencia de cantidades variables de un conjugado de complejo de osmio en electrodos interdigitado de conjunto con control bipotenciostático.

La Fig. 10 es una ilustración gráfica del efecto de la concentración de un conjugado sin marcar (BSA-Alc) sobre el flujo de corriente en una solución que contiene conjugado marcado con osmio (osmio-DSG-Alc)) en presencia de tres composiciones de anticuerpos que reconocen A1c separadas.

La Fig. 11 ilustra la estructura de un conjugado marcado con tris(bipiridil)-osmio para uso de acuerdo con esta invención.

Las Figs. 12-14 son similares y cada una de ellas representa la estructura química de un conjugado de péptido marcado con bis(bipiridil) -imidazolil-cloroosmio para uso de acuerdo con esta invención.

Descripción detallada de la invención

Un aspecto de la invención es un método para medir la concentración de uno o más analitos en una muestra líquida. El método permite dos o más medidas amperométricas independientes de la muestra sobre una sola estructura de electrodos. El método comprende

poner en contacto un volumen de dicha muestra líquida con

1): cantidades predeterminadas de al menos una primera y una segunda especies reversibles rédox, teniendo cada especie respectiva un potencial rédox que difiere al menos en 50 milivoltios del de cada una de las otras especies, comprendiendo al menos una especie un conjugado difusible de muestra líquida de un análogo de ligando de un analito en la muestra líquida y un marcador reversible rédox, siendo dicho conjugado susceptible de fijación competitiva con una pareja de fijación específica para dicho analito, y

2): una cantidad predeterminada de al menos una pareja de fijación específica para cada analito a medir; y

determinar electroquímicamente la concentración de cada una de dichas especies reversibles rédox difusibles en la muestra líquida por

puesta en contacto dicha muestra con una estructura de electrodos que incluye un electrodo de referencia y al menos primero y segundo electrodos de trabajo dimensionados para permitir el reciclado difusional de la especie reversible rédox difusible en la muestra cuando se aplica un potencial catódico predeterminado dependiente de la especie reversible rédox a un electrodo de trabajo y se aplica un potencial anódico predeterminado dependiente de la especie reversible rédox a un segundo electrodo de trabajo, siendo dicho reciclado difusional de dichas especies suficiente para mantener una corriente medible a través de dicha muestra,

aplicación de un primer potencial catódico al primer electrodo de trabajo y un primer potencial anódico al segundo electrodo de trabajo, correspondiendo dichos primeros potenciales catódico y anódico a los potenciales respectivos necesarios para establecer el flujo de corriente a través de la muestra debido al reciclado difusional de la primera especie reversible rédox sin interferencia significativa de dicha segunda especie reversible rédox,

medición del flujo de corriente para dichos primeros potenciales anódico y catódico,

aplicación de un segundo potencial catódico a dicho primer o segundo electrodo de trabajo y un segundo potencial anódico al otro electrodo de trabajo, correspondiendo dichos segundos potenciales catódico y anódico a los potenciales respectivos necesarios para establecer el flujo de corriente a través de la muestra debido al reciclado difusional de la segunda especie reversible rédox sin interferencia significativa de la primera especie reversible rédox,

medición del flujo de corriente para dichos segundos potenciales anódico y catódico, y

correlación de los flujos de corriente respectivos medidos con el correspondiente para concentraciones conocidas de las especies reversibles rédox difusibles respectivas.

El método de la invención tiene aplicabilidad muy general, pero puede utilizarse en particular para ensayar: fármacos, hormonas, con inclusión de hormonas peptídicas (v.g., hormona estimulante del tiroides (TSH), hormona luteinizante (LH), hormona estimulante del folículo (FSH), insulina y prolactina) u hormonas no peptídicas (v.g., hormonas esteroidales tales como cortisol, estradiol, progesterona y testosterona, u hormonas tiroideas tales como tiroxina (T4) y triyodotironina), proteínas (v.g., gonadotropina coriónica humana (hCG), antígeno carcino-embrionario (CEA) y alfafetoproteína (AFP)), fármacos (v.g., digoxina), azúcares, toxinas o vitaminas.

El método puede realizarse sobre muestras líquidas que comprenden fluidos biológicos tales como saliva, orina, o sangre, o bien la muestra líquida puede derivarse de fuentes ambientales. Las muestras líquidas pueden analizarse "tal como se reciben", o bien pueden diluirse, tamponarse o procesarse de otro modo para optimizar la detección del o de los analitos considerados como diana. Así, por ejemplo, las muestras de sangre pueden lisarse y/o desnaturalizarse de otro modo para solubilizar los componentes celulares.

El método puede realizarse utilizando técnicas de manipulación de muestras muy variables. Así, la muestra puede mezclarse previamente con uno cualquiera o ambos de la pareja de fijación específica para los analitos considerados como diana y la especie reversible rédox antes del contacto de la muestra con la estructura de electrodos, o bien la muestra líquida, sea pura o pre-procesada, puede suministrarse a un recipiente que contiene cantidades predeterminadas de la especie reversible rédox y la pareja de fijación específica para contacto subsiguiente o simultáneo con la estructura de electrodos. El orden de introducción de los componentes en la muestra no es crítico; sin embargo, en una realización de la invención las cantidades predeterminadas de las parejas de fijación específica se añaden primeramente a la muestra, y después de ello, se añaden las cantidades predeterminadas de la especie reversible rédox. También es posible combinar las cantidades predeterminadas de las parejas de fijación específica con la especie reversible rédox para formar los complejos respectivos antes de combinar dichos componentes con la muestra líquida. En este último caso, las especies reversible rédox serán desplazadas de su pareja de fijación específica respectiva por el analito correspondiente para proporcionar una concentración de la especie reversible rédox proporcional a la concentración de analito en la muestra líquida. Los reactivos, es decir, las cantidades predeterminadas de la pareja de fijación específica de cada analito y las cantidades predeterminadas de la especie reversible rédox correspondiente pueden, por ejemplo, estar depositados en un recipiente para recibir un volumen predeterminado de la muestra líquida. La muestra líquida se añade al recipiente, y después de ello, o simultáneamente, la muestra líquida se pone en contacto con la estructura de electrodos.

La estructura de electrodos incluye un electrodo de referencia y al menos electrodos de trabajo primero y segundo dimensionados para permitir el reciclado difusional de la especie reversible rédox difusible en la muestra cuando se aplican a los electrodos de trabajo potenciales catódico y anódico predeterminados dependientes de la especie reversible rédox. La expresión "electrodo de trabajo", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un electrodo en el cual tienen lugar los sucesos medidos (es decir, oxidación y/o reducción) y el flujo de corriente resultante puede medirse como indicador de la concentración de analito. "Potencial anódico" se refiere al potencial más positivo (aplicado al ánodo) y "potencial catódico" se refiere al potencial menos positivo o negativo aplicado al cátodo (frente a un electrodo de referencia). Electrodos dimensionados para permitir el reciclado difusional son bien conocidos en la técnica y se encuentran típicamente en la forma de conjuntos de microdiscos, microorificios, o microbandas. En una realización, los electrodos se encuentran en forma de una disposición interdigitado de electrodos de microbanda con separación micrométrica o submicrométrica. Una longitud difusional media corta y un gran número de electrodos son deseables para una amplificación eficaz de la corriente por reciclado de las especies reversibles rédox. Los conjuntos de microelectrodos pueden fabricarse, por ejemplo, como pares de electrodos metálicos interdigitados de película delgada en geometría micrométrica y submicrométrica dispuestos sobre un sustrato aislante, por ejemplo, silicio oxidado. Cada uno de los dedos de los electrodos (Fig. 1) está separado de su dedo contiguo en un intervalo de nanómetros a unos pocos (1-10) micrómetros. Los conjuntos de microelectrodos pueden fabricarse utilizando fotolitografía, litografía de haces electrónicos, y la denominada técnica de levantamiento. Así, un conjunto de electrodos interdigitados (IDA) puede depositarse sobre vidrio, silicio o poliamida utilizando el procedimiento general siguiente:

1.: Dejar crecer una capa de óxido térmica sobre sustrato de silicio;

2.: pulverizar una capa de siembra de cromo de 400 \ring{A}, y 2000 \ring{A} de oro;

3.: aplicar por centrifugación y someter a cochura suave una foto-reserva;

4.: exponer y revelar la foto-reserva con patrón IDA;

5.: estampar oro y cromo con laminación de haces iónicos;

6.: desprender la foto-reserva; y

7.: cortar los electrodos en virutas, recubriendo primeramente con una capa protectora, cortando en tiras, desprendiendo la capa protectora, y limpiando las superficies de los electrodos en plasma de oxígeno.

La estructura de los electrodos puede conformarse sobre una superficie interna de una cámara para recibir la muestra líquida, v.g., una cubeta, una cámara de llenado capilar, u otro recipiente de recepción de la muestra en el cual la estructura de electrodos puede permanecer en contacto con la muestra líquida. Alternativamente, la estructura de electrodos puede formar parte de una sonda para inmersión en la muestra líquida después que la muestra se ha puesto en contacto con las cantidades predeterminadas de la especie reversible rédox y las parejas de fijación específica. La estructura de electrodos está en contacto con conductores que permiten la aplicación de los potenciales respectivos catódico y anódico para realización del presente método. Los potenciales anódico y catódico se aplican con relación a un componente de electrodo de referencia de la estructura de electrodos utilizando un bipotenciostato. La estructura de electrodos puede incluir opcionalmente un electrodo auxiliar para control de la corriente. El bipotenciostato se utiliza para aplicar un primer potencial catódico a un primer electrodo de trabajo y un primer potencial anódico a un segundo electrodo de trabajo, correspondiendo los primeros potenciales catódico y anódico a los potenciales respectivos necesarios para establecer el flujo de corriente a través de la muestra debido al reciclado difusional de la primera especie reversible rédox. Opcionalmente, el potencial en un electrodo de trabajo puede ajustarse a un primer potencial anódico dependiente de la especie difusible, y se mide el flujo de corriente a medida que el potencial del otro electrodo de trabajo se barre a través de un potencial correspondiente al potencial catódico predeterminado dependiente de la especie difusible (o viceversa).

Los potenciales catódico y anódico apropiados para cada especie reversible rédox pueden determinarse fácilmente por medida empírica. Las especies reversibles rédox múltiples utilizadas en la realización del método de esta invención se seleccionan de modo que tengan potenciales rédox que difieran al menos en 50 milivoltios, más preferiblemente al menos en 100 milivoltios, y más preferiblemente todavía al menos en 200 milivoltios, del de cada una de las otras especies reversibles rédox utilizadas en el método. La diferencia en los potenciales rédox de las especies reversibles rédox que se utilizan permiten que cada especie se detecte sin interferencia significativa de la segunda o de cualquier otra especie reversible rédox contenida en la muestra líquida. Se establece rápidamente un flujo de corriente de estado estacionario en cada uno de los electrodos de trabajo después de la aplicación de los potenciales anódico y catódico. El flujo de corriente puede medirse en cualquiera o en ambos electrodos de trabajo, y es proporcional a la concentración de la especie reversible rédox que se recicla.

Se aplican segundos potenciales catódico y anódico a los electrodos de trabajo, correspondiendo dichos segundos potenciales a los potenciales respectivos necesarios para establecer el flujo de corriente a través de la muestra debido al reciclado difusional de la segunda especie reversible rédox sin interferencia significativa de la primera especie reversible rédox, y se mide el flujo de la corriente de estado estacionario resultante. Se repite este paso para cada especie reversible rédox utilizada en el método. Los flujos de corriente medidos se correlacionan luego con concentraciones conocidas de las especies reversibles rédox difusibles respectivas. Dichas concentraciones son proporcionales a las concentraciones respectivas de analito.

Los pasos del método pueden conducirse utilizando un bipotenciostato programado para controlar los potenciales en la estructura de electrodos en contacto con la muestra: el bipotenciostato puede estar incluido en un medidor de sobremesa o un medidor manual que incluye adicionalmente medios para leer los valores para la corriente de estado estacionario, almacenar dichos valores, y calcular las concentraciones de analito utilizando un microprocesador programado para realizar dichos cálculos.

Las especies reversibles rédox utilizadas en el método comprenden un conjugado difusible en la muestra líquida de un análogo de ligando de un analito contenido en la muestra líquida y un marcador reversible rédox. La expresión "análogo de ligando", tal como se utiliza en la definición de la presente invención, se refiere a una especie química susceptible de complejarse con la misma pareja de fijación específica que el analito que se mide, y puede incluir el analito propiamente dicho, con tal que el peso molecular del conjugado sea menor que aproximadamente 50.000, más preferiblemente menor que aproximadamente 10.000 Daltons. Muy preferiblemente, el peso molecular del conjugado del análogo de ligando y el marcador reversible rédox está comprendido entre aproximadamente 500 y aproximadamente 5.000 Daltons. Las especies reversibles rédox de peso molecular bajo son muy deseables teniendo en cuenta la técnica de detección electroquímica basada en difusión que se utiliza en la realización del presente método.

La expresión "marcador reversible rédox", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una especie química susceptible de oxidación y reducción reversible en una muestra líquida. El mismo puede encontrarse en forma de un resto orgánico, por ejemplo, un grupo químico que comprende una nitrosoanilina, un catecol, hidroquinona, o un grupo aminofenol. Alternativamente, el marcador reversible rédox puede ser una especie inorgánica u organometálica susceptible de sufrir oxidación y reducción reversible en una muestra líquida. Dichas especies pueden ser, por ejemplo, moléculas completas, porciones de moléculas, átomos, iones, o más particularmente, complejos iónicos. Los marcadores reversibles rédox son bien conocidos en la técnica, e incluyen complejos de ligandos con iones de metales de transición, por ejemplo hierro (ferroceno y derivados de ferroceno), rutenio y osmio.

Las cantidades relativas de las especies reversibles rédox primera y segunda y las parejas de fijación específica respectivas para los analitos considerados como diana a medir en el método pueden determinarse empíricamente. Las mismas dependen de los intervalos de concentración del analito considerado como diana, y de la estequiometría de fijación de la pareja de fijación específica, la constante de fijación, el analito y la especie reversible rédox correspondiente. Las cantidades de cada reactivo apropiadas para cada analito que se mide pueden determinarse por métodos empíricos.

La especie reversible rédox comprende típicamente un conjugado de un análogo de ligando de un analito en una muestra líquida y un marcador reversible rédox. El conjugado se prepara uniendo el análogo de ligando al marcador, sea covalentemente a través de agentes de enlace bifuncionales o por combinación de enlaces covalentes y entidades de fijación específica reconocidas en la técnica (por ejemplo, biotina-avidina).

En una realización de la invención, la pareja de fijación específica para cada analito es un anticuerpo y el análogo de ligando se selecciona de tal manera que el mismo se fija competitivamente con el analito al anticuerpo. Existen, sin embargo, otros ejemplos de interacciones ligando-pareja de fijación específica que pueden utilizarse en el desarrollo de aplicaciones del presente método. Ejemplos de ligandos y parejas de fijación específica para dichos ligandos se enumeran a continuación.

1

El término "anticuerpo" se refiere a (a) cualquiera de las diversas clases o subclases de inmunoglobulina, v.g., IgG, IgM, derivadas de cualquiera de los animales utilizados convencionalmente, v.g., ovejas, conejos, cabras o ratones; (b) anticuerpos monoclonales; (c) moléculas intactas o "fragmentos" de anticuerpos, monoclonales o policlonales, siendo los fragmentos aquéllos que contienen la región de fijación del anticuerpo, es decir, fragmentos desprovistos de la porción Fc (v.g., Fab, Fab^{1}, F(ab')_{2}) o los denominados fragmentos "semi-molécula" obtenidos por escisión reductora de los enlaces disulfuro que conectan los componentes de la cadena pesada en el anticuerpo intacto. La preparación de tales anticuerpos es bien conocida en la técnica.

El término "antígeno" utilizado en la descripción y definición de la presente invención incluye tanto especies permanentemente antigénicas (por ejemplo, proteínas, péptidos, bacterias, fragmentos de bacterias, células, fragmentos de células, sustancias fármaco, y virus) como haptanos que pueden volverse antigénicos en condiciones adecuadas.

En una realización de la invención, se proporciona un método para medir dos analitos proteináceos en una muestra líquida en el cual el componente análogo de ligando de la primera especie reversible rédox es un péptido que comprende un epítope de un primer analito y el componente análogo de ligando de una segunda especie reversible rédox es un péptido que comprende un epítope de un segundo analito. Una pareja de fijación específica utilizada en el método es un anticuerpo que reconoce el epítope del primer analito, y la otra pareja de fijación específica es un anticuerpo que reconoce el epítope del segundo analito. En otra aplicación del presente método, se realizan dos medidas independientes sobre un solo analito en una muestra líquida. En dicha realización, el componente análogo de ligando respectivo de las especies reversibles rédox primera y segunda son análogos de ligando diferentes del analito considerado como diana. Cuando el analito considerado como diana es un compuesto proteináceo, el componente análogo de ligando de la primera especie reversible rédox es un péptido que comprende un primer epítope del analito, y el análogo de ligando de la segunda especie reversible rédox es un péptido que comprende un segundo epítope del analito, y las parejas de fijación específica son anticuerpos primero y segundo, cada uno de los cuales reconoce epítopes respectivos primero y segundo del analito.

En una realización preferida de la invención, al menos uno de los marcadores reversibles rédox es un complejo de osmio. En otra realización, ambos marcadores reversibles rédox son complejos de osmio, teniendo cada uno una diferencia de potencial de oxidación de al menos 50, muy preferiblemente al menos 200 milivoltios. Ilustrativos de los complejos de osmio reversibles rédox para uso en esta invención son complejos de la fórmula

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en la cual

R y R_{1} son iguales o diferentes y son 2,2'-bipiridilo, 2,2'-bipiridilo disustituido en 4,4', 2,2'-bipiridilo disustituido en 5,5', 1,10-fenantrolinilo, 1,10-fenantrolinilo disustituido en 4,7, o 1,10-fenantrolinilo disustituido en 5,6, en donde cada sustituyente es un grupo metilo, etilo, o fenilo,

R y R_{1} están coordinados a Os a través de sus átomos de nitrógeno;

q es 1 ó 0;

R_{7} es B-(L)_{k}-Q(CH_{2})_{i}-;

R_{2} es hidrógeno, metilo, o etilo cuando q es 1, y R_{2} es B-(L)_{k}-Q(CH_{2})_{i}- cuando q es 0;

en donde en el grupo B-(L)_{k}-Q(CH_{2})_{i}-

Q es O, S, o NR_{4} en donde R_{4} es hidrógeno, metilo o etilo;

-L- es un enlazador bivalente;

k es 1 ó 0;

i es 1, 2, 3, 4, 5 ó 6; y

B es hidrógeno o un grupo que comprende un ligando susceptible de fijación a una pareja de fijación específica;

Z es cloro o bromo;

m es +1 o +2;

X es un anión mono- o bivalente, v.g., cloruro, bromuro, yoduro, fluoruro, tetrafluoroborato, perclorato, nitrato, sulfato, carbonato, o sulfito;

Y es un anión monovalente, v.g., cloruro, bromuro, yoduro, fluoruro, tetrafluoroborato, perclorato o nitrato; y

n es 1 o cero,

con la condición de que cuando X es un anión bivalente, n es cero,

y cuando m es 1, n es cero y X no es un anión bivalente.

Otro complejo de osmio reversible rédox para uso en el presente método es un compuesto de la fórmula

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en la cual

R y R_{1}son iguales o diferentes y son 2,2'-bipiridilo, 2,2'-bipiridilo disustituido en 4,4', 2,2'-bipiridilo disustituido en 5,5', 1,10-fenantrolinilo, 1,10-fenantrolinilo disustituido en 4,7, o 1,10-fenantrolinilo disustituido en 5,6, en donde cada sustituyente es un grupo metilo, etilo, o fenilo,

R_{5} es 2,2'-bipiridilo sustituido en posición 4, o 2,2'-bipiridilo disustituido en 4,4', en donde el sustituyente es el grupo B-(L)_{k}-Q(CH_{2})_{i}- y el sustituyente en 4' es un grupo metilo, etilo o fenilo;

R, R_{1} y R_{5} están coordinados a Os a través de sus átomos de nitrógeno;

Q es O, S, o NR_{4} en donde R_{4} es hidrógeno, metilo o etilo;

-L- es un enlazador bivalente;

k es 1 o cero;

i es 1, 2, 3, 4, 5 ó 6;

d es +2 o +3;

X e Y son aniones seleccionados de aniones monovalentes, v.g., cloruro, bromuro, yoduro, fluoruro, tetrafluoroborato, perclorato y nitrato y aniones bivalentes, v.g., sulfato, carbonato o sulfito en donde x e y son independientemente 0, 1, 2, o 3 de tal modo que la carga neta de X_{x}Y_{y} es -2 o -3.

Especies de conjugado reversibles rédox de cada una de las fórmulas anteriores se preparan a partir de los compuestos correspondientes en los cuales K es 0 y B es hidrógeno por reacción de tales compuestos con un reticulador heterofuncional de la fórmula S-L'-T en donde L' es un enlazador bivalente y S y T son grupos electrófilos diferentes capaces de reaccionar con un grupo nucleófilo para formar un enlace covalente, o con un reticulador homofuncional de la fórmula S-L'-T en donde L' es un enlazador bivalente y S y T son los mismos grupos electrófilos capaces de reaccionar con un grupo nucleófilo para formar un enlace covalente. Los productos resultantes se hacen reaccionar luego con análogos de ligando utilizando condiciones de reacción de acoplamiento clásicas para producir las especies de conjugado. Los potenciales de oxidación de los respectivos complejos de bis-(bipiridil)- y tris(bipiridil)-osmio definidos anteriormente son tales que los complejos respectivos pueden utilizarse como marcadores reversibles rédox para las especies reversibles rédox respectivas en la realización del método. La Fig. 8 ilustra un voltamograma cíclico para una muestra líquida que contiene cantidades equimolares (50 \muM) de un complejo de bis(bipiridil)-imidazolil-cloroosmio y un complejo de tris(bipiridil)-osmio.

En otra realización de la invención, se proporciona un dispositivo para detectar o cuantificar uno o más analitos en una muestra líquida. El dispositivo comprende

: al menos dos especies reversibles rédox, cada una de las cuales es susceptible de difusión en dicha muestra líquida al menos en presencia de un analito respectivo predeterminado, teniendo dichas especies reversibles rédox potenciales rédox respectivos que difieren en al menos 50 milivoltios,

: una estructura de electrodos para contacto con la muestra líquida en dicha cámara, incluyendo dicha estructura de electrodos un electrodo de referencia y electrodos de trabajo dimensionados para permitir el reciclado difusional de una especie reversible rédox difusible en una muestra líquida en contacto con la estructura de electrodos cuando se aplica un potencial catódico predeterminado dependiente de la especie reversible rédox a un electrodo de trabajo y se aplica un potencial anódico predeterminado dependiente de la especie reversible rédox a un segundo electrodo de trabajo, siendo dicho reciclado difusional de dicha especie suficiente para mantener una corriente medible a través de cada electrodo de trabajo, y

: conductores que comunican con los electrodos respectivos para aplicar dicho potencial anódico y dicho potencial catódico y para transportar la corriente conducida por los electrodos.

El dispositivo puede construirse utilizando procedimientos y métodos que han sido descritos previamente en la técnica para la construcción de biosensores que emplean métodos de detección electrométrica. Así, por ejemplo, el dispositivo puede incluir una cámara que tiene una abertura de recepción, y la cámara está dimensionada de tal manera que la misma se llena por flujo capilar cuando la muestra líquida se pone en contacto con la abertura de recepción de la muestra. La estructura del electrodo puede estar formada en una placa que define una pared de la cámara, de tal manera que la estructura del electrodo estará en contacto con una muestra líquida contenida en la cámara. Así, por ejemplo, el dispositivo puede construirse utilizando los procedimientos y diseños generales descritos en la Patente U.S. No. 5.141.868. Las características de la presente invención pueden incorporarse también en otros biosensores electroquímicos o tiras de ensayo, tales como los descritos en las Patentes U.S. Núms. 5.120.420; 5.437.999; 5.192.415; 5.264.103; y 5.575.895. El dispositivo puede construirse de modo que incluya las cantidades predeterminadas de la especie reversible rédox y las parejas de fijación específica. Por ejemplo, una mezcla de tales reactivos puede aplicarse como recubrimiento sobre una pared de la carga de muestra en dicho dispositivo durante la construcción del dispositivo, de tal manera que la muestra líquida se pone en contacto con la mezcla de reactivos a medida que se suministra a la cámara para contener la muestra. En una realización, el dispositivo se construye para cuantificar un primer analito y un segundo analito en una muestra líquida. El dispositivo comprende dos especies reversibles rédox, comprendiendo una primera especie reversible rédox un conjugado de un análogo de ligando del primer analito y comprendiendo una segunda especie reversible rédox un conjugado de un análogo de ligando del segundo analito, y una pareja de fijación específica para cada analito de tal manera que dichos conjugados de análogo del analito son capaces de fijarse competitivamente con su analito respectivo a una pareja de fijación específica.

En una realización de dispositivo de esta invención, el dispositivo comprende adicionalmente un bipotenciostato en comunicación eléctrica con los conductores para aplicar un potencial catódico dependiente de la especie reversible rédox a un electrodo de trabajo y un potencial anódico dependiente de la especie reversible rédox a un segundo electrodo de trabajo. El bipotenciostato puede estar programado para aplicar una secuencia de potenciales a los electrodos de trabajo respectivos. Más particularmente, el bipotenciostato puede estar programado para aplicar un primer potencial catódico a un primer electrodo de trabajo y un primer potencial anódico a un segundo electrodo de trabajo, correspondiendo dichos primeros potenciales anódico y catódico a los potenciales necesarios para establecer el flujo de corriente hacia la muestra debido al reciclado difusional de la primera especie reversible rédox. El bipotenciostato está programado también para aplicar un segundo potencial catódico a dicho primer electrodo de trabajo y un segundo potencial al segundo electrodo anódico, correspondiendo dichos segundos potenciales catódico y anódico a los potenciales necesarios para establecer el flujo de corriente a través de la muestra debido al reciclado difusional de la segunda especie reversible rédox. En una realización alternativa, el dispositivo incluye primera y segunda especies reversibles rédox, y al menos primera y segunda estructuras de electrodos para contacto con la muestra líquida en la cámara, comprendiendo cada una de dichas estructuras de electrodo un microconjunto de electrodos de trabajo, y medios para conmutar el bipotenciostato entre las estructuras de electrodos primera y segunda. En realizaciones preferidas del dispositivo, se proporcionan medios para medir el flujo de corriente a través de la muestra a cada uno de los potenciales primero y segundo, y preferiblemente guardar los valores de dichos flujos de corriente en un registrador acoplado a un microprocesador programado para calcular concentraciones de analito basadas en dichos valores.

En otra realización adicional de la presente invención, se proporciona un estuche para medir la concentración de uno o más analitos en una muestra líquida. El estuche comprende

: al menos dos especies reversibles rédox para contacto con la muestra líquida, siendo cada una susceptible de difusión en la muestra líquida al menos en presencia de un analito predeterminado, siendo al menos una de tales especies un conjugado de un análogo de ligando de un analito y un marcador reversible rédox, teniendo dichas especies reversibles rédox potenciales rédox respectivos que difieren al menos en 50 milivoltios;

: una pareja de fijación específica para cada analito;

: una estructura de electrodos para contacto con la muestra líquida, incluyendo dicha estructura de electrodos un electrodo de referencia y electrodos de trabajo dimensionados para permitir el reciclado difusional de la especie reversible rédox difusible en la muestra cuando se aplica un potencial catódico predeterminado dependiente de la especie reversible rédox a un electrodo de trabajo y se aplica un potencial anódico predeterminado dependiente de la especie reversible rédox al segundo electrodo de trabajo, siendo dichos medios de reciclado difusional de dicha especie suficientes para mantener una corriente medible a través de la muestra; y

: conductores que comunican con los electrodos respectivos para aplicación de dicho potencial anódico y dicho potencial catódico y para transporte de la corriente conducida por los electrodos.

En una realización, las especies reversibles rédox se mezclan como una nueva composición para contacto con la muestra líquida. En otra realización, cada una de las especies reversibles rédox y la pareja de fijación específica para cada analito se mezclan como una composición nueva para contacto con la muestra líquida. Preferiblemente, el marcador reversible rédox de al menos una de las especies reversibles rédox comprende un complejo de osmio.

Preparación de marcadores del mediador Os

Se ha demostrado que el mediador de Os bis(bipiridil)-imidazolil-cloroosmio es un mediador de electrones excelente para muchas enzimas óxido-reductasas (Patente U.S. No. 5.589.326). El mismo exhibe una cinética de mediación rápida (aproximadamente 500 veces más rápida que el ferricianuro con glucosa-oxidasa) y un potencial rédox relativamente bajo (+150 mV frente a Ag/AgCl). El mismo tiene también una tasa muy rápida de transferencia de electrones en la superficie del electrodo. Y lo que es más importante, los ligandos orgánicos en el mediador de Os pueden funcionalizarse de tal modo que el mismo puede enlazarse covalentemente a otras moléculas sin efectos perjudiciales sobre las propiedades rédox del centro Os. Estas propiedades singulares del mediador de Os hacen que el mismo sea un indicador electroquímico ideal para sensores basados en inmunoafinidad.

Se sintetizaron mediadores de Os con estos nuevos ligandos utilizando el mismo procedimiento utilizado para el mediador de Os libre. Su síntesis está constituida por dos pasos de proceso principales como se reseñan más adelante. Detalles de estos pasos de procesamiento se describen a continuación.

El primer paso del proceso implica la síntesis del compuesto intermedio de Os, cis-bis(2,2'-bipiridil)-dicloroosmio(II), a partir de una sal de osmio disponible comercialmente, utilizando el esquema siguiente. El producto intermedio se aísla por recristalización en un baño de hielo.

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El segundo paso de proceso implica la reacción entre el compuesto intermedio de Os y la histamina o ácido 4-imidazolacético (o una bipiridina sustituida para preparación de los complejos tris(bipiridilo)) a fin de producir mediadores de Os con el "asa" apropiada. El producto deseado se precipita luego de la solución por adición de tetrafluoroborato de amonio.

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Estos mediadores de Os pueden convertirse también fácilmente en la forma oxidada, es decir, Os(III) utilizando tetrafluoroborato de nitrosonio. Sin embargo, esto es innecesario, dado que el Os vuelve a la forma reducida en cualquier caso en condiciones alcalinas durante las reacciones de conjugación. Y no requiere forma oxidada de Os(III) para la detección en el biosensor.

A. Medida del mediador mixto simple

1.: Se producen microelectrodos interdigitados de conjunto (IDA) por medios fotolitográficos mediante métodos reconocidos en la técnica, (véase W 97/34140; EP 0299.780; D.G. Sanderson y L.B. Anderson, Analytical Chemistry 57 (1985), 2388; Koichi Aoki et al., J. Electroanalytical Chemistry, 256 91988), 269; y D. Niwa et al., J. Electroanalytical Chemistry, 167 (1989) 291. Otros medios que son estándar en procesamiento litográfico pueden utilizarse también para producir los patrones deseados de un conductor sobre un sustrato aislante.

2.: Se seleccionan mediadores reversibles a partir de los descritos en esta memoria y en las referencias citadas (véase Patente U.S. Núms. 4.945.045 y 5.589.325). Preferiblemente, se seleccionan dos mediadores diferentes con potenciales que difieren al menos en 100 mV, más preferiblemente al menos en 200 mV. Ejemplos de mediadores adecuados incluyen el Os(bipy)ImCl descrito en esta memoria y en la Patente U.S. No. 5.589.326 y ferroceno, descrito en la Patente U.S. No. 4.945.045 y EP 0142301. Se preparan mezclas de estos mediadores en solución acuosa, por ejemplo en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Pueden medirse convenientemente concentraciones comprendidas entre aproximadamente 1 \muM y 1000 \muM.

3.: Se conecta el IDA a un bipotenciostato, instrumento susceptible de controlar el potencial de dos electrodos separados. Se proporciona también un electrodo de referencia. Este electrodo no polarizable sirve como la referencia para los dos potenciales aplicados y puede servir también como el contraelectrodo. Puede utilizarse cualquier electrodo no polarizable, por ejemplo Ag/AgCl, tal como se puede obtener de ABI/Abtech. Puede utilizarse también un electrodo auxiliar para controlar el flujo de corriente a través de los electrodos de trabajo. Las mezclas se disponen en el electrodo IDA y el electrodo de referencia se pone también en contacto con la mezcla, o puede sumergirse en la mezcla el IDA junto con el electrodo de referencia.

4.: Para medir el Mediador 1 (Os(bipy)2ImCl). Se aplica un potencial catódico a una serie de dedos del IDA que es susceptible de reducir el mediador 1 (aprox. –50 mV frente a Ag/AgCl). Se aplica un potencial anódico a la otra serie de dedos del IDA que es susceptible de oxidar el mediador 1 pero no el mediador 2 (o cualesquiera otros mediadores) (aprox. 250 mV frente a Ag/AgCl). Después de un breve periodo de tiempo (milisegundos a segundos), podrá medirse una corriente de estado estacionario que depende únicamente de la concentración del mediador 1.

5.: Para medir el Mediador 2 (Ferroceno). Se aplica un potencial catódico a una serie de dedos del IDA que es susceptible de reducir el mediador 2 pero no el mediador 1 (aprox. 250 mV frente a Ag/AgCl). Se aplica un potencial anódico a la otra serie de dedos del IDA que es susceptible de oxidar el mediador 2 (aprox. 550 mV frente Ag/AgCl). Después de un breve periodo de tiempo (de milisegundos a segundos), podrá medirse una corriente de estado estacionario que depende únicamente de la concentración de mediador 2.

Ensayo de fijación específica con medida del mediador mixto. Ensayo específico de HbA1c en una muestra de sangre

1.: Se proporcionan electrodos IDA como en el párrafo A anterior.

2.: Se proporcionan conjugados de mediadores 1 y 2 y haptenos o miembros de fijación específica utilizando procedimientos reconocidos en la técnica para acoplamiento covalente utilizando un enlazador homo-funcional o hetero-funcional. Específicamente, un péptido sintético correspondiente a la secuencia N-terminal de la cadena \beta de HbA1c se conjuga al complejo de osmio. Análogamente, un péptido sintético correspondiente a la secuencia N-terminal de HbA0 se conjuga a un segundo mediador, por ejemplo ferroceno.

3.: Anticuerpos para los analitos (HbA1c y HbA0) que reaccionan específicamente con los péptidos N-terminales que se han incorporado en el conjugado se proporcionan por métodos estándar a fin de producir anticuerpos policlonales. En este caso, se inmunizaron ovejas con proteínas portadoras a las cuales se conjugaron las secuencias peptídicas sintéticas para HbA1c y HbA0. Después del protocolo de inmunización apropiado, se sangraron las ovejas, y el anticuerpo se aisló de la sangre por cromatografía de intercambio iónico, seguido por purificación con inmunosorbente en una columna del mismo péptido N-terminal con un enlazador diferente.

4.: La estequiometría apropiada de la reacción se determinó independientemente para las dos reacciones por métodos estándar para desarrollo de inmunoensayos. Una solución que contenía una cantidad fijada de conjugado marcado se mezcló con una solución que contenía cantidades variables de anticuerpo y, después de un periodo de incubación apropiado, la cantidad de conjugado libre restante se midió en el electrodo IDA utilizando el procedimiento arriba descrito. Se seleccionó la cantidad de anticuerpo exactamente suficiente para alcanzar el máximo de inhibición del conjugado (aprox. > 80%).

5.: Se preparó una solución de reactivos 1 que contenía una mezcla de los dos conjugados en las concentraciones apropiadas. Se preparó una solución de reactivos 2 que contenía una mezcla de los dos anticuerpos en las cantidades determinadas anteriormente. Una muestra de sangre se diluyó aprox. 20 veces en una solución de ácido cítrico 25 mM/0,5% Brij-35. Después de una incubación de 30 segundos para permitir la lisis y desnaturalización de la hemoglobina, se añadieron a 66 \mul de esta muestra diluida 33 \mul de tampón de fosfato 1M, a fin de ajustar el pH de nuevo a la neutralidad. Se añadieron 30 \mul de la solución de anticuerpos 2, y se dejó que la mezcla se incubara durante 30 s. A continuación se añadieron 30 \mul de la solución de conjugado 1, y la mezcla se midió en el electrodo IDA. La concentración de HbA1c en la muestra es proporcional a la corriente medida por el mediador 1, y la concentración de HbA0 es proporcional a la corriente del mediador 2. El valor % HbA1c en la muestra es proporcional a la relación de las cantidades medidas del mediador 1 y el mediador 2.

Aplicación al ensayo de HbA1c

La hemoglobina A1c es una glicohemoglobina específica en la cual la glicosilación tiene lugar en el terminal N de la cadena \beta de hemoglobina. El anticuerpo se fija específicamente a HbA1c teniendo una secuencia de epítope de Gluc-Val-His-Leu-Thr. Para facilitar la conjugación a otras moléculas, se ha añadido a la secuencia un aminoácido no nativo, v.g., Cys, Lys, o Lys-MH, a fin de producir péptidos A1c que incluyen: 1) Gluc-Val-His-Leu-Thr-Lys-MH; 2) Gluc-Val-His-Leu-Thr-Lys; 3) Gluc-Val-His-Leu-Thr-Cys.

El ensayo de HbA1c requiere medir a la vez la concentración de A1c y la concentración de hemoglobina total, y comunica los resultados como una relación de estas dos medidas (% HbA1c). Es ventajoso ensayar a la vez A1c y la hemoglobina total utilizando el mismo principio, dado que la determinación de la relación podría minimizar las desviaciones debidas a efectos ambientales. Así pues, se ha generado un anticuerpo para fijación específica a las hemoglobinas con término N no glicosilado, es decir, con una secuencia epitópica de Val-His-Leu-Thr. Análogamente, se añade un aminoácido no nativo a la secuencia para facilitar la conjugación. Los péptidos utilizados para medida de la hemoglobina total se conocen como péptidos A0. Péptidos A0 que se han utilizado en la preparación de conjugados mediador de Os-péptido incluyen Val-His-Leu-Thr-Cys y Val-His-Leu-Thr-Lys.

Química de la conjugación y conjugados

Existen muchos tipos de química de conjugación que se pueden emplear para enlazar el mediador de Os a un péptido. Las dos químicas de conjugación siguientes empleadas para la preparación de conjugados mediador de Os-péptido se han utilizado también comúnmente para preparar conjugados de proteínas: 1) formación de enlace amídico por un éster reactivo con amina primaria; 2) formación de enlace tioéter por maleimida con grupos sulfhidrilo. La fijación de amida se prefiere al enlace tioéter debido a que el enlace amídico es generalmente más estable. Sobre la base de la química de conjugación preferida, el ligando en el mediador de Os puede funcionalizarse con un grupo de amina primaria o un grupo de ácido carboxílico. La localización óptima para estos grupos funcionales se cree que está constituida por las posiciones C-4 o C-5 en el ligando de imidazol del mediador de Os; sin embargo, puede llevarse a cabo también la funcionalización a través del átomo de nitrógeno del anillo de imidazol no complejado con Os. Se sintetizaron dos mediadores de Os funcionalizados diferentes como se ha descrito arriba.

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El mediador de Os (a) se formó con histamina, mientras que el mediador de Os (b) se formó con ácido imidazolacético. Sin embargo, se encontró que el nitrógeno imínico del anillo de imidazol interfiere con la activación del grupo ácido carboxílico al éster reactivo (es decir, éster de N-hidroxisuccinimida) utilizando carbodiimida. Así pues, el uso del mediador de Os funcionalizado con ácido carboxílico en la síntesis de los conjugados mediador de Os-péptido daba resultados mucho menos favorables.

El grupo amina en el ligando de histamina del mediador os reacciona fácilmente con el éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) para formar un enlace amida. Se han empleado dos tipos de reticuladores para enlazar el mediador OS a péptidos, (a) reticulador heterofuncional, que tiene un éster de NHS en un extremo y el otro extremo tiene un grupo maleimida o un grupo sulfhidrilo; y (b) reticulador homofuncional, v.g. ambos extremos tienen ésteres de NHS.

En el caso del reticulador heterofuncional, el reticulador se hace reaccionar primeramente con un mediador oxo con ligando de histamina (Os-histamina) a una relación molar 1:1. Un extremo particular precisa ser indicado aquí. El mediador de Os en forma oxidada, es decir, Os(III), puede oxidar instantáneamente el grupo sulfhidrilo para formar el enlace disulfuro. Es importante mantener el centro Os en la forma reducida por adición de una pequeña cantidad de reductor tal como ditionito de sodio durante los procesos de conjugación. El proceso de la reacción puede observarse por HPLC analítica en fase inversa en una columna C18. A continuación, se aísla el aducto mediador de Os-reticulador por HPLC preparativa y la fracción recogida se liofiliza seguidamente. Por último, el aducto mediador de Os-reticulador se hace reaccionar con el péptido apropiado para formar un conjugado mediador de Os- péptido. De nuevo, el producto se aísla por recogida de la fracción apropiada en HPLC preparativa, y la fracción recogida se liofiliza seguidamente.

Se han utilizado dos reticuladores heterofuncionales diferentes para la síntesis de conjugados mediador de Os-péptido. Se utiliza SMCC (4-[N-maleimidometil]ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidilo) para el péptido que contiene cisteína, mientras que se utiliza SATA (S-acetiltioacetato de N-succinimidilo) para el péptido que contiene maleimida. Se han preparado tres conjugados mediador de Os-péptido (dos con el péptido A1c y uno con el péptido A0) utilizando reticuladores heterofuncionales, y sus estructuras se muestran a continuación: (a) Os-SMMC-Alc; (b) Os-SATA-Alc, y (c) Os-SATA-A0.

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Sin embargo, se ha encontrado que estos conjugados no eran estables cuando se guardaron en forma de soluciones. Los resultados de la HPLC analítica indicaban que estos conjugados se degradan. La espectroscopia de masas confirmó que la inestabilidad es debida a la disociación del enlace tioéter presente en estos conjugados.

Con objeto de evitar el enlace tioéter en el conjugado, se utilizó un reticulador homofuncional que contenía dos ésteres de NHS en su lugar para preparar los conjugados. El reticulador utilizado fue DSG (glutarato de disuccinimidilo). Con objeto de evitar la formación del mediador de Os reticulado, es decir, Os-reticulador-Os-, se utilizó un gran exceso de reticulador homofuncional en la reacción con Os-histamina en una relación molar 4:1. En estas condiciones, únicamente se formaba el producto deseado, es decir, Os-reticulador. Se preparó análogamente el conjugado Os-DSG-Alc utilizando el procedimiento descrito anteriormente.

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La preparación del conjugado análogo Os-DSG-A_{o} requiere un paso adicional, dado que la amina N-terminal no glicosilada del péptido HbA_{o} es también reactiva frente al éster de NHS. En este caso, la amina N-terminal del péptido HbA_{o} se protege primeramente por medio de un grupo Fmoc^{1} lábil en medio básico o un grupo Boc^{2} lábil en medio ácido. Después de la reacción con el aducto Os-DSG para formar el conjugado Os-DSG-A_{o}, el grupo protector se escinde luego utilizando un método de desprotección apropiado (adición de base para Fmoc o adición de ácido para Boc). Los péptidos preparados por síntesis de péptidos en fase sólida tienen ya grupos protectores Fmoc en el terminal N. Los grupos protectores se separan usualmente antes de la escisión del péptido de las bolitas de resina, pero pueden dejarse también en su lugar si se desea. El péptido HbA_{o} de Zymed tiene un grupo protector Fmoc intacto en el término N. Utilizando esta estrategia se sintetizó con éxito el conjugado Os-DSG-A_{o}.

Muchos analitos no pueden ser ensayados utilizando sensores basados en enzimas. Aquéllos requieren el desarrollo de biosensores de afinidad o inmunosensores que están basados en la fijación selectiva de los antígenos a los anticuerpos. La clave para la detección de este suceso de fijación en sensores electroquímicos es la inclusión de antígenos marcados con marcadores rédox. El bis(2,2'-bipiridil) imidazolil-cloroosmio, conocido también como mediador de Os, posee muchas propiedades que lo convierten en un marcador rédox excelente para este propósito. Adicionalmente, puede añadirse un "asa" para enlazar el mismo covalentemente a antígenos sin afectar a sus propiedades rédox.

Pueden utilizarse varios esquemas de ensayo en biosensores de afinidad que incluyen, i) ensayo de fijación competitiva (el antígeno marcado compite por un número limitado de sitios de fijación); ii) ensayos de fijación secuencial (el antígeno marcado está combinado con un exceso de sitios de fijación); iii) ensayo heterogéneo (utiliza un paso de separación para separar los antígenos marcados fijados y libres); y iv) ensayo homogéneo (sin paso de separación). Los pasos implicados en un ensayo de fijación secuencial homogéneo incluyen fijación del analito a un anticuerpo. El antígeno marcado (análogo de analito) se fija a los sitios de fijación restantes en el anticuerpo. Finalmente, el antígeno marcado sobrante libre se detecta en la superficie del electrodo. La corriente resultante será función de la cantidad de analito presente.

La detección de antígenos marcados libres puede realizarse utilizando métodos de detección directa o de detección amplificada. La detección directa requiere el uso de técnicas electroquímicas avanzadas tales como voltametría ac, voltametría de pulsos diferencial, voltametría de onda cuadrada o impedancia ac con objeto de alcanzar una sensibilidad de 5 \muM o menos. Métodos de detección amplificados utilizan amperometría dc con amplificación a través de la reacción con enzima o reductores químicos o por el uso de microelectrodos de conjunto interdigital (IDA). El método de detección preferido es la amperometría amplificada, por sometimiento a ciclos del marcador de mediador de Os libre utilizando microelectrodos IDA de acuerdo con esta invención.

Método de HPLC analítica general para conjugados de osmio

Todos los análisis HPLC se realizaron utilizando un conjunto Beckman System Gold HPLC que se compone de un módulo de bomba 126 y un módulo detector de conjunto de 168 diodos. La fase estacionaria es una columna analítica C18 Vydac de fase inversa. Otros parámetros se enumeran más adelante.

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Síntesis de bis(2,2'-bipiridil)-dicloroosmio

1.: Se carga un matraz de fondo redondo y 1 litro de capacidad con 19,335 gramos de K_{2}OsCl_{6} (0,04019 moles) y 13,295 gramos de 2,2'-bipiridilo (0,08512 moles). Se añaden 400 ml de DMF para disolver todas las sustancias reaccionantes.

2.: Se calienta la solución a reflujo y se mantiene luego el reflujo durante 1 hora. Después de ello se desconecta la fuente de calor y se deja enfriar la solución a 30-40ºC en las condiciones del ambiente.

3.: Se filtra la mezcla de reacción utilizando un filtro de frita de vidrio de grado medio. Se enjuaga el matraz con 20 ml adicionales de DMF y se lava el filtro.

4.: Se transfiere el filtrado a un vaso de precipitados de 3 l. Se carga otro vaso de precipitados de 2 l con 22,799 gramos de NaS_{2}O_{4} y se disuelve en 2 litros de agua desionizada. Se añade esta solución al vaso de precipitados que contiene el filtrado Os/DMF gota a gota utilizando un embudo de goteo. Se mantiene la solución en agitación durante todo el tiempo.

5.: Se enfría luego la mezcla en un baño de hielo durante al menos 3 horas. Se añade hielo en caso necesario.

6.: Se filtra la mezcla "fría" utilizando un filtro de cerámica con papel de filtro. Se lava el contenido del filtro con 50 ml de agua dos veces y 50 ml de éter dos veces.

7.: Se seca el producto a alto vacío a 50ºC durante una noche (al menos 15 horas). Se pesa el producto y se transfiere a un frasco de color pardo. Se guarda en un desecador a la temperatura ambiente.

Rendimiento típico = 16 gramos o 70%.

El producto se analiza por espectroscopia UV-visible y análisis elemental.

UV-Vis

\lambda Pico (nm)	E (M^{-1}cm^{-1})
382	10.745
465	9.914
558	4.560
836	3.873

EA

	C %	H %	N %	Cl %	Os %	H_{2}O %
Teórico	41,89	2,81	9,77	12,36	33,17	0
Real	40,74	2,92	9,87	11,91		0,41

Síntesis de Bis(2,2'-bipiridil)-histamina-cloroosmio

1.: Se carga un matraz de 2 l con una sola boca y fondo redondo con 11,3959 gramos de Os(bpy)_{2}Cl_{2} (0,0198 moles) y 4,9836 gramos de histamina (0,0448 moles). Se añaden 500 ml de etanol para disolver las sustancias reaccionantes. Se añaden luego 250 ml de agua desionizada.

2.: Se calienta la solución a reflujo y se mantiene el reflujo durante 6 horas. Se deja enfriar la solución a la temperatura ambiente.

3.: Se separa totalmente el etanol utilizando evaporación rotativa. Se transfiere luego la solución a un vaso de precipitados de 500 ml. Se disuelven 2,136 gramos de NH_{4}BF_{4} en 20 ml de agua. Se añade gota a gota a la solución de Os. Se forma un precipitado. Se enfría en un baño de hielo durante 30 min. Se filtra la mezcla utilizando un filtro de cerámica con papel de filtro. Se lava el contenido en el filtro con 20 ml de agua dos veces.

4.: Se seca a alto vacío a 50ºC durante una noche (al menos 15 horas).

5.: Se pesa el producto y se transfiere a un frasco de color pardo. Se guarda en un desecador a la temperatura ambiente.

Rendimiento típico = 7,6 gramos o 52%.

El producto se realiza por espectroscopia UV-visible y HPLC.

UV-Vis

\lambda pico (nm)	\varepsilon (M^{-1}cm^{-1})
355	7.538
424	7.334
514	7.334
722	2.775

HPLC

Tiempo de elución: 18,0 min

Pureza por HPLC, intervalo de 65-85%.

Preparación del aducto [Os(bpy)_{2}(histamina)Cl]-reticulador heterofuncional

1.: Se pesan 0,1167 g de [Os(bpy)_{2}(histamina)Cl]BF_{4} (0,162 mmol) y se transfiere a un Reacti-Vial de 5 ml. Se añade 1,0 ml de dimetilformamida para disolver la sustancia reaccionante. Se añaden 25 ml de trietilamina.

2.: Se añaden 0,0508 g de SMCC (0,150 mmol) o 0,0390 g de SATA (0,168 mmol). Se agitan las sustancias reaccionantes a la temperatura ambiente durante 2 horas. Se inyecta la muestra en HPLC para observar el progreso de la reacción.

3.: Si la reacción es completa, se diluye la solución con tampón de TFA al 0,1% hasta un volumen final de 4,5 ml. Se inyecta en HPLC preparativa y se recoge el pico de producto.

4.: Se liofiliza la fracción recogida durante una noche.

5.: Se pesa el producto y se transfiere a un frasco de color pardo. Se guarda en una bolsa desecada a -20ºC.

Rendimiento típico: 40 mg, o 25%.

El producto se analiza por HPLC y ES/MS.

	HPLC	ES/MS
Os-SMCC	Tiempo de elución = 32,1 min	\hskip0,8cm m^{+}/e = 434,2
Os-SATA	Tiempo de elución = 27,5 min	\hskip0,8cm m^{+}/e = 382,8

Preparación del aducto [Os(bpy)_{2}(histamina)C1]-homofuncional reticulador aducto

1.: Se pesan 0,2042 g de DSG (0,626 mmol)) y se transfiere a un Reacti-Vial de 5 ml. Se añaden 0,75 ml de DMF para disolver la sustancia reaccionante.

2.: Se pesan 0,1023 g de [Os(bpy)_{2}(histamina)Cl]BF_{4} (0,142 mmol) y se transfiere a un Reacti-Vial de 5 ml separado. Se añaden 1,0 ml de DMF para disolver la sustancia reaccionante. Se añaden 25 \mul de tri-etilamina. Se añade luego solución de Os-DMF gota a gota a la solución de DSG/DW con agitación constante. Después de hacer reaccionar durante 2 horas a la temperatura ambiente, se inyecta una muestra en HPLC para observar el progreso de la reacción.

3.: Si la reacción es completa, se diluye la solución con 0,1% de tampón TFA hasta un volumen final de 4,5 ml. Se inyecta en HPLC preparativa y se recoge el pico de producto.

4.: Se liofiliza la fracción recogida durante una noche.

5.: Se pesa el producto y se transfiere a un frasco de color pardo. Se guarda en una bolsa desecadora a -20ºC.

Rendimiento típico = 45 mg, 0 35%.

El producto se analiza por HPLC y ES/MS

	HPLC	ES/MS
Os-DSG	Tiempo de elución = 27,1 min	\hskip1,9cm m^{+}/e = 429,2 y 859,6

Preparación del conjugado Os-SATA-Alc

1.: Se pesan 40,5 mg de Os-SATA (0,0529 mmol) y se transfiere a un Reacti-Vial de 5 ml con barra de agitación. Se añaden 1,0 ml de PBS (pH 7,5) para favorecer la disolución. Se añaden 20 mg de Na_{2}SO_{2}O_{4} con objeto de mantener Os en forma reducida.

2.: Se añaden 1,0 ml de tampón de desacetilación (PBS, pH 7,5 + hidroxilamina 0,5 M y EDTA 25 mM) para desproteger el grupo sulfhidrilo. Se inyecta una muestra en HPLC analítica para determinar si la desprotección es completa por aparición de un nuevo pico a 25,8 min.

3.: Se añaden 45 mg de péptido HbA1c-MH (0,0474 mmol) y se deja reaccionar a TA durante 1 hora. Se inyecta una muestra en HPLC analítica para observar el progreso de la reacción.

4.: Si la reacción es completa, se diluye la mezcla con tampón de TFA al 0,1% hasta un volumen final de 4,5 ml. Se inyecta en HPLC preparativa para recoger el pico de producto.

5.: Se liofiliza la fracción recogida durante una noche (al menos 15 horas).

6.: Se pesa el producto y se transfiere a un frasco de color pardo. Se guarda en una bolsa desecada a -20ºC.

Rendimiento típico = 12 mg

El producto se analiza por HPLC y ES/MS.

	HPLC	ES/MS
Os-SATA-Alc	Tiempo de elución = 27,6 min	\hskip1,9cm m^{+}/e= 559,1 y 838,5

Preparación del conjugado Os-SMCC-Alc

1.: Se pesan 39,0 mg de Os-SMCC (0,0452 mmol) y se transfiere a un Reacti-Vial de 5 ml con barra de agitación. Se añaden 1,0 ml de PBS (pH 6,0) para favorecer la disolución.

2.: Se añaden 30,0 mg de péptido Hblc-Cys (0,0450 mmol). Se deja transcurrir la reacción a TA durante 2 horas. Se inyecta una muestra en HPLC analítica para observar el progreso de la reacción.

3.: Si la reacción es completa, se diluye la mezcla con tampón de TFA al 0,1% hasta un volumen final de 4,5 ml. Se inyecta en HPLC preparativa para recoger el pico de producto.

4.: Se liofiliza la fracción recogida durante una noche (al menos 15 horas).

Rendimiento típico = 12 mg

El producto se analiza por HPLC y ES/MS.

	HPLC	ES/MS
Os-SMCC-Alc	Tiempo de elución = 97,6 min	\hskip1,9cm m^{+}/e = 480,5 y 534,4

Preparación del conjugado Os-SMCC-Ao

1.: Se pesan 37,0 mg de Os-SMCC (0,0426 mmol) y se transfiere a un Reacti-Vial de 5 ml con barra de agitación. Se añaden 1,0 ml de PBS (pH 6,0) para favorecer la disolución.

2.: Se añaden 24,3 mg de péptido HbAo-Cys (0,0425 mmol). Se deja transcurrir la reacción a TA durante 2 horas. Se inyecta una muestra en HPLC analítica para observar el progreso de la reacción.

3.: Si la reacción es completa, se diluye la mezcla con tampón de TFA al 0,1% hasta un volumen final de 4,5 ml. Se inyecta en HPLC preparativa y se recoge el pico de producto.

Rendimiento típico = 15 mg

El producto se analiza por HPLC y ES/MS.

	HPLC	ES/MS
Os-SMCC-A_{o}	Tiempo de elución = 27,9 min	\hskip1,9cm m^{+}/e = 360,7 y 720,5

Preparación del conjugado Os-DSG-Alc

1.: Se pesan 32,0 mg de Os-DSG (0,037 mmol) y se transfiere a un Reacti-Vial de 5 ml con barra de agitación. Se añaden 0,75 ml de DMF para favorecer la disolución. Se añaden 25 \mul de trietilamina.

2.: Se añaden 26,5 mg de péptido HbA1c-Lys (0,0349 mmol). Se deja transcurrir la reacción a TA durante 2 horas. Se inyecta la muestra en BPLC analítica para observar el progreso de la reacción.

3.: Si la reacción es completa, se diluye la mezcla con tampón TFA al 0,1% hasta un volumen final de 4,5 ml. Se inyecta en HPLC preparativa y se recoge el pico de producto.

Rendimiento típico = 16 mg

El producto se analiza por HPLC y ES/MS.

	HPLC	ES/MS
Os-DSG-Alc	Tiempo de elución = 23,5 min	\hskip1,9cm m^{+}/e = 501,8 y 752,8

Preparación del conjugado Os-DSG-Ao

1.: Se pesan 52,0 mg de Os-DSG (0,0605 mmol) y se transfieren a un Reacti-Vial de 5 ml con barra de agitación. Se añaden 1,0 ml de DMF para favorecer la disolución. Se añaden 25 \mul de trietilamina.

2.: Se añaden 49,1 mg de péptido Fmoc-HbA_{o} (0,0606 mmol). Se deja transcurrir la reacción a TA durante 2 horas. Se inyecta una muestra en HPLC analítica para observar el progreso de la reacción por la aparición de un pico a 40,3 min para Os-DSG-A_{o} (Fmoc).

3.: Si la reacción es completa, se inyectan 100 \mul adicionales de trietilamina. Al cabo de 1 hora, se inyecta la muestra en HPLC analítica para determinar si todo el grupo de protección Fmoc se ha eliminado por desaparición del pico a 40,3 min.

4.: Si la eliminación de Fmoc es completa, se diluye la mezcla con tampón TFA al 0,1% hasta un volumen final de 4,5 ml. Se inyecta en HPLC preparativa para recoger el pico de producto.

Rendimiento típico = 16 mg.

El producto se analiza por HPLC y ES/MS.

	HPLC	ES/MS
Os-DSG-A_{o}	Tiempo de elución = 23,2 min	\hskip1,9cm m^{+}/e = 447,4 y 670,3

Síntesis de bis-(4,4'-dimetil-2,2'-bipiridil)-4-metil-4'-carboxilpropil-2,2'-bipiridil-osmio [Os(dm-bpy)2-(mcp-bpy)]Cl2

Se hizo reaccionar potasio-hexacloroosmio con 4,4'-dimetil-2,2'-bipiridilo en una relación molar de 1:2 por calentamiento a reflujo en DMF. El precipitado de cloruro de potasio se filtró y el complejo dimetil-bipiridil-dicloroosmio se redujo desde el estado de oxidación +3 hasta el estado de oxidación +2 utilizando un exceso de ditionito de sodio. El producto se recristalizó en mezcla DMF/agua a 0ºC y se recuperó por filtración.

Se hizo reaccionar 4,4'-dimetil-2,2'-bipiridildicloroosmio con 4-metil-4'-carboxilpropil-2,2'-bipiridilo por calentamiento a reflujo en etilenglicol. El disolvente se eliminó por evaporación rotativa. El producto se disolvió en DMF y se precipitó en etil-éter. El producto se secó en una estufa de vacío durante una noche.

Reactivos analíticos: el producto y el producto intermedio se analizaron por HPLC y espectroscopia de masas en cuanto a pureza e identidad del compuesto.

Os(dm-bpy)2Cl2: PM teórico = 629,6, MS mostró 8 picos isotópicos con el pico más abundante a 630. Tiempo de elución HPLC a 29,94 min, con una pureza de 90%+.

Os(dm-bpy)2(mcp-bpy): MS confirmó el PM a 814,5 y HPLC exhibió una pureza mayor que 85%.

Síntesis del conjugado complejo biotin-Os, Biotin-Os(dm-bpy)2(mcp-bpy)]Cl2

El grupo carboxilo se activó por reacción del complejo de Os anterior con diciclohexilcarbodiimida en presencia de N-hidroxisuccinimida. El complejo Os éster activo se aisló utilizando un método de HPLC preparativa y se hizo reaccionar luego con biotina que contenía amina para formar el conjugado final.

Experimento para medir independientemente la concentración de dos especies de conjugado electroactivo

Se preparó Os(bipy)HisCl-DSG-HbA1c como se ha descrito arriba.

Se preparó ferroceno-AMCHA-DADOO-biotina a partir de ácido ferroceno-monocarboxílico, el reticulador ácido aminometilciclohexílico, el extendedor de cadena 1,8-diamino-3,6-DiOxoOctano y biotina como se describe en otro lugar.

Se prepararon mezclas de los dos conjugados para evaluar la capacidad del método de la invención para medir independientemente la concentración de los conjugados, y hacer correcciones por las variaciones en las cantidades de reactivos, la respuesta de los electrodos, y las condiciones ambientales.

Parte 1

Respuesta del conjugado mixto simple

Se preparó la matriz de soluciones siguiente en tampón de fosfato 10 mM con NaCl 150 mM y 0,5% de Brij-35, un agente tensioactivo no iónico.

Os-DSG-HbA1c	Ferroceno-biotina	Os-DSG-HbA1c	Ferroceno-biotina
uM/l	uM/l	uM/l	uM/l
0	0	0	12,5
6,25	0	6,25	12,5
12,5	0	12,5	12,5
25	0	25	12,5

Os-DSG-HbA1c	Ferroceno-biotina	Os-DSG-HbA1c	Ferroceno-biotina
uM/l	uM/l	uM/l	uM/l
0	25	0	50
6,25	25	6,25	50
12,5	25	12,5	50
25	25	25	50

Se fabricó un microelectrodo interdigitado de conjunto (IDA) de acuerdo con los procedimientos descritos. Además del IDA, el chip tenía un electrodo plata/cloruro de plata en la superficie para funcionar como el electro de referencia y contra-electrodo. Este electrodo se produjo con el mismo proceso litográfico, y se recubrió luego por electrochapado con plata y cloruro de plata de acuerdo con técnicas estándar. El IDA se conectó a un bipotenciostato susceptible de controlar el potencial con relación a la referencia y medir la corriente en cada uno de los electrodos del IDA. Se pusieron partes alícuotas de las soluciones en la superficie del chip, de tal modo que se cubrieran el IDA y los electrodos de referencia.

Las medidas se realizaron aplicando primeramente -100 mV (frente a Ag/AgCl) a un electrodo del IDA, y 200 mV al otro electrodo durante un periodo de 30 segundos. En este momento, se midió la corriente en cada electrodo. Se aplicaron luego a un electrodo 200 mV, y 550 mV al otro. Después de 30 segundos, se midió de nuevo la corriente. Véase la Figura 9 para un sumario de los resultados, que demuestran claramente que las concentraciones de los dos mediadores pueden medirse independientemente con este método.

Parte 2

Co-varianza de la concentración de mediadores duales en electrodos IDA

En este experimento, se demostró que por preparación de una mezcla de concentraciones conocidas de dos mediadores diferentes, y medida de diferentes diluciones de dicha mezcla por el método de la invención, la relación de las concentraciones de los mediadores se mantiene constante. (Aplicación de patrón interno).

Se utilizaron los mismos dos conjugados de mediador que en la Parte 1. (Os-DSG-Alc y Fc-Bi)

A partir de una solución que contenía 40 \muM de cada conjugado, se prepararon soluciones que contenían 27 \muM, 32 \muM, y 36 \muM de cada conjugado en el mismo tampón (PBS/Brij).

Las soluciones se midieron como en el ejemplo previo. Cada solución se midió en 5 electrodos IDA diferentes. Los resultados se presentan como los valores medios, las desviaciones estándar, y el coeficiente de variación para cada solución por separado, y para todas las soluciones agrupadas en todos los electrodos.

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Este ejemplo demuestra claramente que el efecto de patrón interno de la medida de dos conjugados o mediadores y el cálculo de la relación proporciona una precisión de medida significativamente mejorada, no sólo dentro de cada solución (compensación por la variación entre electrodos) sino a lo largo de todas las soluciones (compensación por la variación en la dilución o cantidad de muestra).

Parte 3

Compensación de temperatura

Se deseaba demostrar la eficacia del método en la compensación por las influencias ambientales tales como la variación de temperatura sobre la exactitud de la medida.

Se prepararon los mismos dos conjugados en solución a 40 \muM como anteriormente. Se midieron los mismos como anteriormente en electrodos IDA, a la temperatura ambiente o después de calentamiento a 35-40ºC sobre una placa metálica calentada antes de la medida. Las soluciones se calentaron también a 37ºC antes de la aplicación a los electrodos.

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	Temperatura Ambiente	Calentada (35-40)C	Relación de respuesta
	(23C)		caliente/TA
Os-DSG-Alc	261	387	1,45
Fc-Bi	179	268	1,5
Relación Os/Fc	1,46	1,44	0,99

Como se demuestra por los resultados, los valores medios aumentan casi en un 50% en el caso de las muestras calentadas, lo cual podría conducir a un gran error de medida. Sin embargo, el uso del patrón interno y el cálculo de la relación elimina eficazmente la dependencia del resultado con respecto a la temperatura.

Detección por inmunoensayo de HbA1c con conjugados de mediador de osmio

La meta de toda la terapia diabética es mantener un nivel aproximadamente normal de glucosa en la sangre. Estuches domésticos de glucosa en sangre están disponibles para observar los valores de glucosa actuales y son valiosos para diabéticos con objeto de ajustar las dosis de insulina día a día y los hábitos de alimentación. Lamentablemente, dado que los resultados miden solamente un resultado instantáneo, no informa a los interesados sobre la eficacia global de sus acciones en el mantenimiento del control de la glucemia. La medida de la hemoglobina glicosilada está siendo aceptada actualmente de modo generalizado como índice de las concentraciones medias de glucosa en sangre a lo largo de las 6-8 semanas precedentes y proporciona por consiguiente una medida de la eficacia de la terapia total de un diabético durante periodos de control estable. Dado que la observación de la hemoglobina glicosilada de un diabético puede conducir a un control mejorado de la glucemia, la ADA recomienda medidas de rutina de cuatro veces al año hasta una vez al mes para los diabéticos de tipo I menos estables.

Están disponibles varias tecnologías para la medida de la hemoglobina glicosilada. Dichas tecnologías incluyen inmunoensayos para HbA1c (TinaQuant, DMC; DCA2000, Ames; y Unimate, Roche), cambio de iones (Variant, BioRad; Eagle Diagnostics), y cromatografía de afinidad (Column Mate, Helena; GlyHb, Pierce).

Un objetivo de este proyecto es desarrollar una tira desechable de utilización sencilla para detección electroquímica de HbA1c para uso tanto en consultas médicas como en el propio domicilio.

El parámetro más importante para evaluar la condición del paciente es la relación de HbA1c a HbA_{o}, y por consiguiente se requiere la medida de ambos valores, glicosilado (AbAlc) y no glicosilado (HbA_{o}) para calcular la relación. Esta requiere dos medidas separadas. Es preferible utilizar la misma tecnología para medir ambas fracciones, glicosilada y no glicosilada, eliminando así algunas interferencias de la muestra y ambientales. La medida de HbA1c por inmunoensayo electroquímico se describe a continuación. Las medidas electroquímicas de HbA_{o} por inmunoensayo se realizan utilizando los mismos métodos que para HbA1c. Las concentraciones de HbA_{o} son significativamente mayores. Una alternativa a las medidas de A_{O} utilizando inmunoafinidad sería medir la hemoglobina total directamente utilizando biamperometría o voltametría diferencial de pulsos. Esto puede realizarse fácilmente dado que la hemoglobina es oxidada rápidamente por [Os(bpy)_{2}(im)Cl]^{2+}Cl_{2}.

La valina N-terminal de la cadena \beta de la hemoglobina A es el sitio de glicosilación en HbA1c, y sirve como sitio de reconocimiento para el anticuerpo. En sangre entera, la valina N-terminal no está accesible para que se fije el anticuerpo. El acceso se consigue por lisado de los glóbulos rojos a fin de liberar la hemoglobina seguido por un cambio de conformación (desnaturalización o desenredado) para exponer adecuadamente el epítope HbA1c. La dilución de la muestra puede ocurrir como parte del proceso de lisado/desnaturalización o puede requerirse después de la desnaturalización para preparar la muestra para el anticuerpo (ajuste del pH, otros) o llevar la muestra a un intervalo adecuado para el inmunoensayo electroquímico. En una realización, una cantidad fijada de anticuerpo se incuba con la muestra preparada y se fija a los epítopes HbA1c de la muestra. El anticuerpo libre y la muestra de anticuerpo fijado se combinan luego con el conjugado de péptido de osmio (Alc o A_{o}) para permitir que el anticuerpo sin fijar remanente se fije a la etiqueta del mediador. Cuando el mediador se fija al anticuerpo (una macromolécula), el mismo no puede difundirse libremente para interaccionar con el electrodo, y por consiguiente las corrientes generadas se reducen significativamente. El marcador del mediador sin fijar remanente es por consiguiente proporcional a la concentración de HbA1c en la muestra. El mediador no fijado puede medirse electroquímicamente, utilizando de modo preferible un electrodo interdigitado de conjunto con control bipotenciostático.

La lisis de la sangre es necesaria para liberar la hemoglobina seguido por desnaturalización para exponer el epítope HbA1c. La lisis puede realizarse fácilmente mediante agentes tensioactivos, efectos osmóticos de dilución con agua, y directamente por medio de muchos desnaturalizantes. Se ha demostrado que la sangre lisada por un ciclo congelación/descongelación no interfiere significativamente con la medida biamperométrica (la "tasa abierta" con y sin sangre lisada era prácticamente idéntica). Inversamente, la desnaturalización de la sangre lisada con una diversidad de desnaturalizantes conocidos para exponer el epítope HbA1c ha demostrado una supresión significativa de la respuesta electroquímica, inhibiendo la medida de una respuesta a la dosis de HbA1c. Únicamente LiSCN y ácido cítrico, de la lista de desnaturalizantes evaluados que se muestra en la Tabla 1, era capaz de exponer el epítope A1c y minimizar el ensuciamiento por proteínas lo suficiente para medir una respuesta de HbA1c a la dosis.

La desnaturalización de la muestra para reconocimiento de anticuerpos sin ensuciamiento severo de la superficie de los electrodos es importante para el desarrollo con éxito de un inmunoensayo de HbA1c. Aunque se ha utilizado casi exclusivamente LiSCN para mostrar la factibilidad, el mismo tiene muchas limitaciones, que impedirían su uso desechable. El ácido cítrico, que es sólido a TA, puede ofrecer ventajas como desnaturalizador si pudiera secarse sobre una tira seguido por un diluyente para ajustar el pH a la neutralidad. La desnaturalización de la sangre con ácidos o bases seguida por un ajuste final del pH con un diluyente tamponado es un área que merece evaluación ulterior. Un problema que se encontró inicialmente fue la precipitación al ajustar el pH de nuevo a la neutralidad, lo que puede resolverse utilizando un tampón diferente o con adición de agentes tensioactivos.

TABLA 1

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TABLA 2

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El ensuciamiento de los electrodos causado por las proteínas de la sangre desnaturalizada que se adsorben a la superficie de los electrodos puede impedir la transferencia de electrones y reducir por consiguiente la sensibilidad de los electrodos. El ensuciamiento o pasivación de los electrodos ocurre más o menos inmediatamente después del contacto de la muestra con la superficie, minimizando así la severidad de la desnaturalización en la muestra que debería ser el primer enfoque. Las condiciones de la superficie que son hidrófobas favorecerán la adhesión de las proteínas y por consiguiente el ensuciamiento puede minimizarse con superficies de electrodo que tengan energías superficiales mayores. Esto explica por qué los electrodos de oro exhiben menos ensuciamiento con sangre desnaturalizada que los de paladio. La reducción del ensuciamiento por las proteínas puede conseguirse cambiando o protegiendo la superficie del electrodo. Las modificaciones que hacen la superficie más hidrófila deberían reducir el grado de ensuciamiento y ello puede realizarse por tratamiento en plasma de argón u oxígeno, o tratamiento corona. Recubrimientos selectivos que podrían bloquear el alcance de la superficie de los electrodos por las proteínas pueden soslayar usualmente en parte el problema y han sido utilizados en el campo para reducir el ensuciamiento. Lamentablemente, con su utilización se observan normalmente disminuciones espectaculares en las respuestas mayores que las observadas con las proteínas de la sangre desnaturalizada. Recubrimientos hidrófilos tales como PEO se evaluaron también y exhibieron alguna mejora, pero presentan problemas similares de magnitud y precisión disminuidas causados por forzar la difusión de los reactivos a través de los polímeros. Los reactivos suministrados y secados sobre los electrodos pueden contribuir a reducir la magnitud del ensuciamiento por las proteínas con efectos menos negativos.

La respuesta a la dosis de concentración del mediador, inhibición con anticuerpo e inversión con un polihaptano BSA-Alc se evaluaron y se resumen en la Tabla 3. El Os-DSG-Alc es estable en forma liofilizada y, cuando está congelado en solución a -20ºC (40 y 80 \muM).

TABLA 3

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El anticuerpo de oveja DE policlonal (de intercambio iónico) purificado se utiliza en el ensayo TinaQuant HbA1c. El anticuerpo IS (inmunosorbente) se prepara utilizando metodología estándar de purificación IS. Se obtuvieron también muestras de un anticuerpo monoclonal para evaluación. Se construyeron curvas de inhibición en solución, realizándose todas las mezcladuras en tubos de microcentrífuga. Los ensayos se midieron aplicando 20 \mul sobre electrodos de paladio de 6 mm^{2} en las condiciones que se muestran en la Tabla 3. Las curvas de inhibición con los tres anticuerpos de hemoglobina A1c (PAB IS, PAB DE, y MAB) se generaron por fijación de OS-DSG-Alc a 5 \muM y variando la concentración de anticuerpo. Tanto PAB IS como MAB mostraban la relación estequiométrica esperada para la inhibición con el conjugado de péptido de osmio, lo que indicaba una fijación eficiente y rápida del anticuerpo al péptido Alc. El IS policlonal y monoclonal mostraron ambos curvas de inhibición pronunciadas, alcanzándose el cambio máximo próximo a 5 \muM. El anticuerpo adicional por encima de 5 \muM exhibió poco efecto en el aumento de la inhibición. El anticuerpo PAB DE menos purificado tenía una pendiente mucho menor y, como era de esperar, requería una cantidad más de 3 veces mayor para aproximarse a la inhibición máxima. La Figura 6 muestra las curvas de inhibición para cada uno de los anticuerpos HbA1c ensayados. A partir de las curvas de inhibición, los autores de la invención pudieron seleccionar concentraciones razonables de anticuerpo para inversión máxima con las muestras de Alc.

Las curvas de inhibición se realizaron también para los marcadores mediadores Os-SMCC-Alc (Max = 97%) y OS-SATA-Alc (Max = 44%). La estabilidad de los marcadores mediadores se evaluó también por observación de los valores de inhibición porcentual a lo largo del tiempo. Todos los marcadores mediadores mostraron cierta degradación cuando se guardaron en soluciones diluidas (40 \muM) a TA. Las muestras congeladas a -20ºC parecían ser estables.

Para demostración de la inversión de la inhibición, se seleccionaron concentraciones de anticuerpos de 4 \muM tanto para PAB IS como para MAB y 15 \muM para PAB DE a partir de las curvas de inhibición mostradas anteriormente. Se generaron luego curvas de inversión utilizando una serie de diluciones de polihaptano BAS-Alc con un -1:1 Alc:BSA. El BSA-Alc actúa como la muestra de los autores de la invención y se fija al anticuerpo. La Figura 10 muestra las curvas de inversión para los tres anticuerpos.

Si bien estos estudios de factibilidad para un inmunoensayo de HbA1c utilizaron un método de amplificación mediado por enzima (se utilizó Glucdor/PQQ/glucosa para regenerar el mediador reducido después de la oxidación en la superficie del electrodo, proporcionando una corriente mayor controlada por difusión viene dada por la ecuación de Cottrell), se considera que son indicativos de los resultados alcanzables con el uso de electrodos IDA con control bipotenciostático es muy preferido para medida de los conjugados marcados por mediador de acuerdo con esta invención.

Claims

1. Un método para medir la concentración de uno o más analitos en una muestra líquida, comprendiendo dicho método

poner en contacto un volumen de dicha muestra líquida con

2. El método de la reivindicación 1, en el cual los potenciales catódico y anódico se aplican a los electrodos de trabajo utilizando un bipotenciostato.

3. El método de la reivindicación 1, en el cual el marcador reversible rédox es un complejo de ion metálico seleccionado de ferroceno y complejos coordinados con nitrógeno de iones de metales de transición.

4. El método de la reivindicación 1, en el cual el marcador reversible rédox es un grupo orgánico reversible rédox.

5. El método de la reivindicación 1 para medir la concentración de dos analitos en una muestra líquida, en el cual los potenciales rédox respectivos de las especies reversible rédox primera y segunda difieren en al menos 100 milivoltios.

6. El método de la reivindicación 1 para medir la concentración de uno o más analitos en una muestra líquida, en el cual se mide el flujo de corriente a medida que al menos uno de los potenciales anódico y catódico se mantiene en el valor predeterminado y el potencial del otro se barre a través de su valor predeterminado.

7. El método de la reivindicación 1 para medir dos analitos proteináceos en una muestra líquida, en el cual el componente análogo de ligando de la primera especie rédox reversible es un péptido que comprende un epítope de un primer analito y el componente análogo de ligando de una segunda especie reversible rédox es un péptido que comprende un epítope de un segundo analito.

8. El método de la reivindicación 7, en el cual una pareja de fijación específica es un anticuerpo que reconoce el epítope del primer analito y la otra pareja de fijación específica es un anticuerpo que reconoce el epítope del segundo analito.

9. El método de la reivindicación 1 para medir un analito en una muestra líquida, en el cual el componente análogo de ligando respectivo de las especies reversible rédox primera y segunda son análogos de ligando diferentes de un solo analito.

10. El método de la reivindicación 9, en el cual el componente análogo de ligando de la primera especie reversible rédox es un péptido que comprende un primer epítope del analito, y el componente análogo de ligando de la segunda especie reversible rédox es un péptido que comprende un segundo epítope del analito, y las parejas de fijación específica son anticuerpos primero y segundo que reconocen cada uno los respectivos epítopes primero y segundo.

11. Un dispositivo para detectar o cuantificar uno o más analitos en una muestra líquida, comprendiendo dicho dispositivo

12. El dispositivo de la reivindicación 11, que comprende adicionalmente una cámara de muestra, en el cual dicha cámara tiene una abertura de recepción de la muestra y está dimensionada de tal manera que se llena por flujo capilar cuando la muestra líquida se pone en contacto con la abertura de recepción de la muestra.

13. El dispositivo de la reivindicación 11, en el cual la estructura de electrodos comprende electrodos de microconjunto seleccionados del grupo constituido por redes de microdiscos, microbandas o microorificios.

14. El dispositivo de la reivindicación 11, en el cual la estructura de los electrodos comprende electrodos de microconjunto interdigitados.

15. El dispositivo de la reivindicación 11, en el cual las especies reversible rédox están localizadas para contacto con la muestra líquida a medida que la misma se suministra a la cámara.

16. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 11, en el cual al menos una especie reversible rédox incluye un complejo de osmio.

17. El dispositivo de la reivindicación 11, en el cual al menos una de las especies reversible rédox comprende ferroceno o un derivado reversible rédox del mismo.

18. El dispositivo de la reivindicación 11, en el cual dos especies reversible rédox están posicionadas para contacto con la muestra líquida a medida que la misma se suministra a la cámara y cada especie es un complejo de osmio.

19. El dispositivo de la reivindicación 11, que incluye al menos una especie reversible rédox que comprende ferroceno o un derivado reversible rédox del mismo y al menos una especie reversible rédox que comprende un complejo de osmio.

20. El dispositivo de la reivindicación 11, en el cual al menos una de las especies reversible rédox es un compuesto electroquímicamente detectable de la fórmula

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en la cual

R y R_{1} son iguales o diferentes y son 2,2'-bipiridilo, 2,3'-bipiridilo disustituido en 4,4', 2,2'-bipiridilo disustituido en 5,5', 1,10-fenantrolinilo, 1,10-fenantrolinilo disustituido en 4,7, o 1,10-fenantrolinilo disustituido en 5,6, en donde cada sustituyente es un grupo metilo, etilo, o fenilo,

R y R_{1} están coordinados a Os a través de sus átomos de nitrógeno;

q es 1 ó 0;

R_{7} es B-(L)_{k}-Q(CH_{2})_{i}-;

R_{2} es hidrógeno, metilo, o etilo cuando q es 1, y R_{2} es B-(L)_{k}- Q(CH_{2})_{i}- cuando q es 0;

en donde en el grupo B-(L)_{k}-Q(CH_{2})_{i}-

: Q es O, S, o NR_{4} en donde R_{4} es hidrógeno, metilo o etilo;

: -L- es un enlazador bivalente;

: k es 1 ó 0;

: i es 1, 2, 3, 4, 5 ó 6; y

: B es hidrógeno o un grupo que comprende un ligando susceptible de fijación a una pareja de fijación específica;

Z es cloro o bromo;

m es +1 ó +2;

X es un anión mono- o bivalente,

Y es un anión monovalente; y

n es 1 o cero,

con la condición de que cuando X es un anión bivalente, n es cero,

y cuando m es 1, n es cero y X no es un anión bivalente.

21. El dispositivo de la reivindicación 11, en el cual al menos una de las especies reversible rédox es un compuesto electroquímicamente detectable de la fórmula

20

en la cual

Q es O, S, o NR_{4} en donde R_{4} es hidrógeno, metilo o etilo;

-L- es un enlazador bivalente;

k es 1 o cero;

i es 1, 2, 3, 4, 5 ó 6;

d es +2 ó +3;

X e Y son aniones seleccionados de aniones monovalentes y aniones bivalentes sulfato, carbonato o sulfito en donde x e y son independientemente 0, 1, 2, o 3 de tal modo que la carga neta de X_{x}Y_{y} es -2 o -3.

22. El dispositivo de la reivindicación 11, en el cual las especies reversible rédox tienen potenciales rédox respectivos que difieren al menos en 100 milivoltios.

23. El dispositivo de la reivindicación 11, en el cual las especies reversible rédox tienen potenciales rédox respectivos que difieren al menos en 200 milivoltios.

24. El dispositivo de la reivindicación 11, en el cual el dispositivo comprende al menos dos estructuras de electrodos, cada una de ellas en la forma de electrodos de microconjunto dimensionados para permitir el reciclado difusible de una especie reversible rédox difusible.

25. El dispositivo de la reivindicación 11 para cuantificar un primer analito y un segundo analito en una muestra líquida, comprendiendo dicho dispositivo dos especies reversible rédox, comprendiendo una primera especie reversible rédox un conjugado de un análogo de ligando del primer analito y comprendiendo una segunda especie reversible rédox un conjugado de un análogo de ligando del segundo analito, siendo capaz cada uno de dichos conjugados de análogo de analito de fijarse competitivamente con su analito respectivo a una pareja de fijación específica.

26. El dispositivo de la reivindicación 25, que comprende adicionalmente una pareja de fijación específica tanto para el primer analito como para el conjugado reversible rédox del análogo de ligando del primer analito y una pareja de fijación específica tanto para el segundo analito como para el conjugado reversible rédox del análogo de ligando del segundo analito.

27. El dispositivo de la reivindicación 11, que comprende adicionalmente un bipotenciostato en comunicación eléctrica con los conductores para aplicar un potencial catódico dependiente de la especie reversible rédox a un electrodo de trabajo y un potencial anódico dependiente de la especie reversible rédox a un segundo electrodo de trabajo.

28. El dispositivo de la reivindicación 27 para cuantificar uno o más analitos en una muestra líquida, incluyendo dicho dispositivo especies reversible rédox primera y segunda, en el cual el bipotenciostato es programable, y está programado para aplicar un primer potencial catódico a un primer electrodo de trabajo y un primer potencial anódico a un segundo electrodo de trabajo, correspondiendo dichos primeros potenciales anódico y catódico a los potenciales necesarios para establecer flujo de corriente a través de la muestra debido al reciclado difusional de la primera especie reversible rédox, y en el cual el bipotenciostato está programado para aplicar un segundo potencial catódico a dicho primer electrodo de trabajo y un segundo potencial anódico al segundo electrodo de trabajo, correspondiendo dichos segundos potenciales catódico y anódico a los potenciales necesarios para establecer flujo de corriente a través de la muestra debido al reciclado difusional de la segunda especie reversible rédox, y medios para medir el flujo de corriente a través de la muestra para cada uno de los potenciales primero y segundo.

29. El dispositivo de la reivindicación 27 para cuantificar uno o más analitos en una muestra de ligando, incluyendo dicho dispositivo especies reversibles rédox primera y segunda, y al menos primera y segunda estructuras de electrodos para contacto con la muestra líquida en la cámara, comprendiendo cada una de dichas estructuras de electrodos una microconjunto de electrodos de trabajo, y un conmutador para cambiar la comunicación eléctrica del bipotenciostato entre las estructuras de electrodos primera y segunda.

30. El dispositivo de la reivindicación 29, en el cual el bipotenciostato es programable, y está programado para aplicar un primer potencial catódico a un electrodo de trabajo de la primera estructura de electrodos y un primer potencial anódico a un segundo electrodo de trabajo de la primera estructura de electrodos, correspondiendo dichos primeros potenciales anódico y catódico a los necesarios para establecer flujo de corriente a través de la muestra debido al reciclado difusional de la primera especie reversible rédox, y en el cual el bipotenciostato está programado para aplicar un segundo potencial catódico a un electrodo de trabajo de la segunda estructura de electrodos y un segundo potencial anódico a un segundo electrodo de la segunda estructura de electrodos, correspondiendo dicho segundo potencial anódico y catódico a los potenciales necesarios para establecer flujo de corriente a través de la muestra debido al reciclado difusional de la segunda especie reversible rédox, y medios para medir el flujo de corriente a través de la muestra en cada estructura de electrodos.

31. El dispositivo de la reivindicación 11, en el cual las especies reversibles primera y segunda comprenden cada una un conjugado de análogos de ligando diferentes de un analito, siendo cada uno de dichos conjugados capaz de fijarse competitivamente con dicho analito a una de dos parejas de fijación específica independientes para dicho analito.

32. El dispositivo de la reivindicación 11 para cuantificar hemoglobina glicosilada, en el cual al menos una de las dos especies reversible rédox comprende un conjugado de la fórmula

Gluc-Val-His-Leu-Thr - L - M_{1}

en donde M es un marcador reversible rédox, L es un enlazador y Gluc-Val-His- Leu-Thr- es la secuencia N-terminal de la cadena \beta de la hemoglobina A1c.

33. El dispositivo de la reivindicación 23, en el cual el marcador reversible rédox es un complejo de ion metálico.

34. El dispositivo de la reivindicación 32, en el cual M_{1} es un complejo de ion osmio o ferroceno.

35. El dispositivo de la reivindicación 32, en el cual la otra especie reversible rédox comprende un conjugado reversible rédox de la fórmula

Val-His-Leu-Thr - L - M_{2}

en la cual M_{2} es un marcador reversible rédox y L es un enlazador.

36. El dispositivo de la reivindicación 35, en el cual el marcador reversible rédox es un complejo de ion metálico.

37. El dispositivo de la reivindicación 35, en el cual el potencial rédox de M_{1} y M_{2} difieren al menos en 100 milivoltios.

38. El dispositivo de la reivindicación 35, en el cual el potencial rédox de M_{1} y M_{2} difieren al menos en 200 milivoltios.

39. El dispositivo de la reivindicación 35 que comprende adicionalmente una pareja de fijación específica tanto para hemoglobina A1c como para el conjugado reversible rédox Gluc-Val-His-Leu-Thr - L - M_{1}.

40. El dispositivo de la reivindicación 27, que comprende adicionalmente una pareja de fijación específica tanto para hemoglobina como para el conjugado reversible rédox Val-His-Leu-Thr - L - M_{2}.

41. Un estuche para medir la concentración de uno o más analitos en una muestra líquida, comprendiendo dicho estuche

: al menos dos especies reversibles rédox para contacto con la muestra líquida, siendo cada una susceptible de difusión en la muestra líquida al menos en presencia de un analito predeterminado, comprendiendo al menos una especie un conjugado de un análogo de ligando de un analito y un marcador reversible rédox, teniendo dichas especies reversibles rédox potenciales rédox respectivos que difieren al menos en 50 milivoltios;

: una pareja de fijación específica para cada analito;

42. El estuche de la reivindicación 41, en el cual la estructura de electrodos comprende electrodos de microconjunto seleccionados del grupo constituido por redes de microdiscos, microbandas, o microorificios.

43. El estuche de la reivindicación 41, en el cual la estructura de electrodos comprende electrodos de microconjunto interdigitados.

44. El estuche de la reivindicación 41, en el cual las especies reversible rédox están mezcladas como una composición para contacto con la muestra líquida.

45. El estuche de la reivindicación 41 en el cual el marcador reversible rédox de al menos una especie reversible rédox comprende un complejo de osmio.

46. El estuche de la reivindicación 41, en el cual las especies reversible rédox tienen potenciales rédox respectivos que difieren al menos en 100 milivoltios.

47. El estuche de la reivindicación 41, en el cual las especies reversible rédox tienen potenciales rédox respectivos que difieren en al menos 200 milivoltios.