ES2219521T3 - Medicamento que contiene un inhibidor tisular de metaloproteinasas-2 (timp-2) como sustancia osteoanabolicamente activa. - Google Patents

Abstract

Utilización de un TIMP-2 con la secuencia de aminoácidos significando X1 el aminoácido E ó D, X2 el aminoácido T ó I, X3 el aminoácido N ó S, Z1 -NH2, una amina sustituida o un péptido arbitrario con hasta diez aminoácidos, Z2 -COOH, CONH2, una amida sustituida o un péptido arbitrario con hasta diez aminoácidos, así como sus fragmentos biológicamente activos y/o derivados amidados, acilados, sulfatados, fosforilados, glicosilados y/o modificados con polietilen-glicoles, para la preparación de un medicamento destinado a la estimulación de osteoblastos después de fracturas óseas o intervenciones quirúrgicas.

Description

Medicamento que contiene un inhibidor tisular de metaloproteinasas-2(TIMP-2) como sustancia osteoanabólicamente activa.

El invento se refiere a un medicamento y a un agente de diagnóstico, que contienen un inhibidor tisular de metaloproteinasas-2 (TIMP-2, de Tissue Inhibitor of Metalloproteinases-2) como formulación peptídica eficaz osteoanabólicamente, y a las utilizaciones de los mismos.

Un TIMP-2 pertenece a la familia de los "inhibidores tisulares de metaloproteinasas" de los que hasta ahora se conocen cuatro diferentes péptidos (TIMP-1 hasta -4) con funciones biológicas diversas.

La estructura primaria de un TIMP-2 se pudo esclarecer en diferentes organismos tales como seres humanos (Liotta y colaboradores, 1991), ratas (Roswit y colaboradores, 1992) y ratones (Kishi y colaboradores, 1991). El péptido contiene en total 12 cisteínas, que están unidas unas con otras a través de 6 puentes de cisteínas.

A las funciones biológicas de un TIMP-2 pertenece sobre todo la inhibición de metaloproteinasas de la matriz (MMPs, de Matrix - Metalloproteinases) activas. Por el concepto de MMPs se entiende un conjunto de endoproteinasas dependientes del zinc, que están en situación de descomponer a la matriz extracelular. La matriz extracelular consta de una estructura compleja y está formada a base de colágeno, proteoglicanos, glicoproteínas y glicosaminoglicanos, entre otras sustancias. Una descomposición de la matriz extracelular es esencial para muchos procesos biológicos tales como la embriogénesis, la morfogénesis, así como la resorción y remodelación de tejidos. No obstante, una actividad sin regular de las MMPs puede conducir a una considerable destrucción de tejidos, tal como por ejemplo en el caso de una artritis reumática (Okada y colaboradores, 1986).

Con la inhibición de las metaloproteinasas de la matriz se encuentran conectadas otras funciones biológicas adicionales de un TIMP-2, entre las que se cuentan, entre otras, la reducción del crecimiento de células tumorales (Gómez y colaboradores, 1997) así como la inhibición de la angiogénesis (Valente y colaboradores, 1998).

Junto a estas funciones, se describen también actividades biológicas intrínsecas de un TIMP-2. Entre ellas, se cuentan una formación aumentada de glóbulos rojos de la sangre (Stetler-Stevenson y colaboradores, 1992) así como un efecto mitógeno sobre diferentes linajes celulares (Hayakawa y colaboradores, 1994). Además, se pudieron mostrar in vitro tanto una inhibición de la resorción ósea en cultivos globales de huesos (Hill y colaboradores, 1993), como también una estimulación de la resorción ósea por medio de osteoclastos (Shibutani y colaboradores, 1999).

El documento de patente de los EE.UU. US-A-5.714.465 se refiere al tratamiento de enfermedades óseas con composiciones farmacéuticas, que contienen un TIMP-2.

También el documento US-A-5.595.885 se refiere a composiciones farmacéuticas, que contienen un TIMP-2.

El documento US-A-5.643.752 se refiere a la utilización de metaloproteinasas de la matriz, en particular un TIMP-4, para el tratamiento de diferentes enfermedades óseas.

Figura 1: A) hasta D) Las diferentes etapas de cromatografía para la purificación del TIMP-2 osteoproliferativo.

Figura 2: A) Efecto proliferativo de un TIMP-2 humano recombinante sobre osteoblastos fetales primarios de ratas. B) Influencia de un TIMP-2 humano recombinante sobre el diámetro medio de las células en el caso del linaje celular osteoblástico de ratón MC3T3-E1.

Sorprendentemente, un TIMP-2 con la secuencia de aminoácidos

1

significando	X1	el aminoácido E ó D,
	X2	el aminoácido T ó I,
	X3	el aminoácido N ó S,
	Z^{1}	-NH_{2}, una amina sustituida o un péptido arbitrario con hasta diez aminoácidos,
	Z^{2}	-COOH, -CONH_{2}, una amida sustituida o un péptido arbitrario con hasta diez aminoácidos,

así como sus fragmentos biológicamente activos y/o derivados amidados, acilados, sulfatados, fosforilados, glicosilados y/o modificados con polietilen-glicoles, están en situación de producir una estimulación de los osteoblastos responsables de la formación de huesos después de fracturas óseas o de intervenciones quirúrgicas. Un TIMP-2 actúa en tal caso de modo proliferativo y protector sobre los osteoblastos fetales.

Conforme al invento se utiliza un medicamento que contiene un TIMP-2 con la secuencia de aminoácidos

2

significando	X1	el aminoácido E ó D,
	X2	el aminoácido T ó I,
	X3	el aminoácido N ó S,
	Z^{1}	-NH_{2}, una amina sustituida o un péptido arbitrario con hasta diez aminoácidos,
	Z^{2}	-COOH, -CONH_{2}, una amida sustituida o un péptido arbitrario con hasta diez aminoácidos,

así como sus fragmentos biológicamente activos y/o derivados amidados, acilados, sulfatados, fosforilados, glicosilados y/o modificados con polietilen-glicoles.

De modo preferido, se utilizan conforme al invento un TIMP-2 humano (SEQ ID. No 1) y un TIMP-2 de rata (SEQ ID. No 2):

3

4

Es objeto del invento la utilización de un TIMP-2 con la secuencia de aminoácidos

5

significando	X1	el aminoácido E ó D,
	X2	el aminoácido T ó I,
	X3	el aminoácido N ó S,
	Z^{1}	-NH_{2}, una amina sustituida o un péptido arbitrario con hasta diez aminoácidos,
	Z^{2}	-COOH, -CONH_{2}, una amida sustituida o un péptido arbitrario con hasta diez aminoácidos,

así como sus fragmentos biológicamente activos y/o derivados amidados, acilados, sulfatados, fosforilados, glicosilados y/o modificados con polietilen-glicoles, para la preparación de un medicamento destinado a la estimulación de osteoblastos después de fracturas óseas o intervenciones quirúrgicas.

Los derivados de TIMP-2, utilizables conforme al invento, presentan, de modo preferido por lo menos una identidad entre secuencias de 90% con la secuencia nativa del TIMP-2 o con las modificaciones mencionadas.

Puede ser ventajoso emplear el TIMP-2, que se ha de utilizar conforme al invento, en combinación con otros factores de crecimiento y/o medicamentos, así como en combinación con sustancias coadyuvantes medicinales, por ejemplo en el caso de implantes.

La administración del TIMP-2 se efectúa en particular como una formulación en forma de inyecciones, pomadas, cápsulas de "liberación lenta" y formulaciones galénicas similares.

El TIMP-2 que se ha de utilizar conforme al invento se emplea para la preparación de un medicamento osteoanabólico destinado al tratamiento de defectos óseos y al mejoramiento de la regeneración ósea después de fracturas óseas o intervenciones quirúrgicas.

El fundamento para la identificación de un TIMP-2 como péptido osteoanabólico lo constituyó la observación de que existe una capacidad diversa de regeneración de defectos óseos en función de la edad de un organismo. Mientras que, normalmente, los organismos adultos no están en situación de regenerar defectos óseos de tamaño mayor mediante la formación de tejido óseo nuevo, en el caso de organismos más jóvenes tiene lugar una regeneración ósea completa de defectos comparables.

Se obtuvieron observaciones similares también in vitro al realizar la investigación de osteoblastos: Los osteoblastos aislados a partir de organismos fetales crecen sin problemas en un cultivo y comienzan a mineralizarse después de unos pocos días. Los osteoblastos procedentes de animales inmaduros y adultos no están, por el contrario, en situación de proliferarse en condiciones clásicas de cultivo, y mueren finalmente. Si estas células, incapaces de vivir por sí solas, se suplementan con el material sobrenadante de osteoblastos fetales, entonces éstas se proliferan y mineralizan de una manera similar a como lo hacen las células fetales.

Una capacidad manifiestamente regenerativa del material sobrenadante de cultivo celular de osteoblastos fetales se pudo mostrar también in vivo. En tal caso, se ocasionó en ratas por medios quirúrgicos un defecto craneal, que sin una estimulación externa no se puede curar mediando formación de tejido óseo. Sin embargo, si se aplica en uno de estos defectos un extracto peptídico procedente del material sobrenadante de cultivo celular de osteoblastos primarios fetales, entonces tiene lugar una regeneración completa del defecto mediando formación de nuevo tejido óseo.

Con el fin de aislar la sustancia, que es responsable de los efectos antes descritos, se llevó a cabo una extracción de péptidos a partir del material sobrenadante de osteoblastos fetales, y los péptidos obtenidos se investigaron a continuación in vitro en cuanto a sus capacidades osteoproliferativas (véase el Ejemplo 3). En tal caso, el péptido conforme al invento se puede purificar mediante una cromatografía de RP (de Reverse Phase = fase inversa) preparativa, semipreparativa y analítica, con ayuda de su actividad biológica.

La caracterización bioquímica del péptido conforme al invento, purificado, se efectuó mediante una espectrometría de masas y una secuenciación del extremo terminal de N. La determinación de la masa molecular mediante una espectrometría de masas con ionización por proyección de electrones (ESI) arrojó un peso molecular de 21.715 Da. El análisis de la secuencia del extremo terminal de N mediante una descomposición de Edmann, dio como resultado la siguiente secuencia:

XSXSPVHPQQAFXNADVVIRAKAV

La sustancia conforme al invento se puede emplear para obtener un crecimiento aumentado y una regeneración mejorada de un tejido óseo. Esto se puede concebir después de fracturas óseas o intervenciones quirúrgicas.

El invento se explica con mayor detalle con ayuda de los siguientes ejemplos:

Ejemplo 1 Aislamiento de un TIMP-2 a partir de un material sobrenadante de cultivo celular

Materiales sobrenadantes de cultivos celulares se obtuvieron a partir de cultivos confluyentes de osteoblastos fetales primarios. Para esto, los osteoblastos se aislaron en primer lugar a partir de las cubiertas de cráneos de fetos de ratas mediante una digestión secuencial con colagenasa y tripsina, y a continuación se cultivaron en un medio esencial mínimo (MEM, de Minimal Essential Medium) de Eagle, con una mezcla de penicilina y estreptomicina y 10% de suero de ternero fetal (FCS, de Fetal Calf Serum). Después de haberse alcanzado la confluencia, las células se mantuvieron, de modo alternado, en cada caso durante 24 h con 10% de FCS y durante 24 h sin suero. Los materiales sobrenadantes exentos de suero se recogieron en tal caso y se utilizaron para el aislamiento ulterior de los péptidos.

El aislamiento de un TIMP-2 se efectuó mediante diferentes etapas consecutivas de RP-HPLC (de Reverse Phase -
High Performance Liquid Chromatography = cromatografía en fase líquida de alto rendimiento en fase inversa), que sirvieron para el fraccionamiento del extracto peptídico global. Partes alícuotas de las fracciones se ensayaron en el bioensayo. Las fracciones se almacenaron a -20ºC.

Las diferentes etapas de cromatografía para la purificación de un TIMP-2 osteoproliferativo están mostradas en las Figuras 1 A-D.

1. Cromatografía preparativa

Los materiales sobrenadantes de cultivo celular, exentos de suero, se ajustaron a un pH de 2,5 con HCl y a una concentración de 5% de acetonitrilo por adición de acetonitrilo. Después de ello, se filtraron primeramente a través de un filtro de fibras de vidrio (GF6, de Schleicher & Schuell) y a continuación a través de un filtro de membrana (OE G7, 4,43 \mum, de Schleicher & Schuell). El material así obtenido se aplicó en unas cantidades de 1-2 l, con un caudal de 40 a 50 ml/min, a una columna de RP.

Condiciones de la cromatografía:

Columna:	YMC Gel Basic (15 - 30 \mum, 47 x 300 mm)
Caudal:	40 ml/min
Fracciones:	50 ml
Tampón A:	10 mM de HCl
Tampón B:	80% (p/v = peso / volumen) de acetonitrilo, 10 mM de HCl
Gradiente:	5 - 75% de B en 47,5 min
	75 - 100% de B en 5 min

A continuación, se ensayaron en un bioensayo partes alícuotas de las fracciones obtenidas.

2. Separación semipreparativa

Las fracciones 37-40 que eran bioactivas en el ensayo, se separaron con ayuda de otra etapa de RP adicional.

Condiciones de la cromatografía:

Columna:	Biotek RP Silica C4 (100 \ring{A}, 5 \mum, 20 x 125 mm)
Caudal:	5 ml/min
Fracción:	5 ml
Tampón A:	0,1% de TFA (ácido trifluoroacético)
Tampón B:	80% (p/v) de acetonitrilo, 0,1% de TFA
Gradiente:	5 - 40% de B en 10 min
	40 - 100% de B en 60 min

Partes alícuotas de las fracciones obtenidas se ensayaron de nuevo en el bioensayo.

3. Cromatografía analítica

El subsiguiente fraccionamiento de las fracciones bioactivas 22 y 23 se efectuó con ayuda de una cromatografía RP adicional.

Condiciones de la cromatografía:

Columna:	YMC C18 (120 \ring{A}, 5 \mum, 4,6 x 250 mm)
Caudal:	0,6 ml/min
Fracción:	0,6 ml
Tampón A:	0,1% de TFA
Tampón B:	80% (p/v) de acetonitrilo, 0,1% de TFA
Gradiente:	5 - 30% de B en 4 min
	30 - 55% de B en 50 min
	55 - 100% de B en 5 min

Partes alícuotas de las fracciones obtenidas se ensayaron en el bioensayo.

4. Cromatografía analítica

Las fracciones bioactivas 27 - 29 se separaron de nuevo mediante una cromatografía en RP.

Condiciones de la cromatografía:

\newpage

Columna:	Phenomenex C5 (4,6 x 250 mm)
Caudal:	0,6 ml/min
Fracción:	0,6 ml
Tampón A:	0,1% de TFA
Tampón B:	80% (p/v) de acetonitrilo, 0,1% de TFA
Gradiente:	5 - 38% de B en 4 min
	38 - 58% de B en 60 min
	58 - 100% de B en 5 min

En el siguiente bioensayo, el péptido conforme al invento, presente en la fracción 24, se pudo obtener en forma pura.

Ejemplo 2 Análisis bioquímico de un TIMP-2 1. Determinación de la masa

La determinación de la masa del péptido nativo purificado se llevó a cabo con ayuda de un espectrómetro de masas con ESI. Se obtuvo una masa molecular de 21.715 Da. Ésta concuerda muy bien con la masa teórica de la forma oxidada de un TIMP-2, en la que todas las cisteínas están puenteadas a través de puentes de cisteína.

2. Determinación de la secuencia

El péptido nativo purificado se analizó mediante una descomposición de Edmann en un secuenciador ABI 494, mediando utilización del programa patrón. Las primeras 24 etapas de descomposición proporcionaron la siguiente secuencia terminal de N:

XSXSPVHPQQAFXNADVVIRAKAV

En el caso de X se trata en este contexto de radicales de cisteína, que no son detectables al realizar la secuenciación. Tomando en consideración estas cisteínas no detectables, la secuencia obtenida concuerda exactamente con la secuencia conocida de un TIMP-2. No se obtuvieron secuencias secundarias.

3. Investigación en un banco de datos

Al realizar el subsiguiente balance en el banco de datos SwissProt la secuencia se identificó inequívocamente como la parte de comienzo de un TIMP-2. La masa teórica de la proteína, de 21.713 Da, concuerda asimismo con la masa medida de 21.715 Da. El péptido purificado se pudo identificar por consiguiente de manera inequívoca como un TIMP-2.

Ejemplo 3 Determinación de la actividad biológica de un TIMP-2

El aislamiento de un TIMP-2 se efectuó con ayuda de su actividad biológica, midiéndose la proliferación de osteoblastos fetales de ratas.

Para ello, partes alícuotas de las fracciones obtenidas de péptidos se liofilizaron y se volvieron a suspender en un medio exento de suero. A continuación, se ensayó su efecto proliferativo sobre osteoblastos fetales. Las fracciones con efecto proliferativo se sometieron después de ello a una separación por cromatografía adicional. Las diferentes etapas de cromatografía para la purificación del TIMP-2 osteoproliferativo se muestran en las Figuras 1 A-D.

Para la medición de la proliferación, los osteoblastos primarios fueron tripsinizados y sembrados, en un número de células de 5.000 células por pocillo, en placas de 96 pocillos en un medio exento de suero. A continuación, se añadieron las fracciones que se habían de ensayar. Después de un período de tiempo de incubación de 48 h ó 72 h se ensayó la proliferación mediante dos diferentes métodos. Como testigos positivos se utilizaron diferentes concentraciones de un suero de ternero fetal y de TGF\beta1 (de Tumor Growth Factor = factor de crecimiento de tumores). Como testigo negativo sirvieron células sin estimulación.

La medición de la proliferación se efectuó, por una parte, con ayuda del substrato Wst-1. Este substrato es convertido por enzimas mitocondriales en células activas sobre el metabolismo para dar un producto coloreado, siendo la resultante intensidad de color proporcional al número de células. La intensidad de color se determina a una longitud de onda de 405 nm y a una longitud de onda de referencia situada por encima de 600 nm en el aparato lector de un ELISA.

Por otra parte, se mide la proliferación a través de una medición directa del número de células en un contador Coulter Counter (de CASY).

Ambos métodos mostraron un efecto fomentador del crecimiento, dependiente de la dosis, de un TIMP-2 humano recombinante sobre osteoblastos (Figura 2A). Un importante efecto osteoproliferativo de un TIMP-2 puede detectarse a partir de concentraciones de 100 ng/ml en estos experimentos in vitro. Además de ello, un TIMP-2 humano recombinante produce una disminución del diámetro medio de las células en el caso del linaje celular osteoblástico de ratón MC3T3-E1 (Figura 2B).

Unos efectos significativos de un TIMP-2 se pueden detectar en este experimento in vitro a partir de concentraciones de 100 ng/ml. Además, se pudo mostrar en un microscopio un efecto protector y proliferativo sobre el linaje celular osteoblástico de ratón MC3T3-E1.

Puesto que todas estas células son típicas células óseas, un TIMP-2 se puede considerar como factor osteoanabólico.

Claims (4)

1. Utilización de un TIMP-2 con la secuencia de aminoácidos

6

significando X1 el aminoácido E ó D, X2 el aminoácido T ó I, X3 el aminoácido N ó S, Z^{1} -NH_{2}, una amina sustituida o un péptido arbitrario con hasta diez aminoácidos, Z^{2} -COOH, -CONH_{2}, una amida sustituida o un péptido arbitrario con hasta diez aminoácidos,

así como sus fragmentos biológicamente activos y/o derivados amidados, acilados, sulfatados, fosforilados, glicosilados y/o modificados con polietilen-glicoles, para la preparación de un medicamento destinado a la estimulación de osteoblastos después de fracturas óseas o intervenciones quirúrgicas.

2. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1, poseyendo el derivado de TIMP-2 una identidad entre secuencias de por lo menos 90% con respecto a la secuencia de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Utilización de un TIMP-2 de acuerdo con las reivindicaciones 1 y/ó 2 en combinación con otros factores de crecimiento y/o medicamentos, así como en combinación con agentes coadyuvantes medicinales, por ejemplo en el caso de implantes.

4. Utilización de un TIMP-2 de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3 formulado a la forma de inyecciones, pomadas, cápsulas de "liberación lenta" y formulaciones galénicas similares.