ES2567445T3

ES2567445T3 - Péptidos pro-angiogénicos

Info

Publication number: ES2567445T3
Application number: ES07871699.0T
Authority: ES
Inventors: Laura L. Eggink; J. Kenneth Hoober
Original assignee: Susavion Biosciences Inc
Current assignee: Susavion Biosciences Inc
Priority date: 2006-12-13
Filing date: 2007-12-13
Publication date: 2016-04-22
Anticipated expiration: 2027-12-13
Also published as: EP2101804A4; US7838497B2; WO2008076815A3; EP2101804B8; EP2101804B1; US20080233081A1; JP2010513308A; DK2101804T3; EP2101804A2; WO2008076815A2

Abstract

Un péptido terapéutico que consiste en una construcción y al menos dos o más brazos, teniendo la construcción un armazón central y consistiendo cada brazo en una secuencia unida al armazón central por medio de una secuencia de engarce, en el que cada secuencia es la misma o diferente y se selecciona de entre el grupo que consiste en WNSTL (SEQ ID NO: 1), NQHTPR (SEQ ID NO: 2), WNSTY (SEQ ID NO: 5), YNSTL (SEQ ID NO: 6), YQPSL (SEQ ID NO: 7), y VQATQS (SEQ ID NO: 8).

Description

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DESCRIPCION

Peptidos pro-angiogenicos Antecedentes

1. Campo de la tecnica

La presente invencion se refiere en general al uso de peptidos sinteticos para tratar lesiones en seres humanos, en particular, a peptidos que estimulan la angiogenesis.

2. Estado de la tecnica

La alteracion de la circulacion es un aspecto subyacente de muchos trastornos que se manifiestan clmicamente que incluyen la enfermedad arterial periferica (PAD), enfermedad ca^aca isquemica y ulceras cronicas. Mas de 24 millones de pacientes estan afectados por estas afecciones en los EE.UU., con 10 millones afectados solo por PAD. La PAD a menudo es resultado de la diabetes, que actualmente afecta a uno de cada tres adultos de mas de 40 anos y cuya incidencia se espera que aumente como resultado del aumento de la obesidad en la poblacion general. Las ulceras cronicas afectan a mas de 6,5 millones de pacientes cada ano y producen una alteracion significativa de la calidad de vida. Incluso con los tratamientos actuales, aproximadamente se llevan a cabo 35.000 amputaciones de extremidades cada ano debido a la isquemia que pone en peligro la vida.

La cicatrizacion de las heridas tras una lesion se produce en tres estadios principales. Primero esta el estadio hemostatico e inflamatorio, que minimiza la perdida de sangre y recluta celulas espedficas en el sitio de la lesion. Las plaquetas se organizan en el tejido lesionado, inician la formacion del coagulo y liberan factores de crecimiento durante este primer estadio. En el segundo estadio, las celulas fagodticas reclutadas tales como macrofagos y monocitos digieren el tejido lesionado y los factores de crecimiento liberados por las plaquetas activadas, los macrofagos, y otras celulas se unen a los receptores en la superficie de las celulas endoteliales de los vasos sangumeos pre-existentes. Entonces, las celulas endoteliales proliferan, migran al lecho de la herida, y se diferencian en tejido vascular arterial y venoso. Finalmente, en un tercer estadio de remodelacion, maduran nuevos vasos sangumeos reclutando celulas de musculo liso para estabilizar la arquitectura vascular, con lo que la sangre comienza a fluir a traves de los nuevos vasos sangumeos.

La angiogenesis, el proceso de crecimiento de nuevos vasos sangumeos, es un proceso esencial en la cicatrizacion de heridas y para restaurar el flujo sangumeo a los tejidos tras una lesion. El descubrimiento de los factores de crecimiento que estimulan este proceso ha tenido una influencia importante en el tratamiento medico de afecciones incapacitantes y que ponen en peligro la vida que resultan de la perdida de circulacion sangumea. Al menos se han identificado 20 factores de crecimiento que estimulan la angiogenesis. El factor de crecimiento mas ampliamente estudiado, y utilizado clmicamente, es el factor BB de crecimiento derivado de plaquetas angiogenico (PDGF-BB). El PDGF se libera a partir de muchos tipos celulares que incluyen plaquetas activadas, macrofagos activados, celulas endoteliales, fibroblastos y celulas tumorales y el PDGF se aprobo por la FDA en diciembre de 1997 para su uso clmico como agente topico para las ulceras del pie diabetico. Un segundo factor de crecimiento desarrollado para su uso clmico es el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Los factores de crecimiento de este tipo y los analogos biologicamente activos son tipicamente protemas de tamano medio que se pueden producir por tecnicas recombinantes (por ejemplo, en levaduras) y se consigue la activacion de la angiogenesis por los factores de crecimiento, al menos en parte, por estimulacion de la produccion de citocinas.

La IL-8 es una citocina que activa los neutrofilos y tiene una potente actividad quimiotactica sobre los neutrofilos y linfocitos. El acontecimiento inflamatorio en el sitio de la infeccion o lesion activa los monocitos y macrofagos, que liberan IL-8. El tejido endotelial inflamado tambien libera IL-8, que atrae neutrofilos de la sangre al tejido durante la fase inicial del mecanismo de defensa. La consecuencia es un drculo vicioso de reclutamiento de neutrofilos en respuesta a la IL-8, dano de los tejidos, y mas produccion de IL-8 lo que da lugar a una inflamacion perjudicial como efecto secundario. Ademas, los neutrofilos se adhieren a los tejidos endoteliales inflamados por medio de las integrinas secretadas por las celulas y la ICAM-1 puede estimular la liberacion de integrinas a las que se unen los neutrofilos, aumentando de esta manera el nivel de inflamacion perjudicial en el sitio de la lesion incluso mas. El aumento de los niveles de ciertos tipos de citocinas clmicamente perjudiciales, tales como la IL-8 y la ICAM-1, en el sitio de la infeccion o lesion puede por lo tanto producir efectos secundarios perjudiciales que pueden dificultar el proceso de cicatrizacion.

La cicatrizacion de heridas en el tejido de mairnferos puede aumentarse por la aplicacion, ya sea solos o en combinacion, de una citocina y/o factor de crecimiento, de ciertos neuropeptidos tales como las taquicininas, sustancia P, sustancia K y similares, asf como peptidos relacionados con el gen de la calcitonina. El uso de dichos peptidos para aplicaciones clmicas, sin embargo, ha tenido dificultades por varios casos problematicos que incluyen efectos secundarios perjudiciales. La sustancia P, por ejemplo, es un conocido mediador de los impulsos dolorosos y sus efectos sobre la cicatrizacion de heridas se conocen bien desde hace varios anos. Sin embargo, tambien se ha demostrado que la sustancia P estimula a las neuronas para que liberen factores que reclutan citocinas inflamatorias y neutrofilos en el sitio de una herida, produciendo de esta manera dolor e inflamacion.

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Por lo tanto, el uso de peptidos o factores de crecimiento y sus analogos como agentes terapeuticos para la cicatrizacion de heridas puede ser problematico por varias razones, que incluyen la eficacia, coste, y efectos secundarios perjudiciales tales como la inflamacion. Una informacion relevante de los intentos dirigidos a uno o mas de estos problemas se pueden encontrar en las siguientes referencias: Patente de EE.UU. n.° 7.105.481, Solicitud de Patente de EE.UU. n.° 2007/0021342, Publicacion de Patente de EE.UU. n.° 2005/0063937 y Solicitud de Patente de EE.UU. n.° 2007/0154448. Sin embargo, cada una de estas referencias tiene una o mas de las siguientes desventajas:

1. la necesidad de expresar un polinucleotido que contenga la secuencia de nucleotidos que codifica la protema, lo que puede complicar la produccion y aumentar significativamente los costes;

2. la necesidad de purificar las protemas expresadas de entre las otras protemas de la celula hospedadora, que puede complicar la produccion y aumentar significativamente los costes;

3. la administracion de factores de crecimiento angiogenicos sin capacidad adicional de activar fagocitos y que por lo tanto aumenten la eficacia o mejoren la infeccion u otros trastornos concomitantes;

4. la administracion de factores de crecimiento angiogenicos sin capacidad adicional para reducir la inflamacion, reduciendo de esta manera los efectos secundarios perjudiciales; y

5. la administracion de un peptido que pueda estimular la liberacion de factores que reclutan citocinas inflamatorias y neutrofilos en el sitio de la herida, produciendo dolor e inflamacion.

Por lo tanto, a la luz de los tratamientos disponibles para promover la cicatrizacion de heridas por estimulacion de la angiogenesis, existe la necesidad de proporcionar terapias practicas, de bajo coste que aumenten u optimicen la cicatrizacion de ulceras cronicas sin producir efectos secundarios perjudiciales.

Sumario

La presente invencion se refiere en general a peptidos y tratamientos que facilitan la cicatrizacion de heridas. Mas particularmente, la invencion se refiere a peptidos que pueden estimular la produccion de citocinas pro-angiogenicas beneficiosas, activar fagocitos, e inhibir la liberacion de citocinas que sean perjudiciales para la cicatrizacion de heridas. Los peptidos por lo tanto pueden facilitar la cicatrizacion de heridas sin producir efectos secundarios perjudiciales tales como la inflamacion.

De acuerdo con un aspecto de la presente invencion, se proporcionan peptidos terapeuticos como se desvelan en las reivindicaciones.

Siguiendo con otro aspecto de la invencion, se proporciona una composicion que contiene un peptido terapeutico de acuerdo con la invencion. En una realizacion, la composicion es una construccion peptfdica.

De acuerdo con otro aspecto mas de la presente invencion, se proporciona el uso de un peptido terapeutico de acuerdo con la invencion en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de una herida promoviendo el proceso de cicatrizacion de heridas.

Lo anterior y otras caractensticas y ventajas de la presente invencion seran evidentes por la siguiente descripcion mas detallada de las realizaciones particulares de la invencion, como se ilustra en los dibujos adjuntos.

Breve descripcion de los dibujos

La FIG. 1 ilustra una estructura molecular de una realizacion de la presente invencion, una construccion peptfdica multivalente que contiene cuatro peptidos de acuerdo con la invencion, cada uno de los cuales esta unido a una estructura de nucleo central por medio de una secuencia de engarce;

La FIG. 2A ilustra la estructura qmmica de una construccion peptfdica de acuerdo con una realizacion de la presente invencion, la construccion SynGia™H1B que contiene cuatro copias de la secuencia central WNSTL (SEQ ID NO: 1) unidas a una estructura de armazon central ramificada.

La FIG. 2B ilustra la estructura qmmica de una construccion peptfdica de acuerdo con una realizacion de la presente invencion, la construccion SynGia™6D que contiene cuatro copias de la secuencia central NQHTPR (SEQ ID NO: 2) unidas a una estructura central ramificada;

La FIG. 3 ilustra la estructura de un marcador indicador que se puede anadir a un peptido de acuerdo con la presente invencion, una extension del extremo C que contiene un grupo dansilo fluorescente; y

La FIG. 4 es un grafico de barras de datos que ilustra la estimulacion del crecimiento de un tumor como resultado de la actividad pro-angiogenica por una realizacion de la presente invencion, la construccion peptfdica SynGia™H1B que contiene la secuencia central WNSTL (SEQ ID NO: 1) como se ilustra en la FIG. 2A.

Descripcion detallada

Para proporcionar un agente terapeutico con amplias propiedades que estimulen la angiogenesis, un proceso esencial de cicatrizacion de heridas y restauracion de la circulacion a los tejidos lesionados, el agente debena

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aumentar la cicatrizacion sin inducir efectos secundarios clmicamente perjudiciales tales como la inflamacion, y debena actuar en concierto con una actividad fagodtica con el fin de eliminar los desechos tisulares y atenuar las infecciones bacterianas. Los peptidos de la presente invencion pueden alcanzar esta meta induciendo la liberacion concomitante de citocinas beneficiosas, inhibiendo la liberacion de citocinas perjudiciales y estimulando la actividad de las celulas fagodticas. Esta ultima actividad tambien permite una respuesta de los tejidos lesionados para responder a la presencia de anticuerpos dirigidos contra agentes patogenos que puede aumentar en afecciones con lesiones cronicas. El tratamiento con los peptidos de la presente invencion debena inducir el proceso de cicatrizacion proporcionando una elevacion endogena sostenida de una matriz de citocinas beneficiosas, al contrario que la presencia de una unica citocina que se da de manera exogena.

La siguiente descripcion presenta realizaciones de la invencion que representan varios modos que se contemplan para la practica de la invencion.

Como se utilizan en el presente documento, se pretende que los terminos “comprende”, “que comprende”, “incluye”, “que incluye”, “tiene”, “que tiene” o cualquier otra variacion de los mismos abarquen una inclusion no excluyente. Por ejemplo, un proceso, procedimiento, artmulo, o aparato que comprende una lista de elementos no se limita necesariamente a solo esos elementos sino que puede incluir otros elementos no enumerados expresamente o inherentes a tal proceso, procedimiento, artmulo o aparato. Ademas, a menos de que se establezca expresamente lo contrario, “o” se refiere a un o incluyente y no a un o excluyente. Por ejemplo, se satisface una condicion A o B por uno cualquiera de lo siguiente: A es cierto (o presente) y B es falso (o no presente), A es falso (o no presente) y B es cierto (o presente), y tanto A como B son ciertos (o presentes).

Tambien, el uso de “un” o “una” se emplean para describir elementos y componentes de la invencion. Esto se hace simplemente por conveniencia y para dar un sentido general de la invencion. Esta descripcion debena leerse para incluir uno o al menos uno y el singular tambien incluye el plural a menos de que sea obvio que significa otra cosa.

A menos de que se definan de otro modo, todos los termicos tecnicos y cientfficos que se utilizan en el presente documento tienen el mismo significado que es entendido comunmente por el experto habituado en la tecnica a la que pertenece la invencion. Aunque se pueden utilizar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la practica o ensayo de la presente invencion, los procesos y materiales adecuados se describen posteriormente. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y otras referencias que se mencionan en el presente documento se incorporan por referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente especificacion, incluyendo las definiciones, prevalecera. Ademas, los materiales, procedimientos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Las siguientes definiciones se refieren a las realizaciones particulares descritas en el presente documento y no se deben tomar como limitantes; la invencion incluye equivalentes para otras realizaciones no descritas.

Como se utiliza en el presente documento, la expresion “adyacente a” cuando se refiere a la localizacion de un peptido o una composicion peptfdica con respecto a una superficie no significa necesariamente que el peptido o composicion este inmediatamente proxima a la superficie. Puede ser o no otra capa, revestimiento, material o espacio contiguo o no contiguo entre el peptido o composicion descrita y la superficie, y la superficie en sf misma puede ser otra capa o revestimiento.

Como se utiliza en el presente documento, el termino “angiogenico” cuando se refiere a un factor o agente se pretende que signifique un agente que estimula el desarrollo de los vasos sangumeos o que promueve la angiogenesis que incluye sin limitacion el crecimiento celular endotelial, la estabilidad de vasos sangumeos, y/o la vasculogenesis y similares.

Como se utiliza en el presente documento, el termino “construccion” cuando se refiere a un peptido se pretende que signifique una estructura que soporte uno o mas peptidos, que incluye sin limitacion un armazon central de tri-lisina que soporta cuatro secuencias peptfdicas identicas en la misma estructura.

Como se utiliza en el presente documento, el termino “citocina” se refiere a una molecula mensajera que controla la actividad de las celulas, que incluye sin limitacion las celulas del sistema inmunitario. Las citocinas pueden controlar la actividad celular por medio de varios mecanismos que incluyen sin limitacion permitir a las celulas comunicarse y alterar la funcion de unas con otras. Ejemplos no limitantes de las citocinas incluyen protemas inmunorreguladoras tales como interleucinas e interferones, que son secretadas por las celulas del sistema inmunitario y pueden afectar a la respuesta inmunitaria.

Como se utiliza en el presente documento, se pretende que la expresion “citocina perjudicial” signifique una citocina capaz de producir uno o mas efectos que puede ser perjudiciales con respecto al tratamiento, que incluye sin limitacion la inflamacion que resulta del aumento de los niveles de IL-8 o ICAM-1.

Como se utiliza en el presente documento, se pretende que la expresion “efecto secundario perjudicial” signifique un efecto secundario que puede ser perjudicial con respecto al tratamiento, que incluye sin limitacion la inflamacion.

Como se utiliza en el presente documento, la expresion cantidad “eficaz” o “terapeuticamente eficaz” se refiere a una

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cantidad de agente eficaz para acelerar o de otra manera mejorar la cicatrizacion de heridas o la circulacion sangumea sistemica en un sujeto, o prevenir la recurrencia de una ulcera en un sujeto. Una dosis terapeutica es una dosis que muestra un efecto terapeutico en el sujeto.

Como se utiliza en el presente documento, se pretende que el termino “pro-angiogenico” signifique una sustancia o agente que estimula o de otra manera aumenta la angiogenesis.

Como se utiliza en el presente documento, se pretende que el termino “estimulante” signifique un agente que produce un aumento temporal de la actividad funcional o eficacia de un organismo o cualquiera de sus partes, incluyendo sin limitacion un farmaco sintetico o una sustancia de origen natural tal como la adrenalina.

Como se utiliza en el presente documento, se pretende que el termino “estimular” o la expresion “que estimula” signifiquen excitar la actividad o crecimiento, o una mayor actividad.

Como se utiliza en el presente documento, se pretende que el termino “sujeto” signifique el que reacciona durante el curso del tratamiento, que incluye sin limitacion un ser humano o individuo no humano que espera o esta bajo atencion medica o tratamiento.

Como se utiliza en el presente documento, se pretende que el termino “terapeutico”, cuando se refiere a una sustancia o tratamiento, signifique una sustancia o tratamiento que afecta a la provision o asistencia en una cura para, o mejorar los smtomas de, una disfuncion corporal tal como la causada por una enfermedad o lesion.

Como se utiliza en el presente documento, el termino “tratamiento” se refiere tanto al tratamiento terapeutico como a las medidas profilacticas o preventivas. Aquellos que necesitan el tratamiento incluyen los que ya tienen un trastorno asf como aquellos en los que se va a prevenir el trastorno.

Como se utiliza en el presente documento, la expresion “cicatrizacion de heridas” se refiere a la afeccion que se beneficiana del tratamiento con una o mas realizaciones de la presente invencion.

La presente invencion se refiere en general a peptidos sinteticos que pueden inducir la liberacion de agentes bioactivos que son esenciales para la estimulacion de la angiogenesis. Mas particularmente, la presente invencion se refiere a peptidos sinteticos capaces de inducir la liberacion de citocinas beneficiosas que pueden estimular terapeuticamente la cicatrizacion de heridas y responder a la presencia de anticuerpos dirigidos contra agentes patogenos sin inducir efectos secundarios perjudiciales. Las realizaciones de peptidos de la presente invencion pueden estimular la liberacion de PDGF-BB, una citocina pro-angiogenica, e inhibir la liberacion de la citocina inflamatoria IL-8 que recluta neutrofilos. Debido a que los neutrofilos son responsables de la mayona de la respuesta inflamatoria en los tejidos lesionados, la regulacion negativa de la IL-8 proporcionada por la presente invencion es beneficiosa para la reparacion tisular. Ademas, los peptidos pueden inhibir la liberacion de ICAM-1, que estimula la liberacion de integrinas a las que se unen los neutrofilos. Estos efectos minimizan la inflamacion en el sitio de la lesion mientras que estimulan el proceso de cicatrizacion. La regulacion positiva concomitante de liberacion de PDGF-BB, que es la citocina clave para la angiogenesis, con la regulacion negativa de la liberacion de IL-8 e ICAM-1 proporciona las condiciones favorables para el inicio de la cicatrizacion.

Ademas, un entrecruzamiento selectivo de receptores de superficie celular con una estructura multivalente que incorpore al menos una realizacion de peptido de la presente invencion puede atenuar las infecciones bacterianas estimulando la actividad de celulas fagodticas que se reclutan en el tejido lesionado o infectado. Las celulas fagodticas responden a la presencia de celulas bacterianas que contienen lipopolisacaridos (LPS) en su superficie englobando las celulas en vacuolas fagodticas y digiriendo las celulas bacterianas. Ademas, las celulas fagodticas responden a la presencia de anticuerpos dirigidos contra (y unidos a) un agente patogeno tal como una celula bacteriana, celula fungica o virus.

La FIG. 1 ilustra un modelo de trabajo de la estructura molecular de una realizacion de una construccion peptfdica inmunorreguladora multivalente 10 de acuerdo con la invencion. La construccion 10 se puede sintetizar con multiples brazos 1, que incluyen sin limitacion dos, tres, cuatro, y ocho o mas brazos 1, utilizando la misma secuencia peptfdica central 2 en los cuatro brazos o con dos o mas secuencias diferentes. La longitud del espaciador 3 entre el armazon central 4 de la construccion y la secuencia peptfdica central 2 determina la longitud del brazo 1. Los brazos 1 que se ilustran en la FIG. 1, que tienen una secuencia de cinco o seis aminoacidos, pueden tener aproximadamente 3 ± 0,5 nm de longitud dependiendo de la conformacion (aproximadamente 7 nm a traves de la molecula), por ejemplo. Los dominios de superficie celular de las proternas receptoras conocidas son en correspondencia de aproximadamente 3 nm a aproximadamente 4 nm de diametro. Esta distancia se puede ajustar aumentando o disminuyendo la longitud del engarce. Por lo tanto el entrecruzamiento de los receptores se puede conseguir con tal realizacion. La naturaleza multidimensional de la estructura ilustrada en la FIG. 1 se obtuvo utilizando tecnicas convencionales de modelado molecular.

Ejemplos

Ejemplo 1

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Diseno y smtesis de peptidos

Una exploracion de secuencias pepffdicas identified un grupo de secuencias de interes. Los peptidos correspondientes se sintetizaron por procedimientos en fase solida utilizando proteccion de cadena lateral Fmoc convencional. Los peptidos ramificados se construyeron sobre un armazon central de tri-lisina que permite cuatro secuencias identicas en la misma estructura. Se incluyo una secuencia de engarce (Gly)3-Ser (GGGS, SEQ ID NO: 3) para distanciar la secuencia activa de el armazon central. Las distancias entre las secuencias activas se pueden ajustar disminuyendo o aumentando la longitud del engarce, que incluye sin limitacion el uso de dos engarces en tandem (GGGSGGGS, SEQ ID NO: 4) o invirtiendo cualquier engarce inerte tal como polietilenglicol (PEG) de una longitud variable. La estructura ramificada se diseno para tener una mayor actividad produciendo el agrupamiento de receptor (entrecruzamiento) sobre la superficie de las celulas sensibles.

Los peptidos se sintetizaron sobre resina de PAL-PEG-poliestireno (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando aminoacidos protegidos con Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonil) y un sintetizador de peptidos de flujo continuo Milligen Biosearch 9050+ (Millipore Corporation, Billerica, MA).

El extremo C de el armazon central es ffpicamente un resto de lisina (K). Sin embargo, el extremo C se puede modificar para incluir aminoacidos adicionales en el extremo C tal como un resto de cistema, al que pueden anadirse marcadores tales como grupos fluorescentes, o un resto de e-biotinil-N-lisina (biotinil-K) util para los procesos posteriores de purificacion. Ademas, se puede insertar un aminoacido tal como p-alanina (pA) o triptofano (W) entre el aminoacido anadido en el extremo C y el resto de lisina del extremo C de el armazon central con el fin de proporcionar un espaciador o un medio para determinar la concentracion por la absorbancia. Ejemplos no limitantes de tales restos de lisina del extremo C en el armazon central incluyen K-pA-C y K-W-biotinil-K, respectivamente. Ademas, se pueden anadir restos de lisina adicionales a uno o ambos de los grupos amino a- y £- de una lisina modificada del extremo C de el armazon central para producir, por ejemplo (K)2K, (K)2K-pA-C o (K)2K-W-bionitil-K, formando de esta manera estructuras ramificadas en las que los grupos amino a- y £- estan disponibles para la expansion.

Los restos de lisina que se utilizan en los puntos de ramificacion se incorporan protegidos con Fmoc en ambos grupos amino a- y e-, de forma que ambos estan disponibles para la formacion de enlaces amida tras la reaccion de desproteccion convencional con piperidina. Se puede incorporar un grupo dansilo (u otro marcador fluorescente) por reaccion del grupo tiol del resto cistema del extremo C utilizando acido 5-((((2 yodoacetil) amino) etil) amino) naftaleno-1-sulfonico (1,5-IAEDANS) seguido por el protocolo convencional para las sondas sensibles al tiol (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Se une una biotina a la lisina por medio de un enlace amida a la cadena lateral del grupo amino que, debido a su alta afinidad por la estreptavidina, proporciona un medio para recuperar el peptido con protemas asociadas de las mezclas de reaccion con el fin de estudiar la interaccion del peptido con los componentes celulares.

Los peptidos se construyeron unidos a una resina en fase solida, que se escogio tal que cuando el peptido se escinde de la resina, el grupo carboxilo del extremo C del peptido se libera como la amida. Cada uno de los cuatro grupos amino de el armazon central tri-lisina se extendieron con la adicion de la secuencia de engarce GGGS (SEQ ID NO:3), seguido por la secuencia pepffdica central activa.

Tras la escision del lecho de resina, el producto se puede purificar sustancial o completamente por HPLC en una columna preparatoria Jupiter Proteo C12 (21,2 mm x 250 mm) (Phenomenex, Inc., Torrance, CA) utilizando un gradiente del 8% al 18% de acetonitrilo en agua que contenga 10 mM de acido trifluoroacetico (TFA). La pureza del producto pepffdico final se confirmo por espectroscopia de masas utilizando un espectrometro de masas Voyager DE STR (Applied Biosystems, Foster City, CA). El peptido purificado por HPLC se seco al vado, se disolvio en solucion salina fosfato tamponada, pH 7.2 (PBS) y se paso a traves de una columna de filtracion en gel de Sefadex G 15 o G 25 (1 x 48 cm para muestras pequenas) para separar el TFA del peptido. La columna se eluyo entonces con PBS esteril.

De manera alternativa, el producto se purifica por el uso de un cartucho de fase inversa C18, cromatograffa de intercambio ionico, y cromatograffa de filtracion en gel para retirar los productos secundarios de la smtesis. La concentracion se puede determinar por la absorbancia del fluoroforo (por ejemplo, el grupo dansilo, coeficiente de extincion, £mM=5,7 cm-1 a 336 nm), absorbancia del enlace pepffdico a 210 nm (e mg/ml “ 31 cm-1), absorbancia de aminoacidos aromaticos (por ejemplo, triptofano, £mM=5,6 cm-1 a 280 nm) en el peptido (cuando estan presentes) y/o la absorbancia del reactivo acido bicinconmico (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Las soluciones de peptido se pueden ajustar a la concentracion deseada y filtrarse en esterilidad antes de su uso.

Ejemplo 2

Peptidos centrales WNSTL (SEQ ID NO: 1) y NQHTPR (SEQ ID NO: 2)

Se identificaron los peptidos triptofano-asparagina-serina-treonina-leucina (WNSTL, SEQ ID NO: 1) y asparagina- glutamina-histidina-treonina-prolina-arginina (NQHTPR, SEQ ID NO:2) a traves de una exploracion de secuencias pepffdicas potencialmente de interes. Las secuencias se sintetizaron sobre un centro tri-lisina de acuerdo con Posnett y col., J. Biol. Chem., 263: 1719-25, 1988, con un engarce (glicina)3-serina (GGGS, SEQ ID NO: 2) incluido

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con la secuencia para extender el peptido activo lejos del centro.

Las FIG. 2A-2B ilustran la estructura qmmica de estas dos realizaciones de la invencion. En estas realizaciones, R = H o puede ser un aducto que contiene un marcador fluorescente como el grupo dansilo que se muestra en la FIG. 3. Las construcciones peptidicas que se ilustran contienen cuatro secuencias identicas, cada una de las cuales esta conectada a un armazon de tri-lisina ramificada central por medio de una secuencia engarce (Gly)3Ser (GGGS, SEQ ID NO: 3). La FIG. 2A es una construccion peptidica ramificada de acuerdo con una realizacion de la invencion, denominada SynGia™H1B, que contiene cuatro copias de la secuencia central que contiene el peptido WNSTL (SEQ ID NO: l). El peptido de la realizacion que contiene R = H tiene una masa molecular de 3.841,16 Dalton.

La FIG. 2B ilustra la estructura de la construccion que contiene la secuencia del extremo N, NQHTPR (SEQ ID NO: 2), denominada SynGia™6D. El peptido de la realizacion que contiene R = H tiene una masa molecular de 4.543,89. En otra realizacion, una extension del extremo C que contiene p-alanina, cistema y un marcador dansilo, como se muestra en la FIG. 3, esta unida covalentemente a la construccion que se ilustra en la FIG. 2B, que da como resultado un peptido que tiene una masa molecular de 4.850,23 Dalton.

Ejemplo 3

Regulacion de la liberacion de citocinas

Para determinar si los peptidos regulan la induccion o inhibicion de la liberacion de citocinas, se trataron celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) cultivadas, con un peptido de una realizacion de la invencion y, tras una incubacion de 4 horas, se recolecto el medio y se ensayo en cuanto a los cambios en las cantidades de 40 citocinas diferentes. Se anadio la construccion peptfdica WNSTL (SEQ ID NO: 1) SynGia™H1B, que se ilustra en la FIG. 2A, con una concentracion de 100 nM en cada uno de los ensayos. Los cultivos de PBMC establecidas con celulas de Cellular Technologies, Ltd. (Shaker Heights, OH). Se descongelaron aproximadamente 3 millones de celulas PBMC humanas congeladas a 37 °C y se transfirieron a un tubo conico de 50 ml en el que se anadieron lentamente 8 ml de medio de lavado. Luego, se anadieron 8 ml adicionales y se le dio vueltas para mezclarlo. Las celulas se centrifugaron entonces a 330 g durante 10 min, se retiro el sobrenadante y el aglomerado se resuspendio en 10 ml de medio de lavado y se centrifugo como anteriormente. Las celulas lavadas se resuspendieron entonces en medio RPMI 1640 que contema un 10% de FBS a aproximadamente 6 millones de celulas por ml y se anadieron 100 pl de la suspension en cada pocillo de una placa de microtitulacion de 96 pocillos y se incubaron durante una noche a 37 °C en un 5% CO2 humidificado. Despues de 24 horas, el medio se sustituyo con 200 pl de medio RPMI 1640 recien preparado que contema un 10% de FBS y se incubo a 37 °C en un 5% de CO2 humidificado durante 2 dfas. Para los datos que se muestran en la Tabla 1, se anadio una alfcuota de la construccion peptfdica a muestras por duplicado con una concentracion final de 5 nM o 100 nM y se incubaron a 37 °C en un 5% de CO2 humidificado durante 4 horas. Para los otros experimentos (datos no incluidos), se continuo la incubacion durante 24 h. El medio se retiro entonces y se almaceno a -80 °C. Las muestras se analizaron en cuanto a produccion de citocinas. Un grupo de celulas de control no se trato con un agente experimental. Un segundo grupo de celulas de control se trato con LPS, el agente que se utiliza comunmente para inducir la produccion de una variedad de citocinas inflamatorias El control positivo de inflamacion proporcionado por este segundo grupo de celulas de control es esencial para asegurar que los peptidos no producen una respuesta inflamatoria no regulada.

Los ensayos de los niveles de citocinas en las muestras de medios de cultivo se llevaron a cabo utilizando procedimientos desarrollados por RayBiotech, Inc. (Norcross, GA). En esta tecnologfa, la membrana de matrices de anticuerpos se incuba con muestras de medios. Tras el lavado, la matriz se incuba con un coctel de todos los anticuerpos marcados con biotina. La membrana se lava entonces para liberar los anticuerpos no unidos y se incuba con estreptavidina marcada con un colorante fluorescente. Tras un lavado final, la membrana de matrices se lee en un detector de fluorescencia y se cuantifican las intensidades de las manchas para obtener valores relativos.

Las TABLAS 1-2 enumeran varias citocinas cuyas concentraciones en un medio de cultivo de PBMC se pueden alterar como resultado del tratamiento de las celulas con realizaciones de peptidos de la presente invencion. Las citocinas que se afectan de esta manera incluyen sin limitacion:

Eotaxina (quimioatrayente, induce la acumulacion sustancial de eosinofilos);

Eotaxina-2 (induce la quimiotaxis de eosinofilos y basofilos, libera histamina);

GCSF (factor estimulante de colonias de granulocitos, factor de crecimiento);

ICAM-1 (molecula -1 de adhesion intercelular, se une a las integrinas, receptor de rinovirus humano);

IL-1p (Interleucina 1p, un mediador de reacciones inflamatorias);

IL-4 (promueve la proliferacion y diferenciacion de linfocitos B e inhibe la produccion de citocinas inflamatorias tales como IL-1, IL-6 y TNF-a);

IL-6SR (receptor soluble para la IL-6);

IL-7 (estimula la proliferacion del precursor de linfocitos B y T);

IL-8 (quimioatrayente y activador de neutrofilos);

IL-10 (inhibe la smtesis de citoquinas inflamatorias tales como el INF-y, IL-2 y TNF-p);

IL-11 (induce respuestas inflamatorias, promueve las respuestas inmunitarias);

IL-12 (contiene las subunidades de 40 y 70 kDa, activa los linfocitos-NK y estimula la proliferacion de

5

10

15

20

25

30

35

linfoblastos);

IL-15 (tiene muchas de las mismas propiedades de IL-2, puede contribuir a las respuestas inmunitarias mediadas por linfocitos T);

IL-16 (quimioatrayente y activador de celulas que expresan CD4);

IL-17 (funciona como mediador de la angiogenesis que estimula la migracion de celulas endoteliales vasculares y formacion de nervios y regula la produccion de una variedad de factores de crecimiento que promueven la angiogenesis);

INF-y (Interferon-gamma, tiene propiedades antivmcas, inmunorreguladoras y anti-tumorales);

MCP-1,2 (protemas quimiotacticas de monocitos):

M-CSF (induce la proliferacion y estimula los monocitos y macrofagos);

MIG (quimioatrayente para linfocitos T estimulados pero no activo sobre neutrofilos o monocitos);

MIP-lb (protema inflamatoria de macrofagos, que esta implicada en la activacion de granulocitos y linfocitos citolfticos);

PDGF-BB (factor de crecimiento derivado de plaquetas, homodfmero BB);

RANTES (regulado en activacion, expresado, y segregado en linfocitos T normales; quimiotactico para linfocitos T);

sTNF RI, RII (formas solubles del receptor RI o RII para el factor de necrosis tumoral (TNF));

TIMP-2 (inhibidor tisular de metaloproteinasas de la matriz extracelular); y

TNF-p (promueve la proliferacion de fibroblastos y esta implicado en la cicatrizacion de heridas).

La Tabla 1 contiene datos que muestran las citocinas que se liberan con una tasa significativamente mas alta o mas baja (en comparacion con los controles sin tratar) durante una incubacion de 4 horas de PBMC con la construccion peptfdica ramificada SynGia™H1B en presencia de suero. Un grupo de las muestras de control no se trato con peptido y un segundo grupo de muestras de control se trato con lipopolisacaridos (LPS) en ausencia de peptido. El SynGia™H1B, cuya estructura se ilustra en la FIG. 2A, contiene la secuencia peptfdica central WNSTL (SEQ ID NO: 1). Entre las citocinas que se inducen a concentraciones de mas de dos veces como resultado de la incubacion con SynGia™H1B estan pDgF-BB, IL-1p, IL-4, IL-11, IL-12 y RANTES. Por el contrario, varias citocinas muestran una disminucion de la concentracion de mas de dos veces en comparacion con las muestras de control sin tratar con este peptido. La disminucion de la concentracion de IL-8 en la muestra tratada con peptido, en comparacion con la cantidad de IL-8 en la muestra tratada con el agente inflamatorio prototfpico LPS, es particularmente notable. Ademas, cuando se comparaba con las muestras de control sin tratar, los peptidos no indudan un cambio en la cantidad de la citocina inflamatoria IL-6. Sin embargo, los niveles de IL-6 estaban significativamente elevados en las muestras tratadas con LPS en ausencia de peptido. En un experimento, por ejemplo, la muestra tratada con peptido tema una concentracion relativa de IL-6 de 93, la muestra de control sin tratar de 98, y la muestra tratada con LPS (en ausencia del peptido), 5.879. Debido a que la concentracion de IL-6 en la muestra tratada con peptido no era significativamente diferente de la muestra de control sin tratar, los datos para la IL-6 no se incluyen en las Tablas 1 o 2. El aumento del PDGF-BB pro-angiogenico y el descenso de la IL-8 inflamatoria, sin la estimulacion concomitante de la inflamacion, tienen una importancia particular con respecto a la cicatrizacion de heridas.

TABLA 1

Concentracion relativa de citocinas tras la incubacion de PBMC en suero

con la construccion peptfdica SynGia™H1B que contiene la secuencia

central WNSTL (SEQ ID NO:1).

Citocinas*: WNSTL (SEQ ID NO:1) Sin tratar (control) LPS (control)

Aumentada:

PDGF-BB: 159 43 56

IL-1p: 120 44 48

IL-4: 97 30 49

IL-11: 49 17 27

IL-12p40: 228 50 46

IL-12p70: 131 90 89

RANTES: 145 60 114

S TNF RI: 78 42 58

Disminuida:

IL-7: 93 154 178

IL-8: 144 417 840

IL-10: 43 101 218

Eotaxina-2: 109 194 470

GCSF: 50 108 120

ICAM-1: 44 58 53

INF-y: 103 134 158

IL-6SR: 32 52 52

TIMP-2: 25 58 92

MCP-1: 968 1464 1844

Los datos de concentracion relativa para la construccion peptidica SynGia™6D se destacan de manera similar en la Tabla 2. La SynGia™6D, cuya estructura se ilustra en la FIG. 2B, contiene la secuencia peptidica central NQHTPR (SEQ ID NO: 2). Las citocinas se observaron de nuevo a concentraciones significativamente mayores o menores (con respecto a los controles) tras una incubacion de 4 horas con la construccion ramificada SynGia™6D. Los datos 5 de la Tabla 2 muestran que, aunque el patron total de la respuesta de citocinas a este peptido es de alguna manera diferente que el de la SynGia™HlB que se muestra en la Tabla 1, induce de manera similar una mayor cantidad de PDGF y una menor cantidad de IL-8.

La toxicidad del peptido in vivo se puede ensayar mediante inyeccion de un peptido en sujetos animales, que incluyen sin limitacion a los ratones. Los peptidos se pueden administrar de varias maneras, que incluyen sin 10 limitacion, por inyeccion (via intravenosa, subcutanea, intramuscular o intraperitoneal), por via topica (via transmucosa, transbucal, o transdermica) y/o por via oral (en lfquido, comprimidos o capsulas). En los estudios preliminares sobre ratones, no se han observado efectos secundarios del peptido sobre la tasa de crecimiento de los animales tras la inyeccion de una dosis eficaz en dfas alternos durante 1 mes (datos no mostrados).

TABLA 2

Concentracion relativa de citocinas tras la incubacion

de PBMC en suero con la construccion peptfdica

SynGia™6D que contiene la secuencia central

NQHTPR (SEQ ID NO:2)

Citocina: NQHTPR (SEQ ID NO:2) Sin tratar (control)

Aumentada:

PDGF-BB: 84 43

Eotaxina: 57 32

Eotaxina-2: 310 193

IL-15: 146 97

IL-16: 8 1

IL-17: 14 5

MCP-2: 90 56

M-CSF: 116 44

MIG: 100 54

TNF-p: 84 38

sTNF RII: 26 8

TIMP-2: 110 58

Disminuida:

IL-8: 261 417

MIP-lb: 777 1172

15 Ejemplo 4

Actividad pro-angiogenica de los peptidos

Los tumores necesitan vascularizacion para obtener los nutrientes que soportan el crecimiento. Por lo tanto, la estimulacion del crecimiento de un tumor en respuesta a la administracion de una construccion de la presente invencion es un indicio de angiogenesis. Para este ejemplo, se utilizo un sistema de modelo de xenoinjerto con 20 ratones desnudos (nu/nu) para determinar el efecto del peptido sobre el crecimiento de la lmea celular de adenocarcinoma de celulas renales 786-O inyectada en el costado de un raton de forma que se inducfa un tumor. Despues de que se estableciera el tumor, se inyecto el peptido por via subcutanea en dfas alternos. Se estimo el peso del tumor calculando el volumen.

La FIG. 4 ilustra los datos que resultan de los ensayos de la actividad pro-angiogenica de una realizacion de la 25 invencion. El grafico de barras en la FIG. 4 muestra el peso medio del tumor en ratones tratados con la construccion peptfdica SynGia™H1B que contiene cuatro copias del peptido central WNSTL (SEQ ID NO: 1) con una dosis de 0,05 nmol/g en comparacion con un grupo de control. El peptido tambien se ensayo en combinacion con Sorafenib, un farmaco anti-angiogenico. Los resultados que se muestran en la FIG. 4 indican que el crecimiento del tumor habfa aumentado significativamente, con un factor de 1,7, sobre el control, en ratones a los que se habfa 30 administrado la construccion SynGia™H1B. El farmaco Sorafenib, un inhibidor de la angiogenesis, inhibfa fuertemente (pero no completamente) el efecto del peptido.

Ejemplo 5

Dispositivos o materiales que contienen peptidos centrales

Los peptidos de la presente invencion tambien pueden depositarse para proporcionar un revestimiento apropiado a

5

10

15

20

25

30

35

40

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50

55

una superficie, que incluyen sin limitacion una superficie bioactiva o superficies inertes no biologicas de un dispositivo o materiales disenados para el implante. Los peptidos pueden por lo tanto promover la cicatrizacion alrededor de los materiales implantados con el fin de conseguir vascularizacion sin formacion de cicatriz. Se podnan utilizar de manera similar en otras aplicaciones in vitro o in vivo, que incluyen sin limitacion con sensores embebidos.

Referencias sobre antecedentes

Arici A (2002) Local cytokines in endometrial tissue: the role of interleukin-8 in the pathogenesis of endometriosis. Ann NY Acad Sci 955: 101-109.

Baggiolini M, Loetscher P, Moser B (1995) Interleukin-8 and the chemokine family. Int J Immunopharmacol 17: 103-108.

Barja-Fidalgo C, Coelho ALJ, Saldanha-Gama R, Helal-Neto E, Mariano-Oliveira A, de Freitas MS (2005) Disintegrins: integrin selective ligands with activate integrin-coupled signaling and modulate leukocyte functions. Braz J Med Biol Res 38: 1513-1520.

Delgado AV, McManus AT, Chambers JP (2005) Exogenous administration of Substance P enhances wound healing in a novel skin-injury model. Exptl Biol Med 230: 271-280.

Etzoni A (1999) Integrins: the glue of life. Lancet 353: 341-343.

Li WW and Li VW (2003a) The biology of PDGF and other growth factors in wound neovascularization. Contempory Surgery, Supplement, noviembre, 12-18.

Li WW and Li VW (2003b) Therapeutic angiogenesis: using growth factors to restore circulation in damaged tissues. Contempory Surgery, Supplement, noviembre, 19-25.

Li VW and Li WW (2003c) Angiogenic therapy for chronic wounds: the clinical experience with Becaplermin. Contempory Surgery, Supplement, noviembre, 26-32.

Li WW, Tsakayannis D and Li VW (2003) Angiogenesis: a control point for normal and delayed wound healing. Contempory Surgery, Supplement, noviembre, 5-11.

O'Shea JJ, Ma A, Lipsky P (2002) Cytokines and autoimmunity. Nature Rev Immunol 2: 37-45.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Susavion Biosciences, Inc.

<120> PEPTIDOS PRO-ANGIOGENICOS

<130> EGGI-12034

<140> Sin asignar <141>

<150> 60/869.862 <151>

<160>8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia sintetica <400> 1

Trp Asn Ser Thr Leu 1 5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210>2 <211>6 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia sintetica <400>2

Ash Gin His Thr Pro Arg 1 5

<210> 3 <211>4 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> secuencia de engarce <400> 3

Gly Gly Gly Ser 1

<210>4 <211>8 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> secuencia de engarce <400>4

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5

<210> 5 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia sintetica <400> 5

Trp Asn Ser Thr Tyr 1 5

<210> 6 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia sintetica <400> 6

5

10

15

20

25

Tyr Asn Ser Thr Leu 1 5

<210>7 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia sintetica <400>7

Tyr Gin Pro Ser Leu 1 5

<210>8 <211>6 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia sintetica <400> 8

Val Gin Ala Thr Gin Ser

1 5

Claims

5

10

15

20

25

REIVINDICACIONES

1. Un peptido terapeutico que consiste en una construccion y al menos dos o mas brazos, teniendo la construccion un armazon central y consistiendo cada brazo en una secuencia unida al armazon central por medio de una secuencia de engarce, en el que cada secuencia es la misma o diferente y se selecciona de entre el grupo que consiste en WNSTL (SEQ ID NO: 1), NQHTPR (SEQ ID NO: 2), WNSTY (SEQ ID NO: 5), YNSTL (SEQ ID NO: 6), YQPSL (SEQ ID NO: 7), y VQATQS (SEQ ID NO: 8).
2. Un peptido terapeutico que se selecciona de entre el grupo que consiste en WNSTL (SEQ ID NO: 1), NQHTPR (SEQ ID NO: 2), WNSTY (SEQ ID NO: 5), YNSTL (SEQ ID NO: 6), YQPSL (SEQ ID NO: 7), y VQATQS (SEQ ID NO: 8).
3. El peptido terapeutico de la reivindicacion 1, en el que el armazon central es un armazon de tri-lisina y la secuencia de engarce es GGGS (SEQ ID NO: 3) o GGGsGgGS (SEQ ID NO: 4).
4. El peptido terapeutico de la reivindicacion 1, en el que el peptido comprende tres o cuatro brazos, consistiendo los brazos en la misma secuencia unida al armazon central por medio de la secuencia de engarce, estando el peptido ramificado.
5. El peptido terapeutico de la reivindicacion 1, 3 o 4, en el que el peptido esta ramificado teniendo cuatro secuencias, siendo cada una WNSTL (SEQ ID NO: 1).
6. El peptido terapeutico de la reivindicacion 1, 3 o 4, en el que el peptido esta ramificado teniendo cuatro secuencias, siendo cada una NQHTPR (SEQ ID NO: 2).
7. Una composicion pro-angiogenica que comprende al menos un peptido terapeutico de acuerdo con la reivindicacion 1, 2, 3, 4 o 5 y un vehnculo farmaceuticamente aceptable.
8. El uso del peptido terapeutico de la reivindicacion 1, 2, 3, 4, 5 o 6 en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de una herida para inducir la cicatrizacion de heridas por medio de angiogenesis.
9. Un peptido terapeutico de la reivindicacion 1, 2, 3, 4, 5 o 6 para su uso en el tratamiento de una herida para promover el proceso de cicatrizacion de heridas.
10. El peptido terapeutico de la reivindicacion 2, 3, 4 o 5 en el que la secuencia se selecciona de entre el grupo que consiste en: WNSTL (SEQ ID NO: 1) y NQHTPR (SEQ ID NO: 2).