ES2212037T3 - Copolimeros de polieterester como matrices para la administracion de medicamentos. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBE UNA COMPOSICION PARA ADMINISTRAR UN AGENTE BIOLOGICAMENTE ACTIVO A UN HUESPED. LA COMPOSICION COMPRENDE UN PRODUCTO QUE INCLUYE UN AGENTE BIOLOGICAMENTE ACTIVO ENCAPSULADO EN UNA MATRIZ QUE COMPRENDE UN COPOLIMERO DE UN POLIALQUILEN GLICOL Y UN POLIESTER AROMATICO, TAL COMO UN COPOLIMERO DE POLIETILEN GLICOL TEREFTALATO / POLIBUTILENO TEREFTALATO. EL COPOLIMERO DE POLIETER CTIVO (INCLUYENDO PROTEINAS, PEPTIDOS Y PEQUEÑAS MOLECULAS DE FARMACO) DE LA DEGRADACION O DESNATURALIZACION Y PROPORCIONA UNA LIBERACION ESENCIALMENTE DE ORDEN CERO.

Description

Copolímetros de polieteréster como matrices para la administración de medicamentos.

La presente invención se refiere a matrices para la administración de medicamentos que contienen y liberan un agente activo. Más particularmente, esta invención se refiere a un compuesto farmacéutico que comprende un agente biológicamente activo encapsulado en una matriz que comprende un copolímero de polieteréster tal como, por ejemplo, un copolímero de polietilén glicol tereftalato/polibutilén tereftalato.

Se han realizado considerables investigaciones en el sector de las matrices de administración o suministro de productos que contienen y suministran varios agentes biológicamente activos. Una razón de ello es la de desarrollar sistemas de suministro que prolonguen el tiempo de liberación de los medicamentos existentes. Otra razón es que muchos medicamentos nuevos que se han desarrollado tienen perfiles farmacocinéticos poco favorables. En particular, los péptidos y las proteínas provocan dificultades farmacocinéticas. Estas substancias deben ser administradas parenteralmente si se requiere una acción sistémica. Asimismo, muchos medicamentos nuevos tienen una vida de almacenamiento corta, lo que requiere programas de inyección frecuente. La aceptación por parte del paciente y elevado coste asociado con protocolos de dosificación frecuente para medicamentos administrados parenteralmente proporcionan un fuerte estímulo para formas de dosificación alternativa y otros regímenes de dosifi-
cación.

Los sistemas polímeros que en la actualidad están bajo investigación como matrices para suministrar medicamentos incluyen ácido poliláctico (PLA) y copolímeros de ácido poliláctico con ácido glicólico. Estos copolímeros son también conocidos como polímeros PLGA. (Brannon-Peppas, Int. J. Pharmaceutics, Vol. 116, 1-9 (1995); Couvreur, y otros, Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 10, 141-162 (1993).) Conti, y otros, J. Microencapsulation, Vol. 9, 153-166 (1992), describen una serie de métodos para preparar microesferas con una carga de un medicamento a partir de polímeros PLGA. No obstante, las microesferas que contienen PLGA tienen desventajas entre las que se pueden citar las siguientes. En primer lugar, la capacidad de manipular la liberación de una proteína encapsulada queda limitada porque para la mayor parte de proteínas, la difusión en las matrices de PLGA es despreciable. La liberación de proteínas a partir de PLGA, por lo tanto, depende de la difusión a través de los poros presentes en la matriz y de la degradación o tiempo de disolución de las microesferas. Asimismo, durante la degradación del PLGA se genera un bajo pH en la matriz polímera, lo cual puede ser perjudicial para muchas proteínas. La patente USA 5.439.688 da a conocer micropartículas que contienen un péptido en una matriz de poli(butilén succinato) que tienen características de liberación continuada. Las patentes EP-A-0 717 999 y USA-A-5 384 333 describen compuestos de medicamentos inyectables que proporcionan liberación del medicamento a largo plazo.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se da a conocer un compuesto para suministrar un agente activo biológicamente a un hospedante, cuyo compuesto no tiene las limitaciones de los sistemas de suministro de la técnica anterior. El compuesto comprende un producto que incluye un agente biológicamente activo encapsulado en una matriz que comprende un copolímero de polialquilén glicol y un poliéster aromático.

El copolímero comprende de 30% en peso a 99% en peso, en especial de 30 a 90% en peso, basado en el peso del copolímero, de un primer componente que comprende un polialquilén glicol y tiene unidades con fórmula -OLO-CO-Q-CO, en la que L es un radical orgánico divalente que permanece después de la eliminación de los grupos hidróxilo terminales de un poli(oxialquilén)glicol, y Q es un radical orgánico divalente, y de 1% a 70% en peso, en especial de 10 a 70% en peso, basado en el peso del copolímero, de un segundo componente que es un poliéster aromático, que tiene unidades de fórmula -O-E-O-CO-R-CO- en la que E es un alquileno u oxidialquileno sustituido o no sustituido, que tiene de 2 a 8 átomos de carbono, y R es un radical aromático divalente sustituido o no sustituido.

El polialquilén glicol es seleccionado, en una realización, a partir de polietilén glicol, polipropilén glicol, y polibutilén glicol y copolímeros de los mismos, tales como poloxámeros. En una realización, el polialquilén glicol es polietilén glicol. Los términos alquileno y polialquileno se refieren en general a una estructura isómera, es decir, propileno que comprende tanto 1,2-propilén y 1,3-propilén, butileno que comprende 1,2-butilén, 1,3-butilén, 2,3-butilén, 1,2-isobutilén, 1,3-isobutilén y 1,4-butilén (tetrametilén) y de manera similar para homólogos de alquileno más elevados. El componente de polialquilén glicol termina con un residuo de ácido dicarboxílico -CO-Q-CO- si es necesario para proporcionar acoplamiento al componente de poliéster. El grupo Q puede ser un grupo aromático que tiene la misma definición que R, o puede ser un grupo alifático, tal como etileno, propileno o butileno.

En el componente de poliéster, el grupo aromático divalente R puede ser fenileno, piridileno, naftileno, bifenilo, oxidifenilo, sufodifenil, metilendifenil, opcionalmente sustituido por hasta cuatro, preferentemente dos, sustituyentes seleccionados entre cloro, nitro, y C_{1}-C_{4} alcoxi y además fluoro, hidroxi y C_{1}-C_{4} alquilo. Preferentemente, el radical aromático R es no sustituido, y más preferentemente, R es 1,4-fenileno. Entre los ejemplos de poliéster -O-E-O-CO-R-CO- se comprenden poli(etilén tereftalato), poli(propilén tereftalato), poli(butilén tereftalato), poli(butilén isoftalato), poli(etilén 4,4'-metilendifenildicarboxilato), poli(butilén 5,6,7,8-tetrahidronaftalén-1,4-dicarboxilato).

En una realización preferente, el poliéster es seleccionado a partir de polietilén tereftalato, polipropilén tereftalato y polibutilén tereftalato. Preferentemente, el poliéster es polibutilén tereftalato. En una realización más preferente, el copolímero es un copolímero bloque de polietilén glicol/polibutilén tereftalato.

El polialquilén glicol puede tener un peso molecular comprendido entre 200 y 20.000. El peso molecular exacto del poli(oxietilén) glicol depende de una serie de factores, incluyendo el tipo de agente biológicamente activo encapsulado por la matriz.

Como ejemplo, un copolímero de polietilén glicol/polibutilén tereftalato puede ser sintetizado a partir de una mezcla de dimetil tereftalato, butanediol (exceso), polietilén glicol, un antioxidante, y un catalizador. La mezcla es situada en un recipiente de reacción y calentada a unos 180ºC, y se destila metanol al tener lugar la transesterificación. Durante la transesterificación, el enlace éster con metilo es sustituido por un enlace éster con butileno. En esta etapa, el polietilén glicol no reacciona. Después de la transesterificación, la temperatura es aumentada lentamente a 245ºC, y se consigue un vacío (finalmente menor de 0,1 mbar). El exceso de butanediol se separa por destilación y un prepolímero de butanediol tereftalato se condensa con el polietilén glicol para formar el copolímero de polietilén glicol/polibutilén tereftalato. Una fracción de tereftalato conecta las unidades de polietilén glicol a las unidades de polibutilén tereftalato del copolímero y por lo tanto, este copolímero es el que se indica también en algunos casos como copolímero de polietilén glicol tereftalato/polibutilén tereftalato, o copolímero PEGT/PBT. En otra alternativa, se pueden preparar copolímeros de polialquilén glicol/poliéster, tal como se describe en la patente USA 3.908.201. La síntesis de los copolímeros de la invención es conocida en sí misma, y la invención no queda limitada a ningún medio determinado de síntesis.

El término "agente biológicamente activo" que se utiliza en esta descripción significa un agente que proporciona un efecto terapéutico o profiláctico. Estos agentes comprenden agentes antimicrobianos (incluyendo agentes antibacterianos y antifúngicos), agentes antivirales, agentes antitumorales, hormonas, agentes inmunogénicos, factores de crecimiento, lípidos y lipopolisacáridos.

Los agentes biológicamente activos que pueden estar contenidos en la matriz de copolímero, incluyen medicamentos de pequeñas dimensiones, no péptidos ni proteínas. Tienen un peso molecular que en general es menor de 1500, y en particular menor de 500. Un segundo grupo importante de agentes biológicamente activos son péptidos y proteínas biológicamente activos.

Entre los ejemplos de medicamentos de pequeñas dimensiones no péptidos ni proteínas que pueden quedar contenidos en la matriz del copolímero, se incluyen los siguientes:

1. Agentes antitumorales: altretamin, fluorouracil, amsacrin, hidroxicarbamida, asparaginasa, ifosfamida, bleomicina, lomustina, busulfán, melfalán, clorambucil, mercaptopurina, clormetín, metotrexato, cisplatín, mitomicín, ciclofosfamida, procarbacina, citarabín, teniposid, dacarbacín, tiotepa, dactinomicín, tioguanín, daunorubicín, treosulfán, doxorubicín, tiofosfamida, estramucín, vinblastina, etoglucida, vincristina, etoposid, vindesín.

2. Agentes antimicrobianos 2.1 Antibióticos

Penicilinas: ampicilina, nafcilina, amoxicilina, oxacilina, azlocilina, penicilina G, carbenicilina, penicilina V, dicloxacilina, feneticilina, floxacilina, piperacilina, mecilinama, sulbenicilina, meticilina, ticarcilina, mezlocilina

Cefalosporinas: cefaclor, cefalotín, cefadroxil, cefapirín, cefamandol, cefradina, cefatricina, cefsulodina, cefazolín, ceftacidim, ceforanida, ceftriaxon, cefoxitín, cefuroxima, cefacetrilo, latamoxef, cefalexín

Aminoglicósidos: amicacina, neomicina, dibecacina, canamicina, gentamicina, netilmicina, canamicina, tobramicina

Macrólidos: anfotericina B, novobiocina, bacitracina, nistatina, clindamicina, polimixinas, colistina, rovamicina, eritromicina, espectinomicina, lincomicina, vancomicina

Tetraciclinas: lortetraciclina, oxitetraciclina, demeclociclina, rolitetraciclina, doxiciclina, tetraciclina, minociclina

Otros antibióticos: cloramfenicol, rifamicín, rifampicín, tiamfenicol

2.2 Agentes quimioterapéuticos

Sulfonamidas: sulfadiacina, sulfametizol, sulfadimetoxina, sulfametoxazol, sulfadimidina, sulfametoxipiridacina, sulfafurazol, sulfafenazol, sulfaleno, sulfisomidina, sulfameracina, sulfisoxazol, trimetoprime con sulfametoxazol o sulfametrol

Antisépticos del aparato urinario: metenamina, quinolonas (norfloxacina, cinoxacina), ácido nalidíxico, nitrocompuestos (nitrofurantoina, nifurtoinol), ácido oxolínico

Infecciones anaeróbicas: metronidazol

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3. Medicamentos para tuberculosis: ácido aminosalicíclico, isoniacida, cicloserina, rifampicina, etambutol, tiocarlida, etionamida, viomicina

4. Medicamentos para tratamiento de la lepra: amitiozona, rifampicina, clofacimina, sulfoxona sódica, diaminodifenilsulfona (DDS, dapsona)

5. Agentes antifúngicos: amfotericina B, quetoconazol, clotrimazol, miconazol, econazol, natamicina, flucitosina, nistatina, griseofulvina

6. Agentes antivíricos: aciclovir, idoxuridina, amantidina, metisazona, citarabina, vidarabina, ganciclovir

7. Quimioterapia de amebiasis: cloroquina, iodoquinol, clioquinol, metronidazol, dehidroemetina, paromomicina, diloxanida, furoatetinidazol, emetina

8. Agentes antimalaria: cloroquina, pirimetamina, hidroxocloroquina, quinina, mefloquina, sulfadoxina/pirimeta-
mina, pentamidina, suramina sódica, primaquina, trimetoprim, proguanil

9. Agentes antihelmintiasis: tartrato antimónico potásico, nitridazol, dimercaptosuccinato antimónico sódico, oxamniquina, befenio, piperacina, diclorofén, praciquantel, detilcarbamacina, pamoato de pirantel, hicantona, pamoato de pirivio, levamisol, estibofén, mebendazol, tetramisol, metrifonato, tiobendazol, niclosamida

10. Agentes antiinflamatorios: ácido acetilsalicíclico, ácido mefenámico, alclofenac, naproxén, azopropanona, ácido niflúmico, bencidamina, oxifenbutazona, diclofenac, piroxicam, fenoprofén, pirprofén, flurbiprofén, saliciclato sódico, ibuprofensulindac, indometacina, ácido tiaprofénico, quetoprofén, tolmetina

11. Agentes antigota: colquicina, alopurinol

12. Analgésicos de acción central (opióides): alfentanil, metadona, becitramida, morfina, buprenorfina, nicomorfina, butorfanol, pentazocina, codeina, petidina, dextromoramida, piritranida, dextropropoxifén, sufentanil, fentanil

13. Anestésicos locales: articaína, mepivacaína, bupivacaína, prilocaína, etidocaína, procaína, lidocaína, tetracaí-
na

14. Medicamentos para la enfermedad de Parkinson: amantidina, difenidramina, apomorfina, etopropacina, mesilato de benztropina, lergotril, biperidén, levodopa, bromocriptina, lisurida, carbidopa, metixén, clorfenoxamina, orfenadrina, cicrimina, prociclidina, dexetimida, trihexifenidil

15. Agentes relajantes musculares de acción central: baclofén, carisoprodol, clormezanona, clorzoxazona, ciclobenzaprina, dantroleno, diacepam, febarbamato, mefenoxalona, mefenesina, metoxalona, metocarbamol, tolperi-
sona

16. Hormonas y antagonistas de hormonas 16.1 Corticosteroides

16.1.1 Mineralocorticosteroides: cortisol, desoxicorticosterona, fluorhidrocortisona

16.1.2 Glucocorticosteroides: beclometasona, betametasona, cortisona, dexametasona, fluocinolona, fluocinonida, fluocortolona, fluorometolona, fluprednisolona, flurandrenolida, halcinonida, hidrocortisona, medrisona, metilprednisolona, parametasona, prednisolona, prednisona, triamcinolona (acetonide)

16.2 Andrógenos

16.2.1 Esteroides androgénicos utilizados en terapia: danazol, fluoximesterona, mesterolona, metiltestosterona, testosterona y sales de los mismos

16.2.2 Esteroides anabólicos utilizados en terapia: calusterona, nandrolona y sales de los mismos, dromostanolona, oxandrolona, etilestrenol, oximetolona, metandriol, estanozolol, metandrostenolona, testolactona

16.2.3 Antiandrógenos: acetato de ciproterona

16.3 Estrógenos

16.3.1 Esteroides estrogénicos utilizados en terapia: dietilestilbestrol, estradiol, estriol, etinilestradiol, mestranol, quinestrol

16.3.2 Antiestrógenos: clorotrianiseno, clomifeno, etamoxitrifetol, nafoxidina, tamoxifén

16.4 Progestinas: alilestrenol, desogestrel, dimetisterona, didrogesterona, etinilestrenol, etisterona, diacetato de etinadiol, etinodiol, hidroxiprogesterona, levonorgestrel, linestrenol, medroxiprogesterona, acetato de megestrol, noretindrona, noretisterona, noretinodrel, norgestrel, progesterona

17. Medicamentos para tiroides

17.1 Medicamentos para tiroides utilizados en terapia: levotironina, liotironina

17.2 Medicamentos antitiroides utilizados en terapia: carbimazol, metimazol, metiltiouracil, propiltiouracil.

Cuando un medicamento de pequeñas dimensiones, tales como los descritos anteriormente, queda contenido en una matriz de copolímero, el componente de polialquilén glicol del copolímero tiene preferentemente un peso molecular de 200 a 400. Asimismo, el componente de polialquilén glicol, opcionalmente como tereftalato, se encuentra presente en el copolímero en una cantidad de 30% en peso a 80% en peso con respecto al peso del copolímero, preferentemente de 50% en peso a 60% en peso con respecto al peso del copolímero. En general, el poliéster aromático se encuentra presente en el copolímero en una cantidad de 20% en peso a 70% en peso del copolímero, preferentemente en una cantidad comprendida de 40% en peso a 50% en peso del copolímero.

Cuando la matriz del polieteréster, tal como polietilén glicol tereftalato/polibutilén tereftalato, contiene un medicamento de pequeñas dimensiones hidrofóbico, tal como, por ejemplo, una hormona esteroide, la matriz puede incluir también como mínimo un antioxidante hidrofóbico. Los antioxidantes hidrofóbicos que se pueden utilizar incluyen tocoferoles, tales como \alpha-tocoferol, \beta-tocoferol, \gamma-tocoferol, \delta-tocoferol, \varepsilon-tocoferol, \zeta_{1}-tocoferol, \zeta_{2}-tocoferol, y \eta-tocoferol; y 1-ácido ascórbico 6-palmitato. Estos antioxidantes hidrofóbicos retardan la degradación de la matriz del copolímero de polieteréster, y retardan la liberación del agente biológicamente activo contenido en la matriz. Por lo tanto, la utilización de un antioxidante hidrofóbico o lipofílico es aplicable particularmente a la formación de matrices que incluyen medicamentos que tienden a ser liberados con rapidez de las microesferas, tal como, por ejemplo, pequeñas moléculas de medicamentos que tienen un peso molecular menor de 500. El antioxidante o antioxidantes hidrofóbicos pueden encontrarse presentes en la matriz en una cantidad de 0,1% en peso a 10% en peso con respecto al peso total de la matriz, preferentemente de 0,5% a 2% en peso.

Cuando la matriz comprende un medicamento hidrofílico de pequeñas dimensiones, tal como un aminoglicósido, la matriz puede incluir también, además del antioxidante hidrofóbico, una molécula hidrofóbica tal como colesterol, ergosterol, ácido litocólico, ácido cólico, dinosterol, betulina, o ácido oleánico, que se pueden emplear a efectos de retardar la proporción de liberación del agente desde la matriz del copolímero. Estas moléculas hidrofóbicas impiden la penetración del agua en la matriz, pero no comprometen la degradabilidad de la matriz. Además, dichas moléculas tienen puntos de fusión de 150ºC a 200ºC o más. Por lo tanto, un pequeño porcentaje de estas moléculas incrementa la temperatura de transición a estado vitreo de la matriz, que disminuye el coeficiente de difusión en la matriz del agente biológicamente activo a liberar, tal como un medicamento con moléculas pequeñas. De este modo, las moléculas hidrofóbicas proporcionan una liberación más continuada del agente biológicamente activo desde la matriz. La molécula o moléculas hidrofóbicas pueden encontrarse presentes en la matriz en una cantidad de 0,1% en peso hasta 20% en peso, preferentemente de 1,0% en peso a 5,0% en peso.

Si se desea incrementar la hidrofilicidad del polímero, y por lo tanto incrementar la proporción de degradación y velocidad de liberación del medicamento del copolímero, éste puede ser modificado substituyendo parcialmente la fracción aromática con una fracción alifática tal como succinato y/o substituyendo parcialmente el alquileno con dioxietileno. Por ejemplo, el tereftalato puede ser substituido por succinato en una cantidad de 0,1 moles % a 20 moles %, preferentemente de 0,1 moles % a 5 moles %, al substituir parcialmente dimetil tereftalato como material inicial con dimetil succinato. Como otro ejemplo, el butileno es substituido por oxidiatileno en una cantidad de 0,1 moles % a 20 moles %, preferentemente de 0,5 moles % a 2 moles %, substituyendo 1,4 butanodiol por dietilenglicol como material inicial.

Se incluyen como ejemplos de péptidos o proteínas que pueden quedar ventajosamente contenidos en la matriz los péptidos o proteínas inmunogénicos, que incluyen los siguientes:

Factores de crecimiento: proteínas morfogenéticas del hueso, factores de crecimiento de transformación, factores de crecimiento de fibroblastos, factores de crecimiento epidérmicos, etc.

Toxinas: toxina de difteria, toxina de tétanos

Antígenos de superficie viral o partes de virus: adenovirus, Virus Epstein-Barr, Virus de Hepatitis A, virus de Hepatitis B, virus de Herpes, HIV-1, HIV-2, HTLV-III, virus de Gripe, virus de encefalitis Japonesa, virus de Sarampión, Papiloma virus, Paramixovirus, Virus de Poliomelitis, Virus de Rabia, Virus Rubeola, virus Vaccinia (Viruela), Virus de Fiebre Amarilla

Antígenos de superficie bacterial o partes de bacterias: Bordetella pertussis, Helicobacter pilori, Clostridium tetani, Corinebacterium difteria, Escericia coli, Haemofilus influenza, especies Klebsiella, neumofila Legionela, Micobacterium bovis, Micobacterium lepra, Micobacterium tuberculosis, gonorrea Neiseria, meningitis Neiseria, especies Proteus, Seudomonas eruginosa, especies Salmonela, especies Sigella, Estafilococus aureus, Estreptococus piogenes, cólera Vibrio, Yersinia pestis

Antígenos de superficie de parásitos que provocan enfermedades o partes de parásitos: Plasmodium vivax-malaria, Plasmodium falciparum-malaria, Plasmodium ovale-malaria, Plasmodium malaria-malaria, Leismania trópica-
Leismaniasis, Leismania donovani-leismaniasis, Leismania branciliensis-leismaniasis, Tripanosoma rodescense-
enfermedad del sueño, Tripanosoma gambiense-enfermedad del sueño, Tripanosoma cruzi-enfermedad de Chagas, Esquistosoma mansoni-esquistosomiasis, Esquistosoma haematobium-esquistosomiasis, Esquistosoma japonicum-
esquistosomiasis, Triquinela espirales-triquinosis, Estrongliloides duodenal-anquilostomiasis, Anquilostoma duode-nal-anquilostomiasis, Necator americanus-anquilostomiasis, Vuceria bancrofti-filariasis, Brugia malaya-filariasis, Loa loa-filariasis, Dipetalonema perstaris-filariasis, Dracuncula medinensis-filariasis, Oncocerca volvulus-filariasis

Inmunoglobulinas: IgG, IgA, IgM, inmunoglobulina Antirábica, inmunoglobulina Antivacunas

Antitoxinas: antitoxina de Botulinum, antitoxina de difteria, antitoxina de gangrena gaseosa, antitoxina de tétanos.

Entre otros péptidos o proteínas que se pueden encapsular se incluyen antígenos que elicitan respuesta inmune contra la Fiebre Aftosa, hormonas y factores de crecimiento tales como hormonas estimuladoras de folículos, prolactina, angiogenina, factor de crecimiento epidérmico, calcitonina, eritropoyetina, hormona de liberación tirotrópica, insulina, hormonas de crecimiento, factores de crecimiento 1 y 2 similares a insulina, factor de crecimiento esquelético, gonadotropina coriónica humana, hormona luteinizante, factor de crecimiento nervioso, hormona adrenocorticotrópica (ACTH), hormona liberadora de hormonas luteinizantes (LHRH), hormona paratiroide (PTH), hormona liberadora de tirotropina (TRH), vasopresina, colecistoquinina, y hormona liberadora de corticotropina; citoquinas, tales como interferones, interleuquinas, factores simuladores de colonias, y factores de necrosis tumural; encimas fibrinolíticas, tales como uroquinasa, activador plasminógeno del riñón; y factores de coagulación, tales como Proteína C, Factor VIII, Factor IX, Factor VII, y Antitrombina III. Se incluyen entre los ejemplos de otras proteínas o péptidos que se pueden encapsular la albúmina, factor natriurético atrial, renina, superóxido dismutaso, \alpha_{1}-antitripsina, proteínas tensoactivas de pulmón, bacitracina, bestatina, cidosporina, péptidos delta inductores del sueño (DSIP), endorfinas, glucagón, gramicidina, factores inhibidores de melanocitos, neurotensina, oxitocina, somostatina, terprótido, factor tímido del suero, timosina, DDAVP, dermorfina, Met-encefalina, péptidoglicano, satietina, timopentina, producto de degradación de fibrina, des-encefalina-\alpha-endorfina, hormona liberadora de gonadotropina, leuprolida, \alpha-MSH, y metquefamida.

Cuando una proteína con un peso molecular superior a 10.000 está contenida en la matriz de polialquilén glicol/poliéster aromático, el componente de polialquilén glicol del copolímero puede tener una peso molecular comprendido aproximadamente entre 1.000 y 20.000. El polialquilén glicol tereftalato puede encontrarse presente en el copolímero en una cantidad de 30% en peso a 90% en peso del copolímero, preferentemente de 60% en peso a 70% en peso. El polibutilén tereftalato se puede encontrar presente en el copolímero en una cantidad de 10% a 70% del peso del copolímero, preferentemente de 30% en peso a 40% en peso.

Cuando la matriz del copolímero contiene una proteína, la matriz puede incluir también un antioxidante hirdrofílico. Se incluyen entre los ejemplos de antioxidantes hidrofílicos: hidroxifenilcarbonil, hidroxibenzofuranilcarbonil y derivados de hidroxicromanilcarbonil de polialquilén glicol, por ejemplo, con una de las siguientes fórmulas:

X^{1}-Q-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-R^{2},

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X^{1}-Q-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-R^{3}-Q-X^{2}

Cada uno de X^{1} y X^{2} es seleccionado independientemente, por ejemplo, entre los grupos siguientes:

1

Cada uno de R^{1} es independientemente seleccionado entre hidrógeno y grupos alquilo que tienen de 1 a 4 átomos de carbono, preferentemente metilo. n tiene valores de 1 a 100, preferentemente de 4 a 22. R^{2} es un grupo alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, preferentemente 1 ó 2 átomos de carbono y R^{3} es un grupo alquileno que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, preferentemente 1 ó 2 átomos de carbono. El indicativo x es un número de 0 a 4.

En una realización, por lo menos una, y preferentemente dos, de las fracciones R^{1}de la estructura de hidroxifenil(alquil)carbonilo es una fracción ter-butilo. Cuando dos de las fracciones R^{1} son fracciones de ter-butilo, cada una de las fracciones ter-butilo es preferentemente adyacente al grupo -OH. En otra realización, el antioxidante hidrofílico es N-(metil-polioxietileno)-6-hidroxi-2,5,8-trimetil-croman-2-carboxamida, en el que poli tiene el significado 21 ó 22.

El antioxidante o antioxidantes hidrofílicos se pueden encontrar presentes en la matriz en una cantidad de 0,1% en peso a 10% en peso con respecto al peso total de la matriz, preferentemente de 1,0% en peso a 5,0% en peso.

Los antioxidantes hidrofílicos proporcionan en general una proporción de degradación incrementada del copolímero de polieteréster. La degradación incrementada del copolímero de polieteréster, no obstante, no se ve acompañada por un incremento en la formación de ácido. Por lo tanto, la utilización de dichos antioxidantes hidrofílicos en la matriz es aplicable particularmente a la encapsulación de moléculas de péptidos o de proteínas por la matriz. Por lo tanto, cuando la proteína o molécula de péptido es liberada de la matriz en la degradación de la misma, la proteína no será desnaturalizada por productos de degradación ácida. Por lo tanto, se puede utilizar un antioxidante hidrofílico a efectos de conseguir una proporción incrementada de liberación de moléculas de péptido o de proteína de la matriz, evitando simultáneamente la desnaturalización del péptido o proteína. A continuación, se hará referencia al polímero PEGT/PBT (polietilén glicol tereftalato/poli(butilén tereftalato) a título de ejemplo, pero lo mismo se puede aplicar mutatis mutandis a otros copolímeros de poliéter/éster definidos anteriormente.

La proporción de degradación del copolímero PEGT/PBT puede también ser incrementada, en caso deseado, substituyendo parcialmente el tereftalato con succinato y/o substituyendo parcialmente el butileno con dioxietileno en las cantidades que se han descrito anteriormente.

Si se desea incrementar la proporción de difusión de la proteína que tiene un peso molecular superior a 10.000 a través del copolímero PEGT/PBT, se puede añadir polietilén glicol con un peso molecular de 4.000 a 10.000 al copolímero PEGT/PBT. Este polietilén glicol puede encontrarse presente en una cantidad que llega a 10% en peso, basado en el peso del copolímero PEGT/PBT.

Además, la proporción de difusión de la proteína se puede incrementar al aumentar el peso del componente del polietilén glicol del copolímero PEGT/PBT. Por ejemplo, cuando el componente de polietilén glicol del copolímero PEGT/PBT tiene un peso molecular de 6.000 a 20.000, se pueden formar poros hidrofílicos en la matriz, proporcionando dichos poros una proporción de difusión incrementada.

Cuando la matriz de PEGT/PBT comprende un péptido o proteína que tiene un peso molecular inferior a 10.000, el polietilén glicol tiene preferentemente un peso molecular de 200 a 6.000. El polietilén glicol tereftalato se puede encontrar presente en el copolímero en una cantidad de 30% en peso a 80% en peso, basado en el peso del copolímero. El polibutilén tereftalato puede encontrarse presente en el copolímero en una cantidad comprendida entre 20% en peso y 70% en peso, basado en el peso del copolímero.

La matriz de PEGT/PBT puede incluir un antioxidante hidrofóbico, molécula hidrofóbica y/o un antioxidante hidrofílico en las cantidades que se han descrito anteriormente. El tipo y cantidad exacta de antioxidante o molécula hidrofóbica utilizada depende del peso molecular de la proteína. Si el copolímero de matriz PEGT/PBT comprende un péptido que tiene un peso molecular bajo (tal como, por ejemplo, menos de 500), el copolímero de PEGT/PBT puede incluir un antioxidante hidrofóbico y/o una molécula hidrofóbica tal como se ha descrito anteriormente. Si la matriz del copolímero PEGT/PBT contiene un péptido o proteína grande (tal como, por ejemplo, insulina), la matriz puede comprender también un antioxidante hidrofílico tal como los descritos anteriormente y en las cantidades que se han descrito, y puede también incluir polietilén glicol con un peso molecular de 1.000 a 4.000, en una cantidad de 1% en peso a 10% en peso, basado en el peso del copolímero.

En caso deseado, la proporción de degradación del copolímero PEGT/PBT se puede incrementar al substituir parcialmente el tereftalato por succionato y/o substituyendo parcialmente el butileno con dioxietileno, en las cantidades anteriormente descritas.

El copolímero de polieteréster, tal como copolímero de PEGT/PBT, con o sin un antioxidante o antioxidantes, o una molécula hidrofóbica, o polietilén glicol, se forma en estructuras conformadas que contienen un agente biológicamente activo, tal como un medicamento o una proteína tal como se ha descrito anteriormente. En general, las estructuras conformadas pueden ser, por ejemplo, microesferas, varillas, pastillas, láminas, hilos, etc. dependiendo de la forma de administración deseada del medicamento o proteína. Las microesferas son partículas esféricas finas que tienen un diámetro que llega a 1.000 \mum, y que contienen un agente biológicamente activo. La microesfera puede ser una microesfera homogénea o monolítica en la que el agente biológicamente activo se disuelve o se dispersa a través de la matriz de polímero. En otra realización, la microesfera puede ser de tipo recipiente en la que el agente biológicamente activo está rodeado por el polímero en estado mononuclear o polinuclear. En otra realización, cuando el agente biológicamente activo es un medicamento hidrofílico de talla pequeña, el medicamento puede ser dispersado en primer lugar en un excipiente hidrofóbico o lipofílico, cuya combinación se dispersa a continuación en forma de partículas, gotas o microsuspensiones en la matriz de polieteréster. A continuación, las microesferas pueden ser formadas a partir de la emulsión.

Las microesferas pueden ser preparadas por técnicas conocidas por los técnicos en la materia, incluyendo evaporación de disolvente y técnicas de secado en pulverización. En una realización, una técnica de evaporación de disolvente, el polieteréster es situado en un disolvente orgánico tal como cloruro de metileno, y se utiliza alcohol polivinílico como agente emulsificante. El diámetro medio de partículas y el tamaño de las partículas dependen de las viscosidad o concentración de la fase de alcohol polivinílico acuoso. Otros parámetros, tales como la concentración de la solución de polieteréster y la velocidad de agitación, tienen también un cierto efecto en la distribución y tamaño de las partículas. La concentración de la solución de polieteréster determina la porosidad de las microesferas. Para concentraciones de polieteréster más elevadas, tales como, por ejemplo, 20%, se obtienen microesferas densas y lisas. Para concentraciones menores de polieteréster, tales como, por ejemplo, 5%, se obtienen microesferas porosas.

Cuando se forman microesferas por un proceso de secado por pulverización, se utiliza una concentración baja de copolímero de polieteréster, de 0,5% a 5,0%, preferentemente 2%, en el disolvente orgánico, tal como, cloruro de metileno. El secado por pulverización tiene como resultado general la producción de partículas porosas conformadas irregularmente.

También, se pueden preparar láminas, hojas y similares por métodos conocidos, tales como moldeo.

Al conformar las formas de administración, un agente biológicamente activo se encapsula en la matriz. En general, cuando se utiliza la técnica de evaporación de disolvente, una solución acuosa del agente es emulsionada en primer lugar en una solución del polieteréster en un disolvente orgánico, tal como cloruro de metileno. La emulsión es emulsionada a continuación en una solución acuosa de alcohol polivinílico, que proporciona una emulsión de agua-en aceite-en agua. El disolvente orgánico, tal como cloruro de metileno, es evaporado a continuación consiguiendo las microesferas. Cuando se utiliza la técnica de secado por pulverización, una solución acuosa del agente es emulsionada en una solución del polieteréster en un disolvente orgánico, tal como cloruro de metileno, tal como se ha descrito anteriormente. La emulsión de agua en aceite es secada a continuación por pulverización utilizando un secador de pulverización.

Las formas de administración conformadas pueden ser administradas por una serie de medios conocidos por los técnicos en la materia, incluyendo administración parenteral y mucosal, tal como administración oral (por ejemplo, administración bucal), administración subcutánea, administración intravenosa, administración intra-arterial, administración intraperitoneal, administración intramuscular, administración vaginal, y administración rectal. También se pueden administrar por vía tópica microesferas, bloques, películas y cintas. Los polieterésteres son compatibles con una amplia variedad de agentes biológicamente activos, y por lo tanto impiden la desnaturalización de dichos agentes hasta que éstos son suministrados a las células, tejidos u órganos deseados. Se incluyen entre los ejemplos de portadores farmacéuticos que puedan ser utilizados, geles incluyendo geles de ácido hialúronico y geles polisacáridos macromoleculares, cremas y ungüentos.

Por ejemplo, las microesferas pueden quedar contenidas en un gel, crema o ungüento y, en caso deseado, pueden estar cubiertas por un agente barrera, cuando se administran por vía tópica. Por lo tanto, las composiciones pueden contener uno o varios agentes biológicamente activos utilizados en el tratamiento de enfermedades de la piel, tales como soriasis, eczema, seborrea y dermatitis. En otra realización, las composiciones pueden quedar contenidas en un gel tal como un gel de ácido hialurónico o un gel polisacárido macromolecular. Esta realización es aplicable particularmente a aplicaciones parenterales, tales como durante y después de la cirugía. Cuando se administran por inyección, las microesferas pueden estar contenidas en un portador farmacéutico tal como agua, solución salina (por ejemplo, solución salina al 0,9%), o una solución que contiene un tensoactivo en una cantidad comprendida desde el 0,1% peso/volumen a 0,5% peso/volumen. Se incluye entre los ejemplos de los tensoactivos que se pueden realizar, sin que ello sirva de limitación, tensoactivo Tween 80. En otra realización, las microesferas pueden estar contenidas en una cápsula dotada de un recubrimiento protector gástrico, tal como, por ejemplo, copolímeros de metacrilato Eudragit®.

En general, las microesferas tienen unas dimensiones de hasta 1.000 micras, preferentemente de 1 micra a 500 micras. Las dimensiones de las microesferas pueden depender de una serie de factores, incluyendo el método de formación de las microesferas y la ruta de administración de las microesferas después de su formación.

Cuando se administran por vía oral, las microesferas tienen en general dimensiones de 0,1 a 1.000 micras. Cuando se desea suministrar las microesferas a los parches de Peyer, las microesferas pueden tener un diámetro desde 1 micra a 10 micras, más preferentemente de 1 micra a 5 micras. El copolímero de polieteréster protege el agente biológicamente activo al impedir la desnaturalización del agente biológicamente activo hasta que dicho agente biológicamente activo alcanza la célula, tejido u órgano deseado.

Por ejemplo, esta realización es aplicable particularmente al suministro oral de moléculas de péptidos o proteínas (incluyendo péptidos o proteínas inmunogénicos), de manera que las microesferas que comprenden el péptido o proteína se desplazan por el tracto gastrointestinal para el suministro a los parches de Peyer situados en el íleon o parte baja del intestino. No obstante, los péptidos y proteínas son altamente susceptibles de degradación o desnaturalización en el tracto gastrointestinal. El copolímero de polieteréster, que es compatible con moléculas de péptido y proteínas, protege el péptido o la proteína contra la degradación o desnaturalización en el tracto gastrointestinal hasta que las microesferas suministren al péptido o proteína a los parches de Peyer. Por lo tanto, las microesferas de la presente invención pueden ser utilizadas como parte de un compuesto farmacéutico para administración oral de péptidos o proteínas biológicamente activos a los parches de Peyer.

En una realización, las microesferas pueden incluir un péptido o proteína inmunogénica y por lo tanto se pueden utilizar en una vacuna administrada por vía oral. El copolímero de polieteréster protege la proteína o péptido inmunogénico al desplazarse éste por el tracto gastrointestinal, hasta que las microesferas suministran la proteína o péptido inmunogénico a los parches de Peyer. Una vez que el péptido o proteína inmunogénicos son subministrados en los parches de Peyer, se genera una respuesta inmune contra el péptido o proteína.

Cuando se administra mediante inyección, las microesferas tienen dimensiones de 1 micra a 30 micras, preferentemente de 10 micras a 20 micras. Dichas microesferas, cuando se administran en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable, pueden ser utilizadas en el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades o desórdenes, dependiendo del material biológicamente activo encapsulado. Por lo tanto, las formulaciones inyectables incluyendo microesferas de la presente invención pueden ser utilizadas en el tratamiento de enfermedades confinadas localmente tales como artritis, reumatismo, inflamaciones, procesos dolorosos locales, infecciones locales, infecciones locales de la piel, tumores (o en sus localizaciones después de eliminación quirúrgica como tratamiento post-operatorio para destruir cualesquiera células tumorales restantes), y en enfermedades locales del cerebro (por ejemplo, enfermedad de Parkinson). Estas formulaciones inyectables pueden ser utilizadas también en tratamientos terapéuticos a largo plazo, tales como, por ejemplo, tratamientos con corticosteroides, andrógenos, anti-andrógenos, estrógenos, anti-estrógenos, agentes progestangénicos u hormonas del tiroides, o con medicamentos anti-tuberculosis, anti-lepra o anti-malaria.

Se pueden preparar hilos que comprenden el polieteréster con compuestos activos por métodos conocidos y se pueden utilizar como suturas quirúrgicas que contienen compuestos activos. Se pueden implantar bloques (porosos o no porosos), partículas y gránulos, por ejemplo, con tratamientos de restauración o mejora de huesos, y elementos laminares o películas se pueden utilizar, por ejemplo, en barreras implantables, membranas guiadas para la regeneración de tejidos y también en emplastos.

Los compuestos de la presente invención muestran sorprendentemente modelos de liberación ampliamente o completamente de orden cero, es decir, una proporción de liberación que es independiente del tiempo o de la cantidad liberada. Los compuestos proporcionan una liberación ajustable exacta y predictible del agente activo del compuesto, tal como se ha mostrado en los ejemplos. La presente invención también da a conocer un método para el cálculo de la proporción de liberación del compuesto PEGT/PBT como función del copolímero específico y del agente activo específico (ver Ejemplo 6).

Ejemplo 1

En este ejemplo, se sintetizaron copolímeros de poli (óxido de etileno) tereftalato/poli (1,4-butileno) tereftalato (PEGT/PBT), de manera que dichos copolímeros tenían proporciones en peso de PEGT/PBT de 80/20, 70/30 y 60/40. Estos copolímeros reciben en algunos casos la designación en la descripción siguiente como PoliActivos, o PA. El componente de polietilén glicol de copolímeros PA 70/30 y PA 60/40 tenía un peso molecular de 1.000. Para los copolímeros PA 80/20, se prepararon lotes con componente de polietilén glicol con pesos moleculares de 1.000, 2.000 y 4.000.

Se obtuvo el toxoide de difteria (peso molecular 62.000) del Netherlands National Institute of Public Health and Environmental Protection, Bilthoven, NL (2025 LF/ml; 1 LF corresponde a unos 4\mug de proteína). El término "LF" significa floculación de pozos, Unidad Internacional para vacunas.

El alcohol polivinílico (PVA, 87-89% hidrolizado; peso molecular 13.000-23.000) fue obtenido de Aldrich, BE. La albúmina de suero bovino (BSA, fracción V) fue obtenido de la firma Acros, Geel, BE. La lisocima (clara de huevo) fue obtenida de la firma Sigma y IgG (inmunoglobulina G, fracción II) fue obtenida de la firma ICN Biomedicals, Zoetermeer, NL.

Se obtuvo Poli(DL-Lactida/glicólido) 50/50 peso/peso (número de lote DL260AM), con viscosidad intrínseca 0,58 dl/g, peso molecular relativo a poliestireno era de 50 kD, obteniéndose de la firma Purac, Gorinchem, NL. Este polímero recibe la designación en algunos casos en esta descripción de "PLGA".

Preparación de microesferas PEGT/PBT

Para la preparación de microesferas PEGT/PBT, se utilizaron dos métodos, es decir, el método de evaporación de disolvente y el método de secado por pulverización. La preparación de microesferas PEGT/PBT utilizando el método de evaporación de disolvente se basó en protocolos utilizados para preparar microesferas de PLGA tal como se da a conocer por O'Hagan, y otros, Intern. J. Pharmaceutics, Vol. 1033, 37-45 (1994). En general, se disolvió PEGT/PBT en 20 ml CH_{2}Cl_{2} (concentración comprendida entre 5-20% (peso/volumen)). Esta solución fue añadida a una solución acuosa de PVA (concentración 1-10%). Después de agitación (agitador mecánico, 1200 rpm), se formó una emulsión de aceite en agua. Debido a la evaporación de CH_{2}Cl_{2}, el PEGT/PBT precipitó de la solución dando lugar a microesferas. Después de dos horas (tiempo necesario para una evaporación casi completa del CH_{2}Cl_{2}), las microesferas de PEGT/PBT formadas fueron recogidas por centrifugación, lavadas con agua (3 veces) y finalmente secadas al aire.

Para la preparación de microesferas cargadas con proteína, se creó en primer lugar una emulsión de agua en aceite. La proteína fue disuelta en agua hasta una concentración de 170 mg/ml para BSA, 100 mg/ml para lisocima y 2025 LF/ml para toxoide de difteria y 0,5 ml de la solución de proteína fueron añadidos a 20 ml de PoliActivo en CH_{2}Cl_{2}. Esta mezcla fue homogeneizada utilizando un Ultraturrax (Tipo 18/10, tiempo de emulsión: 10 segundos), dando lugar a una emulsión de agua en aceite que fue añadida a 200 ml de una solución acuosa de PVA y tratada posteriormente tal como se ha descrito en lo anterior.

Para la preparación de microesferas de PEGT/PBT utilizando el método de secado por pulverización, el polímero fue disuelto en un disolvente orgánico volátil adecuado (1 gramo de PoliActivo disuelto en 50 ml de CH_{2}Cl_{2}). Esta solución fue secada por pulverización utilizando un Secador de Pulverización Buchi con una temperatura de entrada de 42ºC; la temperatura de salida de 38ºC; y un caudal de 5 ml/minuto.

Para la preparación de las microesferas cargadas de proteínas, se formó en primer lugar una emulsión de agua en aceite, tal como se ha descrito anteriormente, con respecto a la técnica de evaporación de disolvente que fue secada por pulverización, tal como se ha descrito anteriormente.

Preparación de microesferas PLGA

Las microesferas de PLGA fueron obtenidas por la técnica de evaporación de disolvente y la técnica de secado por pulverización tal como se describe para las microesferas PEGT/PBT.

Caracterización de las microesferas

El tamaño de partículas (peso en número y peso en volumen) y la distribución de tamaños de partículas se determinaron por una técnica de bloqueo de luz láser (Accusizer®, modelo 770, Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA, USA). La forma y características de la superficie (porosidad) de las microesferas se establecieron por análisis con microscopio electrónico de exploración.

Determinación de proteínas

La concentración de proteínas (BSA, lisocima) de las muestras se midió con un ensayo de proteínas Biorad utilizando el proceso de micro ensayo descrito en Bradford, Anal.Biochem., Vol. 72, pgs. 248-254 (1976). El toxoide de difteria fue determinado utilizando un ensayo inmunoabsorbente relacionado con enzimas (ELISA).

Determinaciones de peso molecular

Los pesos moleculares (M_{n} y M_{w}) de PEGT/PBT y PLGA fueron determinados por cromatografía de permeación de gel (GPC). Para PLGA, se utilizaron columnas Shodex y CHCl_{3} fue la fase móvil. Las columnas fueron calibradas utilizando estándares de poliestireno de pesos moleculares conocidos.

Determinación del contenido de \alpha-tocoferol de las microesferas

Los materiales de PEGT/PBT antes descritos contienen también 0,5% de un antioxidante adecuado (\alpha-tocoferol). La cantidad de antioxidante presente después de la preparación de las microesferas se determinó utilizando análisis HPLC.

Eficacia del encapsulado de proteínas

Se determinó la eficacia del encapsulado de la albúmina sérica bovina (BSA) por disolución de una parte alícuota de las microesferas cargadas con proteínas (\pm25 mg) en CH_{2}Cl_{2} (0,5 ml). Esta solución fue extraída de 5 a 10 veces con agua (0,5 ml). La concentración de proteína de los extractos fue determinada utilizando el ensayo Biorad. De la cantidad de proteína extraída, se calculó el rendimiento del encapsulado. Como control, se determinaron la concentración de proteína del alcohol polivinílico y las soluciones de lavado.

Se determinó el rendimiento de encapsulado del toxoide de difteria determinando la cantidad de proteína en la solución de alcohol polivinílico y las diferentes soluciones de lavado.

Liberación en vitro de proteínas procedentes de microesferas

Un peso conocido de las microesferas (\pm100 mg) fue colocado en un tubo Eppendorf y se añadió 1 ml de tampón (PBS conteniendo 0,02% NaN_{3}). Los tubos fueron cerrados y sometidos a rotación a 37ºC. A intervalos de tiempo seleccionados, las microesferas fueron centifrugadas, el sobrenadante fue eliminado, la pastilla resuspendida en 1 ml de solución tampón y centifrugado nuevamente. El sobrenadante fue añadido al primer sobrenadante y la concentración de la proteína en la muestra recogida fue determinada utilizando el ensayo de proteína Biorad.

Envejecimiento de PEGT/PBT y microesferas PLGA

Se sometieron a envejecimiento PEGT/PBT y microesferas PLGA a 37ºC y a una humedad de 0% y 100%, respectivamente. Los pesos moleculares de los polímeros se determinaron por GPC y se establecieron como función del tiempo de envejecimiento.

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Resultados Preparación de microesferas por la técnica de evaporación de disolvente

33 lotes de PoliActivo (PEGT/PBT ó PA) y microesferas PLGA fueron preparados mediante la técnica de evaporación de disolvente. Las características de dichos lotes de microesferas se indican en la siguiente Tabla I.

TABLA I Características de microesferas PA/PLGA preparadas por la técnica de evaporación de disolvente

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El rendimiento en microesferas (definido como masa de las microesferas/masa del polímero utilizado para la preparación de microesferas) era normalmente de 80%. La figura 1 proporciona un ejemplo representativo de la distribución de tamaños de partículas de las microesferas obtenidas (lote 6, PA 70/30, 5% en CH_{2}Cl_{2}, 10% PVA) determinado utilizando el Accusizer.

La distribución de tamaños obtenida es bastante normal para microesferas preparadas mediante la técnica de evaporación de disolvente. El lote mostrado en la figura 1 tiene un peso medio en número de 6,0 \mum y un peso medio en volumen de 9,4 \mum; 95% de las partículas tienen un diámetro comprendido entre 5 y 17 \mum.

El efecto de la concentración de PEGT/PBT y la concentración de PVA en la distribución de tamaños de partículas fue investigado. La figura 2 muestra el efecto de la concentración de PVA sobre el tamaño (distribución) de las microesferas 70/30 PEGT/PBT. De esta figura se puede apreciar que una concentración creciente de PVA proporcionaba partículas más pequeñas con una distribución más pequeña. Una viscosidad más elevada (debido a una mayor concentración de PVA) de la fase externa proporcionará gotitas más pequeñas del polímero emulsionado y finalmente, después de la evaporación del disolvente, partículas de tamaño más pequeño de PEGT/PBT. De modo interesante, una concentración más elevada de PVA da también como resultado una distribución de tamaños de partículas más estrecha (proporción del promedio de peso por volumen y promedio de peso por número resulta menor para una concentración mayor de PVA).

Mientras el PVA tiene un efecto substancial en las dimensiones de partículas, el efecto de la concentración de 70/30 PEGT/PBT en las dimensiones de partículas y en la distribución de tamaños de partículas es menos pronunciado (figura 3). Además, no se observó ningún efecto importante de la velocidad de agitación sobre las dimensiones de las partículas.

Se puede llegar a la conclusión de que la mejor manera de controlar y adecuar el tamaño de partículas de las microesferas PEGT/PBT es la concentración de PVA de la fase externa.

Por mediciones GPC se demostró que el peso molecular de PEGT/PBT de las microesferas obtenidas no era significativamente distinto del polímero utilizado para la preparación de las microesferas. Esto demuestra que durante la preparación, lavado y secado no tiene lugar degradación (hidrólisis) alguna del polímero.

Se determinó la cantidad de antioxidante en dos lotes de microesferas distintos (lote 7 (PEGT/PBT 70/30) y lote 14 (PEGT/PBT 60/40)). No se observó disminución de \alpha-tocoferol, que se puede atribuir a la solubilidad muy baja de este compuesto en agua. El antioxidante puede inhibir la degradación oxidante de PA durante estudios de liberación in vitro, siendo la hidrólisis la ruta de degradación predominante.

También se prepararon por la técnica de evaporación de disolvente descrita en lo anterior, las siguientes microesferas:

Microesfera A

(i) 89% en peso de una mezcla de 99% en peso de copolímero 50/50 PEGT/PBT, en el que el polietilenglicol tiene un peso molecular de 300 y 1% en peso de \alpha-tocoferol;

(ii) 2% en peso de ácido 1-ascórbico-6-palmitato;

(iii) 4% en peso de colesterol; y

(iv) 5% en peso de péptido de encefalina.

Microesfera B

(i) 85% en peso de una mezcla de 98,5% en peso de copolímero 70/30 PEGT/PBT, en el que el polietilenglicol tiene un peso molecular de 2.000, y 1,5% en peso del antioxidante Trolox-NH-PEG 1.000-OCH_{3}

(ii) 5% en peso de polietilenglicol con un peso molecular de 2.000; y

(iii) 10% en peso de insulina.

Se describe la síntesis de Trolox-NH-PEG 1.000-OCH_{3} en el Ejemplo 3.

Preparación de microesferas mediante la técnica de secado por pulverización

Se ha publicado en la literatura la preparación de las microesferas PLGA utilizando la técnica de secado con pulverización (Gander, y otros, Microencapsulation, Vol. 12, 83-97 (1995)). Se ha demostrado que las microesferas PolyActive podían ser también preparadas por la técnica de secado por pulverización. Como contraste con la técnica de evaporación de disolvente, se pueden utilizar solamente bajas concentraciones de PEGT/PBT en CH_{2}Cl_{2} (2%) para preparar microesferas, a causa de las elevadas concentraciones formadas de fibras de PEGT/PBT. Las características de las microesferas de PEGT/PBT preparadas mediante la técnica de secado por pulverización se indican en la Tabla II.

TABLA II Características de las microesferas de Polyactive (PA)/PLGA preparadas por la técnica de secado por pulverización

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La distribución de tamaños de partículas para las microesferas PEGT/PBT preparadas mediante la técnica de secado por pulverización es substancialmente más amplia en comparación con las microesferas PLGA secadas por pulverización. Éste es especialmente el caso para las microesferas de PEGT/PBT cargadas con proteínas.

Rendimiento del encapsulado de proteína

El rendimiento de encapsulado de BSA se pudo determinar disolviendo una parte alícuota de las microesferas en un disolvente adecuado (CH_{2}Cl_{2}) seguido de extracción con agua. Utilizando este procedimiento se extrajo BSA casi cuantitativamente. Este procedimiento fue validado por extracción de una solución de PLGA en CH_{2}Cl_{2} conteniendo una cantidad conocida de BSA.

Resulta que el rendimiento de encapsulado en microesferas de PEGT/PBT era elevado (50-100%, Tabla I) y difícilmente dependiente de los parámetros del proceso. La concentración de proteína en la fase PVA y las diferentes soluciones de lavado se determinan también a efectos de establecer el equilibrio de masas. La Tabla III resume los resultados.

TABLA III Rendimiento de encapsulado de BSA en PolyActive y en microesferas de PLGA

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De esta tabla resulta evidente que el equilibrio de masas (% de recuperación) es bueno, excepto para 2 formulaciones. La recuperación baja para el lote 18 y el lote 20 se pueden atribuir probablemente a la baja recuperación de las microesferas (ver tabla I).

Se conoce por la literatura que el rendimiento de encapsulado de proteínas en PLGA (y otras matrices) depende notablemente de la estabilidad de la emulsión de agua en aceite. Evidentemente, esto queda asegurado por la utilización del Ultraturrax tal como se ha descrito anteriormente. El rendimiento de encapsulado de toxoide de difteria se determinó, por lo tanto, a partir de las concentraciones de toxoide de difteria en la fase externa de PVA y en las diferentes soluciones de lavado. Se demostró que la cantidad de toxina de difteria en estas soluciones era menor de 15% (rendimiento de encapsulado superior a 85%), excepto para PEGT/PBT 70/30 (10%) y los lotes de microesferas de PLGA (10%).

Análisis al microscopio electrónico de exploración

Se utilizó SEM para evaluar las dimensiones y características superficiales (porosidad) de las microesferas. Se observaron las siguientes tendencias:

Las microesferas preparadas utilizando la técnica de evaporación de disolvente son perfectamente esféricas. Esto es especialmente cierto para microesferas que fueron preparadas utilizando una elevada concentración de PolyActive en CH_{2}Cl_{2}. Las microesferas preparadas utilizando la técnica de secado en pulverización no tienen una forma perfectamente redonda según observación para las partículas de evaporación de disolvente. En las microesferas cargadas con proteínas se pueden observar poros en algunos casos. Estos poros podrían contribuir a la rotura de las proteínas observada en algunos casos, siendo relacionados con la misma.

Liberación de BSA a partir de PA y microesferas PLGA

La liberación de BSA a partir de PA y microesferas PLGA preparadas por la técnica de evaporación de disolvente y de un lote (PLGA) preparado por la técnica de secado por pulverización fue evaluada. La liberación de BSA de las microesferas de PA 60/40, PA 70/30 y PLGA durante un período de 150 días queda indicada en las figuras 4, 5 y 6. Los resultados se resumen en la siguiente tabla IV.

TABLA IV Liberación de BSA a partir de PA y microesferas PLGA

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De las figuras 4, 5 y 6 y la tabla IV, aparece que la liberación de BSA de microesferas PEGT/PBT está asociada con un efecto de reventamiento muy pequeño (máximo 10%). Después de la liberación por reventamiento se observó una liberación continuada de BSA. La liberación lenta (continuada) de BSA a partir de PEGT/PBT 70/30 y de las microesferas 60/40 es debido probablemente a la difusión de BSA a través de la matriz (homogénea). Además, esta liberación fue más pronunciada para las microesferas más hidrofílicas. (PEGT/PBT 70/30; 9-21 \mug BSA/g ms.día) en comparación con las microesferas más hidrofóbicas 60/40 (5 \mug BSA/g ms.día), indicando que la capacidad de difusión de BSA es superior en la matriz PEGT/PBT 70/30 que en la matriz 60/40. Esto se puede atribuir al mayor contenido de agua en equilibrio de las microesferas PEGT/PBT 70/30 en comparación con las microesferas PEGT/PBT 60/40. También se observa que durante el tiempo de liberación (150 días) probablemente no ocurre ninguna degradación substancial de la matriz. También en este caso, en ambientes oxidantes la degradación es más rápida que en PBS, lo cual puede tener un efecto pronunciado en la liberación in vivo de BSA a partir de microesferas PEGT/PBT.

En contraste con las microesferas de PEGT/PBT, 2 de cada 3 microesferas de PLGA mostraron una liberación por reventamiento pronunciada (figura 6). Especialmente las microesferas secadas por pulverización (abreviado: SD) y las microesferas preparadas utilizando una concentración baja de PLGA (5%) mostraron esta liberación elevada por reventamiento, que se puede atribuir al carácter poroso de las partículas. Por otra parte, las microesferas de PLGA preparadas utilizando elevadas concentraciones de PLGA mostraron una liberación por reventamiento marginal. Además, este lote demostró una liberación pulsante de BSA encapsulado entre 60 y 80 días. Los impulsos corresponden al tiempo de degradación (disolución) de estas microesferas. No obstante, es notable que el porcentaje de liberación BSA no alcanzó 100%. Una parte de la proteína puede ser desnaturalizada (precipitada) debido al bajo pH generado en las microesferas en degradación.

Liberación del toxoide de difteria a partir de PA y microesferas de PLGA

La figura 7 muestra un ejemplo representativo de la liberación del toxoide de difteria de PEGT/PBT 70/30 y de las microesferas 60/40. La liberación fue seguida durante un período de 10 semanas. En general, se observó una liberación por reventamiento seguida de liberación continuada del día 1 al día 20, después de la cual se observó una liberación muy baja del toxoide de difteria para los siguientes 50 días. La tabla V resume los resultados.

TABLA V Liberación de toxoide de difteria de microesferas de PEGT/PBT

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Teniendo en consideración que aproximadamente 200 LF toxoides de difteria por gramo de microesferas fueron encapsulados, se demuestra que la liberación por reventamiento del toxoide de difteria de las microesferas de PEGT/PBT preparadas por la técnica de evaporación de disolvente es relativamente baja. Después de la liberación por reventamiento, las partículas de PEGT/PBT mostraron una liberación gradual hasta 70 días después del inicio del experimento de liberación.

En contraste a las microesferas preparadas por la técnica de evaporación de disolvente, las partículas preparadas por la técnica de secado por pulverización mostraron una liberación por reventamiento muy significativa (aproximadamente 50%) que se puede atribuir probablemente al carácter poroso de las partículas preparadas mediante esta técnica. Igual que las partículas de "evaporación de disolvente", las partículas secadas por pulverización mostraron una liberación gradual después de la liberación por reventamiento. La proporción de liberación (de los días 1-21 y 21-70) del toxoide de difteria era más elevada de las partículas secadas por pulverización que de las partículas de "evaporación de disolvente". Evidentemente, la liberación (después del reventamiento) de las partículas de "evaporación de disolvente" es determinada por la difusión del toxoide de difteria a través de la matriz de polímero homogéneo, mientras que la liberación de las partículas "secadas por pulverización" se determina también por la difusión de la proteína a través de los poros presentes en la matriz. En contraste con las microesferas de PLGA que contenían BSA (figura 6), para las microesferas de PLGA conteniendo toxoide de difteria no se observó liberación pulsante entre los días 60 a 80 (tiempo de disolución de las microesferas de PLGA). Esto puede ser provocado por la baja estabilidad del toxoide de difteria para pH bajo generado en la matriz de degradación.

La liberación del toxoide de difteria de las microesferas PEGT/PBT (80/20) (preparadas por técnica de evaporación de disolvente) fue seguida en un período de unos 600 días (figura 8).

Las microesferas preparadas a partir de una solución a un 5% de PEGT/PBT 80/20 en CH_{2}Cl_{2} mostraron una liberación substancial por reventamiento de 50-60% aproximadamente del toxoide de difteria encapsulado. Después de ello, tuvo lugar una liberación gradual de la proteína dentro de los siguientes 20 días. El 10% de microesferas de PEGT/PBT mostró una liberación por reventamiento (más pequeña) de 10-20% aproximadamente de la cantidad encapsulada de proteína, seguida de una liberación gradual hasta 200 días y por una liberación adicional empezando alrededor de los 400 días y terminando después de 550 días. El 20% de microesferas PEGT/PBT 80/20 mostró una liberación por reventamiento marginal (1-2%), seguido de una liberación gradual hasta 400 días después de la cual el toxoide de difteria encapsulado restante es liberado en un impulso. Para el 5% de microesferas de PEGT/PBT 80/20 no se observó impulso alguno después de 400 días. Esto se puede atribuir al carácter bastante poroso de las microesferas y/o al rendimiento de encapsulado bajo del toxoide de difteria en estas partículas.

Los perfiles de liberación observados se pueden explicar del modo siguiente. La liberación por reventamiento es debida a las proteínas presentes en la superficie o cerca de la misma de las microesferas y a la proteína presente en los poros. Una concentración creciente de PEGT/PBT (5-20%) resultó en microesferas con un carácter menos poroso y como consecuencia en una liberación reducida por reventamiento. La liberación gradual seguida después de la liberación por reventamiento es debida a la difusión de la proteína a través de la matriz (no porosa). La liberación que empieza a los 400 días aproximadamente se puede atribuir a la degradación de la matriz. La degradación fue asociada con un hinchamiento creciente de las microesferas (observación visual).

El perfil de liberación observado del toxoide de difteria a partir de microesferas PA 80/20 es muy interesante para el diseño de nuevas formulaciones de vacunas. Se puede prever que al mezclar toxoide de difteria que contiene microesferas con tiempo de degradación variable (disolución), se puede liberar el toxoide de difteria (antígenos en general) en múltiples impulsos, lo que se considera necesario para obtener una respuesta inmune de protección.

Cuando se supone que después de 600 días todo el toxoide de difteria encapsulado ha sido liberado, se puede hacer una estimación del rendimiento de encapsulado DT (Tabla VI).

De nuevo se demuestra que el rendimiento de encapsulado es bajo cuando se utiliza una solución diluída de PA (5%, peso/volumen) para el proceso de encapsulado.

TABLA VI Rendimiento de encapsulado del toxoide de difteria en microesferas PolyActive

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Liberación de lisocima a partir de microesferas de PEGT/PBT

El efecto del peso molecular del bloque de PEG de PolyActive se evaluó estudiando la liberación de proteína con un peso molecular relativamente bajo (lisocima, M-14,3 kD) a partir de microesferas de PA 80/20 con un peso molecular PEG variable (1.000, 2.000 y 4.000 g/mol). Se espera que una molécula de alto peso molecular del bloque de PEG resultará en dominios hidrofílicos PEG más grandes en la matriz de PEGT/PBT, lo que facilitará la difusión de la proteína encapsulada. La liberación inicial (hasta 17 días) ha sido objeto de medición. La figura 9 muestra la liberación de lisocima a partir de microesferas PA 80/20.

Se observa una liberación por reventamiento de lisocima a partir de microesferas de PEGT/PBT seguida de una liberación más gradual. Dado que la cantidad de encapsulado de proteína en las diferentes microesferas no es conocida, la liberación por reventamiento observada no se puede expresar en % de la carga de núcleo. Cuando se supone que el rendimiento de encapsulado es de 100%, la liberación por reventamiento es aproximadamente de 10, 20 y 40% para PEGT/PBT 80/20 (1000), PEGT/PBT 80/20 (2000) y PEGT/PBT 80/20 (4000), respectivamente. La liberación real con reventamiento será mayor porque el rendimiento de encapsulado será menor de lo supuesto. Esto significa que la lisozima muestra una liberación por reventamiento pronunciada a partir de microesferas 80/20. Esto está causado probablemente por la baja concentración de PEGT/PBT utilizado (5%) para la preparación de las partículas que proporciona una estructura porosa. Después de la liberación por reventamiento, todas las partículas de PEGT/PBT 80/20 mostraron una liberación gradual. Esto se ha mostrado en detalle para una preparación de microesferas en la figura 10A (liberación con respecto al tiempo) y 10B (liberación con respecto a la raíz cuadrada del tiempo).

La figura 10B muestra que la liberación acumulativa (después de la liberación por reventamiento) fue proporcional a la raíz cuadrada del tiempo, lo que es indicativo de una liberación controlada por difusión. La otra microesfera mostró también una dependencia de la raíz cuadrada del tiempo de la liberación (no se muestran resultados).

Envejecimiento de microesferas de PA y PLGA

Se envejecieron microesferas de PEGT/PBT y PLGA a 37ºC y a 100 y 0% de humedad relativa respectivamente. El envejecimiento fue seguido de la medición del peso molecular del polímero. La figura 11 muestra el peso molecular de PA y PLGA con función del tiempo de incubación (envejecimiento).

Resulta que el PLGA se degrada rápidamente en una atmósfera húmeda. Dentro de 8 semanas las partículas se degradaron por completo. Esto es incluso más rápido que el tiempo de degradación de las mismas partículas en una solución tampón de pH 7,2 (tiempo de degradación 10-12 semanas). La degradación rápida del PLGA a 100% de humedad se puede explicar del modo siguiente. Inicialmente, las microesferas de PLGA (secas) absorben una cierta cantidad de agua. Esto tiene como resultado la hidrólisis de los enlaces éster, dando lugar a residuos de ácido carboxílico. Estos grupos ácidos catalizan hidrólisis adicionalmente del núcleo del poliéster, resultando finalmente en oligómeros y monómeros solubles en agua. En soluciones tampón una parte de los residuos de ácido formados son neutralizados y/o difundidos hacia fuera de las micropartículas, resultando en una degradación retardada en comparación con partículas envejecidas en un ambiente húmedo. Por otra parte, ambas microesferas de PEGT/PBT 60/40 y PEGT/PBT 70/30 fueron estables a 100% de humedad (sin cambio significativo en el peso molecular a lo largo de un período de 20 semanas). La figura 11 muestra los resultados para PEGT/PBT 70/30. Se obtuvieron resultados comparables para PEGT/PBT 60/40. Esto demuestra nuevamente que el PEGT/PBT se degrada más lentamente que el PLGA en un ambiente húmedo. Además, se demostró que las microesferas de PEGT/PBT (lote 12 70/30) absorbían agua en condiciones de envejecimiento. El contenido de agua en equilibrio (titulación Karl Fischer llevada a cabo por Dr. J. Goedemoed) llegó a 16 y 25% (peso/peso) después de 1 y 2 semanas de envejecimiento respectivamente. Evidentemente, el agua presente en las microesferas no provocó ninguna hidrólisis significativa (degradación) del polímero. En un medio ambiente sin humedad, tanto PLGA como PA fueron estables: no se observó descenso en el peso molecular.

Ejemplo 2

Seis copolímeros de polietilenglicoltereftalato/ polibutilentereftalato (PEGT/PBT) fueron sintetizados. En tres de los copolímeros, el polietilenglicol tenía un peso molecular de 1.000 (PEG 1.000). Estos tres copolímeros tenían relaciones de porcentaje en peso de PEGT/PBT de 40/60, 60/40 y 80/20. En los otros tres copolímeros el polietilenglicol tenía un peso molecular de 600 (PEG 600). Estos tres copolímeros tenían proporciones de porcentaje en peso de PEGT/PBT de 40/60, 60/40 y 77/23. Cada uno de los seis copolímeros contiene 0,4% en peso del antioxidante 1,3,5-trimetil-2,4,6-tris(3,5-di-tert-butil-4-hidroxibencil) benceno comercializado por Ciba-Geigy como Irganox 1330.

A continuación se prepararon discos de cada uno de los copolímeros. Cada uno de los discos comprendía indometacina en una cantidad de 5% en peso. La indometacina es ácido 1-(p-clorobenzoil)-5-metoxi-2-metil-3-indol-3-acético, tiene un peso molecular de 357,8. Los discos que incluían el copolímero PEGT/PBT en el que la proporción en peso de PEGT/PBT era de 40/60, y el peso molecular del polietilenglicol en el polímero era de 1.000, fueron preparados formando una solución de 6,34 g PEGT/PBT, 73,36 g de cloroformo y 5 g de hexafluoroisopropanol (HFIP). Esta solución fue mezclada a continuación con una solución de 0,333 gramos de indometacina, 10 gramos de cloroformo y 50 \mul HFIP en un platillo petri con un diámetro de 9 centímetros. Antes de la mezcla, el polímero se dejó disolver durante una noche. Una pequeña cantidad de HFIP incrementa la proporción de disolución del medicamento considerablemente. Se prepararon a continuación discos con un diámetro de 5 mm punzonando la película resultante formada por la combinación de la solución con un sacacorchos. Asimismo, se prepararon discos a partir de pequeñas cantidades de solución polímero/medicamento que no se vertió en el plato petri.

Para los polímeros en los que el polietilenglicol tiene un peso molecular de 1.000 y que tiene una proporción de peso PEGT/PBT de 60/40 y 80/20, y para los polímeros que tienen un peso molecular de polietilenglicol de 600, una solución de 3,5 gramos de polímero y 35 gramos de cloroformo, y una solución de 0,184 de indometacina, 5,53 gramos de cloroformo y 50 \mul de HFIP fueron combinados en un plato petri con un diámetro de 5 cm.

El copolímero PEG 600 40/60 mostró una retracción considerable; la capa resultante tenía un grosor tal que un disco de 5 mm presentaba un peso de 90-99 mg. Para los demás polímeros era necesario combinar capas de 3 a 5 discos.

Elución de flujo pasante

Se llevaron a cabo estudios de liberación por utilización de células de flujo. Las células de flujo fueron llenadas con pequeños gránulos de cristal. 9 células tenían un diámetro interno de 22,6 milímetros y otras 9 células 12,0 milímetros. A causa del caudal muy reducido (1 ml/hr), es muy probable que las dimensiones de la célula no sean muy críticas en el proceso de liberación.

Las 18 células de flujo recibieron un suministro de eluyente con bombas de jeringa 2 Harvard Infusion (tipo bomba 22, controlada por microprocesador). Cada una de las bombas ha sido modificada de manera tal que 9 jeringas de 100 ml pueden ser colocadas en un soporte. Los vástagos extendidos de las jeringas fueron empujados continuamente en dirección horizontal por una barra móbil.

Compuesto eluyente: tampón fosfato 0,05 M, pH 7, 4, isotónico

NaH_{2}PO_{4}.1H_{2}O	3,65 g
Na_{2}HPO_{4} (anhidro)	5,7 g
NaCl	9,2 g
NaN_{3}	0,5 g
agua purificada	2,0 l

Se tomaron muestras después de 2, 4, 8 y 14 horas, y después de 1, 2, 3, 7,25 y 8,25 días. Durante 30 min se llenó una copa Eppendorf con 0,5 ml. Después de ello las copas fueron cerradas y congeladas en nitrógeno líquido.

Análisis de la indometacina

El sistema cromatográfico líquido consistía en una bomba analítica Pharmacia (tipo 2248) con acondicionador de disolvente, un monitor de longitud de onda variable Pharmacia, una celda de flujo de alta sensibilidad Pharmacia, un automuestreador Marathon con un bucle de muestra de 20 \mul y un sistema de ordenador Pharmacia HPLC con intermedio del ordenador Tandon 1 MB Ram con una impresora Star LC-20.

Se utilizó una columna Zorbax RP8 Stable Bond (Rockland Technologies) (150x4,6 mm) llena de partículas esféricas de 5 \mum. La longitud de onda fue ajustada a 254 nm. La fase móbil consistía en acetonitrilo/1,3% volumen/volumen ácido acético en agua 65/35. El caudal era de 1,0 ml/min. Todas las separaciones fueron realizadas isocráticamente a temperatura ambiente.

Se han preparado estándares de indometacina utilizando el mismo flujo a través de eluyente de 100, 50, 20, 10, 5, 2 y 1 \mug/ml. Poco tiempo después de la preparación los estándares han sido dispensados en copas Eppendorf de 1,5 ml de polipropileno y congelados en nitrógeno líquido a efectos de limitar fenómenos de degradación antes del análisis. Muestras del sistema de flujo pasante han sido inyectadas directamente en el sistema cromatográfico después de fusión.

Ensayo de indometacina en discos PEGT/PBT

Los discos secos fueron cortados en pequeñas piezas, se pesaron con exactitud y se disolvieron en cloroformo (40/60 en 50 ml, 60/40 y 80/20 en 25 ml) durante una noche. Los estándares han sido preparados con disolución de indometacina en cloroformo y diluyendo de manera apropiada 50, 20, 10, 5 y 2 \mug/ml.

Resultados Preparación de dispositivos

Los dispositivos conteniendo PEGT/PBT tenían color amarillo y tenían aspecto opaco. El proceso de evaporación tuvo lugar durante un período de 3 a 5 días. Esta velocidad lenta era necesaria para obtener películas con grosor regular. Después de elución de 8,25 días, la forma cilíndrica de los 18 dispositivos eran las capas de discos originales separadas.

Después de elución en 8,25 días y evaporación/secado a 85ºC, los dispositivos 40/60 mostraron una constitución tenaz, los dispositivos 60/40 moderada y los dispositivos 80/20 una constitución relativamente blanda.

Datos de absorción de agua

Se indican en la tabla VII datos de absorción de agua para los discos con respecto a la elución de flujo pasante a los 8,25 días. Como control se proporciona también la absorción de agua para cilindros moldeados por inyección.

TABLA VII Absorción de agua de dispositivos PolyActive después de 8,25 días de elución en flujo pasante

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Para PEG 600 77/23 se observó una absorción de agua considerablemente menor, debido posiblemente a la influencia extrahidrofóbica de 5% de indometacina peso/peso. También las otras dos formulaciones de PEG 600 tenían porcentajes de absorción algo más bajos. En la serie de PEG 1000, el polímero 40/60 mostró una absorción de agua mitad de la de la referencia moldeada por inyección.

Resultados de liberación de flujo pasante

Se muestran en la figura 12 perfiles de liberación de indometacina a partir de discos realizados cada uno de ellos a base de los 6 polímeros PEGT/PBT. La relación entre la liberación más rápida y más lenta de indometacina es menor de 2. Después de 8,25 días, se liberaron 3,68 mg de indometacina de los discos formados a partir del polímero PEG 1000 80/20 y 2,05 mg de indometacina de los discos formados a partir de los polímeros 600 40/60.

Análisis de indometacina

Con el método cromatográfico aplicado, la indometacina mostraba un tiempo de retención de 3,3 minutos sin picos de interferencia en su proximidad. Después de 8,25 días de elución, incrementan considerablemente un pico en 2,6 minutos ligero y un complejo de picos alrededor de 2 minutos. El cromatograma de un estándar de indometacina en tampón fosfato (2 \mug/ml) muestra que, como mínimo, un pico del complejo se origina de la propia indometacina.

En el cromatograma resultante del ensayo de indometacina de los restos del dispositivo PolyActivo, se puede observar un pico extra en un tiempo de retención de 2,8 minutos, que refleja el antioxidante Irganox 1330 o una o varias formas oxidadas de este compuesto.

Los análisis anteriores de la indometacina se han tomado en consideración en la determinación de la pérdida de peso del polímero después de 8,25 días de elución. Las pérdidas de peso para los discos formados de cada uno de los seis polímeros se indican en la siguiente Tabla VIII.

TABLA VIII

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Preparación de microesferas que contienen indometacina

También se prepararon por la técnica de evaporación de disolvente anteriormente descrita en el Ejemplo 1 las siguientes microesferas que contenían indometacina.

Microesfera C

(i) 89% en peso de una mezcla de 99% en peso de un copolímero PEGT/PBT 50/50, en el que el polietilén glicol tiene un peso molecular de 300, y 1% en peso de \alpha-tocoferol;

(ii) 1% en peso de ácido 1-ascórbico 6-palmitato;

(iii) 5% en peso de ácido cólico; y

(iv) 5% en peso de indometacina.

Microesfera D

(i) 94% en peso de una mezcla de 99% en peso de un copolímero de PEGT/PBT 50/50, en el que el polietilén glicol tiene un peso molecular de 300, y 1% en peso de \alpha-tocoferol;

(ii) 1% en peso de ácido 1-ascórbico 6-palmitato; y

(iii) 5% en peso de indometacina.

Microesfera E

(i) 95% en peso de una mezcla de 99,5% en peso de un copolímero de PEGT/PBT 50/50, en el que el polietilén glicol tiene un peso molecular de 300, y 0,5% en peso de \alpha-tocoferol; y

(ii) 5% en peso de indometacina.

Microesfera F

Igual que la microesfera E, excepto que el polietilén glicol del copolímero PEGT/PBT tiene un peso molecular de 400.

Microesfera G

Igual que la microesfera E, excepto que la proporción PEGT/PBT del copolímero PEGT/PBT es 55/45.

Ejemplo 3

Los materiales polímeros utilizados en este ejemplo fueron (i) un copolímero de PEGT/PBT con una proporción de PEGT/PBT de 70/30 y en el que el polietilén glicol tenía un peso molecular de 1.000, y en el que dicho material comprendía 0,5% en peso del antioxidante d,l \alpha-tocoferol; y (ii) un copolímero de PEGT/PBT con una proporción de PEGT/PBT de 70/30, y un peso molecular de polietilén glicol de 1.000, en el que dicho material comprendía también el antioxidante Trolox-NH-PEG 1.000-OCH_{3}. El antioxidante derivado de Trolox fue sintetizado disolviendo 5,00 g de Trolox, que es el ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico, en una mezcla de 100 ml de dioxano y 100 ml de diclorometano y 5 ml (1,5 equivalentes) de trietilamina a temperatura ambiente. La solución transparente fue enfriada a -15ºC, y se añadieron 2,01 ml (19,5 mmoles) de etil cloroformato en 20 ml de diclorometano gota a gota, y la suspensión resultante fue agitada durante 10 minutos a -15ºC. Se añadió una solución de 10,0 g (10 mmoles) de (CH_{2}-CH_{2}-O)_{21}-NH_{2} en 60 ml dioxano (con 1 ml de trietilamina) y el baño de refrigeración fue retirado. La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente aproximadamente 1 hora. El disolvente fue eliminado en vacío, y el residuo fue disuelto en 100 ml de una solución de 1 M HCl y extraído dos veces con 50 ml de acetato de etilo. La capa acuosa fue neutralizada a pH 12 con K_{2}CO_{3} sólido y extraído tres veces con 50 ml de acetato de etilo. (El producto forma una capa intermedia. Esta capa fue combinada con la capa de acetato de etilo). A continuación, se añadieron 50 ml de 2-propanol a las capas orgánicas combinadas, y las capas fueron secadas a continuación con Na_{2}SO_{4} y concentradas en vacío proporcionando 10,61 g (86%) del producto en crudo.

El producto en crudo fue purificado por cromatografía (Silicagel 60, con metanol como eluyente). Las fracciones negativas de ninhidrina con un valor Rf de 0,3-0,1 se combinaron y concentraron en vacío proporcionando un aceite casi incoloro (8,5 g, 69% de rendimiento), que solidificó al reposar. Se prepararon varios lotes del derivado de Trolox-PEG 1.000. En este ejemplo, 14,5 g del derivado de Trolox-PEG 1.000 fueron utilizados, mientras que el derivado de Trolox-PEG 1.000 se encuentra presente en la matriz en una cantidad de 1,45% en peso.

Las partículas de cada polímero fueron fundidas en caldo de fusión formando varillas cilíndricas porosas con un diámetro de 12 mm y una longitud de 60 mm.

Para varios tipos de varillas porosas, se prepararon utilizando un dispositivo de corte discos de 0,4 g aproximadamente de 12x60 mm, parcialmente irradiados con rayos gamma en su embalaje habitual. Los preparados fueron pesados a continuación y colocados en un medio de pruebas de 20,0 ml.

Los medios de prueba utilizados en este ejemplo fueron los siguientes:

1. Agua con nanopureza (con una conductividad eléctrica por debajo de 1 nano-Siemens por cm)

2. Solución fisiológica salina (0,9% NaCl)

3. Tampón fosfato 20 mM, pH 7,4

4. Tampón fosfato 50 mM, pH 7,4

5. Tampón fosfato 0,5 M, pH 7,4

6. Solución fisiológica salina con H_{2}O_{2} (1mM)

7. Agua con nanopureza con Fe (100 \muM)/H_{2}O_{2} (1mM) para generar radicales hidroxilo

8. Solución fisiológica salina con Fe (100 \muM)/H_{2}O_{2} (1mM) para generar radicales hidroxilo.

9. Tampón fosfato, 20 mM, con Fe (100\muM), EDTA \muM/H_{2}O_{2} (1mM) para generar radicales hidroxilo, pH 7,4.

A efectos de examinar la influencia de la radiación gamma sobre las varillas de PEGT 1.000/PBT 70/30, éstas fueron incubadas en los medios siguientes:

10. Solución fisiológica salina (0,9% NaCl)

11. Solución fisiológica salina con Fe (100 \muM)/H_{2}O_{2} (1mM) para generar radicales hidroxilo.

Asimismo, se incubaron en los siguientes medios irradiados con rayos gamma y no irradiados incluyendo el antioxidante Trolox:

12. Radiación gamma y solución fisiológica salina (0,9% NaCl)

13. Radiación gamma y solución fisiológica salina (0,9% NaCl) con Fe (100 \muM)H_{2}O_{2} (1mM)

14. Solución fisiológica salina (0,9% NaCl) sin radiación

15. Solución fisiológica salina (0,9% NaCl) sin radiación con Fe (100 \muM)/H_{2}O_{2} (1mM)

Durante la prueba de estos polímeros, se utilizaron también las siguientes condiciones.

Proporción masa/volumen: 1:50. Se añadieron 400 mg de polímero a la fase líquida de 20 ml.

Botella: frascos cilíndricos de 40 ml, cerrados con tapones de rosca de material plástico (cristal de calidad química).

Temperatura: Temperatura de incubación 37ºC \pm 0,5ºC.

Presión: Presión atmosférica.

Períodos de prueba: Se probaron muestras de polímeros a 0, 1, 2, 4, 8, 12, 26, 39 y 52 semanas.

Cambio de medio: Todos los medios de pruebas fueron cambiados una vez a la semana.

Agitación: Sin agitación.

Manipulación antes de las pruebas: No se realizó proceso de secado a peso constante de las muestras de prueba a efectos de impedir las alteraciones de contenido de antioxidante.

Manipulación después de la prueba: Al final del período de pruebas, los restos del dispositivo fueron secados en una estufa a 45ºC durante 3 horas y se pesaron. Se esperó que, con un contenido decreciente de PEGT de dispositivos degradados parcialmente, el contenido de agua fuese un asunto de menor importancia (<< 1% peso/peso) después de 3 horas de secado a 45ºC. Se tuvo especial cuidado durante el cambio de medio en la etapa de fragmentación de dispositivo (aproximadamente cuando M_{w} ha alcanzado valores por debajo de 40.000).

Todas las soluciones resultantes del período de pruebas se almacenaron en el congelador por debajo de 0ºC.

Número de pruebas: Todas las pruebas fueron llevadas a cabo en triplicado.

Se indica a continuación en la Tabla IX un resumen de soportes y número de muestras comprobadas de cada soporte.

TABLA IX

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Se llevaron a cabo los siguientes análisis en cada una de las muestras del polímero.

Los dispositivos intactos fueron pesados después del proceso de secado que se ha descrito. Cuando un dispositivo quedó fragmentado, la botella de cristal con residuos, después de eliminación cuidadosa del medio de pruebas, fue pesada en su conjunto después del mismo proceso de secado.

Se llevaron a cabo mediciones de pH en uno de los medios de prueba triplicados justamente después del cambio de medio semanal (precisión dentro de unidad 0,01 pH).

Se llevó a cabo análisis GPC de todas las muestras. El calibrado fue llevado a cabo con 12 estándares desde 580 Daltons a 2.000.000 Daltons.

Se llevó a cabo análisis HPLC de un \alpha-tocoferol hasta que no se pudo medir en los residuos del dispositivo \alpha-tocoferol. El método fue conducido por reflujo de los restos del dispositivo con metanol, seguido de análisis de fase inversa HPLC utilizando una columna Zorbax SB C8 y 100% de acetonitrilo como eluyente.

Se llevó a cabo análisis HPLC de soluciones acuosas de ácido tereftálico y sus derivados por análisis de fase inversa de HPLC utilizando una columna Zorbax SB CN con 30% acetonitrilo/70% ácido acético diluido, 1,3% en agua como eluyente.

Se llevaron a cabo análisis espectofotométricos UV para ácido fórmico y ácido acético al aplicar combinaciones de pruebas enzimáticas (ácido fórmico: Boehringer Mannheim Nº. 979732; ácido acético: Boehringer Mannheim Nº. 148261). Se seleccionan soluciones de pruebas que han demostrado ser acidificadas basándose en valores de pH medidos.

Resultados Análisis de antioxidante Trolox

Los análisis cromatográficos determinaron la pureza del derivado de Trolox e indicaron que no tenía lugar acoplamiento con el grupo hidroxi fenólico. El análisis HPLC detectó Trolox libre y sus derivados. Un contenido de Trolox libre en el derivado fue determinado en un valor aproximado de 1,2%. El análisis HPLC de H_{2}N-PEG 1.000-OCH_{3} libre, es decir, el otro material inicial, empleando derivación pre-columna con F-moc-Cl, mostró un contenido libre de H_{2}N-PEG 1.000-OCH_{3} de aproximadamente 0,35% en peso. El análisis GPC mostró un pico monodisperso.

Los siguientes datos de la Tabla X que se adjunta a continuación se facilitan para dos lotes de PEGT/PBT 70/30 sintetizados a escala de 1 kg. Cada uno de los polímeros incluye también antioxidantes \alpha-tocoferol o derivado de Trolox. El lote que incluye el antioxidante \alpha-tocoferol dio un rendimiento de síntesis de 870g, y el lote que comprendía el antioxidante derivado de Trolox dio un rendimiento de síntesis de 835 g. Se obtuvieron datos de pesos moleculares por GPC utilizando poliestirenos como calibradores, y el % de PEGT fue calculado utilizando datos H-NMR.

TABLA X

	M_{w}	M_{w}/M_{n}	% PEGT
rendimiento \alpha-tocoferol: 870 g	107.222	2,144	70,1%
rendimiento derivado Trolox: 835 g	103.285	2,065	71,1%
Mw - Peso molecular promedio en peso
Mn - Peso molecular promedio en número

Antes de las pruebas, se realizaron varias etapas incluyendo el corte del granulado, cribado, secado, fusión para obtener caldo de fusión, envasado, y en algunos casos, radiación gamma.

En la siguiente Tabla XI, se indican datos de peso molecular que representan tres etapas para cada lote: (i) después de síntesis como granulado; (ii) como varilla porosa no irradiada; y (iii) como varilla porosa radiada con rayos gamma.

TABLA XI

lote con \alpha-tocoferol	lote con derivado de Trolox
granulado-Mw=107.222	granulado-Mw=103.285
varilla porosa no irradiada Mw=107.127	varilla porosa no irradiada Mw=104.162
varilla porosa irradiada rayos gamma	varilla porosa irradiada rayos gamma
Mw=102.294	Mw=97.665

Los datos que se han presentado para ambos lotes son comparables; muestran que con ambos antioxidantes se pueden obtener materiales copolímeros completamente comparables con respecto al peso molecular y proporción PEGT/PBT. Asimismo, el antioxidante Trolox protege de manera efectiva el material copolímero que se desarrolla durante el proceso de policondensación a una temperatura que llega a 245ºC. El antioxidante Trolox tiene un punto de ebullición más elevado que el \alpha-tocoferol; por lo tanto, solamente es necesario añadir dicho antioxidante al inicio de la síntesis en contraste con la situación con \alpha-tocoferol.

Análisis TGA de granulado PoliActivo con ambos tipos de antioxidantes

Asimismo, el antioxidante Trolox protege el material PoliActivo 70/30 de manera efectiva. Un análisis termogravimétrico (TGA) es un método apropiado para detectar pérdidas de peso del material durante la exposición a esfuerzos térmicos.

Las pérdidas de peso pueden ser controladas solamente para ambas formulaciones después de un fuerte tratamiento térmico previo del material durante 17 días en una cámara caliente a 100ºC. La necesidad de este pretratamiento indica ya la estabilidad y resistencia a influencia térmicas de la nueva formulación. En las figuras 13A y 13B se puede observar que, después de este pretratamiento, la formulación con el antioxidante Trolox se degrada con más rapidez que una formulación con \alpha-tocoferol en estas condiciones. La resistencia que se ha mostrado de la nueva formulación, no obstante, a los esfuerzos térmicos aplicados, sugiere un comportamiento satisfactorio de vida de almacenamiento en condiciones normales.

Resultados de la degradación in vitro de varillas 70/30 que contienen \alpha-tocoferol * varillas sometidas a radiación gamma

En las figuras 14A y 14B se muestran perfiles de peso molecular M_{w} - tiempo para los soportes o medios de prueba números 2 a 9. (El perfil para el medio nº 1 es casi idéntico al del medio nº 2 y por razones de claridad no se han mostrado).

Se puede apreciar que no existe prácticamente disminución de M_{w} en el agua y medios formados por solución de NaCl al 0,9%. Son comparables las proporciones de disminución de M_{w} de 4 semanas en el medio con tampón fosfato y el medio Fe/H_{2}O_{2}. Después de 4 semanas, la influencia degradante del medio Fe/H_{2}O_{2} sobre las varillas 70/30 de \alpha-tocoferol es mucho más pronunciado que el del medio con tampón fosfato.

En el medio con tampón fosfato (nos. 3,4,5), después de 8 semanas (incluyendo 7 cambios del medio), se encuentra presente todavía más de la mitad de la cantidad de \alpha-tocoferol del tiempo cero en el dispositivo. En el medio nº 5, la mitad de la cantidad inicial se encuentra presente después de 26 semanas. En el medio oxidante de Fe/H_{2}O_{2} (nos. 7,8), el \alpha-tocoferol ha desaparecido (es decir, ha reaccionado).

Por lo tanto, se pueden establecer disminuciones comparables de M_{w} con y sin el consumo de \alpha-tocoferol, por ejemplo, los nos. 3,4,5,7,8,9 después de 2 ó 4 semanas.

Con respecto a los 3 tampones de fosfato, se puede observar que cuanto mayor es la concentración de fosfato, más cantidad de \alpha-tocoferol permanecerá; esto sugiere un "efecto fosfato" específico, tal como la formación de complejo hierro-fosfato o la capacidad de barrido del radical OH, en vez de un efecto no específico de PH del tampón sobre el sistema Fe/H_{2}O_{2}.

La influencia más pronunciada del medio Fe/H_{2}O_{2} después de 4 semanas en comparación con el medio con tampón fosfato se puede explicar del modo siguiente. Para escisión de la cadena oxidante la concentración de PEG disponible sigue siendo relativamente constante tal como es el caso en los medios nos. 7 y 8. Se puede observar una disminución casi lineal de M_{w} a lo largo del tiempo. Como contraste, a la concentración disponible, los enlaces éster sensibles a la hidrólisis disminuyen (nos. 3,4,5). Todas las curvas de M_{w} medio fosfato-tiempo se nivelan.

La influencia estabilizadora de los tampones de fosfato sobre la degradación oxidante del material PEGT/PBT se muestra por comparación de los resultados de los medios nos. 3 y 9. El tampón fosfato 20 mM del medio nº 9 puede impedir por completo la degradación por oxidación a fondo (disminución de M_{w}) tal como ha tenido lugar en el medio nº 7. Los perfiles de los medios nos. 3 y 9 son casi idénticos.

Varillas no irradiadas

En las figuras 15 y 16, se han mostrado los perfiles M_{w}-tiempo de varillas que contienen \alpha-tocoferol radiadas con rayos gamma y no irradiadas, en el medio 0,9% NaCl/Fe/H_{2}O_{2} Y 0,9% NaCl, respectivamente.

Si bien la radiación de rayos gamma disminuye el contenido de \alpha-tocoferol de varillas 70/30 de 0,78% peso/peso a 0,51% peso/peso, la radiación no influye en el comportamiento de degradación de M_{w}. Los perfiles de disminución de M_{w} son casi idénticos.

Resultados de la degradación in vitro de varillas 70/30 conteniendo antioxidante derivado de Trolox Varillas radiadas con rayos gamma

La proporción de degradación de las varillas que contienen ese tipo de antioxidante se manifiesta más rápido en el medio 0,9% NaCl/Fe/H_{2}O_{2} que las proporciones de varillas con \alpha-tocoferol (ver figura 15).

En el medio de 0,9% NaCl, las varillas radiadas con rayos gamma con el antioxidante hidrofílico empiezan a degradarse después de 4 semanas, con un resultado de disminución de 20% M_{w} después de 8 semanas, 31% después de 12 semanas, y 42% después de 26 semanas.

Varillas no irradiadas

En el medio 0,9% NaCl existe solamente una degradación ligera (no. 14), una disminución de 16% M_{w} después de 26 semanas.

La diferencia en la degradación de M_{w} entre ambos tipos de formulaciones antioxidantes es extremadamente interesante para aplicaciones de suministro de proteínas. Las proteínas más grandes (por ejemplo, vacunas) quedan restringidas en la matriz de polímero por su tamaño molecular. Suponiendo que la liberación se inicia solamente a un nivel de degradación (cadena) correspondiente a un M_{w} de valor 40.000 aproximadamente, se sigue de ello que en el medio 0,9% NaCl/Fe/H_{2}O_{2} la matriz "derivado de Trolox" empieza a liberar 4 semanas antes que la matriz "\alpha-tocoferol". Considerando la fuerte solicitación oxidante de este medio, es muy probable que en la liberación in vivo los tiempos de inicio de liberación se desvían en más de 4 semanas. Otra indicación de la gran diferencia en tiempos de liberación in vivo entre copolímeros PEGT/PBT que contienen diferentes antioxidantes es la gran diferencia en pérdida de M_{w} entre las dos matrices radiadas con rayos gamma después de 26 semanas. Se ha producido la pérdida de 8% M_{w} para la matriz que contiene \alpha-tocoferol con respecto a una pérdida de 42% M_{w} para la matriz que incluye el derivado de Trolox. Conociendo estos extremos, se pueden obtener tiempos de inicio de liberación intermedios al variar la proporción del derivado de Trolox y de \alpha-tocoferol dentro de la misma matriz. Combinando varias matrices, por ejemplo, en forma de microesferas, con tiempos de inicio de proteína variables, se pueden desarrollar sistemas de liberación pulsante.

Pérdida de masa

En la figura 14B se han mostrado para 5 medios seleccionados tanto el porcentaje original de masa como los perfiles M_{w}-tiempo mostrando proporciones de degradación variables.

El pequeño porcentaje de pérdidas (aproximadamente 0,5 - 1,5%) en el agua y en el medio 0,9% NaCl son provocados por disolución de los oligómeros solubles en agua de PEG-butilén tereftalato (PEGT-BT) durante la primera semana. Después de ello, el peso ha continuado bastante constante. Las pequeñas variaciones son provocadas por desviaciones en el proceso de secado o en las condiciones de humedad.

Este oligómero, con una estructura química que comprende unidades (BT)_{x}, en el que X=1-20, con 1 ó 2 cadenas de PEG 1.000 suspendidas, es el oligómero químicamente no incorporado de la síntesis del copolímero; a través del PEG 1.000 hidrofílico y de las fracciones hidrofóbicas (BT)_{x}, se obtienen las características de un tensoactivo. La agitación de la solución tiene como resultado la formación de espuma.

En el caso de las varillas de derivado de Trolox, las pérdidas de masa en 0,9% NaCl son ligeramente mayores que las de las varillas de \alpha-tocoferol (nos. 12 y 14 con respecto a los nos. 2 y 10). Esto se puede explicar por pérdida del propio antioxidante soluble en agua (concentraciones aproximadas entre 0,8 y 1,2% peso/peso).

En consideración de ello, es razonable suponer que los porcentajes del oligómero PEG-BT restante después de la síntesis utilizando ambos tipos de antioxidantes son comparables. Esto queda confirmado por la observación de áreas superficiales pico comparables del oligómero PEG-BT que resultan del análisis HPLC del tereftalato.

Se espera que las tendencias en pérdida de masa sean más lentas que en la disminución M_{w} (figura 14B). Inicialmente, tiene lugar solamente escisión de cadena, y en una etapa más adelantada, la pérdida de productos de degradación. Se pueden encontrar en la siguiente Tabla XII algunos ejemplos de disminuciones variables de M_{w} y pérdidas de masa.

Se puede observar en esta tabla y en la figura 14B que las pérdidas de masa para las varillas con derivado de Trolox en el medio de 0,9% NaCl/Fe/H_{2}O_{2} son considerablemente más grandes que las de las varillas de \alpha-tocoferol (nos. 8 y 11 con respecto a números 13 y 15).

TABLA XII

12

mediciones ^{1}H-NMR

Determinando los cambios de ^{1}H-NMR con respecto a la proporción PEGT/PBT, se pueden controlar los cambios dentro del segmento PEGT. El segmento de PEGT solamente se puede calcular al inicio porque se puede suponer que en aquel momento la cadena de PEG tiene un peso molecular de 1000 Daltons. Tan pronto como tiene lugar la escisión de la cadena, estos cálculos ya no son posibles debido a la variación de los pesos moleculares de PEG. En vez de cálculos de % de PEGT, se utilizarán proporciones de señales características que pueden mostrar una disminución en la longitud del segmento de PEG:

señal a = protones internos de butileno (O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-O)

señal c = protones internos de oxietileno (CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2})

señal c' = protones de oxietileno (CO-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2})

señal c''= protones de oxietileno (CO-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2})

La proporción a/c refleja la proporción entre la cantidad disponible de los protones de butileno internos y los protones internos de oxietileno, y, por lo tanto, es la medición de la proporción entre el segmento PEGT y PBT.

Utilizando 70% PEGT, Mw PEGT 1130, 30% PBT, Mw PBT 220: a/c es 0,1084 PEG: 1 + 20,3 + 1 unidades de oxietileno

La proporción (c'+c')/c refleja la relación entre la cantidad disponible de las unidades de oxietileno externas e internas. En el caso de avance de la escisión de cadena, esta proporción aumentará.

Utilizando (1+20,3+1) unidades de oxietileno para PEG, (C''+C')/C es 0,0985.

En las Tablas siguientes XIII y XIV, estas proporciones quedan indicadas después de análisis de los restos del dispositivo para no. 4(50 mM fosfato), no. 8 (NaCl/Fe/H_{2}O_{2}), y no. 13 (NaCl/Fe/H_{2}O_{2} antioxidante hidrofílico) después de 0, 4, 8, y 12 semanas.

Se puede observar que el dispositivo no. 13 de degradación rápida muestra las proporciones a/c más grandes. La diferencia mayor con no. 8 (dispositivos \alpha-tocoferol) se observa después de 8 semanas; después de 12 semanas, la diferencia es más pequeña.

Teniendo en cuenta la proporción (c''+c')/c, no. 13 muestra también los valores más grandes; no obstante, existe una ligera disminución después de 8 semanas.

Posiblemente algunos errores de medición se han realizado debido al hecho de que solamente los restos de copolímero disuelto se miden por NMR; cuanto mayor es el contenido de PBT, más difícil será la disolución en el cloroformo deuterado.

No obstante, la tendencia en general es clara de que cuanto más rápida es la degradación de un dispositivo (Mw, pérdida de masa), más alto será el contenido resultante de PBT en los residuos del dispositivo.

TABLA XIII Proporciones a/c de señales de protones NMR

13

TABLA XIV Proporciones (c''+c')/c de señales de protones NMR

14

\newpage

Formación de productos de degradación de ácido

En medios oxidantes débilmente ácidos (NaCl)/Fe/H_{2}O_{2}, tiene lugar una acidificación adicional. El valor inicial de pH del medio nº 7, es decir, 3,47, disminuye dentro de 5 semanas a una gama fluctuante de 2,77-3,13 (con una muestra de medio nº 7 que tiene un valor de pH de 3,35). El valor inicial de pH del medio nº 8, es decir, 3,65, disminuye dentro de 5 semanas a 3,04-3,25, y para el medio nº 13, se observa aproximadamente la misma reducción.

La acidificación puede ser explicada solamente por la formación de ácidos, tales como ácido fórmico y ácido acético (productos de oxidación conocidos que proceden de PEG), en vez de ácido tereftálico, considerando el hecho de que el ácido tereftálico (o un derivado mono-funcional) no es capaz de establecer valores de pH por debajo de 4 debido a su elevado valor de pK_{a}.

Como confirmación, se midieron concentraciones de ácido fórmico y ácido acético en soluciones de degradación seleccionadas al aplicar pruebas específicas, enzimáticas UV disponibles comercialmente para estos ácidos carboxílicos.

En la siguiente Tabla XV, se han indicado concentraciones de ácido fórmico en \mug/ml en soluciones determinadas de medios nos. 7, 8 y 11, medidos por una combinación de pruebas enzimáticas UV.

TABLA XV

15

TABLA XVI

16

En la Tabla XVI, estas concentraciones de ácido fórmico son utilizadas para calcular la formación molar percentual de ácido fórmico a partir de las unidades disponibles de oxietileno, suponiendo que 1 molécula de ácido fórmico se origina de 1 unidad de oxietileno.

Además, se indican los porcentajes acumulativos durante el período de 15 semanas, tal como se muestra en la Tabla XVII.

Para el medio de degradación más rápida, nº 7, este porcentaje acumulativo, para 15 semanas, era aproximadamente 11% (ver Tabla XVII). Esto pronostica un largo período durante el cual continuará esta producción de ácido fórmico. El bajo pH resultante fue medido hasta 26 semanas.

TABLA XVII Porcentajes molares acumulativos de ácido fórmico de las unidades de oxietileno disponibles

17

En la figura 17, se han mostrado los porcentajes de formación de ácido fórmico para los nos. 7, 8, 11 y 13. Se puede apreciar que, en el medio nº 7, Fe/H_{2}O_{2} sin NaCl, después de 6 semanas, se acumulan porcentajes superiores de ácido fórmico en comparación con los otros medios. También en este caso, no existe influencia de la radiación de rayos gamma (nº 8 con respecto a nº 11).

Durante 0-6 semanas, las concentraciones de ácido fórmico producidas en el nº 13 (antioxidante hidrofílico) son algo más elevadas que las del nº 8 (\alpha-tocoferol); no obstante, los porcentajes acumulativos después de 15 semanas eran comparables.

Aparentemente, la proporción de degradación más rápida observada en el nº 13, reflejada por la disminución de M_{w} y pérdida de masa, no se ve acompañada de un fraccionamiento oxidante de las unidades de PEG resultando en una producción de ácido incrementada.

TABLA XVIII

18

Con el antioxidante hidrofílico, se encontraron aproximadamente los mismos valores de pH en el medio NaCl/Fe/H_{2}
O_{2}. Después de 26 semanas se encontraron valores de pH incluso ligeramente superiores, tal como se ha mostrado en la Tabla XVIII.

En la Tabla XIX, se indican concentraciones de ácido acético (\mug/ml) en soluciones seleccionadas de los medios nos. 7, 8 y 11.

En base molar las concentraciones medidas de ácido acético son 20-100 veces menores que las concentraciones de ácido fórmico. Las concentraciones se miden por una combinación de pruebas enzimáticas UV.

TABLA XIX

19

En la figura 18, se han presentado las concentraciones de ácido acético para los medios 7, 8, 11, 13 y 15.

Se puede llegar a la conclusión de que la acidificación observada en los medios fuertemente oxidantes (NaCl)/Fe/H_{2}
O_{2} se puede atribuir principalmente a la formación de ácido fórmico.

Solamente se observó acidificación en el medio oxidante rígido (NaCl)/Fe/H_{2}O_{2}. En todos los demás medios, no ocurrió acidificación (muy probablemente) o fue dominada por los sistemas de tampón presentes.

Se debe indicar, no obstante, que esta acidificación no se debe esperar in vivo. No tendrá lugar una "oxidación en masa" igual que en el caso del medio rígido (NaCl)/Fe/H_{2}O_{2}; in vivo la generación de radicales OH reactivos tiene lugar solamente en estructuras especialmente adaptadas dentro de la célula de macrófagos fagocitantes.

Por lo tanto, la fragmentación y reducción del tamaño de partículas del material copolímero, y la fagocitosis (proceso con mediación superficial) son etapas limitadoras de proporción in vivo. Por esta extensión en el espacio y tiempo del proceso de degradación, los precursores de aldehídos (reactivos) de ácido fórmico y ácido acético se metabolizan de manera efectiva por sistemas de enzimas a partir de la célula. De manera más probable, esto impedirá cualquier producción de ácidos libres en el citoplasma.

Análisis HPLC de tereftalato Varillas 70/30 conteniendo \alpha-tocoferol (nos. 1-11)

En agua y en 0,9% NaCl (nos. 1, 2, 10), un modelo característico de picos puede ser observado:

	Tiempo de retención
ácido tereftálico	2,3 minutos
tereftalato "dímero"	3 minutos
oligómero PEG-BT	4-8 minutos
pico desconocido	12-14 minutos

Después de una semana, todos estos compuestos han sido liberados de forma predominante. Los cromatogramas resultantes de las soluciones de la semana 2 son casi vacíos.

Los medios de fosfato (nos. 3, 4, 5, 9) y los medios de (NaCl)/Fe/H_{2}O_{2} (nos. 7, 8, 11) tienen otros modelos característicos. Hay picos adicionales y conjuntos de picos presentes en tiempos de retención más cortos (inmediatamente después del ácido tereftálico). El área superficial del oligómero PEGT-BT es habitualmente más pequeña que la resultante del medio acuoso, sugiriendo una degradación parcial del oligómero PEGT-BT en productos más hidrofílicos (incorporación de oxígeno) o en productos de menor peso molecular resultando ambos en tiempos de retención más cortos.

La radiación gamma no influye en ninguno de los modelos de picos. El cromatograma resultante del agua y soluciones de 0,9% NaCl permanecen casi vacías durante 1-12 semanas; sin que tenga lugar degradación.

Las áreas de conjunto de los picos en el cromatograma resultante de los medios de fosfato y oxidantes disminuyen en su tamaño durante 2 y 4 semanas. No obstante, a partir de la semana 6 el área superficial para el modelo de picos "oxidativos" aumenta nuevamente.

Varillas 70/30 que contienen un antioxidante derivado de Trolox

Después de la semana 1, los modelos de picos del cromatograma de las varillas derivadas de Trolox en el medio de NaCl 0,9% (nos. 12, 14) son casi idénticos a los de las varillas de \alpha-tocoferol (nos. 2, 10)

Tampoco en este caso se puede observar influencia de radiación de rayos gamma.

Los cromatogramas han mostrado que, en síntesis, utilizando tanto \alpha-tocoferol como el derivado de Trolox, la parte del oligómero de PEG-BT no incorporado está formada en el mismo grado. Esto indica que el tipo de antioxidante no influye en el proceso de polimerización.

Asimismo, los modelos de picos resultantes del fosfato y medio (NaCl)/Fe/H_{2}O_{2} son casi idénticos después de la semana 1.

Desde la semana 2, el área superficial de los modelos de picos "oxidantes" aumentan. Desde la semana 4, el área superficial incrementada del conjunto de picos permanece constante con respecto a la forma y magnitud. El área superficial del modelo de picos "oxidantes" de las varillas derivadas de Trolox (nos 13, 15) son siempre considerablemente mayores que las que corresponden a las varillas de \alpha-tocoferol (nos. 8, 11).

Comparando los cromatogramas de tereftalato en el tiempo, resultantes de \alpha-tocoferol y de las varillas derivadas de Trolox, es decir, nº 8 con respecto al nº 13 y al nº 11 con respecto al nº 15, se ha observado que existen solamente diferencias cuantitativas. Los tereftalatos derivados deben explicar, por lo menos parcialmente, y posiblemente en la parte más importante, la diferencia en pérdida de masa entre ambos tipos de formulaciones antioxidantes.

Considerando los valores de pH casi idénticos, se puede llegar a la conclusión de que la degradación más extensa con el antioxidante hidrofílico es provocada predominantemente por escisiones más extensas de la cadena PEG, resultando en mayores concentraciones de derivados de tereftalato, valores de M_{w} más bajos y mayores pérdidas de masa. Estas escisiones de cadena PEG incrementada, no obstante, no están acompañadas de un consumo oxidante incrementado de unidades de oxietileno que conducen a productos ácidos.

Ejemplo 4 Liberación continua de proteínas de las películas de PEGT/PBT Materiales

En este ejemplo, se sintetizaron copolímeros de poli(óxido de etileno)tereftalato/poli(1,4-butilén)tereftalato (PEGT/
PBT), de manera que dichos polímeros tenían proporciones en peso de PEGT/PBT de 80/20, 77/23, 70/30, 60/40 y 40/60. El componente de polietilén glicol de los polímeros con relaciones de peso PEGT/PBT de 70/30, 60/40 y 40/60 tenía un peso molecular de 1.000. Para el copolímero con una proporción en peso de PEGT/PBT con un valor de 77/23, el peso molecular del componente de polietilén glicol era de 600 y para el polímero con una proporción en peso PGT/PBT de 80/20, el peso molecular del componente de polietilén glicol era de 4.000. Estos copolímeros están indicados como aPEGbPBTc, en el que a es el peso molecular de PEG, b es el % de PEG-tereftalato y c es el % en peso de PBT.

Se adquirió de la firma NPBI (Emmer-compascuum, NL) solución Salina Tamponada de Fosfato (PBS), pH 7,4. Se adquirieron de la firma Sigma Chem Corp. (St. Louis, USA) albúmina de suero bovino (BSA), Inmunoglobulina G(IgG), Lisocima de clara de huevos (cristalizado 3x, dializado y liofilizado) y células liofilizadas de Micrococcus Lysodeikticus. Los reactivos cloroformo (CHCl_{3}) y metanol, obtenidos de la firma Merck (Darmstadt, DE) eran de calidad analítica.

Preparación de películas de PEGT/PBT (con carga de lisocima)

Una solución de lisocima (0,6 ml, 55 mg/ml) en PBS (pH 7,4) fue emulsionada en una solución de polímero en cloroformo (7 ml, 9% en peso PEGT/PBT) utilizando mezcla en ultratúrrax (30 s a 20,5 krpm). La emulsión resultante de agua en aceite fue moldeada sobre una placa de cristal utilizando una cuchilla de moldeo de 0,75 mm. Después de evaporación lenta del cloroformo, se separaron películas con un grosor de unas 50 \mum de la placa de vidrio se almacenaron con secado a 4ºC. Las películas de copolímero descargadas fueron moldeadas a partir de soluciones de 9% en peso en cloroformo utilizando las mismas condiciones. Para estudiar la influencia del compuesto de copolímero, se utilizaron diferentes polímeros, con el contenido de PBT variando de 20 a 60% en peso y un peso molecular de PEG de 600, 1000 y 4000. Para evaluar el efecto del peso molecular del polímero sobre la proporción de liberación de proteína, se degradó el polvo 1000PEG70PBT30 (2 g) en PBS (25 ml) a 37ºC y se utilizó como material de matriz para las películas cargadas de proteína. El tiempo de incubación fue de 3, 11, o 21 días y el tampón se renovó semanalmente. Después de la incubación, se retiró el tampón, los polímeros fueron lavados con metanol y secados durante 2 días en una estufa al vacío a 50ºC. El peso molecular del polímero fue estimado de la figura 21.

Preparación de películas de PEGT/PBT (cargadas con BSA e IgG)

Para preparar películas cargadas con BSA, se emulsionaron 0,5 - 2,5 ml de una solución acuosa de BSA (55 mg/ml PBS) en una solución de polímero en cloroformo (7 ml, 9% en peso de 1000PEG70PBT30) utilizando mezcla en ultratúrrax (30 s a 20,5 krpm), moldeando sobre una placa de cristal y procesando posteriormente, tal como se ha descrito para las películas con carga de lisocima. Para preparar películas con carga de IgG, se emulsionaron 0,6 ó 2,5 ml de una solución acuosa IgG (25 mg/ml PBS) en una solución de polímero en cloroformo (7 ml, 9% en peso de 1000PEG70PBT30) utilizando mezcla ultratúrrax (30 s a 20,5 krpm), con moldeo sobre la placa de cristal y proceso posterior, tal como se ha descrito para películas cargadas con lisocima.

Exploración con Microscopio Electrónico (SEM)

Se evaluó la estructura interna de las matrices cargadas con lisocima utilizando exploración con microscopio electrónico. Se fracturaron en congelación películas secas en nitrógeno líquido y se montaron sobre un soporte de sustrato. La superficie fue dotada de recubrimiento mediante bombardeo iónico con una delgada capa de oro y se estudió utilizando SEM de emisión de campo Hitachi S-800.

Absorción de agua

El comportamiento de hinchamiento de las películas fue evaluado por medición periódica del peso de las películas después de manchar la superficie con un paño. El contenido de agua se calculó de un modo siguiente:

contenido \ de \ agua \ (%) = 100 \ x \ (W_{1}-W_{0})/W_{0}

en la que W_{0} y W_{1} son los pesos de las películas seca e hidratada, respectivamente.

Degradación del polímero

Para determinar la degradación de matrices de polímero, se pesaron películas secas y se incubaron en PBS a 37ºC en un baño con agitación. Después de ciertos intervalos de tiempo, se tomaron muestras y se pesaron después de secado. La pérdida de peso se calculó del modo siguiente:

(2)pérdida \ de \ peso \ (%) = 100 \ x \ (W_{0} - W_{1})/W_{0}

en la que W_{0} y W_{1} son los pesos de las películas antes y después de incubación, respectivamente. El cambio de peso molecular de los polímeros se determinó utilizando Cromatografía de Permeación de Gel (GPC). Se eludieron muestras en cloroformo conteniendo hexafluoroisopropanol y acetonitrilo a través de una precolumna Waters Styragel Guard y columnas de 2 x 5 \mum Mixed-C 30 cm. El caudal fue de 1 mL/minuto y se utilizó un detector UV ajustado a 245 nm. La temperatura de la columna fue de 35ºC. Concentración de la muestra de 0,03%. El peso molecular se determinó con respecto a estándares de poliestireno y un estándar de PEGT/PBT.

Liberación de proteína

Las películas cargadas con proteína (50 \mum x 2,25 cm^{2}) fueron incubadas en 1,5 ml PBS (pH 7,4). Se agitaron los viales de 37ºC y se tomaron muestras en diferentes momentos. Se determinó el contenido de proteína utilizando un estándar de ensayo Coomassie Blue (Pierce). El tampón se renovó después del muestreo. La actividad de la lisocima liberada se evaluó utilizando un ensayo de Micrococcus lysodeikticus. De modo breve, 150 \mul de las muestras de lisocima o estándares (0-25 \mug/ml) se añadieron a una placa de microtitulación de 96 pocillos. Una suspensión de células de M. Lysodeikticus (100 \mul, 2,3 mg/ml) fue añadida y se midió la disminución de turbidez a 450 nm a intervalos de 15 segundos de 4 minutos a 37ºC. Los resultados fueron expresados como proporción cinética inicial (pendiente de OD con respecto al tiempo para t=0). La actividad de lisocima para la velocidad inicial correspondiente de una muestra se calculó a partir de una forma estándar de la concentración logarítmica con respecto a la proporción inicial.

Resultados

Se preparó una serie de matrices de PEGT/PBT cargadas con proteínas, delgadas (unas 50 \mum). La observación por microscopio electrónico de exploración mostró que las matrices secas tenían una estructura interna densa, con independencia del tipo de copolímero o del contenido de proteína de las matrices. Las matrices completamente hidratadas y cargadas de proteínas se volvieron opacas, indicando que los poros se habían formado en el linchamiento. No obstante, estos poros no pudieron ser detectados utilizando SEM, dado que la estructura de las películas hidratadas no se conservó durante la liofilización.

El comportamiento de hinchamiento de las matrices dependía notablemente de la composición de los copolímeros. La admisión de agua alcanzó el equilibrio dentro de tres días y disminuyó al aumentar el % de PBT de copolímero o al disminuir el peso molecular del componente PEG (figura 19). Como resultado de la incorporación de proteína, la absorción de agua se incrementó. La cinética de hinchado de matrices conteniendo proteínas era comparable a matrices sin carga. La retención de agua era rápida durante las primeras horas, y alcanzó equilibrio después de tres días (no se muestran datos).

Además del hinchado, la degradación del polímero puede influenciar en las características de liberación. Para estudiar la degradación del polímero, se incubaron películas en PBS a 37ºC. La pérdida de peso de las películas de copolímero se ha mostrado en la figura 20. Las matrices conteniendo porcentajes en peso crecientes de PEG mostraron una pérdida de peso más rápida durante el tiempo de incubación. Se observó fragmentación de las películas de 1000PEG70PBT30, mientras que las películas de 1000PEG60PBT40 y 1000PEG40PBT60 permanecieron intactas. No obstante, de la figura 20, es evidente que la pérdida de peso de las películas de PEGT/PBT era pequeña, y no contribuirá de manera significativa a la liberación de las moléculas incorporadas. El peso molecular promedio en peso disminuyó aproximadamente 50% en el período de tiempo de 54 días. Un gráfico del peso molecular promedio en número recíproco, M_{n}, como función del tiempo de incubación en PBS está constituido por una línea recta (figura 21), indicando que la degradación in vitro es provocada por hidrólisis sin catalización. No obstante, después de un cierto período de tiempo se alcanza un valor estable o "meseta" del peso molecular.

Se estudió la liberación de lisocima a partir de cinco copolímeros PEGT/PBT distintos. Para todas las composiciones de polímero, no se observó reventamiento inicial de proteínas, indicando que las proteínas quedan efectivamente atrapadas dentro del núcleo de las películas. Las características de liberación de la lisocima de las películas de PEGT/PBT era muy dependiente de la composición de los copolímeros. La lisocima fue liberada con una proporción casi constante (liberación de orden cero) de películas preparadas a partir de copolímeros 1000PEG70PBT30, 1000PG60PBT40, 1000PEG40PBT60 Y 600PEG77PBT23 (figura 22A). La capacidad de mantener una proporción de liberación constante es frecuentemente una característica deseable de un dispositivo de liberación controlada, pero es difícil de conseguir con un dispositivo de tipo material. Para copolímeros de PEGT/PBT basados en sistemas de liberación, la proporción de liberación constante se obtiene por un equilibrio preciso de la proporción de degradación del polímero y del coeficiente de difusión de la proteína a través de la matriz. La degradación del polímero tendrá como resultado un incremento del coeficiente de difusión, que puede compensar la concentración reducida de medicamento en la matriz, dando lugar a una proporción de liberación casi constante.

La proporción de liberación puede ser controlada por la composición de los copolímeros. Se obtuvieron proporciones de liberación de 1,5 hasta 7%/día para estos polímeros específicos. El incremento del porcentaje en peso de PBT, o la disminución en el peso molecular de los fragmentos de PEG, tuvo como resultado la disminución de la proporción de liberación. Esta disminución se puede explicar por la diferencia en grado de hinchado de los diferentes copolímeros. Cuanto mayor es el contenido de agua en equilibrio de las películas, mayor será la capacidad de la lisocima.

La liberación de lisocima a partir de 4000PEG80PBT20, copolímero que tiene un elevado contenido de agua en equilibrio (220%), era rápida en comparación con la liberación desde otras matrices (figura 22B). La liberación se completó dentro de dos horas, y la cantidad de lisocima liberada era proporcional a la raíz cuadrada del tiempo, lo que indica que la liberación sigue difusión Fickian, en vez de un perfil de orden cero. Esto se puede atribuir al hecho de que la difusión de lisocima a través de 4000PEG80PBT20 es rápida. Para tiempos de liberación cortos no se puede esperar efecto alguno de la degradación de polímero en la liberación.

Otra forma de controlar la proporción de liberación consiste en variar el peso molecular de los polímeros de PEGT/PBT. La disminución del peso molecular tiene como resultado el incremento de la proporción de liberación (figura 23), que se puede atribuir a una reducción de la resistencia con respecto a la difusión con disminución del peso molecular.

Una importante característica de un sistema de liberación de proteína o péptido es la estabilidad de las proteínas. La agregación de la proteína puede ocurrir durante los períodos de formulación, almacenamiento y liberación. Por ejemplo, hay una considerable preocupación en la utilización de poliláctidos y copolímeros como matrices para suministro de proteínas. La degradación de poliláctidos y copolímeros genera una caída de pH en las matrices de polímero, que puede provocar problemas de inestabilidad de la proteína. Se puede esperar que los copolímeros PEGT/PBT provocarán menos problemas de estabilidad de proteína en comparación con sistemas basados en poliláctidos, dado que la degradación de PEGT/PBT es más lenta y genera menos grupos extremos ácidos. Para investigar los problemas de estabilidad de proteínas con respecto a los sistemas PEGT/PBT, se determinó la actividad enzimática de la lisocima liberada (figura 24). No se observó disminución de actividad, indicando que la proteína no había sufrido daños durante los períodos de formulación, almacenamiento y liberación.

La liberación de proteínas de las películas de 1000PEG70PBT30 dependía del peso molecular de las proteínas (figura 25): para niveles de carga bajos (3,3% en peso de la proteína) la liberación de proteínas con un peso molecular elevado (BSA, 67 kD; IgG, 160 kD) era menor de 10%, mientras que la liberación de lisocima (14,4 kD) era de 100% después de 20 días. Esto se puede atribuir a la baja capacidad de difusión de las proteínas HMW. La proporción de difusión se puede incrementar al aumentar la porosidad de una matriz. La porosidad de las películas de PEGT/PBT cargadas con proteínas depende de la cantidad de no disolvente (solución de proteína) que se mezcla con la solución de polímero durante la preparación de la emulsión de agua en aceite. El incremento de la fracción no disolvente (proporción agua/polímero) provocará un incremento de la porosidad. En la figura 26, se ha mostrado la influencia de la proporción agua/polímero de la emulsión inicial agua en aceite sobre la absorción de agua de matrices con carga de BSA. Se observó que la retención de agua incrementaba al aumentar la proporción agua/polímero, indicando que se habían producido matrices con porosidad creciente. Las características de liberación de BSA e IgG a partir de películas de 1000PEG70PBT30 dependían fuertemente de la proporción agua/polímero de la emulsión inicial de agua en aceite, y por lo tanto de la porosidad de las películas (figuras 27 y 10). El incremento de la porosidad provocaba un incremento de la proporción de liberación. Las películas preparadas a partir de emulsiones con una elevada proporción agua/polímero proporcionaban liberación en reventamiento, mientras que la liberación de BSA a partir de películas con una proporción menor agua/polímero era casi constante, como mínimo, durante 40 días.

Conclusión

Se prepararon, utilizando una técnica de agua en aceite, películas delgadas de poliéster (unas 50 \mum) cargadas con diferentes proteínas, de modo satisfactorio. La proporción de liberación de proteínas a partir de películas de PEGT/PBT se pudo manipular mediante varios parámetros. Las proporciones de liberación disminuyeron al disminuir la proporción de PEGT/PBT y al disminuir el peso molecular del componente PEG. Además, un incremento en el peso molecular provocaba la disminución en la proporción de liberación. La liberación de lisocima siguió una cinética de orden cero, sin liberación en reventamiento de proteína. Al cambiar la porosidad de las películas, se pudieron aplicar polímeros de PEGT/PBT como matriz para la liberación de proteínas HMW, tales como BSA e IgG. Finalmente, la determinación de la actividad de lisocima mostró que las proteínas no sufrían daños durante los períodos de formulación, almacenamiento y liberación.

Ejemplo 5 Liberación continua de proteínas a partir de microesferas de PEGT/PBT Materiales

En este ejemplo, se sintetizaron copolímeros de poli(óxido de etileno)tereftalato/poli(1,4-butilén)tereftalato(PEGT/
PBT), en los que dichos polímeros tenían proporciones en peso de PEGT/PBT de 77/23, 70/30, 60/40, 55/45 y 40/60. El componente de polietilén glicol de los polímeros que tenían proporciones en peso de PEGT/PBT de 70/30, 60/40 y 40/60 tenían un peso molecular de 1000. Para los copolímeros con una proporción en peso de PEGT/PBT de 77/23 y 55/45, el peso molecular del componente de polietilén glicol era de 600. Dichos copolímeros se indican como aPEGbPBTc, en el que a es el peso molecular de PEG, b es el % en peso de PEG-tereftalato y c el % en peso de PBT.

Se adquirió la solución salina tamponada de fosfato (PBS) de pH 7,4 de la firma NPBI (Emmer-compascuum, NL). El alcohol polivinílico (PVA, M_{w} = 22.000) fue comprado de ICN Biomedical Inc., la lisocima de clara de huevo (cristalizada 3x, dializada y liofilizada) fue adquirida de Sigma Chem Corp. (St. Louis, USA). El ácido 2,3,6-trinitrobencenesulfónico (TNBS) a 1M se adquirió de la firma Fluka Chemika, NaHCO_{3}, NaOH 1M, HCl (37%), Cloroformo (CHCl_{3}) y metanol (MeOH), obtenidos de Merck (Darmstadt, DE) eran de calidad analítica.

Preparación de microesferas de PEGT/PBT cargadas de proteínas

Se emulsionó una solución de lisocima (0,6 ml, 55 mg/ml) en PBS (pH 7,4) en una solución de 1 gr de PEGT/PBT en cloroformo utilizando mezcla en ultratúrrax (30 s a 20,5 krpm). La emulsión resultante de agua en aceite fue añadida lentamente a 50 ml de PBS conteniendo 4% en peso de PVA (M_{w}=22000) y, después de 5 minutos de agitación a 400 rpm, se añadieron 200 ml de PBS. Esto se mantuvo a una velocidad de agitación constante de 800 rpm durante 2 horas. Las microcápsulas fueron recogidas por filtración, lavadas con PBS y liofilizadas. Para preparar microesferas de diferentes dimensiones, la concentración de la solución de polímero fue variada de 0,14 a 0,048 g/ml. La viscosidad de soluciones de polímero se determinó utilizando un aparato Ubbelohde (Canon 55, L117) a 20ºC. Para estudiar la influencia del compuesto copolímero, se utilizaron diferentes polímeros con un contenido de PBT variando de 30 a 60% en peso y un peso molecular de PEG de 600 y 1000. Se prepararon microesferas a partir de una solución de 0,6 ml de lisocima de (55 mg/ml PBS, pH 7,4) y una solución de 1 gr de PEGT/PBT en 7 ml de cloroformo, tal como se ha descrito anteriormente.

Determinación de la carga de lisocima

Se incubaron microcápsulas (20-30 mg) o 50 \mul de una solución estándar de lisocima (0-1 mg/ml) durante 24 horas a 37ºC con 1 ml de HCl 6M. Después de ello, se añadieron 6 ml NaOH 1M y la suspensión fue incubada durante otras 24 horas a 37ºC. La concentración de proteína en la solución fue determinada utilizando un ensayo TNBS. De modo breve, 50 \mul de las muestras se añadieron a una placa de microtitulación de 96 pocillos, después de lo cual se añadieron a cada pocillo 125 \mul de una solución a 4% (peso/volumen) NaHCO_{3} (pH=9) y 50 \mul de una solución a 0,5% (peso/volumen) de TNBS. Después de 2 horas de incubación a temperatura ambiente, se midió la extinción en 450 nm utilizando un lector microelisa SLT 340 AC. La extinción fue relacionada con la concentración de lisocima utilizando los estándares de lisocima.

Determinación del tamaño de microesferas

El tamaño de las microesferas (hinchadas) (peso en número y peso en volumen) fue determinada utilizando un aparato Microtrac (X100, Leeds & Northrup).

Microscopio Electrónico de Exploración (SEM)

Se utilizó un microscopio Hitachi S-800 de emisión de campo SEM para evaluar las características superficiales de las microesferas. La estructura interna fue observada fracturando las microesferas en nitrógeno líquido.

Liberación de proteínas

Se incubaron microesferas cargadas con proteínas (15 mg) en 1,5 ml PBS (pH 7,4) y fueron sometidas a agitación a 37ºC. En varios puntos de tiempo la suspensión fue centrifugada, y se tomaron muestras del sobrenadante. El contenido de proteínas se determinó utilizando un ensayo estándar Coomassie Blue (Pierce).

El tampón fue renovado después del muestreo.

Resultados

Se prepararon microesferas de PEGT/PBT conteniendo lisocima utilizando un método de emulsión de agua en aceite en agua. El rendimiento de microesferas (masa de las microesferas/masa del polímero utilizado para la preparación) fue de 85% aproximadamente. El SEM mostró que las microesferas eran perfectamente esféricas. El interior de las esferas era denso, con algunos poros pequeños (aproximadamente 100 nm), excepto en las microesferas 1000PEG40PBT60, que son huecas y muy porosas. Las características de los diferentes lotes se indican en la tabla XX y en la tabla XXI.

Tabla XX

Características de las microesferas de 600PEG77PBT23 cargadas de lisocima preparadas a partir de soluciones de polímeros a diferentes concentraciones.

20

La influencia de la concentración de polímero en el tamaño de las microesferas fue investigado. La Tabla XX muestra que una concentración decreciente de polímero tenía como resultado partículas más pequeñas y una distribución de tamaños más reducida. Es sabido que la dimensión de las gotas de la emulsión depende de una serie de variables, que se indican en la fórmula (3):

(3)d\alpha K\frac{D_{v}R\nu_{d}\gamma}{D_{s}N\nu_{c}C_{v}}

en la que D_{v} = diámetro del recipiente de filtrado, D_{s} = diámetro del agitador, R = proporción de volumen de fase dispersa/fase continua, \nu_{d} = viscosidad de la fase dispersa, \nu_{c} = viscosidad de la fase continua, N = velocidad de agitación, \gamma = tensión superficial entre la fase dispersa y continua y C_{s} = concentración del estabilizante. Esta fórmula facilita una predicción de una relación lineal entre el tamaño de las microesferas y la viscosidad de la solución de polímero, lo cual fue confirmado por la figura 29.

Tabla XXI

Características de las microesferas de PEGT/PBT cargada con lisocima preparadas a partir de polímeros de diferente composición de copolímero (concentración de la solución de polímeros es 0,143 g/ml de cloroformo).

21

El rendimiento de encapsulado de la lisocima en microesferas de PEGT/PBT varió desde 60 hasta 100%. En general, la cantidad de proteína encapsulada disminuyó al aumentar la hidrofilicidad de los polímeros y al disminuir el tamaño. Esto puede ser el resultado de liberación de lisocima durante las dos horas de evaporación de disolvente en PBS. Esta liberación aumentará al incrementar el contenido de agua en equilibrio (mayor difusividad) y mayor superficie de las esferas. El rendimiento de encapsulado reducido de 1000PEG40PBT60 se puede explicar por la estructura porosa de estas microesferas.

La liberación de la lisocima fue estudiada como función de las dimensiones de las microesferas y de la composición de los copolímeros. La figura 30 muestra que la liberación de lisocima a partir de microesferas de 600PEG77PBT23 preparadas a partir de soluciones con concentración de polímero decreciente tuvo como resultado el incremento de la velocidad de liberación. Tal como se ha explicado anteriormente, la concentración de polímero decreciente provocó dimensiones decrecientes de las microesferas, y por lo tanto un área superficial mayor por volumen, lo que tiene como resultado una difusión más rápida. La figura 31 muestra que la velocidad de liberación (%/día) del primer 50% de lisocima liberada es proporcional al esfera-diámetro recíproco, lo que es coherente con la literatura.

La lisocima fue liberada con una velocidad casi constante (liberación de orden cero) a partir de las microesferas de 600PEG77PBT23, sin liberación por reventamiento inicial de proteínas. Tal como se ha explicado en el ejemplo 4, la proporción de liberación constante es muy probablemente el resultado de un equilibrio preciso entre la velocidad de difusión de la proteína a través de la matriz y la velocidad de degradación de los polímeros.

Otro parámetro que puede ser utilizado para manipular las velocidades de liberación es la composición del copolímero. La figura 32 muestra la liberación a partir de microesferas de cinco copolímeros distintos. No se observó reventamiento inicial de proteína, indicando que las proteínas están efectivamente atrapadas dentro de las microesferas. Además, las velocidades de liberación eran casi constantes, excepto para 1000PEG40PBT60. En general, un incremento del porcentaje de PBT, o una disminución en el peso molecular de los segmentos PEG, tuvo como resultado una disminución de la velocidad de liberación. Tal como se ha explicado en el ejemplo 4, esta disminución puede ser explicada por la diferencia en grado de hinchado de los diferentes copolímeros. La liberación de 1000PEG40PBT60 era más rápida de lo esperado, lo que se puede explicar por la estructura porosa de estas microesferas.

Conclusión

Las microesferas de polieteréster, conteniendo lisocima, fueron preparadas satisfactoriamente utilizando una técnica de emulsión agua en aceite en agua. El rendimiento del encapsulado era elevado (60-100%). Las dimensiones de las microesferas de PEGT/PBT se pudo adaptar por la concentración de la solución de polímero que fue utilizada en el proceso de emulsión. La liberación de lisocima a partir de las esferas de polieteréster siguió una cinética de orden cero, sin liberación por reventamiento de la proteína, y se pudo manipular por la composición de copolímero y las dimensiones de las microesferas.

Ejemplo 6 Predicción de la liberación de proteína a partir de matrices de PEGT/PBT Materiales

En este ejemplo, se sintetizaron cinco copolímeros de poli(óxido de etileno) tereftalato/poli(1,4-butilén tereftalato) (PEGT/PBT), de manera que dichos copolímeros tenían proporciones en peso PEGT/PBT de 80/20, 77/23, 70/30, 60/40 y 40/60. El componente de polietilén glicol en los polímeros con proporciones en peso de PEGT/PBT de 70/30, 60/40 y 40/60 tenía un peso molecular de 1.000. Para el copolímero con una proporción en peso de PEGT/PBT de 77/23, el peso molecular del componente de polietilén glicol era de 600 y, para polímero con una proporción en peso PEGT/PBT de 80/20, el peso molecular del componente de polietilén glicol era de 4.000. Estos copolímeros quedan indicados como aPEGbPBTc, en el que a es el peso molecular de PEG, b es el % en peso de PEG-tereftalato y c es el % en peso de PBT.

Se adquirió solución Salina Tamponada Fosfatada (PBS), pH 7,4 de la firma NPBI (Emmer-compascuum, NL). El alcohol polivinílico (PVA, M_{w} = 22.000) fue obtenido de la firma ICN Biomedical Inc., Lisocima a partir de clara de huevo (cristalizada 3x, dializada y liofilizada) fue adquirida de la firma Sigma Chem Corp. (St. Louis, USA). El ácido 2,3,6-trinitrobencensulfónico 1M (TNBS) fue adquirido de Fluka Chemika, NaHCO_{3}, NaOH 1M, HCl (37%), Cloroformo (CHCl_{3}) y metanol (MeOH), obtenidos de la firma Merck (Darmstadt, DE) eran de calidad analítica.

Preparación y caracterización de microesferas (conteniendo lisocima) y películas

La preparación y caracterización de las películas conteniendo lisocima y microesferas fue llevada a cabo tal como se describe en los ejemplos 4 y 5.

Determinación del coeficiente de difusión inicial

El coeficiente de difusión inicial de lisocima a través de películas de PEGT/PBT se determinó como función de la composición del copolímero. La liberación de lisocima fue determinada tal como se describe en el ejemplo 1. Los coeficientes de difusión fueron determinados por trazado de un gráfico de la liberación de lisocima fraccional M_{t}/M_{\infty} con respecto al (tiempo)^{1/2}. Desde la primera parte de las curvas, que es una línea recta, el coeficiente de difusión inicial D_{0} fue estimado utilizando la ecuación (4):

(4)M_{t}/M_{\infty}= \ 4 \ (D_{0}t/\pi l^{2})^{1/2}

en la que l es el grosor de la película y t es el tiempo.

La figura 33 muestra la liberación de lisocima a partir de películas de PEGT/PBT de diferente composición en función del (tiempo)^{1/2}. Los coeficientes de difusión calculados a partir de la primera parte de las curvas eran muy pequeñas en comparación con la difusión de lisocima en agua (10^{-6} cm^{2}/s) (tabla XXII). Los coeficientes de difusión dependían notablemente del hinchado de los copolímeros (figura 34). El incremento en retención de agua de las matrices de 40% hasta 220% provocó un incremento de casi 5.000 veces en el coeficiente de difusión. Esto demuestra nuevamente que una amplia gama de velocidades de liberación puede ser obtenida utilizando un sistema PEGT/PBT como matrices para liberación de medicamentos.

Tabla XXII

Retención de agua de copolímeros de PEGT/PBT y coeficiente de difusión de lisocima en función de la composición de un polímero. Se prepararon películas cargadas de proteínas a partir de emulsiones de agua en aceite conteniendo 1,2 ml de solución de lisocima (55 mg/ml PBS) y 2 g de polímero (9% en peso en CHCl_{3}).

22

Modelación de la liberación de proteína

Tal como se ha descrito en el ejemplo 1, la liberación constante a partir de las matrices de PEGT/PBT es muy probablemente el resultado de la influencia de la degradación del polímero en la difusión a través de la matriz del polímero. Para cuantificar el efecto de la degradación del polímero sobre la difusión de la lisocima a través de la matriz de polímero, se debe hallar la relación entre el coeficiente de difusión y el peso molecular de los polímeros. Se obtuvieron polímeros con diferente peso molecular por incubación de 1000PEG70PBT30 en polvo (2 g) en PBS (25 ml) a 37ºC. El tiempo de incubación era de 3, 5, 7, 11, 14 ó 21 días, y el tampón se renovó semanalmente. Después de la incubación, el tampón fue eliminado, los polímeros fueron lavados con metanol y secados durante dos días en una estufa en vacío a 50ºC. El peso molecular del polímero fue estimado a partir de la figura 21. Las películas conteniendo proteínas, la liberación de la lisocima y los coeficientes de difusión fueron determinados tal como se ha descrito en la anterior.

La figura 35 muestra la liberación de lisocima a partir de películas de PEGT/PBT de diferente peso molecular en función del (tiempo)^{1/2}. La disminución en la velocidad de liberación fue observada al incrementar el peso molecular. Los coeficientes de difusión, calculados a partir de la primera parte de las curvas, se trazaron con respecto a (1/M_{n})^{2} dando lugar a una línea recta (figura 36):

(5)D = k_{1} \ x \ (1/M_{n})^{2} + k_{2}

De la figura 21 es conocido que

(6)(1/M_{n}) = k_{3} \ x \ t + (1/M_{n,0})

en la que D = coeficiente de difusión, M_{n} = peso molecular promedio en número, t = tiempo, M_{n,0} = peso molecular promedio en número a t = 0, y k_{1} ...k_{3} son constantes. Combinando (5) y (6) y substituyendo D = D_{0} en t = 0, ello resulta en la ecuación (7) para un coeficiente de difusión que depende del tiempo:

(7) D(t) = D_{0} \ x \ (1 + a \ t + b \ t^{2})

El valor de a y b se pueden calcular a partir de las figuras 21 y 36, y D_{0} para difusión de lisocima a través de diferentes copolímeros de PEGT/PBT se puede determinar a partir de la figura 34. Para describir la difusión de lisocima a través de matrices de PEGT/PBT, se pueden incorporar los coeficientes de difusión dependientes del tiempo en las ecuaciones para difusión por medio de una substitución simple (Crank, The mathematics of diffusion):

T=\int\limits^{t}_{0}D(t^{1})dt^{1}

(8)T=D_{0}(t+0,5at^{2}+bt^{3})

La difusión desde las esferas se puede describir por

\frac{M_{t}}{M_{\infty}}=1-\frac{6}{\pi^{2}}exp(-\frac{\pi^{2}T}{r^{2}})

\hskip12,5cm

M_{t}/M_{\infty}>{0,6}

\hskip0,7cm

(9)

\frac{M_{t}}{M_{\infty}}=\sqrt[6]{\frac{T}{\pi r^{2}}}

\hskip12,5cm

M_{t}/M_{\infty}<{0,4}

\hskip0,7cm

(10)

en las que r es el radio de la esfera.

La difusión desde películas se puede describir por

\frac{M_{t}}{M_{\infty}}=1-\frac{8}{\pi^{2}}exp(-\frac{\pi^{2}T}{\pi^{2}})

\hskip12,5cm

M_{t}/M_{\infty}>{0,6}

\hskip0,7cm

(11)

\frac{M_{t}}{M_{\infty}}=\sqrt[4]{\frac{T}{\pi r^{2}}}

\hskip12,5cm

M_{t}/M_{\infty}<0,4

\hskip0,7cm

(12)

en las que r es el grosor de la película.

La figura 37 muestra como resultados de cálculo de la liberación de lisocima a partir de películas 1000PEG70
PBT30, 1000PEG60PBT40 y 1000PEG40PBT60 y microesferas 1000PEG70PBT30 y 1000PEG60PBT40 utilizando el modelo anteriormente indicado. Las constantes utilizadas en el cálculo se indican en la tabla XXIII. Es evidente que el modelo es satisfactorio, ya que la curva de liberación calculada sigue íntimamente la curva experimental.

Tabla XXIII

Constantes utilizadas en las ecuaciones (8)-(12) para calcular la liberación de lisocima a partir de matrices de PEGT/PBT. a = 10^{-5}s^{-1}; b = 1,3 x 10^{-12}s^{-2}.

23

Conclusión

Se ha demostrado que la liberación se puede describir por una combinación de difusión y degradación del polímero. Para matrices moderadamente hinchadas, la degradación del polímero tendrá como resultado el incremento del coeficiente de difusión, que puede compensar la concentración reducida de medicamento en la matriz, para dar lugar a una velocidad de liberación casi constante. No obstante, para matrices completamente hinchadas, la difusión es rápida en comparación con la degradación, resultando ello en una liberación de primer orden. Un modelo matemático del mecanismo de liberación fue desarrollado de manera coherente con las observaciones experimentales. Esto ofrece la posibilidad de adaptar las direcciones de liberación de medicamentos de matrices de PEGT/PBT de manera precisa.

Descripción de las figuras

La figura 1 muestra una distribución típica de tamaños de un lote de microesferas PolyActive en \mum.

La figura 2 muestra el efecto de la concentración (%) de PVA en el diámetro promedio para peso en volumen (\medbullet) y el diámetro promedio para peso en número (\blacksquare) en \mum a 5% de PolyActive (peso/volumen) con una proporción de PEGT/PBT de 70/30; velocidad de agitación: 1200 rpm.

La figura 3 muestra el efecto de la concentración (%) de PolyActive (PA) en el diámetro promedio de peso en volumen (\blacksquare) y el diámetro promedio de peso en número (\medbullet) en \mum a 5% PVA (peso/volumen) con una proporción de PEGT/PBT de 70/30; velocidad de agitación: 1200 rpm.

La figura 4 muestra la liberación de BSA a partir de microesferas PA 60/40; "10%" hace referencia a la concentración de PA en CH_{2}Cl_{2}.

La figura 5 muestra la liberación de BSA a partir de microesferas PA 70/30; "10%" se refiere a la concentración de PA en CH_{2}Cl_{2}.

La figura 6 muestra la liberación de BSA a partir de microesferas PLGA; "10%" se refiere a la concentración de PLGA en CH_{2}Cl_{2}; SD significa partículas secadas por pulverización.

La figura 7 muestra la liberación del toxoide de difteria a partir de microesferas PA 60/40 y 70/30; "10%" se refiere a la concentración de PA en CH_{2}Cl_{2}.

La figura 8 muestra la liberación del toxoide de difteria a partir de microesferas PA 80/20; "10%" se refiere a la concentración de PA en CH_{2}Cl_{2}.

La figura 9 muestra la liberación de lisocima a partir de microesferas de PA 80/20.

Las figuras 10A y 10B muestran la liberación de lisocima a partir de microesferas de PA 80/20 como función del tiempo y como función de la raíz cuadrada del tiempo, respectivamente.

La figura 11 muestra el peso molecular promedio en peso (M_{w}) de PLGA y PA en microesferas como función del tiempo de envejecimiento.

La figura 12 muestra perfiles de liberación de indometacina a partir de dispositivos PolyActive: + (\cdot-\cdot-\cdot) PEG 1000 40/60; \square (- - - -) PEG 1000 60/40; \circ (- - - -) PEG 1000 80/20: + (\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot) PEG 600 40/60;

\tb

(------) PEG 600 60/40;
\cdot (- - -) PEG 600 77/23.

Las figuras 13A y 13B muestran la pérdida de peso del granulado de Polyactive con \alpha-tocoferol y con Trolox, respectivamente.

Las figuras 14A y 14B muestran valores M_{w} promedio (n=3) para varillas irradiadas con rayos gamma de varillas de PEGT/PBT 70/30, con el porcentaje de la masa original en la figura 14B.

La figura 15 muestra valores M_{w} promedio (n=3) para varillas PEGT/PBT 70/30 irradiadas con rayos gamma o no irradiadas con rayos gamma, con antioxidantes: -\circ- \alpha-tocoferol \gamma irradiado; -\Delta- \alpha-tocoferol no irradiado; -\bullet- Trolox \gamma irradiado; -\vardiamondsuit- Trolox no irradiado.

La figura 16 muestra valores promedio M_{w} (n=3) para varillas de PEGT/PBT 70/30 irradiadas con rayos gamma y no irradiadas con rayos gamma en una solución 0,9% NaCl con antioxidantes: -\circ- \alpha-tocoferol \gamma irradiado; -\Delta- \alpha-tocoferol no irradiado; -\bullet- Trolox \gamma irradiado; -\vardiamondsuit- Trolox no irradiado.

La figura 17 muestra formación de ácido fórmico como % OCH_{2}CH_{2} para varillas PEGT/PBT 70/30 nos. 7 (-\circ-), 8 (-\Delta-), 11 (-\bullet-) y 13 (-\vardiamondsuit-).

La figura 18 muestra la concentración de ácido acético en mg/l en un medio para varillas PEGT/PBT 70/30 nos. 7 (-\circ-), 8 (-\Delta-), 11 (-\bullet-), 13 (-\vardiamondsuit -) y 15(-\diamond-).

La figura 19 muestra la absorción de agua de películas de copolímero de PEGT/PBT como función del tiempo; (\boxempty) 4000PEG80PBT20; (\circ) 1000PEG70PBT30; (\diamond) 1000PEG60PBT40; (\Delta) 1000PEG40PBT60; (\nabla) 600PEG77PBT23; n = 3 \pm S.D.

La figura 20 muestra la degradación de películas: (\boxempty) 1000PEG70PBT30; (\diamond) 1000PEG60PBT40; (\circ) 1000PEG40
PBT60 en PBS a 37ºC. Los símbolos llenos (parte inferior) indican pérdida de peso (n=2 \pm S.D.), los símbolos abiertos (parte superior) representan M_{w}.

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La figura 21 muestra el cambio del valor recíproco de M_{n} como función del tiempo de incubación en PBS a 37ºC de películas de (\boxempty) 1000PEG70PBT30; (\diamond) 1000PEG60PBT40; (\circ) 1000PEG40PBT60.

Las figuras 22A y 22B muestran una liberación acumulativa de lisocima a partir de películas de PEGT/PBT como función del tiempo y como función de la raíz cuadrada del tiempo para 4000PEG80PBT20, respectivamente.

La figura 23 muestra el efecto del peso molecular del polímero sobre la liberación acumulativa de lisocima a partir de películas de 1000PEG70PBT30. M_{n} = 45.100 (\boxempty), 42.000 (\diamond), 36.600 (\Delta) o 28.700 (o) g/mol.

La figura 24 muestra la actividad de la lisocima liberada a partir de matrices de (\circ) 1000PEG60PBT40; (\diamond) 1000PEG40PBT60. (N=3 \pm S.D.).

La figura 25 muestra la liberación de proteína acumulativa (%) a partir de matrices de 1000PEG70PBT30. La liberación de lisocima (\diamond), BSA (\boxempty) y IgG (\Delta). Las películas fueron preparadas a partir de emulsiones de agua en aceite conteniendo 0,6 ml de una solución de lisocima (55 mg/ml PBS) y 1 g de polímero (9% en peso en CHCl_{3}). (n=3 \pm S.D.).

La figura 26 muestra la influencia de la proporción agua/polímero en la emulsión inicial agua en aceite sobre la absorción de agua de películas de BSA 1000PEG70PBT30 (n=3 \pm S.D.).

La figura 27 muestra el efecto de 1000PEG70PBT30 sobre la liberación acumulativa de BSA. La absorción de agua (w.u.) Se considera medida de la porosidad. (n=3 \pm S.D.).

La figura 28 muestra el efecto de la proporción agua/polímero de la emulsión inicial agua en aceite (w/p) y la absorción de agua sobre la liberación acumulativa de IgG a partir de matrices de 1000PEG70PBT30. (n=3 \pm S.D.).

La figura 29 muestra el diámetro medio (volumen) de las microesferas de 600PEG77PBT23 cargadas de lisocima como función de la viscosidad de las soluciones de polímero.

La figura 30 muestra la liberación de lisocima a partir de microesferas de 600PEG77PBT23 preparadas a partir de soluciones de polímero con concentraciones distintas.

La figura 31 muestra la liberación inicial de lisocima a partir de microesferas de 600PEG77PBT23 como función de la dimensión recíproca de las microesferas.

La figura 32 muestra la liberación de lisocima a partir de microesferas de PEG/PBT como función de la composición del copolímero.

La figura 33 es un gráfico de M_{t}/M_{\infty} con respecto a (tiempo)^{1/2} para la liberación de lisocima a partir de matrices de PEGT/PBT para diferentes copolímeros.

La figura 34 muestra el coeficiente de difusión inicial de lisocima a través de matrices de PEGT/PBT como función de la absorción de agua.

La figura 35 es un gráfico de M_{t}/M_{\infty} con respecto a (tiempo)^{1/2} para la liberación de lisocima a partir de matrices de 1000PEG70PBT30 con diferente peso molecular.

La figura 36 muestra el coeficiente de difusión inicial de lisocima a través de matrices de 1000PEG70PBT30 como función del peso molecular.

Las figuras 37A-E muestran una predicción de liberación de proteína a partir de películas (A) 1000PEG70PBT30; (B) películas 1000PEG60PBT40; (C) películas 1000PEG40PBT60; (D) microesferas 1000PEG70PBT30 y (E) microesferas 1000PEG60PBT40; ------: calculada; o: experimental.

Claims (16)

1. Compuesto para suministrar un agente biológicamente activo a un hospedante, que comprende un agente biológicamente activo encapsulado en una matriz que comprende un copolímero de polialquilén glicol y poli(butilén tereftalato).

2. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que dicho polialquilén glicol es seleccionado del grupo que consiste en polietilén glicol, polipropilén glicol y polibutilén glicol y copolímeros de los mismos.

3. Compuesto, según la reivindicación 2, en el que dicho copolímero es un copolímero de polietilén glicol/poli(butilén tereftalato).

4. Compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho componente de polialquilén glicol constituye del 30% en peso hasta 90% en peso del peso de dicho copolímero.

5. Compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho agente biológicamente activo es un medicamento no péptido, no proteína.

6. Compuesto, según la reivindicación 5, en el que el componente de polialquilén glicol de dicho copolímero tiene un peso molecular de 200 a 400.

7. Compuesto, según la reivindicación 5 ó 6, en el que dicha matriz comprende además de 0,5% en peso a 2% en peso de uno o varios antioxidantes hidrofóbicos, basado en el peso total de la matriz.

8. Compuesto, de acuerdo a las reivindicaciones 5-7, en el que 0,1 mol% a 20 mol% de dicho poli(butilén tereftalato) es sustituido por un poliéster alifático, tal como poli(alquilén succinato) y/o un poliéster aromático de un dialquilén glicol, en una cantidad de 0,1 mol% a 5 mol%.

9. Compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que 0,1 mol% a 20 mol% de dicho poli(butilén tereftalato) es sustituido por un poli(dietilénglicol tereftalato).

10. Compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho agente biológicamente activo es una proteína biológicamente activa que tiene un peso molecular superior a 10.000.

11. Compuesto, según la reivindicación 10, en el que el polialquilén glicol de dicho copolímero tiene un peso molecular de 1.000 a 20.000.

12. Compuesto, según la reivindicación 10 u 11, en el que dicha matriz comprende además hasta 10% en peso, basado en el peso de dicho copolímero, de polietilén glicol con un peso molecular de 4.000 a 10.000.

13. Compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho agente biológicamente activo es un péptido biológicamente activo o una proteína biológicamente activa que tiene un peso molecular menor de 10.000.

14. Compuesto, según la reivindicación 13, en el que dicho polietilén glicol tiene un peso molecular de 200 a 6000.

15. Compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 10-14, en el que dicha matriz comprende además de 1,0% en peso hasta 5,0% en peso de un antioxidante hidrofílico, basado en el peso total de la matriz.

16. Compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha matriz tiene la forma de microesferas, varillas, bloques porosos o no porosos, esponjas, partículas, membranas, emplastos, películas, cintas o hilos.