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EP1078990A1 - Fermentatives Verfahren zur Gewinnung natürlicher, aliphatischer und Thiocarbonsäuren und Mikroorganismus dafür - Google Patents

Fermentatives Verfahren zur Gewinnung natürlicher, aliphatischer und Thiocarbonsäuren und Mikroorganismus dafür Download PDF

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Publication number
EP1078990A1
EP1078990A1 EP99116711A EP99116711A EP1078990A1 EP 1078990 A1 EP1078990 A1 EP 1078990A1 EP 99116711 A EP99116711 A EP 99116711A EP 99116711 A EP99116711 A EP 99116711A EP 1078990 A1 EP1078990 A1 EP 1078990A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gluconobacter
acid
bacteria
production
aliphatic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP99116711A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jürgen Dr. Rabenhorst
Ian Dr. Gatfield
Jens-Michael Dr. Hilmer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Haarmann and Reimer GmbH
Original Assignee
Haarmann and Reimer GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Haarmann and Reimer GmbH filed Critical Haarmann and Reimer GmbH
Priority to EP99116711A priority Critical patent/EP1078990A1/de
Priority to EP00117247A priority patent/EP1081229A1/de
Priority to AU53454/00A priority patent/AU5345400A/en
Priority to JP2000249790A priority patent/JP2001086996A/ja
Priority to CA002316526A priority patent/CA2316526A1/en
Priority to IL13799200A priority patent/IL137992A0/xx
Priority to SK1273-2000A priority patent/SK12732000A3/sk
Priority to NZ506517A priority patent/NZ506517A/en
Priority to KR1020000049136A priority patent/KR20010050180A/ko
Priority to MXPA00008296A priority patent/MXPA00008296A/es
Priority to BR0003775-3A priority patent/BR0003775A/pt
Priority to NO20004238A priority patent/NO20004238L/no
Priority to CN00126051A priority patent/CN1286307A/zh
Priority to HU0003414A priority patent/HUP0003414A3/hu
Publication of EP1078990A1 publication Critical patent/EP1078990A1/de
Priority to US10/377,505 priority patent/US20030170774A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P11/00—Preparation of sulfur-containing organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/52—Propionic acid; Butyric acids

Definitions

  • the present invention relates to a biological method for production various carboxylic acids by the enzymatic oxidation of the corresponding Alcohols with alcohol oxidase in very high yields.
  • the alcohol oxidase is of bacteria of the genus Gluconobacter, preferably of the species Gluconobacter sp. HR 101, (DSM 12884).
  • benzoic acid is made from benzyl alcohol, Butyric acid from n-butanol, isobutyric acid from isobutanol, isovaleric acid from isoamyl alcohol, 2-methylbutyric acid from 2-methylbutanol, 3-methylthiopropionic acid from 3-methylthiopropanol, phenylacetic acid from phenylethanol, propionic acid made from propanol and cinnamic acid from cinnamon alcohol.
  • DE 3713668 describes the production of aliphatic carboxylic acids by microbial oxidation of aliphatic alcohols with bacteria of the species Gluconobacter roseus. The alcohols were after a growth phase of over 24 hours directly into the culture medium with the organism. The preferred pH range was given as 4 to 4.5. There were only low yields of 13 g n-butyric acid / L, 21 g isobutyric acid / L, 7 g 2-methylbutyric acid / L and 17 g Obtain 3-methylbutyric acid / L fermentation solution.
  • DE 195 03 598 describes a process for the preparation of propionic acid or butyric acid or salts thereof. They use a bacterium of the species Gluconobacter oxydans. After 9 to 10 hours of cultivation, n-propanol or n-butanol was added repeatedly in portions depending on the pO 2 value. They achieved yields of 43.7 g / L propionic acid and 49 g / l butyric acid.
  • EP 0563346 describes a process for the production of carboxylic acids by oxidation corresponding alcohols or aldehydes with the help of a yeast of the genus Saccharomyces, Hansenula, Pichia, Candida or Kluyvermyces. Disadvantageous is here that with the yeasts only get low product concentrations very high biomass concentrations have to be used and for a long time Process times. After four days, only less than 0.6 g / L of 3-methylthiopropanoic acid obtained, and for the 90% conversion of 0.01% isoamyl alcohol were needed 6 days.
  • the new organisms of the genus Gluconobacter are very surprising high yields not only of aliphatic, but also of aromatic and thio carboxylic acids achieve. This applies both in terms of product concentration in the solution, the percentage molar conversion of the starting materials as well as in relation to the Space-time yield. It is for the process in addition to the media composition and the pH kept at pH 6.4, especially the type of continuous Addition of the substrate is important.
  • Preferred bacteria for the process according to the invention are bacteria of Gluconobacter sp. HR 101 (DSM 12884) used. Gluconobacter sp. HR 101 (DSM 12884) is new.
  • the bacterium is preferably used in pure culture.
  • the nutrient medium for the organisms used according to the invention are synthetic, semi-synthetic or complex culture media. These can carbon-containing and nitrogen-containing compounds, inorganic salts, if appropriate Contain trace elements as well as vitamins.
  • Carbohydrates, hydrocarbons can be used as carbon-containing compounds or organic basic chemicals.
  • preferred usable compounds are sugar, alcohols or sugar alcohols, organic Acids or complex mixtures.
  • the preferred sugar is glucose.
  • organic acids can preferably citric acid or acetic acid are used.
  • To the complex Mixtures count e.g. B. malt extract, yeast extract, casein or casein hydrolyzate.
  • Inorganic compounds are suitable as nitrogen-containing substrates. Examples for this are nitrates and ammonium salts. Organic nitrogen sources can also be used are used. These include yeast extract, soy flour, casein, Casein hydrolyzate and corn steep liquor.
  • the inorganic salts which can be used include, for example, sulfates, nitrates, Chlorides, carbonates and phosphates.
  • the salts mentioned preferably contain as metals Sodium, potassium, magnesium, manganese, calcium, zinc and iron.
  • the temperature for cultivation is preferably in the range of 10 to 40 ° C.
  • the range from 20 to 35 ° C. is particularly preferred.
  • the pH of the medium is preferably 4 to 8.
  • bioreactors known to the person skilled in the art can be used.
  • devices suitable for submerged processes That is, it can be used according to the invention without or with a mechanical mixing device become.
  • the former include e.g. B. shakers, bubble or Loop reactors.
  • the latter preferably include all known devices with stirrers in any design.
  • the process according to the invention can be carried out continuously or batchwise become.
  • the duration of the fermentation until a maximum is reached The amount of product depends on the specific type of organism used. Basically however, the fermentation times are between 2 and 200 hours.
  • Aliphatic carboxylic acids for the process according to the invention are butyric acid, Isobutyric acid, isovaleric acid, 2-methylbutyric acid, and propionic acid.
  • Aromatic carboxylic acids for the process according to the invention are benzoic acid, Phenylacetic acid and cinnamic acid.
  • a thiocarboxylic acid for the process according to the invention is 3-methylthiopropionic acid
  • Isobutyric acid Isovaleric acid, 2-methylbutyric acid and phenylacetic acid implemented.
  • a 500 ml Erlenmeyer flask with a side puncture is mixed with 100 ml of sterile medium consisting of 1.25 g of D-mannitol and 0.75 g of yeast extract at pH 6.5 with 0.9 ml of a glycerol culture from Gluconobacter sp. HR 101 (DSM 12884) inoculated.
  • the flask is incubated for 16 hours on the rotating shaker at 30 ° C and 140 rpm.
  • the number of bacteria in the preculture is approx. 2 x 10 9 CFU / ml.
  • the speed of the stirrer is 500 rpm, the ventilation 5 NL / min; the temperature 30 ° C. After setting these parameters, the preculture according to Example 1 becomes Inoculation used.
  • n-butanol is added using a pump.
  • the dosing of the substrate is controlled by a flow controller.
  • n-Butanol is added according to the following flow profile: 0 h 0 g / lh 17 h 1.0 g / lh, 20 h 4.0 g / lh 27 h 3.0 g / lh 30 h 2.5 g / lh 35 h 2.0 g / lh 50 h 1.5 g / lh 50.5 h 2.0 g / lh 53 h 1.5 g / lh 57 h 1.0 g / lh 63 h 0 g / lh 66 h 1.0 g / lh 68 h 1.5 g / lh 71 h 1.0 g / lh 73 h 0 g / lh
  • the pH is kept constant in the range of 6.2 - 6.4 with NH 4 + .
  • the fermentation is complete after 74 hours.
  • the final concentration of n-butyric acid is 95 g / l according to HPLC analysis.
  • the molar conversion is almost 90%.
  • the speed of the stirrer is 500 rpm, the ventilation 5 NL / min; the temperature 30 ° C. After setting these parameters, the preculture according to Example 1 becomes Inoculation used.
  • Isobutanol is added via a pump.
  • the dosing of the substrate is controlled by a flow controller.
  • Isobutanol is added according to the following flow profile: Fermentation time Flow rate 0 h 0 g / lh 22.5 h 1.0 g / lh 23.5 h 4.0 g / lh 30 h 3.0 g / lh 35 h 2.5 g / lh 50 h 2.0 g / lh 50.3 h 2.5 g / lh 53 h 1.5 g / lh 58 h 1.0 g / lh 60 h 0 g / lh 64 h 1.0 g / lh 67 h 0 g / lh 68 h 1.5 g / lh 73 h 1.0 g / lh 74 h 0 g / lh
  • the pH is kept constant in the range of 6.2 - 6.4 with NH 4 + .
  • the fermentation is complete after 74 hours.
  • the final concentration of isobutyric acid is 92.7 g / l according to HPLC analysis.
  • the molar conversion is scarce 88%.
  • the speed of the stirrer is 500 rpm, the ventilation 5 NL / min; the temperature 30 ° C. After setting these parameters, the preculture according to Example 1 becomes Inoculation used.
  • 2-methylbutanol is started via a pump.
  • the dosing of the substrate is controlled by a flow controller.
  • 2-Methylbutanol is added according to the following flow profile: Fermentation time Flow rate 0 h 0 g / lh 17 h 1.0 g / lh 20 h 4.0 g / lh 28 h 3.5 g / lh 31 h 3.0 g / lh 35 h 2.5 g / lh 39 h 2.0 g / lh 45 h 1.5 g / lh 51 h 1.0 g / lh 55 hh 0 g / lh
  • the pH is kept constant in the range of 6.2 - 6.4 with NH 4 + .
  • the final concentration of 2-methylbutyric acid is 80 g / l according to HPLC analysis.
  • the molar conversion is almost 89%.
  • the speed of the stirrer is 500 rpm, the ventilation 5 NL / min; the temperature 30 ° C. After setting these parameters, the preculture according to Example 1 becomes Inoculation used.
  • Isobutanol is added according to the following flow profile: Fermentation time Flow rate 0 h 0 g / lh 17 h 1.0 g / lh 20 h 4.0 g / lh 28 h 3.5 g / lh 31h h 3.0 g / lh 35 h 2.5 g / lh 39 h 2.0 g / lh 44 h 1.5 g / lh 48 h 1.0 g / lh 49.5 h 0 g / lh 55 h 1.0 g / lh 58 h 0 g / lh 63 h 1.0 g / lh 66 h 0 g / lh
  • the pH is kept constant in the range of 6.2 - 6.4 with NH 4 + .
  • the fermentation is complete after 70.5 hours.
  • the final concentration of isovaleric acid is 82 g / l after working up the fermentation solution.
  • the molar Implementation is just under 85%.
  • the speed of the stirrer is 500 rpm, the ventilation 5 NL / min; the temperature 30 ° C. After setting these parameters, the preculture according to Example 1 becomes Inoculation used.
  • the pH is kept constant in the range of 6.2 - 6.4 with NH 4 + .
  • the fermentation is complete after 92 hours.
  • the final concentration of propionic acid is 94 g / l according to HPLC analysis.
  • the molar conversion is 88.3%.
  • the speed of the stirrer is 500 rpm, the ventilation 5 NL / min; the temperature 30 ° C. After setting these parameters, the preculture according to Example 1 becomes Inoculation used.
  • Phenylethyl alcohol is added according to the following flow profile: Fermentation time Flow rate 0 h 0 g / lh 17 h 1.0 g / lh 20 h 4.0 g / lh 23.5 h 2.0 g / lh 24 hours 2.5 g / lh 30 h 2.0 g / lh 37 h 1.5 g / lh 41 h 1.0 g / lh 43.8 h 0 g / lh 50.5 h 1.0 g / lh 53 hh 0 g / lh 58 hh 1.0 g / lh 60 h 0 g / lh 65 h 1.0 g / lh 67 0 g / lh
  • the pH is kept constant in the range of 6.2 - 6.4 with NH 4 + .
  • the fermentation is complete after 48 hours.
  • the final concentration of phenylacetic acid is 54 g / l according to HPLC analysis.
  • the molar conversion is 88.5%.
  • the speed of the stirrer is 500 rpm, the ventilation 5 NL / min; the temperature 30 ° C. After setting these parameters, the preculture according to Example 1 becomes Inoculation used.
  • Benzyl alcohol is added according to the following flow profile: Fermentation time Flow rate 0 h 0 g / lh 21.25 h 1.0 g / lh 23 h 3.0 g / lh 28 h 2.5 g / lh 31 h 2.0 g / lh 34 h 1.5 g / lh 37 h 1.0 g / lh 40 h 0 g / lh 43 h 1.0 g / lh 47.5 h 0 g / lh 50.5 h 1.0 g / lh 54 h 0 g / lh 57 h 1.0 g / lh 60 h 0 g / lh 63 h 1.0 g / lh 65 h 0 g /
  • the pH is kept constant in the range of 6.2 - 6.4 with NH 4 + .
  • the fermentation is complete after 68 hours.
  • the final concentration of benzoic acid is 51 g / l according to HPLC analysis.
  • the educt was implemented almost quantitatively.
  • the speed of the stirrer is 500 rpm, the ventilation 5 NL / min; the temperature 30 ° C. After setting these parameters, the preculture according to Example 1 becomes Inoculation used.
  • Cinnamon alcohol is added according to the following flow profile: Fermentation time Flow rate 0 h 0 g / lh 17 h 1.2 g / lh 20 h 2.4 g / lh 21 h 3.6 g / lh 25.25 h 0 g / lh 26.25 h 2.4 g / lh 28 h 1.2 g / lh 30 h 0 g / lh 31 h 1.2 g / lh 32 h 0 g / lh
  • the fermentation is complete after 32 hours.
  • the final concentration of cinnamic acid is 26 g / l according to HPLC analysis.
  • the educt was implemented almost quantitatively.
  • the speed of the stirrer is 500 rpm, the ventilation 5 NL / min; the temperature 27 ° C. After setting these parameters, the preculture according to Example 1 becomes Inoculation used.
  • the pH is kept constant in the range of 6.2 - 6.4 with NH 4 + .
  • the fermentation is complete after 65 hours.
  • the final concentration of 3-methylthiopropionic acid is 82.6 g / l according to HPLC analysis.
  • the molar implementation is almost 100%.
  • Propionic acid 92 94 1.02 New process Isobutyric acid 42 21 0.5 DE 3713668 Isobutyric acid 74 92.7 1.25 New process Isovaleric acid 25th 17th 0.68 DE 3713668 Isovaleric acid 90 45 0.5 Molinari et al. Isovaleric acid 70.5 82 1.16 New process 2-methylbutyric acid 24th 7 0.29 DE 3713668 2-methylbutyric acid 90 44 0.49 Molinari et al. 2-methylbutyric acid 52 80 1.54 New process

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von aliphatischen, aromatischen und Thiocarbonsäuren, wobei Bakterien der Gattung Gluconobacter enthaltende Kulturen eingesetzt werden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein biologisches Verfahren zur Herstellung verschiedener Carbonsäuren durch die enzymatische Oxidation der entsprechenden Alkohole mit Alkoholoxidase in sehr hohen Ausbeuten. Die Alkoholoxidase wird von Bakterien der Gattung Gluconobacter, bevorzugt der Spezies Gluconobacter sp. HR 101, (DSM 12884) gebildet. So werden beispielsweise Benzoesäure aus Benzylalkohol, Buttersäure aus n-Butanol, Isobuttersäure aus Isobutanol, Isovaleriansäure aus Isoamylalkohol, 2-Metylbuttersäure aus 2-Methylbutanol, 3-Methylthiopropionsäure aus 3-Methylthiopropanol, Phenylessigsäure aus Phenylethanol, Propionsäure aus Propanol und Zimtsäure aus Zimtalkohol hergestellt.
Neben dem lange bekannten Verfahren der Essigherstellung durch Oxidation von Ethanol zu Essigsäure mit Bakterien der Gattung Acetobacter, gibt es auch einige Verfahren zur Herstellung von einigen Carbonsäuren mit Bakterien der Gattungen Acetobacter oder Gluconobacter oder mit Hefen.
So beschreibt die DE 3713668 die Herstellung aliphatischer Carbonsäuren durch mikrobielle Oxidation aliphatischer Alkohole mit Bakterien der Spezies Gluconobacter roseus. Die Alkohole wurden dabei nach einer Wachstumsphase von über 24 Stunden direkt in das Kulturmedium mit dem Organismus gegeben. Der bevorzugte pH-Bereich wurde mit 4 bis 4,5 angegeben. Es wurden nur geringe Ausbeuten von 13 g n-Buttersäure/L, 21 g Isobuttersäure/L, 7 g 2-Methylbuttersäure/L und 17 g 3-Methylbuttersäure/L Fermentationslösung erhalten.
In der DE 195 03 598 wird ein Verfahren zur Herstellung von Propionsäure oder Buttersäure bzw. deren Salze beschrieben.. Sie verwenden ein Bakterium der Spezies Gluconobacter oxydans. Nach 9 bis 10 stündiger Kultivation wurde n-Propanol oder n-Butanol portionsweise in Abhängigkeit vom pO2-Wert wiederholt zugegeben. Sie erzielten damit Ausbeuten von 43,7 g/L Propionsäure und 49 g/l Buttersäure.
In der EP 0563346 wird ein Verfahren zur Herstellung von Carbonsäuren durch Oxidation entsprechender Alkohole oder Aldehyde mit Hilfe einer Hefe der Gattung Saccharomyces, Hansenula, Pichia, Candida oder Kluyvermyces beschrieben. Nachteilig ist hier, dass mit den Hefen nur niedrige Produktkonzentrationen erhalten werden, sehr hohe Biomassekonzentrationen eingesetzt werden müssen und lange Prozesszeiten. So wurden nach vier Tagen nur weniger als 0,6 g/L 3-Methylthiopropansäure erhalten, und für die 90 %ige Umsetzung von 0,01 % Isoamylalkohol wurden 6 Tage benötigt.
In J.Chem.Tech.Biotechnol. 1997, 68, 214 bis 218 wird die Biotransformation einiger aliphatischer Alkohole und 2-Phenylethanol in die entsprechenden Säuren mit Bakterien der Spezies Acetobacter aceti beschrieben. Nachteilig sind auch hier die geringen erhaltenen Produktkonzentrationen. So wurde die höchste beschriebene Produktkonzentration bei der Oxidation von Butanol zu Buttersäure mit 39,3 g/l nach 60 Stunden angegeben.
In J.Chem.Tech.Biotechnol. 1997, 70, 294 bis 298 wird das Bacterium Acetobacter pasteurianus bei der oxidativen Herstellung bestimmter Carbonsäuren beschrieben. Von Nachteil ist hier die Verwendung von Air-lift Bioreaktoren, da durch den hohen Luftstrom, der für die Belüftung und Durchmischung der Kultur notwendig ist größere Mengen der flüchtigen Edukte und Produkte ausgetragen werden. Die aus diesem Grund dahinter angeschlossene Kühlfalle mit Flüssigstickstoff ist großtechnsich nicht praktikabel.
Es wurde eine Verfahren zur Herstellung von aliphatischen, aromatischen und Thiocarbonsäuren in Bioreaktoren gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass Bakterien der Gattung Gluconobacter enthaltende Kulturen eingesetzt werden.
Überraschend lassen sich mit den neuen Organismen der Gattung Gluconobacter sehr hohe Ausbeuten nicht nur an aliphatischen-, sondern auch an aromatischen- und thioCarbonsäuren erzielen. Dies gilt sowohl in Hinsicht auf die Produktkonzentration in der Lösung, die prozentuale molare Umsetzung der Edukte als auch in Bezug auf die Raum-Zeit-Ausbeute. Dabei ist für den Prozess neben der Medienzusammensetzung und dem auf pH 6,4 gehaltenen pH-Wert, insbesondere die Art der kontinuierliche Zugabe des Substrats von Bedeutung.
Als Bakterien werden bevorzugt für das erfindungsgemäße Verfahren Bakterien des Typs Gluconobacter sp. HR 101 (DSM 12884) eingesetzt. Gluconobacter sp. HR 101 (DSM 12884) ist neu.
Bevorzugt wird das Bakterium in Reinkultur eingesetzt.
Als Nährmedium für die erfindungsgemäß eingesetzten Organismen kommen synthetische, halbsynthetische oder komplexe Kulturmedien in Betracht. Diese können kohlenstoffhaltige und stickstoffhaltige Verbindungen, anorganische Salze, gegebenenfalls Spurenelemente sowie Vitamine enthalten.
Als kohlenstoffhaltige Verbindungen können Kohlenhydrate, Kohlenwasserstoffe oder organische Grundchemikalien in Betracht kommen. Beispiele für vorzugsweise verwendbare Verbindungen sind Zucker, Alkohole bzw. Zuckeralkohole, organische Säuren oder komplexe Gemische.
Als Zucker kommt vorzugsweise Glucose in Betracht. Als organische Säuren können vorzugsweise Zitronensäure oder Essigsäure zum Einsatz kommen. Zu den komplexen Gemischen zählen z. B. Malzextrakt, Hefeextrakt, Casein oder Caseinhydrolysat.
Als stickstoffhaltige Substrate kommen anorganische Verbindungen in Betracht. Beispiele hierfür sind Nitrate und Ammoniumsalze. Ebenso können organische Stickstoffquellen zum Einsatz kommen. Hierzu zählen Hefeextrakt, Sojamehl, Casein, Caseinhydrolysat und Maisquellwasser.
Zu den einsetzbaren anorganischen Salzen zählen beispielsweise Sulfate, Nitrate, Chloride, Carbonate und Phosphate. Als Metalle enthalten die genannte Salze vorzugsweise Natrium, Kalium, Magnesium, Mangan, Calcium, Zink und Eisen.
Die Temperatur für die Kultivierung liegt vorzugsweise im Bereich von 10 bis 40°C. Besonders bevorzugt ist der Bereich von 20 bis 35°C.
Der pH-Wert des Mediums beträgt bevorzugt 4 bis 8. Besonders bevorzugt ist der Bereich von 6,2 bis 6,5.
Grundsätzlich können für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens alle dem Fachmann bekannten Bioreaktoren eingesetzt werden. Vorzugsweise kommen alle für Submersverfahren geeigneten Vorrichtungen in Betracht. Das heißt, es können erfindungsgemäß Gefäße ohne oder mit mechanischer Mischeinrichtung eingesetzt werden. Zu ersteren zählen z. B. Schüttelapparaturen, Blasensäulen- oder Schlaufenreaktoren. Zu letzteren gehören vorzugsweise alle bekannten Vorrichtungen mit Rührern in beliebiger Gestaltung.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt werden. Die Dauer der Fermentation bis zum Erreichen einer maximalen Produktmenge hängt von der speziellen Art des eingesetzten Organismus ab. Grundsätzlich liegen die Zeiten der Fermentation jedoch zwischen 2 und 200 Stunden.
Aliphatische Carbonsäuren für das erfindungsgemäße Verfahren sind Buttersäure, Isobuttersäure, Isovaleriansäure, 2-Methylbuttersäure, und Propionsäure.
Aromatische Carbonsäuren für das erfindungsgemäße Verfahrensind Benzoesäure, Phenylessigsäure und Zimtsäure.
Eine Thiocarbonsäuren für das erfindungsgemäße Verfahren ist 3-Methylthiopropionsäure
Bevorzugt werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Buttersäure, Isobuttersäure, Isovaleriansäure, 2-Methylbuttersäure, Propionsäure, Phenylessigsäure und 3-Methylthiopropionsäure umgesetzt.
Insbesondere bevorzugt werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Isobuttersäure, Isovaleriansäure, 2-Methylbuttersäure und Phenylessigsäure umgesetzt.
Im folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf Beispiele näher erläutert:
Beispiele Beispiel 1 - Herstellung der Vorkultur
Ein 500 ml Erlenmeyerkolben mit seitlichem Einstich wird mit 100 ml sterilem Medium, bestehend aus 1,25 g D-Mannit und 0,75 g Hefeextrakt bei pH 6,5, mit 0,9 ml einer Glycerinkulur von Gluconobacter sp. HR 101 (DSM 12884) angeimpft. Der Kolben wird für 16 Stunden auf der rotierenden Schüttelmaschine bei 30 °C und 140 Upm inkubiert. Die Keimzahl der Vorkultur beträgt ca. 2 x 109 KBE/ml.
Beispiel 2 - Herstellung von natürlicher n-Buttersäure aus n-Butanol
Es werden 125 g Mannit und 75 g Hefeextrakt in 9,9 L Wasser in einem 10 L Fermenter gelöst, 10 ml Antischaummittel hinzu gegeben und der pH-Wert auf 6,3 eingestellt. Das so hergestellte Medium wir für 30 Minuten bei 121°C sterilisiert.
Die Drehzahl des Rührers beträgt 500 Upm, die Belüftung 5 NL/min; die Temperatur 30°C. Nach Einstellung dieser Parameter wird die Vorkultur gemäß Beispiel 1 zum Animpfen verwendet.
Nach 17 Stunden Fermentationszeit wird mit der Zugabe von n-Butanol über eine Pumpe begonnen. Die Dosierung des Substrats wird über einen Flow-Controller gesteuert. n-Butanol wird gemäß folgendem Flow-Profil zugegeben:
0 h 0 g/lh
17 h 1,0 g/lh,
20 h 4,0 g/lh
27 h 3,0 g/lh
30 h 2,5 g/lh
35 h 2,0 g/lh
50 h 1,5 g/lh
50,5 h 2,0 g/lh
53 h 1,5 g/lh
57 h 1,0 g/lh
63 h 0 g/lh
66 h 1,0 g/lh
68 h 1,5 g/lh
71 h 1,0 g/lh
73 h 0 g/lh
Während des Feedings wird der pH-Wert im Bereich von 6,2 - 6,4 mit NH4 + konstant gehalten.
Die Fermentation ist nach 74 Stunden beendet. Die Endkonzentration an n-Buttersäure beträgt laut HPLC-Analytik 95 g/l. Die molare Umsetzung beträgt knapp 90 %.
Beispiel 3 - Herstellung von natürlicher Isobuttersäure aus Isobutanol
Es werden 125 g Mannit und 75 g Hefeextrakt in 9,9 L Wasser in einem 10 L Fermenter gelöst, 10 ml Antischaummittel hinzu gegeben und der pH-Wert auf 6,3 eingestellt. Das so hergestellte Medium wir für 30 Minuten bei 121°C sterilisiert.
Die Drehzahl des Rührers beträgt 500 Upm, die Belüftung 5 NL/min; die Temperatur 30°C. Nach Einstellung dieser Parameter wird die Vorkultur gemäß Beispiel 1 zum Animpfen verwendet.
Nach 22,5 Stunden Fermentationszeit wird mit der Zugabe von Isobutanol über eine Pumpe begonnen. Die Dosierung des Substrats wird über einen Flow-Controller gesteuert. Isobutanol wird gemäß folgendem Flow-Profil zugegeben:
Fermentationszeit Flußrate
0 h 0 g/lh
22,5 h 1,0 g/lh
23,5 h 4,0 g/lh
30 h 3,0 g/lh
35 h 2,5 g/lh
50 h 2,0 g/lh
50,3 h 2,5 g/lh
53 h 1,5 g/lh
58 h 1,0 g/lh
60 h 0 g/lh
64 h 1,0 g/lh
67 h 0 g/lh
68 h 1,5 g/lh
73 h 1,0 g/lh
74 h 0 g/lh
Während des Feedings wird der pH-Wert im Bereich von 6,2 - 6,4 mit NH4 + konstant gehalten.
Die Fermentation ist nach 74 Stunden beendet. Die Endkonzentration an Isobuttersäure beträgt laut HPLC-Analytik 92,7 g/l. Die molare Umsetzung beträgt knapp 88 %.
Beispiel 4 - Herstellung von natürlicher 2-Methylbuttersäure aus 2-Methylbutanol
Es werden 125 g Mannit und 75 g Hefeextrakt in 9,9 L Wasser in einem 10 L Fermenter gelöst, 10 ml Antischaummittel hinzu gegeben und der pH-Wert auf 6,3 eingestellt. Das so hergestellte Medium wir für 30 Minuten bei 121°C sterilisiert.
Die Drehzahl des Rührers beträgt 500 Upm, die Belüftung 5 NL/min; die Temperatur 30°C. Nach Einstellung dieser Parameter wird die Vorkultur gemäß Beispiel 1 zum Animpfen verwendet.
Nach 17 Stunden Fermentationszeit wird mit der Zugabe von 2-Methylbutanol über eine Pumpe begonnen. Die Dosierung des Substrats wird über einen Flow-Controller gesteuert. 2-Methylbutanol wird gemäß folgendem Flow-Profil zugegeben:
Fermentationszeit Flußrate
0 h 0 g/lh
17 h 1,0 g/lh
20 h 4,0 g/lh
28 h 3,5 g/lh
31 h 3,0 g/lh
35 h 2,5 g/lh
39 h 2,0 g/lh
45 h 1,5 g/lh
51 h 1,0 g/lh
55 h h 0 g/lh
Während des Feedings wird der pH-Wert im Bereich von 6,2 - 6,4 mit NH4 + konstant gehalten.
Die Endkonzentration an 2-Methylbuttersäure beträgt laut HPLC-Analytik 80 g/l. Die molare Umsetzung beträgt knapp 89 %.
Beispiel 5 - Herstellung von natürlicher Isovaleriansäure aus Isoamylalkohol
Es werden 125 g Mannit und 75 g Hefeextrakt in 9,9 L Wasser in einem 10 L Fermenter gelöst, 10 ml Antischaummittel hinzu gegeben und der pH-Wert auf 6,3 eingestellt. Das so hergestellte Medium wir für 30 Minuten bei 121°C sterilisiert.
Die Drehzahl des Rührers beträgt 500 Upm, die Belüftung 5 NL/min; die Temperatur 30°C. Nach Einstellung dieser Parameter wird die Vorkultur gemäß Beispiel 1 zum Animpfen verwendet.
Nach 22,5 Stunden Fermentationszeit wird mit der Zugabe von Isoamylalkohol über eine Pumpe begonnen. Die Dosierung des Substrats wird über einen Flow-Controller gesteuert. Isobutanol wird gemäß folgendem Flow-Profil zugegeben:
Fermentationszeit Flußrate
0 h 0 g/lh
17 h 1,0 g/lh
20 h 4,0 g/lh
28 h 3,5 g/lh
31h h 3,0 g/lh
35 h 2,5 g/lh
39 h 2,0 g/lh
44 h 1,5 g/lh
48 h 1,0 g/lh
49,5 h 0 g/lh
55 h 1,0 g/lh
58 h 0 g/lh
63 h 1,0 g/lh
66 h 0 g/lh
Während des Feedings wird der pH-Wert im Bereich von 6,2 - 6,4 mit NH4 + konstant gehalten.
Die Fermentation ist nach 70,5 Stunden beendet. Die Endkonzentration an Isovaleriansäure beträgt nach Aufarbeitung der Fermentationslösung 82 g/l. Die molare Umsetzung beträgt knapp 85 %.
Beispiel 6 - Herstellung von natürlicher Propionsäure aus n-Propanol
Es werden 125 g Mannit und 75 g Hefeextrakt in 9,9 L Wasser in einem 10 L Fermenter gelöst, 10 ml Antischaummittel hinzu gegeben und der pH-Wert auf 6,3 eingestellt. Das so hergestellte Medium wir für 30 Minuten bei 121°C sterilisiert.
Die Drehzahl des Rührers beträgt 500 Upm, die Belüftung 5 NL/min; die Temperatur 30°C. Nach Einstellung dieser Parameter wird die Vorkultur gemäß Beispiel 1 zum Animpfen verwendet.
Nach 17 Stunden Fermentationszeit wird mit der Zugabe von Propanol über eine Pumpe begonnen. Die Dosierung des Substrats wird über einen Flow-Controller gesteuert. Isobutanol wird gemäß folgendem Flow-Profil zugegeben:
Fermentationszeit Flußrate
0 h 0 g/lh
17 h 1,0 g/lh
20 h 3,5 g/lh
27 h 3,0 g/lh
29 h 2,0 g/lh
35 h 1,5 g/lh
60 h 1,0 g/lh
82 h 0 g/lh
87 h 1,0 g/lh
90 h 0 g/lh
Während des Feedings wird der pH-Wert im Bereich von 6,2 - 6,4 mit NH4 + konstant gehalten.
Die Fermentation ist nach 92 Stunden beendet. Die Endkonzentration an Propionsäure beträgt laut HPLC-Analytik 94 g/l. Die molare Umsetzung beträgt 88,3%.
Beispiel 7 - Herstellung von natürlicher Phenylessigsäure aus Phenylethanol
Es werden 125 g Mannit und 75 g Hefeextrakt in 9,9 L Wasser in einem 10 L Fermenter gelöst, 10 ml Antischaummittel hinzu gegeben und der pH-Wert auf 6,3 eingestellt. Das so hergestellte Medium wir für 30 Minuten bei 121°C sterilisiert.
Die Drehzahl des Rührers beträgt 500 Upm, die Belüftung 5 NL/min; die Temperatur 30°C. Nach Einstellung dieser Parameter wird die Vorkultur gemäß Beispiel 1 zum Animpfen verwendet.
Nach 17 Stunden Fermentationszeit wird mit der Zugabe von Phenylethylalkohol über eine Pumpe begonnen. Die Dosierung des Substrats wird über einen Flow-Controller gesteuert. Phenylethylalkohol wird gemäß folgendem Flow-Profil zugegeben:
Fermentationszeit Flußrate
0 h 0 g/lh
17 h 1,0 g/lh
20 h 4,0 g/lh
23,5 h 2,0 g/lh
24 h 2,5 g/lh
30 h 2,0 g/lh
37 h 1,5 g/lh
41 h 1,0 g/lh
43,8 h 0 g/lh
50,5 h 1,0 g/lh
53 h h 0 g/lh
58 h h 1,0 g/lh
60 h 0 g/lh
65 h 1,0 g/lh
67 h 0 g/lh
Während des Feedings wird der pH-Wert im Bereich von 6,2 - 6,4 mit NH4 + konstant gehalten.
Die Fermentation ist nach 48 Stunden beendet. Die Endkonzentration an Phenylessigsäure beträgt laut HPLC-Analytik 54 g/l. Die molare Umsetzung beträgt 88,5 %.
Bei Übertragung des Prozesses auf den 200 L Maßstab wurden 52 g/l erhalten; die molare Umsetzung lag hier bei 95 %.
Beispiel 8 - Herstellung von natürlicher Benzoesäure aus Benzylalkohol
Es werden 125 g Mannit und 75 g Hefeextrakt in 9,9 L Wasser in einem 10 L Fermenter gelöst, 10 ml Antischaummittel hinzu gegeben und der pH-Wert auf 6,3 eingestellt. Das so hergestellte Medium wir für 30 Minuten bei 121°C sterilisiert.
Die Drehzahl des Rührers beträgt 500 Upm, die Belüftung 5 NL/min; die Temperatur 30°C. Nach Einstellung dieser Parameter wird die Vorkultur gemäß Beispiel 1 zum Animpfen verwendet.
Nach 21,25 Stunden Fermentationszeit wird mit der Zugabe von Benzylalkohol über eine Pumpe begonnen. Die Dosierung des Substrats wird über einen Flow-Controller gesteuert. Benzylalkohol wird gemäß folgendem Flow-Profil zugegeben:
Fermentationszeit Flußrate
0 h 0 g/lh
21,25 h 1,0 g/lh
23 h 3,0 g/lh
28 h 2,5 g/lh
31 h 2,0 g/lh
34 h 1,5 g/lh
37 h 1,0 g/lh
40 h 0 g/lh
43 h 1,0 g/lh
47,5 h 0 g/lh
50,5 h 1,0 g/lh
54 h 0 g/lh
57 h 1,0 g/lh
60 h 0 g/lh
63 h 1,0 g/lh
65 h 0 g/lh
Während des Feedings wird der pH-Wert im Bereich von 6,2 - 6,4 mit NH4 + konstant gehalten.
Die Fermentation ist nach 68 Stunden beendet. Die Endkonzentration an Benzoesäure beträgt laut HPLC-Analytik 51 g/l. Das Edukt wurde nahezu quantitativ umgesetzt.
Beispiel 9 - Herstellung von natürlicher Zimtsäure aus Zimtalkohol
Es werden 125 g Mannit und 75 g Hefeextrakt in 9,9 L Wasser in einem 10 L Fermenter gelöst, 10 ml Antischaummittel hinzu gegeben und der pH-Wert auf 6,3 eingestellt. Das so hergestellte Medium wir für 30 Minuten bei 121°C sterilisiert.
Die Drehzahl des Rührers beträgt 500 Upm, die Belüftung 5 NL/min; die Temperatur 30°C. Nach Einstellung dieser Parameter wird die Vorkultur gemäß Beispiel 1 zum Animpfen verwendet.
Nach 18 Stunden Fermentationszeit wird mit der Zugabe von Zimtalkohol über eine Pumpe begonnen. Um den Zimtalkohol in der flüssigen Phase zu haben, wurde das Edukt erwärmt. Zimtalkohol wird gemäß folgendem Flow-Profil zugegeben:
Fermentationszeit Flußrate
0 h 0 g/lh
17 h 1,2 g/lh
20 h 2,4 g/lh
21 h 3,6 g/lh
25,25 h 0 g/lh
26,25 h 2,4 g/lh
28 h 1,2 g/lh
30 h 0 g/lh
31 h 1,2 g/lh
32 h 0 g/lh
Die Fermentation ist nach 32 Stunden beendet. Die Endkonzentration an Zimtsäure beträgt laut HPLC-Analytik 26 g/l. Das Edukt wurde nahezu quantitativ umgesetzt.
Beispiel 10 Herstellung von natürlicher 3-Methylthiopropionsäure aus 3-Methylthiopropanol
Es werden 125 g Mannit und 125 g Hefeextrakt in 10 L Wasser in einem 10 L Fermenter gelöst, 10 ml Antischaummittel hinzu gegeben und der pH-Wert auf 6,3 eingestellt. Das so hergestellte Medium wir für 30 Minuten bei 121°C sterilisiert.
Die Drehzahl des Rührers beträgt 500 Upm, die Belüftung 5 NL/min; die Temperatur 27°C. Nach Einstellung dieser Parameter wird die Vorkultur gemäß Beispiel 1 zum Animpfen verwendet.
Nach 16 Stunden Fermentationszeit wird mit der Zugabe von 3-Methylthiopropanol über eine Pumpe begonnen. Die Dosierung des Substrats erfolgt gemäß folgendem Flow-Profil:
Fermentationszeit Flußrate
0 h 0 g/lh
16 h 1,0 g/lh
17,66 h 2,0 g/lh
19 h 3,0 g/lh
20,8 h 4,2 g/lh
21,8 h 4,8 g/lh
23,2 h 4,2 g/lh
23,8 h 2,6 g/lh
42,5 h 2,2 g/lh
48,8 h 0 g/lh
Während des Feedings wird der pH-Wert im Bereich von 6,2 - 6,4 mit NH4 + konstant gehalten.
Die Fermentation ist nach 65 Stunden beendet. Die Endkonzentration an 3-Methylthiopropionsäure beträgt laut HPLC-Analytik 82,6 g/l. Die molare Umsetzung beträgt fast 100 %.
Beispiel 12 Vergleich der Raum-Zeit-Ausbeute der neuen Erfindung mit den bekannten Prozessen
Im folgenden Beispiel werden die Raum-Zeit-Ausbeuten der neuen Produktionsverfahrens mit dem Gluconobacter sp. DSM 12884 mit den bisher bekannten Verfahren verglichen, um die Überlegenheit des neuen Prozesses zu verdeutlichen.
Produkt Prozessdauer [Stunden] Produktkonzentration [g/L] Raum-Zeit-Ausbeute [g/L/Std.] Prozess
Buttersäure 120 13 0,11 DE 3713668
Buttersäure 60 39,3 0,66 Druaux et al.
Buttersäure 80 49 0,61 DE 195 03 598
Buttersäure 90 60 0,67 Molinari et al.
Buttersäure 73 95 1,3 Neuer Prozess
Propionsäure 70 43,7 0,62 DE 195 03 598
Propionsäure 90 60 0,67 Molinari et al.
Propionsäure 92 94 1,02 Neuer Prozess
Isobuttersäure 42 21 0,5 DE 3713668
Isobuttersäure 74 92,7 1,25 Neuer Prozess
Isovaleriansäure 25 17 0,68 DE 3713668
Isovaleriansäure 90 45 0,5 Molinari et al.
Isovaleriansäure 70,5 82 1,16 Neuer Prozess
2-Methylbuttersäure 24 7 0,29 DE 3713668
2-Methylbuttersäure 90 44 0,49 Molinari et al.
2-Methylbuttersäure 52 80 1,54 Neuer Prozess
Wie aus der Tabelle zu ersehen ist, ist mit dem neuen Prozess mit Gluconobacter sp. DSM 12884 bei den schon beschriebenen Alkoholoxidationen eine enorme Steigerung sowohl der Raum-Zeit-Ausbeute als auch in der absoluten Produktkonzentration zu verzeichnen. So erhöht sich bei Buttersäure die Raum-Zeit-Ausbeute um 94 % und die Produktkonzentration um 58 % gegenüber dem bisher besten Prozess. Bei Propionsäure erhöht sich die Raum-Zeit-Ausbeute um 52 % und die Produktkonzentration um 57 %. Noch höher sind die Steigerungen bei Isobuttersäure mit 150 % bei der Raum-Zeit-Ausbeute und 341 % bei der Produktkonzentration. Die Steigerungen für Isovaleriansäure und 2-Methylbuttersäure sind 132 % und 82 %, bzw. 214 % und 82 %.

Claims (19)

  1. Verfahren zur Herstellung von aliphatischen, aromatischen und ThioCarbonsäuren in Bioreaktoren, dadurch gekennzeichnet, dass Bakterien der Gattung Gluconobacter enthaltende Kulturen eingesetzt werden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass eine aus Bakterien der Gattung Gluconobacter bestehende Reinkultur eingesetzt wird.
  3. Verfahren nach einem Ansprüche 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass Gluconobacter sp. HR 101 (DSM 12884) eingesetzt wird.
  4. Verfahren nach einem Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, dass synthetische, halbsynthetische oder komplexe Substrate eingesetzt werden.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, dass kohlenstoffhaltige sowie stickstoffhaltige Verbindungen, anorganische Salze, Spurenelemente und/oder Vitamine enthaltende Substrate eingesetzt werden.
  6. Verfahren nach Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat als kohlenstoffhaltige Verbindungen Zucker, Zuckeralkohole. Alkohol, organische Säuren, komplexe Gemische, Öle oder Gemische zweier oder mehrerer dieser Substanzen enthält.
  7. Verfahren nach Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, dass Glucose, Glyzerin, Mannit, Zitronensäure, Malzextrakt, Hefeextrakt, Casein, Caseinhydrolysat und Rizinusöl oder Gemische zweier oder mehrerer dieser Substanzen enthaltende Substrate eingesetzt werden.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 dadurch gekennzeichnet, dass anorganische Verbindungen und/oder organische Verbindungen enthaltenden Substrate eingesetzt werden.
  9. Verfahren nach Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, dass Nitrate, Ammoniumsalze, Hefeextrakt, Sojamehl, Baumwollsaatmehl, Casein, Caseinhydrolysat, Weizengluten und Maisquellwasser eingesetzt werden.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 dadurch gekennzeichnet, Sulfate, Nitrate, Chloride, Carbonate und Phosphate der Metalle Natrium, Kalium, Magnesium, Mangan, Calcium, Zink und Eisen oder Gemische zweier oder mehrerer dieser Verbindungen enthaltende Substrate eingesetzt werden.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 dadurch gekennzeichnet, dass die Temperaturen im Bereich von 10 bis 40°C liegen
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert im Bereich von 4 bis 8.
  13. Gluconobacter sp. HR 101 (DSM 12884).
  14. Verwendung von Gluconobacter sp. nach Anspruch 13 zur Herstellung von aliphatischen, aromatischen und Thiocarbonsäuren.
  15. Verfahren zur Herstellung von aliphatischen, aromatischen und Thiocarbonsäuren dadurch gekennzeichnet, dass das die molare Umsetzung der Edukte größer als 60 % ist.
  16. Verfahren zur Herstellung von natürliche Buttersäure in Bioreaktoren, dadurch gekennzeichnet, dass Bakterien der Gattung Gluconobacter enthaltende Kulturen eingesetzt werden.
  17. Verfahren zur Herstellung von Isobuttersäure in Bioreaktoren dadurch gekennzeichnet, dass Bakterien der Gattung Gluconobacter enthaltende Kulturen eingesetzt werden.
  18. Verfahren nach Anspruch 16 und 17,dadurch gekennzeichnet, dass eine aus Bakterien der Gattung Gluconobacter bestehende Reinkultur eingesetzt wird.
  19. Verfahren nach Anspruch 16, 17 und 18, dadurch gekennzeichnet, dass Gluconobacter sp. HR 101 (DSM 12884) eingesetzt wird.
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