EA024824B1 - Соединения-ингибиторы raf - Google Patents

Abstract

В настоящем изобретении предложена 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевина или ее фармацевтически приемлемая соль, ингибирующая Raf, которая, таким образом, может подходить для лечения рака.

Description

Сигнальный каскад киназы Как/КаТ/митоген-активированной протеинкиназы (также известной как МАР2К; МАРК киназы и МАРК/ЕКК киназы или МЕК)/внеклеточной сигнал-регулируемой киназы (ЕКК) (называемый в настоящем описании Как/КаТ/МЕК/ЕКК или Как/КаТ/МЕК/МАРК) сохранился в процессе эволюции и играет основополагающую роль в развитии и гомеостазе тканей млекопитающих. Этот сигнальный путь включает киназный каскад, который передает внеклеточные сигналы к ядру для регуляции экспрессии генов и ключевых клеточных функций. Экспрессия генов, контролируемая сигнальным путем Как/КаТ/МЕК/ЕКК, регулирует фундаментальные клеточные процессы, включая пролиферацию, дифференцировку, апоптоз и ангиогенез. При различных раковых заболеваниях происходит ошибочная активация разнообразных участков сигнального пути Как/КаТ/МЕК/ЕКК. Мутации генов в рамках этого пути могут приводить к образованию конститутивно активных белков, что, в свою очередь, вызывает повышение пролиферации клеток и резистентность к апоптозу.

КаТ (серин/треонин протеинкиназа) кодируется семейством генов, состоящим из трех генов, являющихся тремя изоформами КаТ (В-КаТ, С-КаТ (КаТ-1) и А-КаТ). Каждый из этих белков имеет схожие высококонсервативные аминотерминальные регуляторные участки и каталитические домены при концевых карбоксигруппах. Если не указано иное, КаТ относится ко всем трем членам семейства. Несмотря на то, что каждая изоформа участвует в пути Как/КаТ/МЕК/ЕКК, было показано, что В-КаТ является основным активатором МЕК. Как:РТО осуществляет рекрутинг КаТ в направлении внутренней части клеточной мембраны, где происходит активация В-КаТ. В свою очередь В-КаТ отвечает за активацию МЕК1/2, а МЕК1/2 активирует ЕКК1/ЕКК2. Мутации гена В-КаТ приводят к появлению сигнала В-КаТ, не зависящему от предшествующих сигналов. В результате мутировавший белок В-КаТ (такой как У600Е) инициирует избыточный нисходящий сигнал МЕК и ЕКК. Это приводит к избыточной пролиферации клеток, их выживанию и онкогенезу. Чрезмерная активация сигнального каскада мутировавшей В-КаТ задействована при многих злокачественных образованиях.

Рецепторная тирозинкиназа (РТК) с-КО (также называемая СЭ117) экспрессируется широким диапазоном типов клеток. Лигандом с-К1Т является фактор стволовых клеток (ФСК). Связывание ФСК с внеклеточным доменом с-К1Т вызывает димеризацию рецептора и активацию нисходящих сигнальных путей, включая путь КА8/КАР/МЕК/ЕКК. Мутантная с-К1Т задействована в патогенезе некоторых раковых заболеваний.

Несмотря на существование специфических ингибиторов В-КаТ (таких как вемурафениб) и соединений, таких, как предложены в международных заявках на патент АО 2006/039718 и АО 2008/034008, сохраняется необходимость в ингибиторе КаТ, обладающем активностью для ингибирования всех изоформ белков КаТ, включая А-КаТ, В-КаТ, С-КаТ и В-КаТ с мутацией У600Е. Кроме того, сохраняется необходимость в ингибиторе КаТ, обладающем активностью в отношении опухолевых клеток, в которых происходит предшествующая активация пути, вызванная мутациями Ν-Как, мутациями К-Как и мутациями сКО. Кроме того, сохраняется необходимость в обеспечении альтернативных ингибиторов КаТ для лечения рака. Также сохраняется необходимость в обеспечении альтернативных ингибиторов КаТ, обладающих активностью для ингибирования А-КаТ, В-КаТ, С-КаТ и В-КаТ с мутацией У600Е для лечения рака. Соответственно, в настоящем изобретении предложен ингибитор КаТ, который может обладать ингибирующей активностью в отношении всех изоформ белков КаТ. Также в настоящем изобретении предложен ингибитор КаТ, который может обладать активностью в отношении опухолевых клеток, в которых происходит предшествующая активация пути, вызванная мутациями Ν-Как, мутациями К-Как и мутациями сКО. Кроме того, в настоящем изобретении предложен альтернативный ингибитор КаТ. Также в настоящем изобретении предложен альтернативный ингибитор КаТ, который может подходить для лечения рака. В настоящем изобретении также предложен альтернативный ингибитор КаТ, обладающий ингибирующей активностью в отношении А-КаТ, В-КаТ, С-КаТ и В-КаТ с мутацией У600Е. Кроме того, в настоящем изобретении предложен альтернативный ингибитор КаТ, обладающий ингибирующей активностью в отношении А-КаТ, В-КаТ, С-КаТ и В-КаТ с мутацией У600Е, который может подходить для лечения рака.

На чертеже приведена типовая рентгеновская порошковая дифрактограмма соединения согласно примеру 1.

В настоящем изобретении предложено соединение, представляющее собой 1-(3,3-диметилбутил)-3(2-фтор-4-метил-5 -(7-метил-2-(метиламино)пиридо [2,3-6]пиримидин-6-ил)фенил)мочевину, или его фармацевтически приемлемая соль.

В качестве конкретного варианта реализации в настоящем изобретении предложено соединение, представляющее собой 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,36] пиримидин-6 -ил) фенил)мочевину.

В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая 1-(3,3диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-6]пиримидин-6ил)фенил)мочевину или ее фармацевтически приемлемую соль совместно с фармацевтически приемлемым носителем. В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая 1(3,3-диметилбутил)-3 -(2-фтор-4-метил-5-(7 -метил-2-(метиламино)пиридо [2,3-6]пиримидин-6ил)фенил)мочевину совместно с фармацевтически приемлемым носителем.

- 1 024824

В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая 1-(3,3диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-6ил)фенил)мочевину или ее фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-6-ил)фенил)мочевину и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.

В качестве конкретного варианта реализации в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-6-ил)фенил)мочевину или ее фармацевтически приемлемую соль и сополимер поливинилпирролидона и винилацетата (ПВП-ВА). В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая комбинация, содержащая 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил2-(метиламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-6-ил)фенил)мочевину и сополимер поливинилпирролидона и винилацетата (ПВП-ВА). Кроме того, в настоящем изобретении предложены предпочтительные варианты реализации фармацевтических композиций, описываемых в настоящей заявке, в которых ПВП-ВА выбран из группы, состоящей из коповидонов Κοίΐίάοη® УА 64 и Иазбоие™ 8-630. Предпочтительно ПВП-ВА представляет собой Κοίΐίάοη® УА 64.

Предпочтительный состав согласно настоящему изобретению содержит 1-(3,3-диметилбутил)-3-{2фтор-4-метил-5-[7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-6-ил]фенил}мочевину или ее фармацевтически приемлемую соль совместно с Κοίΐίάοη® УА 64 (ВА8Р Οοτροταΐίοη, кат.№ 95405-2-43), сополимером 1-винил-2-пирролидона и винилацетата в отношении 60:40 и 1-2% (мас./мас.) лаурилсульфата натрия. Получают твердую дисперсию, которая может содержать 20% или 40% лекарственного средства и 0-2% лаурилсульфата натрия или соответствующее количество другого подходящего фармацевтически приемлемого увлажнителя, пластификатора, технологической добавки или иного подходящего вспомогательного вещества(веществ).

В настоящем изобретении предложен способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-6-ил)фенил)мочевины или ее фармацевтически приемлемой соли. В настоящем изобретении предложен способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-6-ил)фенил)мочевины.

В настоящем изобретении предложена 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-6-ил)фенил)мочевина или ее фармацевтически приемлемая соль для применения в терапии. В настоящем изобретении предложена 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4метил-5-(7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-6-ил)фенил)мочевина или ее фармацевтически приемлемая соль для применения для лечения рака. В настоящем изобретении предложена композиция для применения для лечения рака, содержащая 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил2-(метиламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-6-ил)фенил)мочевину или ее фармацевтически приемлемую соль.

В настоящем изобретении предложена 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-6-ил)фенил)мочевина для применения в терапии. В настоящем изобретении предложена 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3б]пиримидин-6-ил)фенил)мочевина для применения для лечения рака. В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция для применения для лечения рака, содержащая 1-(3,3диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-6ил)фенил)мочевину.

В настоящем изобретении предложено применение 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-6-ил)фенил)мочевины или ее фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения рака. В настоящем изобретении также предложено применение 1 -(3,3-диметилбутил)-3 -(2-фтор-4-метил-5-(7 -метил-2-(метиламино)пиридо [2,3 б]пиримидин-6-ил)фенил)мочевины для получения лекарственного средства для лечения рака.

В настоящем изобретении предложена 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-6-ил)фенил)мочевина в кристаллической форме. В настоящем изобретении также предложена 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-6-ил)фенил)мочевина в кристаллической форме, характеризующейся рентгеновской порошковой дифрактограммой, имеющей характеристические пики, 2θ±0,2, при 16,0 и один или более пиков при 6,9, 7,0, 18,2 и 23,2.

Кроме того, в настоящем изобретении предложены предпочтительные варианты реализации способов и применений, описанных в настоящей заявке, в которых рак выбран из группы, состоящей из острой миелоидной лейкемии (ОМЛ), хронической миелоидной лейкемии (ХМЛ), хронической лимфобластной лейкемии (ХЛЛ), миелодиспластического синдрома, рака яичников, меланомы, мелкоклеточного рака

- 2 024824 легких, немелкоклеточного рака легких, колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака простаты, рака печени или рака щитовидной железы. Более предпочтительно рак выбран из группы, состоящей из рака щитовидной железы, рака яичников, меланомы, острой миелоидной лейкемии (ОМЛ) и колоректального рака. Еще более предпочтительно рак представляет собой меланому или колоректальный рак.

Способ лечения рака, представляющего собой рак щитовидной железы, рак яичников, меланому, ОМЛ или колоректальный рак, у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-6-ил)фенил)мочевины или ее фармацевтически приемлемой соли.

Соединение, представляющее собой 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-6-ил)фенил)мочевину, или его фармацевтически приемлемая соль для применения в терапии.

Соединение, представляющее собой 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-6-ил)фенил)мочевину, или его фармацевтически приемлемая соль для применения для лечения рака, представляющего собой рак щитовидной железы, рак яичников, меланому, ОМЛ или колоректальный рак.

Применение 1 -(3,3-диметилбутил)-3 -(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2-(метиламино)пиридо [2,3б]пиримидин-6-ил)фенил)мочевины или ее фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения рака, представляющего собой рак щитовидной железы, рак яичников, меланому, ОМЛ или колоректальный рак.

В конкретном варианте реализации фармацевтическая композиция содержит 1-(3,3-диметилбутил)3-{2-фтор-4-метил-5-[7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-6-ил]фенил}мочевину или ее фармацевтически приемлемую соль совместно с фармацевтически приемлемым носителем и необязательно с другими терапевтическими ингредиентами.

В конкретном варианте реализации фармацевтическая композиция содержит 1-(3,3-диметилбутил)3 -{2-фтор-4 -метил-5 - [7 -метил-2-(метиламино)пиридо [2,3 -б] пиримидин-6-ил] фенил} мочевину или ее фармацевтически приемлемую соль совместно с фармацевтически приемлемым носителем и необязательно с другими терапевтическими ингредиентами, в частности подходящими для лечения рака в целом или конкретного типа рака.

В настоящем изобретении предложено соединение формулы:

Ν' или его фармацевтически приемлемая соль.

Термин пациент обозначает млекопитающее, а млекопитающее включает, но не ограничивается им, человека.

Терапевтически эффективное количество или эффективное количество обозначает дозировку соединения или его фармацевтически приемлемой соли или фармацевтической композиции, содержащей предложенное соединение или его фармацевтически приемлемую соль, необходимое для ингибирования сигналов В-ВаГ, С-ВаГ, А-ВаГ и/или В-ВаГ У600Е у ракового пациента и для уничтожения целевых раковых клеток или замедления или остановки прогрессирования рака у пациента. Предполагаемые дозировки предложенного соединения или его фармацевтически приемлемой соли находятся в диапазоне от 300 до 1500 мг/пациент/сутки. Ожидается, что предпочтительные дозировки находятся в диапазоне от 400 до 1400 мг/пациент/сутки. Ожидается, что наиболее предпочтительные дозировки находятся в диапазоне от 600 до 1200 мг/пациент/сутки. Точную дозировку, требуемую для лечения пациента, и продолжительность курса лечения определяет лечащий врач с учетом стадии и степени тяжести заболевания, а также конкретных требований и ответа каждого пациента и конкретного вводимого соединения. Несмотря на то, что приведенные выше данные выражены в пересчете на суточную дозу, для обеспечения оптимального терапевтического благоприятного действия у пациента схему дозирования можно регулировать. Помимо введения один раз в сутки подходящими схемами являются введение два раза в сутки (ВГО) или три раза в сутки (ТГО). Введение ВГО является предпочтительным согласно настоящему изобретению.

Термины лечение, лечить и излечивать включают полный спектр мер противодействия раковому заболеванию, от которого страдает пациент, таких как введение активного соединения для ослабления, замедления или обращения вспять одного или более симптомов рака и для отсрочки прогрессирования рака, даже если раковое заболевание фактически не устраняется.

Предложенное соединение согласно настоящему изобретению предпочтительно получают в составе фармацевтической композиции с использованием фармацевтически приемлемого носителя или одного или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ и вводят при помощи ряда способов. Предпочтительно указанные композиции предназначены для перорального введения. Указанные фармацевтические композиции и способы их получения хорошо известны в

- 3 024824 данной области техники. См., например, ΚΕΜΙΝΟΤΟΝ: ТНЕ δΤΊΕΝΤΈ ΆΝΏ РКАСТ1СЕ ОР РНАКМАСУ (А. Оеииаго, е! а1., еб§., 21⁸‘ еб., Маек РиЬйкНпд Со., 2005).

Предложенное соединение согласно настоящему изобретению способно взаимодействовать с рядом неорганических и органических кислот с получением фармацевтически приемлемых солей присоединения кислот. Указанные фармацевтически приемлемые соли и общая методология их получения хорошо известны в данной области техники. См., например, Р. §!аЬ1, е! а1., ΗΛΝΌΒΟΟΚ ОР РНАКМАСЕИТЮАР 8АЬТ§: РКОРЕКТ1Е8, 5ЕЕЕСТ1ОХ АМ) И8Е, (УСНА/^беу-УСН, 2002); 8.М. Негде, е! а1., РЬагшасеиОса1 8а1к 1оигиа1 оГ РЬагшасеибса1 Заепсек, Уо1. 66, Νο. 1, Тпшагу 1977.

Следует понимать, что 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-6-ил)фенил)мочевину или ее фармацевтически приемлемую соль можно получать при помощи ряда способов, известных в данной области техники, а также тех, что описаны ниже.

Соединение согласно примеру 1 имеет следующее название: 1-(3,3-диметилбутил)-3-{2-фтор-4метил-5-[7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-6-ил]фенил}мочевина; также его можно называть: N-(3,3-диметилбутил)-N'-[2-фтор-4-метил-5-[7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-6ил]фенил]мочевина; можно использовать и другие названия, позволяющие однозначно определить соединение согласно примеру 1.

Соединения, применяемые в качестве исходных веществ для синтеза 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2фтор-4-метил-5-(7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-6-ил)фенил)мочевины, хорошо известны, и даже если они не являются коммерчески доступными, то их можно легко синтезировать при помощи приведенных конкретных способов, при помощи стандартных способов, применяемых специалистами в данной области техники, или содержащихся в общих справочниках.

Примеры известных процедур и способов включают те, что описаны в общих справочниках, таких как СотргеЬеи81уе Огдатс ТгаизГогтайопк, УСН РиЬйкЬегк 1пс, 1989; Сотрепбшт оГ Огдатс ЗупШейс МеШобк, Уо1ите8 1-10, 1974-2002, \УПеу 1п!ег8аепсе; Абуапсеб Огдатс СЬет18!гу, РеасОощ МесЬатктк, апб 8йис!иге, 5* ЕбШоп, МюЬае1 В. διηίΐΐι апб 1еггу МагсЬ, \УПеу 1п!ег8шепсе, 2001; Абуапсеб Огдатс СЬет181гу, 4* ЕбШоп, Рай В, Кеасйопк апб 8уп!йе818, Ргапсй А. Сагеу апб КюЬагб I. ЗипбЬегд, К1и\уег Асабетю // Р1епит РнЫйНецу 2000, и т.д., а также в ссылках, приведенных в указанных справочниках.

Следующие термины, используемые в настоящем описании, имеют указанные значения: б6-ДМСО относится к гексадейтерированному диметилсульфоксиду; ДХМ относится к дихлорметану; ДМСО относится к диметилсульфоксиду; Е!ОАс относится к этилацетату; Е!ОН относится к этанолу; ВЭЖХ относится к высокоэффективной жидкостной хроматографии; 1РАС относится к изопропилацетату; КР относится к содержанию воды, определенному по методу Карла Фишера; МС относится к масс-спектроскопии; МеОН относится к метанолу; МТБЭ относится к метил-третбутиловому эфиру; ЯМР относится к ядерному магнитному резонансу; КТ относится к комнатной температуре; ТГФ относится к тетрагидрофурану.

Если не указано обратное, соединениям, проиллюстрированным в настоящей заявке, присваивали названия и нумерацию с использованием АСЭРАВЗ или Зутух Эга\у 3.2.

Пример получения 1.

-бром-2 -фтор -4 -метиланилин

Способ А.

Объединяли 1-бром-4-фтор-2-метилбензол (30,0 г, 159 ммоль) и концентрированную серную кислоту (100 мл), охлаждали примерно до -5°С и обрабатывали по каплям азотной кислотой (11,00 мл, 174 ммоль) в течение 20 мин. Оставляли реакционную смесь нагреваться до КТ и перемешивали в течение 30 мин. Выливали в колотый лед при перемешивании и разделяли с использованием метил-третбутилового эфира (МТБЭ) (200 мл). Отделяли водный слой и экстрагировали МТБЭ (2x50 мл). Объединяли органические слои, сушили и концентрировали при пониженном давлении с получением 1-бром-4фтор-2-метил-5-нитробензола в виде оранжевой вязкой маслянистой жидкости (39,0 г).

Объединяли неочищенный 1-бром-4-фтор-2-метил-5-нитробензол (32,4 г, 138 ммоль), этанол (100 мл) и никель Ренея (1,00 г, 17,04 ммоль) в колбе встряхивателя. Колбу заполняли водородом (275 кПа) и перемешивали до прекращения абсорбции водорода. Спускали давление в реакционном сосуде, удаляли катализатор путем фильтрования и выпаривали фильтрат досуха. Добавляли МТБЭ, затем снова фильтровали и выпаривали фильтрат. Перемешивали остаток в гексанах. Собирали твердые вещества путем фильтрования, промывали холодными гексанами и сушили в вакууме с получением титульного соединения (17,8 г, выход 63%) в виде темного твердого вещества. МС (т/ζ): 204,0 (М+1)/206,0 (М+3).

Способ В.

В 4-горлую круглодонную колбу, оборудованную механической мешалкой, термометром, ледяной баней и подводом Ν₂, добавляли 1-бром-4-фтор-2-метилбензол (1,4 кг, 7,4 моль), затем добавляли кон- 4 024824 центрированную Н₂8О₄ (6,3 кг) при 0-10°С. После перемешивания в течение 10-20 мин смесь охлаждали до -10~0°С и по частям добавляли КЫО₃ (0,82 кг, 7,8 моль, 1,05 экв.) в течение примерно 6 ч, поддерживая температуру -10~0°С. После завершения добавления реакционную смесь нагревали до 10-20°С, прохождение реакции отслеживали путем ТСХ (ЭА:ПЭ = 1:20) и ВЭЖХ до того момента, когда содержание 1-бром-4-фтор-2-метилбензола становилось <0,5%. Смесь выливали в смесь лед/вода (11,2 кг, лед:вода = 1:1) и дважды экстрагировали МТБЭ (4,7 л и 1,9 л). Органические слои объединяли, промывали насыщенным солевым раствором (5,6 кг) и концентрировали до 1,5~2У при температуре ниже 45°С и пониженном давлении. Остаток разбавляли ЕЮАс (5,6 л), полученный раствор непосредственно использовали на следующей стадии (1,22 кг (с коррекцией по мас.%), выход 70,5%, чистота 68,3%, определенная по УФ поглощению при 210 нм). ^!Н ЯМР (400 МГц, СЭС1₃): δ 8,35 (5, 1 = 7,1 Гц, 1Н), 7,29 (к, 1 = 11,3 Гц, 1Н), 2,59 (к, 1 = 6,8 Гц, 3Н).

В 4-горлую круглодонную колбу, оборудованную механической мешалкой, термометром и подводом Ν₂, добавляли раствор 1-бром-4-фтор-2-метил-5-нитробензола (1,16 кг, 4,96 моль) в ЕЮАс (5 л) и 36% раствор НС1 (4,9 кг, 49,6 моль, 10,0 экв.). После перемешивания в течение 5~10 мин при 20~30°С по частям добавляли порошок Ре (1,34 кг, 24,0 моль, 4,8 экв.), поддерживая температуру 20-30°С. Прохождение реакции отслеживали путем ТСХ (ЭА:ПЭ = 1:10). После завершения реакции рН доводили до 2~3 при помощи NаНСОз и добавляли Се1йе® (0,56 кг). Смесь перемешивали в течение 0,5~1 ч и фильтровали. Твердое вещество промывали толуолом (2x2,6 л). Фильтраты объединяли и перемешивали в течение еще 0,5~1 ч, после чего разделяли слои. Водный слой экстрагировали толуолом (2,6 л). Органические слои объединяли, промывали солевым раствором (3 л) и фильтровали через подложку с силикагелем (2~3 см). Фильтрат концентрировали до 2~2,5 л, остаток перемешивали с н-гептаном (3,3 л). Снова концентрировали до 2~2,5 л, после чего добавляли н-гептан (1,65 л). Смесь охлаждали до -10~0°С и перемешивали в течение 1 ч. Осадок собирали путем фильтрования, промывали н-гептаном (0,5 л, предварительно охлажденным до -10~0°С) и сушили с получением неочищенного титульного соединения в виде коричневого твердого вещества. Перекристаллизация неочищенного продукта в н-гептане (3,3 л) приводила к получению титульного соединения в виде беловато-коричневого твердого вещества (527 г, выход 52%, 98% чистота, определенная по поглощению при 210 нм). 'Н ЯМР (400 МГц, к6-ДМСО): δ 6,97 (т, 2Н), 5,18 (5, 2Н), 2,16 (5, ЗН); ¹³С ЯМР (500 МГц, СЭС13): 5 21,41, 116,60, 118,30, 119,66, 127,22, 132,88, (149,37, 151,12); ¹⁹Р ЯМР (400 МГц, СЭС13): δ 151,14.

Пример получения 2.

2-фтор-4-метил-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)анилин

Способ А.

Объединяли 5-бром-2-фтор-4-метиланилин (3,1 г, 15,2 ммоль), бис-(пинаколато)дибор (4,24 г, 16,7 ммоль) и ацетат калия (4,47 г, 45,6 ммоль) в диоксане (40 мл) и барботировали аргоном. Добавляли комплекс [1,1'-бис-(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладий(П)-дихлорметан (0,620 г, 0,760 ммоль), снова барботировали аргоном и грели при 100°С в течение ночи. Фильтровали реакционную смесь и концентрировали в вакууме. Очищали путем хроматографии на силикагеле (0-50% ЕЮАс/гексаны) с получением титульного соединения (3,24 г, выход 85%). МС (т/ζ): 252,1 (М+1).

Способ В.

В 4-горлую круглодонную колбу, оборудованную механической мешалкой, термометром и подводом Ν₂, добавляли 5-бром-2-фтор-4-метиланилин (200 г, 0,98 моль), СН₃СООК (192 г, 1,95 моль, 2,0 экв.), бис-(пинаколато)дибор (248 г, 0,98 моль, 1,0 экв.) и 1РАС (3 л). Дегазировали Ν₂ в течение 30 мин, после чего смесь нагревали до 50°С и добавляли Рк(крр£)С1₂ (8 г, 4 мас.%). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение по меньшей мере 10 ч до достижения содержания исходного материала <2% (ГХ). Смесь охлаждали до 20~30°С, фильтровали через подложку с Се1йе® и промывали 1РАС (1 л). Фильтрат концентрировали до 400-500 мл. Остаток перемешивали с н-гептаном (700 мл), фильтровали через подложку 8Ю₂ и элюировали смесью 1РАС/н-гептан (сначала 1/5, ~2 л, затем 2/5, ~3 л). Фильтрат концентрировали до 350-400 мл. Добавляли н-гептан (300 мл) и смесь снова концентрировали до 350~400 мл. Остаток (в виде суспензии) охлаждали до -10—20°С и фильтровали после 2-5часового перемешивания. Неочищенный продукт растворяли в МеОН (200 мл) при 30~40°С, затем медленно по каплям добавляли Н₂О (600 мл) в течение 0,5-1 ч. Суспензию охлаждали до 20~30°С и фильтровали после 1-2-часового перемешивания. Твердое вещество сушили в глубоком вакууме с получением титульного соединения в виде беловатого твердого вещества (183 г, выход 74%, чистота 99%, определена по УФ поглощению при 210 нм); Ή ЯМР (400 МГц, СЭС1₃): δ 7,42 (к, 1 = 10,2 Гц, 1Н), 7,01 (к, 1 = 12,4 Гц, 1Н), 3,76 (5, 2Н), 2,64 (5, 3Н), 1,55 (5, 12Н); ¹³С ЯМР (500 МГц, СЭС1₃): 5 20,66, 20,67, 24,40, 82,93,

- 5 024824

116,20, 124,37, 130,64, 135,02, (151,93, 153,37); ¹⁹Р ЯМР (400 МГц, СИС1₃): δ 145,72.

Пример получения 3.

Проп-1-ен-2-ил-2-фтор-4-метил-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)фенилкарбамат

В ЕЮАс (60 мл) и насыщенный водный ЫаНСО₃ (60 мл) добавляли 2-фтор-4-метил-5-(4,4,5,5тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)анилин (5,0 г, 19,91 ммоль) и изопропенилхлорформиат (2,40 мл, 21,90 ммоль) и перемешивали при КТ в течение 6 ч. Разделяли слои, экстрагировали водный слой ЕЮАс (2х), промывали объединенные органические слои солевым раствором, сушили над Ыа₂8О₄ и концентрировали с получением титульного соединения. Использовали для следующего взаимодействия без дополнительной очистки (предполагая 100% выход). МС (т/ζ): 336,2 (М+1).

Пример получения 4.

Гидрохлорид 3,3-диметилбутан-1-амина < на

В 4-горлую круглодонную колбу, оборудованную механической мешалкой, термометром и подводом Ν₂, добавляли 3,3-диметилбутаналь (200 г, 2,0 моль). Затем по каплям добавляли 1-фенилметанамин (214 г, 2,0 моль, 1,0 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 20-30°С в течение 2~5 ч до достижения конверсии более 99%, определенной путем ГХ. Добавляли №Ю1 (4 г) и отбрасывали водную фазу. Добавляли ТГФ (800 мл) и смесь концентрировали до 400 мл. Эту операцию повторяли до тех пор, пока значение КР остатка не становилось менее 0,2%. Добавляли ТГФ (800 мл) и 1-ВиОК (44,8 г, 0,4 моль, 0,2 экв.). Смесь нагревали до 60~65°С и перемешивали до тех пор, пока содержание Юбензил-3,3диметилбутан-1-имина, определенное путем ГХ, не становилось менее 1%. После охлаждения до 10-20°С добавляли воду (1500 мл) и смесь экстрагировали МТБЭ (2х1500 мл). Объединенные органические фазы промывали насыщенным Ναί'Ί (800 мл), отбирали пробу для анализа содержания воды и подтверждали 1%-2% содержание, определенное по методу КР. Фракцию Ю(3,3-диметилбутил)-1-фенилметанамина использовали непосредственно на следующей стадии (чистота 83% согласно ГХ; ГХ-МС т/ζ 188,2 [М-Н]+).

В 4-горлую круглодонную колбу, оборудованную механической мешалкой, термометром и подводом Ν₂, добавляли раствор Ю(3,3-диметилбутил)-1-фенилметанимина, полученный выше (412 г, 2,18 моль, 3,27 л МТбЭ, 1,3 л ТГФ), и по каплям добавляли раствор НС1/МТБЭ (16%, 398 г, 1,74 моль, 0,8 экв.) при 20~30°С. Во время добавления осаждалось белое твердое вещество. После перемешивания в течение 1~2 ч фильтровали аликвоту образца суспензии. Надосадочную жидкость исследовали путем ГХ. Если содержание Ю(3,3-диметилбутил)-1-фенилметанимина составляло более 30%, то дополнительно добавляли раствор НС1/МТБЭ (45 г, 0,10 экв.) до достижения содержания Ю(3,3-диметилбутил)-1фенилметанимина, определенного путем ГХ, 20~30%. Твердое вещество собирали путем фильтрования, промывали МТБЭ (870 мл) и сушили в атмосфере Ν2 с получением целевого титульного соединения в виде белого кристаллического вещества (195 г, выход 65%); 'Н ЯМР (400 МГц, 66-ДМСО): δ 7,90 (в, ЗН), 2,74 (т, 2Н), 1,47 (т, 2Н), 0,89 (в, 9Н); ¹³С ЯМР (500 МГц, 66-ДМСО): δ 28,98, 29,31, 35,49, 40,34.

Пример получения 5.

1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2ил)фенил)мочевина

Способ А.

Раствор проп-1-ен-2-ил-2-фтор-4-метил-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2ил)фенилкарбамата (6,67 г, 19,90 ммоль) в диоксане (60 мл) обрабатывали 3,3-диметилбутан-1-амином (2,42 г, 23,9 ммоль) и 1-метилпирролидином (0,169 г, 1,99 ммоль) и грели при 75°С в течение ночи. Охлаждали смесь до КТ, собирали твердое вещество путем фильтрования и промывали диэтиловым эфиром с получением титульного соединения (6,62 г, выход 88% за две стадии). МС (т/ζ): 379,2 (М+1).

Способ В.

В 4-горлую круглодонную колбу, оборудованную механической мешалкой, термометром и подводом N2, добавляли 2-фтор-4-метил-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)анилин (40 г, 0,159 моль), ТГФ (600 мл) и №-1НСО3 (16,0 г, 0,19 моль, 1,20 экв.). Смесь охлаждали до 0~5°С и по кап- 6 024824 лям добавляли фенилхлорформиат (26,14 г, 0,167 моль, 1,05 экв.). Реакционную смесь нагревали до 60°С и перемешивали до достижения содержания 2-фтор-4-метил-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан2-ил)анилина <2%. Смесь фильтровали и твердое вещество (соль) промывали ТГФ (120 мл). Фильтрат концентрировали до 65~80 мл. В остаток добавляли толуол (720 мл), 3,3-диметилбутан-1-амин (соль НС1, 26,14 г, 0,19 моль, 1,2 экв.) и ТЭА (20,87 г, 0,21 моль, 1,3 экв.). Полученную смесь нагревали до 90°С и перемешивали до достижения содержания промежуточного вещества <2%. Смесь охлаждали до 15~20°С, перемешивали в течение 2 ч и фильтровали. Твердое вещество промывали толуолом (120 мл), Н₂О (2x400 мл) и сушили в глубоком вакууме с получением титульного соединения в виде белого твердого вещества (54,9 г, выход 91,3%, чистота 99%, определенная по УФ поглощению при 210 нм); 'Н ЯМР (400 МГц, 66-ДМСО): δ 8,34 (6, 1 = 9,1 Гц, 1Н), 8,08 (5, 1Н), 6,98 (6, 1 = 12,3 Гц, 1Н), 6,41 (5, 1Н), 3,08 (5, 2Н), 2,38 (5, 3Н), 1,36 (т, 14Н), 0,90 (5, 9Н); ¹³С ЯМР (500 МГц, 66-ДМСО): δ 21,12, 24,65, 29,37, 29,58, 35,65, 43,50, 83,25, 104,32, 116,09, 125,02, 128,19, 138,71, (152,40, 154,34), 154,81; ¹⁹Р ЯМР (400 МГц, 66ДМСО): δ 136,34.

Пример получения 6.

Этил-4-амино-2-(метилтио)пиримидин-5-карбоксилат

Способ А.

В интенсивно перемешиваемую суспензию этил-4-хлор-2-(метилтио)пиримидин-5-карбоксилата (200 г, 860 ммоль) в этаноле (ЕЮН) (450 мл) добавляли концентрированный гидроксид аммония (335 мл, 8,60 моль) и оставляли перемешиваться на ночь. Собирали твердые вещества путем фильтрования, промывали ЕЮН (2x100 мл) и Н₂О (3x200 мл) и сушили в вакуумной печи (65-70°С) в течение ночи с получением титульного соединения (164,4 г, выход 90%) в виде белого твердого вещества. МС (т/ζ): 214,1 (М+1).

Способ В.

В реакционный сосуд помещали 1190 г ТГФ и 660 г этил-4-хлор-2-(метилсульфанил)пиримидин-5карбоксилата (1,0 экв., 2,84 моль). Перемешивали при 10~20°С в течение 20-30 мин, а затем в смесь добавляли 907 г ПН₃-Н₂О и 989 г Εΐ₃Ν.

Нагревали до 45-55°С и перемешивали в течение 2-6 ч при 45-55°С. После завершения реакции охлаждали до 8-12°С и добавляли 4000 г воды. Перемешивали в течение 4-8 ч при 8-12°С, фильтровали и промывали 200 г воды. Сушили осадок в вакууме при 80°С в течение 8-24 ч с получением титульного соединения (560 г; чистота 98,8%, выход 92%; [М+1] = 213,8; ¹Н ЯМР (66-ДМСО, 400 МГц): δ = 8,564 (5, 1Н), 8,278 (5, 1Н), 8,011 (5, 1Н), 7,649 (5, 1Н), 4,293-4,240 (66, ф = 6,8, ί₂ = 14, 2Н), 2,462 (5, 3Н), δ 1,308-1,272 (т, 3Н)).

Пример получения 7.

(4-амино-2-(метилтио)пиримидин-5-ил)метанол

Η₂Ν Ν 5

Охлаждали раствор этил-4-амино-2-(метилтио)пиримидин-5-карбоксилата (72,3 г, 339 ммоль) в тетрагидрофуране (ТГФ) (900 мл) до 0°С. По каплям добавляли раствор Ь1Л1Н₄ (2М в ТГФ) (195 мл, 390 ммоль) в течение 1 ч. Перемешивали в течение 2 ч при 0°С и оставляли реакционную смесь нагреваться до КТ на ночь. Охлаждали смесь до 0°С и осторожно гасили путем последовательного добавления воды (15 мл), 20% водн. КОН (15 мл) и воды (30 мл). Перемешивали полученную смесь в течение 1 ч. Сушили над Мд§О4, фильтровали, концентрировали при пониженном давлении и сушили в вакууме с получением титульного соединения (55,85 г, выход 96%). МС (т/ζ): 172,1 (М+1).

Пример получения 8.

4-амино-2-(метилтио)пиримидин-5-карбальдегид

Способ А.

В суспензию (4-амино-2-(метилтио)пиримидин-5-ил)метанола (28 г, 164 ммоль) в хлороформе (818 мл) добавляли МпО₂ (49,8 г, 572 ммоль) и грели реакционную смесь при 55°С (внутренняя температура смеси) в течение 4 ч. Фильтровали горячую реакционную смесь и промывали осадок горячим хлороформом и ТГФ. Концентрировали объединенные фильтраты при пониженном давлении и сушили в вакууме с получением титульного соединения (26,7 г, выход 96%) в виде бледно-желтого твердого вещества МС (т/ζ) 170,1 (М+1).

- 7 024824

Способ В.

В реакционный сосуд помещали 450 г (2,08 моль, 1,0 экв) этил-4-амино-2-(метилтио)пиримидин-5карбоксилата и 6750 мл (15,0 V) ТГФ В отдельный реакционный сосуд помещали 88,1 г (1,1 экв) ЫА1Н₄ и 2250 г (5,0 V) ТГФ Охлаждали полученную смесь, содержащую ЫЛ1Н₄, до -5~5°С По каплям добавляли раствор этил-4-амино-2-(метилтио)пиримидин-5-карбоксилата в ТГФ в смесь, содержащую ЫЛ1Н₄, при температуре ниже 10°С После завершения добавления перемешивали смесь при 5~15°С в течение 2-3 ч Охлаждали до -5~5°С и по каплям добавляли 279 г (1,5 экв) ЕЮАс при температуре ниже 20°С Перемешивали смесь при 10~20°С в течение 1-2 ч Добавляли 450 г (0,66 экв) Ыа₂8О₄ 10Н₂О по частям при температуре ниже 20°С Перемешивали смесь при 10~20°С в течение 1~2 ч фильтровали суспензию через диатомитовую землю промывали осадок ТГФ В фильтрат, содержащий раствор (4-амино-2(метилтио)пиримидин-5-ил)метанола, помещали 734 г (4,0 экв) МпО₂ Нагревали смесь до 40°С перемешивали смесь при 40~45°С в течение 6~8 ч фильтровали суспензию через диатомитовую землю промывали осадок ТГФ объединяли фильтраты, концентрировали и по каплям добавляли 1530 г (5,0 V) н-гептана перемешивали смесь при 10~20°С в течение 3~4 ч фильтровали суспензию и промывали осадок гептаном Сушили осадок при пониженном давлении при 40~50°С в течение 10-16 ч с получением титульного соединения (276 г, чистота 97,9%, выход 75%, [М+1] = 171,8, ’Н ЯМР (66-ДМСО, 400 МГц) δ = 7,887 (5, 1Н), 6,704 (5, 2Н), 5,066-5,042 (т, 1Н), 5 4,292-4,280 (б, 2Н), 2,392 (5, 3Н); [М+1] = 169,8, ¹Н ЯМР (СБС1₃, 400 МГц) δ = 9,769 (5, 1Н), 8,414 (5, 1Н), 8,190 (5, 1Н), 5,772 (5, 1Н), 2,540 (5, 3Н)).

Пример получения 9

-метил-2-(метилтио)пиридо [2,3-б]пиримидин-6-ол

Способ А.

В раствор гидроксида натрия (23,64 г, 591 ммоль) и воды (200 мл) добавляли 1-гидроксипропан-2он (24,3 мл, 355 ммоль) и 4-амино-2-(метилтио)пиримидин-5-карбальдегид (50 г, 296 ммоль). В суспензию добавляли ЕЮН (600 мл) и перемешивали при КТ в течение ночи. Медленно добавляли раствор концентрированной НС1 (50 мл) в воде (350 мл). Добавляли 1:1 ЕЮН/Н₂О (100 мл) и собирали твердые вещества путем фильтрования. Промывали твердые вещества 1:1 ЕЮН/Н₂О (250 мл), ледяным ЕЮН (4x25 мл) и гексанами (2x250 мл). Сушили в вакуумной печи при 30-35°С с получением титульного соединения в виде бежевого твердого вещества (34 г, выход 56%). МС (т/ζ): 208,1 (М+1).

Способ В.

В реакционный сосуд помещали 2400 г (8,0 V) Н₂О и 177,3 г (2,5 экв.) ЫаОН и 300,0 г (1,77 моль, 1,0 экв.) 4-амино-2-(метилтио)пиримидин-5-карбальдегида и 157,6 г (1,2 экв.) гидроксиацетона. Нагревали смесь до 35-45°С и перемешивали в течение 10-20 ч при 35-45°С. Охлаждали смесь до 5-15°С. По каплям добавляли 4500 мл 1н. НС1 и доводили рН до 3~4 при температуре ниже 15°С. Перемешивали в течение 1-2 ч при 10-15°С. Фильтровали и промывали осадок 300 г воды. Сушили осадок при пониженном давлении при 50~60°С в течение 16-24 ч с получением титульного соединения (372 г коричневого твердого вещества; площадь пика ВЭЖХ: 98,0% (исследование: 90,0%); выход 90%; ’Н ЯМР (66-ДМСО, 400 МГц): δ = 10,864 (5, 1Н), 9,276 (5, 1Н), 7,529 (5, 1Н), 2,570 (5, 6Н)).

Пример получения 10.

7-метил-2-(метилтио)пиридо[2,3-б]пиримидин-6-илтрифторметансульфонат

Р₃СО₂5⁰ N ^NN5

Способ А.

Объединяли 7-метил-2-(метилтио)пиридо[2,3-б]пиримидин-6-ол (25 г, 121 ммоль), ДХМ (1100 мл) и пиридин (98 мл, 1206 ммоль) и охлаждали смесь на ледяной бане до достижения внутренней температуры <3°С. Медленно при помощи шприца добавляли ангидрид трифторметансульфокислоты (24,5 мл, 145 ммоль) с такой скоростью, чтобы поддерживать внутреннюю температуру ниже 5°С. Перемешивали реакционную смесь при 0°С в течение 2 ч. Промывали водой (3x300 мл) и солевым раствором (300 мл), сушили над Мд§О₄ и фильтровали. Концентрировали фильтрат при пониженном давлении (температура водяной бани ~35°С) и сушили в глубоком вакууме в течение 2-3 ч при КТ. Растворяли остаток в ДХМ и очищали путем хроматографии на силикагеле (ЕЮАс/гексаны). Концентрировали фракции с получением получистого твердого вещества. Растирали твердое вещество в 20% смеси ЕЮАс/гексаны (100 мл), собирали путем фильтрования, промывали 20% смесью ЕЮАс/гексаны (2x10 мл) и сушили в вакууме при КТ с получением титульного соединения в виде бледно-розового твердого вещества (28,6 г, выход 70%). МС (т/ζ): 340,0 (М+1).

Способ В.

В реакционный сосуд помещали 4000 мл (20,0 V) ДХМ и 208 г (1,0 моль, 1,0 экв.) 7-метил-2(метилтио)пиридо[2,3-б]пиримидин-6-ола. Перемешивали смесь в течение 10-20 мин. Помещали 312 г

- 8 024824 (4,0 экв.) пиридина при температуре ниже 20°С. Охлаждали до -5~0°С и по каплям добавляли раствор 416 г ангидрида трифторметансульфокислоты (1,5 экв.) в ДХМ (2000 мл, 10,0 V) при температуре ниже 0°С. После завершения добавления перемешивали при 0-5°С в течение 2-3 ч. Гасили реакцию 2000 мл 1н. НС1 (2х). Дважды промывали 500 мл Н₂О. Добавляли 100,0 г силикагеля и перемешивали при 10~20°С в течение 1-2 ч. Фильтровали смесь через диатомитовую землю. Концентрировали фильтрат и по каплям добавляли 1000 мл н-гептана (5,0 V) при перемешивании при 10~20°С. Перемешивали смесь при 10~20°С в течение 3-4 ч. Фильтровали и сушили осадок при пониженном давлении при 35~40°С в течение 8-12 ч с получением титульного соединения (307 г коричневого твердого вещества; площадь пика ВЭЖХ 99,1% (исследование: 96,8%)%; выход 86%); ¹Н ЯМР (СОС1₃, 400 МГц): δ = 9,216 (5, 1Н), 8,120 (5,

1Н), 2,890 (5, 3Н), 2,773 (5, 3Н).

Пример получения 11.

-метил-2-(метиламино)пиридо [2,3-6]пиримидин-6-илтрифторметансульфонат

Н

Способ А.

Нагревали смесь 7-метил-2-(метилтио)пиридо [2,3-6]пиримидин-6-илтрифторметансульфоната (28,6 г, 84 ммоль), диметилформамида (74 мл) и ледяной уксусной кислоты (9,61 мл, 169 ммоль) до 45°С, а затем по каплям добавляли 6,15% водный №ЮС1 (хлорная известь, 612 г, 506 ммоль) в течение 2 ч. Грели при 45-50°С в течение 2 ч, охлаждали до КТ, собирали твердые вещества путем фильтрования и промывали водой (300 мл). В твердые вещества добавляли ДХМ (200 мл), охлаждали суспензию на бане лед-вода и обрабатывали 2,0 М раствором Ν-метиламина в ТГФ (126 мл, 253 ммоль). Оставляли смесь медленно нагреваться до КТ и перемешивали в течение 2 ч. Удаляли растворитель при пониженном давлении, обрабатывали метанолом (МеОН) (50 мл) и перемешивали при КТ в течение 30 мин. Собирали твердое вещество путем фильтрования и промывали МеОН. Обрабатывали твердое вещество ЕЮАс (30 мл) и перемешивали при КТ в течение 30 мин. Собирали твердое вещество путем фильтрования и промывали ЕЮАс с получением титульного соединения (19,82 г, выход 73%). МС (т/ζ): 323,0 (М+1).

Способ В.

В реакционный сосуд помещали 150 г (0,442 моль, 1,0 экв., ограничивающий реагент) 7-метил-2(метилтио)пиридо[2,3-6]пиримидин-6-илтрифторметансульфоната, добавляли 3000 мл ДХМ до получения прозрачного раствора, охлаждали смесь до -5~5°С. Добавляли 105 г (0,442 моль, 1,0 экв.) м-ХПБК по частям при температуре ниже 5°С. Перемешивали смесь при 0~5°С в течение 3~4 ч (Е/А = 1%). По каплям добавляли 660 мл (1,326 моль, 3,0 экв.) 2М метиламина в ТГФ при температуре ниже 10°С, перемешивали смесь при 0~10°С в течение 3-4 ч. Добавляли 1500 мл ДХМ и 1000 мл Н₂О при перемешивании и отделяли водный слой. Четыре раза промывали органический слой 500 мл Н₂О и концентрировали до 600 г при температуре ниже 40°С. Дважды проводили замену растворителя на н-гептан и перемешивали смесь при 10~20°С в течение 3~4 ч. Фильтровали суспензию. Промывали 150 г н-гептана и сушили осадок при пониженном давлении при 65~75°С в течение 10-16 ч с получением титульного соединения (129,6 г, чистота 96,5%, выход 82%); ЖХ-МС (МС+ = 371,8); ¹Н ЯМР (СОС1₃, 400 МГц): δ = 8,932 (5, 1Н),

7,86 (т, 1Н), 5,707 (5, 1Н), 3,192-3,180 (6, 3Н), 2,754 (5, 3Н). Пример получения 12.

N,7-диметилпиридо [2,3-6] пиримидин-2-амин

Обрабатывали раствор 4-амино-2-(метилтио)пиримидин-5-карбальдегида (10 г, 59,1 ммоль) в ацетоне (100 мл) с использованием КОН (3,32 г, 59,1 ммоль), перемешивали при КТ в течение 10 мин, затем концентрировали досуха. Обрабатывали остаток ЕЮАс, промывали насыщенным водным NаНСΟ₃, затем солевым раствором, сушили над №₂8О₄ и концентрировали с получением 7-метил-2(метилтио)пиридо[2,3-6]пиримидина. МС (т/ζ): 192,1 (М+1). Добавляли раствор метиламина в этаноле (33%, 80 мл) и грели при 110°С в течение ночи в пробирке, стойкой к давлению. Удаляли растворитель при пониженном давлении и очищали неочищенный продукт путем хроматографии на силикагеле (50-100% ЕЮАс/гексаны) с получением титульного соединения (6,73 г, 65% за 2 стадии). МС (т/ζ): 175,1 (М+1).

Пример получения 13.

6-бром-У7-диметилпиридо [2,3-6]пиримидин-2-амин

Охлаждали раствор Ы,7-диметилпиридо[2,3-й]пиримидин-2-амина (6,73 г, 38,6 ммоль) в ацетонитриле (160 мл) на ледяной бане, защищая от доступа света алюминиевой фольгой. Добавляли Ν-бромсукцинимид (6,88 г, 38,6 ммоль) и перемешивали при 0°С в течение 2 ч. Переносили реакционную смесь в холодильник при 5°С на 4 дня. Собирали твердое вещество путем фильтрования. Промывали твердое вещество ДХМ и концентрировали промывочные растворы с получением титульного соединения (3,0 г, выход 31%). МС (т/ζ): 253,0/255,0 (М+1).

Пример 1.

-(3,3-диметилбутил)-3 -(2-фтор-4-метил-5-(7 -метил-2-(метиламино)пиридо [2,3-й]пиримидин-6ил)фенил)мочевина

Соединение согласно примеру 1 можно получать при помощи способа А, способа В или способа С.

Способ А.

Объединяли 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2ил)фенил)мочевину (25,9 г, 68,5 ммоль), 7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-й]пиримидин-6илтрифторметансульфонат (22,09 г, 68,5 ммоль) и ЫаНСО₃ (17,28 г, 206 ммоль) в 1,4-диоксане (500 мл) и воде (125 мл) и барботировали аргоном в течение 20 мин. Добавляли тетракис(трифенилфосфин)палладий (3,96 г, 3,43 ммоль), а затем грели в атмосфере аргона при 50°С. Добавляли дополнительное количество 7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-й]пиримидин-6илтрифторметансульфоната (300 мг, 0,55 ммоль) и продолжали нагревать при 50°С в течение ночи. Охлаждали смесь до КТ, собирали твердое вещество путем фильтрования и промывали водой, а затем диэтиловым эфиром. Обрабатывали твердое вещество ацетонитрилом (50 мл) и грели взвесь при 80°С в течение 30 мин. Собирали твердое вещество путем фильтрования, промывали ацетонитрилом и сушили в вакууме при 80°С с получением бледно-желтого твердого вещества. Обрабатывали твердое вещество МеОН (50 мл) и грели смесь при 80°С в течение 1 ч. Охлаждали до КТ, собирали твердое вещество путем фильтрования, промывали МеОН (20 мл) и сушили в вакууме с получением титульного соединения (22,5 г, выход 77%) в виде бледно-желтого твердого вещества. МС (т/ζ): 425,2 (М+1).

Способ В.

Барботировали суспензию 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2диоксаборолан-2-ил)фенил)мочевины (4,48 г, 11,8 ммоль), 6-бром-Ы,7-диметилпиридо[2,3-й]пиримидин2-амина (3,0 г, 11,8 ммоль) и К₂СО₃ (4,91 г, 35,6 ммоль) в диоксане (80 мл) и воде (20 мл) аргоном, обрабатывали тетракис(трифенилфосфин)палладием (0,685 г, 0,593 ммоль) и грели при 85°С в течение ночи. Удаляли диоксан при пониженном давлении, обрабатывали смесь ЕЮАс и солевым раствором, разделяли слои, сушили органический слой над Ыа₂8О₄, концентрировали и очищали путем хроматографии на силикагеле (от 40% до 100% ЕЮАс/гексан, 100% ЕЮАс, 5% МеОН/ЕЮАс). Обрабатывали вещество СН3СЫ, грели при 80°С в течение 1 ч, охлаждали до КТ и собирали твердое вещество путем фильтрования с получением титульного соединения (3,52 г, выход 70%) в виде бледно-желтого твердого вещества. МС (т/ζ): 425,2 (М+1).

Способ С.

В реакционном сосуде продували смесь растворителей, состоящую из 1,4-диоксана (1250 г) и воды (200 г), с использованием Ν₂. Нагревали смесь до 80~85°С. Помещали 100 г (0,31 моль, 1,0 экв, ограничивающий реагент) 7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-й]пиримидин-6-илтрифторметансульфоната, 117,4 г (0,31 моль, 1,0 экв) 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2диоксаборолан-2-ил)фенил)мочевины, 128,7 г (0,93 моль, 3,0 экв) К2СО3 и 6,81 г (0,0093 моль, 0,03 экв) Рй(йррГ)С1₃ в атмосфере азота Перемешивали смесь при 80~90°С в течение 4-6 ч Охлаждали смесь до 40~50°С Концентрировали и по каплям добавляли 2000 г воды при температуре ниже 30°С После завершения добавления перемешивали смесь при 10~30°С в течение 6-8 ч Фильтровали и промывали 200 г воды, затем промывали осадок Сушили осадок при пониженном давлении и 60~70°С в течение 14-16 ч с получением технически чистого титульного соединения в качестве АФИ (158 г, чистота 90,4%, исследование 63,4%, КЕ: 5%-6%) Растворяли технически чистое титульное соединение, представляющее собой АФИ, в 1000 мл ДХМ и 1000 мл ЕЮН при 10~30°С Добавляли 50 г силикагеля, 80 г Ыа₂8₂О₃5Н₂О и 10 г активированного угля Нагревали смесь до 40~50°С и перемешивали в течение 3-5 ч, охлаждали до 10~30°С Фильтровали и промывали осадок 200 г ДХМ/ЕЮН (1 1) Перемешивали с 5 г §ШсаТЫо1 при 40~50°С и фильтровали Дважды заменяли растворитель на 390,0 г ЕЮН Концентрировали и фильтровали суспензию, затем промывали осадок 39,0 г ЕЮН Сушили осадок при пониженном давлении при 65~75°С в течение 14-16 ч с получением титульного соединения в качестве АФИ (61 г, чистота 98,5%, исследование 97,5%, выход 65%), Ή ЯМР (Й6-ДМСО, 400 МГц) δ = 9,077 (5, 1Н), 8,278 (5, 1Н), 7,9687,947 (ά, 1Н), 7,893 (5, 1Н), 7,680 (5, 1Н), δ 7,193-7,162 (ά, 1Н), 6,512-6,485 (т, 1Н), 3,088-3,035 (т, 2Н),

- 10 024824

2,924-2,914 (б, ЗН), 2,296 (5, 3Н), 1,955 (5, ЗН), 1,344-1,304 (т, 2Н), 0,875 (5, 9Н).

Рентгеновская порошковая дифракция.

Дифрактограммы ΧΚΌ кристаллических твердых веществ получали на рентгеновском порошковом дифрактометре Вгикег Ό4 Еибеауог, оборудованном источником СиКа (λ = 1,54060 $$$) и детектором УаШсс, с рабочими характеристиками 35 кВ и 50 мА Образец сканировали в диапазоне от 4 до 40°2θ с шагом 0,009°2θ и скоростью сканирования 0,5 секунды/шаг, дивергенция составляла 0,6 мм, фиксирующая антирассеивающая щель 5,28, щель детектора 9,5 мм Сухие порошки помещали в кварцевый держатель образцов, гладкую поверхность получали при помощи предметного стекла Дифрактограммы кристаллических форм собирали при температуре и относительной влажности окружающей среды В области кристаллографии хорошо известно, что любая данная кристаллическая форма может иметь различные значения относительной интенсивности пиков дифракции, вызванных предпочтительной ориентацией, что обусловлено такими факторами, как морфология и форма кристаллов. В случае наличия предпочтительной ориентации интенсивности пиков изменяются, но положения характеристических пиков полиморфа остаются неизменными. См., например, Фармакопея США № 23, Национальный формуляр № 18, стр. 1843-1844, 1995. Кроме того, в области кристаллографии хорошо известно, что для любой данной кристаллической формы угловые положения пиков могут незначительно изменяться. Например, сдвиг пиков может происходить в результате изменения температуры или влажности, при которых проводят анализ образца, смещения образца или наличия или отсутствия внутреннего стандарта. В настоящем случае погрешность измерения положения пиков ±0,2°2λ учитывает эти возможные изменения, но не препятствует однозначной идентификации указанной кристаллической формы. Подтверждение кристаллической формы можно проводить на основании любой уникальной комбинации различных пиков (в °2λ), как правило, наиболее выраженных пиков. Дифрактограммы кристаллической формы, собранные при температуре и относительной влажности окружающей среды, нормировали по стандартным пикам ΝΙ8Τ 675 при 8,853 и 26,774 градуса 2-тета.

Твердая кристаллическая форма свободного основания.

Таким образом, полученный образец твердой кристаллической формы свободного основания согласно примеру 1 был охарактеризован при помощи дифрактограммы ΧΡΌ, полученной с использованием излучения СиКа и имеющей пики дифракции (в градусах 2-тета), такие как описано ниже в табл. 1, в частности имеющей пики при 16,0 в комбинации с одним или более пиков, выбранных из группы, состоящей из 6,9, 7,0, 18,2 и 23,2; где погрешность углов дифракции составляла 0,2 градуса.

Таблица 1

Пики рентгеновской порошковой дифракции твердой кристаллической формы свободного основания согласно примеру 1

Общеизвестно, что биодоступность соединения с низкой растворимостью можно увеличивать за счет введения его в состав твердой дисперсии в полимерной матрице. Указанные твердые дисперсии представляют собой дисперсии лекарственного средства в инертной матрице-носителе, полученные пу- 11 024824 тем плавления (плавки) смесей лекарственное средство-полимер и последующего отверждения гомогенной расплавленной смеси посредством быстрого охлаждения (например, при помощи способов, таких как экструзия горячего расплава) или путем растворения лекарственного средства и полимера в подходящем органическом растворителе и последующего удаления растворителя посредством выпаривания (например, при помощи сушки распылением) или осаждения с использованием антирастворителя. В твердых дисперсиях, как правило, лекарственное средство переходит в аморфную форму, что приводит к увеличению скорости растворения и/или к увеличению степени (уровня) и продолжительности пересыщения, обеспечивая повышенную пероральную биодоступность соединений с низкой растворимостью по сравнению с недиспергированным кристаллическим лекарственным средством. Полимеры, которые успешно используют в твердых дисперсиях, включают (но не ограничиваются ими) поливинилпирролидон (ПВП), поливинилпирролидон-винилацетат (ПВП-ВА), гидроксипропилметилцеллюлозу (ГПМЦ), ацетат-сукцинат гидроксипропилметилцеллюлозы (ГПМЦАС), фталат гидроксипропилметилцеллюлозы (ГПМЦФ-55), ацетат-фталат целлюлозы (ЦАФ) и Еийгадй® ЕРО.

Физическая и химическая стабильность твердых дисперсий являются факторами, определяющими возможность применения указанных составов. Содержание лекарственного средства является другой переменной, которая может влиять на физическую стабильность метастабильной аморфной фазы лекарственного средства, а также на его характеристики ίη νίνο. Предпочтительным способом введения твердой дисперсии человеку является ее дополнительная обработка с получением капсулы, таблетки или другой твердой пероральной лекарственной формы путем добавления фармацевтически приемлемого носителя и необязательно других вспомогательных веществ, подходящих для получения и улучшения характеристик указанных лекарственных форм. Твердые дисперсии можно дозировать в виде капсул, заполненных порошком или гранулированной смесью, суспензии в подходящем носителе или любой другой подходящей пероральной фармацевтической лекарственной формы, такой как (не ограничиваясь ими) таблетки, саше, гранулы, капсулы, заполненные гранулами, и т.д.

Вследствие низкой биодоступности соединения согласно примеру 1, вызванной его низкой растворимостью, желательным является получение составов для проведения исследования на небольших животных, таких как собаки и крысы, а также для клинического исследования. С использованием нейтрального полимера ПВП-ВА (Κοίίίάοη® УА 64) получали твердые дисперсии, которые обладали химической и физической стабильностью в ускоренном исследовании стабильности (40°С; относительная влажность 75%) в течение одного месяца, а также в исследовании хранения в течение продолжительного периода времени (11 месяцев для 20% содержания лекарственного средства и 10 месяцев для 40% содержания лекарственного средства) в условиях окружающей среды.

Пример композиции 1. 20% твердая дисперсия, содержащая соединение согласно примеру 1: ПВП-ВА (20:80).

Кристаллическое соединение согласно примеру 1 использовали для получения твердой дисперсии. Сополимер поливинилпирролидона и винилацетата (ПВП-ВА) коммерчески доступен под торговой маркой Κοίίίάοη® УА 64 производства ВАЗЕ Согрогайоп. В качестве растворителя использовали 1: 1 смесь дихлорметана и метанола, полученную путем смешения равных объемов дихлорметана (р18Йег Зс1епййс) и метанола (Οιηηί3ο1ν). Также использовали коммерчески доступный лаурилсульфат натрия (р18Йег Зс1епййс).

Способ. Твердую дисперсию получали и сушили распылением в виде двух небольших партий. Для получения первой партии соединение согласно примеру 1 (22,22 г) добавляли в 2000 мл бутыль. Добавляли 1180 мл растворителя (дихлорметан:метанол, 1:1) и образец обрабатывали в ультразвуковой ванне в течение примерно 20 мин до полного растворения соединения, что давало теоретическое значение концентрации 19 мг/мл. В полученный раствор добавляли 88,86 г ПВП-ВА и растворяли путем перемешивания до получения гомогенного раствора. Раствор соединения согласно примеру 1 и ПВП-ВА (20:80) в смеси дихлорметан:метанол (1:1) сушили распылением при помощи распылительной минисушилки (ВисЫ Μίηί Зргау Эгуег 290). Расход раствора составлял 9-12 мл/мин, температуру на входе устанавливали на 100°С-110°С, температура на выходе, соответственно, составляла 37-55°С. Для получения второй партии соединение согласно примеру 1 (34,62 г) добавляли в 2000 мл бутыль. Добавляли 1820 мл растворителя (дихлорметан:метанол, 1:1) и образец обрабатывали в ультразвуковой ванне в течение примерно 20 мин до полного растворения соединения, что давало теоретическое значение концентрации 19 мг/мл. В полученный раствор добавляли 138,48 г ПВП-ВА и растворяли путем перемешивания до получения гомогенного раствора. Раствор соединения согласно примеру 1 и ПВП-ВА (20:80) в смеси дихлорметан:метанол (1:1) сушили распылением при помощи распылительной минисушилки (ВисЫ Μίηί Зргау Огуег 290). Расход раствора составлял 14-15 мл/мин, температуру на входе устанавливали на 100-110°С, температура на выходе, соответственно, составляла 62-70°С. Высушенный распылением материал из двух полученных партий перемешивали и дополнительно сушили в вакуумной печи в течение ночи при температуре 40-60°С, а затем выдерживали в вакууме еще день при комнатной температуре.

В 236,28 г твердой дисперсии, содержащей смесь соединение согласно примеру 1:ПВП-ВА (20:80) добавляли 4,278 г лаурилсульфата натрия, тщательно перемешивали в крупном сосуде для кристаллиза- 12 024824 ции при помощи шпателя с получением конечной композиции, содержащей 98% твердой дисперсии и 2% лаурилсульфата натрия.

Полученный состав можно дозировать в виде капсул, заполненных перемешанным порошком, или суспензии, полученной путем суспендирования в носителе, например в смеси 1% гидроксиэтилцеллюлоза/0,25% полисорбат 80/0,05% противовспенивающая добавка Эо\у Согшпд 1510-И8.

Пример композиции 2. 40% твердая дисперсия, содержащая соединение согласно примеру 1: ПВП-ВА (40:60)

Использовали кристаллическое соединение согласно примеру 1, сополимер поливинилпирролидона и винилацетата (ПВП-ВА) и лаурилсульфат натрия, такие как описано для примера композиции 1.

Способ. Твердую дисперсию получали при помощи способа сушки распылением, по существу, такого, как описано для примера композиции 1, с использованием 3,79 г соединения согласно примеру 1, соответствующего объема растворителя (дихлорметан:метанол, 1:1) с получением раствора с концентрацией 20 мг/мл. В полученный раствор добавляли 5,68 г ПВП-ВА и растворяли путем перемешивания до получения гомогенного раствора. Раствор сушили распылением, по существу, так, как описано для примера композиции 1. Расход раствора устанавливали на 40% при помощи 2 мм силиконовой трубки, температуру на входе устанавливали на 80°С, соответственно, температура на выходе составляла 34°С. Высушенный распылением материал собирали и дополнительно сушили в вакуумной печи в течение 14 ч при комнатной температуре, медленно подавая ток азота, в присутствии поглотителя влаги.

В 6,64 г твердой дисперсии, содержащей смесь соединение согласно примеру 1: ПВП-ВА (40:60) добавляли 0,0665 г лаурилсульфата натрия, тщательно перемешивали в сосуде при помощи шпателя, что приводило к получению конечной композиции, содержащей твердую дисперсию и лаурилсульфат натрия в отношении 99:1.

Полученный состав можно дозировать в виде капсул, заполненных перемешанным порошком, или суспензии, полученной путем суспендирования в носителе, например в смеси 1% гидроксиэтилцеллюлоза/0,25% полисорбат 80/0,05% противовспенивающая добавка Эо\у Согшпд 1510-И8.

Рак в последнее время все чаще воспринимают как гетерогенную группу заболеваний, возникновение и прогрессирование которых происходит в результате нарушения функции одного или более генов, которые регулируют репарацию ДНК, стабильность генома, пролиферацию клеток, гибель клеток, адгезию, ангиогенез, инвазию и метастаз в клеточных и тканевых микросредах. Измененная или нарушенная функция раковых генов может возникать в результате естественного полиморфизма ДНК, изменений числа копий генома (за счет амплификации, делеции, утраты хромосом или дупликации), изменений структуры генов и хромосом (за счет хромосомной транслокации, инверсии или иной перегруппировки, которая приводит к дерегуляции экспрессии генов), а также точечных мутаций. Раковые новообразования могут возникать в результате единственного нарушения функции гена и поддерживаться тем же нарушением функции гена, или могут поддерживаться и прогрессировать за счет дополнительных нарушений функции генов.

Помимо генетических структурных изменений хромосом, отмеченных выше, каждое из раковых заболеваний может включать эпигенетические модификации генома, включая метилирование ДНК, геномный импринтинг и модификации гистонов в результате ацетилирования, метилирования или фосфорилирования. Эпигенетические модификации могут влиять на возникновение и/или поддержание злокачественного образования.

Были составлены расширенные каталоги цитогенетических нарушений при раковых заболеваниях человека, которые поддерживаются и регулярно обновляются в сети Интернет (см. базу данных Мительмана для структурных нарушений хромосом при раке в проекте анатомии генома при раке (Сапсег Сепоте АпаЮту Рго|ес1 (ССАР)) национального института рака США (ИС1), веб-сайт: НИр://сдар.пс1.п|Н.доу). База данных включает структурные нарушения хромосом, по меньшей мере, для некоторых злокачественных образований, приведенных в настоящем изобретении. В проекте генома рака института Сенгера (^ейсоте Тгпк1) ведут подробную онлайн-базу данных Сапсег Сепе Сепкик для всех генов человека, которые имеют причинно-следственную связь с онкогенезом (см. ИрУ/ууу.капдег.ас.ик/депейск/ССР/Сепкик), а также базу данных СО8М1С (каталог соматических мутаций при раке) для соматических мутаций при раковых заболеваниях человека (см. ЬйрУ/ууу.капдег.ас.ик/депейск/ССР/соктк). Дополнительным источником, в котором содержится подробная информация о цитогенетических изменениях, имеющих причинно-следственную связь с различными раковыми заболеваниями, является Атлас генетики и цитогенетики при онкологии и гематологии (Ьйр://аЙа5депейс5опсо1оду.Огд//Апотайе5/Апот1151е.Ыт1#МП§). Указанные базы данных также включают структурные нарушения хромосом, по меньшей мере, для некоторых злокачественных образований, приведенных в настоящем изобретении.

Известна и традиционно используется диагностика раковых злокачественных образований путем биопсии, иммунофенотипирования и других исследований. Помимо технологий бэндинга хромосом с высоким разрешением и усовершенствованной визуализации хромосом структурные нарушения хромосом в случаях, где предполагают рак, можно определять путем цитогенетического анализа, такого как флуоресцентная гибридизация ш κίΐιι (ΡΙδΗ), кариотипирование, спектральное кариотипирование (δΚΥ),

- 13 024824 мультиплексная ΡΙδΗ (Μ-ΡΊδΗ), сравнительная геномная гибридизация (СОН), матрицы однонуклеотидного полиморфизма (δΝΡ СЫрк) и другие диагностические и аналитические исследования, известные и используемые специалистами в данной области техники.

Сигнальный путь Вак/ВаГ/МЕК/МАРК передает внеклеточные стимулы к ядру, регулируя тем самым разнообразные клеточные ответы, включая пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток. Нарушение указанных процессов в результате изменений сигнала МАРК, таких как генетические изменения, часто приводят к злокачественной трансформации. Важность этого сигнального пути при новообразованиях становится очевидной с учетом открытия множества мутантных аллелей, которые активируют этот путь при различных злокачественных образованиях у человека. Онкогенные мутации рецепторных тирозинкиназ (РТК), таких как РЭФР и сМс1, или избыточная экспрессия РТК и их лигандов приводят к нарушению активации Как и нисходящих компонентов ее сигнального пути. Активирующие мутации Как были выявлены примерно в 30% раковых заболеваний человека. Указанные мутации значительно снижают активность ГТФазы, тем самым переводя Вак в ГТФ-связанное и активное состояние. У млекопитающих семейство Вак состоит из трех генов: К-Вак, Ν-Вак и Η-Вак. Мутации К-Вак часто происходят при эпителиальных раковых заболеваниях, таких как рак поджелудочной железы, легких и колоректальный рак, тогда как мутации Ν-Вак часто происходят при меланоме, злокачественных образованиях в печени и миелоидных (ОМЛ, ХМЛ) злокачественных образованиях. Активирующие мутации В-ВаГ, члена семейства ВаГ, очень часто обнаруживают при меланоме и карциноме щитовидной железы и реже при колоректальном раке, раке яичников и легких. У пациентов с меланомой были выявлены соматические мутации МЕК1 и МЕК2. Наконец, исчерпание отрицательных регуляторов, таких как члены семейства δρΓουΙν, и ОАР (белков, активирующих ГТФазу), таких как ΝΡ1, может косвенным образом активировать этот путь. Полагают, что при многих опухолях происходит дерегуляция пути Как/КаГ/ΜЕК/ΜАРК, что делает его привлекательной мишенью для терапевтического вмешательства.

Семейство белков ВаГ состоит из трех членов, А-ВаГ, В-ВаГ и С-ВаГ (также называемого ВаГ1), которые играют ключевую роль при переносе сигналов от Вак к нисходящим компонентам пути МЕК1/2 и ЕВЮ/ЕВК?. Было показано, что протеинкиназы ВаГ задействованы в онкогенезе, включая пролиферацию, выживание, инвазию и ангиогенез опухолевых клеток, δοόοΙΙ-ΡοοροΙά е! а1., №1 Вех Сапсег, 2004, 4: 937-947; \Уе11Ьгоск е! а1., №1 Веу Μοί Се11 Бю1, 2004, 5: 875-885. Активация пути МАРК в опухолевых клетках проходит по нескольким механизмам, таким как мутации или повышенная экспрессия РТК и мутации Вак, и все из них опосредованы белками ВаГ. Активирующие мутации В-ВАР, что более важно, часто наблюдают при некоторых злокачественных образованиях, включая меланому, колоректальный рак, карциномы легких, яичников и щитовидной железы, Эа\тек е! а1., №!иге, 2002, 417: 949-954. Примерно 90% мутаций В-ВаГ заключаются в изменении Т1799А в экзоне 15, что приводит к аминокислотной замене Уа1 на О1и (В-ВаГ У600Е). Эта мутация В-ВаГ приводит к увеличению конститутивной активности киназы примерно в 500 раз по сравнению с белком дикого типа, вызывая злокачественную трансформацию. Также известны дополнительные мутации, такие как Τ529Ι, мутация с заменой треонина на изолейцин в гене-привратнике В-ВаГ, и О468А, вторичная мутация В-ВаГ при О1403С в 11 экзоне, которые, как полагают, играют роль в появлении, поддержании или усилении злокачественной трансформации, ^Ыйакег е! а1., δ^. Тгапк1. Меб., 2010, 2(35) га41; \Уап е! а1., Се11, 2004, 116: 855-867.

Недавно специфический ингибитор киназы В-ВаГ вемурафениб (также называемый РЬХ-4032) был одобрен Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (РЭА) для лечения пациентов с меланомой, имеющих мутацию В-ВаГ У600Е. Вемурафениб является эффективным и обеспечивает благоприятные показатели выживаемости у указанных пациентов. Тем не менее, у пациентов, чувствительных к этому лекарственному средству, обычно развивается лекарственная резистентность, что приводит к рецидиву заболевания в среднем через 7 месяцев. По аналогии со многими другими терапиями направленного действия приобретенная резистентность к ингибированию В-ВАР значительно затрудняет достижение долгосрочных благоприятных показателей выживаемости при лечении этой популяции пациентов.

В поисках улучшений благоприятного действия ингибиторов В-ВаГ продолжают проводить исследования по выявлению механизмов, которые наделяют клетки меланомы, экспрессирующие мутантную В-ВАР, резистентностью к вемурафенибу. Недавние исследования показали, что механизмом резистентности к ингибированию В-ВАР является повторная активация пути МАРК. В механизмах резистентности, главным образом, задействована повторная активация сигнала ЕВК за счет вспомогательных механизмов, которые могут быть Как/КАΡ-зависимыми, такими как активация Ν-Вак, №/апап е! а1, №йиге. 2010, 468: 973-7, активация Н-Вак (δυ е! а1., Νον Еп§1апб 1οιιπκι1 οί Мебкше. 2012, 366: 207-215) или повышающая регуляция С-ВАР Ηοίκ-ηυ·^^!'! е! а1., №й.1ге. 2010, 468: 968-72; Μοηίади! е! а1., Сапсег Век. 2008, 68: 4853-61), вариации В-ВАР У600Е с нарушенным сплайсингом ^цИка^к е! а1., №йиге. 2011, 480: 387-390), или Вак/ВАР-независимыми (повышенная экспрессия Тр12/СОТ), .КНаппеккеп е! а1., №йиге.

2010, 468: 968-72. Следовательно, ослабление действия ингибирования В-ВАР на сигнальный путь МАРК при раковых заболеваниях с мутацией В-ВАР может происходить по нескольким механизмам. Несмотря на то, что мутации гена-привратника В-ВАР (Т5291), которые могут вызывать резистентность к ингибированию ВВАР, до настоящего времени еще не получили клинического подтверждения, сущест- 14 024824 вуют экспериментальные доказательства того, что указанная мутация вызывает резистентность, \УНй1акет с1 а1., δει Тгапк1 Меб. 2010, 2(35): га41. В недавних исследованиях также высказывались предположения о том, что активация МАРК-избыточных сигнальных путей посредством РТК, таких как 1СР-1Р или РИСРРР, может иметь значение при приобретенной резистентности к ингибированию В-РАР; Ναζαпап е1 а1., №Диге. 2010, 468: 973-7; УШапиеуа е1 а1., Сапсег Се11. 2010, 18: 683-95; δΐιί е1 а1., Сапсег Кек. 2011, 71: 5067-74. Очевидно, что во многих из указанных механизмов резистентности задействована повторная активация МАРК. Можно ожидать, что универсальный ингибитор Ка! сможет блокировать повторную активацию МАРК.

Кроме того, было показано, что специфические ингибиторы В-РаГ, включая вемурафениб и его ближайший аналог N-[3 -(5-хлор-1Н-пирроло [2,3-Ь]пиридин-3 -карбонил)-2,4-дифторфенил]пропан-1 сульфонамид (РЬХ4720; коммерчески доступный селективный ингибитор В-РаГ) вызывают активацию парадоксального пути посредством димеризации с другими изоформами КаГ в окружении В-КаГ дикого типа, НаГгщаккйюи С, еГ а1. №Ииге, 2010, 464: 431-435; Роийкакок еГ а1., №Диге, 2010, 464: 427-430; Не1богп, е1 а1., Се11, 2010, 140: 209-221. Полагают, что вемурафениб активирует путь РаГ/МЕК/ЕРК посредством связывания В-РаГ дикого типа и стимуляции димеризации В-РаГ-С-РаГ. Полагают, что активация такого парадоксального пути за счет специфического ингибирования В-РаГ является основной причиной побочных эффектов на коже (таких как плоскоклеточная карцинома) у некоторых пациентов с меланомой, которых лечили вемурафенибом. Вемурафениб не одобрен для лечения раковых пациентов с генетическим окружением В-РаГ дикого типа вследствие его активности в отношении активации парадоксального пути при данном генетическом окружении.

Исследуемое предложенное соединение является ингибитором РаГ киназы, ингибирующим все изоформы белков РаГ, включая А-РаГ, В-РаГ, С-РаГ и В-РаГ с мутацией У600Е. Вследствие универсальной активности в отношении РаГ исследуемое предложенное соединение обладает активностью в отношении опухолевых клеток, в которых активация пути МАРК происходит посредством предшествующих сигналов, таких как мутация Ν-Рак и мутация К-Рак в генетическом окружении В-РаГ дикого типа.

Таким образом, исследуемое предложенное соединение обладает потенциалом для лечения пациентов с раковыми заболеваниями с мутацией В-РаГ (такими как меланома, колоректальный рак, карцинома легких, яичников и щитовидной железы), с мутацией Ν-Рак В-РаГ дикого типа (такими как меланома, ОМЛ, ХМЛ, ОЛЛ, ХЛЛ, рак печени) ^сйиЬЬей е1 а1., №Диге Ре\те\ук Сапсег, 2007, 7: 295; Ру1ауе\а-Сир1а е1 а1., №1иге Ре\те\ук Сапсег, 2011, 11: 761); или с мутацией К-Рак В-РаГ дикого типа (такими как рак желчевыводящих путей, шейки матки, колоректальный рак, рак эндометрия, легких, яичников, поджелудочной железы и печени; δΛώ^ή е1 а1., №Диге Ре\ае\ук Сапсег, 2007, 7: 295; Ру1ауеуа-Сир1а е1 а1., №Щце Ре\ае\ук Сапсег, 2011,11: 761) или РаГ, активированной по другому механизму, включая предшествующую активирующую мутацию/повышенную экспрессию РТК. Исследуемое предложенное соединение также обладает активностью в отношении опухолевых клеток меланомы с развившейся резистентностью к вемурафенибу. Таким образом, полагают, что исследуемое предложенное соединение является эффективным для лечения пациентов с меланомой, лечение которых с использованием вемурафениба или других ингибиторов В-РаГ не дало результата.

Исследуемое предложенное соединение также является ингибитором с-Кй. С'-Кй представляет собой рецепторную тирозинкиназу, которая в обычных условиях контролирует функцию примитивных гематопоэтических клеток, меланоцитов и зародышевых клеток. После связывания со своим лигандом, фактором стволовых клеток (ФСК), с-Кй подвергается димеризации/олигомеризации и аутофосфорилированию. Генетические мутации (такие как Ь576Р, К642Е, Т6701 и У654А) с-Кй, которые приводят к конститутивной активации с-Кй, могут вызывать меланому, острую миелоидную лейкемию и стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта (С^Т), таким образом, исследуемое предложенное соединение обладает потенциалом для лечения пациентов с меланомой, острой миелоидной лейкемией и СГБТ, Ьеппайккоп е1 а1., СиггеЩ Сапсег Эгид ТатдеГк, 2006, 6: 65.

Предложенное соединение можно применять в качестве единственного агента или в комбинации с одним или более другими одобренными лекарственными средствами для лечения раковых пациентов. Указанные раковые пациенты включают: пациентов с меланомой с мутацией В-РаГ У600Е, пациентов с меланомой, лечение которых с использованием вемурафениба или других ингибиторов В-РаГ не дало результатов, пациентов с меланомой с мутацией Ν-Рак В-РаГ дикого типа, пациентов с меланомой с повышенной экспрессией с-Кй или мутацией с-Кй; пациентов с колоректальным раком с мутацией В-РаГ У600Е или мутацией К-Рак В-РаГ дикого типа; пациентов с раком яичников с мутацией В-РаГ У600Е или мутацией К-Рак В-РаГ дикого типа; пациентов с раком легких с мутацией В-РаГ У600Е или мутацией К-Рак В-РаГ дикого типа; пациентов с миелоидной лейкемией с мутацией Ν-Рак В-РаГ дикого типа или повышенной экспрессией с-Кй или мутацией с-Кй; пациентов с раком печени с мутацией Ν-Рак или КРак В-РаГ дикого типа; пациентов с раком поджелудочной железы с мутацией К-Рак В-РаГ дикого типа; пациентов с карциномой щитовидной железы с мутацией В-РаГ У600Е или Ν-Рак В-РаГ дикого типа; пациентов с раком желчевыводящих путей с мутацией К-Рак В-РаГ дикого типа; пациентов с СГБТ с мутацией или повышенной экспрессией с-Кй.

В следующих исследованиях ш \йго и ш νί\Ό продемонстрирована ингибирующая активность

- 15 024824 предложенного соединения в отношении сигнального пути Как/КаТ/МЕК/ЕКК. Специалисты в данной области техники, в целом, считают, что эти исследования подтверждают клиническую химиотерапевтическую активность при лечении человека. Исследования, в которых получают подтверждения универсальности ингибирования КаТ и ингибирующей активности в отношении сигнального пути, можно проводить, по существу, при помощи приведенных далее способов или при помощи схожих исследований с получением схожих данных. Если не указано иное, приведенные значения 1С₅₀ являются абсолютными.

Ферментные исследования киназной активности В-КаТ, С-КаТ и мутантных В-КаТ.

Проводили оценку ингибирующей активности исследуемого соединения в отношении человеческой В-КаТ дикого типа, человеческой С-КаТ дикого типа, человеческой В-КаТ У600Е, человеческой В-КаТ У600Е+Т5291 или человеческой В-КаТ У600Е+0468А. Т5291 представляет собой мутацию генапривратника В-КаТ с заменой треонина на изолейцин, а О468А представляет собой вторичную мутацию В-КаТ при О1403С в 11 экзоне. В ферментных исследованиях В-КаТ, С-КаТ и мутаций В-КаТ проводили оценку свойства комплекса КаТ и МЕК1, который в присутствии АТФ катализирует усиленный гидролиз АТФ (Кош1пдег, е! а1., АгсЬ. ВюсЬет. ВюрЬук. 2007, 464: 130-137; опубликованная заявка на патент США № 2006/0211073). Образующийся АДФ отслеживают с использованием хорошо известной системы связанных ПК/ЛДГ (пируваткиназа/лактатдегидрогеназа) по окислению НАДН, которое можно наблюдать и детектировать спектрофотометрическими методами по поглощению при 340 нм (А340; основы метода см. в §сЫпб1ег е! а1., 8с1епсе, 2000, 289: 1938-1942). Активируемая КаТ активность АТФазы МЕК1 является общим свойством всех форм белков КаТ.

Экспрессия и очистка белков КаТ.

В целом, клеточные линии получали с использованием коммерчески доступных материалов при помощи способов, известных и традиционно применяемых специалистами в данной области техники. Известны последовательности нуклеотидов, кодирующие ДНК непроцессированного В-КаТ дикого типа (Национальный центр биотехнологической информации (ΝίΈΙ), стандартная последовательность Νί.’_000007.13). С-КаТ (Национальный центр биотехнологической информации (Νί'ΒΙ), стандартная последовательность Νί'.'_000003.11) и А-КаТ (Национальный центр биотехнологической информации (ΝΟΕΙ), стандартная последовательность N^000023.10). См. также для В-КаТ: 8. 1кауа, е! а1., В-гаТ, а пе\у тетЬег οί 1Ье гаТ ТатПу, к асЬуа!еб Ьу ^NА геаггапдетеп!, Мо1 Се11 Вю1, 8(6):2651-4 (1988); для С-КаТ: М. Рикш, е! а1., Мо1еси1аг с1отпд апб сНагасЮп/аЬоп оТ ап асбуЩеб Ьитап с-гаТ-1 депе, Мо1 Се11 Вю1, 7(5):1776-81 (1987); Воппег, е! а1., ТНе сотр1е1е собтд кециепсе оТ !Ье Ьитап гаТ опсодепе апб !Ье соггекропбшд к!гис!иге оТ !Ье с-гаТ-1 депе, ШсШс Аабк Кек., 14 (2), 1009-1015 (1986); для МЕК1: С.Р. 2Ьепд, е! а1., С1отпд апб сЬагасЮп/абоп оТ !уо бкбпс! Ьитап ех1гасе11и1аг к1дпа1-геди1а!еб ктаке асбуаЮг книжек, МЕК1 апб МЕК2, I. Вю1. СЬет., 268 (15), 11435-11439 (1993); для информации о метках: I. ТкаЬ е! а1., Иксоуегу оТ а ке1ес0уе тЫЬЬог оТ опсодетс В-КаТ ктаке \уЬЬ ро1еп1 апбте1апота асДуДу, Ргос. Ν;·ιΐ1. Асаб. 8си И.8.А., 105(8), 3041-3046 (2008); О. НаШуаккДюи, е! а1., КАР 1пЫЬДогк рпте \\Дб-1уре КАР !о асДуа!е !Ье МАРК ра!Ьуау апб епЬапсе дгоУЬ, №!иге, 464 (7287), 431-435 (2010).

В-КаТ У600Е (остатки 433-726, содержащие мутацию У600Е), содержащую Ν-терминальную метку очистки, экспрессировали и очищали, по существу, согласно приведенному ранее описанию (Аап е! а1., Се11, 2004,116, 855-867).

Конструкты В-КаТ У600Е, содержащие вторичную мутацию Т5291 или мутацию О468А, получали путем сайт-направленного мутагенеза (ОшксЬапде, 8!га!едепе) основного конструкта ЬКаТ (433-726, У600Е).

Последовательности, которые применяли согласно настоящему описанию, включают: В-КаТ У600Е (остатки 433-726, содержащие мутацию У600Е) без Ν-терминальной метки очистки; В-КаТ У600Е (остатки 433-426, содержащие мутации У600Е и Т5291) без Ν-терминальной метки очистки; В-КаТ У600Е (остатки 433-726, содержащие мутации У600Е и О468А) без Ν-терминальной метки очистки; ВКАР-У600Е; ВКАР-У600Е+Т5291; ВКАР-У600Е+О468А; ВКАР дикого типа, непроцессированный; последовательность белков МЕК1, которую применяли для скрининга.

Ферментные исследования для измерения киназной активности КаТ.

Проводили оценку ингибирующей активности исследуемого соединения в отношении В-КаТ дикого типа, С-КаТ дикого типа, В-КаТ У600Е, В-КаТ У600Е+Т5291 и В-КаТ У600Е+О468А. Т5291 представляет собой мутацию гена-привратника В-КаТ, а О468А является вторичной мутацией В-КаТ. В ферментных исследованиях В-КаТ, С-КаТ и мутантных В-КаТ проводили оценку свойства комплекса КаТ и МЕК1, который в присутствии АТФ катализирует усиленный гидролиз АТФ (Котшдег, е! а1., АгсЬ. ВюсЬет. ВюрЬук. 2007, 464: 130-137). Образующийся АДФ отслеживают с использованием хорошо известной системы связанных ПК/ЛДГ (пируваткиназа/лактатдегидрогеназа) по окислению НАДН, которое можно наблюдать и детектировать по поглощению при 340 нм (А340; основы метода см. в 8сЫпб1ег е! а1., 8с1епсе, 2000, 289: 1938-1942). Активируемая КаТ активность АТФазы МЕК1 является общим свойством всех форм белков КаТ. В ферментном исследовании В-КаТ дикого типа реакционная смесь содержала: 1,2 нмоль В-КаТ, 30 нмоль МЕК1, 1000 мкмоль АТФ, 3,5 единицы (на 100 мкл) ПК, 5 единиц (на 100 мкл) ЛДГ, 1 ммоль фосфоенолпируват (ФЕП) и 280 мкмоль НАДН. В исследовании С-КаТ реакционная смесь содержала 0,6 нмоль С-КаТ, 26 нмоль МЕК1, 2000 мкмоль АТФ и такие же количества ФК, ЛДГ, ФЕП и

- 16 024824

НАДН, что указаны выше. В исследовании В-РаГ У600Е реакционная смесь содержала 1,6 мкмоль В-РаГ У600Е, 26 нмоль МЕК1, 200 мкмоль АТФ и такие же количества ФК, ЛДГ, ФЕП и НАДН, что указаны выше. В исследовании В-РаГ У600Е+Т5291 реакционная смесь содержала 6,2 нмоль В-РаГ У600Е+Т5291, 30 нмоль МЕК1, 200 мкмоль АТФ и такие же количества ФК, ЛДГ, ФЕП и НАДН, что указаны выше. В исследовании В-РаГ У600Е+0468А реакционная смесь содержала 3,5 нмоль В-РаГ, 30 нмоль МЕК1, 200 мкмоль АТФ и такие же количества ФК, ЛДГ, ФЕП и НАДН, что указаны выше. Все исследования начинали путем перемешивания приведенной выше смеси с исследуемым соединением и непрерывно отслеживали при А340 в течение примерно 5 ч. Данные, полученные для реакционных смесей в период с 3 по 4 час, собирали для вычисления значений 1С50.

Для соединения согласно примеру 1 значение 1С₅₀ в отношении фермента В-РаГ У600Е составляло 6 нмоль, а в отношении С-РаГ - 15 нмоль. Эти данные подтверждают, что предложенное соединение ингибирует В-РаГ У600Е и С-РаГ в указанных исследованиях.

Проводили оценку соединения согласно примеру 1 в других ферментных исследованиях, которые осуществляли при помощи способов, по существу схожих с теми, что описаны выше. Соединение согласно примеру 1 ингибирует В-РаГ дикого типа, В-РаГ У600Е+Т5291 и В-РаГ У600Е+0468А со значениями 1С₅₀, составляющими 9,8, 15,47 и 16,9 нмоль, соответственно. Эти данные подтверждают, что соединение согласно примеру 1 является ингибитором РаГ в указанных исследованиях.

Ферментное исследование киназной активности с-Κίΐ.

с-Κίΐ является важным онкогеном, и ее повышенную экспрессию и генетические мутации часто наблюдают у пациентов с меланомой и стромальной опухолью желудочно-кишечного тракта (018Т). В ферментном исследовании с-Κίΐ спектрофотометрическими методами отслеживали фосфорилирование поли-Е4У под действием АТФ, катализируемое человеческой с-Κίΐ. АДФ, получаемый в результате киназной реакции вступает в реакцию сочетания с системой пируваткиназа/лактатдегидрогеназа (ПК/ЛДГ), в результате которой из пирувата и НАДН образуется НАД. НАДН можно детектировать по поглощению при 340 нм, что описано выше для ферментных исследований киназных активностей В-РаГ, С-РаГ и мутантных В-РаГ.

Экспрессия и очистка рецептора с-Κίΐ дикого типа.

В целом, клеточные линии получали с использованием коммерчески доступных материалов при помощи способов, известных и традиционно используемых специалистами в данной области техники.

Использовали известную последовательность нуклеотидов, кодирующую ДНК непроцессированного рецептора человеческой с-Κίΐ дикого типа (Национальный центр биотехнологической информации (ЫСВ1), стандартная последовательность ЫС_000004.11). См. также для последовательности человеческого белка с1<П: Υ. Уагбсп.У.. с1 а1., Нитап ргоФ-опсодепе с-Ρίΐ: а пс\у се11 кигГасе гсссрЮг (угокте ктаке Гог ап итбепййеб Идапб, ЕМВО 1. 6 (11), 3341-3351 (1987); для ГСТ-гибридных белков: Э.В. §тйй, еΐ а1., 5>шд1е-к1ер рштйсайоп оГ ро1урер1Юе5 ехргеккеб т ЕксЬейсЫа сой ак Гикюпк \νί11ι дйНаШюпе Б-йапкГегаке, 0епе 67 (1988) 31-40; Э.В. §тйй, Рштйсайоп оГ дйиайиопе §-йапкГегаке Гикюп р1Ше1п8, МеШойк Мо1. Се11 Вю1. 4 (1993) 220-229.

Исследования с-Κίΐ.

Исследуемая реакционная смесь содержала 6 нмоль человеческой с-ЮТ дикого типа, 1 мг/мл поли(01и, Туг) (Шдта), 1 ммоль фосфоенолпируват, 280 мкмоль НАДН, 5 ед./3,5 ед. (на 100 мкл) пируваткиназы/лактатдегидрогеназы, 85 ммоль Тпк, рН 7,5, 17 ммоль МдС1₂, 0,0042% ТгПоп® Х-100, 0,005% БСА, 1% ДМСО. Исследуемое соединение инкубировали с реакционной смесью в течение 0,5 ч, после чего добавляли 200 мкмоль АТФ для инициирования реакции при 30°С. Скорости реакции в диапазоне от 0,5 до 1 ч использовали для вычисления значений ингибирования в % и 1С₅₀.

Последовательность, которую использовали в данном исследовании, включала с-ЮТ с Ν-терминальным 08Т гибридным белком.

Для соединения согласно примеру 1 значение 1С₅₀ в исследовании ингибирования с-Κίΐ составляло 21 нмоль. Эти данные подтверждают, что исследуемое предложенное соединение является ингибитором человеческой с-Κίΐ дикого типа в указанном исследовании.

Для дополнительной оценки исследуемого соединения его тестировали в отношении мутаций с-Κίΐ, традиционно встречающихся при меланоме и/или 018Т. Клеточную линию Ва/Р3 (производства АТСС) трансфицировали с-Κίΐ дикого типа (УТ), с-Κίΐ Б576Р (УШшоге-Раупе еΐ а1., Нитап РаШо1оду, 2005, 36(5), 486; УШтоге-Раупе еΐ а1., Нитап Ра1йо1оду, 2006, 37, 520), с-Κίΐ Р642Е (АУШтоге еΐ а1., Ат 1 С1ш РаШо1, 2004, 122(2), 206; Мопке1 еΐ а1., Опсодепе, 2010, 29, 227); с-Κίΐ Т6701 (ТатЪопш еΐ а1., Опсодепе, 2006, 25,6140) или с-Κίΐ У654А (ТатЪопш еΐ а1., Опсодепе, 2006, 25,6140), соответственно, при помощи способов ретровирусной трансфекции, хорошо известных и используемых специалистами в данной области техники. Мутации создавали путем мутагенеза с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и подтверждали путем автоматического секвенирования конструкта, экспрессирующего с-Κίΐ, амплифицированного путем ПЦР. Стабильные клеточные линии Ва/Р3 получали путем трансфицирования плазмидной ДНК. Экспрессию соответствующих мутантных с-Κίΐ подтверждали путем вестерн-блот анализа.

- 17 024824

Рост клеток Ва/Р3 дикого типа, в целом, зависит от 1Ь-3. После трансфекции С-Κίΐ указанные клетки выращивали в питательной среде, рекомендованной АТСС для Ва/Р3, в присутствии фактора стволовых клеток (ФСК), лиганда с-Κίΐ. Активность исследуемых соединений в отношении подавления пролиферации указанных клеток тестировали в присутствии 1Ь-3 или ФСК.

Таблица 2

Активность соединения согласно примеру 1 в отношении подавления пролиферации клеточных линий Ва/Р3 с-Κίΐ

Активность соединения согласно примеру 1 (1С₅о, мкмоль) в отношении подавления пролиферации клеточных линий Ва/РЗ с-Κίΐ

Исследуем	Обр	Ва/РЗ	Ва/РЗ с-	Ва/РЗ с-	Ва/РЗ с-	Ва/РЗ с-Кк	Ва/РЗ с-
ое соединение	абот ка		К ίί АТ	Кк И576Р	Кк К642Е	Τ670Ι	Кк У654А
Пример 1	СКФ	Н/О	0,062	0,179	0,047	0,29	0,086
	11-3	Н/О	2.858	2,079	1.200	5,919	2,942

Данные, приведенные в табл. 2, подтверждают, что соединение согласно примеру 1 обладает ингибирующей активностью в отношении пролиферации и жизнеспособности клеток Ва/Р3 с с-Κίΐ дикого типа и выявленными генетическими мутациями с-Κίΐ.

Измерение киназной активности ВаГ с использованием нативных полных ферментов в исследовании ΚίΝαΙίν. разработанном в АскуХ Вю5аепсе5 1пс.

Для дополнительной оценки универсальной активности исследуемого соединения в отношении ферментов ВаГ его тестировали в исследовании ΚίΝ-ιΟν, разработанном и реализуемом Ас11уХ Вю5аепсе5 1пс., с использованием цельноклеточных лизатов клеток А375. Клетки А375 представляют собой клетки меланомы человека с мутацией В-ВаГ У600Е, А-ВаГ дикого типа и С-ВаГ дикого типа.

Получение образца: Клетки А375 (В-ВаГ У600Е), полученные в АТСС, лизировали путем обработки ультразвуком в коммерчески доступном лизисном буфере, сгусток клеток удаляли путем центрифугирования, полученный надосадочный гель фильтровали в коммерчески доступный буфер для киназной реакции, содержащий 20 ммоль МпС1₂. Конечная концентрация белка в лизатах составляла 10 мг/мл. По 5 мкл каждого исследуемого соединения добавляли из 100 мкмоль, 10 мкмоль, 1 мкмоль или 0,1 мкмоль маточных растворов в ДМСО в 500 мкл лизатов в двух повторностях до достижения конечных концентраций 1 мкмоль, 0,1 мкмоль, 0,01 мкмоль и 0,001 мкмоль. В качестве контроля в 500 мкл лизатов добавляли по 5 мкл ДМСО в четырех повторностях. После 15-минутной инкубации в каждый образец добавляли дестиобиотин-АТФ ацилфосфат в качестве зонда до достижения конечной концентрации 5 мкмоль и инкубировали совместно с образцами в течение 10 мин. После взаимодействия с зондом образцы готовили для анализа таргетной масс-спектрометрии в соответствии со стандартным протоколом АскуХ. Вкратце, образцы подготавливали для гидролиза с трипсином (денатурировали, восстанавливали алкилят), подвергали гидролизу с трипсином, дестио-биотинилированные пептиды концентрировали на смоле со стрептавидином.

Сбор данных: Образцы, обогащенные пептидом, анализировали путем ЖХ-МС/МС на массспектрометре Ткегто-ЬТО с ионной ловушкой с использованием методологии сбора данных АскуХ для клеток А375 У600Е.

Анализ данных: Количественную оценку проводили путем выделения характеристических фрагментов ионных сигналов таргетных МС/МС спектров и сравнения сигналов в контрольных и обработанных образцах. Использовали программное обеспечение АскуХ, проводя при необходимости неавтоматизированную валидацию/визуальную проверку в целях выделения/фильтрации данных. Все значения данных ингибирования подтверждали визуально, так же как и все значения данных, свидетельствующие о колебаниях за рамками нормального диапазона. Значимость значений, соответствующих ингибированию >35%, определяли по следующей формуле: (средняя площадь контрольных пиков - средняя площадь пиков после обработки|/(2*СКО(площади контрольных пиков)) + |площадь пика после обработки для первого эксперимента - площадь пика после обработки для второго эксперимента| > 0,8. Значения 1С₅₀ определяли при помощи программного обеспечения ЮОВ®.

- 18 024824

Таблица 3

Универсальная активность соединения согласно примеру 1 в отношении КаТ в исследовании цельноклеточных лизатов А375 АсйуХ ΚίΝαΙίν

	Ингибирование, %	1С50 (нмоль)
Пример 1 (нмоль)	1000	100	10	1
В-КаГ (У600Е)	96,5	82,9	19,7	8,1	31
В-КаГ (У600Е)	>98	82	7.5	-10	47
А-КаТ (\νΤ)	72	53,6	13,4	4,3	44
С-КаТ (ТУТ)	79,3	50,8	23,9	-11	42

Как показано в табл. 3, соединение согласно примеру 1 ингибировало А-КаТ, В-КаТ У600Е и С-КаТ со значениями 1С50, составляющими 44, 31-47 и 42 нмоль, соответственно. Эти данные подтверждают ингибирование А-КаТ, С-КаТ и В-КаТ У600Е в исследовании цельноклеточных лизатов при использовании соединения согласно примеру 1.

Соединение согласно примеру 1 ингибирует клеточную активность фосфо-ЕКК.

Для исследования возможности соотнесения биохимической активности соединения согласно примеру 1 ίη νίίΓΟ с его клеточной активностью соединение согласно примеру 1 использовали для обработки клеток меланомы А375 У600Е и резистентных клеток \УМ-266-4 У600Е, А375 У600Е-РЬХ4032 (А375гев; получение описано ниже) и клеток НСТ-116 (В-КаТ дикого типа с мутацией К-Кав), клеток опухоли толстой кишки с мутацией К-Кав. Клетки А375 У600Е, \УМ-266-4 У600Е, НСТ-116 с В-КаТ дикого типа с мутацией К-Кав приобретали в АТСС. Клеточную активность определяли при помощи набора для исследования ЕЫ8А, коммерчески доступного в ТОК Вюваепсев, измеряя уровень фосфо-ЕКК для каждого типа клеток.

Резистентные клетки А375 У600Е, А375 У600Е-РЬХ4032, клетки \УМ-266-4 У600Е или НСТ-116 (В-КаТ дикого типа с мутацией К-Кав) выращивали в питательной среде (описанной ниже для исследования Се11ТЬегО1о) в 96-луночных планшетах производства Реткш Е1тег в течение ночи, затем обрабатывали соединением согласно примеру 1 в концентрации 0 и в 11 различных концентрациях, полученных путем последовательного разбавления в диапазоне от 0,17 до 10000 нмоль, в течение 1 ч. Затем клетки в каждой лунке лизировали 50 мкл лизисного буфера производства ТОК Вюваепсев. Активность фосфоЕКК определяли при помощи набора для исследования §итеР1те фосфо-ЕКК А1рЬа8стееп производства ТОК Вюваепсев в соответствии с инструкцией производителя.

Соединение согласно примеру 1 ингибировало уровень фосфо-ЕКК зависящим от дозы образом во всех исследуемых клеточных линиях. Значения 1С₅₀ для клеток А375 У600Е, \УМ-266-4 У600Е, А375 У600Е-гев и НСТ-116 (В-КаТ дикого типа с мутацией К-Кав) составляли 3, 4,9, 9,7 и 132,8 нмоль, соответственно. Эти данные подтверждают, что соединение согласно примеру 1 ингибирует нисходящие сигналы в клетках А375 У600Е, \УМ-266-4 У600Е, А375 У600Е-гев и НСТ-116 с В-КаТ дикого типа с мутацией К-Кав в соответствии с результатами ингибирования КаТ в этом исследовании.

Исследование пролиферации и жизнеспособности клеток Се1ГТЬег-В1ие Исследование пролиферации клеток А375.

Клетки А375 (№ в каталоге СКЬ-1619) получали в Американской коллекции типовых культур (АТСС, Мапаввав, УА). Вкратце, клетки выращивали в среде ИМЕМ с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% стандартной фетальной бычьей сыворотки Д^Ьтодеп, Сат1вЬаб, СА) и 1% смеси пенициллин/стрептомицин/Ь-глутамин при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности. Клетки оставляли для прохождения роста до достижения 70-95% конфлюентности, после чего их пересевали или собирали для использования в исследовании. Исследуемое соединение после последовательных разбавлений помещали в 384-луночный черный планшет с прозрачным дном в трех повторностях. Добавляли по шестьсот двадцать пять клеток на лунку в 50 мкл полной питательной среды в 384-луночный планшет. Планшеты инкубировали в течение 67 ч при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности. По завершении периода инкубации в каждую лунку планшета добавляли 10 мкл 440 мкмоль раствора резазурина (81дша, δΐ. Ьошв, МО) в РВ8 и планшеты дополнительно инкубировали в течение 5 ч при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности. Планшеты исследовали на анализаторе 8упетду2 (Вю1ек, ХУшоовкк УТ), используя длины волн возбуждения 540 нм и испускания 600 нм. Для вычисления значений 1С₅₀ данные анализировали при помощи программного обеспечения Рпвт (ОтарЬраб, 8ап И1едо, СА).

Исследование пролиферации клеток Со1о-205.

Клетки Со1о205 (№ в каталоге НВ-8307) получали в Американской коллекции типовых культур (АТСС, Мапаввав, УА). Вкратце, клетки выращивали в среде КРМ1 1640 с добавлением 10% стандартной фетальной бычьей сыворотки ДпиКодеп, Сат1вЬаб, СА), 1 ммоль пирувата натрия и 1% смеси пенициллин/стрептомицин/Ь-глутамин при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности. Клетки оставляли для прохождения роста до достижения 30-60% конфлюентности, после чего их высевали или собирали для использования в исследовании. Исследуемое соединение после последовательных разбавлений помещали в 384- 19 024824 луночный черный планшет с прозрачным дном в трех повторностях. Добавляли одну тысячу двести пятьдесят клеток на лунку в 50 мкл полной питательной среды в 384-луночный планшет. Планшеты инкубировали в течение 67 ч при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности. По завершении периода инкубации в каждую лунку планшета добавляли 10 мкл 440 мкмоль раствора резазурина (81дта, δΐ. Ьош5, МО) в РВ8 и планшеты дополнительно инкубировали в течение 5 ч при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности. Планшеты исследовали на анализаторе δγ^Γ§γ2 (В1о1ек, \νίηοο5ΐ<ί, νΤ), используя длины волн возбуждения 540 нм и испускания 600 нм. Для вычисления значений 1С₅₀ данные анализировали при помощи программного обеспечения Рп5т (Огарбраб, δаη П1едо, СА).

Исследование пролиферации клеток НТ-29.

Клетки НТ-29 (№ в каталоге НТВ-38) получали в Американской коллекции типовых культур (АТСС, Мапа55а5, νΑ). Вкратце, клетки выращивали в среде МакКоя 5А с добавлением 10% стандартной фетальной бычьей сыворотки Цпубгодеп, СагИЪаб, СА) и 1% смеси пенициллин/стрептомицин/ Ь-глутамин при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности. Клетки оставляли для прохождения роста до достижения 75-90% конфлюентности, после чего их высевали или собирали для использования в исследовании. Исследуемое соединение после последовательных разбавлений помещали в 384-луночный черный планшет с прозрачным дном в трех повторностях. Добавляли одну тысячу двести пятьдесят клеток на лунку в 50 мкл полной питательной среды в 384-луночный планшет. Планшеты инкубировали в течение 67 ч при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности. По завершении периода инкубации в каждую лунку планшета добавляли 10 мкл 440 мкмоль раствора резазурина ^дта, δΐ. Ьош5, МО) в ΡΒδ и планшеты дополнительно инкубировали в течение 5 ч при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности. Планшеты исследовали на анализаторе δγηегду2 (В1о(ек, V^ηοο5к^. νΤ), используя длины волн возбуждения 540 нм и испускания 600 нм. Для вычисления значений 1С₅₀ данные анализировали при помощи программного обеспечения ΡιΪ5ΐη (Огарбраб, δаη О|едо, СА).

Исследование пролиферации клеток НСТ-116.

Клетки НСТ-116 (№ в каталоге ССЬ-247) получали в Американской коллекции типовых культур (АТСС, Мапа55а5, νΑ). Вкратце, клетки выращивали в среде МакКоя 5А с добавлением 10% стандартной фетальной бычьей сыворотки Цпубгодеп, СагбЪаб, СА) и 1% смеси пенициллин/стрептомицин/ Ь-глутамин при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности. Клетки оставляли для прохождения роста до достижения 75-90% конфлюентности, после чего их высевали или собирали для использования в исследовании. Исследуемое соединение после последовательных разбавлений помещали в 384-луночный черный планшет с прозрачным дном в трех повторностях. Добавляли шестьсот двадцать пять клеток на лунку в 50 мкл полной питательной среды в 384-луночный планшет. Планшеты инкубировали в течение 67 ч при 37°С, 5% СО2 и 95% влажности. По завершении периода инкубации в каждую лунку планшета добавляли 10 мкл 440 мкмоль раствора резазурина ^дта, δΐ. Ьош5, МО) в ΡΒδ и планшеты дополнительно инкубировали в течение 5 ч при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности. Планшеты исследовали на анализаторе δуηегду2 (ВЮек, V^пοο5к^. νΤ), используя длины волн возбуждения 540 нм и испускания 600 нм. Для вычисления значений 1С₅₀ данные анализировали при помощи программного обеспечения ΡιΪ5ΐη (Огарбраб, δаη О|едо, СА).

Исследование пролиферации клеток δК-Ме1-2.

Клетки δк-Ме1-2 (№ в каталоге НТВ-68) получали в Американской коллекции типовых культур (АТСС, Мапа55а5, VΑ). Вкратце, клетки выращивали в среде МЕМ с добавлением 10% стандартной фетальной бычьей сыворотки ЦпуПгодеп, СагбЪаб, СА), 1 ммоль пирувата натрия, 0,1 нмоль заменимых аминокислот и 1% смеси пенициллин/стрептомицин/Ь-глутамин при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности. Клетки оставляли для прохождения роста до достижения 70-95% конфлюентности, после чего их высевали или собирали для использования в исследовании. Исследуемое соединение после последовательных разбавлений помещали в 384-луночный черный планшет с прозрачным дном в трех повторностях. Добавляли одну тысячу двести пятьдесят клеток на лунку в 50 мкл полной питательной среды в 384-луночный планшет. Планшеты инкубировали в течение 67 ч при 37°С, 5% СО2 и 95% влажности. По завершении периода инкубации в каждую лунку планшета добавляли 10 мкл 440 мкмоль раствора резазурина ^1дта, δΐ. Ьош5, МО) в ΡΒδ и планшеты дополнительно инкубировали в течение 5 ч при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности. Планшеты исследовали на анализаторе δуηе^ду2 (Вю1ек, V^пοο5к^. νΤ), используя длины волн возбуждения 540 нм и испускания 600 нм. Для вычисления значений 1С₅₀ данные анализировали при помощи программного обеспечения Рп5т (Огарбраб, δаη О|едо, СА).

Клетки А375, ΗΤ-29 и Со1о-205 (АТСС) имели мутацию ν600Ε. Клетки НСТ-116 (АТСС) содержали В-баГ дикого типа с мутацией К-ба5, а клетки δК-Ме1-2 (АТСС) содержали В-баГ дикого типа с мутацией N-6^5.

- 20 024824

Таблица 4

Подавление пролиферации и жизнеспособности клеток

№ примера	Подавление пролиферации клеток, 1Сзо, нмоль
А375	НТ- 29	Со1о-205	нет-116	5К- Ме1-2
1	9	7	27	224	158

Данные, приведенные в табл. 4, подтверждают, что предложенное соединение подавляет пролиферацию и жизнеспособность конкретных клеток, имеющих указанные мутации, в этом исследовании.

Ингибирующая активность в отношении пролиферации и жизнеспособности.

Тестировали ингибирующую активность соединения согласно примеру 1 в отношении пролиферации и жизнеспособности широкого набора клеточных линий опухолей человека в исследованиях

СеиТйег-О1о.

В целом, в исследовании С.'е11ТПег-С1о (Рготеда) клетки выращивали в среде Игла в модификации Дульбекко (ΌΜΕΜ, ТНегто §с1епййс) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ΡΒδ, 1пуНгодеп). Клетки (5х 10³), которые выдерживали в питательной среде, помещали в 96-луночные планшеты с покрытием поли-Э-лизина (ΒΌ Вю5с1епсе5) за день до начала обработки. Клетки обрабатывали в течение 48-72 ч, после чего проводили анализ пролиферации и жизнеспособности в люминесцентном исследовании жизнеспособности клеток С.'е11ТПег-С1о согласно инструкциям производителя (Рготеда) на планшетном анализаторе 5рес1гаМа.\ (Мо1еси1аг Эеу1се5). Для расчета значения концентрации полумаксимального ингибирования (1С₅₀) использовали нелинейную регрессию и сигмоидальные кривые зависимости доза-ответ с использованием программного обеспечения Огар№а6 Рп5т 4.

Для определения чувствительности соединения согласно примеру 1 дополнительно исследовали клеточные линии гематологических раковых заболеваний с В-РаГ дикого типа с мутацией Ν-ΚΑδ. Мутации, активирующие Ν-ΚΗ5, распространены при гематологических раковых заболеваниях, возникая с частотой 10-30%. Исследовали две клеточные линии меланомы с мутантной В-РаГ У600Е (А375 и δΚМе1-28), девять гематологических клеточных линий с мутацией Ν-Κη5 (НЬ-60, ТНР-1, ТЛЬЬ-1, С8166, Н9, 1М-9, ОЛ-10 клон 4, Р31-РШ. МОЬТ-4) и семь клеточных линий с Ν-ΚΗ5 дикого типа (ЬОИСУ, НЕЬ, И266, ЕВ2, Р30-ОНК, NОΜО-1, ССКР-СЕМ), определяли значения 1С₅₀. Несмотря на то, что между значениями чувствительности указанных клеточных линий имеются некоторые различия, 7 из 9 клеточных линий гематологических раковых заболеваний с В-РаГ дикого типа с мутациями И-Ра5 были чувствительными к соединению согласно примеру 1 в субмикромолярной концентрации (1С₅₀ <1 мкмоль).

Таблица 5

Ингибирующая активность соединения согласно примеру 1 в отношении пролиферации и жизнеспособ-

Абс. 1С50	ности клеток, в нмоль Обозначение Отн,1С50 клеточной линии	Коммерческий источник
0,04	0,03	5К-Ме1-28	АТСС
0,05	0,04	СОЬО-829	АТСС
0.06	0,03	НерО2	АТСС
0,08	0,03	ТНР-1	АТСС

- 21 024824

0,11	0,03	А375	АТСС
0,13	0,06	8К-Ме1-5	АТСС
0,17	0,09	ΝΟΙ-Η1993	АТСС
0,19	0,12	ίονο	АТСС
0,2	0,25	ОА-10-клон-4	АТСС
0,2	0,14	НЬ-60	АТСС
0,24	0,22	Са1и-6	АТСС
0,33	0,19	Н9	АТСС
0,33	0,33	ΚΑΤΟΠΙ	АТСС
0,38		ΙΜ-9	АТСС
0,39	0,23	ВхРС-3	АТСС
0,44	0,13	НиН-7	1СВВ СеНЪапк
0,44		Р31-ЕШ	1СК.В СеНЪапк
0,6	0,42	ϋΜ5-53	АТСС
0,68	0,21	Νυοο-з	НеаНЪ 5с1епсе ВевеагсЬ Вевоигсев Вапк
0,69	0,23	55У900	АТСС
0,72	0,42	НСТ-116	АТСС
0,75		ТАЬЬ-1	1СВВ СеНЪапк
0,8	0,36	НерЗВ2.1-7	АТСС
0,81	0,2	А2780	ЗЦта-АИпсЪ
0,83	0,41	ΝΟΙ-Η2030	АТСС
0,91	0,14	ΝΟΙ-Η1299	АТСС
0,93	0,69	ΝΟΙ-Η1975	АТСС
0,98	0,76	Нв746Т	АТСС
0,98	0,5	НТ-1080	АТСС
0,98	1,87	МУ-4-11	АТСС
1,09	0,56	С8166	Зфта-АкЫсН
1,09	0,31	М1А-РаСа-2	АТСС
1,1		и-266	АТСС
1Д4	0,34	АО5	АТСС
1,22	0,38	АвРС-1	АТСС
1,22	1,08	□Μ 229	АТСС
1,27	0,33	ΝΟΙ-Η2052	АТСС
1,43		РЗО-ОНК	1СВВ СеНЪапк
1,5		ССВЕ-СЕМ	АТСС
1,87	2,01	5 N11-449	АТСС
1,96	0,19	22В VI	АТСС
1,96	0,31	ЗК-НЕР-1	АТСС
1,99	0,59	ЪиН-1	1СВВ СеНЪапк
2,63		ΝΟΜΟ-1	1СКВ СеНЪапк
2,86	0,46	55У620	АТСС
2,91	2,03	СакМ	АТСС
4,42	2,07	А549	АТСС
4,5	0,22	ΝΟΙ-Η522	АТСС
4,92	0.26	ККО	АТСС
5,18	0,66	ϋυ-145	АТСС
5,21	0,76	υ-118-мо	АТСС
5,72	0,87	ΜΚΝ45	ЮКВ СеНЪапк

- 22 024824

6,27	0.69	ΝΟΙ-Η23	АТСС
6,93		россу	АТСС
8,35	12,74	N€'1-111436	АТСС
9,58	5.32	СаОУ-З	АТСС
11,63	10,89	ВТ-474	АТСС
11,92	1,58	N€1-112009	АТСС
13,37	6,97	ИС1-Н838	АТСС
15,07	16.27	ΝΟΙ-Η1694	АТСС
15,09	1,01	М059К	АТСС
15,13	19,95	ЫС1-Н2170	АТСС
>20	4,58	786-0	АТСС
>20	0,6	СЗА	АТСС
>20	0.5	ЕВ2	АТСС
>20	>20	НСС70	АТСС
>20		НЕЬ	АТСС
>20	0.06	НТ-29	АТСС
>20	>20	ич 18	АТСС
>20	2,74	ЫЧСаР-клон-РСС	АТСС
>20	0,26	ΜϋΑ-ΜΒ-436	АТСС
>20	1,21	МОСТ-4	АТСС
>20	0,47	ΝΟΙ-Η1155	АТСС
>20	0,99	ΝΟΙ-Η1573	АТСС
>20	0,36	ΝΟΙ-Η1793	АТСС
>20	>20	ΝΟΙ-Η2081	АТСС
>20	>20	ΝΟΙ-Η2126	АТСС
>20	1,18	1ЧС1-Н2228	АТСС
>20	12,55	N€1-11661	АТСС
>20	>20	РС-3	АТСС
>20	11,72	РЬС-РКР-5	АТСС
>20	>20	51На	АТСС
>20	10,8	5К-ОУ-3	АТСС
>20	4,34	υ-87-ΜΟ	АТСС

Приведенные выше данные подтверждают, что клетки меланомы А375 чувствительны к соединению согласно примеру 1. В число наиболее чувствительных клеточных линий по результатам данного скрининга входят клетки НерО2 и ТНР-1. НерО2 получали из линии печеночноклеточной карциномы, ТНР-1 является клеточной линией ОМЛ, оба типа клеток содержали активирующие мутации Ν-ΡΛ5 В-КаТ дикого типа. Данные подтверждают универсальную ингибирующую активность в отношении КаТ и нарушение активации предшествующего сигнала при использовании соединения согласно примеру 1 в этом исследовании.

Соединение согласно примеру 1 ингибирует рост клеток НСТ-116 с мутацией К-Каз.

Мутация К-Каз В-КаТ дикого типа является одной из наиболее распространенных и важных мутаций при многих типах раковых заболеваний, включая рак поджелудочной железы, легких и колоректальный рак (Βο3, Саг1сег КезеагсЬ, 1989, 49(17): 4682). Мутация К-Каз приводит к активации каскада Каз/КаТ/МЕК/МАРК, который вносит вклад в трансформацию и злокачественное развитие клеток. Для определения активности соединения согласно примеру 1 в отношении подавления пролиферации клеток с В-КаТ дикого типа с мутацией К-Каз в исследовании пролиферации и жизнеспособности клеток СеПТЬег-ΟΙο использовали клетки НСТ-116 (АТСС), содержащие В-КаТ дикого типа с мутацией К-Каз. Соединение согласно примеру 1 подавляло пролиферацию и жизнеспособность клеток НСТ-116 с В-КаТ дикого типа с мутацией К-Каз зависящим от дозы образом, значение 1С₅₀ составляло 178 нмоль. Зги данные подтверждают, что ингибирующая активность соединения согласно примеру 1 в отношении КаТ препятствует возникновению нарушенного активированного предшествующего сигнала в указанном исследовании.

Соединение согласно примеру 1 подавляет рост опухолевых клеток с мутацией Ν-Каз.

Мутация Ν-Каз часто происходит при меланоме, острой миелоидной лейкемии (ОМЛ) и раке печени (Βοз, С;н1сег КезеагсЬ, 1989, 49(17): 4682). Мутации Ν-Каз в В-КаТ дикого типа приводят к активации МАРК посредством белков КаТ, в частности С-КаТ. Активность соединения согласно примеру 1 в отношении подавления пролиферации опухолевых клеток с В-КаТ дикого типа с мутацией Ν-Каз, клеточной линии меланомы человека 8К-Ме1-2, имеющей мутацию Ν-Каз Ц61К и В-КаТ дикого типа (АТСС), тестировали в исследовании СеПТЬег-ΟΙο для определения подавления пролиферации и жизнеспособности клеток, также проводили вестерн-блот анализ.

- 23 024824

Иммуноблоттинг (вестерн-блот).

Исследование проводили для дозы 0 и 11 доз, полученных путем последовательного разбавления, в диапазоне от 0,17 до 10000 нмоль. Лизаты белков получали путем обработки клеток лизисным буфером К1РА производства МПИроге. Вестерн-блот анализ проводили, по существу, согласно описанию, данному в Уабау е! а1., Мо1еси1аг Сагстодепе^й, 2011, 50: 346-52. Вкратце, проводили ДСН-ПААГ-электрофорез клеточных лизатов с общим содержанием белка 20 мкг с использованием трисглициновых гелей Шуех® (1пу1!годеп) с градиентом 4-20%. Белок переносили на мембраны с 0,45 мкмоль нитроцеллюлозой с использованием трансферного буфера NиРАΟΕ® (1пуПгодеп) и 10% метанола при 100 В, 4°С в течение 1 ч. В целом, использовали первичное антитело в разбавлении 1:1000 и вторичное антитело в разбавлении 1:20000. Белки детектировали с использованием системы визуализации инфракрасного спектра Обу88еу (Ы-СОК Вю8аепсе8). Антитела к ЕКК1/2, фосфо-ЕКК1/2, фосфо-МЕК1/2 и актину получали в Се11 81дпаПпд ТесЬпо1оду.

Соединение согласно примеру 1 ингибировало зависящим от дозы образом фосфо-МЕК и фосфоЕКК в клетках 8К-Ме1-2, имеющих мутацию Ν-Κπδ Ц61К и В-КаГ дикого типа согласно данным вестернблот анализа. Активность фосфо-ЕКК, по существу, пропадала при 370 нмоль дозе.

Соединение согласно примеру 1 подавляло пролиферацию и жизнеспособность клеток 8К-Ме1-2 в исследовании Се11Т1!ег-О1о, значение 1С₅₀ составляло 188 нмоль. Эти данные подтверждают, что соединение согласно примеру 1 подавляло пролиферацию и жизнеспособность клеток 8К-МЕЬ-2, имеющих В-КаГ дикого типа и мутацию Ν-КаБ Ц61К в указанном исследовании.

Активность соединения согласно примеру 1 в отношении подавления клеток меланомы, резистентных к вемурафенибу.

Вемурафениб (РЬХ4032) и РЬХ4720 являются ингибиторами В-КаГ с мутацией У600Е (1оЬапие88еп е! а1., ^Шю, 2010, 468: 968-72; Моп!ади! е! а1., Сапсег Кее. 2008, 68: 4853-61; \Уад1е е! а1., 1оигпа1 оГ СИшса1 Опсо1оду, 2011, 29: 3085-96). У некоторых пациентов, у которых изначально происходил ответ на терапию с использованием вемурафениба, развивалась лекарственная резистентность, и в среднем в течение 7 месяцев они становились нечувствительными к лечению, \У1Ш1акег е! а1., 8с1 Тгаи81 Меб. 2010, 2: 35-41. Клеточную линию с резистентностью к вемурафенибу получали путем долгосрочной обработки клеточной линии меланомы человека А375 (АТСС), имеющей мутацию В-КаГ У600Е, с использованием увеличивающихся концентраций РЬХ4720.

Получение клеточной линии меланомы с В-КАР У600Е, резистентной к ингибированию В-КАР.

Для получения резистентных клеток клетки А375 В-КаГ У600Е (АТСС) выращивали в питательной среде, такой как описано выше для исследования Се11ТПег-О1о, в присутствии N-[3-(5-хлор-1Нпирроло[2,3-Ь]пиридин-3-карбонил)-2,4-дифторфенил]пропан-1-сульфонамида (РЬХ4720; коммерчески доступный селективный ингибитор В-КаГ) в концентрациях, постепенно повышающихся от 0,02 до 2 мкмоль в течение примерно 4 месяцев, с использованием 30 пересевов с получением резистентной клеточной линии, обозначенной как А375ге8. Резистентность А375ге8 к вемурафенибу и РЬХ4720 подтверждали по повторной активации МАРК в вестерн-блот анализе и сдвигу значений 1С₅₀ в отношении пролиферации и жизнеспособности клеток в исследовании Се11ТПег-О1о.

РЬХ4032 значительно теряет активность в отношении указанных клеток А375ге8, происходит ее примерно 30-кратное изменение от 252 нмоль до более чем 7 мкмоль. Активность соединения согласно примеру 1 в отношении указанных резистентных клеток выражается значением 1С₅₀ 3 4 нмоль, что соответствует только 3-кратному изменению по сравнению с 11 нмоль. Эти данные подтверждают, что соединение согласно примеру 1 подавляло пролиферацию и жизнеспособность клеток А375ге8 в указанном исследовании.

Соединение согласно примеру 1 вызывает минимальную активацию парадоксального пути.

В опубликованных недавно исследованиях (см. выше) было выдвинуто предположение, что специфические ингибиторы В-КаГ, такие как вемурафениб (РЬХ-4032), индуцируют активацию парадоксального пути посредством димеризации В-КаГ и других изоформ КаГ в окружении В-КаГ дикого типа. Вемурафениб не одобрен для лечения раковых пациентов с меланомой с генетическим окружением В-КаГ дикого типа. Полагают также, что активация указанного парадоксального пути является причиной побочных эффектов на коже (таких как плоскоклеточная карцинома) у некоторых пациентов с меланомой, которым проводили лечение с использованием вемурафениба.

Соединение согласно примеру 1 тестировали в отношении клеток НСТ-116 (АТСС), имеющих В-КаГ дикого типа и мутацию К-Ка8, в исследовании жизнеспособности Се11ТПег-О1о. Исследование проводили для дозы 0 и 11 доз, полученных путем последовательного разбавления, от 0,17 до 10000 нмоль. Проводили оценку активности фосфо-МЕК и фосфо-ЕКК при помощи иммуноблоттинга (вестерн-блот анализа).

Соединение согласно примеру 1 вызывало минимальную активацию парадоксального пути и сохраняло ингибирующую активность в отношении фосфо-МЕК и фосфо-ЕКК для клеток НСТ-116, имеющих генетическое окружение В-КаГ дикого типа и К-Ка8. Соединение согласно примеру 1, по существу, устраняло сигнал фосфо-ЕКК в дозах более 41 нмоль в указанном исследовании. С учетом того, что соеди- 24 024824 нение согласно примеру 1 также ингибирует С-ВаГ (предыдущие исследования, см. выше), полагают, что активация парадоксального пути не происходит.

Соединение согласно примеру 1 подавляет рост опухолевых клеток с мутацией В-ВаГ V600Е. Мутации В-ВаГ, в частности В-ВаГ V600Е, при раковых заболеваниях человека часто наблюдают при злокачественных образованиях у человека, включая меланому, колоректальный рак, рак легких и яичников. Эта мутация В-ВаГ может вызывать конститутивную активность киназы и злокачественную трансформацию. Соединение согласно примеру 1 тестировали в исследовании С’е11ТПег-С1о с использованием трех клеточных линий меланомы А375 (АТСС), ХУМ-266-4 (АТСС) и §К-Ме1-28 (АТСС) и двух клеточных линий опухоли толстой кишки НТ-29 (АТСС) и Со1о-205 (АТСС); все пять клеточных линий имели мутацию В-ВаГ V600Е.

Таблица 6

Активность соединения согласно примеру 1 в отношении опухолевых клеток, имеющих мутацию В-ВаГ V600Е

Клеточная линия	Мутация	Тип опухоли	1С.Ч1 (нмоль)
А375	В-ВаГ У600Е	меланома	9,2
5ΥΜ-266-4	В-ВаГ УбООЕ	меланома	52,9
5К-Ме1-28	В-ВаГ У600Е	меланома	29
НТ-29	В-ВаГ У600Е	опухоль толстой кишки	7,3
Со1о-205	В-ВаГ У600Е	опухоль толстой кишки	27

Соединение согласно примеру 1 подавляло жизнеспособность трех клеточных линий меланомы, А375, νΜ-266-4 и §К-Ме1-28, со значениями 1С₅₀, составляющими 9,2, 52,9 и 29 нмоль, соответственно. Аналогично, соединение согласно примеру 1 подавляло жизнеспособность двух клеточных линий опухоли толстой кишки, НТ-29 и Со1о-205, со значениями 1С₅₀, составляющими 7,3 и 27 нмоль. Данные подтверждают, что соединение согласно примеру 1 обладает активностью в отношении подавления жизнеспособности и роста опухолевых клеток с мутацией В-ВаГ V600Е в указанном исследовании.

Соединение согласно примеру 1 также ингибировало активность фосфо-МЕК и фосфо-ЕВК в клетках А375, которые исследовали выше, проводили дополнительную оценку при помощи вестерн-блот анализа, который подтвердил ингибирование нисходящего сигнала зависящим от дозы образом. Активность фосфо-ЕВК, по существу, пропадала при 41 нмоль.

Активность ίη νίνο.

Для оценки активности соединения согласно примеру 1 ίη νίνο использовали модели ксенотрансплантатов опухолей А375 V600Е (АТСС) и НСТ-116 с В-ВаГ дикого типа с мутацией К-Ва5 (АТСС). Вкратце, 10х10⁶ клеток (А375) или 5х10⁶ клеток (НСТ-116) в смеси 1:1 среды и матригеля (общий объем 0,2 мл) имплантировали путем подкожной инъекции в заднюю лапу самок бестимусных крыс (Модель №Н № МНВХЕ-М от Тасотс). Для исследования эффективности использовали всего 8 крыс в каждой группе, а для исследования фармакодинамики использовали всего 3-4 крыс в каждой группе. Комитет по содержанию и использованию животных компании ЕН ЬШу апб Сотрапу одобрил все протоколы экспериментов. Лечение начинали с перорального введения (принудительного) соединения согласно примеру 1 или носителя (20% Сарб5о1®, 25 ммоль фосфат, рН 2,0) в объеме 0,6 мл, когда размер опухоли достигал примерно 500 мг. Соединение согласно примеру 1 вводили перорально два раза в сутки в дозировках 5, 10, 15 и 20 мг/кг в течение 21 дня в модели ксенотрансплантата А375 или 15 и 30 мг/кг в течение 21 дня в модели ксенотрансплантата НСТ-116. Рост опухоли и массу тела отслеживали со временем для оценки активности и признаков токсичности. Измерения размеров опухоли в двух измерениях проводили два раза в неделю, объем опухоли рассчитывали на основании значений длины по средней оси и ширины по средней оси. Данные объема опухоли переводили в логарифмическую шкалу для выравнивания дисперсии по времени и группам лечения. Логарифмированные данные значений объема анализировали при помощи двухфакторного дисперсионного анализа повторных измерений, рассматривая время и группу лечения, при помощи инструмента М1ХЕБ® в программном обеспечении §А§® (версия 8.2). Корреляционная модель повторных измерений является пространственной. Группы лечения сравнивали с контрольной группой для каждого момента времени. Инструмент М1ХЕБ® также использовали для каждой группы лечения в отдельности для вычисления скорректированных средних значений и стандартных ошибок для каждого момента времени. В обоих анализах учитывали автокорреляцию для каждого животного и потерю данных, которая происходила в случае, когда животных с крупными опухолями досрочно выводили из исследования. Строили графики зависимостей скорректированных средних значений и стандартных ошибок для каждой группы лечения от времени.

В моделях ксенотрансплантатов А375 во всех группах, которым вводили дозы соединения, происходило подавление роста опухоли и обращение вспять роста опухоли, ни в одной из этих групп снижения массы тела животных не наблюдали. В модели ксенотрансплантатов НСТ-116 в группе, которой вводили 30 мг/кг соединения, наблюдали статистически значимое подавление роста опухоли. Эти данные свидетельствуют об активности соединения согласно примеру 1 ίη νί\Ό и подтверждают корреляцию

- 25 024824 данных, полученных в ферментных исследованиях, исследованиях клеточных лизатов и пролиферации клеток, с активностью ίη νίνο.

В отдельном исследовании, которое проводили для оценки фармакодинамического (ФД) действия соединения согласно примеру 1 в модели ксенотрансплантата А375, проводили испытание единственной дозы в диапазоне от 3,125 до 50 мг/кг.

Через 2 ч после введения единственной дозы наблюдали зависящее от дозы ФД действие, которое подтверждали путем вестерн-блот анализа. Во всех группах, которым вводили дозу, наблюдали ингибирование фосфо-МЕК и фосфо-ЕКК, а доза 25 мг/кг практически полностью подавляла активность фосфоМЕК и фосфо-ЕКК в этой модели.

Claims (12)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение, представляющее собой 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-4]пиримидин-6-ил)фенил)мочевину, или его фармацевтически приемлемая соль.
2. 2. Соединение по п.1, представляющее собой 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-4]пиримидин-6-ил)фенил)мочевину.
3. 3. Соединение по п.2, представляющее собой 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-4]пиримидин-6-ил)фенил)мочевину в кристаллической форме, характеризующейся рентгеновской порошковой дифрактограммой, имеющей характеристические пики, в 2θ±0,2, при 16,0 и при одном или более из 6,9, 7,0, 18,2 и 23,2.
4. 4. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая соединение по п.1 или его фармацевтически приемлемую соль совместно с фармацевтически приемлемым носителем.
5. 5. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая соединение или его фармацевтически приемлемую соль по любому из пп.1-3 и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.
6. 6. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая соединение или его фармацевтически приемлемую соль по любому из пп.1-3 и поливинилпирролидонвинилацетат (ПВП-ВА).
7. 7. Фармацевтическая композиция по п.6, отличающаяся тем, что ПВП-ВА представляет собой Ко1Ιίάοη® УА 64.
8. 8. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1-3 в терапии рака.
9. 9. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1-3 для лечения рака.
10. 10. Применение по п.9, отличающееся тем, что раковое заболевание выбрано из группы, состоящей из рака щитовидной железы, рака яичников, меланомы, острой миелоидной лейкемии (ОМЛ) и колоректального рака.
11. 11. Применение по п.10, отличающееся тем, что раковое заболевание представляет собой меланому.
12. 12. Применение по п.10, отличающееся тем, что раковое заболевание представляет собой колоректальный рак.