[go: up one dir, main page]

EA021644B1 - Человеческое моноклональное антитело против cd20 и его применение - Google Patents

Человеческое моноклональное антитело против cd20 и его применение Download PDF

Info

Publication number
EA021644B1
EA021644B1 EA200500679A EA200500679A EA021644B1 EA 021644 B1 EA021644 B1 EA 021644B1 EA 200500679 A EA200500679 A EA 200500679A EA 200500679 A EA200500679 A EA 200500679A EA 021644 B1 EA021644 B1 EA 021644B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
cells
human
cell
antibodies
Prior art date
Application number
EA200500679A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200500679A1 (ru
Inventor
Джесика Телинг
Зигрид Руулс
Мартин Гленни
Ян Г.Й. Ван Де Винкель
Пауль Паррен
Йорген Петерсен
Оле Д.М.Ск. Бодсгорд
Хайчан Хуанг
Original Assignee
Генмаб А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=32110219&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA021644(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Генмаб А/С filed Critical Генмаб А/С
Publication of EA200500679A1 publication Critical patent/EA200500679A1/ru
Publication of EA021644B1 publication Critical patent/EA021644B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/08—Antiseborrheics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • C07K16/4258—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/686—Anti-idiotype
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)

Abstract

В изобретении охватываются человеческие моноклональные антитела, которые связываются с человеческим CD20 и ингибируют его, родственные композиции и молекулы на основе антител. Человеческие антитела можно продуцировать при использовании трансфектомы или в организме отличного от человека трансгенного животного, например в трансгенной мыши, способной продуцировать многие изотипы человеческих моноклональных антител при использовании V-D-J рекомбинации и переключения изотипа. Также охватываются фармацевтические композиции, содержащие человеческие антитела, отличные от человека трансгенные животные и гибридомы, которые продуцируют человеческие антитела и диагностические методы для применения человеческих антител.

Description

Молекула СИ20 (также называемая антигеном ограниченной дифференцировки человеческих Влимфоцитов, или Вр35) является гидрофобным трансмембранным белком с молекулярным весом около 35 кДа, расположенным на пре-В и зрелых В-лимфоцитах (Уа1еп!ше с! а1. (1989) 1. ΒίοΙ. СЬет. 264(19): 11282-11287 и Ешйе1й е! а1 (1988) ΕΜΒΟ I. 7(3):711-717). (Белок) СИ20 обнаружен на поверхности более чем 90% В-клеток периферической крови или лимфоидных органов, экспрессируется в процессе раннего развития пре-В-клеток и остается до дифференцировки плазматических клеток. СИ20 присутствует как в нормальных В-клетках, так и в злокачественных В-клетках. В частности, СИ20 экспрессируется более чем в 90% В-клеток неходжкинской лимфомы (ΝΗΕ) (Апйегкоп е! а1. (1984) В1оой 63(6): 1424-1433), но не обнаруживается в гемопоэтических стволовых клетках, про-В-клетках, нормальных плазматических клетках или других нормальных тканях (Теййег е! а1. (1985) 1. 1ттипо1. 135(2)973-979).
Карбоксиконцевая область белка СИ20 из 85 аминокислот расположена в цитоплазме. Протяженность этого участка находится в противоречии с протяженностью этих участков других специфических в отношении В-клетки поверхностных структур, таких как тяжелые цепи 1дМ, 1§И и 1дС или α- или β-цепи антигенов гистосовместимости антигенов класса II, которые имеют сравнительно короткие внутрицитоплазматические участки из 3, 3, 28, 15 16 аминокислот соответственно (Котаготу е! а1. (1983) ΝΑΚ 11:6775-6785). Из последних 61 концевых аминокислот 21 являются кислотными остатками и только 2 основными, это указывает на то, что эта область имеет сильный отрицательный заряд (№ в СепВаик ΝΡ 690605).
Полагают, что СИ20 может быть вовлечен в регуляцию ранней стадии(й) в процессах активации и дифференцировки В-клеток (Теййег е! а1. (1986) Еиг. 1. 1ттипо1. 16:881-887) и может функционировать как кальциевый канал (Теййег е! а1. (1990) 1. Се11. ВюсЬет. 140:195).
Несмотря на неопределенность относительно действительной функции СИ20 в стимулировании пролиферации и/или дифференцировки В-клеток, он представляет важную мишень для антителоопосредованной терапии и для киллинга В-клеток, участвующих в раковых заболеваниях и аутоиммунных нарушениях. В частности, экспрессия СИ20 на опухолевых клетках, например ΝΗΕ, делает его важной мишенью антитело-опосредованной терапии для специфически нацеленных терапевтических агентов против СИ20-позитивных неопластических клеток. Однако, хотя полученные до настоящего времени результаты четко характеризуют СИ20 как мишень для иммунотерапии, они также показывают, что доступные в настоящее время мышиные и химерные антитела не являются идеальными химическими агентами.
Следовательно, существует необходимость в усовершенствованных терапевтических антителах против СИ20, эффективных для предупреждения и/или лечения ряда заболеваний, включающих клетки, экспрессирующие СИ20.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение включает усовершенствованные антитела-лекарственные вещества для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с клетками, экспрессирующими СИ20, включая заболевания, связанные с опухолями, и иммунные заболевания, в том числе и аутоиммунные заболевания. Антитела, охватываемые изобретением, усовершенствованы (улучшены) в том смысле, что они являются полностью человеческими и, таким образом, являются менее иммуногенными в организме пациентов.
Как показано на примерах в данном описании, человеческие антитела по изобретению опосредуют киллинг В-клеток, экспрессирующих СИ20, с помощью различных механизмов. В одном варианте изобретения человеческие антитела по изобретению индуцируют комплемент-зависимую цитотоксичность (СИС), например, по меньшей мере примерно в 20% случаев СИС-опосредованного лизиса, предпочтительно примерно в 30% случаев СИС-опосредованного лизиса и более предпочтительно примерно в 4050% случаев СИС-опосредованного лизиса, в клетках, таких как клетки хронического В-лимфоцитарного лейкоза (В-СЬЬ, В-ХЛЛ). В другом варианте человеческие антитела по изобретению индуцируют апоптоз клеток, экспрессирующих СИ20. В другом варианте человеческие антитела по изобретению индуцируют гомотопическую адгезию клеток, экспрессирующих СИ20. Кроме того, человеческие антитела по изобретению могут индуцировать антителозависимую клеточную цитотоксичность (АИСС) клеток, экспрессирующих СИ20 в присутствии человеческих эффекторных клеток (например, моноцитов, мононуклеаров, ΝΚ клеток и ΡΜΝ). Кроме того, человеческие антитела по изобретению могут индуцировать фагоцитоз клеток, экспрессирующих СИ20 в присутствии макрофагов. Человеческие моноклональные антитела по изобретению могут работать по одному или более этих механизмов. Примеры клеток, которые могут лизироваться антителами по данному изобретению, включают, но без ограничения, В-клетки, экспрессирующие СИ20, такие как опухолегенные В-клетки и В-клетки, участвующие в иммунных заболеваниях. В конкретном варианте по изобретению человеческие антитела применяются для опосредования киллинга В-лимфоцитов при лечении лимфомы, В-клеточной неходжкинской лимфомы.
Человеческие антитела по изобретению включают 1§О1 (например, 1дС.к). 1дС3 (например, 1дО3,к) и 1§О4 (например, Ι§Ο,κ) антитела. Однако другие изотипы антител также охватываются изобретением,
- 1 021644 включая 1дО2, 1дМ, 1дА1, 1дА2, секреторный 1дА, 1дО и 1дЕ. Антитела могут являться целыми антителами или их антигенсвязывающими фрагментами, включая, например, РаЬ, Р(аЬ')2, Ρν, одноцепочечные Ρν фрагменты или биспецифические антитела. Кроме того, антигенсвязывающие фрагменты включают химерные (слитые) белки связывающего домена иммуноглобулинов, содержащие (ί) полипептид связывающего домена (такой как вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область легкой цепи), (ίί) СН2 константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, слитую с полипептидом шарнирной области, и (ίίί) СН3 константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, слитую с СН2 константной областью. Такие химерные белки связывающего домена иммуноглобулина дополнительно описаны в патентных заявках США 2003/0118592 и 2003/0133939.
Конкретные человеческие антитела по настоящему изобретению включают антитела, названные 11В8, 2Р2 и 7Ό8, кодируемые нуклеиновыми кислотами тяжелой цепи человеческого происхождения и легкой цепи к человеческого происхождения, содержащими нуклеотидные последовательности в их вариабельных областях, представленных в 8ЕЦ ГО N0: 1, 5 или 9 и 8ЕЦ ГО N0: 3, 7 или 11 соответственно, и их модификации консервативной последовательности. В другом варианте изобретения человеческие антитела характеризуются тем, что они включают вариабельные области тяжелой цепи человеческого происхождения и легкой цепи к человеческого происхождения, содержащие аминокислотные последовательности, представленные 8ЕЦ ГО N0: 2, 6 или 10 и 8ЕЦ ГО N0: 4, 8 или 12 соответственно, и модификации их консервативных последовательностей.
Еще в одном варианте изобретения человеческие антитела характеризуются тем, что они содержат вариабельные области тяжелой цепи человеческого происхождения и легкой цепи к человеческого происхождения, которые по меньшей мере на 90% гомологичны, предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологичны и более предпочтительно по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологичны аминокислотным последовательностям, представленным 8ЕЦ ГО N0: 2 и 8ЕЦ ГО N0: 4 соответственно; 8Е0 ГО N0: 6 и 8ЕЦ ГО N0: 8 соответственно или 8ЕЦ ГО N0: 10 и 8ЕЦ ГО N0: 12 соответственно.
Другие конкретные человеческие антитела по изобретению включают антитела, которые содержат СОК домен, имеющий СОК1 область тяжелой и легкой цепей человеческого происхождения, СОК2 область тяжелой и легкой цепей человеческого происхождения и СОК3 область тяжелой и легкой цепей человеческого происхождения, где:
(a) СОК1, СОК2 и СОК3 области тяжелой цепи человеческого происхождения содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей СОК1, СОК2 и СОК3, показанных на фиг. 53, 55 или 57 (8ЕЦ ГО N0: 13-15, 19-21 и 25-27), и модификаций их консервативных последовательностей, и (b) СОК1, СОК2 и СОК3 области легкой цепи человеческого происхождения содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей СОК1, СОК2 и СОК3, показанных на фиг. 53, 55 или 57 (8ЕЦ ГО N0: 16-18, 22-24 и 28-30), и модификаций их консервативных последовательностей.
Также настоящее изобретение включает антитела, которые диссоциируют из СО20 с равновесной константой диссоциации (Кс) около 1-10 нМ или ниже. Такие антитела также включают антитела, которые не реагируют перекрестно с родственными антигенами клеточной поверхности и, таким образом, не ингибируют их функцию.
В другом варианте изобретения человеческие антитела против СО20 по настоящему изобретению можно охарактеризовать одним или более следующих свойств:
a) специфичность в отношении человеческих СО20;
b) аффинность связывания с СО20 (Кс) около 10 нМ или ниже, предпочтительно около 5 нМ или ниже и более предпочтительно около 1-3 нМ или ниже по определению с помощью эксперимента по связыванию, представленному в примере 5 (фиг. 9) по данному описанию;
c) константа скорости диссоциации (кй) их ассоциата с СО20 равна около 10-4 с-1 или менее, предпочтительно около 10-5 с-1 или менее и более предпочтительно около 10-6 с-1 по определению с помощью эксперимента по связыванию, представленному в примере 5 (фиг. 9) по данному описанию;
й) способность опосредовать высокий уровень СОС либо на СО55/59 негативных, либо на СО55/59 позитивных клетках;
е) способность к транслокации в липидные рафты (липидные плоты) при связывании с СО20; ί) способность ингибировать рост клеток, экспрессирующих СО20; д) способность индуцировать апоптоз клеток, экспрессирующих СО20;
Ь) способность индуцировать гомотопическую адгезию клеток, экспрессирующих СО20; ί) способность индуцировать АОСС клеток, экспрессирующих СО20 в присутствии эффекторных клеток;
_)) способность пролонгировать выживание субъекта, имеющего опухолевые клетки, экспрессирующие СО20;
к) способность истощать клетки, экспрессирующие СО20; и/или
- 2 021644
1) способность истощать клетки, экспрессирующие низкие уровни ί'.Ό20 (СЭ2010 клетки).
Человеческие антитела против ί'.Ό20 по настоящему изобретению могут быть дериватизированными, связанными с или коэкспрессирующимися с другими специфичностями связывания. В особом варианте изобретение включает биспецифичную или полиспецифичную молекулу, содержащую по меньшей мере одну первую специфичность связывания ί'.Ό20 (например, человеческое антитело против СЭ20 или его миметик) и вторую специфичность связывания человеческой эффекторной клетки, такую как специфичность связывания Ре-рецептора (например, человеческого Рсу рецептора, такого как РсуК1, или человеческого Рса рецептора) или Т-клеточного рецептора, например СЭ3.
Следовательно, настоящее изобретение включает биспецифические и полиспецифические молекулы, которые связываются как с человеческим СЭ20, так и с Рс-рецептором, например СЭ3. Примерами Рс-рецепторов являются, например, рецептор человеческого 1§С, например Рс-гамма рецептор (РсуК), такой как РсуЫ (СЭ64), РсуКП (СЭ32) и РсуКШ (СЭ16). Также могут быть нацеленными другие Рсрецепторы, такие как рецепторы человеческого 1дА (например, РсаЫ). Рс-рецептор предпочтительно локализован на поверхности эффекторной клетки, например моноцита, макрофага или активированного мононуклеара. В предпочтительном варианте изобретения биспецифичные и моноспецифичные молекулы связываются с Рс-рецептором по сайту, отличному от сайта связывания рецептора Рс иммуноглобулина (например, 1§С или 1дА). Следовательно, связывание биспецифичных и полиспецифичных молекул не блокируется физиологическими уровнями иммуноглобулинов.
Еще в одном аспекте человеческие антитела против СЭ20 по изобретению являются дериватизированными, связанными или коэкспрессирующимися с другой функциональной молекулой, например пептидом или белком (например, РаЪ' фрагментом). Например, антитело по изобретению может быть функционально связано (например, химической связью, генетическим слиянием, нековалентной ассоциацией или другим способом) с одним или более других молекулярных объектов, таких как другое антитело (например, с образованием биспецифичного или полиспецифичного антитела), цитотоксин, клеточный лиганд или антиген (например, с образованием иммуноконъюгата, такого как иммунотоксин). Антитело по данному изобретению может быть связано с другими терапевтическими частицами, например, радиоизотопом, низкомолекулярным (малая молекула) противораковым лекарственным веществом, противовоспалительным агентом или иммуносупрессором. Соответственно настоящее изобретение охватывает большой ряд конъюгатов антитела, биспецифичных или полиспецифичных молекул и химерных (слитых, гибридных) белков, причем все они связываются с клетками, экспрессирующими СЭ20. и всех их можно использовать для нацеливания других молекул на такие клетки.
Еще в одном аспекте изобретение включает композиции, например фармацевтические и диагностические композиции/наборы, содержащие фармацевтически приемлемый носитель, приготовленный с одним человеческим моноклональным антителом или с комбинацией человеческих моноклональных антител. В особом варианте изобретения композиция включает комбинацию антител, которые связываются с различными эпитопами или которые обладают различными функциональными характеристиками, таких как индуцирующие СЭС и индуцирующие апоптоз.
Человеческие антитела, иммуноконъюгаты, биспецифичные и полиспецифичные молекулы и композиции по настоящему изобретению можно использовать в различных методах для ингибирования роста клеток, экспрессирующих СЭ20, и/или киллинга клеток, экспрессирующих СЭ20, путем контактирования клеток с эффективным количеством антитела, иммуноконъюгата, биспецифичной/полиспецифичной молекулы или композиции, так что рост клетки ингибируется и/или клетка гибнет. В одном варианте изобретения способ включает киллинг клетки, экспрессирующей СЭ20, в присутствии эффекторных клеток, например, с помощью СЭС, апоптоза, АЭСС, фагоцитоза или комбинацией двух или более из этих механизмов. Предпочтительно клетки лизируют или ингибируют, не убивая или не ингибируя активность клеток, которые не экспрессируют СЭ20, но которые могут, например, экспрессировать родственный по структуре антиген клеточной поверхности (т.е. без кросс-реактивности с родственными, но функционально отличными антигенами клеточной поверхности). Клетки, экспрессирующие СЭ20, которые можно ингибировать или убить, используя человеческие антитела по изобретению, включают, например, опухолегенные В-клетки.
Следовательно, человеческие антитела по настоящему изобретению можно использовать для лечения и/или предупреждения различных заболеваний, включающих клетки, экспрессирующие СЭ20, путем введения антител пациентам, страдающим такими заболеваниями. Примеры заболеваний, которые можно лечить (например, облегчать) или предупреждать, включают, но без ограничения, опухолегенные заболевания и иммунные заболевания, например аутоиммунные заболевания. Примеры опухолегенных заболеваний, которые можно лечить и/или предупреждать, включают В-клеточную лимфому, например ΝΗΠ в том числе В-лимфобластный лейкоз/лимфому из клеток-предшественников и опухоли из зрелых В-клеток, такие как В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз (СЬЬ)/малая лимфоцитарная лимфома (8ЬЬ), В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, лимфоплазмацитарная лимфома, лимфома из клеток мантийной зоны (МСЬ), фолликулярная лимфома (РЬ), включая РЬ низкой, средней и высокой степени злокачественности, кожная лимфома из клеток фолликулярных центров, В-клеточная лимфома
- 3 021644 из клеток маргинальной зоны (МАРТ тип, узловой тип, селезеночный тип), волосатоклеточный лейкоз, диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома, лимфома Беркита, плазмацитома, миелома из плазматических клеток, посттрансплантационное лимфопролиферативное расстройство, макроглобулинемия Вальденстрема и анапластическая крупноклеточная лимфома (АЬСЬ). Примеры иммунных расстройств, в которых участвуют В-клетки, экспрессирующие СБ20. которые можно лечить и/или предупредить, включают псориаз, псориатический артрит, дерматит, системную склеродерму и склероз, воспалительное заболевание кишечника (ΙΒΌ), болезнь Крона, язвенный колит, респираторный дистресс-синдром, менингит, энцефалит, увеит, гломерулонефрит, экзему, астму, атеросклероз, недостаточность адгезии лейкоцитов, рассеянный склероз, синдром Рейно, синдром Сегрена, ювенильный диабет, болезнь Рейтера, болезнь Бехчета, иммунный комплексный нефрит, 1дА нефропатию, 1дМ полинейропатии, иммунные тромбоцитопении, такие как острая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура и хроническая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, гемолитическую анемию, тяжелую псевдопаралитическую миастению, волчаночный нефрит, системную красную волчанку, ревматоидный артрит (КА), атопический дерматит, пузырчатку, болезнь Грейвза, тиреоидит Хашимото, гранулематоз Вегенера, синдром Оменна, хроническую почечную недостаточность, острый инфекционный мононуклеоз, ВИЧ и заболевания, ассоциированные в вирусом герпеса. Дополнительными примерами являются тяжелый острый респираторный дистресс-синдром и хореоретинит. Другими дополнительными примерами являются заболевания и нарушения, вызванные инфицированием В-клеток вирусом, таким как вирус ЭпштейнБарра (ЕВУ).
В особом варианте изобретения субъекта, которому вводят антитело, дополнительно лечат химиотерапевтическим агентом, облучением или агентом, который модулирует, т.е. повышает или ингибирует, экспрессию или активность Рс-рецептора, Рса рецептора или Рсу рецептора, таким как цитокин. Типичные цитокины для введения в процессе лечения включают гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (О-С8Р), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ОМ-С8Р), интерферон-γ (ΙΡΝ-γ) и фактор некроза опухолевых клеток (ΤΝΡ). Типичные терапевтические агенты включают, среди прочих, противоопухолевые агенты, такие как доксорубицин, цисплатин, блеомицин, кармустин, хлорамбуцил и циклофосфамид.
Еще в одном аспекте настоящее изобретение охватывает способ обнаружения ίη νίίτο или ίη νίνο присутствия в образце или индивидуально СБ20. например, для диагностирования связанных с СБ20 заболеваний предпочтительно на ранней стадии. Это также может быть полезно для мониторинга заболевания и эффекта лечения и для определения и корректировки дозы вводимого антитела. Ιη νίνο метод можно осуществлять, используя методику визуализации, такую как РЕТ (позитронно эмиссионная томография) или БРЕСТ (единичная фотонно-эмиссионная компьютерная томография). В одном варианте изобретения визуализацию осуществляют путем контактирования тестируемого образца, необязательно наряду с контрольным образцом, с человеческим моноклональным антителом по изобретению в условиях, которые делают возможным образование комплекса антитела и СБ20. Затем детектируют образование комплекса (например, с помощью РАО анализа или вестерн-блоттинга). Если наряду с тестируемым образцом используют контрольный образец, комплекс обнаруживают в обоих образцах, и любая статистически значимая разница между образцами в образовании комплексов является показателем присутствия в тестируемом образце СБ20.
Еще в одном аспекте изобретение охватывает трансгенное отличное от человека животное, такое как трансгенная мышь, которое экспрессирует человеческие моноклональные антитела, которые связываются с СБ20. В особом варианте изобретения трансгенное, не являющееся человеком животное представляет собой трансгенную мышь, имеющую геном, содержащий трансген с тяжелой цепью человеческого происхождения и трансген с легкой цепью человеческого происхождения, кодирующие все антитело по изобретению или его фрагмент. Трансгенное отличное от человека животное можно иммунизировать очищенным или обогащенным препаратом СБ20 антигена и/или клеток, экспрессирующих СБ20. Предпочтительно трансгенное отличное от человека животное, например трансгенная мышь, способно продуцировать многие изотипы человеческих моноклональных антител к СБ20 (например, 1§О, 1дА и/или 1дМ) при использовании У-Б-1 рекомбинации и переключении изотипа. Переключение изотипа может осуществляться с помощью классического или неклассического переключения изотипа.
Соответственно еще в одном аспекте изобретение охватывает выделенные В-клетки трансгенного отличного от человека животного, описанного выше, например трансгенной мыши, которая экспрессирует человеческие антитела против СБ20. Выделенные В-клетки могут затем быть иммортализованы путем слияния с иммортализованной клеткой для создания источника (например, гибридомы) человеческих антител против СБ20. Такие гибридомы (т.е. те, которые продуцируют человеческие антитела против СБ20) также входят в объем настоящего изобретения.
Как показано в примерах по данному описанию, человеческие антитела по изобретению можно получать непосредственно при использовании гибридом, которые экспрессируют антитело, или можно клонировать и рекомбинантно экспрессировать в клетке-хозяине (например, в СНО клетке, N8/0 клетке или лимфоците). Другими примерами клеток-хозяев являются микроорганизмы, такие как Е. сой и гри- 4 021644 бы, такие как дрожжи. Или же, их можно получать методами рекомбинантной ДНК в трансгенном отличном от человека животном или растении. Соответственно в другом аспекте настоящее изобретение охватывает методы получения моноклональных антител, которые связываются с человеческим СЭ20. В одном варианте изобретения метод включает иммунизацию трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, описанной ранее (например, имеющей геном, содержащий трансген с тяжелой цепью человеческого происхождения и трансген с легкой цепью человеческого происхождения, кодирующие все антитело против СЭ20 или его фрагмент), очищенным или обогащенным препаратом человеческого СЭ20 антигена и/или клеток, экспрессирующих человеческий СЭ20. Затем получают Вклетки (например, В-клетки селезенки) животного и сливают с клетками миеломы для образования бессмертных гибридомных клеток, которые секретируют человеческие моноклональные антитела против СЭ20.
Еще в одном аспекте изобретение включает нуклеотидные молекулы, кодирующие человеческие антитела против СЭ20 (например, их вариабельные области), а также рекомбинантные векторы экспрессии, которые включают нуклеиновые кислоты по изобретению, и клетки-хозяева, трансфецированные при использовании таких векторов. Методы получения антител с помощью культивирования этих клеток-хозяев также охватываются данным изобретением. Конкретные нуклеиновые кислоты по изобретению содержат нуклеотидные последовательности, показанные 8ЕЦ ГО N0: 1, 5 или 9 и 8Еф ГО N0: 3, 7 или 11, кодирующих тяжелую и легкую цепи соответственно человеческих антител 2Р2, 7Ό8 и 11В8 против СЭ20.
Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеприведенного подробного описания и формулы изобретения.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 показан вектор ρί',ΌΝγ Н/вариабельная (область)-тяжелая (цепь), используемый для рекомбинантного продуцирования человеческих моноклональных антител 2Р2 и 11В8.
На фиг. 2 показан вектор ρί',ΌΝγ Н/вариабельная (область)-тяжелая (цепь), используемый для рекомбинантного продуцирования 2Р2 и 11В8.
На фиг. 3 показан двугенный вектор клонирования (ρΕΌΝγ Н/к2А2), используемый для рекомбинантного продуцирования 2Р2 и 11В8.
На фиг. 4 изображен график сравнения определенного методом проточной цитометрии связывания человеческих антител 2Р2, 7Ό8 и 11В8 с клетками N8/0, трансфецированными при использовании КаД, Όαιιύί и СГО20, и родительскими N8/0 клетками.
На фиг. 5А и 5В показано определенное методом проточной цитометрии связывание 2Р2 с РВМС у трех доноров-людей.
На фиг. 6 изображен график, на котором сравниваются аффинности связывания меченного 125Ι 2Р2 и меченного 125Ι 11В8 с клетками Каток-ЕНКВ.
На фиг. 7А и 7В показано связывание меченного 125Ι 2Р2 и меченного 125Ι 11В8 по сравнению с меченным 125Ι ритуксимабом (химерное антитело против СГО20, ГОЕС) и меченным 125Ι В1 (термин В1 соответствует немеченой форме Веххат™, которое представляет собой меченное 131Ι мышиное антитело против человеческого СЭ20, СоиЙет) с клетками Каток-ЕНКВ (А) и клетками Όαιιύί (В).
На фиг. 8 показан график сравнения скорости диссоциации меченного 125Ι 11В8Т, меченного 125Ι 2Р2, меченного 125Ι ритуксимаба (ΒΙΤ) и меченного 125Ι В1.
На фиг. 9 показаны скорости диссоциации Р(аЬ’)2 фрагментов 2Р2, 11В8Т и ритуксимаба в клетках Каток-ЕНКВ.
На фиг. 10А и 10В показана СЭС (комплементзависимая цитотоксичность), индуцированная 2Р2, 11В8Т, ритуксимабом и изотипом контрольного антитела (НиМай-КЬН), клеток Όπυάι (А) и клеток 8ИΌΗΕ-4 (В) в различных временных точках (функциональная оГГ-га1е). определяемая методом проточной цитометрии.
На фиг. 11А-Е показана кинетика СЭС, индуцированной 2Р2 и ритуксимабом в различных клеточных линиях, определяемая с применением проточной цитометрии.
На фиг. 12АГО показана кинетика СЭС, индуцированной 2Р2 и ритуксимабом в различных клеточных линиях, как функция концентрации комплемента (нормальной человеческой сыворотки (ИН8)) при двух различных концентрациях антитела, определяемая с применением проточной цитометрии.
На фиг. 13АГО показана зависимая от концентрации индукция СЭС, индуцированной 2Р2 и ритуксимабом в различных клеточных линиях, определяемая с применением проточной цитометрии.
На фиг. 14А и 14В показана зависимая от концентрации индукция СЭС, вызываемая 2Р2, 2Ρ2Τ, 11В8Т, В1 и ритуксимабом в клетках Ό;ηιύί (А) и КаД (В), определяемая с применением проточной цитометрии.
На фиг. 15А и 15В показаны графики сравнения СЭС (клеточной цитотоксичности) клеток Ό;ηιύί (клеток, экспрессирующих низкие уровни СГО55/59), вызываемой человеческими моноклональными антителами 2Р2, 7Ό8 и 11В8Т и ритуксимабом; график (А) показывает лизис неотмытых клеток в процентах, а график (В) показывает лизис клеток, отмытых перед прибавлением сыворотки, в процентах.
- 5 021644
На фиг. 16А и 16В показаны графики сравнения СЭС клеток Кац (клеток, экспрессирующих высокие уровни СО55/59), вызываемой человеческими моноклональными антителами 2Р2, 7Ό8, 11В8Т, В1 и ритуксимабом; график (А) показывает лизис (в процентах) клеток, не блокированных антителами против СЭ55 и против СЭ59. а график (В) показывает лизис клеток, блокированных антителами против СЭ55 и против СЭ59, в процентах.
На фиг. 17А-С показана роль ί'.Ό55 и СЭ59 в СЭС, индуцированной 2Р2 и ритуксимабом в клетках Кац. На фиг. (А) показан процент клеток, лизированных при добавлении антитела против СЭ55; на фиг. (В) показан процент клеток, лизированных при добавлении антитела против СЭ59, а график (С) показывает процент клеток, лизированных при добавлении как антитела против СЭ55, так и антитела против СО59.
На фиг. 18Α-Ό показано связывание фактора комплемента С1с| при использовании 2Р2 и ритуксимаба в различных клеточных линиях, определяемая проточной цитометрией.
На фиг. 19Α-Ό показано отложение фрагмента фактора комплемента С4с с помощью 2Р2 и ритуксимаба в различных клеточных линиях, определяемая проточной цитометрией.
На фиг. 20 показан лизис клеток АКН-77 с помощью 2Р2, ритуксимаба и 11В8Т в присутствии ΡΜΝ, МЫС, плазмы или цельной крови.
На фиг. 21 показан лизис клеток В-СЬЬ с помощью 2Р2, ритуксимаба и 11В8Т в присутствии ΡΜΝ, МЫС, плазмы или цельной крови.
На фиг. 22 показан лизис клеток НСЬ (волосатоклеточной лейкемии) с помощью 2Р2, ритуксимаба и 11В8Т в присутствии ΡΜΝ, МЫС, плазмы или цельной крови.
На фиг. 23 показан лизис клеток В-АЬЬ с помощью 2Р2, ритуксимаба и 11В8Т в присутствии ΡΜΝ, МЫС, плазмы или цельной крови.
На фиг. 24 показан лизис клеток фолликулярной лимфомы с помощью 2Р2, ритуксимаба и 11В8Т в присутствии ΡΜΝ, ΜΝ0, плазмы или цельной крови.
На фиг. 25 показан лизис клеток лимфомы из клеток мантийной зоны с помощью 2Р2, ритуксимаба и 11В8Т в присутствии ΡΜΝ, ΜΝ0, плазмы или цельной крови.
На фиг. 26 показан зависимый от концентрации лизис клеток АКН-77 с помощью 2Р2 и ритуксимаба в присутствии цельной крови.
На фиг. 27 показан опосредованный ΜNС лизис клеток АКН-77 с помощью 2Р2, 11В8Т и ритуксимаба.
На фиг. 28 показан опосредованный ΜNС лизис Кац клеток с помощью 2Р2, 11В8Т и ритуксимаба.
На фиг. 29А-С даны графики, показывающие образование кластеров ί'.Ό20 в липидных рафтах (липидных плотах) при инкубации с 2Р2, 7Ό8 или 11В8Т, построенные с помощью РКЕТ анализа и анализа нерастворимости с Тритоном-Х.
На фиг. 30 показано образование кластеров ί'.Ό20 в липидных рафтах (липидных плотах) при инкубации с 2Р2, ритуксимабом или 11В8Т, построенные с помощью РКЕТ анализа.
На фиг. 31 показано соотношение СЭ20, остающегося в нерастворимой фракции рафта (плота) после обработки Тритоном-Х-100 (ТХ) и инкубации с 2Р2, ритуксимабом и 11В8Т.
На фиг. 32 показано распределение ί'.Ό20 между рафтовой и нерафтовой мембранными фракциями при стимулировании клеток Паи® 2Р2, ритуксимабом и 11В8Т.
На фиг. 33А-О показан апоптоз клеток Паи® с помощью 2Р2, 7Ό8 и 11В8Т, определяемый проточной цитометрией.
На фиг. 34 показана индукция апоптоза клеток Кац с помощью 2Р2, 11В8Т, ритуксимаба или В1, определяемая проточной цитометрией.
На фиг. 35А показана индукция апоптоза клеток Όηπάί с помощью 2Р2, 11В8Т, ритуксимаба или В1, определяемая проточной цитометрией.
На фиг. 35В показан апоптоз клеток Паи® на ранней и поздней стадии с помощью 2Р2, 11В8Т, ритуксимаба или В1, определяемый проточной цитометрией.
На фиг. 36А-Е показана гомотипическая адгезия клеток Кашо8-ЕНКВ при использовании 2Р2, 7Ό8 и 11В8Т, определяемая с помощью оптической спектроскопии.
На фиг. 37 показана гомотипическая адгезия клеток Паи® при использовании 2Р2, ритуксимаба и В1, определяемая с помощью оптической спектроскопии.
На фиг. 38 дан график, показывающий процент выживания мышей §СГО, которым инъецированы клетки Όππάί и которые обработаны 2Р2 или 7Ό8.
На фиг. 39 дан график, показывающий процент выживания мышей §СГО, которым инъецированы клетки Тапоие и которые обработаны 2Р2, ритуксимабом или В1.
На фиг. 40 показан процент выживания мышей §СГО, которым инъецированы клетки Паи® и которые обработаны различными концентрациями 2Р2 или ритуксимаба.
На фиг. 41 показан процент выживания мышей §СГО, которым инъецированы клетки Паи® и которые обработаны 11В8Т или В1.
На фиг. 42 дана биолюминесцентная визуализация опухолевых клеток у мышей §СГО в день 39 (день 31 после введения 10 мкг В1, ритуксимаба, 11В8Т. 2Р2Т или 1ш1дС). Биолюминесценция представ- 6 021644 лена красным цветом (темные участки на изображении мышей) (интенсивность света > 50 фотонов за 5 мин) как перекрывание черного и белого на изображении мышей.
На фиг. 43 показана массы опухоли у каждой мыши, количественно определяемая интегрированием световых сигналов от поверхности тела в день 25, 32, 39 и 46 после введения, в день 8, 10 мкг В1, ритуксимаба, 11В8Т. 2Р2Т или Ьи1дС.
На фиг. 44А-С показан проточно-цитометрический анализ клеток СИ20 в периферической крови обезьян Суиото1ди8 после внутривенного введения различных доз - 4x1.25 мг/кг (А), 4x6.25 мг/кг (В) или 4х 12.50 мг/кг (С) - 2Р2 или ритуксимаба.
На фиг. 45А-С показан проточно-цитометрический анализ клеток СИ21+ в периферической крови обезьян Суиото1ди8 после внутривенного введения различных доз - 4x1.25 мг/кг (А), 4x6.25 мг/кг (В) или 4х 12.50 мг/кг (С) - 2Р2 или ритуксимаба.
На фиг. 46А-С показан проточно-цитометрический анализ клеток СИ20+ в лимфатических узлах обезьян Суиото1ди8 после внутривенного введения различных доз - 4x1.25 мг/кг (А), 4x6.25 мг/кг (В) или 4x 12.50 мг/кг (С) - 2Р2 или ритуксимаба.
На фиг. 47А-С показан проточно-цитометрический анализ С0201о^С023'СВ40Н|дН экспрессирующих клеток в периферической крови обезьян Суиото1ди8 после внутривенного введения различных доз 4x1.25 мг/кг (А), 4x6.25 мг/кг (В) или 4x12.50 мг/кг (С) - 2Р2 или ритуксимаба.
На фиг. 48А-Е показано связывание ритуксимаба (А), 2Р2 (В), 11В8Т (С), В1 (Ό) или изотипа контрольного антитела (Е) с клетками СНО, экспрессирующими дикого типа (νΤ) С.Н20. мутантный С.Н20 (АхР) или как \УТ СЭ20, так и мутантный С.Н20 (АхР), определяемое проточной цитометрией.
На фиг. 49А-Р показан процент связывания 2Р2, 11В8Т, В1 или ритуксимаба с мутантным Р1728 νδ \УТ С.Н20 (А), процент связывания 2Р2, 11В8Т, В1, САТ (САТ 12.6Е12, мышиное моноклональное 1дО2А антитело против СЭ20, Н1а1ее.Сот.), изотипа контрольного антитела (КЕН) или ритуксимаба с мутантным С.Н20 (АхР) νδ \УТ С.Н20 (В), процент связывания 2Р2, 11В8Т, В1 или ритуксимаба с мутантным Ν166Ό νδ \УТ СЭ20 (С), процент связывания 2Р2Т, САТ или ритуксимаба с мутантным Ν166Ό νδ \УТ СГО20 (Ό), процент связывания 2Р2Т, 2Р2, 11В8Т, В1 или ритуксимаба с мутантным Ν1663Ό νδ \УТ СЭ20 (Е) и процент связывания 2Р2Т, САТ или ритуксимаба с мутантным Ν163Ό νδ \УТ СГО20(Е).
На фиг. 50 показано связывание 2Р2Т, 7Ό8 и изотипа контрольного антитела по определению методом ЕЬ18А с тремя антиидиотипическими антителами, анти-2Р2 δαό 1.1, анти-2Р2 δαό 1.2 и анти-2Р2 δαό 1.3, специфичными к 2Р2.
На фиг. 51 показано связывание 11В8Т по определению методом ЕЬ18А с тремя антиидиотипическими антителами, анти-11В8Т δαό 2.2, анти-11В8Т δαό 2.3, анти-11В8Т δαό 2.4, анти-11В8Т δαό 2.5, анти11В8Т δαό 2.6,специфичное к 11В8Т, но не связывание с антиидиотипическими антителами против 2Р2.
На фиг. 52А-С показано зависящее от дозы связывание 2Р2Т по определению методом ЕЬ18А с тремя антиидиотипическими антителами, анти-2Р2 δαό 1.1 (А), анти-2Р2 δαό 1.2(В) и анти-2Р2 δαό 1.3 (С), специфичными к 2Р2.
На фиг. 53 показаны аминокислотная последовательность (8ЕЦ ГО ΝΟ: 2) V области тяжелой цепи и аминокислотная последовательность (8ЕЦ ГО ΝΟ: 4) V области легкой (к) цепи человеческого моноклонального антитела 2Р2 с обозначенными СОК областями.
На фиг. 54 показаны нуклеотидная последовательность (8ЕЦ ГО ΝΟ: 1) V области тяжелой цепи и нуклеотидная последовательность (8ЕЦ ГО ΝΟ: 3) V области легкой (к) цепи человеческого моноклонального антитела 2Р2.
На фиг. 55 показаны аминокислотная последовательность (8ЕЦ ГО ΝΟ: 6) V области тяжелой цепи и аминокислотная последовательность (8ЕЦ ГО ΝΟ:8) V области легкой (к) цепи человеческого моноклонального антитела 7Ό8 с обозначенными СОК областями.
На фиг. 56 показаны нуклеотидная последовательность (8ЕЦ ГО ΝΟ:5) V области тяжелой цепи и нуклеотидная последовательность (8ЕЦ ГО ΝΟ:7) V области легкой (к) цепи человеческого моноклонального антитела 7Ό8.
На фиг. 57 показаны аминокислотная последовательность (8ЕЦ ГО ΝΟ: 10) V области тяжелой цепи и аминокислотная последовательность (8ЕЦ ГО ΝΟ: 12) V области легкой (к) цепи человеческого моноклонального антитела 11В8 с обозначенными СОК областями.
На фиг. 58 показаны нуклеотидная последовательность (8ЕЦ ГО ΝΟ:9) V области тяжелой цепи и нуклеотидная последовательность (8ЕЦ ГО ΝΟ: 11) V области легкой (к) цепи человеческого моноклонального антитела 11В8.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение охватывает усовершенствованную антительную терапию для лечения и диагностирования нарушений, включающих клетки, экспрессирующие СГО20. Терапия по изобретению применяет выделенные человеческие моноклональные антитела, которые специфически связываются с эпитопом в СГО20. Выделенные человеческие моноклональные антитела, охватываемые настоящим изобретением, включают антитела 1дА, Ι§Ο4, 1дЕ, 1дМ и Ι§Ό.
В одном варианте изобретения антитело является 1§О1 антителом, более конкретно, 1дО1,к или
- 7 021644
ΙβΟΙ.λ изотипа. В другом варианте изобретения антитело является 1§С3 антителом, более конкретно, 1дС3,к или Ι§Ο3,λ изотипа. Еще в одном варианте изобретения антитело является 1§С4 антителом, более конкретно, 1дС4,к или Ι§Ο4,λ изотипа. Еще в одном варианте изобретения антитело является 1дА1 или 1дА2 антителом.
Еще в одном варианте изобретения антитело является 1дМ антителом.
В одном варианте изобретения человеческие антитела продуцируются в отличном от человека трансгенном животном, например в трансгенной мыши, способном продуцировать множество изотипов человеческих моноклональных антител к ί'.Ό20 при использовании У-И-1 рекомбинации или переключения изотипа. Соответственно аспекты по изобретению включают не только антитела, фрагменты антител и их фармацевтические композиции, но также отличных от человека трансгенных животных, В-клетки, трансфектомы клеток-хозяев и гибридомы, которые продуцируют моноклональные антитела. Такое трансгенное животное может также быть трансгенным кроликом для продуцирования поликлональных антител, таких как поликлональные антитела, описанные в патентной заявке США 2003/0017534. Соответственно изобретение также охватывает человеческие поликлональные антитела, которые специфически связываются с СИ20. В одном варианте изобретение относится к поликлональным антителам, которые связываются с эпитопом на СИ20 (ί), который не содержит или которому не требуется аминокислотный остаток пролин в положении 172; (ίί) который не содержит или которому не требуются аминокислотные остатки аланин в положении 170 или пролин в положении 172; (ίίί) который содержит или которому требуются аминокислотные остатки аспарагин в положении 163 и аспарагин в положении 166; (ίν) который не содержит или которому не требуется аминокислотный остаток пролин в положении 172, но который содержит или которому требуются аминокислотные остатки аспарагин в положении 163 и аспарагин в положении 166; или (ν) который не содержит или которому не требуются аминокислотные остатки аланин в положении 170 или пролин в положении 172, но который содержит или которому требуются аминокислотные остатки аспарагин в положении 163 и аспарагин в положении 166.
В другом варианте изобретение относится к человеческим поликлональным антителам, которые имеют одну или более из следующих характеристик: (ί) связываются с мутантным Ρ172δ СИ20 (пролин в положении 172 заменяется на серин), по меньшей мере, с такой же аффинностью, как и с человеческим СИ20; (ίί) связываются с мутантным АхР (аланин в положении 170 заменен на серин и пролин в положении 172 заменен на серин), по меньшей мере, с такой же аффинностью, как и с человеческим СИ20; (ίίί) показывают пониженное на 50% или более связывание с мутантным Ν166Ό (аспарагин в положении 166 заменен на аспарагиновую кислоту) по сравнению с человеческим СИ20 при концентрации антитела 10 мкг/мл; и/или (ίν) показывают пониженное на 50% или более связывание с мутантным Ν163Ό (аспарагин в положении 163 заменен на аспарагиновую кислоту) по сравнению с человеческим СИ20 при концентрации антитела 10 мкг/мл.
Еще в одном варианте изобретение относится к человеческим моноклональным антителам, которые связываются с эпитопом в малой первой внеклеточной петле человеческого СЭ20. Еще в одном варианте изобретение охватывает также человеческие моноклональные антитела, которые связываются с прерывистым эпитопом на СЭ20. Еще в одном варианте изобретение относится к человеческим моноклональным антителам, которые связывают прерывистый эпитоп на СИ20, который содержит участок первой малой внеклеточной петли и участок второй внеклеточной петли. Еще в одном варианте изобретение относится к человеческим поликлональным антителам, которые связываются с прерывистым эпитопом на СИ20, содержащим остатки ΑΟΙΥΑΡ малой первой внеклеточной петли и остатки ΜΕδΕΝΡΙΚΑΗΤΡΥΙ второй внеклеточной петли.
Изобретение охватывает способы применения антител по изобретению для обнаружения клетки, экспрессирующей СИ20. Также охватываются способы применения антител по изобретению для блокирования или ингибирования индуцированных СИ20 активностей, например пролиферативной активности и/или активности дифференцировки, и эти методы применимы для лечения нарушений, ассоциированных с СИ20, таких как опухолегенные заболевания (например, В-клеточная лимфома) и аутоиммунные заболевания (например, ΚΑ (ревматоидный артрит, РА), болезнь Крона и грануломатоз Вегенера).
Для того чтобы лучше понять настоящее изобретение, сначала дается определение некоторых терминов. Дополнительные определения вводятся в ходе подробного описания.
Термины СИ20 и антиген СИ20 применяются поочередно в данном описании и включают любые варианты, изоформы и гомологи человеческого СИ20, которые естественно экспрессируются клетками или экспрессируются в клетках, трансфецированных геном СИ20. Связывание антитела по изобретению с антигеном СИ20 опосредует киллинг клеток, экспрессирующих СИ20 (например, опухолевых клеток) путем инактивации СИ20. Киллинг клеток, экспрессирующих СИ20, может происходить по одному или более следующих механизмов:
комплементзависимая цитотоксичность (СЭС) клеток, экспрессирующих СИ20; апоптоз клеток, экспрессирующих СИ20;
вызванный эффекторными клетками фагоцитоз клеток, экспрессирующих СИ20; или вызванная эффекторными клетками антителозависимая клеточная цитотоксичность (АЭСС, АЗКЦ)
- 8 021644 клеток, экспрессирующих ί'.Ό20.
Признанные в технике синонимы ί'.Ό20 включают В-лимфоцитарный антиген СЭ20. антиген В1 на поверхности В-лимфоцитов, Ьеи-16, Вр35, ВМ5 и ЬР5.
Предполагается, что применяемое в данном описании выражение ингибирует рост (например, по отношению к клетке) включает любое измеряемое уменьшение роста клеток при контакте с антителом против СЭ20 по сравнению с ростом тех же самых клеток, не контактирующих с антителом против СО20, например ингибирование роста клеточной культуры по меньшей мере примерно на 10, 20, 30, 40, 50, 69, 70, 80, 90, 99 или 100%. Такое уменьшение роста клеток может происходить по различным механизмам, например, таким как фагоцитоз эффекторными клетками, АОСС, СЭС и/или апоптоз.
Термин рафт, плот относится к обогащенным сфинголипидами и холестерином мембранным микродоменам, локализованным на внешней поверхности плазменной мембраны клетки. Способность некоторых белков ассоциироваться с такими доменами может влиять на функцию белка. Например, транслокация молекул СО20 в липидные рафты после связывания человеческими антителами по настоящему изобретению дает в плазменных мембранах комплексы антиген СО20-антитело высокой плотности. Такая высокая плотность комплексов СО20-антитело может способствовать эффективной активации системе комплемента в процессе СЭС.
Термин антитело по данному описанию включает целые антитела и любой его антигенсвязывающий фрагмент (т.е. антигенсвязывающий участок) или его одиночную цепь. Антитело относится к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелых (Н) цепи и две легких (Ь) цепи, связанных дисульфидными связями, или его антигенсвязывающий фрагмент. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначенной в данном описании Ун) и константной области тяжелой цепи. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначенной в данном описании Уь) и константной области легкой цепи. Области Ун и Уъ можно далее подразделить на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (СОК), перемежающимися (с вкраплениями) более консервативными областями, называемыми остовными (каркасными, скелетными, РК) областями. Каждая Ун и Уъ область состоит из трех СОК и четырех РК, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: РК1, СОК1, РК2, СОК2, РК3, СОК3, РК4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (С1ф классической системы комплемента.
Термин антигенсвязывающий участок (область, фрагмент) антитела (или просто область (участок, фрагмент) антитела по данному описанию относится к одному или более фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, СО20). Показано, что антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином антигенсвязывающий участок антитела, включают (ί) фрагмент РаЬ, одновалентный фрагмент, состоящий из Ун, Уь, С/, и Сн1 доменов; (ίί) фрагмент Р(аЬ')2, двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента РаЬ, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ίίί) Рб фрагмент, состоящий из Ун и Сн1 доменов; (ίν) фрагмент Ρν, состоящий из Ун и Уъ доменов единственного плеча молекулы антитела; (ν) фрагмент бАЬ (\Уагб е! а1., (1989) №Лиге 341:544-546), который состоит из Ун домена; (νί) выделенную вариабельную область (СОК) и (νίί) комбинацию из двух или более изолированных СОК, которые, необязательно, могут быть соединены синтетическим линкером. Кроме того, хотя два домена фрагмента Ру, Ун и Уь, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с применением методов рекомбинантной ДНК с помощью синтетического линкера, который позволяет им находиться в виде единой белковой цепи, в которой Ун и Уъ области спариваются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Ру СсРу); см., например, Виб е! а1. (1988) 8с1епсе 242:423-426 и Ии^Юи е! а1. (1988) Ргос. №и1. Асаб. 8с1. И8А 85:5879-5883). Предполагается, что такие одноцепочечные антитела охватываются термином антигенсвязывающий фрагмент антитела. Другим примером являются слитые белки связывающего домена иммуноглобулинов, содержащие (ί) полипептид связывающего домена, который сливается с полипептидом шарнирной области иммуноглобулина, (ίί) Сн2 константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, слитую с полипептидом шарнирной области, и (ίίί) Сн3 константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, слитую с СН2 константной областью. Полипептид связывающего домена может быть вариабельной областью тяжелой цепи или вариабельной областью легкой цепи. Такие химерные белки связывающего домена иммуноглобулина дополнительно описаны в патентных заявках США 2003/0118592 и 2003/0133939. Эти фрагменты антитела получены общепринятыми методами, известными специалистам в данной области техники, и фрагменты подвергают скринингу на полезность таким же способом, как и интактные антитела.
Термин эпитоп означает белковую детерминанту, способную специфически связываться с антителом. Эпитопы обычно состоят из химически активных группирующихся на поверхности молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахаров, и, как правило, имеют специфические признаки трехмерной структуры, а также специфический заряд. Конформационные и неконформационные эпитопы
- 9 021644 различаются тем, что связывание с первым, но не с последним, утрачиваются в присутствии денатурирующих агентов.
Термин прерывистый эпитоп по данному описанию означает конформационный эпитоп на белковом антигене, который образуется по меньшей мере из двух отдельных областей в первичной последовательности белка.
Предполагается, что термин биспецифическая молекула включает любой агент, например белок, пептид или комплекс белка или пептида, который имеет две различные специфичности связывания. Например, молекула может связываться с или взаимодействовать с (а) антигеном клеточной поверхности и (Ь) Рс-рецептором на поверхности эффекторной клетки. Предполагается, что термин полиспецифическая молекула или гетероспецифическая молекула включает любой агент, например белок, пептид или комплекс белка или пептида, который имеет более двух различных специфичностей связывания. Например, молекула может связываться с или взаимодействовать с (а) антигеном клеточной поверхности, (Ь) Рс-рецептором на поверхности эффекторной клетки и (с) по меньшей мере одним другим компонентом. Соответственно изобретение включает, но без ограничения, биспецифические, триспецифические, тетраспецифические и другие полиспецифические молекулы, которые направлены на антигены клеточной поверхности, такие как 0020, и на другие мишени, такие как Рс-рецепторы на эффекторных клетках.
Термин биспецифическое антитело также включает ЛаЬоЛек (диатела). Диатела (ЛаЬоЛек) представляют собой двухвалентные биспецифические антитела, в которых νΗ и домены экспрессируются на одиночной полипептидной цепи, но, так как используется линкер, слишком короткий для того, чтобы было возможно спаривание двух доменов на одной и той же цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта (см., например, НоШпдег, Р., е1 а1. (1993) Ргос. №-Н1. Асаб. 8с1. υδΑ 90:6444-6448; РоЦак, К.Т, е1 а1. (1944) 81гис1иге 2: 1121-1123).
Термин производные человеческого антитела относится к любой модифицированной форме антитела, например к конъюгату антитела и другому агенту или антителу.
Выражение происходит из, из, образовано из конкретной последовательности зародышевой линии применяется в данном описании, если антитело получают из системы, использующей последовательности человеческих иммуноглобулинов, например, иммунизацией трансгенной мыши, несущей гены человеческих иммуноглобулинов, или скринингом библиотеки генов человеческих иммуноглобулинов, причем аминокислотная последовательность выбранного человеческого антитела по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии. Как правило, человеческое антитело, образованное из конкретной последовательности человеческой зародышевой линии, демонстрирует не более 10 различий аминокислот, более предпочтительно не более 5 или еще более предпочтительно не более 4, 3, 2 или 1 различия аминокислот от аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии.
Применяемый в данном описании термин гетероантитела относится к двум или более антителам, их производным или антигенсвязывающим областям, связанным вместе, из которых по меньшей мере два имеют различные специфичности. Эти различные специфичности включают специфичность связывания с Рс-рецептором на эффекторной клетке и специфичность связывания с антигеном или эпитопом на клетке-мишени, например опухолевой клетке.
Предполагается, что термин человеческое антитело по данному описанию включает антитела, имеющие вариабельные и константные области последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Человеческие антитела по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями геном человеческого иммуноглобулина зародышевой линии (например, мутации, вводимые случайным или сайт-специфическим мутагенезом ίη νίΙΐΌ или соматической мутацией ίη У1уо). Однако термин человеческое антитело по данному описанию не предполагает включать антитела, в которых последовательности СОК из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мышь, могут быть введены (трансплантированы) в человеческие остовные последовательности.
Термины моноклональное антитело или композиция моноклонального антитела по данному описанию относятся к препарату молекул антитела единого молекулярного состава. Композиция моноклонального антитела демонстрирует единую (общую) специфичность и аффинность в отношении конкретного эпитопа. Следовательно, термин человеческое моноклональное антитело относится к антителам, проявляющим единую (общую) специфичность, которые имеют вариабельные и константные области из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. В одном варианте изобретения человеческие моноклональные антитела продуцируются гибридомой, которая включает В-клетку, полученную от трансгенного или трансхромосомного отличного от человека животного, например трансгенной мыши, имеющей геном, содержащий трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, слитый с иммортализованной клеткой.
Термин рекомбинантное человеческое антитело по данному описанию включает все человеческие антитела, которые получаются, экспрессируются, создаются или выделяются методами рекомбинантной
- 10 021644
ДНК, такие как (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), трангенного или трансхромосомного по генам человеческих иммуноглобулинов или полученных из них гибридом (описанных ниже в разделе 1), (Ь) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антитела, например из трансфектомы, (с) антитела, выделенные при использовании комбинаторной библиотеки, содержащей рекомбинантные человеческие антитела, и (6) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей генов человеческих иммуноглобулинов в последовательности других ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные и константные области из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Однако в некоторых вариантах изобретения такие рекомбинантные человеческие антитела могут претерпевать ίη νίίτο мутагенез (или, если используют животное, трансгенное по последовательностям человеческого 1д, ίη νίνο соматический мутагенез), и тем самым аминокислотные последовательности Ун и Уъ областей рекомбинантных антител секвенируют таким образом, что несмотря на то, что они образованы из последовательностей Ун и Уъ зародышевой линии человека и являются родственными им, они не могут существовать в природе в составе человеческого антитела зародышевой линии ίη νίνο.
Термин трансфектома по данному описанию включает рекомбинантную эукариотную клеткухозяина, экспрессирующую антитело, такую как клетки СНО, клетки N8/0, клетки НЕК293, растительные клетки или клетки грибов, включая клетки дрожжей.
Применяемый в данном описании термин гетерологическое антитело определяют в связи с трансгенным, отличным от человеческого, организмом, продуцирующим такое антитело. Этот термин относится к антителу, имеющему аминокислотную последовательность или кодирующую нуклеотидную последовательность, соответствующие последовательностям антитела, обнаруживаемого в организме, не являющемся организмом трансгенного отличного от человека животного, и, как правило, вида, иного, нежели вид в трансгенном отличном от человека животном.
Применяемый в данном описании термин гетерогибридное антитело относится к антителу, имеющему легкую и тяжелую цепи, происходящие из различных организмов. Например, антитело, имеющее тяжелую цепь, ассоциированную с мышиной легкой цепью, является гетерогибридным антителом. Примеры гетерогибридных антител включают химерные и гуманизированные антитела, обсуждавшиеся выше.
Предполагается, что термин выделенное антитело по данному описанию относится к антителу, практически не содержащему других антител, имеющих отличные антигенные специфичности (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с СЭ20. практически не содержит антител, которые специфически связываются с антигенами, иными, нежели СЭ20). Выделенное антитело, которое специфически связывается с эпитопом, изоформой или вариантом человеческого СЭ20, может, однако, иметь кросс-реактивность в отношении других родственных антигенов, например других видов (например, гомологи СЭ20 вида). Кроме того, выделенное антитело может быть практически свободно от другого клеточного материала и/или химических веществ. В одном варианте изобретения комбинация выделенных моноклональных антител, имеющих различные специфичности, объединены в определенную композицию.
Применяемый в данном описании термин специфическое связывание относится к антителу, связывающемуся с заданным антигеном. Как правило, антитело связывается с аффинностью, соответствующей Кс, примерно, 1 х 10-7 М или меньше, и связывается с заданным антигеном с аффинностью, соответствующей Кс, которая по меньшей мере на два порядка (по абсолютной величине) ниже, чем его аффинность связывания с неспецифическим антигеном (например, В8А, казеин), иным, нежели заданный антиген или близкородственный антиген. Выражения антитело, распознающее антиген и антитело, специфичное в отношении антигена применяются в данном описании взаимозаменяемо, поочередно с выражением антитело, которое связывается специфически с антигеном.
Предполагается, что применяемое в данном описании выражение ка (с-1) относится к константе скорости диссоциации взаимодействия конкретное антитело-антиген. Указанную величину также называют величиной ко££.
Предполагается, что применяемое в данном описании выражение ка (М-1хс-1) относится к константе скорости ассоциации взаимодействия конкретное антитело-антиген.
Предполагается, что применяемое в данном описании выражение Кс (М) относится к константе равновесной диссоциации взаимодействия конкретное антитело-антиген.
Предполагается, что применяемое в данном описании выражение КА (М-1) относится к константе равновесной ассоциации взаимодействия конкретное антитело-антиген и эту величину получают делением ка на к,|.
Предполагается, что применяемый в данном описании термин изотип относится к классу антител (например, 1дМ или ί§01), которые кодируются генами константных областей тяжелой цепи.
Применяемое в данном описании выражение переключение изотипа относится к явлению, когда класс, или изотип, антитела меняется с одного 1д класса на один из других 1д классов.
- 11 021644
Применяемое в данном описании выражение непереключенный изотип относятся к изотипическому классу тяжелой цепи, которая продуцируется, когда не происходит переключения изотипа; СН ген, кодирующий непереключенный изотип, как правило, представляет собой первый ген непосредственно по ходу транскрипции от функционально реаранжированный ген. Переключение изотипа классифицируют как классическое или неклассическое переключение изотипа. Классическое переключение изотипа происходит с помощью событий рекомбинации, которые включают по меньшей мере одну область последовательности-переключателя в трансгене. Неклассическое переключение изотипа может происходить, например, гомологичной рекомбинацией между человеческой σμ и человеческой Σ μ (δассоциированная делеция). Альтернативные неклассические механизмы переключения, среди прочего, такие как интертрансгенная и/или интерхромосомная рекомбинации, могут происходить и осуществлять переключение изотипа.
Применяемый в данном описании термин последовательность-переключатель относится к последовательностям ДНК, ответственным за рекомбинацию с переключением. Последовательность донора переключения, как правило, μ область переключения, располагается 5' (т.е. иркйеат, против хода транскрипции) от области конструкции, удаляемой в ходе рекомбинации с переключением. Область акцептора переключения находится между удаляемой (делетируемой) конструкцией и константной областью замены (например, γ, ε и т.д.). Так как отсутствует специфичный сайт, в котором всегда происходит рекомбинация, последовательность конечного гена, как правило, нельзя предсказать исходя из конструкции.
Применяемый в данном описании термин тип гликозилирования, гликозилирующий паттерн определяется как тип (паттерн) углеводных единиц (элементов), ковалентно связанный с белком, более конкретно с иммуноглобулиновым белком (белком антитела). Тип гликозилирования гетерологического антитела можно охарактеризовать как практически аналогичный типам гликозилирования, встречающимся в природе на антителах, продуцированных видом отличного от человека трангенного животного, когда специалист в данной области техники поймет, что тип гликозилирования гетерологического антитела более похож на тип гликозилирования вида отличного от человека животного, чем на вид, из которого образованы СН гены трансгена.
Термин природный по данному описанию, применяемый к объекту, относится к тем случаям, когда объект может встречаться в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, присутствующая в организме (включая вирусы), которую можно выделить из источника в природе и которая не модифицирована преднамеренно человеком в лаборатории, является природной.
Термин реаранжированный, перегруппированный по данному описанию относится к конфигурации тяжелой цепи или легкой цепи локуса иммуноглобулина, в котором V сегмент позиционирован как непосредственно прилегающий к Ό-1 или 1 сегменту в конформации, кодирующей в основном полный νΗ и ν^ домен соответственно. Перегруппированный (реаранжированный) локус гена иммуноглобулина (антитела) можно идентифицировать, сравнивая с ДНК зародышевой линии; перегруппированный локус содержит по меньшей мере один рекомбинированный гептамерный/нонамерный элемент гомологии.
Термин неаранжированный (неперегруппированный) или конфигурация зародышевой линии по данному описанию по отношению к V сегменту относится к конфигурации, в которой V сегмент не рекомбинируется таким образом, чтобы непосредственно прилегать к сегменту Ό или 1.
Предполагается, что термин нуклеотидная молекула, молекула нуклеиновой кислоты по данному описанию включает молекулы ДНК и молекулы РНК. Нуклеотидная молекула может быть однонитевой (одноцепочечной) или двухнитевой (двухцепочечной), но предпочтительно двухнитевой ДНК.
Предполагается, что термин выделенная молекула нуклеиновой кислоты по данному описанию по отношению к нуклеиновым кислотам (нуклеотидам), кодирующим полные антитела или участки антител (например, νΗ, ν^ СЭР3), которые связываются с СЭ20, относится к нуклеотидной молекуле, в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие интактное антитело или фрагмент антитела, не содержат других нуклеотидных последовательностей, кодирующих полное антитело или фрагменты (участки) антитела, которые связывают антигены, иные, нежели СЭ20, каковые другие последовательности могут в природе фланкировать нуклеиновую кислоту в человеческой геномной ДНК. В одном варианте изобретения человеческое антитело против СГО20 включает нуклеотидную или аминокислотную последовательность 2Р2, 7Ό8 или 11В8, а также вариабельные области тяжелой цепи (νΗ) и легкой цепи (νθ, имеющие последовательности, показанные на БЕЦ ГО N0: 1, 5 или 9 и БЕО ГО N0: 3, 7 или 11 соответственно.
Как описывается в данном описании и заявляется в формуле в данном описании, последовательности, представленные в БЕЦ ГО N0: 1-30, включают модификации консервативных последовательностей, т.е. модификации нуклеотидных или аминокислотных последовательностей, которые не оказывают значительного влияния на или не изменяют в значительной степени характеристики связывания антитела, кодируемого нуклеотидной последовательностью или содержащего аминокислотную последовательность. Такие модификации консервативных последовательностей включают нуклеотидные и амино- 12 021644 кислотные замены, добавления или делеции. Модификации можно вводить в 8ЕЦ ГО N0: 1-30 стандартными методами, известными в технике, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦРопосредованный мутагенез. Консервативные аминокислотные замены включают замены, в которых аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток с аналогичной боковой цепью. Семейства аминокислотных остатков, имеющие аналогичные боковые цепи, определены (охарактеризованы, установлены) в технике. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, остаток заменимой аминокислоты в человеческом антителе против СГО-20 предпочтительно заменяют другим аминокислотным остатком из семейства с такими же боковыми цепями.
Настоящее изобретение также охватывает производные аминокислотных последовательностей, представленных 8ЕЦ ГО N0: 1-30, и модификации их консервативных последовательностей, в которых один или более аминокислотный остаток дериватизирован, например, ацилированием или гликозилированием, что не оказывает значительного влияния или не изменяет значительно характеристики связывания антитела, содержащего аминокислотные последовательности.
Кроме того, настоящее изобретение включает антитела, в которых сделаны изменения в Рс области, чтобы изменить функциональные или фармакокинетические свойства антител. Такие изменения могут привести к уменьшению или увеличению С1с| связывания и СЭС или РсуК связывания и ЛЭСС. Можно, например, сделать замены в одном или более аминокислотных остатков в положениях 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322 константной области тяжелой цепи, тем самым вызывая изменение эффекторной функции, в то же время сохраняя способность связываться с антигеном, по сравнению с немодифицированным антителом, ср. патенты США 5624821 и 5648260.
Ιη νίνο период полужизни антител можно также увеличить, модифицируя эпитоп рецепторамусорщика константного домена 1д или 1§-подобного константного домена так, чтобы молекула не содержала интактного СН2 домена или интактной Ι§ Рс области, ср. патенты США 6121022 и 6194551. Кроме того, ίη νίνο период полужизни можно увеличить, осуществляя мутации в Рс области, например, заменой треонина на лейцин в положении 252, заменой треонина на серин в положении 254 или заменой треонина на фенилаланин в положении 256, ср. патент США 6277375.
Помимо этого, тип гликозилирования антител можно модифицировать для того, чтобы изменить эффекторную функцию антител. Например, можно экспрессировать антитела в трансфектоме, которая не добавляет элемент (единицу) фукозы, обычно соединенный с Αδη в положении 297 области Рс, чтобы повысить аффинность области Рс к РсуКШ, что, в свою очередь, приведет к повышенной АЗКЦ (АЭСС) антител в присутствии клеток ΝΚ, ср. 81ис1Д с1 а1. (2002), ГОС. 277:26733. Кроме того, для модификации СЭС можно модифицировать галактозилирование.
Или же, в другом варианте изобретения можно вводить мутации произвольно по всей или по участку последовательности, кодирующей антитело против СЭ-20, например, с помощью мутагенеза насыщения, и полученные в результате модифицированные антитела против СГО-20 можно подвергнуть скринингу на активность связывания.
Соответственно антитела, кодированные (вариабельные области тяжелой и легкой цепи) нуклеотидными последовательностями по данному описанию и/или содержащие (вариабельные области тяжелой и легкой цепи) аминокислотные последовательности по данному описанию (т.е. 8ЕЦ ГО N0: 1-30), включают практически аналогичные антитела, кодированные аналогичными последовательностями или содержащие аналогичные последовательности, консервативно модифицированные. Дополнительное обсуждение того, как эти практически аналогичные антитела можно получить исходя из частичных (например, вариабельных областей тяжелой и легкой цепи) последовательностей по данному описанию, таких как 8ЕЦ ГО N0: 1-30, дано ниже.
В случае нуклеиновых кислот термин практическая гомология указывает, что две нуклеиновые кислоты или их указанные последовательности при оптимальном наложении и сравнении явяются идентичными при наличии соответствующих инсерций или делеций нуклеотидов по меньшей мере примерно в 80% нуклеотидов, обычно по меньшей мере примерно в 90-95% нуклеотидов и более предпочтительно по меньшей мере примерно в 98-99.5% нуклеотидов. Или же, практическая гомология существует, когда сегменты гибридизуются в селективных условиях гибридизации с комплементом цепи.
По отношению к нуклеотидной и аминокислотной последовательностям термин гомология указывает на степень идентичности между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями при оптимальном наложении и сравнении с соответствующими инсерциями или делециями. Или же, практическая гомология существует тогда, когда ДНК сегменты гибридизуются в селективных условиях гибридизации с комплементом цепи.
- 13 021644
Процент идентичности двух последовательностей является функцией числа идентичных положений, общих для последовательностей (например, % гомологии=# идентичных положений/общее число (#) положенийх100), принимается во внимание число гэпов и протяженность каждого гэпа, которые требуется ввести для оптимального совмещения (наложения) двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности двух последовательностей можно выполнять, используя математический алгоритм, описанный в неограничивающих примерах, приведенных ниже.
Процент идентичности двух нуклеотидных последовательностей можно определить, используя САР программу в программном обеспечении ССС (доступной по адресу в Интернете ййр://№№№.дсд.сот), используя матрицу Ы^Здарбиа.СМР и массу гэпа 40, 50, 60, 70 или 80 1епд1й \усщ1и 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Процент идентичности двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей можно также определить с помощью алгоритма Е. Меуегк и Мй1ег (Сотри!. Арр1. Вюкск, 4:11-17 (1988)), который встроен в программу АЫСИ (вариант 2.0), используя РАМ120 таблицу масс остатков, штрафную функцию длины гэпа 12 и штрафную функцию гэпа 4. Кроме того, процент идентичности двух аминокислотных последовательностей можно определить с помощью алгоритма №еб1етап апб ^ипксй (1. Мо1. ΒίοΙ. 48:444-453 (1970)), который встроен в программу САР в программном обеспечении ССС (доступной по адресу в Интернете ййр://№№№.дсд.сот), используя либо матрицу В1оккит 62, либо матрицу РАМ250 и массу гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и 1еп§1й №е1дЫ 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Далее, нуклеотидные и аминокислотные последовательности по данному изобретению можно использовать в качестве последовательности по запросу для осуществления поиска в доступных базах данных, например, для идентификации родственных последовательностей. Такой поиск можно осуществлять, например, используя программы ΝΒΡ-Λ8Τ и ХВЬА§Т (версия 2.0) АЙ8сйи1, е! а1. (1990) ί. Мо1. Вю1. 215:403-10. Поиск нуклеотидов ВЬА§Т можно осуществлять с помощью программы NΒ^А§Τ, показатель (степень)=100, длина кода=12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот по изобретению. Поиск ВЬА§Т белков можно осуществлять с помощью программы ХВЬА§Т, степень=50, длина кода=3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных белковым молекулам по изобретению. Для проведения совмещения последовательностей с гэпами с целью сравнения можно использовать программу Сарреб ВЬА§Т, описанную А118сйи1 е! а1., (1997) №с1ею Аабк Ке8. 25(17):3389-3402. При использовании программ ВЬА§Т и Сарреб ВЬА§Т можно использовать параметры соответствующих программ (например, ХВЬА§Т и NΒ^А§Τ) по умолчанию; см. 1Шр://\у\у\у.псЬкп1т.шк8оу.
Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в цельных клетках, в клеточном лизате или в частично очищенном или практически чистом виде. Нуклеиновая кислота является выделенной или представленной практически чистой, когда она очищена от других клеточных компонентов или других примесей, например других клеточных нуклеиновых кислот или белков, стандартными методами, включая обработку щелочью/δΌδ, СкС1 бэндинг (дифференциальное окрашивание хромосом), колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие общеизвестные в технике методы; см. Р. Аи8иЬе1, е! а1., еб. СиггеЩ Рго1осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, Сгеепе РиЬйкЫпд апб ^йеу Ьйегкшепсе, №\у Уогк (1987).
Составы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, хотя часто имеющие нативную последовательность (за исключением модифицированных сайтов рестрикции и т.п.) любой кДНК, геномной или их смесей, можно сделать мутантными стандартными методами с целью получения последовательностей генов. В случае кодирующих последовательностей эти мутации, если нужно, могут влиять на аминокислотную последовательность. В частности, рассматриваются последовательности ДНК, практически гомологичные нативным V, Ό, ί, константным переключениям и другим таким последовательностям по данному описанию или образованные из этих последовательностей (где образованный (бепуеб) указывает на то, что последовательность идентична другой последовательности или получена модификацией другой последовательности).
Нуклеиновая кислота функционально связана, если она находится в функциональной связи с другой нуклеотидной последовательностью. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности. Что касается транскрипции регуляторных последовательностей, функционально связанный означает, что последовательности ДНК, будучи связанными, являются соседними и, если необходимо соединить две области, кодирующие белок, соседними и в рамке считывания. Что касается последовательностейпереключателей, функционально связанный указывает, что последовательности способны осуществлять рекомбинацию переключения.
Предполагается, что термин вектор по данному описанию относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать (переносить) другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Одним типом вектора является плазмида, термин, относящийся к петле кольцевой двухцепочечной ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные ДНК сегменты. Другим типом вектора является вирусный вектор, где дополнительные ДНК сегменты могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут быть интегри- 14 021644 рованы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина и тем самым реплицированы вместе с геномом-хозяином. Кроме того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в данном описании называются векторами рекомбинантной экспрессии (или просто векторами экспрессии). В целом векторы экспрессии, применяемые в методах рекомбинантной ДНК, часто находятся в виде плазмид. В настоящем описании плазмида и вектор могут применяться взаимозаменяемо, так как плазмида является наиболее общеупотребительной формой вектора. Предполагается, однако, что изобретение включает такие другие формы векторов экспрессии (экспрессирующих векторов), как вирусные векторы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют аналогичные (эквивалентные) функции.
Предполагается, что термин рекомбинантная клетка-хозяин (или просто клетка-хозяин) по данному описанию относится к клетке, в которую вводят рекомбинантный экспрессирующий вектор. Следует понимать, что такие термины, как предполагается, относятся не только к клетке конкретного субъекта, но к потомству такой клетки. Так как в последующих поколениях могут встречаться некоторые модификации вследствие либо мутации, либо влияния окружающей среды, на самом деле такое потомство может не быть идентичным родительской клетке, но, тем не менее, охватывается термином клетка-хозяин по данному изобретению. Рекомбинантные клетки-хозяева включают, например, трансфектомы, такие как клетки СНО, клетки N8/0 и лимфоциты.
Термин субъект по данному описанию включает человека или отличное от человека животное. Термин отличное от человека (нечеловеческое) животное включает всех позвоночных, например млекопитающих и немлекопитающих, таких как отличные от человека приматы, овца, собака, корова, куры, земноводные, пресмыкающиеся и т.д.
Выражение трансгенное отличное от человека животное относится к отличному от человека животному, имеющему геном, содержащий один или более трансгенов или трансхромосом с тяжелой и/или легкой цепью человеческого происхождения (интегрированных или неинтегрированных в природную геномную ДНК животного) и способный экспрессировать полностью человеческие антитела. Например, трансгенная мышь может иметь трансген с легкой цепью человеческого происхождения и либо трансген с тяжелой цепью человеческого происхождения, либо трансхромосому с тяжелой цепью человеческого происхождения, так что мышь, будучи иммунизирована ΟΌ20 антигеном и/или клетками, экспрессирующими ΟΌ20, продуцирует человеческие антитела против ΟΌ20. Трансген с тяжелой цепью человеческого происхождения можно интегрировать в хромосомную ДНК мыши, как в случае трансгенных, например, НиМЛЬ мышей, таких как мыши Нсо7 или Нсо12, или трансген с тяжелой цепью человеческого происхождения можно сохранять вне хромосомы, как в случае трансхромосомных (например, КМ) мышей, описанных в Международной заявке \УО 02/43478. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши способны продуцировать многие изотипы человеческих моноклональных антител к ΟΌ20 (например, 1дС, 1дА и/или 1дЕ), если претерпевают У-Э-У рекомбинацию и переключение изотипа.
Различные аспекты изобретения более подробно описаны в подразделах, приведенных ниже.
I. Получение человеческих антител к ΟΌ20.
Человеческие моноклональные антитела по изобретению можно получать многими методами, включая обычную методологию моноклональных антител, например стандартный метод гибридизации соматических клеток КоЫет апй МйЧет. №Циге 256:495 (1975). Хотя методы гибридизации соматических клеток являются предпочтительными, в принципе для получения моноклонального антитела можно применять другие методы, например вирусную или онкогенную трансформацию В-лимфоцитов или методы фагового дисплея, используя библиотеки генов человеческих антител.
Предпочтительной животной системой для получения гибридом, которые секретируют человеческие моноклональные антитела, является мышиная система.
Получение гибридом в мыши является общепризнанным методом. Протоколы иммунизации и методы выделения иммунизированных спленоцитов для слияния (гибридизации) известны в технике. Г ибридообразующие клетки-партнеры, например клетки мышиной миеломы, и методики гибридизации также известны.
В предпочтительном варианте изобретения человеческие моноклональные антитела против ΟΌ20 можно получать, используя трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих фрагменты (части) скорее иммунной системы человека, нежели системы мыши. Эти трансгенные и трансхромосомные мыши включают мышей, обозначенных в данном описании мыши НиМаЬ и мыши КМ соответственно, и в данном описании имеют общее название трансгенные мыши.
Мышь НиМАЬ содержит минилокусы гена человеческого иммуноглобулина, которые кодируют неперегруппированные последовательности тяжелой (μ и γ) и легкой (к) цепи человеческого иммуноглобулина, вместе с нацеленными мутациями, которые инактивируют локусы эндогенных μ- и к-цепей (ЬопЬетд, N. е1 а1 (1994) №Циге 368 (6474): 856-859). Соответственно мыши проявляют пониженную экспрессию мышиного 1дМ или к и в ответ на иммунизацию, введенные трансгены с тяжелой и легкой цепью человеческого происхождения претерпевают переключение класса и соматическую мутацию с обра- 15 021644 зованием человеческих моноклональных антител 1дС,к (ЬопЬегд, N. е! а1. (1994), см. выше; обзор в ЬопЬегд, N. (1994) НапйЬоок οί Е.хрептеп1а1 РЬагтасо1оду 113:49-101; ЬопЬегд, N. апй Ни5/аг, Ό. (1995) 1п!ет. Кем. 1ттипо1. Уо1. 13: 65-93, и Нагйшд, Р. апй ЬопЬегд, N. (1995) Апп. КУ. Асай. 8с1 764: 536-546). Получение мышей НиМАЬ подробно описано в Тау1ог, Ь. е! а1. (1992) ШОек Атйз КезеагсЬ 20:62876295; СЬеп, I. е! а1 (1993) 1п!егпайопа1 1ттипо1оду 5: 647-656; ТиаШоп е! а1. (1994) I. 1ттипо1. 152:29122920, ЬопЬегд е! а1., (1994) №1иге 368(6474): 856-859; ЬопЬегд, N. (1994) НапйЬоок о£ Е.хрептеп1а1 РЬагтасо1оду 113:49-101; Тау1ог, Ь. е! а1. (1994) 1п!егпайопа1 1ттипо1оду 6: 579-591; ЬопЬегд, N. апй Ни5/аг, Ό. (1995) 1п!ет. Кем. 1ттипо1. Уо1. 13:65-93; Нагйтд, Р. апй ЬопЬегд, N. (1995) Апп. КУ. Асай. 8с1 764:536-546; р18Ьто1й, И. е! а1. (1996) №1иге Вю!есЬпо1оду 14:845-851. Помимо этого, см. патенты США 5545806;5569825;5625126;5633425;5789650;5877397; 5661016; 5814318; 5874299; и 5770429; все выданы ЬопЬегд апй Кау, а также патент США 5545807, выданный 8игаш е! а1.; международные заявки \У0 98/24884, \\'0 94/25585, \\'0 93/1227, \\'0 92/22645, \\'0 92/03918 Ь \\'0 01/09187.
Мышь КМ содержит трансхромосому с тяжелой цепью человеческого происхождения и с к легкой цепью человеческого происхождения трансгена. Эндогенные гены с мышиной тяжелой и легкой цепью также диссоциированы в мышах КМ, так что иммунизацация мышей ведет скорее к продуцированию человеческих иммуноглобулинов, нежели мышиных иммуноглобулинов. Конструкция КМ мышей и их применение для индуцирования человеческих иммуноглобулинов подробно описаны в Международной заявке \\'0 02/43478.
Иммунизация.
Для получения полностью человеческих моноклональных антител к СЭ20 трансгенных или трансхромосомных мышей, содержащих гены человеческих иммуноглобулинов (например, мышей НСо12, НСо7 или КМ), можно иммунизировать препаратом, обогащенным СЭ20 антигеном, и/или клетками, экспрессирующими СЭ20. описанными, например, в ЬопЬегд е! а1. (1994), см. выше; РЫлуПй е! а1 (1996), см. выше, и в Международной патентной заявке \У0 98/24884. Или же, мышей можно иммунизировать ДНК, кодирующими человеческий СЭ20. Предпочтительно для первой инфузии берут мышей в возрасте 6-16 недель. Например, обогащенный препарат (5-50 мкг) антигена СЭ20 можно использовать для иммунизации мышей НиМАЬ интраперитонеально. В событии, когда иммунизация с использованием очищенного и обогащенного антигена СЭ20 не приводит к антителам, для индуцирования иммунного ответа мышей можно также иммунизировать клетками, экспрессирующими СЭ20, например клеточной линией.
Кумулятивный опыт с различными антигенами показал, что трансгенные мыши НиМАЬ лучше всего отвечают (реагируют), когда их сначала иммунизируют интраперитонеально (1Р) или подкожно (8С) клетками, экспрессирующими СЭ20, в полном адъюванте Фрейнда с последующими 1Р иммунизациями через неделю (каждые две недели) (всего вплоть до 10) клетками, экспрессирующими СЭ20, в РВ8. Мониторинг иммунного ответа можно проводить в течение курса иммунизации по протоколу с образцами плазмы, полученными при ретроорбитальном кровотечении. Скрининг плазмы можно проводить с помощью анализа РАС8 (описанного ниже), а мышей с удовлетворительными титрами человеческого иммуноглобулина против СЭ20 можно использовать для слияний (гибридизации). Мышам можно внутривенно вводить бустер-инъекцию клеток, экспрессирующих СЭ20, за 3 дня до умерщвления и удаления селезенки.
Получение гибридом, продуцирующих человеческие моноклоналъные антитела против СЭ20.
Для получения гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела к человеческому СЭ20, спленоциты и клетки лимфатических узлов иммунизированных мышей можно выделить и гибридизовать с соответствующей иммортализованной клеточной линией, такой как клеточная линия мышиной миеломы. Полученные гибридомы можно затем подвергнуть скринингу на продуцирование антиген-специфических антител. Например, единую суспензию лимфоцитов селезенки иммунизированных мышей можно гибридизовать с 8Р2/0 Ад8.653 несекретирующими клетками мышиной миеломы (АТСС, СКЬ 1580) с 50% РЕС (вес./об.). Клетки можно засевать с примерной плотностью 1x10 на лунку в титрационный микропланшет с плоским профилем дна лунки с последующей двухнедельной инкубацией в селективной среде, содержащей, помимо обычных реагентов, 10% фетальной (телячьей) сыворотки для клонирования, 5-10% фактора начала клонирования гибридомы (1СЕ^ и 1Х НАТ (81дта). Примерно через две недели клетки можно культивировать в среде, в которой НАТ замещают на НТ. Затем индивидуальные клетки можно подвергнуть скринингу методом ЕЫ8А на антитела, содержащие легкую цепь к человеческого происхождения, и анализом РАС8 с применением клеток, экспрессирующих СЭ20, на СЭ20 специфичность. Обычно, когда происходит интенсивный рост гибридом, среду можно наблюдать через 10-14 дней. Гибридомы, секретирующие антитело, можно снова культивировать, снова подвергнуть скринингу и, если они позитивны в отношении человеческого 1дС, моноклональные антитела против СЭ20 можно субклонировать по меньшей мере дважды при ограниченном разведении. Стабильные субклоны можно затем культивировать ш уйго для получения антитела в тканевой культуральной среде для характеристики.
- 16 021644
Получение трансфектом, продуцирующих человеческие моноклоналъные антитела с СЭ20.
Человеческие антитела по изобретению также можно получать в трансфектоме клетки-хозяина, используя, например, комбинацию методов рекомбинантной ДНК и методов трансфекции гена, хорошо известных в технике (Μοττίδοη, 8. (1985) 8аепсе 229:1202).
Например, в одном варианте изобретения ген(-ы), представляющий(-ие) интерес, например ген человеческих антител, может быть лигированы в экспрессирующий вектор, такой как плазмида экспрессии в клетках эукариот, такую, как используемая системой экспрессии С8 генов, описанной в Международных заявках νθ 87/04462, νθ 89/01036 и Европейском патенте ЕР 338841, или другими системами экспрессии, хорошо известными в технике. Очищенную плазмиду с генами клонированных антител можно вводить в эукариотные клетки-хозяева, такие как клетки СНО, клетки N8/0 или клетки НЕК293, или же другие эукариотные клетки, такие как растительные клетки, клетки грибов или дрожжей. Способ, используемый для введения этих генов, может быть методом, описанным в технике, таким как электропорация, липофектин, липофектамин или другие методы. После введения этих генов антител в клеткихозяева клетки, экспрессирующие антитело, могут быть идентифицированы и селектированы. Эти клетки представляют собой трансфектомы, которые можно амплифицировать до их уровня экспрессии и сделать способными продуцировать антитела. Рекомбинантные антитела можно выделить и очистить от этих культуральных супернатантов и/или клеток.
Дополнительные рекомбинантные методы продуцирования человеческих моноклональных антител к ΟΌ20.
Или же, гены клонированных антител можно экспрессировать в других системах экспрессии, включая клетки прокариот, такие как клетки микроорганизмов, таких как Е. соЬ, для получения одноцепочечных Ру антител, водоросли и клетки насекомых. Помимо этого, антитела могут продуцироваться в трансгенных животных, отличных от человека, например в молоке овец и кроликов или в яйцах кур, или в трансгенных растениях; см., например, Уегша, В. е! а1. (1998). АпДЪоДу епдшееппд: Сотрапхоп Ъас1ег1а1, уеахТ шхес! апД таттаЬап ехргеххюп хух!етх. I. 1ттипо1. МеДт 216:165-181; Ро11оск, е! а1 (1999). Тгапхдетс тЛк ах а теДюД £ог Дте ргоДисЬоп о£ гесотЫпап!: апДЪоД1ех. I. 1ттипо1. МеДт 231:147-157 и Р1хсЬег, В., е! а1. (1999). Мо1еси1аг Гагпипд о£ гесотЫпап!: апЬЪоД1ех т р1ап1х. Вю1. СЬет. 380:825-839.
Применение частичных последовательностей антител для экспрессии интактных антител.
Антитела взаимодействуют с антигенами-мишенями преимущественно за счет аминокислотных остатков, которые расположены на шести гипервариабельных участках (ΟΌΚ) тяжелой и легкой цепи. По этой причине аминокислотные последовательности в ΟΌΚ являются более разнообразными в индивидуальных антителах, нежели последовательности вне ΟΌΚ.
Так как последовательности ΟΌΚ ответственны за большинство взаимодействий антиген-антитело, возможно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые подражают свойствам специфичных природных антител, за счет конструкции экспрессирующих векторов, включающих последовательности ΟΌΚ специфичного природного антитела, пересаженные в остовные последовательности из отличного (другого) антитела с отличными (другими) свойствами (см., например, КтесЬтапп, Ь. е! а1. (1998) №-11иге 332:323-327; 1опех, Р. е! а1. (1986) Уинге 321:522-525 и Циееп, С. е! а1. (1989) Ргос. №И. АсаД. 8ск. И.8.А. 86:10029-10033). Такие остовные последовательности можно получить из доступных баз данных ДНК, которые включают последовательности генов антител зародышевой линии. Эти последовательности генов антител зародышевой линии отличаются от последовательностей зрелых генов, кодирующих антитела, так как они не включают полностью собранных вариабельных генов, которые образуются соединением ν(Ό)Ι в процессе созревания В-клетки. Последовательности гена зародышевой линии также будут отличаться от последовательностей вторичного антитела спектра с высокой аффинностью у индивидуума одинаково по всей вариабельной области. Например, соматические мутации являются относительно нечастыми на аминоконцевой части остовной области 1 и на карбоксиконцевой части остовной области 4. Кроме того, многие соматические мутации незначительно изменяют свойства связывания антитела. По этой причине нет необходимости получать полную последовательность ДНК, кодирующей конкретное антитело, чтобы воссоздать интактное рекомбинантное антитело, обладающее свойствами связывания, аналогичными свойствам связывания оригинального (первоначального) антитела (см. ν0 99/45962). Как правило, для этой цели достаточно частичной последовательности тяжелой и легкой цепи, охватывающей ΟΌΚ области. Частичную последовательность используют для определения, какие вариабельные и соединительные генные сегменты зародышевой линии вносят вклад в вариабельные гены рекомбинированного антитела. Последовательность зародышевой линии используют затем для заполнения недостающих частей вариабельных доменов. Лидерные последовательности тяжелой и легкой цепей отщепляются в процессе созревания белка и не вносят вклад в свойства конечного антитела. Для добавления недостающих последовательностей клонированные последовательности кДНК можно соединять с синтетическими олигонуклеотидами лигированием или ПЦР-амплификацией. Или же, полные вариабельные домены можно синтезировать в виде набора коротких, перекрывающихся олигонуклеотидов и объединять с помощью ПЦР-амплификации, чтобы создать клон полностью синтетической вариабельной области. Этот процесс имеет определенные преимущества, такие как элиминирование или включение конкретных сайтов рестрикции или оптимизация конкретных кодонов.
- 17 021644
Нуклеотидные последовательности и транскрипты легких цепей из гибридом используют для дизайна перекрывающегося набора синтетических олигонуклеотидов при создании синтетических V последовательностей со способностью кодировать аминокислоты, идентичной природньм последовательностям. Синтетические последовательности тяжелой и κ-цепей могут отличаться от природных последовательностей по трем направлениям: ряды повторяющихся нуклеотидных оснований прерываются, чтобы упростить синтез олигонуклеотидов и ПЦР-амплификацию; сайты инициации оптимальной трансляции вводятся согласно правилам Козака (Ко/ак. 1991, 1. ΒίοΙ. Сйет. 266:19867-19870) и сайты ΗίηάΙΙΙ создают в 3'-5' (иркйеат) направлении от сайтов инициации трансляции.
Для вариабельных областей как тяжелой, так и легкой цепей оптимизированные кодирующие и соответствующие некодирующие последовательности цепей разбиваются на 30-50 нуклеотидов примерно посередине (в средней точке) некодирующего олигонуклеотида. Таким образом, для каждой цепи олигонуклеотиды можно собрать в перекрывающиеся двухцепочечные наборы, которые охватывают сегменты из 150-400 олигонуклеотидов. Затем пулы используют в качестве матриц для получения продуктов ПЦРамплификации из 150-400 олигонуклеотидов. Как правило, единый набор олигонуклеотидов вариабельной области можно разбить на два пула, которые амплифицируют раздельно, чтобы получить два перекрывающихся ПЦР-продукта. Затем эти перекрывающиеся продукты соединяют ПЦР-амплификацией с образованием полной вариабельной области. Также может быть желательным ввести перекрывающийся фрагмент константной области тяжелой или легкой цепи (включающий сайт ВЬй легкой цепи к или сайт Аде! тяжелой цепи гамма) в ПЦР-амплификацию, чтобы получить фрагменты, которые можно легко клонировать в экспрессирующие векторные конструкции.
Реконструированные вариабельные области тяжелой и легкой цепей затем соединяют с клонированными промотором, лидерной последовательностью, последовательностями сайта инициации трансляции, константной области, 3' нетранслируемой области, сайта полиаденилирования и сайта терминации транскрипции с образованием экспрессирующих векторных конструкций. Конструкции экспрессии тяжелой и легкой цепей можно объединить в единый вектор, котрансфецировать, последовательно трансфецировать или по отдельности трансфецировать в клетки-хозяева, а затем слить (гибридизовать) с образованием клетки-хозяина, экспрессирующей обе цепи.
Плазмиды для применения в конструкции экспрессирующего вектора для человеческого Ι§Ο,κ описаны ниже. Плазмиды конструированы таким образом, чтобы ПЦР-амплифицированные последовательности кДНК V тяжелой и V к легкой цепей можно было использовать для реконструкции минигенов полной тяжелой и легкой цепей. Эти плазмиды можно использовать для экспрессии полностью человеческих или химерных Ι§Ο1,κ или Ι§Ο4,κ антител. Аналогичные плазмиды можно конструировать для экспрессии других изотипов легкой цепи или для экспрессии антител, содержащих легкие цепи λ.
Так, в другом аспекте изобретения структурные особенности (признаки) человеческих антител против СБ20 по изобретению, например 11В8, 2Р2 или 7Ό8, используются для создания родственных по структуре человеческих антител против СБ20, которые сохраняют по меньшей мере одно функциональное свойство антител по изобретению, такое как связывание с СБ20. Более конкретно, одну или более СБК областей 2Р2, 7Ό8 или 11В8 можно объединять рекомбинантно с известными остовными областями человеческого происхождения и СБК для создания дополнительных полученных методом рекомбинантной ДНК антител против СБ20 по изобретению.
Соответственно в другом варианте изобретение включает способ получения антитела против СБ20, заключающийся в получении антитела, содержащего (1) остовные области тяжелой цепи человеческого происхождения и СБК тяжелой цепи человеческого происхождения, в которых по меньшей мере одна из СБК тяжелой цепи человеческого происхождения содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей СБК, показанных на фиг. 53, 55 или 57 (или соответствующие аминокислотные остатки в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 13-15, 19-21 или 25-27); и (2) остовные области легкой цепи человеческого происхождения и СГОК легкой цепи человеческого происхождения, в которых по меньшей мере одна из СГОК легкой цепи человеческого происхождения содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей СГОК, показанных на фиг. 53, 55 или 57 (или соответствующие аминокислотные остатки в 8ЕО ГО ΝΟ. 16-18, 22-24 или 28-30); где антитело сохраняет способность связываться с СГО20.
Способность антитела связываться с СГО20 можно определить с применением стандартных анализов связывания, таких, которые представлены в примерах (например, РАС8 анализ).
Так как в технике хорошо известно, что домены СГОК3 тяжелой и легкой цепей играют особенно важную роль в специфичности/аффинности связывания антитела с антигеном, рекомбинантные антитела по изобретению, полученные, как представлено выше, предпочтительно содержат области СГОК3 тяжелой и легкой цепей 2Р2, 7Ό8 или 11В8. Антитела далее могут содержать области СГОК2 2Р2, 7Ό8 или 11В8. Кроме того, антитела могут содержать области СГОК1 2Р2, 7Ό8 или 11В8. Соответственно изобретение далее содержит антитела против СГО20: (1) остовные области тяжелой цепи человеческого происхождения и область СГОК1 тяжелой цепи человеческого происхождения, область СГОК2 тяжелой цепи человеческого происхождения и область СГОК3 тяжелой цепи человеческого происхождения, в которых
- 18 021644 область С9ЭК3 тяжелой цепи человеческого происхождения представляет собой СЭК3 2Р2, 7Ό8 или 11В8, показанные на фиг. 53, 55 или 57 (или соответствующие аминокислотные остатки в δΕΟ ГО ΝΟ: 15, 21 или 27); и (2) остовные области легкой цепи человеческого происхождения и область СГОК1 легкой цепи человеческого происхождения, область СГОК2 легкой цепи человеческого происхождения и область СГОК3 легкой цепи человеческого происхождения, в которых область СГОК3 легкой цепи человеческого происхождения представляет собой СГОК3 2Р2, 7Ό8 или 11В8, показанные на фиг. 53, 55 или 57 (или соответствующие аминокислотные остатки в δΕΟ ГО ΝΟ. 18, 24 или 30); где антитело связывается с СГО20. Антитело может дополнительно содержать СГОК2 тяжелой и/или легкой цепи 2Р2, 7Ό8 или 11В8. Кроме того, антитела могут содержать области СГОК1 тяжелой и/или легкой цепи 2Р2, 7Ό8 или 11В8.
Предпочтительно СГОК1, 2 и 3 антител, полученных методом рекомбинантной ДНК, описанные выше, содержат точно такую(-е) же аминокислоту(-ы), которые содержат 2Р2, 7Ό8 или 11В8 по данному описанию. Однако рядовой специалист в данной области понимает, что возможно некоторое отклонение от точных СОК последовательностей 2Р2, 7Ό8 или 11В8 при все еще сохраняющейся способности антитела эффективно связывать СГО20 (например, консервативные замены). Соответственно в другом варианте изобретения антитело, полученное методом рекомбинантной ДНК, может состоять из одной или более областей СОК, которая, например, на 90, 95, 98 или 99.5% идентична одной или более областей СОК 2Р2, 7Ό8 или 11В8.
Помимо простого связывания СГО20 антитела, полученные методом рекомбинантной ДНК, такие как описанные выше, можно выбирать из-за сохранения ими других функциональных свойств антител по изобретению, таких как:
(1) низкая скорость диссоциации ассоциата с СГО20;
(2) высокая аффинность связывания с СГО20;
(3) связывание с уникальным эпитопом на СГО20;
(4) опосредование высокого уровня СГОС либо на СГО55/59 негативных, либо на СГО55/59 позитивных клетках;
(5) транслокация в липидные рафты (липидные плоты) при связывании с СЭ20;
(6) ингибирование роста клеток, экспрессирующих СГО20;
(7) индуцирование (стимуляция) апоптоза клеток, экспрессирующих СГО20;
(8) индуцирование гомотипической адгезии клеток, экспрессирующих СГО20;
(9) пролонгированное выживание субъекта, имеющего опухолевые клетки, экспрессирующие СГО20;
(10) опосредование АЭСС СГО20 мишеней при смешении с соответствующими эффекторными клетками;
(11) способность истощать клетки, экспрессирующие СГО20; и/или (12) способность истощать клетки, экспрессирующие низкие уровни СГО20 (СГО20|о'“ клетки).
Характеристика связывания моноклинальных антител с СГО20.
Для очистки человеческих антител против СГО20 выбранные гибридомы можно выращивать в двухлитровых колбах-центрифугах для очистки моноклональных антител. Супернатанты можно отфильтровать и упарить перед аффинной хроматографией с протеин А-сефарозой (для антител изотипа 1дО1) (РЬагташа, Ρ^8саίа№ау, Ν1) или с сефарозой, покрытой антителом против человеческого 1дО, или Осефарозой в случае антител изотипа 1дО3. Для гарантии чистоты элюированный 1§О можно проверять с помощью гель-электрофореза или высокоэффективной жидкостной хроматографии. Буферный раствор можно заменить на ΡΒδ и концентрацию можно определять по ΟΌ280, используя коэффициент 1.43. Моноклональные антитела можно аликвотировать и хранить при -80°С.
Для того чтобы определить, связываются ли человеческие моноклональные антитела против СГО20 с уникальными эпитопами, можно использовать сайт-направленный или полисайт-направленный мутагенез.
Для определения изотипа очищенных антител можно осуществлять изотипический ЕЫ8А. Лунки микротитрационных планшетов можно покрывать пленкой из 10 мкг/мл антитела против человеческого 1д в течение ночи при 4°С. После блокирования с помощью 5% ΒδΑ в лунки планшетов добавляют 10 мкг/мл моноклональных антител или контрольных очищенных изотипов при комнатной температуре на 2 ч. Затем содержимое лунок может реагировать либо с человеческими 1дО1, 1дО2, 1дО3 или 1дО4, либо с зондами конъюгированной человеческий I§Μ-специфической щелочной фосфатазы. После промывания планшеты обрабатывают субстратом ρΝΡΡ (1 мг/мл) и анализируют при ΟΌ 405-650.
Чтобы продемонстрировать присутствие антител против СГО20 в сыворотках иммунизированных мышей или связывание моноклональных антител с живыми клетками, экспрессирующими СГО20, можно применять проточную цитометрию. Коротко говоря, клеточные линии, экспрессирующие СГО20 (выращенные в стандартных условиях культивирования), смешивают с моноклональными антителами в различных концентрациях в ΡΒδ, содержащем 0.1 ΒδΑ и 0.02% азида натрия, и инкубируют при 4°С в течение 30 мин. После отмывания клетки реагируют с меченным флуоресцеином антителом против человеческого 1дО в тех же условиях, что и первичное окрашивание антитела. Образцы можно анализировать проточной цитометрией на приборе РΑСδ, используя светорассеяние и боковое рассеяние на одиночных живущих клетках. Альтернативный анализ с применением флуоресцентной микроскопии можно исполь- 19 021644 зовать как дополнение к или вместо проточной цитометрии. Клетки можно окрашивать точно так, как описано выше, и исследовать методом флуоресцентной микроскопии. Этот метод делает возможной визуализацию отдельных клеток, но может иметь пониженную чувствительность, зависящую от плотности антигена.
Человеческие 1дС против СИ20 можно дополнительно тестировать на реактивность в отношении СИ20 вестерн-блоттингом. Коротко говоря, можно приготовить клеточные экстракты клеток, экспрессирующих СИ20, и подвергнуть их электрофорезу на додецилсульфат (§И§)-полиакриламидном геле. После электрофореза разделенные антигены можно перенести на нитроцеллюлозные мембраны, блокировать 20% мышиной сывороткой и гибридизовать с зондом испытуемых моноклональных антител. Связывание человеческого 1дС можно обнаружить, применяя конъюгат щелочной фосфатазы против 1дС и обрабатывая таблетками субстрата ΒΟΡ/ΝΒΤ (§1дта СЬет. Со., δ!. Ьошк, ΜΟ).
Фагоцитарная активность человеческих мооноклональных антител к СИ20 и их активность в отношении киллинга клеток.
Помимо специфического связывания с СИ20, человеческие моноклональные антитела против СИ20 можно тестировать на их способность опосредовать фагоцитоз и киллинг клеток, экспрессирующих СИ20. Тестирование активности моноклонального антитела ш У1!го обеспечит начальный скрининг перед тестированием ш У1уо моделей. Коротко говоря, полиморфноядерные клетки (ΡΜΝ), ΝΚ клетки, моноциты или другие эффекторные клетки здоровых доноров можно очистить центрифугированием по плотности в среде Нсо11 Нурадие с последующим лизисом примеси эритроцитов. Отмытые ΡΜΝ можно суспендировать в среде ΚΡΜΙ, дополненной 10% термоинактивированной фетальной телячьей сывороткой, и смешать с мечеными 51Сг клетками, экспрессирующими СИ20, при различных соотношениях эффекторных клеток к опухолевым клеткам (-эффекторные клетки: опухолевые клетки). Затем можно добавлять очищенные 1дС против СИ20 в различных концентрациях. В качестве негативного контроля можно использовать нерелевантные человеческие 1дС. Анализ можно проводить в течение 4-20 ч при 37°С в зависимости от типа используемых эффекторных клеток. Образцы можно анализировать на цитолиз, измеряя выделение 51Сг в культуральный супернатант. Моноклональные антитела против СИ20 можно также тестировать в комбинации друг с другом для определения, повышается ли цитолиз в присутствии нескольких моноклональных антител.
Человеческие моноклональные антитела, которые связываются с СИ20, также можно испытывать на ш У1уо моделях (например, на мышах) для определения их эффективности в регулировании роста опухолевых клеток, экспрессирующих СИ20. Эти антитела можно выбирать, например, на основе нижеприведенных критериев, которые не претендуют на эксклюзивность:
1) связывание с живыми клетками, экспрессирующими СИ20;
2) низкая скорость диссоциации ассоциата с СИ20;
3) высокая аффинность связывания с СИ20;
4) связывание с уникальным эпитопом на СИ20, и/или связывание в специфической ориентации с СИ20, и/или связывание со специфической формой СИ20;
5) опсонизация клеток, экспрессирующих СИ20;
6) опосредование ингибирования клеток, фагоцитоза и/или киллинга клеток, экспрессирующих СИ20, в присутствии человеческих эффекторных клеток;
7) способность индуцировать СЭС либо на СИ55/59 негативных, либо на СИ55/59 позитивных клетках;
8) способность индуцировать гомотопическую адгезию;
9) способность индуцировать транслокацию в липидные рафты (липидные плоты) при связывании с СИ20;
10) способность индуцировать (стимулировать) апоптоз;
11) способность индуцировать АИСС на клетках, экспрессирующих СИ20;
12) способность истощать клетки, экспрессирующие СИ20; и/или
13) способность истощать клетки, экспрессирующие низкие уровни СЭ20 (СЭ201о'“ клетки).
Предпочтительные человеческие моноклональные антитела по изобретению отвечают одному или более этих критериев.
Человеческие моноклональные антитела против СЭ20 можно тестировать на их способность опосредовать СЭС различными известными методами. Например, сыворотку для комплемента можно получать из крови здоровых субъектов, ее можно центрифугировать и собирать. Для определения СЭС активности различных тАЬ можно использовать различные методы. Например, можно определять высвобождение 51Сг или можно оценивать повышенную проницаемость мембран методом исключения окрашиванием йодидом пропидия (ΡΙ). Коротко говоря, клетки-мишени можно отмывать и снова суспендировать в ΚΡΜΙ-1% ΒδΑ при плотности 1х106/мл. К клеткам можно добавлять различные концентрации тАЬ и их оставляют связываться на 10-15 мин при комнатной температуре. Затем можно добавить сыворотку до конечной концентрации 20 об.% и клетки инкубируют при 37°С в течение 45 мин. Все клетки каждого образца можно прибавить к раствору ΡΙ в пробирке с ΡΑСδ. Затем смесь можно сразу же оценивать проточной цитометрией на проточном цитометре РАСЪсаЬЬиг и анализировать с помощью про- 20 021644 граммы СеНЦие^ рго (ВО Вюкаепсек, Моийаш СА).
Для испытания способности инициировать апоптоз человеческие моноклональные антитела против СЭ20 можно, например, инкубировать с СЭ20 позитивными опухолевыми клетками, например ЭаиЙ1, при 37°С примерно в течение 20 ч. Клетки можно собрать, отмыть Аппехт-У-НТС буфером для связывания (ВО Ыокс1епсек) и пометить с помощью Аппехт-У-НТС (ВО Ьюкаепсек) в течение 15 мин в темноте при 4°С. Все клетки каждого образца можно прибавить к раствору ΡΙ (10 мкг/мл в РВ8) в пробирке с РАС8 и сразу же оценивать проточной цитометрией (как указано выше).
В конкретном варианте изобретения человеческие моноклональные антитела используются в комбинации, например, в виде фармацевтической композиции, содержащей два или более моноклональных антител против СЭ20. Например, человеческие моноклональные антитела, имеющие различные, но комплементарные активности, можно объединять в единое лекарственное средство для достижения заданного терапевтического или диагностического эффекта. В предпочтительном варианте композиция включает человеческое моноклональное антитело против СЭ20, которое опосредует СЭС, объединенное с другим человеческим моноклональным антителом, которое стимулирует апоптоз. В другом варианте изобретения композиция включает человеческое моноклональное антитело против СЭ20, которое опосредует высокоэффективный киллинг клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток, объединенное с другим человеческим моноклональным антителом против СЭ20, которое ингибирует рост клеток, экспрессирующих СО.
ΙΙ. Получение трансгенных отличных от человека животных, которые генерируют человеческие моноклональные антитела против СЭ20.
Еще в одном аспекте изобретение включает трансгенных или трансхромосомных отличных от человека животных, таких как трансгенные или трансхромосомные мыши, которые способны экспрессировать человеческие антитела, специфично связывающиеся с СЭ20. В особом варианте изобретение включает трансгенную или трансхромосомную мышь, имеющую геном, содержащий трансген с тяжелой цепью человеческого происхождения, так, что при иммунизации клетками, экспрессирующими СЭ20, мышь продуцирует человеческие моноклональные антитела против СЭ20. Трансген с тяжелой цепью человеческого происхождения можно интегрировать в хромосомную ДНК мыши, как в случае трансгенных, например НиМАЬ, мышей, как подробно описано и показано на примерах в данном описании. Или же, трансген тяжелой цепи человеческого происхождения можно сохранять вне хромосомы, как в случае трансхромосомных мышей (например, КМ), описанных в Международной заявке \У0 02/43478. Такие трансгенные и трансхромосомные животные способны продуцировать многие изотипы человеческих моноклональных антител против СЭ20 (например, ЦС, Ι§Λ и/или Ι§Ρ), претерпевая У-Э-У/У-I рекомбинацию и переключение изотипа. Дизайн трансгенного или трансхромосомного отличного от человека животного, которое отвечает на стимуляцию чужеродным антигеном с помощью спектра гетерологических антител, требует, чтобы трансгены гетерологических иммуноглобулинов в организме трансгенного животного корректно функционировали на всем пути развития В-клетки. Это включает, например, переключение изотипа гетерологического трансгена тяжелой цепи. Соответственно трансгены строят таким образом, чтобы можно было индуцировать переключение изотипа и один или более следующих признаков генов антитела: (1) высокий уровень экспрессии и ее специфичность в отношении типа клеток, (2) функциональная реаранжировка гена, (3) активация исключения аллеля и ответ на него, (4) экспрессия достаточного первичного спектра, (5) сигнальная трансдукция, (6) соматическая гипермутация и (7) доминирование локуса трансгена, кодирующего антитело, в процессе иммунного ответа.
Необязательно должны присутствовать все вышеуказанные критерии. Например, в тех вариантах изобретения, в которых эндогенные локусы генов иммуноглобулинов трансгенного животного функционально разрушены, для трансгена нет необходимости в активации аллельного исключения. Кроме того, в тех вариантах изобретения, в которых трансген содержит функционально реаранжированный ген тяжелой и/или легкой цепи иммуноглобулина, необязательным является второй критерий функциональной реаранжировки гена, по меньшей мере, для того трансгена, который уже является реаранжированным. Сведения общего характера о молекулярной иммунологии см. в Рипйатеп1а1 Ппттю^ду. 2'1 еййюп (1989), Раи1 МППат Е., ей. Кауеп Ргекк, КУ.
В других вариантах изобретения трансгенные или трансхромосомные отличные от человека животные, используемые для получения человеческих моноклональных антител по изобретению, содержат реаранжированные, нереаранжированные или комбинацию реаранжированных и нереаранжированных гетерологических трансгенов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина в зародышевой линии трансгенного животного. Каждый из трансгенов тяжелой цепи содержит по меньшей мере один СН ген. Кроме того, трансген тяжелой цепи может содержать функциональные последовательности-переключатели изотипа, которые способны поддерживать переключение изотипа многих кодирующих СН генов гетерологического трансгена в В-клетках трансгенного животного. Такими последовательностямипереключателями могут быть такие последовательности, которые встречаются в природе в локусе зародышевой линии иммуноглобулина вида, который служит в качестве источника СН генов трансгена, или такие последовательности переключатели могут быть образованы из последовательностей, которые встречаются в виде, применяемом для получения трансгенной конструкции (трансгенное животное). На- 21 021644 пример, трансгенная конструкция человеческого происхождения, которая применяется для получения трансгенной мыши, может давать большую частоту события переключения изотипа, если она вводит последовательности-переключатели, аналогичные последовательностям-переключателям, которые встречаются в природе в локусе мышиной тяжелой цепи, так как, предположительно, мышиные последовательности-переключатели оптимизированы таким образом, чтобы функционировать с системой фермента рекомбиназы, тогда как последовательности-переключатели человеческого происхождения не оптимизированы. Последовательности-переключатели можно выделить и клонировать обычными методами клонирования или их можно синтезировать бе ηονο из перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов, созданных на основе опубликованной информации о последовательностях, относящихся к последовательностям области переключения (Μίΐΐδ е1 а1., Νιιαί. Αοίάδ Кек. 15:7305-7316 (1991); §Мегак е1 а1., Ιηΐΐ. 1ттипо1. 1:631-642 (1989)). В случае каждого из вышеприведенных трансгенных животных функционально реаранжированные гетерологические трансгены тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина обнаружены в значительной части В-клеток трансгенного животного (по меньшей мере 10%).
Трансгены, используемые для получения трансгенных отличных от человека животных по изобретению, включают трансген тяжелой цепи, содержащий ДНК, кодирующую по меньшей мере один вариабельный сегмент гена, один Ό сегмент, один соединяющий сегмент гена и по меньшей мере один сегмент константной области гена. Трансген легкой цепи иммуноглобулина содержит ДНК, кодирующую по меньшей мере один вариабельный сегмент гена, один соединяющий сегмент гена и по меньшей мере один сегмент константной области гена. Сегменты гена, кодирующие (вернее, соответствующие) сегменты (сегментам) генов легкой и тяжелой цепей, являются гетерологическими для трансгенного животного в том отношении, что они образованы из или соотносятся с ДНК, соответствующей сегментам генов тяжелой и легкой цепи, вида, не состоящего из трансгенного отличного от человека животного. В одном аспекте изобретения трансген построен таким образом, что отдельные сегменты гена являются неаранжированными, т.е. трансген не аранжирован так, чтобы кодировать функциональную легкую или тяжелую цепь иммуноглобулина. Такие неаранжированные трансгены содействуют рекомбинации V, Ό и ί сегментов гена (функциональная реаранжировка) и предпочтительно содействуют включению всего или части Ό сегмента гена в полученную в результате реаранжированную тяжелую цепь иммуноглобулина в трансгенном животном при экспозиции с антигеном СЭ20.
В альтернативном варианте изобретения трансгены содержат неаранжированный минилокус. Такие трансгены, как правило, содержат значительную часть С, Ό и ί сегментов, а также субпопуляцию сегментов V генов. В таких трансгенных конструкциях различные регуляторные последовательности, например промоторы, энхансеры, области-переключатели класса, последовательности доноров и акцепторов сплайсинга для процессирования РНК, сигналы рекомбинации и т.п., содержат соответствующие последовательности гетерологической ДНК. Такие регуляторные последовательности могут быть включены в трансген того же самого или родственного вида отличного от человека животного, используемого в изобретении. Например, сегменты гена человеческого иммуноглобулина можно соединять в трансгене с энхансерной последовательностью иммуноглобулина грызунов для использования в трансгенной мыши. Или же, синтетические регуляторные последовательности могут быть включены в трансген, в котором такие синтетические регуляторные последовательности не являются гомологичными функциональной последовательности ДНК, о которой известно, что она встречается в природе в геномах млекопитающих. Синтетические регуляторные последовательности строят по правилам согласованности (консенсуса), так, например, регуляторные последовательности, которые обусловливают разрешенную последовательность акцепторного сайта сплайсинга или промоторный/энхансерный мотив. Например, минилокус содержит часть локуса генома иммуноглобулина, имеющего по меньшей мере одну внутреннюю делецию (т.е. не на конце участка) заменимого участка ДНК (например, интрон или его часть) по сравнению с природным Ι§ локусом зародышевой линии.
Предпочтительные трансгенные и трансхромосомные отличные от человека животные, например мыши, продуцируют значительный спектр иммуноглобулинов, практически в идеале похожий на спектр иммуноглобулинов человека после поправки на объем.
Спектр в идеале приближается к спектру человека после поправки на объем обычно при разнообразии по меньшей мере около 10%, предпочтительно 25-50% или более. В целом получается по меньшей мере тысяча различных иммуноглобулинов (в идеале Ι§0), предпочтительно 104-106 или более в зависимости от числа различных V, I и Ό областей, введенных в геном мыши и управляемых дополнительным разнообразием, вызванным реаранжировками ν-(Ό)-Ι сегментов гена, случайных добавлений в соединяющие области. Как правило, иммуноглобулины проявляют аффинность (Кс) к предварительно выбранным антигенам ниже 10-7 М, такую как аффинность более низкая чем 10-8 М, 10-9 М или 10-10 М или даже ниже.
Трансгенные и трансхромосомные отличные от человека животные, например мыши, описанные выше, могут быть иммунизированы, например, клетками, экспрессирующими СЭ20. Или же, трансгенные животные могут быть иммунизированы ДНК, кодирующей человеческие СЭ20. Животные, которые затем продуцируют В-клетки, которые претерпевают переключение класса путем рекомбинациипереключения (цис-переключение) и экспрессируют иммуноглобулины, реактивные в отношении СЭ20.
- 22 021644
Иммуноглобулины могут представлять собой человеческие антитела (также называемые антитела с последовательностями человеческого происхождения), в которых полипептиды тяжелой и легкой цепей кодируются последовательностями трансгена человеческого происхождения, которые могут включать последовательности, образованные при использовании соматической мутации и рекомбинаторных (рекомбинированных) соединений У области, а также последовательности, кодируемые генами зародышевой линии; эти человеческие антитела можно считать практически идентичными полипептидной последовательности, кодируемой сегментами Уъ и I, или Ун, и 1н генов человеческого происхождения, даже несмотря на то, что в результате соматической мутации и различия У-Ι и У-О-1 рекомбинированных соединяющих частей могут присутствовать другие последовательности незародышевой линии. Вариабельные области каждой цепи антитела, как правило, по меньшей мере на 80% аналогичны сегментам У, I и в случае тяжелых цепей Ό генов зародышевой цепи человеческого происхождения; часто по меньшей мере на 85% аналогичны последовательностям зародышевой линии в трансгене; часто на 90 и 95% аналогичны последовательностям зародышевой линии в трансгене. Однако, так как последовательности нечеловеческой зародышевой линии вводятся соматической мутацией и У1 и УО1 соединением, антитела с последовательностью человеческого происхождения часто будут иметь некоторые последовательности вариабельной области, которые не кодируются сегментами У, Ό или I гена человеческого происхождения, обнаруженными в трансгене(ах) человеческого происхождения в зародышевой линии мышей. Как правило, последовательности не-человеческого происхождения (или отдельные положения нуклеотидов) являются кластером в или около СОК, или в областях, где соматические мутации известны кластеру.
Другой аспект изобретения включает В-клетки трансгенных или трансхромосомных отличных от человека животных по данному описанию. В-клетки можно использовать для получения гибридом, экспрессирующих человеческие моноклональные антитела, которые связываются с высокой аффинностью (например, константа равновесной диссоциации (Кс) ниже 10-7 М) с человеческими СО20. Так, в одном варианте изобретение включает гибридому, которая продуцирует человеческое антитело, имеющее аффинность (Кс) ниже 10-7 М, такую как аффинность более низкая чем 10-8 М, 10-9 М или 10-10 М или даже ниже, если ее определять, анализируя клетки, экспрессирующие СО20, по методу Скэтчарда, используя меченное радиоактивной меткой моноклональное антитело, или определяя полумаксимальную концентрацию связывания, используя РАС8 анализ.
Моноклональные антитела по данному описанию содержат легкую цепь с последовательностью человеческого происхождения, состоящую из (1) вариабельной области легкой цепи, имеющей полипептидную последовательность, практически идентичную полипептидной последовательности, кодируемой генным сегментом Уъ человеческого происхождения и генным сегментом I, человеческого происхождения, и 2) константной области легкой цепи, кодируемой генным сегментом Сь человеческого происхождения, и тяжелую цепь с последовательностью человеческого происхождения, состоящую из (1) вариабельной области тяжелой цепи, имеющей полипептидную последовательность, практически идентичную полипептидной последовательности, кодируемой генным сегментом Ун человеческого происхождения, областью О и генным сегментом 1н человеческого происхождения, и 2) константной области тяжелой цепи, кодируемой генным сегментом Съ человеческого происхождения.
Создание человеческих моноклональных антител с высокой аффинностью против СО20 можно упростить с помощью метода расширения спектра сегментов вариабельной области гена человеческого происхождения в трансгенном отличном от человека животном, имеющем геном, содержащий интегрированный трансген человеческого иммуноглобулина, причем указанный метод включает введение в геном трансгена У гена, содержащий генные сегменты У области, которые отсутствуют в указанном интегрированном трансгене человеческого иммуноглобулина. Часто трансген У области представляет собой искусственную хромосому дрожжей, содержащую часть набора генных сегментов Ун и Уъ (УК) человеческого происхождения, которые могут встречаться в геноме человека или могут быть раздельно вырезаны при сплайсинге вместе методами рекомбинантной ДНК, которые могут включать нестандартные (выпадающие) У-генные сегменты. Часто по меньшей мере пять или более функциональных Угенных сегментов содержится на УАС (искусственных хромосомах дрожжей, и.х.д.). В этом варианте возможно получить трансгенное животное методом расширения У спектра, при этом животное экспрессирует цепь иммуноглобулина, содержащую последовательность вариабельного домена, кодируемую сегментом У-генной области, присутствующим в трангене У области, и С области, кодируемой трансгеном человеческого 1д. С помощью метода расширения У спектра можно получать трансгенные животные, имеющие по меньшей мере 5 различных У генов; а также можно получить животных, содержащих по меньшей мере около 24 У генов. Некоторые У-генные сегменты могут быть нефункциональными (например, псевдогены и т.п.); эти сегменты, если требуется, можно сохранять или можно селективно делетировать (удалять) методами рекомбинантной ДНК, доступными специалистам в данной области техники.
Когда методом рекомбинантной ДНК мышиная последовательность зародышевой линии создана таким образом, чтобы содержать функциональную УАС, имеющую расширенный спектр У сегментов, практически отсутствующих в трансгене человеческого 1д, содержащем I и С генные сегменты, признак можно размножить и развести в других генетических средах, включая среды, в которых функциональ- 23 021644 ные УАС, имеющие расширенный спектр V сегментов, введены в зародышевую линию отличного от человека животного, имеющую трансген другого человеческого 1д. Многие функциональные УАС, имеющие расширенный спектр V сегментов, можно ввести в зародышевую линию для работы с трансгеном человеческого 1д (или многими трансгенами человеческих 1д). Хотя такие трансгены в данном описании называются УАС трансгенами, такие трансгены, будучи интегрированы в геном, могут практически утратить последовательности дрожжей, такие как последовательности, требуемые для автономной репликации в дрожжах; такие последовательности могут, необязательно, быть удалены методом рекомбинантной ДНК (например, рестрикцией при гидролизе и гель-электрофорезом в пульсирующем электрическом поле или другим подходящим методом) после репликации в дрожжах, они более не нужны (например, перед введением в мышиную клетку Εδ или мышиный фагоцит). Методы распространения признака экспрессии иммуноглобулина с последовательностями человеческого происхождения включают разведение трансгенного животного, имеющего трансген(-ы) человеческого 1д, и, необязательно, также имеющего функциональную УАС с расширенным спектром V сегментов. Как νΗ, так и ν7 генные сегменты могут присутствовать на УАС. Трансгенное животное можно разводить в любой (генной) среде, нужной практику, включая среды, содержащие другие трансгены человеческого происхождения, включающие трансгены человеческих 1д и/или трансгены, кодирующие другие белки человеческих лимфоцитов. Изобретение также включает высокоаффинный иммуноглобулин с последовательностью человеческого происхождения, продуцируемый трансгенной мышью, имеющей трансген с УАС, содержащей расширенный спектр V области. Хотя вышесказанное описывает предпочтительный вариант трансгенного животного по изобретению, рассматриваются другие варианты изобретения, которые делятся на три класса:
I) трансгенные животные, содержащие трансген иммуноглобулина с нереаранжированной тяжелой и реаранжированной легкой цепью;
II) трансгенные животные, содержащие трансген иммуноглобулина с нереаранжированной тяжелой и нереаранжированной легкой цепью;
III) трансгенные животные, содержащие трансген иммуноглобулина с реаранжированной тяжелой и нереаранжированной легкой цепью.
Порядок предпочтительности этих классов (категорий) трансгенного животного следующий: ИМИ, где гены с эндогенной легкой цепью (или, по меньшей мере, К ген) нокаутированы с помощью гомологичной рекомбинации (или другим методом), и ИМИ, где гены с эндогенной легкой цепью не нокаутированы и должны быть доминирующими при использовании аллельного исключения.
III. Биспецифические/полиспецифические молекулы, связывающиеся с СЭ20.
Еще в одном варианте изобретения человеческие моноклональные антитела к ί'.Ό20 могут быть дериватизированы или связаны с другой функциональной молекулой, например другим пептидом или белком (например, с РаЬ' фрагментом) с образованием биспецифической или полиспецифической молекулы, которая связывается со многими сайтами связывания или эпитопами-мишенями. Например, антитело по изобретению может быть функционально связано (например, химической связью, генетического слияния (гибридизации), нековалентной ассоциацией или иным способом) с одной или более связующих молекул, таких как другое антитело, пептид или связующий миметик.
Соответственно настоящее изобретение включает биспецифические и полиспецифические молекулы, содержащие по меньшей мере одну специфичность связывания с ί'.Ό20 и вторую специфичность связывания со вторым эпитопом-мишенью. В особом варианте изобретения вторым нацеленным эпитопом (эпитопом-мишенью) является Рс-рецептор, человеческий РсуК1 (СЭ64) рецептор или человеческий Рса рецептор (СП89), или Т-клеточный рецептор, например СЭ3. Следовательно, изобретение включает биспецифические и полиспецифические молекулы, способные связываться с эффекторными клетками, экспрессирующими как РсуК, РсаК, так и РскК (например, моноцитами, макрофагами или полиморфонуклеарами (ΡΜΝ)) и с клетками-мишенями, экспрессирующими СЭ20. Эти биспецифические и полиспецифические молекулы нацеливают клетки, экспрессирующие СЭ20, на эффекторную клетку и, подобно человеческим моноклональным антителам по изобретению, включают активности эффекторных клеток, опосредованные Рс-рецептором, такие как фагоцитоз клеток, экспрессирующих СЭ20, антителозависимая клеточная цитотоксичность (АЭСС), высвобождение цитокинов или образование аниона супероксида.
Далее, биспецифические и полиспецифические молекулы по изобретению могут включать третью специфичность связывания, помимо анти-Рс специфичности связывания и анти-СО20 специфичности связывания. В одном варианте изобретения третья специфичность связывания представляет собой участок (часть) фактора противоусиления (апР-епНапсетеШ) (ЕР), например молекула, которая связывается с поверхностным белком, включена в цитотоксическую активность и тем самым повышает иммунный ответ на клетку-мишень. Участком (частью) фактора противоусиления (апБ-епЪапсетеп!) (ЕР) может быть антитело, функциональный фрагмент антитела или лиганд, который связывается с данной молекулой, например антиген или рецептор, и тем самым приводит к усилению влияния детерминант связывания на Рс-рецептор или антиген клетки-мишени. Участок фактора противоусиления может связываться с объектом, отличным от объекта, с которым связываются первая и вторая специфичности. Например,
- 24 021644 участок связывания может связывать цитотоксическую Т-клетку (например, через СЭ2, СЭ3, СЭ8, СЭ28, СЭ4, СЭ40, 1САМ-1 или другая иммунная клетка, которая приводит к повышенному иммунному ответу против клетки-мишени).
В одном варианте изобретения биспецифические и полиспецифические молекулы по изобретению содержат в качестве специфичности связывания по меньшей мере одно антитело, включая РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')2, Ρν или одноцепочечный Ρν. Антитело также может димером легкой или тяжелой цепи или его минимальным фрагментом, таким как Ρν, или одноцепочечной конструкцией, описанной Ьабиег е1 а1. в патенте США 4946778. Антитело может также быть химерным белком связывающего домена иммуноглобулина, описанного в патентных заявках США 2003/0118592 и 2003/0133939.
В одном варианте изобретения биспецифические и моноспецифические молекулы по изобретению содержат специфичность связывания с РсуК или РсаК на поверхности эффекторной клетки, а вторая специфичность связывания с антигеном клетки-мишени, например СЭ20.
В одном варианте изобретения специфичность связывания с Рс-рецептором обеспечивается человеческим моноклональным антителом, связывание которого не блокируется человеческим иммуноглобулином О (Ι§Ο). Применяемый в данном описании термин 1дО рецептор относится к любому из восьми генов γ-цепи, локализованных на хромосоме 1. Эти гены кодируют всего двенадцать изоформ мембранных или растворимых рецепторов, которые группируются в три класса Ρсγ рецепторов: ΡсγКI (СИ64), ΡсγКII (СР32) и ΡсγКIII (СЭ 16). В одном предпочтительном варианте изобретения Ρсγ представляет собой человеческий высокоаффинный ΡсγКI.
Продуцирование и характеристика этих предпочтительных моноклональных антител описаны Раидег е1 а1. в Международной заявке νΟ 88/00052 и в патенте США 4954617. Эти антитела связываются с эпитопом ΡсγКI, ΡсγКII и ΡсγКШ в сайте, который отличен от сайта связывания Ρсγ рецептора, и, таким образом, их связывание практически не блокируется физиологическими уровнями 1§О. Специфическими антителами против ΡсγКI, применимыми по данному изобретению, являются тАЬ 22, тАЬ 32, тАЬ 44, тАЬ 62 и тАЬ 197. В других вариантах изобретения анти-Р^ рецепторное антитело представляет собой гуманизированную форму моноклонального антитела 22 (Н22).
Продуцирование и характеристика антитела Н22 описано в ОпШапо, К.Р. е1 а1. (1995) I. 1ттипо1 155 (10): 4996-5002 и в Международной заявке νΟ 94/10332. Клеточная линия, продуцирующая Н22 антитело, депонирована в Американской коллекции типовых клеточных культур 4 ноября 1992 г. под названием НА022СШ и имеет №. СКЬ 11177.
В других предпочтительных вариантах изобретения специфичность связывания с Рс-рецептором обеспечивается антителом, которое связывается с рецептором человеческого 1дА, например с Рс-α рецептором (РсаК1 (СИ89)), связывание которого предпочтительно не блокируется человеческим иммуноглобулином А (1дА). Предполагается, что термин 1дА рецептор включает генный продукт α-гена (РсаК1), локализованный на хромосоме 19. Известно, что этот ген кодирует несколько альтернативно вырезанных при сплайсинге трансмембранных изоформ от 55 до 110 кДа. РсаК1 (СИ89) конститутивно экспрессируется на моноцитах/макрофагах, эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитах, но не на популяции не-эффекторных клеток. РсаК1 имеет аффинность среды как в отношении 1дА1, так и в отношении 1дА2, которая повышается при экспозиции с цитокинами, такими как О-С8Р или ОМ-С8Р (Мойоп, Н.С. е1 а1. (1996) СпЬса1 Ке\ае\\ъ ίη 1ттипо1оду 16:423-440). Четыре РсаК1-специфических моноклональных антитела, идентифицированные как А3, А59, А62 и А77, связывают РсаК1 вне лигандсвязывающего домена 1дА, описаны МоПеио, К.С. е1 а1. (1992) I. 1ттипо1. 148:1764.
РсаК1 и ΡсγКI являются предпочтительными триггерными рецепторами для применения по изобретению, так как они (1) экспрессируются первично на иммунных эффекторных клетках; (2) экспрессируются с высокими уровнями (например, 5000-1000000 на клетку); (3) являются медиаторами цитотоксических активностей (например, АЭСС, фагоцитоза); (4) опосредуют повышенную антигенную презентацию антигенов, включая аутоантигены, нацеленные на них.
В другом варианте изобретения биспецифическая молекула составлена двумя моноклональными антителами по изобретению, которые имеют комплементарные функциональные активности, так что одно антитело преимущественно работает, индуцируя СЭС, а другое антитело преимущественно работает, индуцируя апоптоз, например, 2Р2 в комбинации с 11В8.
В других вариантах изобретения биспецифические и полиспецифические молекулы по изобретению дополнительно содержат активность связывания, которая распознает антиген клетки-мишени, например связывается с антигеном клетки-мишени, например, с СЭ20. В предпочтительном варианте изобретения специфичность связывания обеспечивается с помощью человеческого моноклонального антитела по данному изобретению.
Выражение специфическое антитело эффекторной клетки по данному описанию относится к антителу или функциональному фрагменту антитела, которые связываются с эффекторными клетками. Предпочтительные антитела для применения в качестве предмета изобретения связываются с эффекторными клетками по сайту, который не связан эндогенным иммуноглобулином.
Применяемый в данном описании термин эффекторная клетка относится к иммунной клетке, ко- 25 021644 торая участвует в эффекторной фазе иммунного ответа, в противоположность когнитивной фазе и фазе активации иммунного ответа. Примеры иммунных клеток включают клетки миелоидного или лимфоидного происхождения, например лимфоциты (например, В-клетки и Т-клетки, включая цитолитические Тклетки (СТЬ), киллерные клетки, природные клетки-киллеры, макрофаги, моноциты, эозинофилы, нейтрофилы, полиморфонуклеары, гранулоциты, тучные клетки и базофилы. Некоторые эффекторные клетки экспрессируют специфические Рс-рецепторы и выполняют иммунные функции. В предпочтительных вариантах изобретения эффекторная клетка способна индуцировать антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС), например нейтрофил, способный индуцировать АЭСС. Например, моноциты, макрофаги, которые экспрессируют РсК, участвуют в (включены) в специфическом киллинге клетокмишеней и презентации антигенов другим компонентам иммунной системы или в связывании с клетками, которые содержат (презентируют) антигены. В других вариантах изобретения эффекторная клетка может фагоцитировать нацеленный антиген, клетку-мишень или микроорганизм. Экспрессия конкретного РсК на эффекторной клетке может регулироваться гуморальными факторами, такими как цитокины. Найдено, например, что экспрессия РсуК1 позитивно регулируется интерфероном гамма (ΙΡΝ-γ). Эта повышенная экспрессия повышает цитотоксическую активность РсγКI-несущих клеток против мишеней. Эффекторная клетка может фагоцитировать или лизировать антиген-мишень или клетку-мишень.
Термин клетка-мишень должен означать любую нежелательную клетку субъекта (например, человека или животного), которая может быть целью композиции (например, моноклонального антитела, биспецифической или полиспецифической молекулы) по изобретению. В предпочтительных вариантах изобретения клетка-мишень представляет собой клетку, экспрессирующую или сверхэкспрессирующую ί'.Ό20. Клетки, экспрессирующие СЭ20, как правило, включают В-клетки и В-клеточные опухоли.
Хотя предпочтительными являются человеческие моноклональные антитела, в биспецифических и моноспецифических молекулах по данному изобретению могут использоваться другие антитела, а именно мышиные, химерные и гуманизированные моноклональные антитела. Такие мышиные, химерные и гуманизированные моноклональные антитела можно получать известными в технике методами.
Биспецифические и полиспецифические молекулы по настоящему изобретению можно получать химическими методами (см., например, Ό.Μ. Клан/ βί а1. (1981) Ргос. Ναίΐ. Асаб. 8сг И8А 78:5807), методами полидома (см. патент США 4474893, выданный Кеабшд) или методами рекомбинантной ДНК.
В частности, биспецифические и моноспецифические молекулы по данному изобретению можно получать конъюгацией компонентов специфичностей связывания, например специфичностей связывания против РсК и ί'.Ό20, применяя методы, известные в технике и описанные в примерах в данном описании. Например, каждую специфичность связывания биспецифической и полиспецифической молекулы можно получать отдельно, а затем конъюгировать друг с другом. Когда специфичности связывания представляют собой белки или пептиды, для ковалентной конъюгации можно использовать множество линкеров и сшивающих агентов. Примеры сшивающих агентов включают протеин А, карбодиимид, Ν-сукцинимидил-8-ацетилтиоацетат (8АТА), 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойную кислоту) (ΌΤΝΒ), о-фенилендималеинимид (οΡΌΜ), ^сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)пропионат (8ΡΌΡ) и сульфосукцинимидинил 4-Щ-малеинимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-8МСС) (см., например, Капюухку с1 а1. (1984) I. Ехр. Меб. 160:1686; Ьш, М.А. βί а1. (1985) Ргос. Νηΐΐ. Асаб. 8сг И8А 82:8648). Другие методы включают методы, описанные Раи1и8 (ВеЬгшд Ιηδ. Мш. (1985) Νο. 78, 118-132); Вгеппап е1 а1. (8аепсе (1985) 229:81-83) и О1е1нйе еί а1. (I. Iттиηο1. (1987) 139: 2367-2375). Предпочтительными конъюгирующими агентами являются 8АТА и сульфо-8МСС, оба выпускаются Рьегсе СЬешюа1 Οο. (КοскΓο^б. Ш).
Если специфичности связывания представляют собой антитела, их можно конъюгировать с помощью связывания сульфгидрильных групп С-концевых шарнирных областей двух тяжелых цепей. В особенно предпочтительном варианте изобретения шарнирная область модифицирована таким образом, чтобы пред конъюгацией содержать нечетное число сульфгидрильных остатков, предпочтительно один.
Или же, обе специфичности связывания можно кодировать в одном и том же векторе и экспрессировать в той же самой клетке-хозяине. Этот метод особенно применим в тех случаях, когда биспецифическая и полиспецифическая молекула представляет собой шАЬхшАЬ, тАЬхРаЬ, РаЬхР(аЬ')2 или лигандхРаЬ химерный белок. Биспецифическая и полиспецифическая молекула по изобретению, например бисецифическая молекула, может быть одноцепочечной молекулой, такой как одноцепочечное биспецифическое антитело, одноцепочечная биспецифическая молекула, содержащая две детерминанты связывания. Биспецифические и полиспецифические молекулы могут также представлять собой одноцепочечные молекулы или, по меньшей мере, могут содержать по меньшей мере две одноцепочечные молекулы. Методы получения би- и полиспецифических молекул описаны, например, в патентах США 5260203;5455030;4881175;5132405;5091513; 5476786; 5013653; 5258498 и 5482858.
Связывание биспецифических и полиспецифических молекул с их специфическими мишенями можно подтвердить твердофазным иммуноферментным анализом (ЕЫ8А), радиоиммуноанализом (К1А), анализом РАС8, биоанализом (например, ингибированием роста) или вестерн-блоттингом. Каждый из этих анализов, как правило, обнаруживает присутствие комплексов белок-антитело, представляющих особый интерес, с помощью меченого реагента (например, антитела), специфического в отношении
- 26 021644 представляющего интерес комплекса. Например, комплексы РсК-антитело можно обнаружить, используя, например, антитело, связанное с ферментом, или фрагмент антитела, который распознает и специфически связывается с комплексами антитело-РсК. Или же, комплексы можно обнаруживать, используя любой из множества других иммуноанализов. Например, антитело можно метить радиоактивной меткой и использовать в радиоиммуноанализе (МА) (см., например, УешкаиЬ, В., Рппс1р1ек оГ Кайюипишпоаккаук, 8еуеп1Ь Тгштпд Соигке оп КайюЬдапй Аккау ТесЬпкщек, ТЬе Епйосппе 8ос1е1у, МагсЬ, 1986). Радиоактивный изотоп можно обнаружить такими способами, как применение счетчика γ-излучения или сцинтилляционного счетчика, или ауторадиографии.
IV. Иммуноконъюгаты.
В другом аспекте настоящее изобретение включает человеческое моноклональное антитело против СЭ20, конъюгированное с терапевтической частицей, такой как цитотоксин, лекарственным веществом (например, иммуносупрессором) или радиоизотопом. Такие конъюгаты называются в данном описании иммуноконъюгатами. Иммуноконъюгаты, которые включают один или более цитотоксинов, называются иммунотоксинами. Цитотоксин или цитотоксический агент включает любой агент, который является вредным для клеток (например, убивает клетки). Примеры включают таксол, цитохалазин В, грамицидин Ό, этидия бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин Ό, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи.
Подходящие терапевтические агенты для образования иммуноконъюгатов по изобретению включают, но без ограничения, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, флюдарабин, 5-флуорурацил декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, Шюера, хлорамбуцил, мельфалан, кармустин (Β8Νυ) и ломустин (СС.%и), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлордиамин платина (II) (ΌΌΡ), цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (прежнее название дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (прежнее название актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС)) и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин). В предпочтительном варианте изобретения терапевтический агент представляет собой цитотоксический агент или радиотоксический агент. В другом варианте изобретения терапевтическим агентом является иммуносупрессор. Еще в одном варианте изобретения терапевтическим агентом является СМ-С8Р. В предпочтительном варианте изобретения терапевтическим агентом является доксорубицин, цисплатин, блеомицин, сульфат, кармустин, хлорамбуцил, циклофосфамид или рицин А.
Антитела по данному изобретению также могут быть конъюгированы с радиоизотопом, например, таким как йод-131, иттрий-111, для получения цитотоксических радиофармацевтических средств для лечения нарушения, связанного с СЭ20, такого как рак. Конъюгаты антител по изобретению можно использовать для модификации данного биологического ответа, а долю лекарственного вещества не следует конструировать как ограничивающуюся классическими химическими терапевтическими агентами. Например, доля (элемент, частица, фрагмент) лекарственного вещества может представлять собой белок или полипептид, обладающий заданной биологической активностью. Такие белки могут включать, например, ферментативно активный токсин или его активный фрагмент, такой как абрин, рицин А, экзотоксин псевдомонад или дифтерийный токсин; белок, такой как фактор некроза опухолевых клеток или интерферон-γ; или модификаторы биологического ответа, например, такие как лимфокины, интерлейкин1 (!Е-1), интерлейкин-2 (!Е-2), интерлейкин-6 ('ΊΕ-6), гранолоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (СР-С8Р), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (С-С8Р) или другие факторы роста.
Методы конъюгирования такого терапевтического фрагмента с антителами хорошо известны, см., например, Атоп е1 а1., Мопос1опа1 АпЬЬоШек Рог НтпипоЕндеЬпд ОГ Игадк Ш Сапсег ТЬегару, в Мопос1опа1 АпЬЬоШек Апй Сапсег ТЬегару, Ке1кГе1й е! а1. (ейк.), р. 243-56 (А1ап К. Ыкк, Шс. 1985), Не11ккот е! а1., АпкЬоФек Рог Игад Иекуегу, в Сопко11ей Игад Иекуегу (2пй Ей.), КоЫпкоп е! а1. (ейк.), р. 623-53 (Магсе1 Иеккег, Ею. 1987); ТЬогре, АпкЬойу Сатегк ОГ СуЮЮхю Адеп!к ш Сапсег ТЬегару: А Кеу1е\у, в Мопос1опа1 АпкЬоФек '84: Вю1одюа1 Апй СЬтса1 АррЬсакопк, РшсЬега е! а1. (ейк.), р. 475-506 (1985); Апа1укк, Кеки1!к, Апй Ри!иге Ргокрескуе ОГ ТЬе ТЬегареикс Ике ОГ Кайю1аЬе1ей АпкЬойу Ш Сапсег ТЬегару, в Мопос1опа1 АпкЬоФек Рог Сапсег Иекскоп Апй ТЬегару, Ва1й\ут е! а1. (ейк.), р. 303-16 (Асайетю Ргекк 1985) и ТЬогре е! а1., ТЬе Ргерагакоп Апй СуЮЮхю Ргорегкек ОГ АпкЬойу-Тохш Соп)ида!ек, Iттипо1. Кеу., 62:119-58(1982).
Еще в одном варианте человеческие моноклональные антитела по изобретению присоединены к линкеру-хелатору, например тиуксетану, который способствует конъюгации антитела с радиоизотопом.
- 27 021644
V. Фармацевтические композиции.
В другом аспекте настоящее изобретение включает композицию, например фармацевтическую композицию, содержащую одно или комбинацию человеческих моноклональных антител по настоящему изобретению. Фармацевтические композиции можно готовить с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, а также с другими известными адъювантами и эксципиентами обычными методами, такими как методы, описанные в РепипдЮп: ТЬе 8с1епсе апД РгасДсе οί РЬагтасу, 1911' ЕДйюп, Оеппаго, ЕД., Маск РиЬШЫпд Со., Еа§1оп, РА, 1995. В одном варианте изобретения композиции включают комбинацию нескольких (например, двух или более) выделенных человеческих антител по изобретению, которые действуют по различным механизмам, например одно антитело, которое действует, преимущественно индуцируя СЭС, в комбинации с другим антителом, которое действует, преимущественно индуцируя апоптоз.
Фармацевтические композиции по изобретению можно также применять в комбинированной терапии, т.е. комбинировать с другими агентами. Например, комбинированная терапия может включать композицию по настоящему изобретению по меньшей мере с одним противовоспалительным агентом и по меньшей мере с одним иммунодепрессантом. В одном варианте изобретения такие терапевтические агенты включают один или более противовоспалительных агентов, таких как стероидные лекарственные средства или НСПВС (нестероидные противовоспалительные средства). Предпочтительные агенты включают, например, аспирин и другие салицилаты, Сох-2 ингибиторы, такие как рофекоксиб (νίοχχ) и целекоксиб (Се1еЬгех), НСПВС, такие как ибупрофен (ΜοΙππ, АДуД), фенопрофен (налфон), напрофен (напросин), сулиндак (клинорил), диклофенак (вольтарен), пироксикам (фелден), кетопрофен (орудис), дифлунизал (долобид), набуметон (релафен), этодолак (лодин), оксапрозин (дайпро) и индометацин (индоцин).
В другом варианте изобретения такие терапевтические агенты включают одно или более модифицирующих заболевание противоревматических лекарственных средств (ΌΜΑΚΟ), таких как метотрексат (ревматрекс), гидроксихлорокин (плакенил,), сульфасалазин (асульфидин), ингибиторы синтеза пиримидина, например лефлуномид (Арава), блокаторы 1Ь-1 рецептора, например анакинра (кинерет), и блокаторы ЮТ-а, например этанерсепт (энбрел), инфликсимаб (ремикад) и адалимумаб.
В другом варианте изобретения такие агенты включают один или более иммунодепрессантов, таких как циклоспорин (сандиммун, неорал) и азатиоприн (имирал).
В другом варианте изобретения такие терапевтические агенты включают один или более химиотерапевтических агентов, таких как доксорубицин (адриамицин), цисплатин (платинол), блеомицин (бленоксан), кармустин (глиадел), циклофосфамид (цитоксан, процитокс, неосар) и хлорамбуцил (леукеран).
В одном варианте человеческие антитела по данному изобретению могут вводиться в комбинации с хлорамбуцилом и преднизолоном; циклофосфамидом; винкристином; доксорубицином и преднизоном; флударабином и антрациклином или в комбинации с другими обычными схемами полилекарственной терапии для N40, такими, которые описаны, например, в Nοη-ΗοДдк^η'δ кутр1юит: Мактд хепхе οί ^^адηοδ^δ, ТгеаПпепГ апД 0р1ю1Ъ, Γογηιπβ; .ЮЬщЮп, 1999, 0'КеШу апД ΑδδοατΚδ, 1пс.
Еще в одном варианте изобретения человеческие антитела можно вводить в сочетании с лучевой терапией и/или с аутотрансплантацией периферических стволовых клеток или костного мозга.
Еще в одном варианте изобретения человеческие антитела можно вводить в комбинации с одним или более антител, выбранных из антител против СЭ25, антител против СЭ19, антител против СЭ21, антител против СЭ22, антител против СЭ37, антител против СЭ38, антител против 1Ь6К, антител против 1Ь8, антител против 1Ь15, антител против 1Ь15К, антител против СЭ4, антител против СГО11а (например, эфализумаб), антител против альфа-4/бета-1 интегрина (νΕΑ4) (например, натализумаб), и СТЬА4-1д.
В особом варианте изобретения человеческие моноклональные антитела вводят в комбинации с антителом против С.ГО25 для лечения буллезного пемфигоида, например, у больных гомологичной болезнью.
В другом особом варианте изобретения человеческие моноклональные антитела вводят в комбинации с одним или более антител, выбранных из антител против СЭ19, антител против СЭ21, антител против СЭ22, антител против С.ГО37 и антител против С.ГО38 для лечения злокачественных опухолей.
Еще в одном варианте изобретения человеческие антитела вводят в комбинации с одним или более антител, выбранных из антител против 1Ь6К, антител против 1Ь8, антител против 1Ь15, антител против 1Ь15К, антител против СЭ4, антител против СГО11а (например, эфализумаб), антител против альфа4/бета-1 интегрина (νΕΑ4) (например, натализумаб), и СТЬА4-1§ для лечения воспалительных заболеваний.
Еще в одном варианте изобретения человеческие антитела можно вводить в комбинации с антителом против С-С3Ь(1) для повышения активации комплемента.
Применяемое в данном описании выражение фармацевтически приемлемый носитель включает любой из перечисленных ниже и все перечисленные ниже физиологически совместимые растворители, дисперсионные среды, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и снижающие всасывание агенты и т.п. Предпочтительно носитель пригоден для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, с помощью инъек- 28 021644 ции или вливания (инфузии)). В зависимости от способа введения активное соединение, т.е. антитело, биспецифическая и полиспецифическая молекула могут быть покрыты оболочкой, чтобы защитить соединение от действия кислот и других естественных условий, которые могут инактивировать соединение.
Выражение фармацевтически приемлемая соль относится к соли, которая сохраняет заданную биологическую активность исходного соединения и не имеет никакого нежелательного токсикологического действия (см., например, Вегде, Б.М. е1 а1. (1977) ί. Ркагт. Бс1. 66:1-19). Примеры таких солей включают соли присоединения кислоты и соли присоединения основания. Соли присоединения кислоты включают соли, образованные присоединением нетоксических неорганических кислот, таких как хлористо-водородная, азотная фосфорная, серная, бромисто-водородная, йодисто-водородная, фосфорная и т.п., а также нетоксических органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, ароматические сульфокислоты и т.п. Соли присоединения основания включают соли, образованные присоединением оснований щелочных и щелочно-земельных металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и т.п., а также нетоксических органических аминов, таких как Ν,Ν'-диметилэтилендиамин, Νметилглюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и т.п.
Композицию по данному изобретению можно вводить различными методами, известными в технике. Как понятно специалисту в данной области техники, путь и/или способ введения меняется в зависимости от желаемого результата. Активные соединения можно приготовить с носителями, которые предохраняют соединение от быстрого высвобождения, как в препарате пролонгированного действия (с регулируемым выделением), включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как сополимер этилена-винилацетата, полиангидриды, полигликолевую кислоту, коллаген, полиортоэфиры и полимолочную кислоту. Методы приготовления таких препаратов хорошо известны специалистам в данной области техники; см., например, БикйшеД апД Соп1го11еД Ре1еаке Эгид ОеПуегу Бук1етк, !Р. РоЪшкоп, еД., Магсе1 Эеккег. 1пс., Νον Уогк, 1978.
Для введения соединения по изобретению определенными методами может быть необходимо покрыть соединение оболочкой из материала, предупреждающего инактивирование, или вводить соединение одновременно с этим материалом. Например, соединение можно вводить субъекту в подходящем носителе, например в липосомах, или в разбавителе. Фармацевтически приемлемые разбавители включают физиологический солевой раствор и водные буферные растворы. Липосомы включают эмульсии ССР вода-в-масле-в-воде, а также обычные липосомы (Б1ге_|ап е1 а1. (1984) ί. йеигойптипок 7:27).
Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии или стерильные порошки для немедленного приготовления стерильных инъецируемых растворов или дисперсии. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ известно в технике. Рассматривается применение в фармацевтических композициях по изобретению любых обычных сред или агентов, за исключением тех, которые несовместимы с активным компонентом. В композиции могут вводиться активные добавки.
Терапевтические композиции, как правило, должны быть стерильны и устойчивы в условиях производства и хранения. Композицию можно готовить в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, пригодной для высоких концентраций лекарственного вещества. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Может сохраняться соответствующая текучесть, например, с помощью покрытия, такого как лецитин, путем сохранения требуемого гранулометрического состава в случае дисперсии и с помощью поверхностно-активных веществ. Во многих случаях предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например сахара, полиолы, такие как маннит, сорбит, или хлористый натрий. Пролонгированное всасывание инъецированных композиций можно вызвать, включая в композицию агент, который замедляет всасывание, например, солей-моностеаратов и желатина.
Стерильные растворы для инъекций можно приготовить, вводя в случае необходимости активное соединение в требуемом количестве в подходящем растворителе с одним из ингредиентов или с комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, с последующей стерилизационной микрофильтрацией. Как правило, дисперсии получают, вводя активное соединение в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие нужные ингредиенты, выбранные из вышеперечисленных. В случае применения стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными методами приготовления являются вакуумная сушка и лиофилизация (сушка в замороженном состоянии), которые дают порошок активного ингредиента плюс любого нужного ингредиента из их раствора, предварительно очищенного стерилизационной микрофильтрацией.
Схемы приема доз корректируют таким образом, чтобы обеспечить оптимальную нужную реакцию (например, терапевтическую реакцию). Например, можно вводить единичный болюс, можно вводить несколько раздельных доз во времени или дозу можно пропорционально снизить или повысить в соответствии с ситуациями, неожиданно возникающими при лечении. Особенно предпочтительными являют- 29 021644 ся парентеральные композиции, приготовленные в виде стандартной лекарственной формы, облегчающей введение и способствующие однородности лекарственной формы. Выражение стандартная лекарственная форма (доза) по данному описанию относится к физически дискретным единицам лекарственной формы для проходящих лечения субъектов; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, вычисленное исходя из того, что требуется получить заданный терапевтический эффект в сочетании с нужным фармацевтическим носителем. Технические условия для стандартных лекарственных форм по изобретению диктуются или непосредственно зависят от (а) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, который требуется достичь, и (б) ограничений, свойственных технике приготовления препарата из такого активного соединения, для лечения чувствительности у индивидуума.
Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, цистеин гидрохлорид, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и т.п.; (2) маслорастворимые антиоксиданты, такие как алкорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ИНТ), лецитин, пропилгаллат, альфатокоферол и т.п.; и (3) агенты, хелатирующие металлы, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЕБТА), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и т.п.
Для терапевтических композиций препараты по настоящему изобретению включают такие препараты, которые пригодны для перорального, назального, местного (включая трансбуккальное и подъязычное), ректальное, вагинальное и/или парентеральное применение. Препараты могут обычно находиться в виде стандартных лекарственных форм (в виде унифицированных доз) и могут быть приготовлены любыми методами, известными в технике фармации. Количество активного ингредиента, которое можно объединять с материалом носителя для получения стандартной лекарственной формы, в значительной мере зависит от субъекта, проходящего лечение и конкретного способа применения. Количество активного ингредиента, которое можно объединять с материалом носителя для получения стандартной лекарственной формы, как правило, таково, чтобы композиция вызывала терапевтический эффект. Как правило, если исходить из ста процентов, это количество находится в интервале примерно 0.01-95% активного ингредиента, предпочтительно около 0.1-70%, наиболее предпочтительно около 1-30%.
Препараты по настоящему изобретению, пригодные для вагинального применения, включают также пессарии, тампоны, кремы, гели, пасты, пены или препараты в виде спрея, содержащие такие носители, которые, как известно в технике, являются подходящими. Лекарственные формы композиций по данному изобретению для местного или трансдермального применения включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и летучие препараты для ингаляций. Активное соединение можно смешивать в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и с любыми требующимися консервантами, буферами или диспергаторами.
Выражения парентеральное введение (применение) и применяемый парентерально по данному описанию означают способы введения (применения), иные, нежели энтеральный и местный, обычно с помощью инъекции, и включает, без ограничения, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, подоболочечную, интракапсулярную, интраорбитальную, интракардиальную, интрадермальную, интраперитонеальную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, интраартикулярную, субкапсулярную, субарахноидную, интраспинальную, эпидуральную и интрастернальную инъекции и инфузию.
Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые можно применять в фармацевтических композициях по изобретению, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические эфиры, такие как этилолеат. Должна сохраняться подходящая текучесть, например, за счет использования материалов для покрытия, таких как лецитин, с помощью сохранения гранулометрического состава в случае дисперсий и за счет использования поверхностно-активных вещества.
Эти композиции также могут содержать адъюванты, такие как консерванты, увлажняющие средства, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Предупреждение присутствия микроорганизмов можно обеспечить как с помощью стерилизации, см. выше, так и включением различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Также может быть желательным включить в композиции изотонические агенты, такие как сахара, хлорид натрия и т.п. Кроме того, пролонгированное всасывание фармацевтической формы для инъекций можно осуществить, включая агенты, которые замедляют всасывание, такие как моностеарат алюминия и желатин.
В одном варианте человеческие моноклональные антитела по изобретению вводят в кристаллической форме в виде подкожной инъекции, ср. Υαη§ еί а1. (2003) РNА§, 100(12):6934-6939.
Когда соединения по настоящему изобретению вводят в виде фармацевтических препаратов людям или животным, их можно давать индивидуально или в виде фармацевтической композиции, содержащей, например, 0.01-99.5% (более предпочтительно 0.1-90%) активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
Вне зависимости от выбранного способа применения, соединения по настоящему изобретению, ко- 30 021644 торые могут применяться в соответствующей гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции по настоящему изобретению готовят в фармацевтически приемлемых лекарственных формах обычными методами, известными специалистам в данной области техники.
Действительные уровни доз активных ингредиентов в фармацевтических композициях по настоящему изобретению могут варьироваться таким образом, чтобы получать количество активного ингредиента, эффективное для достижения нужного терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и способа введения, при этом не являясь токсическим для пациента. Выбранный уровень дозы зависит от ряда фармакокинетических факторов, включая активность конкретных применяемых композиций по данному изобретению или их сложного эфира, соли или амида, способ применения, время применения, скорость экскреции конкретного применяемого соединения, продолжительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, применяемые в комбинации с конкретными применяемыми композициями, возраст, пол, вес, состояние, общее состояние здоровья и историю болезни проходящего лечение пациента и другие подобные общеизвестные в медицинской технике факторы.
Врач или ветеринар, имеющий обычный опыт в данной области техники, может легко определить и прописать требуемое эффективное количество фармацевтической композиции. Например, врач или ветеринар может начать с доз соединений по изобретению, применяемых в фармацевтических композициях по изобретению, более низких, чем требуется, для достижения нужного терапевтического эффекта, и постепенно повышать дозу до достижения нужного эффекта. Как правило, подходящей суточной дозой соединения по изобретению является такое количество соединения, которое является самой низкой дозой, эффективной для получения терапевтического эффекта. Такая эффективная доза, как правило, зависит от описанных выше факторов. Предпочтительно, что введение было внутривенным, внутримышечным, интраперитонеальным или подкожным, предпочтительно проксимальное введение в нужное место. Желательно, чтобы эффективную суточную дозу терапевтической композиции можно было вводить в виде двух, трех, четырех, пяти, шести или более субдоз, вводимых раздельно с соответствующими интервалами в течение дня, необязательно в виде стандартной лекарственной формы. Хотя соединение по настоящему изобретению можно вводить индивидуально, предпочтительно его вводить в виде фармацевтического состава (композиции, препарата).
В одном варианте изобретения человеческие моноклональные антитела по изобретению можно вводить с помощью инфузии в еженедельной дозе 10-500 мг/м2, такой как 200-400 мг/м2. Такое введение может быть многократным, например 1-8 раз, как, например, 3-5 раз. Введение можно осуществлять в виде непрерывной инфузии (вливания) в течение 2-24 ч, например в течение 2-12 ч.
В другом варианте изобретения человеческие моноклональные антитела вводят с помощью медленного непрерывного вливания, например, в течение более 24 ч, чтобы уменьшить токсические побочные эффекты.
Еще в одном варианте изобретения человеческие моноклональные антитела вводят в еженедельной дозе 250-2000 мг, например в дозе 300, 500, 700, 1000, 1500 или 2000 мг, до 8 раз, например 4-6 раз. Введение можно осуществлять непрерывным вливанием в течение 2-24 ч, например в течение 2-12 ч. Такую схему при необходимости можно повторить один или более раз, например через 6 или 12 месяцев. Дозировку можно определять или корректировать, измеряя после введения в биологическом образце количество моноклональных антител против СЭ20 в кровотоке, используя антиидиотипические моноклональные антитела, нацеленные на антитела против ί'.Ό20.
Еще в одном варианте изобретения человеческие моноклональные антитела вводят в качестве поддерживающей терапии, например, один раз в неделю в течение 6 месяцев или более.
Еще в одном варианте человеческие моноклональные антитела по изобретению можно вводить по схеме, включающей одно вливание человеческого моноклонального антитела против ί'.Ό20 с последующим вливанием человеческого моноклонального антитела против СЭ20, конъюгированного с радиоизотопом. Схему можно повторить спустя 7-9 дней.
Терапевтические композиции можно вводить с применением медицинских устройств, известных в технике. Например, в предпочтительном варианте изобретения терапевтическую композицию по изобретению можно вводить с помощью безыгольного гиподермического инъектора, такого как устройства, описанные в патентах США 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824; или 4596556. Примеры общеизвестных имплантатов и модулей, применимых в данном изобретении, включают патент США 4487603, в котором описан имплантируемый микроинфузионный насос для распределения медицинского препарата с регулируемой скоростью; патент США 4486194, в котором описано терапевтическое устройство для введения медицинских препаратов через кожу; патент США 4447233, в котором описан медицинский инфузионный насос для доставки медицинского средства с точной скоростью вливания; патент США 4447224, в котором описан имплантируемое инфузионное устройство с переменной скоростью для непрерывной доставки лекарственного вещества; патент США 4439196, в котором описана осмотическая система доставки лекарственного вещества с многокамерными ячейками; и патент США 4475196, в котором описана осмотическая система доставки лекарственного вещества. Специалистам в данной области техники известны многие другие имплантаты, системы доставки и модули.
В некоторых вариантах человеческие моноклональные антитела по изобретению можно пригото- 31 021644 вить таким образом, чтобы гарантировать соответствующее распределение ίη νίνο. Например, гематоэнцефалический барьер (ВВВ) исключает многие высокогидрофильные соединения. Для того чтобы гарантировать, чтобы лекарственные соединения по изобретению проникали (если требуется) через ВВВ, они должны быть приготовлены, например, в липосомах. О методах получения липосом см., например, патенты США 4522811; 5374548; 5399331. Липосомы могут содержать одну или более частиц, которые селективно переносятся (транспортируются) в специфические клетки или органы, тем самым повышается нацеленная доставка лекарственного вещества (см., например, ν.ν. Капабе (1989) ί. СЬп. РЬагтасо1. 29:685). Примеры нацеленных частиц включают фолат или биотин (см., например, патент США 5416016, принадлежащий Ьоте е1 а1.); маннозиды (Όιικζ;·ι\ν;·ι е! а1., (1988) ВюсНет. ВюрНук. Кек. Соттип. 153:1038); антитела (Р.С. ВЦешап е! а1. (1995) ΡΕΒδ Ьей. 357:140; М. О\\шк е! а1. (1995) АпбтюгоЪ Адеп!к СНеиюНюг. 39:180); поверхностно-активный рецептор протеина А (ВЕктое е! а1. (1995) Ат. ί. РЬ.укю1. 1233:134), различные виды которого могут включать рецептуры по изобретению, а также компоненты молекул по изобретению; р120 (ЗсНгеьег е! а1. (1994) I. Βίο1. СЬет. 269:9090); см. также К. Кешапеп; М.Ь. Ьаиккапеп (1994) ΡΕΒδ Ье!!. 346:123; П КШюп; Ι.Ρ Г1б1ег (1994) Iттиηοте!Ьοбк 4:273. В одном варианте изобретения лекарственные соединения по изобретению приготовлены в липосомах (инкапсулированы в липосомы); в более предпочтительном варианте изобретения липосомы включают целевую частицу. В наиболее предпочтительном варианте изобретения лекарственные соединения в липосомах доставляются с помощью болюсной инъекции к месту, проксимально к нужной области, например к месту воспаления или инфекции или к опухоли. Композиция должна быть настолько жидкой, чтобы ее можно было легко набирать в шприц. Она должна быть стабильной в условиях получения и хранения и должна быть защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки.
Еще в одном варианте изобретения человеческие моноклональные антитела по изобретению могут быть приготовлены таким образом, чтобы предупредить или уменьшить их транспорт через плаценту. Это можно сделать методами, известными в технике, например ПЭГированием антител или применением Р(аЪ)2'-фрагментов. Дополнительные ссылки можно сделать на СипшпдЬат-КипЫек С., ΖΗυο Ζ., СпГй!Ь В., Кеепап X. (1992). Β^ο1οд^са1 асШаНек ρο^!^Κ^^^ο1 ^ттиηοд1οЪи1^η тор^дайк. Кек1к1апсе !ο ег^утаНс бед^абаι^οη. ί. Iттиηο1 Мебюбк., 152:177-190 и на Εαπ6οΓ М. (1995) Ма1егпа1-Ге1а1 РапкГег οί ^ттиηοд1οЪи1^ηк, Апп А11егду Ак!Ьта Iттиηο1., 74:279-283. Это особенно важно, когда антитела применяются для лечения или предупреждения повторного самопроизвольного выкидыша.
Терапевтически эффективную дозу для терапии опухоли можно определять с помощью объективных ответов опухоли, который может быть полным или частичным. Полный ответ (СК) опухоли определяется как отсутствие клинических, радиологических или других свидетельств заболевания. Заключение о частичном ответе (РК) делают на основании того, что общий размер опухоли уменьшился более чем на 50%. Среднее время развития (прогрессирования) есть мера, которая характеризует продолжительность объективного ответа опухоли.
Терапевтически эффективная доза в терапии опухолей может также измеряться ее способностью стабилизировать прогрессирование заболевания. Способность соединения подавлять раковое заболевание можно оценивать на животной модельной системе, которая позволяет прогнозировать эффективность лечения человеческих опухолей. Или же, это свойство композиции можно оценивать, изучая способность соединения подавлять рост клеток или апоптоз, с помощью ш νίίτο анализов, известных опытному практику. Терапевтически эффективное количество лекарственного соединения может уменьшить размер опухоли или иным способом ослабить симптомы у субъекта. Рядовой специалист в данной области техники способен определить такие количества на основе таких факторов, как габариты субъекта, симптомы у субъекта и конкретная композиция или конкретный способ, выбранный для применения.
Терапевтически эффективная доза при ревматоидном артрите предпочтительно приводит к улучшению по критериям АСК20 предварительного определения улучшения, более предпочтительно приводит к улучшению по критериям АСК50 предварительного определения улучшения и еще более предпочтительно приводит к улучшению по критериям АСК70 предварительного определения улучшения.
Критерии АСК20 предварительного определения улучшения определяют как: > 20% улучшение показателей: числа болезненных суставов (ТСб) и числа опухших суставов (δΆΤ) и > 20% улучшение 3 из 5 следующих оценок: оценка болевых ощущений пациентом (VΑδ), общая оценка состояния пациентом (VΑδ), общая оценка состояния врачом (VΑδ), самооценка пациентом нетрудоспособности (НАЦ), реагент в острой фазе (СКР или ΕδΒ).
АСК50 и АСК70 определяются таким же способом с улучшениями > 50% и > 70% соответственно. Более подробно см. в Ве^п е! а1. в Атепсап С^Педе οί КЬеитаФШду РгеЬт1пагу ОеГтНюп οί Итргоуетеп! ш КНеитаЮ1б АгбтНк; АгбтНк КЬеитабкт (1995) 38:727-735.
Композиция должна быть стерильной и настолько текучей (жидкой), чтобы композицию можно было набирать в шприц. Помимо воды, носителями могут быть изотонический забуференный солевой раствор, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Должна сохраняться соответствующая текучесть, например, с помощью применения покрытия, такого как лецитин, путем сохранения требуемого гранулометрического состава в случае дис- 32 021644 персии и с помощью применения поверхностно-активного вещества. Во многих случаях предпочтительным является включение в композицию изотонических агентов, например сахаров, полиспиртов, таких как маннит или сорбит, и хлористого натрия. Пролонгированного всасывания инъецированных композиций можно достичь, включая в композицию агент, замедляющий всасывание, например моностеарат алюминия или желатин.
Если активное соединение защищено соответствующим образом, описанным выше, соединение можно применять перорально, например, с инертным разбавителем или с усвояемым съедобным носителем.
Ιν. Применение и способы по изобретению.
Человеческие антитела (включая иммуноконъюгаты, биспецифические/моноспецифические антитела, композиции и другие производные по данному описанию) по данному изобретению имеют многочисленное ш уйго и ш νί\Ό применение в диагностике и терапии, включая диагностику и лечение нарушений, включающих клетки, экспрессирующие ί'.Ό20. Например, антитела можно вводить в клетки в культуре, например, ш уйго и ех У1уо, или человеку, например, ш У1уо для лечения, предупреждения и диагностики ряда нарушений. Предполагается, что применяемый в данном описании термин субъект включает человека и отличное от человека животное, которые вырабатывают иммунный отвечает на человеческие антитела против СЭ20. Предпочтительные субъекты включают больных людей с нарушениями, которые можно корректировать или ослабить путем подавления или контроля В-клеток (нормальных или злокачественных).
Например, в одном варианте изобретения человеческие антитела по настоящему изобретению можно использовать для лечения субъекта с опухолегенным нарушением, например нарушение, характеризующееся присутствием опухолевых клеток, экспрессирующих ί'.Ό20, включая, например, В-клеточную лимфому, например ΝΗΠ Примеры опухолегенных заболеваний, которые можно лечить и/или предупредить, включают В-клеточную лимфому, например МНЬ, включая лейкоз из предшественников В лимфобластных клеток/лимфому и неоплазмы из зрелых В-клеток, например, такие как хронический лимфоцитарный лейкоз из В-клеток (СЬЬ)/малая лимфоцитарная лимфома (8ЬЬ), пролимфоцитарный лейкоз из В-клеток, лимфоплазматическая лимфома, лимфома клеток мантии (ΜίΈ), фолликулярная лимфома (РЬ), включая РЬ низкой степени, средней степени и высокой степени злокачественности, кожная лимфома из клеток фолликулярных центров, В-клеточная лимфома маргинальной зоны ^АЬТ типа, нодального типа и селезенки), волосатоклеточная лейкемия, крупноклеточная диффузная В-клеточная лимфома, лимфома Беркита, плазмацитома, плазмоклеточная миелома, посттрансплантационное лимфопролиферативное заболевание, макроглобулинемия Вальденстрема и анапластическая крупноклеточная лимфома (АЬСЬ).
Другими примерами В-клеточных неходжкинских лимфом являются лимфоматоидный гранулематоз, первичная эффузионная лимфома, интраваскулярная В-клеточная лимфома, медиастинальная крупноклеточная В-клеточная лимфома, заболевания тяжелых цепей (включая γ, μ и α заболевание), лимфомы, вызванные терапией иммунодепрессантами, такими как лимфома, вызванная циклоспорином, и лимфома, вызванная метотрексатом.
В другом варианте человеческие антитела по настоящему изобретению можно использовать для лечения лимфомы Ходжкина.
Примеры нарушений иммунной системы, в которых участвуют В-клетки, экспрессирующие СЭ20, которые можно лечить и/или предупреждать, включают аутоиммунные нарушения, такие как псориаз, псориатический артрит, дерматит, системную склеродерму и склероз, воспалительное заболевание кишечника (ΙΒΌ), болезнь Крона, язвенный колит, респираторный дистресс-синдром, менингит, энцефалит, увеит, гломерулонефрит, экзему, астму, атеросклероз, недостаточность адгезии лейкоцитов, рассеянный склероз, синдром Рейно, синдром Сегрена (Шегрена), ювенильный диабет, болезнь Рейтера, болезнь Бехчета, нефрит с отложениями иммунных комплексов, ЦА нефропатию, ΙμΜ полинейропатию, опосредованную иммунной системой тромбоцитопению, такую как острая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура и хроническая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, гемолитическую анемию, тяжелую псевдопаралитическую миастению, волчаночный нефрит, системную эритематозную волчанку, ревматоидный артрит (РА, РА), диффузный нейродермит, пузырчатка, болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото, гранулематоз Вегенера, синдром Оменна, хроническую почечную недостаточность, острый инфекционный мононуклеоз, ВИЧ и болезни, связанные с вирусом герпеса. Другими примерами является острый респираторный дистресс-синдром и хореоретинит. Кроме того, другие заболевания и нарушения включают те из них, которые вызваны или опосредованы инфицированием В-клеток вирусом, таким как вирус Эпштейн-Барра (ΕΒν).
Другие примеры воспалительных, иммунных и/или аутоиммунных нарушений, в которых важную роль играют антитела и/или избыточная активность В-лимфоцитов и которые можно лечить и/или предупреждать, включают следующие заболевания и нарушения:
васкулитиды и другие сосудистые заболевания, такие как микроскопические полиангииты, синдром Черга-Штрауса и другие ассоциированные с ΑNСΑ васкулитиды, узелковый полиартериит, эссенциальный криоглобулинэмический васкулит, кожный лейкоцитокластический ангиит, болезнь Кавасаки, арте- 33 021644 риит Такаяши, гигантоклеточный артериит, пурпура Геноха-Шенляйна, первичный или изолированный церебральный ангиит, узловая эритема, облитерирующий тромбангиит, тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (включая гемолитический уремический синдром) и вторичные васкулитиды, включая кожный лейкоцитокластический васкулит (например, вторичный, вызванный гепатитом В, гепатитом С, макроглобулинемией Вальденстрема, В-клеточной неоплазией, ревматоидным артритом, синдромом Сегрена (Шегрена) или системным волчаночным эритематозом); другими примерами являются узловая эритема, аллергический васкулит, панникулит, болезнь Вебера-Крисчена, гиперглобулинемическая пурпура и болезнь Бюргера;
кожные заболевания, такие как контактный дерматит, линеарный 1§А-дерматоз, витилиго, гангренозная пиодермия, приобретенный буллезный эпидермолиз, обыкновенная пузырчатка (включая, рубцовый пемфигоид и буллезный пемфигоид), очаговая (гнездная) алопеция (включая универсальную алопецию и полную алопецию), герпетиформный дерматит, многоформная эритема и хроническая аутоиммунная крапивница (включая ангионевротический отек и уртикарный васкулит);
иммунные цитопении, такие как аутоиммунная нейтропения и истинная красно-клеточная аплазия; нарушения соединительных тканей, такие как С№ (ЦНС) волчанка, дискоидная красная волчанка,
СКЕ8Т синдром, смешанная болезнь соединительной ткани, полимиозит/дерматомиозит, миозит телец включения, вторичный амилоидоз, криоглобулинемия типа I и типа II, фибромиалгия, антифосфолипидный синдром, вторичная гемофилия, рецидивирующий полихондрит, саркоидоз, синдром ригидности мышц шеи ревматическая лихорадка; другим примером является эозинофильный фасцит;
артритиды, такие как анкилоизирующий спондилоартрит, ювенильный хронический артрит, болезнь Стилла у взрослых и синдром 8АРНО; другими примерами являются сакроилеит, реактивный артрит, болезнь Стилла и подагра;
гематологические нарушения, такие как гипопластическая анемия, первичная гемолитическая анемия (включая холодовую агглютининовую болезнь), вторичная гемолитическая анемия вследствие СЬЬ или системной красной волчанки; синдром РОКМБ, злокачественная анемия и макроглобулинемическая пурпура Вальденстрема; другими примерами являются агранулоцитоз, аутоиммунная нейтропения, болезнь Франклина, болезнь Зелигманна, болезнь μ-цепи, вторичный паранеопластический синдром вследствие тимомы и лимфом и образование ингибитора фактора VIII;
эндокринопатии, такие как полиэндокринопатия и болезнь Аддисона; другими примерами являются аутоиммунная гипогликемия, аутоиммунный гипотиреоидизм, аутоиммунный инсулиновый синдром, тиреоидит де Кервена и опосредуемая антителом к рецептору инсулина инсулиновая резистентность;
болезни печени и желудочно-кишечного тракта, такие как глютеновая болезнь, болезнь Уиппла, первичный билиарный цирроз, хронический активный гепатит и первичный склерозирующий холангиит; другим примером является аутоиммунный гастрит;
нефропатии, такие как быстро прогрессирующий гломелуронефрит, постстрептококковый гломелуронефрит, синдром Гудпасчера, мембранный гломерулонефрит и криоглобулинемический нефрит; другим примером является болезнь минимальных изменений;
нейрологические нарушения, такие как аутоиммунные нейропатии, множественный мононеврит, миастенический синдром Ламберта-Итона, хорея Сиденгама, сухотка спинного мозга и синдром Г ийенаБарре; другими примерами являются миелопатия/нижний спастический парапарез, тяжелая миастеническая миастения, острая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия и хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия;
сердечные и легочные заболевания, такие как фиброзный альвеолит, облитерирующий бронхиолит, аллергический аспергиллез, муковисцидоз, синдром Леффлера, миокардит и перикардит; другими примерами являются легочная сверхчувствительность и вторичный паранеопластический синдром вследствие рака легкого;
аллергические заболевания, такие как бронхиальная астма и гиперЛдЕ-синдром; другим примером является преходящая слепота;
глазные болезни, такие как идиопатический хориоретинит;
инфекционные заболевания, такие как инфекция парвовирусом В (включая синдром рук-и-носков (Напбк-апб-коскк); и акушерско-гинекологические заболевания, такие как привычный выкидыш, привычная потеря плода и задержка внутриутробного роста; другим примером является вторичный паранеопластический синдром вследствие гинекологических новообразований (опухолей);
нарушение репродуктивной функции у мужчин, такое как вторичный паранеопластический синдром вследствие опухолей яичек; и нарушения, вызванные трансплантацией, такие как отторжение аллотрансплантата и ксенотрансплантата и гомологичная болезнь.
В одном варианте изобретения заболевание является воспалительным, иммунным и/или аутоиммунным заболеванием, выбранным из язвенного колита, болезни Крона, ювенильного диабета, иммунной тромбоцитопении, такой как острая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, и гемолитической анемии (включая аутоиммунную гемолитическую анемию), тяжелой псевдопаралитической миастении,
- 34 021644 системного склероза и обычной пузырчатки.
В другом варианте изобретения антитела по изобретению можно использовать для обнаружения уровней СЭ20 или уровней клеток, которые содержат СЭ20 на поверхности клеточной мембраны, эти уровни можно затем соотнести (связать) с некоторыми симптомами заболевания. Или же, антитела можно использовать для истощения или взаимодействия с функцией клеток, экспрессирующих СЭ20, тем самым используя (вовлекая) эти клетки в качестве важных медиаторов заболевания. Этого можно достичь при контактировании образца и контрольного образца с антителом против СЭ20 в условиях, которые способствуют образованию комплекса между антителом и СЭ20. Любые образующиеся в образце и контрольном образце комплексы между антителом и СЭ20 детектируются и сравниваются.
Человеческие антитела по изобретению можно сначала тестировать на активность связывания, ассоциирующуюся с терапевтическим или диагностическим применением ш уйго. Например, антитела можно проверять, используя методы жидкостной цитометрии, описанные в приведенных ниже примерах. Кроме того, можно проанализировать активность антител при включении по меньшей мере одной опосредованной медиатором активности эффекторных клеток, включая подавление роста и/или киллинга клеток, экспрессирующих СЭ20. Например, можно анализировать способность антител включать СЭС и/или апоптоз. Протоколы анализа на СЭС. гомотопическую адгезию, образование молекулярных кластеров или апоптоз описаны в приведенных ниже примерах.
Кроме того, человеческие антитела по изобретению имеют применение в терапии и диагностике ряда заболеваний, связанных с СЭ20. Например, человеческие антитела можно использовать для выявления ш У1уо или ш уйго одной или более следующих биологических активностей: подавление роста и/или дифференцировки клеток, экспрессирующих СЭ20; киллинг клеток, экспрессирующих СЭ20; опосредование фагоцитоза или АЭСС клетки, экспрессирующей СЭ20 в присутствии человеческих эффекторных клеток; опосредование СЭС клетки, экспрессирующей СЭ20 в присутствии комплемента; опосредование апоптоза клетки, экспрессирующей СЭ20; индукция гомотипической адгезии и/или индукция транслокации в липидные рафты при связывании СЭ20.
В особом варианте изобретения человеческие антитела используются ш У1уо для лечения, предупреждения или диагностики ряда заболеваний, обусловленных СЭ20. Примеры заболеваний, обусловленных СО20, включают, среди других, В-клеточную лимфому, например ННЬ и иммунные заболевания, например аутоиммунные заболевания, такие как заболевания, описанные выше.
В особом варианте изобретения антитела по изобретению используются для лечения или предупреждения ИНЬ, так как антитела истощают опухолевые клетки, несущие СЭ20.
Неходжкинская лимфома представляет собой тип В-клеточной лимфомы. Лимфомы, например Вклеточные лимфомы, представляют собой группу родственных раковых заболеваний, которые возникают, когда лимфоцит (клетка крови) становится злокачественным. Нормальной функцией лимфоцитов является защита организма от захватчиков: микроорганизмов, вирусов, грибков, даже рака. Существует много подтипов и стадий созревания лимфоцитов и, следовательно, существует много видов лимфом. Как нормальные клетки, злокачественные лимфоциты могут мигрировать в различные участки организма. Как правило, клетки лимфом образуют опухоли в лимфатической системе: костном мозге, лимфатических узлах, селезенке и в крови. Однако эти клетки могут мигрировать в другие органы. Некоторые типы лимфомы имеют тенденцию расти в местах, где находится нормальная клетка. Например, фолликулярные ННЬ опухоли обычно образуются в лимфатических узлах.
Обычно повышенные уровни ΟΌ20 экспрессируются на неопластических (т.е. опухолегенных) Вклетках, ассоциированных с N40 Соответственно антитела по изобретению, связывающие ΟΌ20, можно применять для истощения опухолевых клеток, несущих ΟΌ20, которые приводят к КНЬ, и, таким образом, можно применять для предупреждения или лечения этого заболевания.
Человеческие антитела (например, человеческие моноклональные антитела, полиспецифические и биспецифические молекулы) по настоящему изобретению также можно использовать для блокирования или подавления других эффектов ΟΌ20. Известно, например, что ΟΌ20 экспрессируются на В-лимфоцитах и вовлечены в пролиферацию и/или дифференцировку этих клеток. Так как лимфоциты работают как иммуномодуляторы, ΟΌ20 является важной целью опосредованной атителами терапии в отношении В-лимфоцитов-мишеней, такой, например, как инактивация или киллинг В-лимфоцитов, участвующих в аутоиммунных нарушениях. Такие аутоиммунные нарушения включают, например, вышеперечисленные заболевания.
Подходящие способы введения композиций антител (например, человеческих моноклональных антител, полиспецифических и биспецифических молекул и иммуноконъюгатов) по изобретению ш уйго и ш У1уо общеизвестны в технике и могут быть выбраны рядовым специалистом. Например, композиции антител можно вводить с помощью инъекции (например, внутривенной или подкожной). Подходящие дозы молекул зависят от возраста и веса субъекта и от концентрации и/или состава композиции антитела. Помимо этого, можно определить опухолевую нагрузку и использовать ее для расчета подходящих доз.
Как описано ранее, человеческие антитела против ΟΌ20 по изобретению можно применять вместе с одним или более терапевтическим агентом, например с цитотоксическим агентом, радиотоксическим агентом или иммунодепрессантом. Антитело может быть связано с агентом (в виде иммунокомплекса)
- 35 021644 или может применяться отдельно от агента. В последнем случае (раздельное применение) антитело можно вводить до, после агента или одновременно с агентом или может применяться вместе с другими известными способами терапии, например с противораковой терапией, например с облучением. Такие терапевтические агенты включают, наряду с другими, антинеопластические агенты, такие как доксорубицин, цисплатин, блеомицин, кармустин, хлорамбуцил и циклофосфамид. Совместное применение человеческих антител против СЭ20 по настоящему изобретению с химиотерапевтическими агентами обеспечивает наличие двух противораковых агентов, которые работают по различным механизмам, что оказывает цитотоксическое действие на человеческие опухолевые клетки. Такое совместное применение может решить проблемы, возникающие вследствие появления резистентности к лекарственным веществам или изменения антигенности опухолевых клеток, что делает их нереактивными в отношении антитела.
Специфические в отношении мишени эффекторные клетки, например эффекторные клетки, связанные с композициями (например, человеческими антителами, полиспецифическими и биспецифическими молекулами) по изобретению, могут также применяться в качестве терапевтических агентов. Эффекторные клетки для нацеливания могут являться человеческими лейкоцитами, такими как макрофаги, нейтрофилы или моноциты. Другие клетки включают эозинофилы, природные клетки-киллеры и другие клетки, несущие рецептор 1§С или 1§А. При необходимости эффекторные клетки можно получить от субъекта, подвергающегося лечению. Эффекторные клетки, специфические в отношении мишени, можно применять в виде клеточной суспензии в физиологически приемлемом растворе. Число введенных клеток может быть порядка 108-109, но меняется в зависимости от целей терапии. В целом, количество должно быть достаточным для локализации в клетке-мишени, например в опухолевой клетке, экспрессирующей ί'.Ό20, и чтобы вызвать гибель клеток, например, с помощью фагоцитоза.
Для удаления целевых клеток терапию специфическими в отношении мишени эффекторными клетками можно осуществлять в сочетании с другими методами. Например, противоопухолевая терапия с применением композиций (например, человеческих антител, полиспецифических и биспецифических молекул) по изобретению и/или эффекторных клеток, вооруженных этими композициями, может применяться в сочетании с химиотерапией. Кроме того, комбинированную иммунотерапию можно применять для направления двух отдельных популяций цитотоксических эффекторных клеток на отторжение опухолевых клеток. Например, антитела против СЭ20, связанные с антителами против РсуЫ или против СЭ3, могут применяться в сочетании с агентами, специфически связывающимися с 1§С- или 1дАрецепторами.
Биспецифические и полиспецифические антитела по изобретению можно также применять для модулирования уровней РсуК и РсаК на эффекторных клетках, например, кэпированием и элиминированием рецепторов на клеточной поверхности. Для этой цели можно также применять смеси анти-Рсрецепторов.
Композиции (например, человеческие антитела, полиспецифические и биспецифические молекулы и иммуноконъюгаты) по изобретению, которые содержат сайты связывания комплемента, такие как участки 1дС1, -2 или -3 или 1дМ, которые связывают комплемент, можно также применять в присутствии комплемента. В одном варианте изобретения ех У1уо обработка популяции клетки, содержащей клеткимишени, связующим агентом по изобретению и соответствующими эффекторными клетками может быть дополнена добавлением комплемента или сыворотки, содержащей комплемент. Фагоцитоз клетокмишеней, покрытых связующим агентом по изобретению, можно повысить путем связывания белков комплемента. В другом варианте изобретения клетки-мишени, покрытые композициями (т.е. человеческими антителами, полиспецифическими и биспецифическими частицами) по изобретению можно также лизировать при использовании комплемента. Еще в одном варианте изобретения композиции по изобретению не активируют комплемент.
Композиции (например, человеческие антитела, полиспецифические и биспецифические молекулы и иммуноконъюгаты) по изобретению можно также вводить вместе с комплементом. Соответственно в объем изобретения входят композиции, содержащие человеческие антитела, полиспецифические или биспецифические молекулы и сыворотку или комплемент. Преимущество этих композиций заключается в том, что комплемент расположен в тесной близости к человеческим антителам, полиспецифическим или биспецифическим молекулам. Или же, человеческие антитела, полиспецифические или биспецифические молекулы по изобретению и комплемент или сыворотку можно вводить раздельно. Связывание композиций по настоящему изобретению с клетками-мишенями вызывает транслокацию комплекса СЭ20 антиген-антитело в липидные рафты клеточной мембраны. Такая транслокация создает высокую плотность комплексов антиген-антитело, которые могут эффективно активировать и/или повышать СЭС.
В объем настоящего изобретения также входят наборы, содержащие композиции антител по изобретению (например, человеческие антитела и иммуноконъюгаты) и инструкции по применению. Кроме того, набор содержит один или более дополнительных реагентов, таких как иммуносупрессор (иммунодепрессант), цитотоксический агент или радиотоксический агент или одно или более дополнительных человеческих антител по изобретению (например, человеческих антител с комплементарной активностью).
- 36 021644
Таким образом, пациентам, проходящим лечение композициями антител по изобретению, можно дополнительно вводить (перед, одновременно или после введения человеческого антитела по изобретению) другой терапевтический агент, такой как цитотоксический или радиотоксический агент, который повышает или усиливает терапевтическое действие человеческих антител.
В других вариантах настоящего изобретения субъект можно дополнительно обрабатывать агентом, который модулирует, например повышает или подавляет, экспрессию или активность рецепторов Реу или Рса, например, цитокином. Предпочтительные цитокины для применения в ходе лечения полиспецифическими молекулами включают гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (0-0'δΡ)„ гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ΟΜ-ί,’δΡ), интерферон-у (ΙΡΝ-у) и фактор некроза опухолевых клеток (ΓΝΡ).
Композиции (например, человеческие антитела, полиспецифические и биспецифические молекулы) по изобретению можно также применять для нацеливания клеток, экспрессирующих РсуК или ί.Ό20, например, для мечения таких клеток. С этой целью связующий агент можно соединять с молекулой, которую можно детектировать. Таким образом, изобретение включает методы локализации ех νΐνο или ίη νίίτο клеток, экспрессирующих Рс-рецепторы, такие как РсуК или СЭ20. Детектируемой меткой может быть, например, радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или ферментный кофактор.
В особом варианте изобретение включает методы детектирования присутствия С.ГО20 антигена в образце или определение количества СГО20 антигена, заключающееся в контактировании образца и контрольного образца с человеческим моноклональным антителом, которое специфически связывается с СЭ20, в условиях, которые способствуют образованию комплекса между антителом или его участком и СЭ20. Затем детектируют образование комплекса, при этом разница в образовании комплекса между образцом и контрольным образцом является показателем присутствия в образце антигена СГО20.
В других вариантах настоящее изобретение охватывает методы лечения нарушения, включающие клетки, экспрессирующие С.ГО20 в организме субъекта, например неходжкинскую лимфому или ревматоидный артрит, путем введения субъекту описанных выше человеческих антител. Такие антитела и их производные применяются для подавления стимулированных СЭ20 активностей, ассоциированных с некоторыми нарушениями, например, пролиферацией и/или дифференцировкой. При контактировании антитела с С.ГО20 (например, при введении антитела субъекту) способность СЭ20 стимулировать активность подавляется и, таким образом, происходит лечение ассоциированного нарушения.
Соответственно в другом варианте настоящее изобретение включает метод лечения или предупреждения опухолегенного нарушения, включающего клетки, экспрессирующие СЭ20, например ННЬ. Метод заключается во введении субъекту композиции антитела по настоящему изобретению в количестве, эффективном для лечения или предупреждения нарушения. Композицию антитела можно вводить индивидуально или вместе с другим терапевтическим агентом, таким как цитотоксический или радиотоксический агент, который взаимодействует с или действует синергистически с композицией антитела, для лечения или предупреждения заболеваний, в которых участвуют клетки, экспрессирующие СЭ20. В особенно предпочтительном варианте настоящее изобретение охватывает метод лечения неходжкинской лимфомы.
В другом варианте настоящее изобретение охватывает метод лечения или предупреждения аутоиммунного нарушения, в котором участвуют клетки, экспрессирующие СЭ20, например заболеваний, перечисленных выше. Способ заключается во введении субъекту композиции антитела по настоящему изобретению в количестве, эффективном для лечения или предупреждения нарушения. Композицию антитела можно вводить вместе с другим терапевтическим агентом, таким как иммунодепрессант (иммуносупрессор), который взаимодействует с или действует синергистически с композицией антитела, для лечения или предупреждения заболевания, в котором участвуют клетки, экспрессирующие СЭ20.
Еще в одном варианте изобретение охватывает способ обнаружения (детектирования) присутствия или определения количества клеток, экспрессирующих СЭ20, ίη νΐνο или ίη νίΐτο. Способ включает (ί) введение субъекту композиции (например, поли- или биспецифической молекулы) по изобретению, конъюгированной с детектируемым маркером; (ίί) экспозиция субъекта со средствами обнаружения указанного детектируемого маркера для идентификации областей, содержащих клетки, экспрессирующие СО20.
Еще в одном варианте изобретения иммуноконъюгаты по изобретению можно использовать для нацеливания соединений (например, терапевтических агентов, меток, цитотоксинов, радиотоксинов, иммуносупрессоров и т.д.) на клетки с СЭ20, экспрессированными на их поверхности, путем связывания таких соединений с антителом. Так, изобретение также охватывает методы локализации ех νΐνο или ίη νίίτο клеток, экспрессирующих ί.Ό20, таких как клетки Рида-Штернберга (например, с детектируемой меткой, такой как радиоизотоп, флуоресцентным соединением, ферментом или ферментным кофактором). Или же, иммуноконъюгаты можно использовать для киллинга клеток, содержащих СЭ20, экспрессированные на их поверхности, путем нацеливания цитотоксинов или радиотоксинов на С.ГО20.
Далее настоящее изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами, которые не следует рассматривать как ограничивающие.
- 37 021644
Примеры
В-клеточные линии, используемые в примерах
Линия Происхождение Получены от клеток
Дауди Африканская лимфома Беркитта ЕСАСС <85011437)
(ГЭаисН)
АКН- 77 Лейкоз (1§<3 типа) плазматических клеток ОСЖ(АСС512)
ЭОНН Рефракторная имунобластная В- клеточная лимфома ОСЖ (АСС 47)
Райи Африканская лимфома Беркитта ЕСАСС (85011429)
(Ка)Ь
зи- онь- 4 В- ΝΗΕ. диффузная гистиоцитическая лимфома 1)СМ2 (АСС 495)
Кашоз- ЕНКВ Лимфома Беркитта ЕСАСС (85030804)
Тапоие Человеческий В- клеточный лейкоз ϋΟΜΖ (АСС 399)
В-клеточные линии Дауди (Оаий1), АКН-77, И0НН, Райи (Ка|1), Катоз-ЕНКВ и Тапоие культивируют в культуральной среде КРМ1 1640, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой (РС8) (0ρίίтит С241, \У15еп1 1пс., 51. Вгипо, Сапайа), 2 мМ Ь-глутамина, 100 М Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 1 мМ пирувата натрия (все СЬсо ВКЬ, Ы£е ТесЬио1од1е5, Ра151еу, 8со!1апй).
Линию клеток 8И-ОНЬ-4 культивируют в той же самой среде, но без пирувата натрия.
Культуры выдерживают в термостате с увлажненным 5% С02 при 37°С, расщепляют и собирают при 80-90% монослое. Среду заменяют свежей дважды в неделю. В это время клетки расщепляют и засевают при плотности 1-1.5 х 106 клеток/мл для гарантии выживаемости и оптимального роста.
Пример 1. Получение человеческих антител против СЭ20.
Мыши НСо7 и КМ.
Полностью человеческие моноклональные антитела к СЭ20 получают при использовании мышей НСо7 и КМ, которые экспрессируют гены человеческих антител. В штамме КМ мышей эндогенную мышиную легкую цепь к гомозиготно разделяют, как описано в СЬеп е! а1. (1993) ЕМВ0 I. 12:811-820, а эндогенную мышиную тяжелую цепь гомозиготно разделяют, как описано в примере 1 РСТ опубликованной Международной заявки \У0 01/09187. Этот штамм мышей несет трансген легкой цепи к человеческого происхождения, КСо5, описанный в Ρί5ΐι\γίΜ е! а1. (1996) №Циге Вю!есЬио1о§у 14:845-851. Этот штамм мышей также несет тяжелую цепь человеческого происхождения в трансхромосоме, состоящую из фрагмента ЬСР (8С20) хромосомы 14, как описано в Международной заявке \У0 02/43478.
У мышей НСо7 имеется ЖЭ разрыв в генах эндогенной легкой цепи (к) (как описано в СЬеп е! а1. (1993) ЕМВ0 I. 12: 821-830), СМИ разрыв в генах эндогенной тяжелой цепи (как описано в примере 1 в Международной заявке \У0 01/14424), трансген КСо5 легкой цепи к человеческого происхождения (описанный в ΡίδΗγίΙό е! а1. (1996) №йиге Вю!есЬио1о§у 14:845-851) и НСо7 трансген тяжелой цепи человеческого происхождения (описанный в патенте США 5770429).
Иммунизация мышей НСо7 и КМ.
Мышей НСо7 и КМ иммунизируют клетками N8/0, трансфецированными человеческим геном СЭ20. Для первой иммунизации одной мыши 1 х 107 клеток в 150 мкл РВ8 смешивают 1:1 с полным адъювантом Фрейнда и инъецируют интраперитонеально (ί.ρ., внутрибрюшинно). Последующие ί.ρ. иммунизации осуществляют, вводя такое же количество клеток без адъюванта. За три или два дня до слияния мышам вводят в виде бустер-инъекции 0.5х 107 клеток, суспендированных в РВ8.
Мониторинг присутствия антител к человеческим СЭ20 в сыворотке мышей проводят проточной цитометрией с помощью анализа РАС8, используя клетки N8/0, трансфецированные человеческим геном СЭ20, а также негативные в отношении СЭ20 парентальные клетки N8/0.
Генерация гибридом, продуцирующих человеческие моноклоналъные антитела к СЭ20.
Мышиные спленоциты выделяют из мышей НСо7 и КМ и сливают с линией клеток мышиной миеломы с помощью ПЭГ в соответствии со стандартным протоколом. Затем проводят скрининг полученных гибридом на продукцию 1дС,к методом ЕЫ8А и на специфичность в отношении СЭ20 РАС8 анализом, используя трансфецированные с помощью СЭ20 клетки N8/0 и 8КВК3. Суспензии одиночных клеток селезеночных лимфоцитов иммунизированных мышей сливают (гибридизуют) с одной четвертой частью не секретирующих 8Р2/0 клеток мышиной миеломы (АТСС, СМ 1581) в присутствии 50% ПЭГ (81дта). Клетки засевают в титрационные микропланшеты с плоскодонными лунками при плотности примерно 1 х 105/лунка и инкубируют примерно в течение двух недель в избирательной среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 10% Р388Э1 (АТСС, СКЬ Т1В-63) кондиционированной среды, 3-5% оригена (опдеп) (1СЕ^ в ИМЕМ (МеФа!есЬ, СКЬ 10013, с высоким содержанием глюкозы, Ьглутамином и пируватом натрия) плюс 5 мМ НЕРЕ8, 0.055 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 мг/мл гентамицина и 1хНАТ (81дта, СКЬ Р-7185). Через 1-2 недели клетки культивируют в среде, в которой НАТ заменяют на НТ. Затем отдельные лунки подвергают скринингу проточной цитометрией на человеческие моноклональные 1дС антитела против СЭ20. После начала интенсивного роста гибридом мониторинг среды проводят, как правило, через 10-14 дней. Гибридомы, секретирующие антитела, пересаживают в планшеты, снова подвергают скринингу и, если они все еще позитивны в отношении человеческого 1дС, монокло- 38 021644 нальные антитела против СЭ20 субклонируют при ограничении разведения. Стабильные субклоны затем культивируют ш νίΙΐΌ для получения малых количеств антител в тканевой культуральной среде для определения характеристик. Выбирают один клон каждой гибридомы, сохраняющий реактивность (реакционную способность) родительских клеток (РАС8 анализ). Получают банк по 5-10 ампул каждого клона и хранят в жидком азоте.
Селекция связывания человеческих моноклональных антител с СГО20/первичный скрининг.
Для определения изотипа антител проводят изотипический анализ ЕЫ8А. Лунки микротитрационных планшетов покрывают 1 мкг/мл мышиного антитела против легкой цепи к человеческого происхождения, 50 мкл/лунка в ΡΒδ, инкубируют при 4°С в течение ночи. После блокирования с помощью 5% куриной сыворотки содержимое планшетов реагирует с супернатантом и очищенным контролем изотипов. Затем планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 1-2 ч. Содержимое лунок реагирует с зондами, конъюгированными с пероксидазой хрена, специфическими в отношении человеческих Σ§Ο1, !дО2, !дО3 или ЦО4. Планшеты обрабатывают и анализируют, как описано выше.
Получают четыре клеточные линии гибридом, три - полученные при слиянии клеток мышей КМ и одна - при слиянии клеток мышей НСо7, экспрессирующие следующие антитела:
2Р2: человеческое моноклональное ^01,к антитело с нуклеотидными последовательностями δΕΟ ГО N0: 1 и 3 и аминокислотными последовательностями δΕΟ ГО N0: 2 и 4.
4С9: человеческое моноклональное ЦОЕк антитело с точно такими же аминокислотными последовательностями, что и 2Р2. δΕΟ ГО N0: 2 и 4.
7Ό8: человеческое моноклональное ЦОЕк антитело с нуклеотидными последовательностями δΕΟ ГО N0: 5 и 7 и аминокислотными последовательностями δΕΟ ГО N0: 6 и 8.
11В8: человеческое моноклональное !дО3л< антитело с нуклеотидными последовательностями δΕΟ ГО N0: 9 и 11 и аминокислотными последовательностями δΕΟ ГО N0: 10 и 12.
Термин 2Р2 применяют для обозначения как антитело из клона гибридомы 2Р2, так и идентичного антитела из клона гибридомы 4С9.
Антитела по изобретению можно переключать в другие изотипы, определяемые при использовании трансгенного или трансхромосомного отличного от человека животного, из которого они получены. В одном варианте изобретения 11В8 человеческое моноклональное !дО3л< антитело можно переключить в человеческое моноклональное антитело ЦОЕ к изотипа, имеющее точно те же самые и V!, последовательности. В другом варианте изобретения антитело 2Р2 ЦОЕк или антитело 7Ό8 ЦОЕк можно переключить в человеческие моноклональные антитела !дО2, !дО4, [дА!, ЦА2 или !^Ε изотипа, имеющие точно те же самые и V!, последовательности.
Пример 2. Секвенирование последовательностей человеческих антител против СГО20 (установление первичных последовательностей).
Секвенирование областей V и
Получение РНК.
Тотальную РНК получают из 5х106 всех клеточных линий гибридомы НиМАЬ СГО20 (2Р2, 7Ό8 и 11В8) с применением набора К№а8у (Ц1адеп, ХУеЧЬигд, Ьеи8беп, №1йег1апб8) в соответствием с протоколом производителя.
Получение кДНК 2Р2 и 7Ό8.
5'-КΑСΕ-комплементарную ДНК (кДНК) из матрицы РНК получают из 1 мкг тотальной РНК с применением набора для амплификации δΜΑКТ КΑСΕ кДНК (С1опе1есН) в соответствием с протоколом производителя.
и V,, области амплифицируют, используя преимущество набора НР 2 РСК (С1опе1есН, ΒΌ) и с применением следующих праймеров:
νκ ЕАСЕ2 5' ОСА ООС АСА САА САО АОО САО ТТС САО АТТ ТС отжигают в С-каппа νΗ КАСЕ2 5' ОСТ ОТО ССС ССА ОАО ОТО СТС ТТО ОАО О отжигают в Снг
Получение кДНК клеток 11В8.
Комплементарную ДНК (кДНК) из матрицы РНК клеток 11В8 получают из 3 мкг тотальной РНК при использовании ΑΜV обратной транскриптазы с буфером (КосНе Н1адпо8Йс8 ОтЬН, МаппНейп, Оегтапу), олигомера б(Т)45 (Рготеда, Маб18оп, ЭД1, ^А), бЭТР (КосНе Н1адпо8Йс8 ОтЬН, МаппНеш, Оегтапу) и КNΑ8^п (Рготеда) в соответствием с протоколом производителя. (2000, версия 3).
ПЦР праймеры, используемые для амплификации и V!, областей для клонирования.
- 39 021644
Используемые пары праймеров. Ун:
РК1 5' праймеры
АВ62 АВ63 АВ65 САд §ТК САд СТд дТд САд ТС 8Ад дТд САд СТд КТд дАд ТС дАд дТд САд СТд дТд САд ТС
Ун лидерные 5' праймеры
АВ85 АТд дАС Тдд АСС Тдд АдС АТС
АВ86 АТд дАА ТТд ддд СТд АдС Тд
АВ87 АТд дАд ТТТ ддК СТд АдС Тд
АВ88 АТд ААА САС СТд Тдд ТГС ТТС
АВ89 АТд ддд ТСА АСС дСС АТС СТ
Ун 3' праймер
АВ90 ТдС САд ддд дАА дАС СдА Тдд
νκ:
РК1 5' праймеры
АВ8 КАС АТС САд АТЙ АУС САд ГС
АВ9 дУС АТС ΥΚ@ АТа АСС СЛв ТС
АВ 10 §АТ АТТ дТд АТд АСС СЛв АС
АВ 11 дАА АТТ дТд ТТд АСК С Ад ТС
АВ 12 вАА ΑΤΨ дТК АТд АСА СА§ ТС
АВ 13 вАТ §ТТ вТд ЛТд АСА С АО ТС
АВ 14 §АА АТТ §Тд СТд АСТ САд ТС
Ук лидерные 5' праймеры
АВ 123 ССС аСТ Сад СТС СТд адд СТС СТа
АВ 124 ССС ТдС ТСА дСТ ССТ еда. аСТ дС
АВ 125 ССС АдС дС А дСТ ТСТ СТТ ССТ ССТ дС
АВ 126 АТд дАА ССА Тдд ААд ССС САд САС АдС
Ук 3' праймер
АВ 16 Сдд дАА дАТ дАА дАС АдА Тд где К=Т или О, 8=С или О, К=А или О, Υ=Ο или Т и \ν=Λ или Т.
Условия РСК (ПЦР) амплификации областей νΗ и для клонирования 2Р2 и 7Ό8: полимеразную цепную реакцию (РСК, ПЦР) осуществляют с НР полимеразной смесью (Οοικ^ΐι.) в термоблоке Т1 (Вютейа, Vе8ίЬи^д).
Условия ПЦР:
°С 30 сек 5 циклов 72 °С 1 мин °С 30 сек °С 30 сек 5 циклов °С 1 мин °С 30 сек °С 30 сек 27- 30 циклов 72 °С 1 мин
Условия РСК (ПЦР) амплификации областей νΗ и У для клонирования 11В8.
Полимеразную цепную реакцию (РСК, ПЦР) осуществляют с АтрйТад полимеразой (Регкт Е1тег)
- 40 021644 в термоблоке Т1 (Вютейа, VеδΐЬи^д, Ьешбеп, №1йег1а1^). Протокол ПЦР циклизации:
94 °С 2 мин
11 циклов 70 °С 30 сек 65 °С 30 сек, минус 1 °С на цикл 72 “С 30 сек
30 циклов 94 “С 30 сек 55 °С 30 сек 72 °С 30 сек 73 °С 10 мин
охлаждают до 4 °С
Клонирование УН и У,, в рОЕМТ-векторной системе II (2Р2, 7Ό8 и 11В8).
После анализа продуктов ПЦР на агарозном геле продукты очищают при использовании набора Ц1АЕХ II Ое1 Ехбасйоп Кб (Ц1адеп, VеδΐЬи^д, Ьешбеп, Nеίйе^1аηбδ). Два независимо амплифицированных продукта ПЦР каждой γΗ и V области клонируют в рОЕМТ-векторной системе II (Рготеда) в соответствием с протоколом производителя. (1999, версия 6).
После трансформации в Е. сой 1М109 отдельные колонии подвергают скринингу с помощью ПЦР колоний, используя праймеры Т7 и 8Р6, 30 циклов отжига при 55°С. Плазмиду ДНК из колоний очищают, используя минипрепаративный набор Ц1аргер 8рш тииргер кН (Ц1адеп). Для дальнейшего анализа V: и V областей осуществляют расщепление №о1/№11 (ΝΉ Вю1а№ VеδΐЬи^д, Ьешбеп Nеίйе^1аηбδ) и анализируют на агарозном геле.
Секвенирование (2Р2, 7Ό8 и 11В8).
V-области секвенируют после клонирования в рОВМТ-векторную систему II. Секвенирование осуществляют на Ваδес1еа^ (Ье1беп, Nеίйе^1аηбδ). Последовательности анализируют, выравнивания последовательности V-гена зародышевой линии на УЬаδе (\у\у\у.тгс-сре.сат.ас.ик/ип1бос/риЬ1^с/^ηΐ^о.Ьΐт).Ы:ιр://№№№.т^с-сре.сат.ас.ик/νЬаδе-ок.рЬр?теηи=901.
Полученные последовательности показаны на фиг. 53-58.
Пример 3. Рекомбинантное получение 2Р2 и 11В8 в линии клеток Ο8-Ν8/0.
2Р2Т.
Вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела 2Р2 амплифицируют методом ПЦР с применением стандартного клонирующего вектора рОет-52Г (Рготеда), используя праймеры, включающие оптимальную последовательность Козака и подходящие сайты рестрикции для клонирования фрагментов в векторы рТО^ 1 и РТО№ (Ьоп/а) О8 константной области.
После амплификации фрагменты очищают и расщепляют рестриктазами для клонирования и лигируют в два вектора. Фрагмент вариабельной области тяжелой цепи расщепляют с помощью Ншб III и Βδί VI, лигируют в вектор рТО^ 1, который расщепляют с помощью Ншб III и Βδί VI, и дефосфорилируют щелочной фосфатазой. Вариабельный фрагмент легкой цепи расщепляют с помощью Ншб III и Ара I и лигируют в вектор РСΟNκ; который расщепляют с помощью Ншб III и Ара I, и дефосфорилируют щелочной фосфатазой. Векторы рСΟNγ 1Г/вариабельный домен тяжелой цепи и РСΟNκ/вариабельный домен легкой цепи показаны на фиг. 1 и 2 соответственно. Трансформированные колонии Е. сой проверяют ПЦР колоний 2, позитивные колонии каждой конструкции тяжелой цепи (НС) и легкой цепи (ЬС) выращивают с целью изоляции плазмиды. Выделенную плазмиду этих 4 клонов секвенируют для подтверждения последовательности. Найдено, что оба НС клона и один ЬС клон имеют корректные последовательности.
Две НС конструкции и одну ЬС конструкцию объединяют, получают две комбинации ЬС-НС и транзиторно трансфецируют в СНО-К1 клетках для проверки конструкций на соответствующую продукцию 2Р2 антитела. Нормальные уровни продукции достигаются для всех комбинаций в этом эксперименте по экспрессии, и 1 клон каждой из НС и ЬС конструкций выбирают для конструкции двойного генного вектора.
Объединение НС и ЬС в двойной генный клонирующий вектор, обозначенный рСΟNγ 1Г/к 2Р2, осуществляют лигированием полной кассеты экспрессии из вектора тяжелой цепи, рСΟNγ 1Г/вариабельный домен тяжелой цепи, в вектор легкой цепи, РСΟNκ /вариабельный домен легкой цепи. Вектор рТО^ 1Г/к 2Р2 показан на фиг. 3.
11В8Т.
Аналогичным образом установлена линия клеток Ο8-Ν8/0 для рекомбинантной продукции 11В8 (обозначенной 11В8Т) с небольшой модификацией методики, приведенной ниже.
Осуществляют четыре трансфекции Ν8/0 клеток-хозяев электропорацией с помощью плазмидной ДНК, используя ДНК линейной плазмиды. После изучения полученных колоний под микроскопом для подтверждения того, что колонии имеют подходящий размер для анализа (покрывают более 60% дна
- 41 021644 лунки) и что в каждой лунке имеется только одна колония, клеточные супернатанты от 596 трансфектантов подвергают скринингу на собранное антитело с помощью ЦС. к-ЕЫ8А. Используя эти данные, отбирают 100 трансфектантов для развития и дальнейшей оценки в статической культуре. Культуры выбранных клеточных линий выращивают и адаптируют к среде с низким содержанием сыворотки (среде, содержащей альбумин бычьей сыворотки (В8А) с добавлением 1% бРС8) и осуществляют дополнительную оценку продуктивности в статической культуре (ЕЫ8А и определение процентного содержания монослоя). Для развития (выращивания) выбирают 60 клеточных линий с наивысшим ранжированием, и дополнительные 13 клеточных линий, данные о продуктивности которых не получены, также взяты для продолжения исследования (выращивания). Предварительную оценку продуктивности выбранных клеточных линий проводят в суспензионной культуре, помещенной в периодически встряхиваемую колбу в среде с низким содержанием сыворотки (среде, содержащей альбумин бычьей сыворотки (В8А) с добавлением 1% бРС8). Исходя из концентрации собираемого антитела (методом ЕЫЗА) и приемлемых характеристик роста 10 клеточных линий выбирают для дальнейшей оценки в суспензионных культурах (в среде, содержащей альбумин бычьей сыворотки (ВЗА) с добавлением 1% бРСЗ), помещенных во встряхиваемую колбу с периодической подпиткой. Концентрации продукта при сборе определяют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ, НРЬС) с протеином А общеизвестными стандартными методами. В результате одну из клеточных линий отбрасывают. Все полученные 9 клеточных линий продуцируют антитело 11В8 (обозначенное 118ВТ) с хорошими выходами в интервале 354-771 мг/л по определению методом протеин А ВЭЖХ.
Пример 4. Сравнение антитела 2Р2 гибридомы и рекомбинантного антитела 2Р2Т трансфектомы.
С помощью гель-электрофореза (8Э8-РАСЕ и нативного (обычного) электрофореза в агарозном геле) показано, что 2Р2 и 2Р2Т имеют один размер и лишь немного различающийся электрический заряд.
Кроме того, 2Р2 и 2Р2Т связываются с трансфецированными при использовании СЭ20 клетками N8/0 и клетками Райи с аналогичной аффинностью, что показано методом проточной цитометрии с применением РАСЗсайЬиг (Вес!оп Эюкшкоп, 8ап 01едо, СА, ИЗА). Никакого связывания с нетрансфецированными клетками N8/0 не наблюдается, что демонстрирует специфичность 2Р2 и 2Р2Т. 2Р2 и 2Р2Т также индуцируют СЭС в зависимости от концентрации в той же степени, что и в клетках АКН-77 (!дС типа лейкоза плазматических клеток), клетках Дауди, клетках ЭОНН (рефракторной иммунобластной Вклеточной лимфомы, выращенных из клеток фолликулярной центробластной/центролитической (сеШго1уйс) лимфомы, ЭЗМ2, ВгаипксНуеЦ, Сегтапу), клетках Райи, по измерению лизиса клеток (число РК позитивных клеток) методом проточной цитометрии (РАСЗсаПЬиг). Во втором эксперименте концентрации 2Р2 и 2Р2Т остаются постоянными, в то время как добавляют различные концентрации сыворотки. Никаких заметных различий между 2Р2 и 2Р2Т не наблюдается.
Наконец, 2Р2 и 2Р2Т, связанные с ассоциированным с клетками СЭ20, образуют прочную и одинаковую по прочности связь с фактором комплемента С.'1с.|. Эксперимент проводят на клетках Дауди, клетках ЭОНН и клетках Райи с использованием поликлональных антител против С1с| для детектирования связывания с С.'1с.|.
Пример 5. Характеристики связывания человеческих антител против СЭ20.
Связывание с различными линиями клеток.
Клетки N8/0, N8/0, трансфецированные человеческим СЭ20, клетки Дауди и Райи инкубируют в течение 30 мин при 4°С с культуральным супернатантом, содержащим человеческие антитела 2Р2, 7Ό8 и 11В8, с последующей инкубацией с ПТС'-конъюгированными АЬ против человеческого ЦС. Связывание оценивают проточной цитометрией на проточном цитометре РАСЗсайЬиг. Интенсивности флуоресценции сравнивают с образцами с негативным контрольным изотипом. Как показано на фиг. 4, все три антитела связываются с N8/0 клетками, трансфецированными при использовании человеческого СЭ20, тогда как в родительских нетрансфецированных N8/0 клетках никакого связывания не наблюдается. Все три антитела также связываются с двумя различными линиями В-клеток (Райи (Кар) и Дауди ШаибО), это показывает, что антитела 2Р2, 7Ό8, и 11В8 являются специфическими в отношении СЭ20. Супернатанты, содержащие 7Ό8 или 11В8, анализируют в условиях ненасыщенности, следовательно, наблюдается более низкая интенсивность по сравнению с 2Р2.
Значение ЕС50 антитела 2Р2, определяемое проточной цитометрией.
Для определения средней (кажущейся) аффинности 2Р2 в отношении СЭ20, экспрессированного на человеческих В-клетках, строят кривую связывания 2Р2 с использованием выделенных РВМС (мононуклеаров периферической крови) от трех человек-доноров и селекции пропускания СЭ3 негативных клеток. Выделенные РВМС инкубируют в течение 1 ч с ПТС, меченными 2Р2, в интервале концентраций и анализируют на РАС8, определяя среднее значение интенсивности флуоресценции (МП). Значения МИ показаны на фиг. 5А и 5В как функция концентрации антитела. Значения ЕС50 рассчитывают методом нелинейной регрессии, используя Сгарй Раб Рпкт 3.02. Значение ЕС50 2Р2 для человека аналогично для всех трех доноров, среднее значение (± к.е.т. (стандартная ошибка)) 287±12.7 нг/мл (1.9±0.1 нМ).
Связывание меченых 'ПтАЬк с клетками, экспрессирующими СЭ20.
тАЬк (моноклональные антитела) йодируют с помощью гранул (кристаллов) йода (Р1егсе Сйетюа1
- 42 021644
Со., Коскйогб, 1Ь). Меченные 1251 шАЬ§ серийно разводят и инкубируют с Като8-ЕнКВ (клетки на 2 ч при 37°С в присутствии азида натрия и 2-дезоксиглюкозы для предупреждения эндоцитоза. Связанные с клетками и свободные меченные 1251 тАЬк затем разделяют центрифугированием при 14,000х§ в течение 2 мин с помощью смеси фталатных масел (пластификаторов), дающих быстрое разделение, не нарушая равновесное связывание. Выпавший клеточный осадок (пеллеты) вместе со связанным антителом считают гамма-счетчиком (\Уа11ас ИК Ыб, МПЮп Кеуиек, ИК).
Как показано на фиг. 6, 2Р2 и 11В8 имеют аналогичные значения Кс (или аналогичные точки насыщения), это указывает, что оба антитела связываются со сходной аффинностью. Однако уровень насыщения антитела 11В8 ниже, чем уровень насыщения 2Р2, это показывает, что 11В8 распознает другую форму СЭ20. Это также находится в соответствии с другим экспериментом, показывающим, что аналогичное число молекул антител 2Р2 и ритуксимаба связывается с СЭ20 на клетках Каток-ЕИКВ и клетках Дауди, это показывают аналогичные уровни насыщения связывания (примерно 2-3 х105 молекул антитела на клетку). 11В8 и В1, напротив, насыщают при половине этого уровня, и только около 1-2х105 молекул антитела связывается с клетками Каток-ЕнКВ (фиг. 7А) и клетками Дауди (фиг. 7В).
Чтобы исключить возможность того, что йодированные антитела связываются через Рс-рецепторы, подтверждают кривые связывания, используя Р(аЬ')2 фрагменты антител против СЭ20. И снова аналогичные количества 2Р2 и ритуксимаб-Р(аЬ')2 фрагментов связываются как с клетками Каток-ЕнКВ, так и с клетками Дауди. Также в этих экспериментах число молекул антител 2Р2 или ритуксимаба, связывающееся с клетками Каток-ЕнКВ и Дауди, насыщает примерно при вдвое большем числе, чем число молекул 11В8 и В1, связанных с клетками.
Скорость диссоциации.
Для определения скорости диссоциации тАЬк клетки Каток-ЕИКВ (конечный объем 1 мл в присутствии азида/2ЭОС) инкубируют в течение 2 ч при 37°С с 2 мкг/мл 1251 тАЬк до достижения максимального связывания. После центрифугирования на микрофуге (2000 об/мин в течение 2 мин) супернатант удаляют, клеточный осадок (пеллеты) сразу же переносят в 9 мл среды при 37°С в коническую пробирку на 15 мл. В различные временные точки в течение последующих 2 ч отбирают образцы по 0.4 мл и разделяют на фталатных маслах для определения уровня меченных радиоактивными метками тАЬк, остающихся на клеточной поверхности. Как показано на фиг. 8, как 2Р2, так и 11В8 диссоциируют значительно медленнее из ассоциата с СЭ20, чем ритуксимаб или В1.
Скорости диссоциации анти-СЭ20 Р(аЬ)2 фрагментов.
Клетки Каток-ЕнВК насыщают, используя 2 мкг/мл меченных 1251 Р(аЬ)2 фрагментов антител 2Р2, 11В8 и ритуксимаба соответственно. Клетки Каток-ЕнВК отмывают и инкубируют в присутствии высокой концентрации немеченого антитела. Максимальное (начальное) связывание с клетками Каток-ЕнКВ устанавливают 100%. В различные временные точки в течение 3 ч после лодинга (нагрузки, нанесения) отбирают образцы по 0.4 мл и разделяют на фталатном масле для определения уровней меченных радиоактивными метками тАЬк, остающихся на клеточной поверхности. Как можно видеть на фиг. 9, 2Р2 и 11В8 диссоциируют с поверхности СЭ20 значительно более медленно, чем ритуксимаб. Через 90 мин примерно 50% молекул Р(аЬ)2 ритуксимаба связываются с клеткой, тогда как половина молекул 2Р2 Р(аЬ)2 диссоциирует через 3 ч. Значения ка (кй для 2Р2, 11В8 и ритуксимаба вычисляют следующим образом:
Р(аЬ)2 2Р2: ка = Ιη 2/1!/2 (сек) = 1п 2/10800 (сек) = 6.4 х 10’5 сек1
Р(аЪ)2 11В8Т: ка = 1η 2/ίν2 (сек) = 1п 2/9000 (сек) = 7.7 х 10’5 сек1
Р(аЬ)2 ритуксимаб: ка = 1п 2/1 ш (сек) = 1п 2/5400 (сек) = 1.3 х 10-4 сек'1
Функциональные ой (диссоциации) скорости антител тАЬ против СЭ20.
Влияние медленной диссоциации 2Р2 по сравнению с ритуксимабом оценивают с помощью функционального СЭС анализа. С этой целью клетки Дауди или 8и-ЭнЬ4 преинкубируют с 10 мкг/мл тАЬ против СЭ20 или изотипного контрольного антитела, отмывают и инкубируют в среде различное время. В эти временные точки после начала анализа образцы инкубируют с комплементом (нормальная человеческая сыворотка 20 об.%), а затем инкубируют еще в течение 45 мин при 37°С. После этого определяют лизис клеток на РАС8, используя метод окрашивания Р1 (пропидий йодидом). % лизированных клеток (Р1-позитивные клетки) показан на фиг. 10А (клетки Дауди) или на фиг. 10В (клетки 8и-ЭнЬ4) как функция времени инкубации. 2Р2 индуцирует высокую СЭС в обоих типах клеток и все еще лизирует до 90% клеток через 6 ч, это указывает, что СЭ20 насыщение клеток остается достаточно высоким для того, чтобы индуцировать опосредованный комплементом лизис большинства клеток. Напротив, ритуксимаб в соответствии с указанной выше скоростью диссоциации быстро диссоциирует из ассоциата с клеткой и не может индуцировать специфический лизис после 6-часовой инкубации. Антитело 11В8 используют в качестве контроля и оно не индуцирует СЭС.
- 43 021644
Пример 6. СЭС человеческих антител против СЭ20.
Приготовление сыворотки.
Сыворотку для комплементзависимого лизиса готовят, помещая кровь здоровых добровольцев в аиЮкер (для ауторазделения) гель в пробирки вакутейнеры для активатора свертывания крови (ΒΌ Ью5с^еηсе5, КиШег&гб, Νί), которые выдерживают при комнатной температуре в течение 30-60 мин, а затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. Сыворотку собирают и хранят при -80°С.
Проточная цитометрия.
Для проточной цитометрии применяют проточный цитометр РАС8саЬЬиг с программным обеспечением Се110ие51 рго (ΒΌ Β^ο5с^еηсе5. Μοиηίа^η у1е\у, СА). По меньшей мере 5000 событий собирают для анализа, при этом клеточный дебрис исключают, корректирую границу переднего и бокового рассеяния света (ТС8-1ог\уагб 51бе\\агб 5сайег).
Кинетика СЭС.
В первой серии экспериментов (η=3) определяют кинетику СЭС различных линий В-клеток, а именно Дауди, 8и-ЭНЬ4, Райи, ΌΘΗΗ и АКН-77, добавляя 10 мкг/мл 2Р2, ритуксимаба и 1дО контрольного антитела соответственно за 10 мин перед прибавлением человеческой сыворотки. Через различные временные интервалы (вплоть до 1 ч) после индукции СЭС клетки суспендируют в растворе Р1 и клеточный лизис (число Р1-позитивных клеток) измеряют проточной цитометрией. Результаты изображены на фиг. 11А (АКН-77 клетки), 11В (клетки Дауди), 11С (клетки Райи), 11Ό (ΌΘΗΗ) и 11 Е (8и-ОНЬ4). Как можно видеть, добавление антител вызывает лизис клеток в течение 5 мин. Интересно отметить, что добавление 2Р2 вызывает заметный - более 80% - лизис клеток во всех пяти В-клеточных линиях. Ритуксимаб вызывает более чем 80% клеточный лизис только в клеточных линиях 8и-ЭНЬ4 и Дауди, тогда как клеточный лизис в линии клеток ЭОНН составляет ~50%, а в клеточных линиях АКН-77 и Райи - менее 20%. Лизис совсем не наблюдается в присутствии 1дО контрольного антитела (данные только показаны на фиг. 11В).
Титрование сыворотки для определения СЭС.
В отдельной серии экспериментов (η=5) ΝΉ8 (нормальную человеческую сыворотку) титруют при двух различных концентрациях антител: 0.5 и 5 мкг/мл. Клетки преинкубируют с 2Р2 или ритуксимабом в течение 10 мин перед тем, как добавить ΝΉ8 в пределах концентраций. Через 45 мин после индукции СЭС клетки ресуспендируют в растворе РЬ, клеточный лизис (число Р1-позитивных клеток) измеряют проточной цитометрией. На фиг. 12А-Э показан процент лизированных клеток (Р1-позитивных) как функция концентрации ΝΉ8. На фиг. 12А показан клеточный лизис клеток Дауди, на фиг. 12В - клеточный лизис клеток АКН-77, на фиг. 12С - клеточный лизис клеток ЭОНН и на фиг. 12Ό - клеточный лизис клеток Райи. Повышенный лизис клеток наблюдают с повышением концентрации ΝΉ8. Добавление 2Р2 вызывает максимальный лизис клеток Дауди при наиболее высоких концентрациях ΝΉ8 и антитела. Ритуксимаб вызывает примерно 50% клеточный лизис клеток Дауди при наиболее высокой концентрации Ν^.
В клетках АКН-77 только самая высокая концентрация ΝΉ8 и 2Р2 вызывает примерно 75% клеточный лизис. Более низкие концентрации недостаточны для индуцирования клеточного лизиса клеток АКН-77. Ритуксимаб не способен индуцировать клеточный лизис клеток АКН-77 в этом эксперименте.
2Р2 может индуцировать зависимый от концентрации ΝΉ8 клеточный лизис клеток ЭОНН как при высокой, так и при низкой концентрации, тогда как ритуксимаб не может индуцировать лизис в этих условиях.
Наконец, 2Р2 индуцирует зависимый от концентрации ΝΉ8 клеточный лизис клеток Райи, который можно наблюдать только при концентрации тАЬ 5 мкг/мл. Никакого лизиса не наблюдается в случае ритуксимаба.
В этих экспериментах не наблюдается лизис в случае изотипического контрольного антитела.
Титрование антител для определения СЭС.
Для измерения способности антител против ί'.Ό20 индуцировать СЭС при низких концентрациях проводят эксперимент, в котором титруют антитела (η=6). Различные линии клеток преинкубируют соответственно в присутствии 2Р2 и ритуксимаба в интервале концентраций в течение 10 мин перед добавлением ΝΉ8. После 45-минутной инкубации при 37°С (когда достигается максимальный лизис) клетки ресуспендируют в растворе Р1 и клеточный лизис (число Р1-позитивных клеток) измеряют проточной цитометрией. На фиг. 13А (клетки Дауди), 13В (клетки ЭОНН), 13С (клетки АКН-77) и 13Ό (клетки Райи) показано выраженное в процентах число лизированных (Р1-позитивных) клеток как функция концентрации антитела. Как 2Р2, так и ритуксимаб вызывают зависимое от концентрации повышение клеточного лизиса. 2Р2 индуцируют более чем 80% лизис клеток Дауди при добавлении 2 мкг/мл, в то время как в случае ритуксимаба этот уровень не достигается даже после прибавления 10 мкг/мл. Помимо этого, 2Р2 индуцирует более чем 80% лизис клеток ЭОНН при концентрации 0.4 мкг/мл, тогда как в случае ритуксимаба при этой концентрации наблюдается минимальный лизис. Максимальный лизис клеток ЭОНН ритуксимабом (~30% от общего числа анализированных клеток) достигается при концентрации 10 мкг/мл. Индукция лизиса клеток АКН-77 и клеток Райи при использовании 2Р2 ниже, но при концентрации антитела 10 мкг/мл все еще достигается ~70% лизис. При этой, наиболее высокой, концентрации
- 44 021644 ритуксимаб индуцирует лизис клеток АРН-77 только на ~23%, а клеток Райи только на ~6%.
В аналогичном эксперименте изучают способность 2Р2, 2Р2Т, 11В8Т и ритуксимаба индуцировать СЭС линий клеток Дауди и Райи, см. фиг. 14А и 14В. В этом эксперименте также наблюдается более чем 80%-ный лизис клеток Дауди при использовании (полученных из трансфектомы) антител 2Р2Т при концентрации 10 мкг/мл, тогда как в случае ритуксимаба даже при концентрации 10 мкг/мл достигается только 60%-ный уровень лизиса, ср. фиг. 14А. Лизис клеток Дауди при использовании 2Р2Т идентичен лизису, наблюдаемому в случае 2Р2 гибридомы.
Лизис клеток Райи проходит более трудно, но опять же, как в случае 2Р2, так и в случае 2Р2Т степень индукции лизиса аналогична (фиг. 14В). Ритуксимаб не способен индуцировать СЭС клеток Райи, что согласуется с экспериментом, проиллюстрированным на фиг. 13Ό.
Как показано на фиг. 14А и 14В, ни клетки Дауди, ни клетки Райи не чувствительны к СЭС, вызываемой с помощью 11В8Т. Антитело В1 индуцирует лизис клеток Дауди, но только в малой степени, и не способно индуцировать лизис клеток Райи.
СЭС активность антител против СЭ20 в клетках Дауди.
Для определения СЭС активности каждого антитела методом РАСБ оценивают повышенную проницаемость мембран клеток, окрашенных йодидом пропидия (Р1). Коротко говоря, клетки Дауди отмывают и ресуспендируют в питательной среде РРМ1/1% ВБА при плотности 1 х 106 клеток/мл. К клеткам Дауди прибавляют различные концентрации человеческих моноклональных антител и оставляют связываться с СЭ20 на клетках в течение 10-15 мин при комнатной температуре. Затем в качестве источника комплемента прибавляют сыворотку до конечной концентрации 20 об.% и смесь инкубируют в течение 45 мин при 37°С. До анализа клетки хранят при 4°С. Затем каждый образец (150 мкл) добавляют к 10 мл раствора Р1 (10 мкг/мл в РВБ) в пробирке РАСБ. Смесь сразу же анализируют проточной цитометрией. Как показано на фиг. 15А, антитела 2Р2 и 7Ό8 проявляют более высокую СЭС активность по сравнению с ритуксимабом.
Во втором эксперименте клетки метят человеческими моноклональными антителами, как указано выше, затем отмывают и инкубируют в РВБ в течение 45 мин при 37°С перед добавлением человеческой сыворотки. Это гарантирует, что только антитело, связанное с клеткой во время добавления сыворотки, способно активировать комплемент для клеточного лизиса. Как показано на фиг. 15В, в случае ритуксимаба наблюдается пониженная СЭС активность по сравнению с 2Р2 и 7Ό8, это указывает, что на человеческие антитела (2Р2 и 7Ό8) не влияет отмывание клеток перед добавлением сыворотки.
СЭС активность антител против СЭ20 в клетках Райи.
СЭС активность анализируют, используя клетки Райи, которые имеют сравнительно высокую поверхность экспрессии СЭ55 и СЭ59 и, следовательно, более устойчивы к атаке комплемента. Человеческие антитела прибавляют к клеткам Райи и оставляют связываться в течение 15 мин. Добавляют человеческую сыворотку (20%) и смеси инкубируют в течение 45 мин при 37°С. Как показано на фиг. 16А, ритуксимаб неэффективно опосредует СЭС клеток Райи, тогда как в клетках Райи, опсонизированных при использовании 2Р2 и 7Ό8, наблюдаются значительные уровни клеточного лизиса. Следовательно, 2Р2 и 7Ό8 обладают уникальной способностью лизировать СЭ55/59 позитивные клетки-мишени.
В отдельном эксперименте клетки Райи преинкубируют с концентрациями насыщения тАЬ против СЭ55 (конечная концентрация 5 мкг/мл) и тАЬ против СЭ59 (конечная концентрация 5 мкг/мл), чтобы блокировать действие этих молекул защиты комплемента. Затем прибавляют человеческие антитела против СЭ20 вместе с сывороткой (20%), как описано выше, на 45 мин при 37°С. Как показано на фиг. 16В, блокада молекул СЭ55 и СЭ59 вызывает почти 100%-ный лизис клеток Райи человеческими антителами 2Р2 и 7Ό8, тогда как при применении ритуксимаба наблюдается только 25%-ное увеличение клеточного лизиса.
Роль ингибиторов комплемента I - экспрессия молекул поверхности.
Так как ингибиторы комплемента, такие как СЭ55 и СЭ59, по-видимому, играют важную роль в чувствительности к вызванной ритуксимабом СЭС, проводят эксперимент для определения экспрессии этих молекул на исследуемых линиях В-клеток (Райи, Дауди, Ό0ΗΗ, АРН-77 и Би-ЭНЬ4).
Клетки окрашивают Р1ТС-конъюгированными антителами против СЭ55, СЭ59 и СЭ20 и экспрессию молекул анализируют проточной цитометрией. Результаты показаны в приведенной ниже табл. 1.
Таблица 1
Экспрессия СО20 СО55 СП59
АКН- 77 ++ ++++ ++
Райи + ++ +++
ЙОНН ++ +++ ++
зи- они +++ + ++
Дауди ++ + +
Роль ингибиторов комплемента II - блокада СЭ55 и СЭ59.
Для дополнительного изучения роли СЭ55 и СЭ59 в СЭС, индуцированной против СЭ20, перед
- 45 021644 индукцией СЭС обе молекулы ингибиторов комплемента блокируют специфическими антителами (п=3). Используют клетки Райи, так как один 2Р2 вызывает лишь частичный лизис. Клетки Райи (1х105 клеток/50 мкл) преинкубируют с 2Р2 и ритуксимабом в интервале концентраций вместе с антителами против СЭ55 95 мкг/мл) и СЭ59 (5 мкг/мл) в течение 10 мин перед тем как добавить пул ΝΗ8 (20%). Через 45 мин после индукции СЭС клетки ресуспендируют в растворе РЬ, клеточный лизис (число Р1позитивных клеток) измеряют проточной цитометрией. На фиг. 17А-С показано количество лизированных (Р1-позитивных) клеток в процентах как функция концентрации антитела и показан один эксперимент, который является примером трех экспериментов. На фиг. 17А показана инкубация клеток Райи с антителом против СЭ55, на фиг. 17В показана инкубация клеток Райи с антителом против СЭ59 и на фиг. 17С показана инкубация клеток Райи с антителами против СЬ55 и СЭ59.
Как видно на фиг. 17А, добавление антитела против СЬ55 не влияет на СЭС, индуцированную 2Р2 или ритуксимабом. Добавление антитела против СЬ59 повышает чувствительность клеток как к 2Р2, так и ритуксимабу примерно на 30% (фиг. 17В). Добавление антител как против СЭ55, так и против СЭ59 дополнительно повышает лизис клеток, вызванный антителами против СЭ20, примерно на 30% (фиг. 17С).
Роль факторов комплемента, определяемая проточной цитометрией I - С1с.| связывание.
Антитела против СЭ20 (2Р2 и ритуксимаб) и изотипическое контрольное антитело добавляют к различным В-клеточным линиям. Инкубируют 10 мин и прибавляют ΝΗ8 (1 об.%). Инкубируют еще в течение 10 мин при 37°С и клетки отмывают, супернатант отбрасывают и клеточный осадок (пеллеты) инкубируют с конъюгированным с Р1ТС антителом против С1с.|. Данные средней интенсивности флуоресценции клеток, окрашенных с помощью С1с], показаны на фиг. 18А (Дауди), 18В (АКН-77), 18С (Ό0ΗΗ) и 18Ό (Райи) (п=6). Результаты указывают на зависящее от концентрации антитела повышение связывания С1с.| антителом 2Р2 вне зависимости от исследуемой В-клеточной линии. Кроме того, связывание С1с.| антителом 2Р2 всегда выше, чем связывание ритуксимабом во всех изученных линиях клеток. В случае изотипического контрольного антитела не наблюдается никакого увеличения среднего значения флуоресценции (данные не показаны).
Роль факторов комплемента, определяемая проточной цитометрией II - активация комплемента по классическому пути.
Фиксация С4с на клетках с пленкой из антител есть показатель активации комплемента по классическому пути. Антитела против СЭ20 (2Р2 и ритуксимаб) и изотипическое контрольное антитело добавляют к различным линиям В-клеток. Инкубируют при 37°С в течение 10 мин, прибавляют ΝΗ8 (1 об.%). После дополнительной инкубации и отмывания клеток отбрасывают супернатант и клеточный осадок инкубируют с Р1ТС-конъюгированным антителом против С4с. Данные средней интенсивности флуоресценции клеток, окрашенных с помощью С4с, показаны на фиг. 19А (Дауди), 19В (АКΗ-77), 18С (Ό0ΗΗ) и 18Ό (Райи) (п=6). Фиксация фактора комплемента С4с на 2Р2 продемонстрирована во всех тестированных В-клеточных линиях (п=3), при этом максимум достигается при концентрации антитела ~1 мкг/мл. Фиксация С4с после связывания с 2Р2 значительно выше, чем в случае ритуксимаба, вне зависимости от тестируемой клеточной линии. В случае изотипического контрольного антитела не наблюдается никакого увеличения среднего значения флуоресценции (данные не показаны).
СЭС в термоинактивированной сыворотке.
Клетки (клетки Дауди, клетки ΛΚΗ-77 или клетки Райи) и антитела (ритуксимаб, 2Р2, 2Р2Т, 11В8 и изотипическое контрольное антитело ИиМаЪ-КЬИ 1дС1) преинкубируют в пределах концентраций антител против ί'.Ό20 в течение 10 мин, после чего добавляют ΝΗ8 (активную или термоинактивированную на водяной бане при 57°С в течение 30 мин). Через 45 мин после индукции СЭС клетки ресуспендируют в растворе Р1. Клеточный лизис (число Р1-позитивных клеток) определяют проточной цитометрией. В присутствии термоинактивированной сыворотки, вне зависимости оТ-клеточной линии и используемого антитела к ί'.Ό20, не наблюдается никакого лизиса клеток, в присутствии термоинактивированной сыворотки не наблюдается СЭС.
Пример 7. ЛЭСС человеческих антител против СЭ20 ЛЬСС анализ I.
Обогащение человеческих нейтрофилов.
Полиморфонуклеарные клетки (нейтрофилы, РМЦ) обогащают из гепаринизированной цельной крови. Кровь дважды разводят в КРΜI 1640 и наносят слоями на Ртсо11 (Ьутрйосу(е 8ерага(юп МеДшт (среда для разделения лимфоцитов), 1077 г/мл, 710 г, КТ (комнатная температура), 20 мин; В^οVЬ^йаке^, са(. 17-829Е, 1о! по. 014832) и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 20 мин. Слой мононуклеаров удаляют и эритроциты в осадке (пеллетах), содержащем нейтрофилы, лизируют в гипотоническом растворе, используя охлажденный льдом раствор ΝΗ4Ο (155 мМ ΝΗ.·|Ο, 10 мМ NаΗС0з, 0.1 мМ ЕЬТА, рН 7.4). Оставшиеся нейтрофилы дважды отмывают и ресуспендируют в среде КРΜI 1640, дополненной 10% РС8 (КРМЫ0).
Обогащение мононуклеаров человеческой периферической крови.
Человеческую кровь дважды разводят в среде КРΜI 1640 и клетки крови наносят слоями на Ртсо11 (Ьутрйосу(е 8ерага(юп МеДшт (среда для разделения лимфоцитов) 1077 г/мл, 710 г, КТ (комнатная температура), 20 мин; В^οVΗ^ιιаке^. СатЪгех Вю 8шепсе VеηДе^8, Vе^ν^е^8, Ве1дшт, сак 17-829Е, 1ок по.
- 46 021644
014832). Мононуклеары периферической крови (ΜNС) собирают из интерфазы, отмывают и ресуспендируют в культуральной среде ΡΡΜΙ 1640, дополненной 10% РС8, 2 мМ Ь-глутамина, 5 Ед./мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина (все от Β^ο\V11^иаке^). к которой добавлено 25 мМ ΗΕΡΕδ (ЬюХУНШакег).
Проведение анализа АЭСС.
В-клетки-мишени (свежевыделенные В-клетки или линии В-клеток) метят с помощью 20 мкКи 51Сг (АтегкЬат Β^08С^еηсе8, Ирр8а1а, 8^ейеп) в течение 2 ч. После интенсивного отмывания в среде ΡΡΜΙ-10 концентрацию клеток доводят до 1х 105 клеток/мл. Цельную кровь, или изолированные эффекторные клетки (50 мкл; ΜΝΟ, ΡΜΝ), или плазму (50 мкл), сенсибилизирующие антитела (50 мкл) и ΡΡΜΙ-10 (50 мкл) помещают в круглодонные микротитрационные плашки (Отешет Βώ-Опе СтЬН, РпскепЬаикеп, Сегтапу). Анализы начинают, добавляя клетки-мишени (50 мл), получают конечный объем 200 мкл. В случае выделенных эффекторных клеток используют соотношение эффектора к мишени (Е:Т) 40:1. Для цельной крови используют количество 33 об.%, соответствующее установленному соотношению эффектора к мишени 40:1. После инкубации (3 ч, 37°С) анализ прекращают центрифугированием и сцинтилляционным счетчиком в тройном повторе измеряют высвобождение 51Сг числом импульсов в 1 мин (срт). Клеточную цитотоксичность в процентах вычисляют по следующей формуле:
специфический лизис % = (экспериментальное срт - базисное срт)/ (максимальное срт - базисное срт) х 100 максимальное высвобождение (выделение) 51Сг измеряют, добавляя перхлорную кислоту (конечная концентрация 3%) к клеткам-мишеням, а базисное выделение измеряют в отсутствие сенсибилизирующих антител и эффекторных клеток.
Статистика.
Данные анализируют односторонним дисперсионным анализом ΑNΟVΑ с последующим тестом Тьюки для множественных роЧ-Ьос сравнений. Анализ осуществляют с помощью ОгарЬ Ρаά Ρτίκιη (версия 3.02 для ХУшйозук, ОгарЬ Ρаά 5оП\уаге, §ап О|едо, СА, И8А).
Лизис клеток АРН-77.
В первой серии экспериментов в качестве клеток-мишеней используют клетки АРН-77 (фиг. 20). Добавление 2Р2 (п=3), ритуксимаба (п=3) или 11В8Т (п=1) вызывает опосредованный ΜΝ0, примерно 50%-ный лизис клеток АРН-77. Специфический лизис не наблюдается в присутствии нейтрофилов. Добавление плазмы (для оценки роли комплемента) вызывает лизис клеток АРН-77 после инкубации с 2Р2, но не после инкубации с ритуксимабом (р<0.05, сравнение данных в присутствии 2Р2 (ν8.) и в отсутствие антитела, ΑNΟVΑ) или 11В8Т. В присутствии цельной крови лизис клеток АРН-77 повышается после инкубации с 2Р2 (р<0.05, 2Р2 ν8. ритуксимаб и 2Р2 ν8. отсутствие антитела, ΑNΟVΑ), но не с ритуксимабом. Специфический лизис, вызванный ритуксимабом, на самом деле очень низок в присутствии цельной крови. 11В8Т вызываеТ-клеточный лизис с уровнем примерно 25% (п=1) в присутствии цельной крови. В отсутствие антитела наблюдается 10-15%-ный неспецифический лизис.
Лизис клеток Β-СЬЬ.
Во второй серии экспериментов клетки хронического В-лимфоцитарного лейкоза (Β-СЬЬ), полученные от Β-СЬЬ пациентов (п=12), субклонируют в течение 5 циклов, а затем используют в качестве клеток-мишеней в эксперименте (фиг. 21). В отсутствие антитела специфический лизис не наблюдается, но добавление 2Р2, 11В8Т или ритуксимаба (10 мкг/мл) повышает уровень опосредованного ΜΝ0 специфического лизиса до 10-20% (р<0.001, ΑNΟVΑ). Инкубация клеток-мишеней с плазмой и 2Р2 индуцирует специфический лизис клеток В-СЬЬ, тогда как никакого специфического лизиса не наблюдается с 11В8Т или ритуксимабом (р<0.001, ΑNΟVΑ). Помимо этого, 2Р2 опосредует специфический лизис клеток В-СЬЬ после инкубации с цельной кровью. Никакого специфического лизиса клеток В-СЬЬ цельной кровью не наблюдается с 11В8Т (р<0.01, ΑNΟVΑ) или ритуксимабом (р<0.001, ΑNΟVΑ). Никакого специфического лизиса не наблюдается в присутствии нейтрофилов.
Так как ритуксимаб способен опосредовать эффективную АЭСС, но не СЬС (цитотоксичность) тестируемых опухолевых клеток, то, по-видимому, индуцированный цельной кровью лизис В-клеток при использовании 2Р2 опосредуется комплементом.
Лизис клеток волосатоклеточного лейкоза (НСЬ).
В третьей серии экспериментов определяют лизис клеток НСЬ при использовании 2Р2, 11В8Т и ритуксимаба с помощью АЭСС или в присутствии плазмы или цельной крови. Данные показаны на фиг. 22. В то время как нейтрофилы не могут опосредовать АЭСС вне зависимости от применяемого тАЬ, 1Ш8Т может индуцировать ΜNС-опосредованный лизис НСЬ клеток более эффективно, чем 2Р2 (р<0001, ΑNΟVΑ) или ритуксимаб (р<0.05, ΑNΟVΑ). 2Р2 и ритуксимаб не могут индуцировать ΜΝ0опосредованный лизис НСЬ клеток. Опосредованный плазмой лизис клеток значительно повышается при использовании 2Р2 по сравнению с ритуксимабом (р<0.05, ΑNΟVΑ), 1Ш8Т (р<0.01, ΑNΟVΑ) или в сравнении с отсутствием антитела (р<0.001, ΑNΟVΑ). При изучении лизиса, индуцированного антителом против СЬ20 в присутствии цельной крови, 2Р2 индуцирует полный лизис клеток и уровень его выше, чем в присутствии ритуксимаба (р<0.01, ΑNΟVΑ), 1Ш8Т или в отсутствие антитела (р<0.001, ΑNΟVΑ).
- 47 021644
Лизис клеток В-АЬЬ.
На клетках двух пациентов изучена способность 2Р2 и ритуксимаба индуцировать лизис В-АЬЬ клеток с помощью АЭСС или комплемента (фиг. 23). Как наблюдалось в предыдущих экспериментах, 2Р2 и ритуксимаб индуцирует ΜNС-опосредованную АЭСС клеток В-АЬЬ в одинаковой степени. Но опять же, 2Р2 способен индуцировать лизис В-АЬЬ клеток, опосредованный плазмой или цельной кровью, тогда как ритуксимаб не способен.
Лизис клеток фолликулярной лимфомы.
При исследовании лизиса фолликулярной лимфомы (п=2) наблюдается другая картина (фиг. 24). Наблюдается минорный РМ№опосредованный лизис 2Р2, и как 2Р2, так и ритуксимаб не способны индуцировать ΜNС-опосредованную АЭСС. 11В8Т еще способно индуцировать ΜNС-опосредованный лизис примерно на 20%. Хотя ритуксимабом индуцируются относительно высокие уровни опосредованного плазмой лизиса, полный опосредованный плазмой лизис наблюдается с 2Р2. Также при использовании цельной крови полный лизис наблюдается с 2Р2, тогда как с ритуксимабом уровень лизиса составляет 70%. В случае 11В8Т наблюдается минимальный уровень лизиса, опосредованного плазмой или цельной кровью.
Лизис клеток лимфомы клеток мантийной зоны.
Труднее вызвать лизис клеток лимфомы мантийной зоны (п=1, фиг. 25). Минимальный уровень лизиса или отсутствие лизиса при использовании 2Р2, 11В8Т или ритуксимаба наблюдается после прибавления ΡΜN ил ΜNС и тАЬк против СЭ20. Однако антитело 2Р2 еще способно вызвать примерно 40%ный лизис при использовании плазмы или цельной крови, тогда как в случае ритуксимаба лизируется только 10-20% клеток. 11В8Т не способен индуцировать лизис первичных клеток лимфомы мантийных клеток.
Зависимый от концентрации антитела лизис клеток АКН-77 в цельной крови.
В следующем эксперименте (п=4) анализируют зависимость от дозы индукции АЭСС на клетках АКН-77 в присутствии цельной крови. Как видно на фиг. 26, титрование 2Р2 индуцирует зависимое от дозы повышение выраженного в процентах уровня специфического лизиса (р<0.05: эффект обработок, двусторонний АNОVА) клеток АКН-77. В случае ритуксимаба не наблюдается никакого специфического лизиса клеток АКН-77.
АЭСС анализ II.
Приготовление меченных 51Сг клеток-мишеней.
Клетки АКН-77 и клетки Райи собирают (3х106 клеток) в среде КΡΜI++, отделяют центрифугированием (1500 об/мин, 5 мин), ресуспендируют в 140 мкл 51Сг (Хром-51; С3811-1 мКи, партия 12, 140 мкл примерно эквивалентны 100 мкКи) и инкубируют; (37°С водяная баня; 1 ч). Клетки отмывают (1500 об/мин, 5 мин, в РВ8, 3х), ресуспендируют в КРМН+ и считают с помощью исключения трипанового синего. Клетки доводят до концентрации 2х 10 клеток/мл.
Приготовление эффекторных клеток.
Свежие мононуклеары периферической крови (ΜNС) выделяют из 40 мл гепаринизированной крови с помощью Рюо11 (Вю УНйакег, среда для отделения лимфоцитов, са! 17-829Е) по рекомендациям производителя. Клетки ресуспендируют в КРМН+, считают исключением трипанового синего и доводят до концентрации 1 х 10 клеток/мл.
Определение АЭСС.
мкл КРМН+ пипеткой вносят в 96-луночные планшеты и добавляют 50 мкл меченных 51Сг клеток-мишеней. Затем добавляют 50 антитела, разведенного в КРМН+ (конечные концентрации 10, 1, 0.1, 0.01 мкг/мл). Клетки инкубируют (КТ, 10 мин) и добавляют 50 мкл эффекторных клеток, получают соотношение эффектора к мишени 50:1 (для определения максимального лизиса вместо эффекторных клеток прибавляют 50 мкл 5% Тритон-Х-100). Клетки отделяют на центрифуге (500 об/мин, 5 мин) и инкубируют (37 °С, 5% СО2, 4 ч). Клетки центрифугируют (1500 об/мин, 5 мин), 100 мкл супернатанта собирают в микропробирки и считают на гамма-счетчике. Процент специфического лизиса вычисляют следующим образом:
% специфического лизиса = (срт образца- срт одних клеток- мишеней)/(срт максимального лизиса- срт одних клеток- мишеней) х 100
Статистика.
Данные анализируют односторонним дисперсионным анализом АNОVА с последующим тестом Тьюки для множественных рок!-Ьос сравнений. Анализ осуществляют с помощью СгарЬ Рай Рпкт (версия 3.02 для \Утйо\ук, СгарЬ Рай 8ойуаге, 8ап О|едо, СА, И8А).
Зависимый от концентрации антитела лизис клеток АКН-77 и клеток Райи.
2Р2Т и 11В8Т проверяют на способность индуцировать АЭСС клеток АКН-77 и клеток Райи (п=3) с ритуксимабом.
Зависимое от дозы отношение тАЬк к ί'.Ό20 наблюдают при АЭСС клеток АКН-77 при использовании ΜNС в качестве эффекторных клеток (фиг. 27). Как 2Р2Т, так и 11В8Т индуцируют специфический лизис клеток АКН-77, максимальный (50%) при концентрации тАЬ 10 мкг/мл. Ритуксимаб вызыва- 48 021644 ет только 25%-ный лизис клеток-мишеней. Добавление изотипического контрольного антитела (НиМаЬКЬН) не индуцирует лизис АОСС. Никакого специфического лизиса не наблюдается без добавления ΜNС (данные не показаны).
Если в качестве клеток-мишеней используют клетки Райи, наблюдается такая же картина, что и в случае с клетками АКН-77 (фиг. 28). Как 2Р2Т, так и 11В8Т индуцируют ΜNС-опосредованный лизис клеток Райи, хотя при низких концентрациях 2Р2Т, по-видимому, более эффективно, чем 11В8Т. Максимальный уровень лизиса, достигаемый в случае 2Р2Т и 11В8Т, составляет около 35%. Ритуксимаб индуцируют МИС-опосредованный лизис клеток Райи, хотя только 20% клеток-мишеней чувствительно к ритуксимабу. Добавление изотипического контрольного антитела (НиМаЬ-КЬН) не индуцирует лизис АОСС. Никакого специфического лизиса не наблюдается без добавления МКС (данные не показаны).
Пример 8. Анализ РКЕТ и анализ на основе нерастворимости Тритона-Х (ТпЮп-Х).
Получение Су3-и Су5-конъюгированного тАЬ для флуоресцентного резонансного переноса энергии (РКЕТ).
Моноклональные антитела непосредственно конъюгируют с бифункциональными N48сложноэфирными производными Су3 и Су5 (АтегеЬат Βίοδ№ι^δ ИК ЫД), как описано в рекомендациях производителя. Коротко говоря, тАЬ диализуют против 0.1 М карбонатно/бикарбонатного буфера (рН 9). Затем краситель растворяют в Н20, сразу же прибавляют к 1 мг тАЬ и инкубируют при комнатной температуре в темноте в течение 45 мин. Меченые тАГО отделяют от неконъюгированного красителя гель-хроматографией на колонке РО10-8ерЬаДех О25, уравновешенной в РВ8. Молярные соотношения связывания определяют спектрофотометрически от 8552=150/мМ/см для Су3, е650=250/мМ/см для Су5 и е280 =170/мМ/см для белка и в интервале 5-8-кратный избыток красителя: белок.
Анализ РКЕТ.
Клетки Дауди ресуспендируют при концентрации 5х106 клеток/мл в РВ8/0.1% В8А и к клеточной суспензии прибавляют эквимолярное количество донорного (Су3)-конъюгированного и акцепторного (Су5)-конъюгированного тАЬ (конечная концентрация 10 мкг/мл). Клетки инкубируют в течение 30 мин в темноте при 4°С или при 37°С. В каждом эксперименте участвуют клетки, меченные конъюгированным с донором или конъюгированным с акцептором тАЬ в результате преинкубации с 5-кратным молярным избытком неконъюгированного тАЬ, и клетки, меченные конъюгированным с донором с акцептором тАЬ в присутствии эквимолярного количества неконъюгированного тАЬ. Для оценки ассоциации меченых антигенов проводят измерения методом проточноцитометрического РКЕТ на приборе РАС8саБЬиг (ΒΌ Βίοδ№ικχδ). Интенсивности флуоресценции при 585 нм (РЬ2) и 650 нм (РЬ3), в обоих случаях возбуждение при 488 нм, и интенсивности флуоресценции при 661 нм (РЬ4), возбуждаемой при 635 нм, детектируют и используют для расчета РКЕТ по приведенному ниже уравнению, где А обозначает акцептор (Су5), а Ό обозначает донор (Су3). Для всех полученных значений делают поправку на аутофлуоресценцию по следующей формуле:
РКЕТ = РЬЗ(В,А)- РЬ2(В,А)/а- РЬ4(О,А)Л где а = РЬ2(П)/ТЪЗ(О) а Ь = РЬ4(А)/РЬЗ(А)
Скорректированные параметры получают, используя данные, полученные на клетках, меченных одной меткой, а боковое рассеяние света используют для того, чтобы отсеять клеточный дебрис и мертвые клетки. РКЕТ между донорными и акцепторными тАЬ производными на клетках, меченных двумя метками, выражают как сенсибилизированную акцептором эмиссию при 488 нм. Более высокие значения РКЕТ указывают на более тесную физическую ассоциацию антител, меченных донором и акцептором, или на более высокую плотность меченного акцептором тАЬ вблизи от меченного донором тАЬ.
Оценка антигена, ассоциированного с рафтом, основанная на нерастворимости Тритона-Х-100 (ТХ).
Для быстрой оценки присутствия антигена в микродоменах рафтов используют метод проточной цитометрии, основанный на нерастворимости Тритона-Х-100 (ТХ) при низких температурах, описанный ранее. Коротко говоря, клетки Дауди отмывают в КРМ1/1%В8А и ресуспендируют при концентрации 2.5х106 клеток/мл. Затем клетки (100 мкл) инкубируют с 10 мг/мл тАЬ, конъюгированными с Р1ТС, в течение 15 мин при 37°С, отмывают в холодном РВ8/1%В8А/20 мМ азида натрия (РВ8-В8) и образец делят пополам. Во время остального анализа все образцы хранят на льду. Одну половину хранят на льду, что позволило бы рассчитать 100%-ные уровни поверхностных антигенов, в то время как другую половину обрабатывают 0.5% ТХ в течение 15 мин на льду для определения пропорции антигена, остающегося в нерастворимой рафтовой фракции. Затем клетки хранят при 4°С до конца анализа, отмывают РВ8В8, снова суспендируют в РВ8-В8 и анализируют проточной цитометрией. Для определения конститутивного уровня ассоциации рафтов с антигенами-мишенями клетки сначала обрабатывают 0.5% ТХ в течение 25 мин на льду и промывают РВ8-В8 перед связыванием тАЬ, меченных Р1ТС.
Как показано на фиг. 29А, 29В и 29, метод флуоресцентного переноса резонансной энергии (РКЕТ) показывает образование кластеров СЭ20 при инкубации с 2Р2 или 7Ό8. Никакого образования кластеров не обнаруживается при инкубации с 11В8. Эти результаты согласуются с данными обработки ТХ, ср. фиг. 29С (т.е. 2Р2 и 7Ό8, в отличие от 11В8, после связывания остаются в нерастворимой фракции клеток) и подтверждают концепцию, что 2Р2 и 7Ό8 после связывания переносят (транслоцируют) СЭ20 в
- 49 021644 компартмент липидного рафта В-клеточной мембраны.
Как показано на фиг. 30 (значения РКЕТ и 8.е.т. (стандартной ошибки) из трех экспериментов односторонним дисперсионным анализом ΑΝΟνΑ с последующим тестом Тьюки для множественных ροδί1юс сравнений), РКЕТ анализ указывает на образование кластеров ритуксимаба и 2Р2, тогда как в случае 1188Т образования кластеров не наблюдается. Эти данные находятся в соответствии с данными, полученными после обработки 0.5%ТХ перед связыванием тΑЬ, меченных Р1ТС, см. фиг. 31 (п=2).
Получение фракции липидных рафтов и вестерн-блоттинг.
Другим способом изучения ассоциации СЭ20 с липидными рафтами является исследование распределения СЭ20 в мембране между фракциями липидных рафтов и участками, не содержащими рафтов, используя метод градиентного фракционирования сахарозы, описанный Эеапк, Ι.Ρ., еί а1., I. ΒίοΙ. СНет., 1998. 273(1): ρ. 344-348, с одним изменением: вместо сахарозы берут ΟρΙίριτρ Лдта). Моноклональные антитела против СЭ20 (10 мкг/мл) оставляют связываться с клетками Дауди (1х 107) в течение 20 мин при 37°С. После этой инкубации клетки центрифугируют (пеллетируют), отмывают дважды ΡΒδ и лизируют в охлажденном льдом буфере для лизиса (1.0% ТХ в забуференном ΜЕδ физиологическом солевом растворе (25 мМ ΜЕδ, рН 6.5, 150 мМ №С1, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, 5 мкг/мл апротинина, 5 мкг/мл лейпептина, 10 мМ Е^ТΑ)). Клеточные пеллеты тщательно ресуспендируют в течение 20 мин на льду. Затем лизат смешивают с 400 мкл холодного препарата 60% ΟρΙίριτρ Лдта). Образец покрывают слоем 600 мкл каждого разведения Ορίίρκρ: 35, 30, 25, 20, 0% в буфере для лизиса. Градиенты центрифугируют при 40.000 об/мин при 4°С в течение 18 ч. Шесть фракций собирают сверху, подвергают электрофорезу на 4-15% δ^δ-ΡΑОЕ геле, переносят на нитроцеллюлозные мамбраны и инкубируют с первичным антителом (мышиные антитела (поликлональных сывороток) против СЭ20 (апЦ-СЭ20 ρο1\^π·ι; δе^οίес, иК)), а затем с НКЕ-конъюгированным вторичным антителом (кроличье антитело против мышиного НКГ; ΓκΚδοη, Βπτ На^Ьο^. Μа^ηе, υδΑ). Блоты визуализуют, используя субстрат пролонгированного действия δ^Γδίβΐη-ιΙ Ае$1 Эта Легсе, ΧνοόιίΓη, ΜΑ, υδΑ).
Результаты показаны на фиг. 32. Видно, что присутствие молекул СЭ20 ограничивается фракцией с высокой плотностью 5 (необработанные клетки). В клетках, обработанных ритуксимабом, наблюдается заметный сдвиг распределения СЭ20 при значительной доле в мембранных фракциях 2 и 3 с низкой плотностью, соответствующих фракции, в которых, как ожидается, происходит седиментация рафтовых участков мембраны. В клетках, обработанных 2Р2, также наблюдается этот сдвиг во фракции 2 и 3. Напротив, в случае клеток, в течение 20 мин обработанных 11В8Т, наблюдается аналогичное распределение, аналогичное распределению в необработанных клетках, с присутствием молекул СЭ20 во фракции 5. В заключение можно сказать, что связывание с 2Р2 и ритуксимабом индуцирует сдвиг молекул СЭ20 в мембранные фракции с более низкой плотностью, тогда как связывание с 11В8Т такого сдвига не дает.
Пример 9. Апоптоз клеточных линий Беркитта человеческими антителами против СЭ20.
Апоптоз.
Клетки Дауди, 0.5х106 в 1 мл среды для тканевых культур, помещают в 24-луночные плоскодонные планшеты, содержащие 1 или 10 мкг/мл тΑЬ или контрольных антител, и инкубируют при 37°С. Через 20 ч клетки собирают, отмывают в буфере, связывающем Αηηеx^η-V-РIТС (ΒΌ Ъю8аепсе8), и метят с помощью Αηηеx^η-V-РIТС (ΒΌ Ъю8аепсе8) в течение 15 мин в темноте при 4°С. Клетки хранят при 4°С до анализа. Каждый образец (150 мкл) прибавляют к 10 мкл раствора ΡΙ (10 мкг/мл в ΡΒδ) в пробирке РΑСδ. Смесь сразу же анализируют проточной цитометрией на проточном цитометре с РΑСδса1^Ьи^ с помощью программы Се11Оие51 ρτο (ΒΌ Β^οδс^еηсеδ, ΜοιιηΕιίη νΐϋ^, СΑ). Для анализа собирают по меньшей мере 10000 событий.
Индукция апоптоза в клетках Дауди.
Клетки Дауди инкубируют в течение 20 ч в присутствии человеческих антител против СО20 (1 мкг/мл) (без добавления вторичного сшивающего антитела). Индукцию апоптоза анализируют методом проточной цитометрии с окрашиванием с помощью Αηηϋχΐη-ν/ΡΙ.
Как показано на фиг. 33Α-Ο, в случае 11В8 имеется четкое свидетельство индуцирования апоптоза (аналогично апоптозу, индуцированному антителом против Ι§Μ). 2Р2 и 7Ό8 не индуцируют апоптоз клеток Дауди. В качестве контрольного используют АТ80, мышиное антитело, индуцирующее апоптоз против СО20.
Индукция апоптоза в клетках Райи.
Индукцию апоптоза клеток Райи анализируют в интервале концентраций тΑЬ против СО20. На фиг. 34 показано процентное содержание позитивных в отношении аннексина-ν клеток. Как видно на фиг. 34, позитивное контрольное мышиное тΑЬ против человеческого СО20, В1, индуцирует зависимое от концентрации повышение апоптоза клеток Райи с максимальным значением примерно 70% при 10 мкг/мл тΑЬ. 11Β8 также является сильным индуктором апоптоза, вызывая апоптоз клеток Райи с максимумом 53.4% при концентрации тΑЬ 10 мкг/мл. С другой стороны, 2Р2 и ритуксимаб в очень слабой степени индуцируют апоптоз клеток Райи: слегка повышенные уровни вызываемого ими апоптоза сравнимы с уровнями негативного контроля.
- 50 021644
Индукция апоптоза в клетках Дауди.
Такая же картина наблюдается при добавлении 1.0 мкг/мл тАЬ против СЭ20, когда в качестве клеток-мишеней используют клетки Дауди (фиг. 35А и 35В). Данные на фиг. 35 показывают сумму (все количество) клеток, позитивных в отношении аннексина-У, а данные на фиг. 35В (данные на оси X относятся к аннексину-У, а на оси Υ к ΡΙ) показывают процентное содержание клеток Дауди при раннем апоптозе (клетки, позитивные в отношении аннексина-У и негативные в отношении ΡΙ) и при позднем апоптозе (клетки, позитивные в отношении аннексина-У и позитивные в отношении ΡΙ). Опять же, как В1 (65.9%), так и 11В8Т (56.3%) являются сильными индукторами апоптоза при концентрации 1.0 мкг/мл. Прибавление 2Р2Т дает низкий уровень апоптотических клеток Дауди (17%). Прибавление ритуксимаба вызывает уровень апоптоза клеток Дауди 29%. Добавление изотипического контрольного антитела НнМаЬ-КЬН не индуцирует апоптоз клеток Дауди (6%).
Пример 10. Гомотипическая адгезия клеток с человеческими антителами против СЭ20.
Гомотипическая адгезия коррелируется с индукцией апоптоза. Поэтому изучают способность тАЬк против СЭ20 индуцировать гомотопическую агрегацию В-клеток.
Гомотипическая агрегация клеток Каток-ЕНКВ.
Клетки Каток-ЕНКВ (0.5х106 в 1 мл тканевой культуральной среды) инкубируют при 37°С в течение 4 ч в присутствии антител против СЭ20 11В8, 2Р2 или 7Ό8 (без сшивания) и индукцию гомотипической адгезии изучают методом световой микроскопии (описанной выше).
Как показано на фиг. 36А-Е, 11В8 вызывает интенсивную агрегацию клеток Каток-ЕНКВ (аналогично агрегации, вызванной АТ80, мышиным антителом против СЭ20). 2Р2 и 7Ό8 не индуцируют гомотопическую агрегацию клеток Каток.
Гомотипическая агрегация клеток Дауди.
Клетки Дауди помещают в 24-луночные плоскодонные планшеты при концентрации 1 или 10 мкг/мл тАЬ против СЭ20 или контрольного антитела и инкубируют при 37°С в течение 4 ч. Степень гомотипической агрегации определяют световой микроскопией. Как видно на фиг. 37, 2Р2 с трудом индуцирует агрегацию клеток Дауди при концентрации 1.0 мкг/мл (и 10 мкг/мл, данные не показаны). Ритуксимаб вызывает небольшую гомотопическую агрегацию клеток Дауди. Напротив, антитело В1 является сильным индуктором гомотипической агрегации.
Пример 11. Иммунотерапия с применением человеческих антител против СЭ20.
Терапия высокой дозой (100 мг) 2Р2 и 7Ό8 мышей 8СГО, которым введены (зараженных клетками) клетки Дауди. Мышей 8СГО получают от Наг1ап ИК Ый., В1аск11югп, Охоп, ИК, размножают и хранят в стерильных условиях. Клетки Дауди (2.5х 106) инъецируют в.в. (внутривенно) в хвостовую вену группам 12-16-недельных мышей 8СГО, а через 7 дней таким же способом инъецируют 100 мкг 2Р2 или 7Ό8. Показателем поражения животного является паралич конечностей в соответствии с инструкциями комиссии по этике при работе с животными. Как показано на фиг. 38, продолжительность жизни (выживание) мышей увеличивается после обработки с помощью 2Р2 или 7Ό8.
Терапия высокой дозой (100 мкг) 2Р2 и ритуксимаба мышей 8СГО, которым введены (зараженных клетками) клетки Тапоие. Клетки Тапоие (2.5х 106 в 200 мкл ΡВ8) инъецируют в.в. (внутривенно) в хвостовую вену группам 12-16-недельных мышей 8СГО (Наг1ап ИК Ый., В1аск1йотп, Охоп, ИК), а через 7 дней таким же способом инъецируют 100 мкг (в 200 мкл ΡВ8) 2Р2 или 7Ό8. В этом эксперименте 2Р2 сравнивают с ритуксимабом и В1. Показателем поражения животного является паралич задних конечностей. Результаты показаны на фиг. 39. На 39 день первые две контрольные мыши гибнут, и в этой группе в день 54 гибнут все животные. В группе, принимавшей 2Р2, за это время погибла только одна мышь, и в этой группе продолжительность жизни (выживание) других мышей значительно выше. Одна мышь умерла на 81 день после инъекции опухолевых клеток, а остальные мыши (60% от всего количества) живы к концу эксперимента на 100 день после заражения. Напротив, ритуксимаб увеличивает срок жизни только 2 мышей из 5 (смерть на 66 и 83 дни после заражения) и ни одна мышь не доживает до конца эксперимента. В группе В-1 срок жизни (выживание) мышей 8СГО аналогичен сроку жизни в группе 2Р2, в этой группе две мыши гибнут на 48 день, а одна мышь на 76 день. В этой группе сорок процентов мышей живы ко времени окончания эксперимента.
Эффект дозы 2Р2 и ритуксимаба при лечении мышей 8СГО, зараженных клетками Дауди.
С целью оценки эффективности 2Р2 для защиты от опухолегенеза по сравнению с ритуксимабом определяют их дозу для терапии мышей 8СГО, зараженных опухолевыми клетками Дауди. Клетки Дауди экспрессируют больше СО20, чем клетки Тапоие, и более чувствительны к киллингу ш уйго. 10 группам мышей 8СГО (по 4 мыши в группе) и 1 контрольной группе (5 мышей 8СГО) инъецируют 2.5х106 клеток Дауди (в 200 мкл ΡВ8) в.в. в день 0, а затем в день 7 внутривенно (в.в.) вводят 20, 5, 2, 0.5 или 0.1 мкг ритуксимаба, 2Р2 или ΡВ8 (в 200 мкл ΡВ8). Показателем поражения животного является паралич задних конечностей. Результаты показаны на фиг. 40.
В контрольной группе все мыши погибают в дни 26-29. Однако в случае 2Р2 наблюдается четкий эффект дозы (соотношение доза-эффект) (фиг. 40, верхний график). В то время как эффект дозы не наблюдается при дозах 0.1 и 0.5 мкг 2Р2, доза 2 мкг 2Р2 существенно увеличивает срок жизни до 41 дня,
- 51 021644 доза 5 мкг 2Ρ2 увеличивает срок жизни до 47 дней и доза 20 мкг 2Ρ2 увеличивает срок жизни до 50 дней.
Напротив, ритуксимаб, даже при испытании в самой высокой дозе 20 мкг, лишь немного повышает срок жизни (выживание) и, следовательно, при более низких концентрациях не наблюдается никакого эффекта дозы (фиг. 40, нижний график).
Терапия мышей δί'.'ΙΌ с опухолями Дауди с помощью 11В8Т и В1.
Клетки Дауди (2.5х 106) инъецируют в.в. (внутривенно) в хвостовую вену группам 12-16-недельных мышей δΟΌ, а через 7 дней таким же способом инъецируют 100 мкг 11В8Т или В1. Показателем поражения животного является паралич нижних конечностей. В группе контрольных мышей, получавших ΡΒδ, все мыши гибнут в интервале между днем 35 и днем 53 (фиг. 41). Инъекция 11В8Т надежно защищает мышей, при этом мыши погибают между днем 72 и днем 98 после заражения опухолевыми клетками. В группе, инъецированной В1, большинство мышей доживает до дня 98, а 40% мышей живо до окончания эксперимента, т.е. до дня 100.
Пример 12. Оценка антител против СЭ20 на модели ДаудиЧис ксенотрансплантата у мышей δΡΙΌ.
Терапевтическую эффективность антител против СО-20 изучают на мышиной модели, в которой распространяют разрастание человеческих опухолевых В-клеток, а затем применяют внешнюю оптическую визуализацию (сцинтиграфию). В этой модели опухолевые клетки трансфецируют с помощью лиюциферазы светляков. При введении мышам люциферина ^ο^υΠτ РгоЪек (Молекулярные зонды), Ье1беп, ТЬе №!Ьег1апбк) меченые клетки можно обнаружить ш νίνο биолюминесцентной визуализацией (сцинтиграфией), используя ССО камеру с высокой чувствительностью, ср. \УеПег\уа1б е! а1. (2002) Атепсап Шитй οί Ра^^ду, 160(3): 1143-1153.
Клетки Дауди трансфецируют с помощью д\УЕ люциферазы из системы для генной терапии (Сепе ТЬегару δук!етк (δαιτ ^^едο, СА)) и культивируют в среде ΚΡΜI с 10% ΡСδ, Репитер, пирувата натрия и 1 мкг/мл пуромицина ^1дта). Клетки анализируют на экспрессию люциферазы (экспрессируемой в КЬИ/1х105 клеток) с помощью люминометра и на экспрессию СЭ20 с помощью ΡΑСδ. 2.5х106 трансфецированных при участии люциферазы клеток Дауди/мышь инъецируют в.в. мышам δΟΙΌ. Через восемь дней после инокуляции мышам вводят однократную дозу (10 мкг) 2Ρ2Τ, 11В8Т, ритуксимаба, В1 или изотипического контрольного антитела (ЬШдСЦ (6 мышей в группе обработки). Для проведения визуализации (сцинтиграфии) мышей усыпляют с помощью ί.ρ. (интраперитонеальной инъекции) смеси кетамин/кселазин/атропин. Синтетический Ό-люциферин (натриевая соль, (молекулярные зонды) Μο1еси1а^ РгоЪек) вводят интраперитонеально в дозе 25 мг/мл. Затем мышей помещают в легкий тесный бокс и через 3 мин начинают сцинтиграфию с применением охлаждаемого жидким азотом детектора ССО Vе^кΑ^^ау 1300В (^рег δ^τιΟί^). Излучаемые люциферазой фотоны считают в течение периода экспозиции 5 мин. Черные и белые изображения при освещении берутся в качестве стандарта. Для сбора данных и анализа изображения используют программное обеспечение Ме!а^е гай^ате Шшуегка1 Пмадтд С-'οΓρ.). Статистическую значимость разницы между группами устанавливают методом одностороннего анализа вариантов, используя тест Ньюмена-Кейсла, с помощью программы СгарЬРаб РКШМ, версия 3.02 (СгарЬраб δοΠ\ναΐΌ Шс).
Сцинтиграфию с темной стороны осуществляют с недельными интервалами. На восьмой день, в день обработки, эмиссию света обнаруживают только в местах инокуляции в хвосте. Образование опухоли в удаленных местах обнаруживают в день 14 у всех мышей контрольной группы, получавшей изотипическое контрольное антитело (Ьп[дС1), и у одной мыши из группы, получавшей ритуксимаб. В последующие недели эмиссия света постоянно повышается. На фиг. 42 даны изображения мышей в день 39 (31 день после обработки), где биолюминесценция представлена красным цветом (темные области у мышей) (интенсивность света > 50 фотонов за 5 мин), который налагается на черно-белое изображение мышей. Массу опухоли количественно определяют в дни 25, 32, 39 и 46, интегрируя области световых сигналов на поверхности тела, ср. фиг. 43. Наиболее быстрый рост опухоли наблюдается в группе, получившей изотипическое контрольное антитело. Обработка ритуксимабом приводит к значительной задержке роста опухоли. Однако ингибирование (задержка) роста опухоли под действием 2Ρ2Τ, 11В8Т и В1 значительно более значительна (уровни значимости см. ниже в табл. 2).
- 52 021644
Таблица 2
Уровни значимости разницы общей интенсивности света между группами в различные моменты времени (временные точки)
День 25 День 32 День 39 День 46
Β1 νε. ритуксимаб Ρ > 0.05 Ρ < 0.05 Ρ<0.01 Ρ< 0.001
Β1 νε. 11В8Т Ρ > 0.05 Ρ > 0.05 Ρ > 0.05 Ρ > 0.05
Β1 νε. 2РТ2 Ρ > 0.05 Ρ > 0.05 Ρ > 0.05 Ρ > 0.05
Β1 νε. Ьи1§01 Ρ < 0.001 Ρ < 0.001 Ρ <0.001
ритуксимаб νε. 11В8Т Ρ>0.05 Ρ < 0.05 Ρ <0.01 Ρ < 0.001
ритуксимаб νε. 2Р2Т Ρ > 0.05 Ρ > 0.05 Ρ > 0.05 Ρ < 0.001
ритуксимаб νε. №§61 Ρ< 0.001 Ρ>0.05 Ρ < 0.05
ΙΙΒδΤνε. 2Р2Т Ρ > 0.05 Ρ > 0.05 Ρ > 0.05 Ρ > 0.05
ΙΙΒδΤνε №§61 Ρ< 0.001 Ρ< 0.001 Ρ < 0.001
2РТ2 νε. ΙΙΒδΤ Ρ С 0.001 Ρ < 0.01 Ρ < 0.01
Пример 13. Пилотное и фармакокинетическое исследование на макаках циномолгус.
Целью является определить фармакокинетический паттерн и фармакологическое действие 2Р2 у макак циномолгус (примерный возраст 2 года; вес в пределах 2.1-2.6 кг) после однократной ежедневной инфузии (в подкожную вену в ноги) 4 дня подряд. В данном исследовании также проводится сравнение фармакологического действия ритуксимаба для определения его эквивалентного потенциала. С этой целью 6 самцов и 6 самок макак циномолгус разбивают на 6 групп в зависимости от дозы, которые получают 2Р2 или ритуксимаб при уровнях доз 1.25, 6.25 и 12.5 мг/кг/день при постоянном объеме дозы 10 мл/кг 4 дня подряд, всего 5, 25 и 50 мг/кг соответственно. После введения последней дозы животных оставляют для последующего наблюдения в течение 130 дней. Практическая работа и методики в ходе этого изучения соответствуют Правилам работы в лаборатории (Οοοά ΕαόοπιΙοΓν Ргас11се) ОБСЕ, установленным Министерством здравоохранения Великобритании. У всех животных регулярно проверяют признаки заболевания или реакцию на лечение и их подвергают физическому исследованию. В процессе лабораторных гематологических исследований определяют свертывание крови, проводят клинический анализ и анализ мочи. Образцы крови и биопсии лимфатических узлов получают (из поверхностных лимфатических узлов) для анализа проточной цитометрией в процессе введения доз и в период последующего наблюдения. Проточной цитометрией анализируют следующие клеточные фенотипы: СБ3, СБ4, СБ8,СБ20 и СБ21. По завершении периода наблюдения после последнего введения доз животных умерщвляют и проводят подробную аутопсию.
Не наблюдается клинических признаков побочного действия или любых проявлений, о которых можно сказать, что они связаны с лечением 2Р2 или ритуксимабом. На фиг. 44 и 45 показан анализ с помощью проточной цитометрии клеток периферической крови, экспрессирующих СБ20 или СБ21. На фиг. 46 показан анализ клеток лимфатических узлов, экспрессирующих СБ20 или СБ21, методом проточной цитометрии. Вместе оба анализированных в ходе исследования фенотипа показывают сильное и эффективное истощение В-клеток после введения 2Р2 и ритуксимаба при дозе 6.25 мг/кг/день (всего 25 мг/кг) и 12.5 мг/кг/день (всего 50 мг/кг). Кроме того, данные показывают, что репопуляция клеток, экспрессирующих СБ20 в лимфатических узлах и периферической крови животных, получавших 2Р2, снова начинается на 75 день после приема тотальных доз 25 и 50 мг/кг, т.е. заметно позже, чем у животных, получавших ритуксимаб.
Кроме того, на фиг. 47А-С показаны результаты анализа методом проточной цитометрии субпопуляций клеток периферической крови, экспрессирующих ίΌ20Ιο'“ί.Ό23'ί.Ό40Ιιι?|1 (Υ. УидтеуГОег еί а1. (2003) Суктейу 52А:101-109).
Клетки периферической крови обезьян, получавших 2Р2 или ритуксимаб при уровне доз 1.25 мг/кг (фиг. 47А), 6.25 мг/кг (фиг. 47В) и 12.5 мг/кг (фиг. 47С) в виде инфузии один раз в день ежедневно 4 дня подряд, инкубируют с ПТС мышиным моноклональным антителом против человеческого СБ20 (ОиНет) при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем вместе с РВ8 прибавляют гранулы для подсчета и клетки дважды отмывают (300 г за 10 мин), а затем сразу же анализируют на проточном цитометре (Βесктаη СоиНе!·) субпопуляцию клеток, экспрессирующих 0020|ο^0023'ΟΩ40Ηι?Η в сравнении с субпопуляцией клеток, экспрессирующих С1)20' С1)2<С1)40 ·. Результаты, показывающие число клеток, экспрессирующих 0020|ο^0023'0040|ι?Η, выражаются как клетки/на 1 мл. Как видно на фиг. 47, антитело 2Р2 способно вызывать полное и более продолжительное истощение клеток, экспрессирующих 0020|ο^0023'0040|ι?|1, по сравнению с ритуксимабом.
- 53 021644
Пример 14. Эпитопное картирование с применением сайт-направленного мутагенеза.
Исследования эпитопного картирования с применением подхода на основе мутагенеза показывает, что аланин в положении 170 (А170) и пролин в положении 172 (Р172) во второй внеклеточной петле имеют важное значение для распознавания человеческого СО20 с помощью известных антител против СО20. В работах Динса (Оеап8) и коллег (М.Е Ро1уак, е! а1., В1ооб, (2002) 99(9): р. 3256-3262; МД. Ро1уак, е1 а1., ί. Iттипо1, (1998) 161(7): р. 3242-3248) связывание всех тестируемых тАЬ8 против СЭ20 аннулируется (отменяется) при замене А170 и Р172 на соответствующие остатки δ170 и δ172 мышиного СЭ20. Некоторая гетерогенность наблюдается при распознавании АхР эпитопа, однако, тогда как большинство антител, подобных ритуксимабу, распознают мышиный СЭ20 с δ170 и 8172, мутировавшими в А170хР172 последовательности человеческого происхождения, в некоторых других антителах требуются дополнительные мутации непосредственно рядом с ^концом последовательности АхР. Для того чтобы проверить, является ли мотив А17-хР172 важным для связывания антител по изобретению, осуществляют мутацию последовательности АхР в δχδ с применением сайт-направленного мутагенеза (АхР мутант=Α170δ, Р1728), клетки трансфецируют с мутантом АхР и ДНК СЭ20 дикого типа (^Т) и сравнивают характеристики связывания тАЬ8 против СЭ20.
Используя сайт-направленный мутагенез, получают дополнительные мутанты, Р1728 (пролин в положении 172 мутирует (меняется на) в серин), N1660 (аспарагин в положении 166 мутирует в аспарагиновую кислоту) и N1630 (аспарагин в положении 163 мутирует в аспарагиновую кислоту), чтобы оценить важность мутантных аминокислотных остатков для связывания антител по изобретению.
Для изучения этого вопроса конструируют вектор экспрессии СО20 амплификацией кодирующей последовательности, используя подходящие праймеры, вводящие сайты рестрикции в идеальную последовательность Козака для оптимальной экспрессии. Амплифицированный фрагмент расщепляют и лигируют в экспрессирующий вектор рЕЕ13.4. После трансформации в Е. сой проводят скрининг колоний на инсерты и два клона выбирают для секвенирования, чтобы подтвердить корректность последовательности. Конструкцию обозначают рΕΕ13.4С^20Ηδ.
Мутагенез осуществляют для того, чтобы ввести мутацию АхР и 20 мутаций мышиной последовательности в области внеклеточной петли человеческого СО20. Мутагенез проверяют с помощью расщепления рестриктазой и секвенирования. Конструкции транзиторно трансфецируют в клетках СНО (для АхР мутаций) или в клетках ΗΕК293Р и анализируют через 24 и 48 ч после трансфекции проточной цитометрией.
Олигонуклеотидные ПЦР (РСК) праймеры.
Олигонуклеотидные праймеры синтезируют и количественно рассчитывают при использовании Нодеп ΒV (Мааг88еп, Тйе №1йег1апб8). Праймеры восстанавливают в воде с концентрацией 100 пмоль/мкл и хранят при -20°С до нужного момента. Краткие сведения о ПЦР и секвенировании праймеров даны в табл. 3.
Определение оптической плотности нуклеиновых кислот.
Оптическую плотность определяют на приборе иНго8рес 2100 рго С1а88Ю (Атегейат Вю8с1епсе8, ирр8а1а, δ\\ι^π) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК определяют, анализируя 0026о нм, где одна единица 0О260 нм=50 мкг/мл. Эталонный раствор идентичен раствору, применяемому для растворения нуклеиновых кислот.
Выделение плазмидной ДНК из культуры Е. соП.
Плазмидную ДНК выделяют из культур Е. сой, применяя наборы от Ц1адеп в соответствии с инструкциями производителя (^е81Ьигд ΒV, Ьешбеи, Тйе №1йег1апб8). Для получения объемных количеств плазмиды используют либо набор Н^рееб р1а8т1б Мах1, либо набор Н^рееб р1а8т1б М161 (Ц1адеп). Для получения плазмиды в малых количествах (т.е. 2 мл культуры Е. сой) применяют набор Ц1аргер 8рш М1И1ргер Кй (Ц1адеп) и ДНК элюируют в 50 мкл ТЕ (ТП8-НС110 мМ рН 8.0, Ε^ТΑ 1 мМ).
ПЦР амплификация.
Реакции ПЦР проводят в соответствии с рекомендациями производителя для ДНК полимеразы Р£иТигЬо© Но181аг1 ^ШИадепе, Ат81егбат, ТНе №1йег1апб8). Каждая реакционная смесь объемом 20 мкл 1хПЦР буфера для реакции, 200 мкМ бЭТР, 6.7 пмоль прямого и обратного праймеров, около 1 нг матричной ДНК и 1 Ед. полимеразы Р£и-ТигЬо© Но181аг1. Реакции ПЦР проводят в градиентном термоциклере (термоблоке) Т-дгаб1еп1 Тйегтосус1ег 96 (Вютейа ОтЬН, Ооейшдеп, Оегтапу) по программе из 30 циклов: +95°С в течение 2 мин, затем 30 циклов: +95°С в течение 30 с, отжиг: градиент 45-65°С в течение 30 с и удлинение: +72°С в течение 2 мин с последующей конечной стадией удлинения 10 мин при 72°С, хранение при 4°С. По окончании реакционные смеси анализируют электрофорезом на агарозном геле.
Электрофорез на агарозном геле.
Электрофорез на агарозном геле проводят в соответствии с δатЬ^оок (Мо1еси1аг С1отпд ЬаЬога1огу Мапиа1, 3гб ебйюп), используя 50 мл гелей в буфере 1хТЙ8/уксусная кислота/ЕОТА (ТАЕ). ДНК визуализуют включением этидия бромида в гель и наблюдением в УФ-свете. Изображение в геле регистрируют с помощью камеры ССО и системы анализа изображений (ОепеОпоте; δупдепе, СатЬпбде, иК).
- 54 021644
Расщепление рестриктазами.
Рестриктазы поставляются Νον Епд1апб Вю1аЩ (Веуег1у, МА) и применяются в соответствии с рекомендациями производителя. Как правило, 100 нг расщепляют с помощью 5 Ед. фермента(ов) в подходящем буфере в конечном объеме 10 мкл. Используют подходящие объемы реакционных смесей. Продукты расщепления инкубируют минимум в течение 60 мин при температуре, рекомендованной производителем.
В случае фрагментов, требующих двойного расщепления рестриктазами с несовместимыми требованиями относительно буфера или температуры расщепления проводят последовательно таким образом, чтобы для каждого фермента по очереди были предпочтительные условия.
Обработка щелочной фосфатовой.
Щелочную фосфатазу из креветок (И8В, С1еуе1апб, Ο4) используют согласно рекомендациям поставщика. Щелочная фосфатаза удаляет 5'-фосфатные группы на концах ДНК-фрагментов, тем самым предупреждая самосшивание (самолигирование). Особенно существенным является, когда саморелигирование ДНК-фрагмента может дать компетентный по репликации вектор. Фермент активен в большинстве буферов для фермента и добавляется по потребности. После расщепления фермент инактивируют, поднимая температуру до 70°С в течение 15 мин.
Очистка ПЦР и продукты взаимодействия с рестриктазами.
Очистку проводят с применением набора РСК Рипйсайп кН для элиминирования микроколичеств (от Ц1адеп) в соответствии с инструкциями производителя. Коротко говоря, образцы ДНК разводят в 5 об. буфера для связывания I (Ц1адеп) и наносят на миниколонку в центрифужной пробирке Эппендорфа. Сборку (ансамбль) центрифугируют на настольной микроцентрифуге. Колонку дважды промывают буфером II (Ц1адеп): После буфера набор центрифугируют и промывную жидкость (Яоубйгоидй) отбрасывают. Колонку сушат на центрифуге в отсутствие буфера. ДНК элюируют, пропуская через колонку буфера для элюирования, количественно определяют УФ-спектроскопией и содержание оценивают электрофорезом на агарозном геле.
Выделение ДНК-фрагментов из агарозного геля.
Когда требуется (т.е. когда присутствует несколько (много) фрагментов), образцы ДНК разделяют гель-электрофорезом и нужный фрагмент вырезают из геля и регенерируют, используя набор для экстракции в геле ЦМЕХ II (Ц1адеп) в соответствии с рекомендациями производителя. Коротко говоря, полосы ДНК вырезают из агарозного геля и расплавляют в подходящем буфере при +55°С. Добавляют полимер ЦМЕХ II и инкубируют в течение 5 мин. Полимер ЦМЕХ II осаждают (пеллеты) кратковременным центрифугированием (1 мин, 14000 д, КТ) и отмывают водным буфером РЕ (дважды по 500 мкл). Под конец пеллеты сушат в ламинаре, а ДНК элюируют соответствующим объемом ТЕ и при соответствующей температуре (в зависимости от размера ДНК).
Лигирование ДНК-фрагментов.
Лигирование проводят с применением набора для быстрого лигирования Цшск Ыдайоп Кб (№у Епд1апб Вю1аЩ) в соответствии с рекомендациями производителя. Для каждого лигирования векторную ДНК смешивают примерно с 3-кратным молярным избытком ДНК инсерта, так что общее количество ДНК составляет менее 200 нг в 10 мкл, при необходимости до нужного объема доводят водой. К этой смеси прибавляют 10 мкл 2x^и^ск Ыдайоп ВиГГег (буфера для быстрого лигирования и 1 мкл Цшск Т4 ДНК лигазы) и смесь для лигирования инкубируют в течение 5-30 мин при комнатной температуре.
Трансформация ДНК в бактерии.
Образцы ДНК используют для трансформации единичных Οικ 8йо1 ЭН5а-Т1К компетентных клеток Е. сой (!пу|1годеп, Вгеба, Тйе Nеίйе^1аηбδ) в соответствии с инструкциями производителя. Коротко говоря, 1-5 мкл раствора ДНК (как правило, 2 мкл смеси для лигирования ДНК) добавляют к аликвоте трансформированных компетентных бактериальных клеток и указанную смесь инкубируют на льду в течение 30 мин. Затем клетки подвергают тепловому шоку, перенося в водяную баню с температурой 42°С на 30 с с последующей дополнительной инкубацией на льду в течение 5 мин. Клетки оставляют для регенерации с помощью инкубации в неселективной культуральной среде (8ΟС) на 1 ч при встряхивании при 37°С, а затем наносят (распластывают) на плашки с агар-агаром, содержащие подходящий селективный агент (ампициллин в концентрации 50 мкг/мл). Плашки инкубируют в течение 16-18 ч при +37°С или до тех пор, пока колонии бактерий не станут явными.
Скрининг колоний бактерий методом ПЦР.
Бактериальные колонии подвергают скринингу на присутствие векторов, содержащих заданные последовательности, методом ПЦР для скрининга колоний. 20 мкл реакционной смеси, содержащей 0.5 об. смеси Но181агТас.] Маδΐе^ М1х (Ц1адеп), 4 пмоль прямого и обратного праймеров и дополненной водой, помещают в пробирку ПЦР. Колоний лишь слегка касаются кончиком пипетки на 20 мкл, один раз коснувшейся культур ЬВ в пробирке на 2 мл (для выращивания бактерий, содержащих соответствующую плазмиду) и ресуспендируют в 20 мкл смеси ПЦР. РСК проводят в Т-градиентном термоциклере (термоблоке) Т-дгаб1еп1 Тйегтосус1ег 96 (Вютеба) по программе из 30 циклов: +95°С в течение 15 мин, затем 35 циклов: +94°С в течение 30 с, отжиг: градиент 55°С в течение 30 с и удлинение: +72°С в течение
- 55 021644 мин с последующей конечной стадией удлинения 10 мин при 72°С, последующее хранение при 4°С. По окончании реакционные смеси анализируют электрофорезом на агарозном геле; см. в табл. 3 подробное описание пар праймеров, применяемых в ПЦР для колоний.
Секвенирование ДНК.
Образцы плазмид посылают на АСО^А (Вегйи, Сегтапу) для секвенирования. Последовательности анализируют с помощью программного обеспечения Vес!ο^NΤI ([пГогтах, Ргебепск, МО, И8А).
Таблица 3
Название Применение Длила Последовательность олигонуклеотида
СР20Р1725 СО20 мутагенез 36 ТООООАОТТТТТСТСАОАООААТТСОАТООТТСАСАСТТОТА
СШОТНббО СО20 мутагенез 39 ГОТААСАОТАТТОСОТАОАТООО
€ϋ20Ν103ϋ СШО мутагенез 36 ААТСАТООАСАТАСТТААТАТТА
сбЗОехТог СО20 конструкция 4] ТАТАОСССООООССОССАССАТОАСААСАСССАОАААТТСА
с020ехгеу СО20 конструкция 38 ОСОТСТСАТОТАСАТТААООАОАОСТОТСАТТТТСТАТ
рее134з«]геу2 ПЦР колоний 23 ТСООАСАТСТСАТОАСТТТСГТ
рСопКве^ 1 ПЦР колоний 23 ОТАОТСТОАОСАОТАСТСОТГОС
сб201г5арти1г (АхР) СОЮ мутагенез 42 ТОССОАСТТТТСТСАСАОСААТГСОАТОСТТСАСАОТТОТА
сд20Ь5артиЙ· (АхР) СО20 мутагенез 42 ТАСААСТОТОААССАТСОААТ1ССТСТОАОАААААСТССССА
СО20зн]2 СОЮ секвенирование 23 ТОТААСАСТАТТОСаТАОАТОСС
ос!20$ец1 СО20 секвенирование 23 ААТСАТООАСАТАСТТААТАТТА
Мутагенез.
Мутагенез осуществляют с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза ЦшкСйапде® ХЬ (Са! 200517-5, Ьо! 1120630, 81га1адепе Еигоре) в соответствии с инструкциями производителя.
Реакционные смеси для мутагенеза концентрируют осаждением из этанола и трансформируют либо в единичные (опекйо!) ЭН5а-Т1К компетентные клетки Е. сой, либо электропорацией в Е1ес1гоТеп-В1ие® электрокомпетентные клетки. Перед трансфекцией колонии проверяют с помощью ПЦР колоний и расщеплением рестриктазами.
Трансфекция клеток НЕК293Р.
Клетки НЕК293Р получают от йпйгодеп и трансфецируют в соответствии с инструкциями производителя с применением 293Гесйп. Клетки НЕК293Р используют для всех единичных мутантных последовательностей.
Трансфекция клеток СНО.
Клетки СНО, выращенные примерно до 95% монослоя, транзиторно трансфецируют с СЭ20 дикого типа, мутантной кДНК или комбинацией обеих конструкций, используя липофектамин 2000 (М668-019, Шуйгодеп, Вгеба, №!Ьег1апбк). Для этой цели 24 мкг осажденной ДНК разводят (1 мкг/мл) в 500 мкл оптимем (орйтет) в соотношениях АхР 100%: \УТ 0%; АхР 33.3%: \УТ 66.6%; АхР 66.6%: \УТ 33.3%; АхР 0%:\УТ 100%. Для каждой трансфекции 24 липофектамина разводят в 500 мкл оптимем. Затем разведенный липофектамин инкубируют (КТ, 5 мин) и разведенную ДНК объединяют с разведенным липофектамином. Осторожно перемешивают и инкубируют раствор (КТ, 20 мин), 1000 мкл ДНК/липофектамина прибавляют к клеткам СНО, тщательно перемешивают и инкубируют в течение 48 ч при 37°С, 5% СО2. Через 2 дня после трансфекции СНО клеток клетки дважды отмывают буфером РАС8 (РВ8, дополненный 0.1% В8А и 0.002% №N3). Клетки СНО обрабатывают трипсином/ЕОТА (СЬсо ВКЬ, ЫГе Тес1по1од1е8, Рай1еу, 8со!1апб) и снимают с плашек с культурой.
Связывание с антителом против ί'.Ό20.
Клетки НЕК293Р и клетки СНО помешают в РВ8 в концентрации 2x10 мл и помещают в круглодонные планшеты (1х105/лунка). Затем добавляют 50 мкл СЭ20 тАЬ в серийных разведениях 10, 5, 2.5 или 0 мкг на лунку (4°С, 30 мин). После отмывания в буфере РАС8 (РВ8, дополненный 0.1% В8А и 0.002% №N3) клетки анализируют на проточном цитометре (Вес!оп Оюкткоп, 8ап 01едо, СА, И8А), и при высокой скорости потока требуется 5000 событий на образец.
Как видно на фиг. 48А-Е, все тАЬк против СЭ20 эффективно связываются с клетками СНО, экспрессирующими \УТ (дикого типа) СЭ20. Как и предполагалось, ритуксимаб не связывается с АхР мутантом (фиг. 48А), а В1 слабо связывается с этим мутантом (фиг. 48Ό). Напротив, как 2Р2, так и 11В8 равно одинаково связываются с \УТ и АхР мутантом ί'.Ό20 (фиг. 48В и 48С). Однако титрование количества \УТ ί'.Ό20 на поверхности показывает только связывание ритуксимаба и В1. Снова как 2Р2, так и 11В8 нечувствительны к отсутствию или присутствию мутации.
Это исследование показывает, что связывание 2Р2 и 11В8 с человеческим ί'.Ό20 нечувствительно к мутациям в аминокислотных положениях 170 и 172. Следовательно, 2Р2 и 11В8 представляют собой новый класс тАЬк к СЭ20, распознающих новый СЭ20 эпитоп.
На фиг. 49А показан процент связывания 2Р2, 11В8Т, В1 или ритуксимаба с мутантом Р1728 νκ. (по сравнению с) \УТ ί'.Ό20, на фиг. 49В показан процент связывания 2Р2Т, 11В8Т, В1, САТ (САТ 13.6Е12, мышиное моноклональное ЦС2А антитело против СЭ20, О1а1ес.Сот), контрольного изотипического антитела (КЬН) или ритуксимаба с мутантным СЭ20 (АхР) νκ. (по сравнению с) \УТ СЭ20.
В случае мутанта, в котором аспарагин в положении 166 заменен на аспарагиновую кислоту
- 56 021644 (СО20Ш66О), 2Р2 показывает очень низкую степень связывания, тогда как В1, ритуксимаб и 11В8Т способны связываться, см. фиг. 49С. В аналогичном эксперименте САТ 13.6Е12 и ритуксимаб способны связываться с СО20Ш66О, тогда как 2Р2Т показывает только очень низкую степень связывания, см. фиг. 49Ό. В случае мутанта, в котором аспарагин в положении 163 заменен на аспарагиновую кислоту (СО20Ш63О), снова ритуксимаб, 11В8Т и В1 способны связываться с СО20Ш63О, тогда как 2Р2 и 2Р2Т показывают только очень низкую степень связывания, см. фиг. 49Е. В аналогичном эксперименте САТ 13.6Е12 и ритуксимаб способны связываться с СО20Ш63О, тогда как 2Р2Т показывает только очень низкую степень связывания, см. фиг. 49Р.
Эти эксперименты показывают, что 2Р2 и 11В8 связываются с различными эпитопами.
Пример 15. Эпитопное картирование с применением метода Рерзсап.
Синтез пептидов: 1-, 9-и 15-мерные пептиды синтезируют стандартными методами. В некоторых случаях химическое связывание 15-мерного пептида помогает идентифицировать аминокислотные последовательности потенциально прерывистого эпитопа. По известным методикам (Н.М. Сеузеп е! а1. (1984) Ргос. ЫаИ. Асай. 8ск И8А, 81:3998; Ι.№. 81оо!5!га е! а1. (1996) Мо1. Впмеге 1:87 и \\'0 01/60769) синтезируют 7-, 9- и 15-мерные пептиды, которые могли быть сайтами связывания или эпитопами, включенными в связывание 2Р2 или 11В8 с молекулой человеческого СЭ20. 9-и 15-меры синтезируют как петли и подергают скринингу в платах т^η^-РЕР8САN в формате кредитной карты (формат 455 пептидов/плата). Во всех петлеобразных пептидах аминокислоты в изменяющихся положениях заменяют на цистеин (например, ацетил-ХСХХХХХХХХХХХСХ-миникарта). Пептиды синтезируют стандартным химическим методом с Ртос-защитой и депротекцией с помощью ТФК с акцептором (кислоты). Затем депротекционированные пептиды реагируют на микроматрице с 0.5 мМ раствором 1,3-бис(бромметил)бензолом в бикарбонате аммония (20 мМ, рН 7.9), дополненном ацетонитрилом (1:1 (об./об.)). Микроматрицы осторожно встряхивают в растворе в течение 30-60 мин, пока они полностью не покроются раствором. Наконец, микроматрицы интенсивно отмывают избытком МППроге Н20 и подвергают ультразвуковой дезинтеграции в буфере, содержащем 1% додецилсульфата натрия, 0.1% βмеркаптоэтанола в РВ8 (рН 7.2), при 70°С в течение 30 мин с последующей ультразвуковой дезинтеграцией в МППроге Н20 еще в течение 45 мин. Затем лунки микропланшета готовы для скрининга методом ЕЫ8А.
Анализ Рерзсап ЕЫ8А.
455-луночные полиэтиленовые платы в формате кредитной карты, содержащие ковалентно связанные пептиды, инкубируют с сывороткой (в разведении 1:1000 в блокирующем растворе, содержащем 5 об.% лошадиной сыворотки и 5% яичного белка (вес./об.)) (4°С, в течение ночи). После отмывания пептиды инкубируют с пероксидазой человеческих антител (разведение 1:1000, 1 ч, 25°С) и после отмывания пероксидазного субстрата добавляют 2,2-азиноди-3-этиленбистиазолинсульфонат и 2 мкл/мл 3% Н2О2. Через 1 ч измеряют проявление цвета. Проявление цвета ЕЫ8А количественно рассчитывают с использованием ССЭ-камеры и системы процессинга изображения. Установка состоит из ССЭ-камеры и 55-мм линзы (8опу ССЭ УШео Сатега ХС-77КК, №коп микронник или линза 55 мм £/2.8), фотоприставка (8опу Сатега айар!ог ЭС-77КК) и программное обеспечение системы процессинга изображения 0рПтаз, версия 6.5 (МеФа СуЬетеНсз, 8Пуег 8ргшд, МО 20910, И.8.А.). Программное обеспечение 0рПта8 установлено на компьютерной системе РепПит II.
Оптическая плотность (значения 0Ό) пептидов при различных концентрациях антител представлена ниже в табл. 4 и 5.
Таблица 4
- 57 021644
Таблица 5
Как явствует из табл. 4, в случае 11В8 наблюдается связывание с последовательностью АО1УАР малой первой внеклеточной петли человеческого СЭ20 как при концентрации 10 мкг/мл, так и при концентрации 100 мкг/мл, в то время как для других исследованных антител не наблюдается заметное связывание с фрагментом АО1УАР.
Кроме того, для 11В8 наблюдается связывание с последовательностью МЕ8Ь№'1КЛнТРУ1 второй внеклеточной петли человеческого СЭ20 как при концентрации 10 мкг/мл, так и при концентрации 100 мкг/мл, в то время как для других исследованных антител не наблюдается заметное связывание с фрагментом МЕ8^NΡIКЛΗТРΥI.
Как явствует из табл. 5, для ритуксимаба наблюдается связывание с ЕРАЫР8ЕК второй внеклеточной петли человеческой СЭ20 как при концентрации 1 мкг/мл, так и при концентрации 10 мкг/мл, в то время как для других исследованных антител не наблюдается заметное связывание с фрагментом ЕРАМР8ЕК.
Пример 16. Антиидиотипические антитела.
Получение антиидиотипических антител.
Мышиные антиидиотипические антитела получают иммунизацией мышей Ва1Ь/С с помощью 2Р2 или 11В8Т и образованием гибридом из селезенок этих мышей путем слияния с N81 клетками миеломы стандартными методами. Получают следующие антиидиотипические антитела: анти-2Р2 каЬ 1.1, анти2Р2 каЬ 1.2, анти-2Р2 каЬ 1.3, анти-11В8Т каЬ 2.2, анти-11В8Т каЬ 2.3, анти-11В8Т каЬ 2.4, анти-11В8Т каЬ 2.5 и анти-11В8Т каЬ 2.6. Их проверяют на специфическое связывание с 2Р2Т, 7Ό8 и 11В8Т. Планшеты ЕЫ8А покрывают очищенными 2Р2Т, 7Ό8 или 11В8Т (разведенными в РВ8 до конечной концентрации 1-2 мкг/мл, 37°С, 2 ч). Планшеты блокируют РВ8, содержащим 0.05% Т\уееп-20 и 2% куриной сыворотки (КТ, 1 ч). Затем планшеты инкубируют с супернатантами культур антиидиотипических антител (конечную концентрацию доводят до1-10 мкг/мл, КТ, 2 ч). Связанные мышиные антиидиотипические антитела обнаруживают с использованием кроличьего ТдО-ИКР-конъюгированного антитела против мыши (басккоп 1ттииоКе8еагсЬ).
Как показано на фиг. 50, анти-2Р2 каЬ 1.1, анти-2Р2 каЬ 1.2 и анти-2Р2 каЬ 1.3 связываются с 2Р2Т и 7Ό8, но не с 11В8Т или неродственным изотипическим контрольным человеческим антителом. Так как 2Р2Т и 7Ό8 имеют высокую степень гомологии последовательности Уъ и Ун, предполагалось, что анти2Р2-идиотипические антитела реагируют с 7Ό8.
На фиг. 51 показано, что анти-11В8Т каЬ 2.2, анти-11В8Т каЬ 2.3, анти-11В8Т каЬ 2.4, анти-11В8Т каЬ 2.5 и анти-11В8Т каЬ 2.6, все, связываются с 11В8Т в сходной степени.
Антиидиотипические антитела как инструмент иммунодиагностики.
Антиидиотипические антитела 2Р2/7Э8 и 11В8Т можно использовать в качестве инструмента иммунодиагностики для обнаружения и количественного определения уровней человеческих моноклональных антител против СЭ20 в лабораторных образцах или в образцах пациентов. Это можно применять для изучения фармакокинетики антитела против СЭ20 или обнаружения и корректировки дозировки антитела против СЭ20 и для мониторинга заболевания и эффекта лечения пациента. Пример такого анализа: планшеты для ЕЫ8А покрывают, используя 4 мкг/мл анти-2Р2 каЬ 1.1, анти-2Р2 каЬ 1.2 или анти-2Р2 каЬ 1.3. Планшеты блокируют РВ8, содержащим 0.05% Т\уееп-20 и 2% куриной сыворотки (КТ, 1 ч). Затем планшеты инкубируют в серийном разведении 2Р2Т (10000-9.77 нг/мл, КТ, 2 ч). Связанный 2Р2Т детектируют с использованием мышиного ИКР-конъюгированного антитела против человеческого 1§С. Как показано на фиг. 52А-С, наблюдается зависимость связывания 2Р2Т от дозы.
Эквиваленты
Опытные специалисты в данной области техники признают или смогут убедиться с помощью лишь рутинных экспериментов, что существует множество эквивалентов специфических вариантов изобретения по данному описанию. Предполагается, что такие эквиваленты охватываются нижеприведенной формулой изобретения. Считается, что любая комбинация вариантов изобретения, описанных в зависимых пунктах формулы изобретения, входит в объем данного изобретения.
Включение в описание изобретения сведений с помощью ссылок
Все патенты, рассматривающиеся патентные заявки и другие публикации, цитированные в данном описании, вводятся в качестве ссылок во всей полноте.
- 58 021644
Перечень последовательностей <110> ТееПпд, ДеззЬса Кии1з, ЗЬдгЬд 61еппЬе, НагЫп уап άβ ИЬпкеЬ, Лап 6.7.
Раггеп, Раи1 РеЕегзеп, Догдеп ВааДздаагй, 01е Ниапд, НаЬсЬип <120> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ СС20 <130> 4086.1000-002 <140> 10/687,799 <141> 2003-10-17 <150> 60/419,163 <151> 2002-10-17 <150> 60/460,028 <151> 2003-04-02 <160> 57 <170> ГазЕЗЕО Ьог ИЬпСоыз УегэЬоп 4.0 <210> 1
<211> <212> <213> 424 ΟΝΑ Ното $ар1епз
<400> 1
аЕддадЕЕдд дасЕдадсЕд даЕЕЕЕссЕЕ 1.1. ддс ЕаЕ 1.1. ЕааааддЕдЕ ссадЕдЕдаа 60
дЕдсадсЕдд ЕддадЕсЕдд дддаддсЕЕд дЕасадссЕд дсаддЕсссЕ дадасЕсЕсс 120
ЕдЕдсадссЕ сЕддаЕЕсас сЕЕЕааЕдаЕ ЕаЕдссаЕдс асЕдддЕссд дсаадсЕсса 180
дддаадддсс ЕддадЕдддЕ сЕсаасЕаЕЕ адЕЕддааЕа дЕддЕЕссаЕ аддсЕаЕдсд 240
дасЕсЕдЕда адддссдаЕЕ сассаЕсЕсс ададасаасд ссаадаадЕс ссЕдЕаЕсЕд 300
саааЕдааса дЕсЕдададс Едаддасасд дссЕЕдЕаЕЕ асЕдЕдсааа адаЕаЕасад 360
ЕасддсаасЕ асЕасЕасдд ЕаЕддасдЕс Еддддссаад ддассасддЕ сассдЕсЕсс 420
Осад 424
<210> 2
<211> 122
<212> РКТ
<213> Ното зарЬепз
<400> 2
61и Уа1 С1п Ьеи УаЬ С1и Зег СЬу СЬу С1у Ьеи Уа1 СЬп Рго СЬу Агд
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе Азп Аэр Туг
20 25 30
А1а МеЕ НЬз Тгр Уа1 Агд СЬп А1а Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр УаЬ
35 40 45
Зег ТЬг Не Зег Тгр Азп Зег С1у Зег 11е 61у Туг АЬа Азр Зег УаЬ
50 55 60
Ьуз С1у Агд РНе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп АЬа Ьуз Ьуз Зег Ьеи Туг
65 70 75 30
Ьеи С1п МеЕ Азп Зег Ьеи Агд А1а СЬи Азр ТЬг АЬа Ьеи Туг Туг Суз
35 90 95
АЬа Ьуз Азр 11е С1п Туг СЬу Азп Туг Туг Туг СЬу МеЕ Азр УаЬ Тгр
100 105 110
- 59 021644
61у 61п 61у ТЬг ТНг Уа1 ТНг УаЬ Зег ВегИй 120 <210> 3 <2Η> 3Θ2 <212> ОНА <213> Ното еаргепз <400> 3 аЬддаадссс даааНдЬдЬ сЬсНссЬдса ддссаддсНс адднсадьд даадаЬСНд дддасасдас садсьсадсн
НдасасадЬс дддссадСса ссаддсСссС дсадСдддСс садССЬаССа
СддадаССаа
СсСсССссСс сСдсСасСсС ддсСсссада Сассассдда 60 Сссадссасс сСдСсСССдС сСссадддда аададссасс 120 дадСдССадс адсСасССад ссСддСасса асадааассС 180 саСсСаСдаС дсаСссааса дддссасСдд саСсссадсс 240 Сдддасадас ССсасСсСса ссаСсадсад ссСададссС 300 сСдСсадсад сдСадсаасС ддссдаСсас сССсддссаа 360 ас 382 <210> 4 <211> 107 <212> РКТ <213> Ноао зарЬепз <400> 4
61и Не Уа1 Ьеи ТНг 61п Зег Рго АЬа ТНг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 61у
1 5 10 15
61и Агд А1а ТНг Ьеи Зег Суз Агд АЬа Зег 61п Зег Уа1 Зег Зег Туг
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг 61п 61п Ьуз Рго 61у С1п АЬа Рго Агд Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг Азр А1а Зег Азп Агд АЬа ТНг 61у Не Рго А1а Агд РНе Зег 61у
50 55 60
Зег 61у Зег 61у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг Не Зег Зег Ьеи 61и Рго
65 70 75 80
С1и Азр РНе А1а УаЬ Туг Туг Суз 61п С1п Агд Зег Азп Тгр Рго 11е
85 90 95
ТНг РНе 61у 61п 61у ТНг Агд Ьеи 61и 11е Ьуз
100 105
<210> 5 <211> 424 <212> ϋΝΑ <213> Ното зарЬепз <400> 5 аСддадССдд дСдсадсСдд
СдСдсадссС дддаадддсс дасСсСдСда саааСдааса
СасддсаасС
Ссад дасСдадсСд
СддадСсСдд сСддаССсас сддадсдддс адддссдаСС дСсСдададс асСасСасдд даСССССССС дддаддсССд сСССсаСдаС сСсаасСаСС сассаСсСсс
Сдаддасасд
СаСддасдСс
ССддсСаССС дСасадссСд
СаСдссаСдс адССддааСа ададасаасд дссССдСаСС
Сддддссаад
СааааддСдС асаддСсссС асСдддСссд дСддСассаС ссаадаасСс асСдСдсааа ддассасддс ссадСдСдаа 60 дадасСсСсс 120 дсаадсСсса 180 аддсСаСдсд 240 ссСдСаСсСд 300 адаСаСасад 360 сассдЪсСсс 420
424 <210> 6 <211> 122 <212> РКТ <213> Ното зарЬепе <400> 6
С1и 7а 1 61п Ьеи Уа1 61и Зег 61у 61у 61у Ьеи 7а1 С1п Рго Азр Агд 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег 61у РНе ТНг РНе НЬз Азр Туг
- 60 021644
20 25 30
Аба Меб НбЗ Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго Е1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег ТЬг Не Зег Тгр Азп Зег С1у ТЬг 11е 61у Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РНе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи 61п Меб Азп Зег Ьеи Агд А1а 51и Азр ТЬг А1а Ьеи Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз Азр Не Е1п Туг С1у Азп Туг Туг Туг Е1у Меб Азр Уа1 Тгр
100 105 110
61у С1п С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬе Уа1 Зег Зег
115 120
<210> 7 <211> 382 <212> ОНА <213> Ното зарбепй <400> 7 абддаадссс даааббдбдб сбсбссбдса ддссаддсбс аддббсадбд даадаббббд дддасасдас садсбсадсб бдасасадбс дддссадбса ссаддсбссб дсадбдддбс садбббабба бддадаббаа бсбсббссбс бссадссасс дадбдббадс сабсбабдаб бдддасадас сбдбсадсад ас сбдсбасбсб сбдбсбббдб адсбасббад дсабссааса ббсасбсбса сдбадсаасб ддсбсссада сбссадддда ссбддбасса дддссасбдд ссабсадсад ддссдабсас бассассдда аададссасс асадааассб сабсссадсс ссбададссб сббсддссаа
120
180
240
300
360
382 <210> 8 <211> 107 <212> РКТ <213> Ното зарбепз <400> 8
С1и 1 Не Уа1 Ъеи ТЬг С1п 5 Зег Рго А1а ТЬг 10 Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 15 С1у
С1и Агд АЬа ТЬг Ьеи Зег Суз Агд АЬа Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Туг
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п АЬа Рго Агд Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТЬг С1у Не Рго А1а Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег 61у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТНг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1и Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз 61п С1п Агд Зег Азп Тгр Рго 11е
85 90 95
ТЬг РЬе 61у С1п 61у ТЬг Агд Ьеи С1и 11е Ьуз
100 105
<210> 9 <211> 433 <212> ОНА <213> Ното зархепз <400> 9 абддадббдд ддсбдадсбд ддббббссбб дббдсбабаб дббсадсбдд бдсадбсбдд дддаддсббд дбасабссбд бдбасаддсб сбддаббсас сббсадббас сабдсбабдс ддааааддбс бддаабдддс абсааббабб дддасбддбд бссдбдаадд дссдаббсас сабсбссада дасаабдбса абдаасадсс бдададссда ддасабддсб дбдбаббасб дсддддадбб бббабдасдд ссбсбасддб абддасдбсб бааааддбдб дддддбсссб аббдддббсд дбдбсасаба адаасбссбб дбдсаадада ддддссаадд ссадбдбдад дадасбсбсс ссаддсбсса сбабдсадас дбабсббсаа ббасбабддб дассасддбс
120 180 240 300 360 4 20
- 61 021644 ассдЬсЬссЬ сад 433 <210> 10 <211> 125 <212> РЕТ <213> Ното эарЬепз <400> 10
С1и Уа1 61п Ьеи Уа1 С1п Зег 61 у СЬу С1у Ьеи Уа1 НЬз Рго 61 у СЬу
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз ТНг 61 у Зег С1у РНе ТНг РНе Зег Туг НЬз
20 25 30
А1а МеЬ НЬз Тгр Уа1 Агд 61п А1а Рго СЬу Ьуз 61у Ьеи СЬи Тгр Уа1
35 40 45
Зег Не Не 61у ТНг 01 у 61у Уа1 ТНг Туг Туг АЬа Азр Зег Уа1 Ьуз
50 55 60
61у Агд РНе ТНг Не Зег Агд Азр Азп Уа1 Ьуз Азп Зег Ьеи Туг Ьеи
65 70 75 80
61 η МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а 61и Азр МеЬ А1а Уа1 Туг Туг Суз АЬа
85 90 95
Агд Азр Туг Туг 61 у АЬа 61у Зег РНе Туг Азр СЬу Ьеи Туг 61у МеЬ
100 105 НО
Азр УаЬ Тгр 61у С1п 61у ТНг ТНг Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег
115 120 125
<210> 11 <211> 382 <212> ОКА <213> Ното зарЬепз <400> 11 аЬддаадссс садсасадсЬ ЬсЬсЬЬссЬс сЬдсЬасЬсЬ ддсЬсссада Ьассассдда 60 даааЬЬдЬдЬ ЬдасасадЬс Ьссадссасс сЬдЬсЬЬЬдЬ сЬссадддда аададссасс 120 сьсьссьдса дддссадЬса дадЬдЬЬадс адсЬасЬТад ссьддьасса асадааассЬ 180 ддссаддсЬс ссаддсЬссЬ саЬсЬаЬдаЬ дсаЬссааса дддссасЬдд саЬсссадсс 240 аддЬЬсадЬд дсадЬдддЬс Ьдддасадас ЬЬсасЬсЬса ссаЬсадсад ссЬададссЬ 300 даадаЬЬЬЬд садЬЬЬаЬЬа сЬдЬсадсад сдЬадсдасЬ ддссдсЬсас ЬЬЬсддсдда 360 дддассаадд ЬддадаЬсаа ас 382 <210> 12 <211> 107 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400> 12
С1и 1 11е Уа1 Ьеи ТНг СЬп 5 Зег Рго А1а ТНг 10 Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 15 СЬу
СЬи Агд А1а ТНг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег СЬп Зег Уа1 Зег Зег Туг
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг С1п 61п Ьуз Рго 61у СЬп АЬа Рго Агд Ьеи Ьеи Пе
35 40 45
Туг Азр АЬа Зег Азп Агд АЬа ТНг СЬу Не Рго А1а Агд РНе Зег СЬу
50 55 60
Зег 61у Зег 61у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТЬг Ые Зег Зег Ьеи СЬи Рго
65 70 75 30
61и Азр РНе А1а Уа1 Туг Туг Суз 61п СЬп Агд Зег Азр Тгр Рго Ьеи
35 90 95
ТНг РНе СЬу 61у 61у ТНг Ьуз УаЬ СЬи Ые Ьуз
100 105
<210> 13 <211> 5 <212> РЕТ <213> Ното зарЬепз <400> 13
Азр Туг А1а Мес Н1з 1 5 <210> 14 <211> 17 <212> РЕТ <213> Ното зарьепз <400> 14
ТЬг Не Зег Тгр Азп Зег С1у Зег Не 31у Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз 15 10 15
Е1у <210> 15 <211> 13 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400> 15
Азр 11е С1п Туг Е1у Азп Туг Туг Туг 61у Ме! Азр Уа1 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> РЕТ <213> Ното зарЬепз <400> 16
Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Туг Ьеи А1а 15 10 <210> 17 <211> 7 <212> РЕТ <213> Ното зарЬепз <400> 17
Азр А1а Зег Азп Агд АЬа ТЬг 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> РЕТ <213> Ното заргепз <400> 18
С1п С1п Агд Зег Азп Тгр Рго 11е ТЬг 1 5 <210> 19 <211> 5 <212> РЕТ <213> Ното зарЬепз
- 63 021644 <400> 19
Азр Туг А1а Мер з 1 5 <210> 20 <211> 17 <212> РКТ <213> Ното зарТепз <400> 20
ТЬг Не Зег Тгр Азп Зег С1у ТЬг 11е С1у Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз 15 10 15
С1у <210> 21 <211> 13 <212> РКТ <213> Ното зарТепз <400> 21
Азр 11е С1п Туг СТу Азп Туг Туг Туг С1у Мер Азр Уа1 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400> 22
Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Тур Ьеи А1а 15 10 <210> 23 <211> 7 <212> РКТ <213> Ното заррепз <400> 23
Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТЬг 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> РКТ <213> Ното зарТепз <400> 24
61п С1п Агд Зег Азп Тгр Рго 11е ТЬг
1 5
<210> 25 <211> 5 <212> РКТ <213> Ното зар1еп5
<400> 25
Н1
Туг Ηίβ А1а МеХ Ηίβ 1 5 <210> 26 <211> 16 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400> 26
Не 11е С1у ТЬг С1у С1у 7а 1 ТЬг Туг Туг А1а Азр 2ег Уа1 Ьуз С1у 15 10 15 <210> 27 <211> 17 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400> 27
Азр Туг Туг С1у А1а 61у 5ег РЬе Туг Азр 51у Ьеи Туг 61у МеХ Азр 15 10 15
Уа1 <210> 28 <211> 11 <212> РКТ <213> Ното зарйепз <40О> 28
Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Туг Ьеи А1а 15 10 <210> 29 <211> 7 <212> РКТ <213> Ното зар1впз <400> 29
Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТЬг 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> РКТ <213> Ното зараепз <400> 30
С1п С1п Агд Зег Азр Тгр Рго Ьеи ТЬг
1 5
<210> 31
<211> 32
<212> ОНА
<213> ΑγΧι£1с1а1 Зедиепсе
<220>
<223> Ргхтег
<400> 31 дсаддсасас аасададдса дХЬссадаХС £с 32 <210> 32 <211> 26 <212> ΟΝΑ <213> Аг£1£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> Ргхгаег <400> 32 дсГдГдсссс сададдГдсГ сГГддадд 28 <210> 33 <211> 20 <212> СНА <213> АгЫ£1с£а1 Зедиепсе <220>
<223> Рггшег <220>
<221> ν3Γί3£ΐοπ <222> (6)...(6) <223> η = Т ог 6 <400> 33 саддГпсадс ХддХдоадХс 20 <210> 34 <211> 20 <212> Г?МА <213> АгЫ£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> Ргхшег <220>
<221> νβΓίβίίοη <222> (1)...(1) <223> п= С ог Е <220>
<221> νβΓίβΐίοη <222> (13)... (13) <223> η = Т ог С <400> 34 паддСдсадс СдпГддадСс 20 <210> 35 <211> 20 <212> ОМА <213> Аг£1£д.с1а1 Зециепсе <220>
<223> Рг1тоег <400> 35 даддСдсадс СддГдсадСс 20 <210> 36 <211> 21
- 66 021644 <212> ϋΝΑ <213> ΑιΕΙΕίοίθΙ Зециепсе <220>
<223> Рггтоег <400> 36 а£ддас£дда ссЬддадсаЬ с 21 <210> 37 <211> 20 <212> СКА <213> АгЫ£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> Рггтег <400> 37 а£ддаа£Сдд ддсбдадсбд 20 <210> 38 <211> 20 <212> ΕΝΑ <213> АгЫ£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> Рггтег <220>
<221> уаггаЫоп <222> (12)...(12) <223> η = А ог С <400> 38 а£ддад£Е£д дпс£дадс£д 20 <210> 39 <211> 21 <212> ΕΝΑ <213> АгЫ£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> Рггшег <400> 39 а£дааасасс Ъд^ддсгсЫ: с 21 <210> 40 <2и> го <212> ΕΝΑ <213> Агс1£1сга1 Зедиепсе <220>
<223> Рггшег <400> 40 а£дддд£саа ссдссаЬссЬ 20 <210> 41 <211> 21 <212> ОНА <213> Аг£1£1с1а1 Зедиепсе <220>
- 67 021644 <223> Ргхтег <400> 41
Хдссаддддд аадассдаСд д 21 <210> 42 <211> 20 <212> ОНА <213> АгХл_£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> Ргппег <220>
<221> уагЬаЫоп <222> (1).,.(1) <223> η = А ог С <220>
<221> хагЬаЫог, <222> (14)...(14) <223> η = С ог Т <400> 42 пасаХссада ХдапссадСс 20 <210> 43 <211> 20 <212> ϋΝΑ <213> АгП£1с1а1 Зечиепсе <220>
<223> ΡκίιηθΓ <220>
<221> ν3Γί3Χΐοη <222> (2)...(2) <223> η = С ог Т <220>
<221> ?аг1а1:1оп <222> (7)...(7) <223> η = С ог Т <220>
<221> уагааЫог!
<222> (8) ... (8) <223> η = А ог С <400> 43 дпсаХсппда ХдасссадЪс 20 <210> 44 <211> 20 <212> ОМА <213> ΑΓϋίίίοίδΙ Зедиепсе <220>
<223> Ргдтег <400> 44 даХаХХдХда Хдасссадас 20 <210> 45
- 68 021644 <211> 20 <212> ϋΝΑ <213> Аг£1£1с±а1 Зедиетсе <220 <223> Рг1тег <220>
<221> уагтаМоп <222> (15)...(15) <223> η = А ог С <400 45 даааСЪдЬдТ СдаспсадГс 20 <210> 46 <211> 20 <212> ОМА <213> ΑΓϊίίίοίβΙ Зедиепсе <220 <223> Ргхтаег <220 <221> уагтаЬюп <222> (6)...(6) <223> η = А ог Т <220>
<221> νθτίδΐίοη <222> (9) . . .(9) <223> η = А ог С <400 46 даааЬпдРпа ЬдасасадЬс 20 <210 47 <211> 20 <212> ОНА <213> АгС1Г1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> Ргатег <400> 47 да^д-ЫздЪда рдасасадбс 20 <210> 48 <211> 20 <212> βΝΑ <213> АгГ1£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> Ргттег <400> 48 дааа£Сд£дс ГдасГсадСс 20 <210 49 <211> 24 <212> ВМА <213> Аг£±£1с1а1 Зедиепсе <220>
- 69 021644 <223> РгЬтег <400> 49 сссдс£садс СссЬддддсЬ сс£д 24 <210> 50 <211> 23 <212> Р’1А <213> АгЬЬ£ЬсЬаЬ Зедиепсе <220>
<223> РгЬтег <400> 50 ссс£дс£сад сСссЬддддс Ьдс 23 <210> 51 <211> 26 <212> ОМА <213> Аг£Ь£ЬсЬа1 Зециепсе <220>
<223> РгЬтег <400> 51 сссадсдсад сЬЬсЬсЬЬсс ЬссЬдс 26 <210> 52 <211> 27 <212> ОНА <213> Аг£Ь£ЬсЬаЬ Зециепсе <220>
<223> РгЬтег <400> 52 аЬддаассаЬ ддаадсссса дсасадс 27 <210> 53 <211> 20 <212> ОНА <213> АгЬЬ£ЬсЬа1 Зедиепсе <220>
<223> РгЬтег <400> 53 сдддаадаЬд аадасадаЬд 20 <210> 54 <211> 116 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400> 54
МеЬ СЬи ьеи СЬу Ьеи Зег Тгр УаЬ РЬе Ьеи УаЬ АЬа ЬЬе Ьеи СЬи СЬу
1 5 10 15
УаЬ СЬп Суз СЬи УаЬ СЬп Ьеи УаЬ СЬп Зег СЬу СЬу СЬу Ьеи УаЬ НЬз
20 25 30
Рго СЬу СЬу Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа СЬу Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе
35 40 45
Зег Зег Туг АЬа МеЬ НЬз Тгр УаЬ Агд еьп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи
50 55 60
СЬи Тгр УаЬ Зег АЬа Не СЬу ТЬг СЬу СЬу СЬу ТЬг Туг Туг АЬа Азр
65 70 75 ео
Зег УаЬ Ьуз СЬу Агд РНе ТНг Не Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег
65 90 95
Ьеи Туг Ьеи С1п МеН Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр Мер А1а Уа1 Туг
100 105 110
Туг СуЗ А1а Агд
115
<210> 55 <211> 139 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз
<400> 55
Мер С1и АЬа Рго АЬа СЬп Ьеи Ьеи РНе Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Тгр Ьеи Рго
1 5 10 15
Азр ТНг ТНг С1у С1и Пе Уа1 Ьеи ТНг С1п Зег Рго А1а ТНг Ьеи Зег
20 25 30
Ьеи Зег Рго С1у С1и Агд А1а ТНг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег С1п Зег
35 40 45
Уа1 Зег Зег Туг Ьеи А1а Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго С1у СЬп А1а Рго
50 55 60
Агд Ьеи Ьеи Пе Туг Азр А1а Зег Азп Агд АЬа ТНг С1у Пе РГО А1а
65 70 75 80
Агд РНе Зег СЬу Зег СЬу Зег С1у ТЬг Азр РНе ТЬг Ьеи ТНг 11е Зег
85 90 95
Зег Ьеи С1и Рго С1и Азр РНе А1а Уа1 Туг Туг Суз 61п С1п Агд Зег
100 105 110
Азп Тгр Рго Ьеи ТНг РНе СЬу СЬу С1у ТНг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд
115 120 125
ТНг Уа1 А1а АЬа Рго Зег ν91 РНе 11е РНе Рго
130 135
<210> 56 <211> 141 <212> РКТ <213> Ното ί зархепе
<400> 56
Мен С1и Ьеи С1у Ьеи Зег Тгр Пе РНе Ьеи Ьеи А1а 11е Ьеи Ьуз С1у
1 5 10 15
Уа1 С1п Суз С1и Уа1 СЬп Ьеи Уа1 С1и Зег СЬу С1у С1у Ьеи Уа1 С1п
20 25 30
Рго СЬу Агд Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе
35 40 45
Азр Азр Туг А1а Меб НЬз Тгр Уа1 Агд С1п АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи
50 55 60
С1и Тгр Уа1 Зег С1у Пе Зег Тгр Азп Зег С1у Зег 11е С1у Туг А1а
65 70 75 ЭО
Азр Зег Уа1 Ьуз С1у Агд РНе ТНг Пе Зег Агд Азр Азп АЬа Ьуз Азп
85 90 95
Зег Ьеи Туг Ьеи СЬп МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг АЬа Ьеи
100 105 110
Туг Туг Суз А1а Ьуз Азр Пе Азр Туг Туг Туг Туг Туг Туг С1у Мес
115 120 125
Азр Уа1 Тгр С1у С1п С1у ТНг ТНг Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег
130 135 140
<210> 57 <211> 127 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400 57
Ме! СЬи АЬа Рго АЬа СЬп Ьеи Ьеи РЬе Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Тгр Ьеи Рго
1 5 10 15
Αερ ТЬг ТЬг СЬу СЬи ЬЬе УаЬ Ьеи ТЬг СЬп Зег Рго АЬа ТЬг Ьеи Зег
20 25 30
Ьеи Зег Рго СЬу СЬи Агд АЬа ТЬг Ьеи Зег Суз Агд АЬа Зег СЬп Зег
35 40 45
УаЬ Зег Зег Туг Ьеи АЬа Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу СЬп АЬа Рго
50 55 60
Агд Ьеи Ьеи ЬЬе Туг Азр АЬа Зег Азп Агд АЬа ТЬг СЬу Ые Рго АЬа
65 70 75 30
Агд РЬе Зег СЬу Зег СЬу Зег СЬу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Ые Зег
85 90 95
Зег Ьеи СЬи Рго СЬи Азр РЬе АЬа Уа1 Туг Туг Суз СЬп СЬп Агд Зег
ЬОО 105 110
Азп Тгр Рго ЬЬе ТЬг РЬе СЬу СЬп СЬу ТЬг Агд Ьеи СЬи Ые Ьу5
115 120 125
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (49)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенное человеческое моноклональное антитело, связывающееся с человеческим СГО20 и включающее СЭК1 тяжелой цепи с последовательностью 8Е0 ГО Ν0: 13, СГОК2 тяжелой цепи с последовательностью 8Е0 ГО Ν0: 14, СГОК3 тяжелой цепи с последовательностью 8Е0 ГО Ν0: 15, СГОК1 легкой цепи с последовательностью 8Е0 ГО Ν0: 16, СГОК2 легкой цепи с последовательностью 8Е0 ГО Ν0: 17 и СГОК3 легкой цепи с последовательностью 8Е0 ГО Ν0: 18 или СГОК1 тяжелой цепи с последовательностью 8Е0 ГО Ν0: 19, СГОК2 тяжелой цепи с последовательностью 8Е0 ГО Ν0: 20, СГОК3 тяжелой цепи с последовательностью 8Е0 ГО Ν0: 21, СГОК1 легкой цепи с последовательностью 8Е0 ГО Ν0: 22, СГОК2 легкой цепи с последовательностью 8Е0 ГО Ν0: 23 и СГОК3 легкой цепи с последовательностью 8Е0 ГО Ν0: 24.
  2. 2. Антитело по п.1, выбранное из группы, состоящей из ^01, ^02, !дС3, !8С4, ЦМ, ЦАЕ [^2, секреторного ЦА, ЦО и !дЕ антител.
  3. 3. Антитело по п.2, представляющее собой !д01 антитело.
  4. 4. Антитело по п.2, представляющее собой ^03 антитело.
  5. 5. Антитело по п.2, представляющее собой Ц04 антитело.
  6. 6. Антитело по п.2, представляющее собой IдА1 или IдА2 антитело.
  7. 7. Антитело по любому из пп.1-6, содержащее вариабельные области тяжелой и κ-легкой цепей человеческого происхождения, кодируемые нуклеотидными последовательностями 8Е0 ГО Ν0: 1 и 8Е0 ГО Ν0: 3 соответственно.
  8. 8. Антитело по любому из пп.1-6, содержащее вариабельные области тяжелой и κ-легкой цепей человеческого происхождения, кодируемые нуклеотидными последовательностями 8Е0 ГО Ν0: 5 и 8Е0 ГО Ν0: 7 соответственно.
  9. 9. Антитело по любому из пп.1-6, содержащее вариабельные области тяжелой и κ-легкой цепей человеческого происхождения, включающие аминокислотные последовательности 8Е0 ГО Ν0: 2 и 8Е0 ГО Ν0: 4 соответственно, или консервативные модификации последовательностей этих цепей.
  10. 10. Антитело по любому из пп.1-6, имеющее вариабельные области тяжелой цепи человеческого происхождения и κ-легкой цепи человеческого происхождения, которые по меньшей мере на 90% гомологичны, предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологичны и более предпочтительно по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологичны аминокислотным последовательностям 8Е0 ГО Ν0: 2 и 8Е0 ГО Ν0: 4 соответственно.
  11. 11. Антитело по любому из пп.1-6, имеющее вариабельные области тяжелой цепи человеческого происхождения и κ-легкой цепи человеческого происхождения, содержащие аминокислотные последовательности 8Е0 ГО Ν0: 6 и 8Е0 ГО Ν0: 8 соответственно, или консервативные модификации последовательностей этих цепей.
  12. 12. Антитело по любому из пп.1-6, имеющее вариабельные области тяжелой цепи человеческого происхождения и κ-легкой цепи человеческого происхождения, которые по меньшей мере на 90% гомологичны, предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологичны и более предпочтительно по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологичны аминокислотным последовательностям 8Е0 ГО Ν0: 6 и 8Е0 ГО Ν0: 8 соответственно.
  13. 13. Антитело по любому из пп.1-12, которое представляет собой интактное антитело, выбранное из группы, состоящей из интактного !дС1 антитела, интактного Ц02 антитела, интактного !дС3 антитела, интактного Ц04 антитела, интактного ЦМ антитела, интактного IдА1 антитела, интактного IдА2 антитела, интактного секреторного ЦА антитела, интактного ЦО антитела и интактного !дЕ антитела, отличающееся тем, что антитело является гликозилированным в клетке эукариот.
  14. 14. Антитело по любому из пп.1-13, являющееся фрагментом антитела или одноцепочечным анти- 72 021644 телом.
  15. 15. Эукариотическая или прокариотическая клетка-хозяин, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельные области тяжелой и легкой цепей человеческого моноклонального антитела, раскрытые в пп.9-12.
  16. 16. Фармацевтическая композиция, ингибирующая рост или вызывающая гибель клеток, экспрессирующих ΟΌ20, содержащая человеческое моноклональное антитело по любому из пп.1-14 и фармацевтически приемлемый носитель.
  17. 17. Фармацевтическая композиция по п.16, содержащая антитело по п.9 и дополнительный терапевтический агент, представляющий антитело, связывающееся с СГО20 человеческого происхождения и имеющее вариабельные области тяжелой и к легкой цепей человеческого происхождения, содержащие аминокислотные последовательности 8ЕЦ ГО N0: 10 и 8ЕЦ ГО N0: 12 соответственно, или консервативные модификации последовательностей этих цепей.
  18. 18. Фармацевтическая композиция по любому из пп.16, 17, дополнительно содержащая терапевтический агент, выбранный из цитотоксического агента, радиотоксического агента, иммунодепрессанта и иммунологического модулирующего агента.
  19. 19. Антитело по любому из пп.1-14, дополнительно содержащее линкер-хелатор для связывания радиоактивного изотопа.
  20. 20. Иммуноконъюгат, содержащий антитело по любому из пп.1-14, связанное с цитотоксическим агентом, радиоизотопом или лекарственным веществом.
  21. 21. Биспецифическая молекула, содержащая антитело по любому из пп.1-14 и группировку со специфичностью связывания с человеческой эффекторной клеткой.
  22. 22. Биспецифическая молекула, содержащая антитело по любому из пп.1-17 и группировку со специфичностью связывания с человеческим Рс-рецептором или группировку со специфичностью связывания с Т-клеточным рецептором, таким как СГО3.
  23. 23. Способ ингибирования роста клетки, экспрессирующей ΟΌ20, включающий приведение клетки в контакт с эффективным количеством антитела по любому из пп.1-14 таким образом, что рост клетки подавляется.
  24. 24. Способ киллинга клетки, экспрессирующей СЭ20, включающий приведение клетки в контакт с эффективным количеством антитела по любому из пп.1-14 таким образом, что происходит киллинг клетки, экспрессирующей СГО20.
  25. 25. Способ по любому из пп.23 или 24, отличающийся тем, что клетка представляет собой Влимфоцит или опухолевую клетку.
  26. 26. Способ лечения или предупреждения заболевания или нарушения, связанного с клетками, экспрессирующими СЭ20, включающий введение субъекту человеческого антитела, композиции, иммуноконъюгата или биспецифической молекулы по любому из пп.1-14 или 16-22 в количестве, обеспечивающем эффективное лечение или предупреждение заболевания.
  27. 27. Способ по п.26, отличающийся тем, что заболевание представляет собой В-клеточную лимфому.
  28. 28. Способ по п.27, отличающийся тем, что заболевание представляет собой В-клеточную неходжкинскую лимфому.
  29. 29. Способ по п.28, отличающийся тем, что заболевание выбирают из группы, включающей Влимфобластный лейкоз/лимфому из клеток-предшественников и опухоли из зрелых В-клеток, такие как В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз (СЬЬ)/малая лимфоцитарная лимфома (8ЬЬ), Вклеточный пролимфоцитарный лейкоз, лимфоплазмацитарную лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны (МСЬ), фолликулярную лимфому (РЬ), кожную лимфому из клеток фолликулярных центров, Вклеточную лимфому из клеток маргинальной зоны (МАЬТ типа, узлового типа, селезеночного типа), волосатоклеточный лейкоз, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, лимфому Беркита, плазмацитому, миелому из плазматических клеток, пострансплантационное лимфопролиферативное расстройство, макроглобулинемию Вальденстрема и анапластическую крупноклеточную лимфому (АЬСЬ).
  30. 30. Способ по п.29, отличающийся тем, что заболевание представляет собой фолликулярную лимфому (РЬ).
  31. 31. Способ по п.29, отличающийся тем, что заболевание представляет собой В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз (СЬЬ)/малую лимфоцитарную лимфому (8ЬЬ).
  32. 32. Способ по п.26, отличающийся тем, что заболевание выбирают из группы, состоящей из лимфоматоидного гранулематоза, первичной эффузионной лимфомы, интраваскулярной В-клеточной лимфомы, медиастинальной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, заболеваний тяжелых цепей (включая γ, μ и а заболевание), лимфом, вызванных терапией иммунодепрессантами, таких как лимфома, вызванная циклоспорином, и лимфома, вызванная метотрексатом.
  33. 33. Способ лечения или предупреждения иммунного заболевания с участием иммунных клеток, экспрессирующих СЭ20, включающий введение субъекту антитела, композиции, иммуноконъюгата или биспецифической молекулы по любому из пп.1-14 или 16-22 в количестве, обеспечивающем эффективное лечение или предупреждение иммунного заболевания.
    - 73 021644
  34. 34. Способ по п.33, отличающийся тем, что лечение включает киллинг В-клеток, которые продуцируют антитела против аутоантигенов.
  35. 35. Способ по п.33, отличающийся тем, что болезнь или нарушение выбирают из группы, включающей псориаз, псориатический артрит, дерматит, системную склеродерму и склероз, воспалительное заболевание кишечника (ΓΒΌ), болезнь Крона, язвенный колит, респираторный дистресс-синдром, менингит, энцефалит, увеит, гломерулонефрит, экзему, астму, атеросклероз, недостаточность адгезии лейкоцитов, рассеянный склероз, синдром Рейно, синдром Сегрена, ювенильный диабет, болезнь Рейтера, болезнь Бехчета, иммунный комплексный нефрит, ЦА нефропатию, IдΜ полинейропатии, иммунные тромбоцитопении, такие как острая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура и хроническая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, гемолитическую анемию, тяжелую псевдопаралитическую миастению, волчаночный нефрит, системную красную волчанку, ревматоидный артрит (КА), атопический дерматит, пузырчатку, болезнь Грейвза, тиреоидит Хашимото, гранулематоз Вегенера, синдром Оменна, хроническую почечную недостаточность, острый инфекционный мононуклеоз, ВИЧ, заболевания, ассоциированные с вирусом герпеса, системный склероз и обыкновенную пузырчатку.
  36. 36. Способ по п.35, отличающийся тем, что заболевание представляет собой ревматоидный артрит (КА).
  37. 37. Способ по любому из пп.23-36, дополнительно включающий введение субъекту другого терапевтического агента, где терапевтический агент выбран из цитотоксического агента, радиотоксического агента, иммунодепрессанта и иммунологического модулирующего агента.
  38. 38. Способ по п.37, отличающийся тем, что терапевтический агент является цитотоксическим агентом или радиотоксическим агентом.
  39. 39. Способ по п.37, отличающийся тем, что терапевтический агент представляет собой иммунодепрессант.
  40. 40. Способ по п.37, отличающийся тем, что терапевтический агент представляет собой иммунологический модулирующий агент, такой как цитокин или хемокин.
  41. 41. Способ по п.37, отличающийся тем, что терапевтический агент выбирают из группы, состоящей из доксорубицина, цисплатина, блеомицина, кармустина, хлорамбуцила и циклофосфамида.
  42. 42. Способ по п.37, отличающийся тем, что терапевтический агент выбирают из группы, состоящей из антител против ΟΌ25, антител против СЭ19, антител против СО21, антител против СЭ22, антител против СО37, антител против СЭ38, антител против ГГ6К, антител против ГГ8, антител против ГЦ15, антител против ГГ15К, антител против СЭ4, антител против СО11а, антител против альфа-4/бета-1 интегрина (^А4), СТЕА4-!8 и антител против С3Ь(т).
  43. 43. Способ детектирования ш \йго присутствия в образце антигена СЭ20 или клетки, экспрессирующей ΟΌ20, включающий контактирование образца с антителом по любому из пп.1-14 в условиях, допускающих образование комплекса между антителом и ΟΌ20, и выявление образованного комплекса.
  44. 44. Композиция для обнаружения присутствия в образце антигена ΟΌ20 или клетки, экспрессирующей ΟΌ20, содержащая антитело по любому из пп.1-14.
  45. 45. Способ обнаружения ш νί\Ό присутствия в организме субъекта антигена СЭ20 или клетки, экспрессирующей ΟΌ20, включающий введение в организме субъекта антитела по любому из пп.1-14 в условиях, допускающих образование комплекса между антителом и ΟΌ20, и выявление образованного комплекса.
  46. 46. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела, раскрытого в пп.9-12.
  47. 47. Фармацевтическая композиция, ингибирующая рост или вызывающая гибель клеток, экспрессирующих ΟΌ20, содержащая экспрессирующий вектор по п.46 и фармацевтически приемлемый носитель.
  48. 48. Антиидиотипическое антитело, связывающееся с антителом по любому из пп.1-14.
  49. 49. Применение антиидиотипического антитела по п.48 для детектирования уровня человеческого моноклонального антитела против 0020 по любому из пп.1-14 в образце.
    - 74 021644
    Фиг. 1
    Фиг. 3
    - 75 021644
    Фиг. 4
    Фиг. 5А
    Фиг. 5В
    - 76 021644
    - 77 021644
    Фиг. 11В
    - 78 021644
    Фиг. 12В
    - 79 021644
    Фиг. 121)
    Фиг. 13В
    Фиг. 13Ώ
    - 80 021644
    Фиг. 14В
    Фиг. 15В
    - 81 021644
    Фиг. 16В
    Фиг. 17В
    Фиг. 17С
    - 82 021644
    - 83 021644
    Фиг. 19Ό
    Фиг. 20
    Фиг. 21
    НСЬ
    100 без антитела 2Р2 Ритуксимаб 11В8Т
    Фиг. 22
    - 84 021644 ли.
    1ΟΟη без антитела 2Р2 Ритуксимаб
    Фиг. 23 без антитела 2Р2 ритуксимаб 11В8Т
    Фиг. 24
    Фиг. 25
    Фиг. 26
    Фиг. 27
    - 85 021644
    Фиг. 28
    Фиг. 29А
    РЕЕТ
    ОаисН, 37°С
    Фиг. 29В
    I 1 обработано Тритоном X- 100 не обработано
    Фиг. 29С
    - 86 021644 ϋθΐκϋ £: ιοοΊ <υ ритуксимаб > 2Ϊ-2 11Β8Τ
    Фиг. 30
    Фиг. 31
    Фиг. 32
    - 87 021644
    Фиг. 33А
    10х
    708
    10ς
    10‘
    10ι
    • ' '<ί:· • '•ЛК* . .; 7% * г · ···,. 1* ·Λ· А.· 1 г· :·Ή-^βΗ - · г-хлИ-ЖЗ ίΐκ 12%
    10° 101 102 1 03 1 0'
    Аннексии !-\ЛРИс
    Фиг. 33В
    Фиг. 33С а!еМ
    Аннексин-\ЛРЙС
    Фиг. 33Б а!§М
    Аннексии [«ЛАРИС
    Фиг. 33Е
    - 88 021644
    Аннексиш-Л/-Р НС Фиг. 33Р
    Аннексин-\/-РИС
    Фиг. 33С
    2ΧΧζ·1 не обработано
    Κ5Κ311Β8Τ концентрация АЬ (антитела) (мкг/млТ
    Фиг. 34 Ηθ 2Р2Т 11В8Т Р'ДУЦ1’ Ни1дС1 В1 обработано антитела
    Фиг. 35А
    - 89 021644
    Фиг. 35В
    - 90 021644
    Гомотипическая адгезия клеток Кат05 |[ц
    Фиг. 36
    Фиг. 37
    - 91 021644
    Фиг. 41
    - 92 021644
    Фиг. 42
    Фиг. 43
    Фиг. 44В
    - 93 021644
    Фиг. 45В
    Фиг. 46В
    - 94 021644
    Фиг. 46С
    Фиг. 47В
    Фиг. 47С
    - 95 021644
    300-1
    200ίΖ г
    100ο —*-ΑχΡ 100%
    -·—ΑχΡ 66% /\Л/Т 33% -о- ΑχΡ 33% IУТТ 66% -ο-νντιοο%
    Фиг. 48Е
    Фиг. 49В
    - 96 021644 покрытие (плёнка) из антител 1 мкг/мл
    Фиг. 50
    - 97 021644
    Фиг. 51
    Фиг. 52
    Трансляция 2Р2 УН !^33ΕΞΐ®_ _51 _|ΫΑΜ|ΜγΚ0ΑΕ'_5Κ5ίΕΜν5ΐΤΙ_3ΒΝ555ΙΰΥΆ РЗУКбКЕТТЗ ΕΡΝΑΚΚ3ΕΥΙ,_ 101 0ΜΝ5Ι.ΚΑΕΡΤ АЬУУСАКЦГб Υ6ΚΙΥΥϊ6Κ59] ИСОСТТУТУЗ 3
    Трансляция 2Р2 VI» —ί-_^§^^?ίίΕί-ίίίΜί£ΡΊ”Γ3-ΕΙΥί'Ι'93-ΑΤ-Ε3ί§£^Ε^Τ-ί§$--93Υ§1 —Д—^Ϋί^ϊ2§ΕΕ-3§^ΕΕΕίϊ^-^3^Ε/4^ίΥ^-ΕΕ33333ι3'Ι'Ρ-Ε ΓΕΤΙ33ΙιΕΕ' ιοί ереаууусйо кзотгеиДгео ετκι,εικ
    I I СОК.1
    1 I СЭК2
    I I сцкз
    Фиг. 53
    - 98 021644
    2Е2 УН __1___АТССАС_ТТСССА_СТСАСС_ТССАТТ_ТТССТТ_ТТСССТ_АТТТТА_АААССТ_СТССАС.
    _55 __ТСТСАА_СТССАС_СТССТС_САСТСТ_СССССА_СССТТС_СТАСАС_ССТССС_АССТСС. 1Р92__СТСАСА_СТСТСС_ТСТССА_СССТСТ_ССАТТС_АССТТТ_ААТСАТ_ТАТССС_АТССАС_ .163___ТСССТС_ССССАА_ССТССА_СССААС_ССССТС_САСТСе_СТСТСА_АСТАТТ_АСТТСС.
    .217___ААТАСТ_ССТТСС_АТАССС_ТАТеСС_САСТСТ_СТСААС_СССССА_ТТСАСС_АТСТСС_ .2712_асасас_аасссс_аасаас_тсссто_татстс;сааатс_аасаст_стсаса_сстсас.
    .325___САСАСС_6ССТТ6_ТАТТАС_Т6ТССА_АААСАт2аТАСАС_ТАСССС_ААСТАС_ТАСТАС;
    .379___ССТАТС_САССТС_ТСдССС_СААСС6_АССАСе_СТСАСС_0ТСТСС_ТСАе__________
    2Г2УЬ .1___АТССАА_СССССА_ССТСАС_СТТСТС_ТТССТС_СТССТА_СТСТСС_СТСССА_САТАСС.
    55 АССССА САААТТ СТСТТС АСАСАС ТСТССА СССАСС СТСТСТ ТТСТСТ ССАССС 109 САААСА СССАСС стстсс ТССАСС СССАСТ САСАСТ СТТАСС АССТАС ТТАССС 163 ТС6ТАС СААСАС АААССТ ССССАС ССТССС АСССТС СТСАТС ТАТСАТ ССАТСС 217 ААСАСС СССАСТ СССАТС ССАССС АССТТС ССТССС АСТССС ТСТССС АСАСАС 271 ТТСАСТ СТСАСС АТСАСС АСССТА САСССТ СААСАТ ТТТССА етттАт ТАСТСТ 325 САССАС ССТАСС ААСТСС СССАТС АССТТС ССССАА СССАСА ССАСТС САСАТТ 379 АААС
    Фиг. 54
    Трансляция 7ϋ8νΗ ___ι___мЕьсьзи1Е'ь_ьА1ТксудсЕ_у2ьуЕзеее1;_У2Рокз1,к1,з_СААзегтгЩ_
    У 51___ЫВиукдАР- екёьЁиу 3ΙΤΙ_3ΜΝ3ΰΤΙΰΥΑ_Ρ3νΚ§ΚΕΤ 13 _ΚρΝΑΚΝ3ΣΥΙ;
    101___ΟΜΝ3ΕΚΆΕρΤ_ΑΪΥΥΟΑΚΒ'№:Μ6ΗΥ.ΥΥ6·Μρνΐ_ΜΰΟ5ΤΤνΤν5_32_______’
    Трансляция 7Ц8У1* ___1___МЕАРА01,1;ЕЕ_ЪЕЬНЕРрТТС_Е1уЬТ031?АТ_Е31;ЗРСЕКАТ_ЕЗСВ5§ОЗу23.
    '...5Ϊ..ΖΖ^ΐ5^ΪΟΟΕΕ-§56ΡΕΕΕΙΐΡ_Α3ΝΚΑΤΚΪΡΑ_ΚΕ3ΰ3536Τρ ЁТЕТ153ЁЕР λοι___ЕрЕАууудадудзтЕтяЁ5о_еткьЁ1к~_________________________
    1 I сгак.1
    1 1 СОК2
    1.........1 сокз
    Фиг. 55
    7ϋ8νΗ 1 АТССАС ТТСССА СТСАСС ТССАТТ ттсстт ттсссг АТТТТА АААССТ СТССАС 55 Τ6ΤΘΑΑ СТССАС СТС6ТС САСТСТ СССССА сссттс СТАСАС ССТСАС А66ТСС 109 СТСАСА СТСТСС ТСТССА СССТСТ ССАТТС АССТТТ САТСАТ ТАТССС АТ6САС 163 ТСССТС ССССАА ССТССА СССААС сссстс САСТСС СТСТСА АСТАТТ АСТТСС 217 ААТАСТ ССТАСС АТАССС ТАТССС САСТСТ СТСААС СССССА ТТСАСС АТСТСС 271 АСАСАС ААСССС ААСААС тссстс ТАТСТС САААТС ААСАСТ СТСАСА ССТСАС 325 САСАСС сссттс ТАТТАС ТСТССА АААСАТ АТАСАС ТАСССС ААСТАС ТАСТАС 379 6СТАТС 6АС6ТС тсссес СААССС АССАСС СТСАСС СТСТСС ТСАС
    1 АТССАА 7ϋ8νΗ СТСССА САТАСС СССССА ССТСАС СТТСТС ТТССТС стеста СТСТСС 55 АССССА САААТТ СТСТТС АСАСАС ТСТССА СССАСС СТСТСТ ТТСТСТ ССАССС 109 САААСА СССАСС СТСТСС ТССАСС СССАСТ САСАСТ СТТАСС АССТАС ТТАССС 163 ТССТАС' СААСАС АААССТ ССССАС ССТССС АСССТС СТСАТС ТАТСАТ ССАТСС 217 ААСАСС СССАСТ СССАТС ССАССС АССТТС АСТССС астссс ТСТССС АСАСАС 271 ТТСАСТ СТСАСС АТСАСС АСССТА САСССТ СААСАТ ТТТССА СТТТАТ ТАСТСТ 325 САССАС ССТАСС ААСТСС СССАТС АССТТС ССССАА СССАСА ССАСТС САСАТТ 379 АААС
    Фиг. 56 __1 _51 ΐοΐ __1 ^51
    101
    Трансляция УНСО2011В8 _МЕ1;еЬ5№уГ1;_уА1ЬКСУ2СЕ_у01;У056ССД_уНРеб31;Е1;5_СТС5еГТЕ;^. 'Ё^ЙуКОа^бКСДЁяуЗ^ЕЗ^дбуТУУАР-ЗуК^ЕТТЗ^РЫукЙбЬуЬО' МЙЗЪКАЕрМЛ_ууУСАКВ|ш:^ЗИЙаЖ^;:ДИ50|тТУ_Ту55_____
    Трансляция УЪСО2011В8
    МЕАРАОЪ1;Г1 1;ЪЬИ1,РРТТе Е1у11ТОЗРАТ Ь313РСЕКаТ ЬЗС^ЙЗд5уд|.
    ЗЖЬ^ЙуООКР2дОАРКЕЬ1У^_АЗЫРАТ|С1РА_РГ553СЗСТР_ЕТЪТ133ЬЕР
    ΕΡΕΑνΥΥ9§^Β36»ΒΧ^Γ36 ΰΤΚνΕΙΚ
    3 СОК!
    3 СОК2
    3 сокз
    Фиг. 57
    - 99 021644
    1 АТ6САС ттсссс СТСАСС УНСО2011В8 тссстт ТТССТТ СТТССТ АТАТТА АААССТ СТССАС 55 ТСТСАС СТТСАС СТССТС САСТСТ СССССА СССТТС СТАСАТ ССТССС СССТСС 109 СТСАСА стстсс ТСТАСА ссстст ССАТТС АССТТС АСТТАС САТССТ АТССАТ 163 ТСССТТ ССССАС ССТССА ССАААА ССТСТС СААТСС СТАТСА АТТАТТ СССАСТ 217 естсст СТСАСА ТАСТАТ ССАСАС тссстс ААСССС ССАТТС АССАТС ТССАСА 271 САСААТ СТСААС ААСТСС ТТСТАТ СТТСАА АТСААС АСССТС АСАССС САССАС 325 АТСССТ СТСТАТ ТАСТСТ ССААСА САТТАС ТАТССТ СССССС ΑΘΤΤΤΤ ТАТ6АС 379 ССССТС ТАСССТ АТССАС СТСТСС ССССАА СССАСС АСССТС АСССТС ТССТСА
    433 _е νΐιΟϋ2011Β8
    1 АТССАА СССССА ССАСАС СТТСТС ТТССТС СТССТА СТСТСС СТСССА 6АТАСС 55 АССССА САААТТ СТСТТС АСАСАС ТСТССА СССАСС СТСТСТ ТТСТСТ ССАССС 109 САААСА СССАСС СТСТСС ТССАСС СССАСТ САСАСТ СТТАСС АССТАС ТТАССС 163 ТССТАС СААСАС АААССТ ССССАС ССТССС АСССТС СТСАТС ТАТСАТ ССАТСС 217 ААСАСС СССАСТ СССАТС ССАССС АССТТС АСТССС АСТССС ТСТССС АСАСАС 271 ТТСАСТ СТСАСС АТСАСС АСССТА САСССТ СААСАТ ТТТЕСА СТТТАТ ТАСТСТ 325 САССАС ССТАСС САСТСС ССССТС АСТТТС СССССА СССАСС ААССТС САСАТС 379 АААС
    Фиг. 58
EA200500679A 2002-10-17 2003-10-17 Человеческое моноклональное антитело против cd20 и его применение EA021644B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41916302P 2002-10-17 2002-10-17
US46002803P 2003-04-02 2003-04-02
PCT/US2003/033057 WO2004035607A2 (en) 2002-10-17 2003-10-17 Human monoclonal antibodies against cd20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200500679A1 EA200500679A1 (ru) 2006-02-24
EA021644B1 true EA021644B1 (ru) 2015-08-31

Family

ID=32110219

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201492217A EA201492217A1 (ru) 2002-10-17 2003-10-17 Человеческие моноклональные антитела против cd20
EA200500679A EA021644B1 (ru) 2002-10-17 2003-10-17 Человеческое моноклональное антитело против cd20 и его применение

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201492217A EA201492217A1 (ru) 2002-10-17 2003-10-17 Человеческие моноклональные антитела против cd20

Country Status (25)

Country Link
US (3) US8529902B2 (ru)
EP (4) EP1558648B1 (ru)
JP (3) JP4662473B2 (ru)
KR (7) KR101348472B1 (ru)
CN (3) CN101928344B (ru)
AT (1) ATE540978T1 (ru)
AU (1) AU2003301445A1 (ru)
BR (1) BRPI0315295C1 (ru)
CA (2) CA3029035C (ru)
CY (2) CY1112750T1 (ru)
DK (2) DK1558648T3 (ru)
EA (2) EA201492217A1 (ru)
ES (3) ES2744275T3 (ru)
FR (1) FR21C1028I1 (ru)
HK (1) HK1077590A1 (ru)
HU (2) HUE046695T2 (ru)
IL (2) IL167851A (ru)
LT (2) LT3284753T (ru)
LU (1) LU92041I2 (ru)
MX (1) MXPA05004022A (ru)
NZ (2) NZ568769A (ru)
PL (2) PL216630B1 (ru)
PT (2) PT1558648E (ru)
SI (1) SI1558648T1 (ru)
WO (1) WO2004035607A2 (ru)

Families Citing this family (458)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT752248E (pt) * 1992-11-13 2001-01-31 Idec Pharma Corp Aplicacao terapeutica de anticorpos quimericos e marcados radioactivamente contra antigenios de diferenciacao restrita de linfocitos b humanos para o tratamento do linfoma de celulas b
US7744877B2 (en) * 1992-11-13 2010-06-29 Biogen Idec Inc. Expression and use of anti-CD20 Antibodies
EP1112084B2 (en) 1998-08-11 2012-04-25 Biogen Idec Inc. Combination therapies for b-cell lymphomas comprising administration of anti-cd20 antibody
BR9915149A (pt) * 1998-11-09 2001-08-07 Idec Pharma Corp Tratamento com anticorpo anti-cd20 quimérico de pacientes recebendo transplantes de bmt ou de pbsc
EP1131093A4 (en) 1998-11-09 2002-05-02 Idec Pharma Corp TREATMENT OF HEMATOLOGICAL VILTIES ASSOCIATED WITH CIRCULATING TUMOR CELLS USING CHIMERIC ANTI-CD20 ANTIBODIES
US8557244B1 (en) 1999-08-11 2013-10-15 Biogen Idec Inc. Treatment of aggressive non-Hodgkins lymphoma with anti-CD20 antibody
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
EP1558648B1 (en) 2002-10-17 2012-01-11 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd20
DE10254601A1 (de) 2002-11-22 2004-06-03 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
RU2326127C2 (ru) 2002-12-16 2008-06-10 Джинентех, Инк. Варианты иммуноглобулинов и их применение
CA2897608C (en) * 2003-05-09 2018-07-31 Duke University Cd20-specific antibodies and methods employing same
AR044388A1 (es) * 2003-05-20 2005-09-07 Applied Molecular Evolution Moleculas de union a cd20
ZA200601218B (en) * 2003-08-29 2007-05-30 Genentech Inc Anti-CD20 therapy of ocular disorders
ES2550311T3 (es) 2003-11-05 2015-11-06 Roche Glycart Ag Moléculas de unión a antígeno con afinidad de unión a receptores Fc y función efectora incrementadas
FR2867982B1 (fr) * 2004-03-26 2007-07-20 Jean Marie Andrieu Procede pour amplifier l'activite de vaccins therapeutiques
AR049021A1 (es) * 2004-04-16 2006-06-21 Genentech Inc Tratamiento de trastornos con un anticuerpo que se une a cd20
MXPA06011805A (es) * 2004-04-16 2006-12-15 Genentech Inc Metodo para aumentar agotamiento de celulas b.
RU2006145450A (ru) * 2004-04-16 2008-06-27 Дженентек, Инк. (Us) Анализ на антитела
JP5848861B2 (ja) * 2004-04-20 2016-01-27 ジェンマブ エー／エスＧｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ Ｃｄ２０に対するヒトモノクローナル抗体
AU2005249393A1 (en) * 2004-05-05 2005-12-15 Genentech, Inc. Preventing autoimmune disease by using an anti-CD20 antibody
DE102004024617A1 (de) 2004-05-18 2005-12-29 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
AR049200A1 (es) * 2004-06-04 2006-07-05 Genentech Inc Metodo para tratar esclerosis multiple con una composicion que contiene un anticuerpo cd20
NZ551974A (en) * 2004-07-02 2010-01-29 Inst Medical W & E Hall Alpha-helical minetics
WO2006085967A2 (en) * 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
BRPI0514068B8 (pt) 2004-08-04 2021-05-25 Applied Molecular Evolution Inc anticorpo anti-cd20, e, composição farmacêutica
KR20070100228A (ko) * 2004-10-05 2007-10-10 제넨테크, 인크. 혈관염의 치료 방법
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
FR2879204B1 (fr) 2004-12-15 2007-02-16 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps cytotoxique dirige contre les proliferations hematopoietiques lymphoides de type b.
US10206998B2 (en) 2005-01-12 2019-02-19 Proteonova, Inc. Modular targeted therapeutic agents and methods of making same
EP1846432A4 (en) * 2005-01-12 2008-11-19 Proteonova Inc METHOD FOR MANUFACTURING TARGETED THERAPEUTIC AGENTS
CN101218256B (zh) 2005-03-23 2017-04-19 根马布股份公司 用于治疗多发性骨髓瘤的cd38抗体
AR053579A1 (es) * 2005-04-15 2007-05-09 Genentech Inc Tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal (eii)
US20090041783A1 (en) 2005-04-28 2009-02-12 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-platelet membrane glycoprotein vi monoclonal antibody
JP5224707B2 (ja) * 2005-04-28 2013-07-03 持田製薬株式会社 抗血小板膜糖蛋白質ｖｉモノクローナル抗体
CN101223448B (zh) 2005-05-20 2012-01-18 健泰科生物技术公司 来自自身免疫病受试者的生物学样品的预处理
KR101273829B1 (ko) 2005-05-20 2013-06-11 론자 바이올로직스 피엘씨 포유류 숙주 세포에서의 재조합 항체의 고-수준 발현
FR2886298A1 (fr) * 2005-05-24 2006-12-01 Ifremer Anticorps ou fragment d'anticorps couple a un agent immunogene
CA2610234A1 (en) * 2005-06-02 2006-12-07 Astrazeneca Ab Antibodies directed to cd20 and uses thereof
KR20080030673A (ko) 2005-07-21 2008-04-04 젠맵 에이/에스 Ｆｃ 수용체와 결합하는 항체 약품 성분에 대한 효력 검정
CA2616395C (en) 2005-07-25 2016-10-04 Trubion Pharmaceuticals B-cell reduction using cd37-specific and cd20-specific binding molecules
US20090215992A1 (en) * 2005-08-19 2009-08-27 Chengbin Wu Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP1762575A1 (en) 2005-09-12 2007-03-14 Ganymed Pharmaceuticals AG Identification of tumor-associated antigens for diagnosis and therapy
MY149159A (en) 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
AU2006318539B2 (en) 2005-11-23 2012-09-13 Genentech, Inc. Methods and compositions related to B cell assays
EP1790664A1 (en) 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
TWI461436B (zh) * 2005-11-25 2014-11-21 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 人類ｃｄ１３４（ｏｘ４０）之人類單株抗體及其製造及使用方法
EP4316465A3 (en) 2006-03-15 2024-04-24 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria patients by an inhibitor of complement
CN105177091A (zh) 2006-03-31 2015-12-23 中外制药株式会社 用于纯化双特异性抗体的抗体修饰方法
TWI390034B (zh) * 2006-04-06 2013-03-21 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Novel anti-CD98 antibody
MX2008015524A (es) 2006-06-12 2009-01-13 Trubion Pharmaceuticals Inc Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora.
US20130004480A1 (en) 2006-07-04 2013-01-03 Paul Parren CD20 Binding Molecules for the Treatment of Copd
EP3569245A1 (en) * 2006-09-26 2019-11-20 Genmab A/S Combination treatment of cd38-expressing tumors
SI2486941T1 (sl) * 2006-10-02 2017-08-31 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Humana protitelesa, ki vežejo CXCR4 in njihova uporaba
US9382327B2 (en) * 2006-10-10 2016-07-05 Vaccinex, Inc. Anti-CD20 antibodies and methods of use
CN101646431B (zh) 2007-01-22 2012-06-27 健泰科生物技术公司 蛋白质的聚电解质沉淀和纯化
EP1970384A1 (en) 2007-03-14 2008-09-17 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies for treatment of cancer
US7960139B2 (en) 2007-03-23 2011-06-14 Academia Sinica Alkynyl sugar analogs for the labeling and visualization of glycoconjugates in cells
AR065803A1 (es) * 2007-03-23 2009-07-01 Smithkline Beecham Corp Uso de un polipeptido de il- 18 humana y un anticuerpo anti- cd para preparar unmedicamento
CN104497143B (zh) 2007-03-29 2020-08-25 健玛保 双特异性抗体及其制造方法
EP1997832A1 (en) 2007-05-29 2008-12-03 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against Claudin-18 for treatment of cancer
KR102606597B1 (ko) 2007-05-29 2023-11-29 노파르티스 아게 항-ｉｌ-1-베타 치료법에 대한 신규 적응증
EP2615175B1 (en) 2007-05-31 2018-08-08 Genmab A/S Monovalent human antibodies
EP4119579A1 (en) 2007-05-31 2023-01-18 Genmab A/S Stable igg4 antibodies
UA107557C2 (xx) * 2007-07-06 2015-01-26 Композиція антитіла офатумумабу
EP2178916B1 (en) * 2007-07-31 2014-12-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human antibodies to human cd20 and method of using thereof
AU2008295140A1 (en) * 2007-09-05 2009-03-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with type I and type II anti-CD20 antibodies
US20090098118A1 (en) 2007-10-15 2009-04-16 Thomas Friess Combination therapy of a type ii anti-cd20 antibody with an anti-bcl-2 active agent
PL2233149T3 (pl) 2007-10-16 2016-08-31 Zymogenetics Inc Kombinacja przezbłonowego aktywatora i ligandu cyklofiliny (taci) oraz przeciwciała anty-cd20 do leczenia chorób autoimmunologicznych
EP2205277B1 (en) * 2007-10-22 2017-07-26 Genmab A/S Novel antibody therapies
EP2215117B2 (en) 2007-10-30 2018-01-10 Genentech, Inc. Antibody purification by cation exchange chromatography
EP2231183A2 (en) 2007-12-21 2010-09-29 Genentech, Inc. Therapy of rituximab-refractory rheumatoid arthritis patients
US7914785B2 (en) 2008-01-02 2011-03-29 Bergen Teknologieverforing As B-cell depleting agents, like anti-CD20 antibodies or fragments thereof for the treatment of chronic fatigue syndrome
EP2077281A1 (en) 2008-01-02 2009-07-08 Bergen Teknologioverforing AS Anti-CD20 antibodies or fragments thereof for the treatment of chronic fatigue syndrome
NZ587284A (en) * 2008-03-25 2012-05-25 Roche Glycart Ag Use of a type ii anti-cd20 antibody with increased antibody dependent cellular cytotoxicity (adcc) in combination with cyclophosphamide, vincristine and doxorubicine for treating non-hodgkin' s lymphomas
WO2009126944A1 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof
US20090269339A1 (en) * 2008-04-29 2009-10-29 Genentech, Inc. Responses to immunizations in rheumatoid arthritis patients treated with a cd20 antibody
ES2442024T3 (es) 2008-07-15 2014-02-07 Academia Sinica Matrices de glucano sobre portaobjetos de vidrio revestidos con aluminio de tipo PTFE y métodos relacionados
WO2011011027A1 (en) 2009-07-20 2011-01-27 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-ctla4 antibody with diverse therapeutic regimens for the synergistic treatment of proliferative diseases
WO2010014784A2 (en) 2008-08-01 2010-02-04 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-ctla4 antibody with diverse therapeutic regimens for the synergistic treatment of proliferative diseases
PT2848625T (pt) 2008-08-14 2019-10-25 Genentech Inc Métodos para remover um contaminante com a utilização de cromatografia de membrana de permuta iónica de deslocação de proteína indígena.
EP2684570A1 (en) 2008-09-10 2014-01-15 F. Hoffmann-La Roche AG Compositions and methods for the prevention of oxidative degradation of proteins
EP2166021A1 (en) 2008-09-16 2010-03-24 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies for treatment of cancer
TW201014605A (en) 2008-09-16 2010-04-16 Genentech Inc Methods for treating progressive multiple sclerosis
WO2010042433A1 (en) 2008-10-06 2010-04-15 Bristol-Myers Squibb Company Combination of cd137 antibody and ctla-4 antibody for the treatment of proliferative diseases
SG10201610247QA (en) 2008-12-03 2017-02-27 Genmab As Antibody variants having modifications in the constant region
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
JP5828151B6 (ja) * 2009-01-06 2018-09-19 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル アテローム性動脈硬化の処置のためのｂ細胞枯渇剤
CN102355907A (zh) * 2009-01-16 2012-02-15 葛兰素史密斯克莱有限责任公司 用苯达莫司汀和抗cd20抗体的组合治疗癌症
EP2398902B1 (en) 2009-02-20 2023-10-04 Astellas Pharma Inc. Methods and compositions for diagnosis and treatment of cancer
US20100247484A1 (en) * 2009-03-31 2010-09-30 Heinrich Barchet Combination therapy of an afucosylated antibody and one or more of the cytokines gm csf, m csf and/or il3
AR077867A1 (es) 2009-08-14 2011-09-28 Roche Glycart Ag Terapia combinatoria de un anticuerpo cd20 afucosilado con fludarabina y/o mitoxantrona
TWI409079B (zh) 2009-08-14 2013-09-21 Roche Glycart Ag 非典型岩藻醣化ｃｄ２０抗體與苯達莫斯汀（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）之組合療法
RU2539112C2 (ru) 2009-09-03 2015-01-10 Дженентек, Инк. Способы лечения, диагностики и мониторинга ревматоидного артрита
AR078161A1 (es) 2009-09-11 2011-10-19 Hoffmann La Roche Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento.
US20110070227A1 (en) * 2009-09-18 2011-03-24 Anna-Marie Novotney-Barry Treatment of Autoimmune and Inflammatory Diseases
WO2011057188A1 (en) 2009-11-06 2011-05-12 Idexx Laboratories, Inc. Canine anti-cd20 antibodies
NO2499161T3 (ru) 2009-11-11 2018-02-03
EP2322555A1 (en) 2009-11-11 2011-05-18 Ganymed Pharmaceuticals AG Antibodies specific for claudin 6 (CLDN6)
US11377485B2 (en) 2009-12-02 2022-07-05 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
US10087236B2 (en) 2009-12-02 2018-10-02 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
US9175086B2 (en) * 2010-02-10 2015-11-03 Immunogen, Inc. CD20 antibodies and uses thereof
TW201129384A (en) * 2010-02-10 2011-09-01 Immunogen Inc CD20 antibodies and uses thereof
WO2011119487A2 (en) 2010-03-22 2011-09-29 Genentech, Inc. Compositions and methods useful for stabilizing protein-containing formulations
EP2371864A1 (en) 2010-03-23 2011-10-05 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies for treatment of cancer
WO2011130332A1 (en) 2010-04-12 2011-10-20 Academia Sinica Glycan arrays for high throughput screening of viruses
CN103097417B (zh) 2010-04-20 2019-04-09 根马布股份公司 含异二聚体抗体fc的蛋白及其制备方法
MX346731B (es) † 2010-04-23 2017-03-30 Genentech Inc * Producción de proteínas heteromultiméricas.
CN102844049B (zh) 2010-04-27 2016-06-01 罗切格利卡特公司 无岩藻糖基化CD20抗体与mTOR抑制剂的联合疗法
RU2012151500A (ru) 2010-05-03 2014-06-10 Дженентек, Инк. Композиции и способы, пригодные для снижения вязкости белковосодержащих составов
EP2975409B1 (en) 2010-05-10 2018-10-31 Academia Sinica Zanamivir phosphonate congeners with anti-influenza activity and determining oseltamivir susceptibility of influenza viruses
EP2571577A1 (en) 2010-05-17 2013-03-27 Bristol-Myers Squibb Company Improved immunotherapeutic dosing regimens and combinations thereof
CN103154035B (zh) 2010-05-27 2017-05-10 根马布股份公司 针对her2的单克隆抗体
DK2580243T3 (da) 2010-06-09 2020-01-13 Genmab As Antibodies against human cd38
BR112012033002B1 (pt) 2010-06-24 2021-10-13 Genentech, Inc Composição aquosa de matéria, método de inibição de agregação induzida por agitação e método de prevenção de oxidação
EP2404936A1 (en) 2010-07-06 2012-01-11 Ganymed Pharmaceuticals AG Cancer therapy using CLDN6 target-directed antibodies in vivo
BR112013002535A2 (pt) 2010-08-03 2019-09-24 Hoffmann La Roche biomarcadores de leucemia linfocítica crônica (cll)
US8822663B2 (en) 2010-08-06 2014-09-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
AR082693A1 (es) 2010-08-17 2012-12-26 Roche Glycart Ag Terapia de combinacion de un anticuerpo anti-cd20 afucosilado con un anticuerpo anti-vegf
CN104531671A (zh) 2010-10-01 2015-04-22 现代治疗公司 设计核酸及其使用方法
EP2787007A3 (en) 2010-11-08 2015-03-11 F. Hoffmann-La Roche AG Subcutaneously administered ANTI-IL-6 receptor antibody
US11066483B2 (en) 2010-11-30 2021-07-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
JP6157045B2 (ja) * 2010-12-06 2017-07-05 公益財団法人がん研究会 Ｃｄ２０認識モノクローナル抗体、ハイブリドーマ、ｃｄ２０の検出方法および判定方法
KR20130088170A (ko) 2010-12-16 2013-08-07 로슈 글리카트 아게 비푸코실화 ｃｄ20 항체와 ｍｄｍ2 저해제와의 조합 치료
JP2014506258A (ja) * 2011-01-10 2014-03-13 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッド 新規使用
EP2680884B1 (en) 2011-02-28 2018-01-17 F. Hoffmann-La Roche AG Biological markers and methods for predicting response to b-cell antagonists
CA2831613A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
EP4520771A2 (en) 2011-04-20 2025-03-12 Genmab A/S Bispecifc antibodies against her2
WO2012143524A2 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Genmab A/S Bispecific antibodies against her2 and cd3
CA2832387A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Genmab A/S Bispecifc antibodies against her2
HUE028603T2 (en) 2011-05-13 2016-12-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies for treatment of cancer expressing claudin 6
BR122016016837A2 (pt) 2011-05-21 2019-08-27 Macrogenics Inc moléculas de ligação a cd3; anticorpos de ligação a cd3; composições farmacêuticas; e usos da molécula de ligação a cd3
EP2537933A1 (en) 2011-06-24 2012-12-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) An IL-15 and IL-15Ralpha sushi domain based immunocytokines
BR112013033944A2 (pt) 2011-07-06 2017-12-19 Morphosys Ag combinação sinérgica
WO2013004841A1 (en) 2011-07-06 2013-01-10 Genmab A/S Modulation of complement-dependent cytotoxicity through modifications of the c-terminus of antibody heavy chains
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
CN102875678B (zh) * 2011-07-13 2014-08-06 无锡天演生物技术有限公司 全人源抗人cd20单抗分子及其应用
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
CA2846319A1 (en) * 2011-09-19 2013-03-28 Kymab Limited Antibodies, variable domains & chains tailored for human use
BR112014007852B1 (pt) 2011-10-03 2021-11-03 Moderna Therapeutics, Inc Polinucleotídeo isolado modificado e composição farmacêutica
RU2623122C2 (ru) 2011-10-26 2017-06-22 Новартис Тиргезундхайт АГ Моноклональные антитела и способы их применения
US10344050B2 (en) 2011-10-27 2019-07-09 Genmab A/S Production of heterodimeric proteins
EP2787078B1 (en) 2011-10-31 2019-05-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule having regulated conjugation between heavy-chain and light-chain
US20130302274A1 (en) 2011-11-25 2013-11-14 Roche Glycart Ag Combination therapy
AU2012352180A1 (en) 2011-12-16 2014-07-31 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
SI2794635T1 (sl) 2011-12-22 2018-12-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Ionskoizmenjevalna membranska kromatografija
US20130243750A1 (en) 2012-01-31 2013-09-19 Genentech, Inc. Anti-ige antibodies and methods using same
CN102585000B (zh) * 2012-02-22 2013-05-29 尉军 一种肿瘤标志物cd25自身抗体及应用
WO2013138702A2 (en) 2012-03-15 2013-09-19 Bristol-Myers Squibb Company Methods for predicting gastrointestinal immune-related adverse events (gi-irae) in patients treated with modulation of the co-stimulatory pathway
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
WO2013151672A2 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of oncology-related proteins and peptides
US10130714B2 (en) 2012-04-14 2018-11-20 Academia Sinica Enhanced anti-influenza agents conjugated with anti-inflammatory activity
PT2662386T (pt) 2012-05-07 2019-06-14 Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh Anticorpos que se ligam a plac1 e bloqueiam a interação entre plac1 e fgf7
WO2013167153A1 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies useful in cancer diagnosis
WO2013169971A1 (en) 2012-05-10 2013-11-14 Bristol-Myers Squibb Company Anti-tumor antibodies as predictive or prognostic biomarkers of efficacy and survival in ipilimumab-treated patients
NZ701915A (en) 2012-05-18 2016-11-25 Genentech Inc High-concentration monoclonal antibody formulations
EP3725810B1 (en) 2012-05-23 2022-07-06 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2013174404A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
PL2852408T3 (pl) 2012-05-23 2017-12-29 Ganymed Pharmaceuticals Gmbh Terapia skojarzona obejmująca przeciwciała przeciwko Klaudynie 18.2 do leczenia nowotworu
WO2013174403A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
PT2869845T (pt) * 2012-07-06 2019-12-09 Genmab Bv Proteína dimérica com mutações triplas
EP3632462A1 (en) 2012-07-06 2020-04-08 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
CN104736174B (zh) 2012-07-06 2019-06-14 根马布私人有限公司 具有三重突变的二聚体蛋白质
CN103588882B (zh) * 2012-08-13 2015-10-28 中国抗体制药有限公司 针对人cd22抗体的抗独特型抗体及其应用
CA2880701A1 (en) 2012-08-18 2014-02-27 Academia Sinica Cell-permeable probes for identification and imaging of sialidases
EP2888238A4 (en) 2012-08-21 2016-01-27 Academia Sinica BENZOCYCLOOCTYN COMPOUNDS AND USES THEREOF
US8643360B1 (en) * 2012-09-02 2014-02-04 George S. Cargill, III In-water voltage gradient detector
EP2892557A1 (en) 2012-09-07 2015-07-15 Genentech, Inc. Combination therapy of a type ii anti-cd20 antibody with a selective bcl-2 inhibitor
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
JP6273205B2 (ja) 2012-10-05 2018-01-31 協和発酵キリン株式会社 ヘテロダイマータンパク質組成物
DK2914633T3 (da) 2012-10-30 2022-03-14 Esperance Pharmaceuticals Inc Antistof/lægemiddel-konjugater og anvendelsesfremgangsmåder
KR102643443B1 (ko) * 2012-11-13 2024-03-06 비온테크 에스이 클라우딘 발현 암 질환의 치료제
EP3766903A3 (en) 2012-11-13 2021-02-17 BioNTech SE Bispecific anti claudin xcd3 antibodies for treatment of claudin expressing cancer diseases
WO2014075697A1 (en) 2012-11-13 2014-05-22 Biontech Ag Agents for treatment of claudin expressing cancer diseases
RS63237B1 (sr) 2012-11-26 2022-06-30 Modernatx Inc Terminalno modifikovana rnk
CN103173412B (zh) * 2012-12-07 2015-04-22 天津三箭生物技术有限公司 小鼠抗人cd20单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株
IL283173B2 (en) 2013-01-10 2024-12-01 Genmab Bv Human igg1 fc region variants and uses thereof
CN103145847B (zh) * 2013-02-05 2014-05-21 浙江大学 一种抗cd20抗体-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用
HRP20221319T1 (hr) 2013-02-20 2022-12-23 Astellas Pharma Inc. Kombinirana terapija koja uključuje antitijela protiv klaudina 18.2 za liječenje raka
WO2014127785A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
SG11201507475UA (en) 2013-03-13 2015-10-29 Genentech Inc Antibody formulations
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
FR3003171B1 (fr) * 2013-03-15 2015-04-10 Lab Francais Du Fractionnement Nouveaux medicaments comprenant une composition d'anticorps enrichie en isoforme de charge majoritaire
SI2976360T1 (sl) 2013-03-18 2020-04-30 Astellas Pharma Inc. Terapija, ki vključuje protitelesa proti Klavdinu 18.2 za zdravljenje raka
WO2014146672A1 (en) 2013-03-18 2014-09-25 Ganymed Pharmaceuticals Ag Therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2014169078A2 (en) 2013-04-09 2014-10-16 Boston Biomedical, Inc. Methods for treating cancer
JP2016518361A (ja) 2013-04-19 2016-06-23 シーチューヌ ファルマＣｙｔｕｎｅ Ｐｈａｒｍａ 血管漏出症候群の発生を抑制するサイトカイン治療
CN103254317B (zh) * 2013-05-08 2014-08-13 浙江大学 一种抗cd20单克隆抗体-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用
US10086054B2 (en) 2013-06-26 2018-10-02 Academia Sinica RM2 antigens and use thereof
EP3013347B1 (en) 2013-06-27 2019-12-11 Academia Sinica Glycan conjugates and use thereof
PL3016681T3 (pl) 2013-07-05 2020-06-15 Genmab A/S Humanizowane lub chimeryczne przeciwciała CD3
EP3738611A1 (en) 2013-07-31 2020-11-18 BioNTech AG Diagnosis and therapy of cancer involving cancer stem cells
WO2015014376A1 (en) 2013-07-31 2015-02-05 Biontech Ag Diagnosis and therapy of cancer involving cancer stem cells
EP3030262B1 (en) 2013-08-08 2019-10-09 Cytune Pharma Combined pharmaceutical composition
EP3995507B1 (en) 2013-08-08 2023-10-04 Cytune Pharma Il-15 and il-15ralpha sushi domain based on modulokines
CN103467605B (zh) * 2013-09-05 2015-02-04 武汉友芝友生物制药有限公司 一种cd3抗原及其制备方法和用途
CN105682666B (zh) 2013-09-06 2021-06-01 中央研究院 使用醣脂激活人类iNKT细胞
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
JP2016538829A (ja) 2013-10-03 2016-12-15 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 低密度リポタンパク質受容体をコードするポリヌクレオチド
WO2015069770A1 (en) 2013-11-05 2015-05-14 Cognate Bioservices, Inc. Combinations of checkpoint inhibitors and therapeutics to treat cancer
US20160264670A1 (en) 2013-11-06 2016-09-15 Bristol-Myers Squibb Company Immunotherapeutic dosing regimens and combinations thereof
EP3066126B1 (en) * 2013-11-07 2019-03-27 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of an anti cd20 antibody with a btk inhibitor
ES2839087T3 (es) 2013-11-12 2021-07-05 Ogd2 Pharma Anticuerpo derivado de IGG1 humana con actividad pro-apoptótica
CN105899535A (zh) 2013-12-17 2016-08-24 豪夫迈·罗氏有限公司 用pd-1轴结合拮抗剂和抗cd20抗体治疗癌症的方法
US10150818B2 (en) 2014-01-16 2018-12-11 Academia Sinica Compositions and methods for treatment and detection of cancers
WO2015109180A2 (en) 2014-01-16 2015-07-23 Academia Sinica Compositions and methods for treatment and detection of cancers
EP2910645A1 (en) 2014-02-25 2015-08-26 STRATIFYER Molecular Pathology GmbH Methods and compositions for prediction of therapeutic efficacy of cancer treatments and cancer prognosis upon antibody treatment
EP2915569A1 (en) 2014-03-03 2015-09-09 Cytune Pharma IL-15/IL-15Ralpha based conjugates purification method
TWI701042B (zh) 2014-03-19 2020-08-11 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
CN103880958B (zh) * 2014-03-27 2016-01-20 安徽大学 抗cd20抗原的抗体l4h6及其应用
CN103880957B (zh) * 2014-03-27 2016-01-20 安徽大学 抗cd20抗原的抗体l1h1及其应用
TWI797430B (zh) 2014-03-27 2023-04-01 中央研究院 反應性標記化合物及其用途
WO2015156268A1 (ja) 2014-04-07 2015-10-15 中外製薬株式会社 免疫活性化抗原結合分子
DK4219687T3 (da) 2014-04-23 2024-10-28 Juno Therapeutics Inc Fremgangsmåder til isolering, dyrkning og genmanipulering af immuncellepopulationer til adoptiv terapi
US20170049887A1 (en) 2014-04-25 2017-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Methods of permitting a subject to receive multiple doses of recombinant adeno-associated virus
HRP20231139T1 (hr) 2014-05-06 2024-01-05 F. Hoffmann - La Roche Ag Proizvodnja heteromultimernih proteina upotrebom stanica sisavaca
CA2947157A1 (en) 2014-05-13 2015-11-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha T cell-redirected antigen-binding molecule for cells having immunosuppression function
US10118969B2 (en) 2014-05-27 2018-11-06 Academia Sinica Compositions and methods relating to universal glycoforms for enhanced antibody efficacy
WO2015184004A1 (en) 2014-05-27 2015-12-03 Academia Sinica Anti-cd20 glycoantibodies and uses thereof
CN106661099A (zh) 2014-05-27 2017-05-10 中央研究院 抗her2醣抗体及其用途
TWI654202B (zh) 2014-05-27 2019-03-21 中央研究院 增進抗體功效之通用糖型之組合物及方法
EP3154582A4 (en) 2014-05-28 2018-01-10 Academia Sinica Anti-tnf-alpha glycoantibodies and uses thereof
TWI745275B (zh) 2014-09-08 2021-11-11 中央研究院 使用醣脂激活人類ｉＮＫＴ細胞
RU2704611C2 (ru) 2014-09-15 2019-10-30 Дженентек, Инк. Составы на основе антител
CA3069221C (en) 2014-09-23 2023-04-04 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
EP3204040B1 (en) 2014-10-10 2021-12-08 Idera Pharmaceuticals, Inc. Treatment of cancer using tlr9 agonists and checkpoint inhibitors
PL3221359T3 (pl) 2014-11-17 2020-11-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sposoby leczenia nowotworów przy użyciu dwuswoistego przeciwciała CD3XCD20
KR20170088984A (ko) 2014-12-04 2017-08-02 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 암 (골수종)을 치료하기 위한 항-cs1 항체와 항-pd1 항체의 조합
FI3240805T3 (fi) 2014-12-15 2025-02-17 Univ California Cd19- ja cd20-vasteellinen bispesifinen tai-veräjän kimeerinen antigeenireseptori
US10865253B2 (en) 2014-12-19 2020-12-15 Genmab A/S Rodent bispecific heterodimeric proteins
KR102663073B1 (ko) * 2015-01-08 2024-05-07 젠맵 에이/에스 Cd3 및 cd20에 대항한 이중특이적 항체
US9975965B2 (en) 2015-01-16 2018-05-22 Academia Sinica Compositions and methods for treatment and detection of cancers
US10495645B2 (en) 2015-01-16 2019-12-03 Academia Sinica Cancer markers and methods of use thereof
EP3789766A1 (en) 2015-01-24 2021-03-10 Academia Sinica Novel glycan conjugates and methods of use thereof
EP3250588A1 (en) 2015-01-29 2017-12-06 Board of Trustees of Michigan State University Cryptic polypeptides and uses thereof
SG11201707144VA (en) * 2015-03-04 2017-09-28 Igm Biosciences Inc Cd20 binding molecules and uses thereof
WO2016146143A1 (en) 2015-03-16 2016-09-22 Amal Therapeutics Sa Cell penetrating peptides and complexes comprising the same
CA2981068C (en) 2015-03-26 2021-12-14 Women & Infants Hospital Of Rhode Island Therapy for malignant disease comprising the inhibition of human epididymal secretory protein e4 and immune checkpoint inhibitors
WO2016165762A1 (en) 2015-04-15 2016-10-20 Ganymed Pharmaceuticals Ag Drug conjugates comprising antibodies against claudin 18.2
WO2016165765A1 (en) 2015-04-15 2016-10-20 Ganymed Pharmaceuticals Ag Methods and compositions for prediction of therapeutic efficacy of cancer treatments and cancer prognosis
CN107529739B (zh) * 2015-04-30 2021-01-08 株式会社特殊免疫研究所 表达人特定分子和人Fcγ受体家族的转基因非人动物
WO2016183183A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 The Johns Hopkins University Autoimmune antibodies for use in inhibiting cancer cell growth
WO2016183104A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating lupus nephritis
BR112017024899A2 (pt) 2015-05-21 2018-11-13 Harpoon Therapeutics, Inc. proteínas de ligação trispecíficas e métodos de uso.
JP7028765B2 (ja) 2015-05-22 2022-03-02 トランスレイショナル・ドラッグ・ディベロップメント・エルエルシー ベンズアミドおよび活性化合物組成物および使用方法
CA2988126A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 Boston Biomedical, Inc. Compositions comprising a cancer stemness inhibitor and an immunotherapeutic agent for use in treating cancer
ES2908009T3 (es) 2015-06-24 2022-04-27 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-receptor de transferrina con afinidad adaptada
EP3108897A1 (en) 2015-06-24 2016-12-28 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies against human csf-1r for use in inducing lymphocytosis in lymphomas or leukemias
JOP20200312A1 (ar) 2015-06-26 2017-06-16 Novartis Ag الأجسام المضادة للعامل xi وطرق الاستخدام
PT3313528T (pt) 2015-06-29 2021-09-16 Bristol Myers Squibb Co Regimes de dosagem imunoterapêuticos compreendendo pomalidomida e um anticorpo anti-cs1 para tratamento do cancro
EP3313885A1 (en) 2015-06-29 2018-05-02 H. Hoffnabb-La Roche Ag Type ii anti-cd20 antibody for use in organ transplantation
US20180201693A1 (en) 2015-07-09 2018-07-19 Genmab A/S Bispecific and multispecific antibodies and method for isolation of such
EP3744340A3 (en) 2015-07-16 2021-03-03 Biokine Therapeutics Ltd. Compositions and methods for treating cancer
EP3328896A4 (en) 2015-07-31 2019-08-07 University of Florida Research Foundation, Inc. HEMATOPOIETIC STEM CELLS IN COMBINATORY THERAPY WITH IMMUNCHECKPOINT INHIBITORS AGAINST CANCER
US20180230431A1 (en) 2015-08-07 2018-08-16 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination Therapy
ES2964640T3 (es) 2015-08-13 2024-04-08 Amgen Inc Filtración en profundidad cargada de proteínas de unión al antígeno
EP3352760A4 (en) 2015-09-21 2019-03-06 Aptevo Research and Development LLC CD3-BINDING POLYPEPTIDES
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
CN114014936A (zh) 2015-10-02 2022-02-08 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗人cd20/人转铁蛋白受体抗体及使用方法
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
AU2016339832B2 (en) * 2015-10-13 2023-07-06 Eureka Therapeutics, Inc. Antibody agents specific for human CD19 and uses thereof
WO2017086419A1 (ja) 2015-11-18 2017-05-26 中外製薬株式会社 液性免疫応答の増強方法
WO2017086367A1 (ja) 2015-11-18 2017-05-26 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子を用いた併用療法
JP7254515B2 (ja) 2015-12-01 2023-04-10 ジェンマブ ビー．ブイ． 抗ｄｒ５抗体およびその使用方法
AU2016368469B2 (en) 2015-12-09 2023-11-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Type II anti-CD20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
EP3178848A1 (en) 2015-12-09 2017-06-14 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
CN105348388B (zh) * 2015-12-11 2018-10-19 安徽大学 抗cd20抗原的抗体l3h3及其应用
MX2018007781A (es) 2015-12-28 2018-09-05 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Metodo para promover la eficiencia de purificacion del polipeptido que contiene la region de fragmento cristalizable (fc).
CA3007419A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Genentech, Inc. Formulations with reduced degradation of polysorbate
WO2017148880A1 (en) 2016-03-01 2017-09-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Obinutuzumab variants having altered cell death induction
WO2017149018A1 (en) 2016-03-02 2017-09-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and kits for predicting the risk of relapse in patients suffering from idiopathic nephrotic syndrome
US10336784B2 (en) 2016-03-08 2019-07-02 Academia Sinica Methods for modular synthesis of N-glycans and arrays thereof
WO2017160599A1 (en) 2016-03-14 2017-09-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Use of cd300b antagonists to treat sepsis and septic shock
RU2746754C2 (ru) 2016-03-14 2021-04-20 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Индуцирующее повреждение клеток терапевтическое лекарственное средство, предназначенное для противораковой терапии
EP4302782A3 (en) 2016-03-15 2024-03-27 Mersana Therapeutics, Inc. Napi2b-targeted antibody-drug conjugates and methods of use thereof
HRP20240510T1 (hr) 2016-03-16 2024-07-05 Amal Therapeutics Sa Kombinacija modulatora imunosne kontrolne točke i kompleksa koji sadrži peptid koji prodire u stanicu, teretni i tlr peptidni agonist za uporabu u medicini
EP3445378A1 (en) 2016-04-22 2019-02-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and vaccine compositions for the treatment of b-cell malignancies
US20190298824A1 (en) 2016-05-04 2019-10-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Serv Albumin-binding immunomodulatory compositions and methods of use thereof
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
TW201802121A (zh) 2016-05-25 2018-01-16 諾華公司 抗因子XI/XIa抗體之逆轉結合劑及其用途
US11052148B2 (en) 2016-05-30 2021-07-06 Geo Vax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to hepatitis B virus
TW201902512A (zh) 2016-06-02 2019-01-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 治療方法
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
SG10202012243VA (en) 2016-06-14 2021-01-28 Regeneron Pharma Anti-c5 antibodies and uses thereof
CN109154600A (zh) * 2016-06-16 2019-01-04 豪夫迈·罗氏有限公司 用于确定cdc诱导抗体的测定法和方法
SG11201811600PA (en) 2016-06-30 2019-01-30 Oncorus Inc Pseudotyped oncolytic viral delivery of therapeutic polypeptides
CN106267406B (zh) * 2016-07-01 2019-02-01 翁炳焕 艾滋病血液净化器
WO2018025221A1 (en) 2016-08-04 2018-02-08 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Anti-icos and anti-pd-1 antibody combination therapy
JP7213549B2 (ja) 2016-08-22 2023-01-27 シーエイチオー ファーマ インコーポレイテッド 抗体、結合性断片、および使用の方法
JP2019530661A (ja) * 2016-09-01 2019-10-24 ユーエムシー ユトレヒト ホールディング ビー．ブイ． Ｃｄ２０抗体
KR20190057345A (ko) 2016-09-21 2019-05-28 아말 테라퓨틱스 에스에이 암 치료를 위한, 세포 투과 펩타이드, 멀티 에피토프 및 tlr 펩타이드 작용제를 포함하는 융합체
WO2018054484A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Biontech Ag Bispecific trivalent antibodies binding to claudin 6 or claudin18.2 and cd3 for treatment of claudin expressing cancer diseases
JP7277363B2 (ja) 2016-11-01 2023-05-18 ジェンマブ ビー．ブイ． ポリペプチド変異体およびその使用
US11135307B2 (en) 2016-11-23 2021-10-05 Mersana Therapeutics, Inc. Peptide-containing linkers for antibody-drug conjugates
CN110234319B (zh) 2016-11-23 2022-09-27 转化药物开发有限责任公司 苯甲酰胺和活性化合物的组合物及其使用方法
CA3045306A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 Boston Biomedical, Inc. Naphthofuran derivatives, preparation, and methods of use thereof
WO2018099539A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 Horst Lindhofer Combination of t-cell redirecting multifunctional antibodies with immune checkpoint modulators and uses thereof
EP3548896B1 (en) 2016-12-01 2021-01-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of anti-uchl1 igg plasma concentration for diagnosing idiopathic steroid sensitive nephrotic syndrome
CA3045243A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination therapy
BR112019011370A2 (pt) 2016-12-01 2019-10-15 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd terapia de combinação
US20180206726A1 (en) 2016-12-07 2018-07-26 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
CN117752798A (zh) 2016-12-19 2024-03-26 豪夫迈·罗氏有限公司 用靶向性4-1bb(cd137)激动剂的组合疗法
CA3039446A1 (en) 2016-12-20 2018-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and 4-1bb (cd137) agonists
JP7139332B2 (ja) 2016-12-23 2022-09-20 ノバルティス アーゲー 第ｘｉ因子抗体および使用方法
EP3579885A4 (en) 2017-02-07 2020-12-16 Nantcell, Inc. MAXIMIZING T CELL MEMORY, COMPOSITIONS AND RELATED METHODS
CN108395482B (zh) 2017-02-08 2021-02-05 西比曼生物科技（香港）有限公司 一种靶向cd20抗原嵌合抗原受体的构建及其工程化t细胞的活性鉴定
MA47449A (fr) 2017-02-10 2019-12-18 Genmab Bv Variants polypeptidiques et ses utilisations
WO2018160538A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Mersana Therapeutics, Inc. Combination therapies of her2-targeted antibody-drug conjugates
WO2018167780A1 (en) 2017-03-12 2018-09-20 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of prognosing and treating cancer
EP3596469A1 (en) 2017-03-12 2020-01-22 Yeda Research and Development Co., Ltd. Methods of diagnosing and prognosing cancer
WO2018183929A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
MX2019011520A (es) 2017-03-31 2020-08-03 Genmab Holding B V Anticuerpos anti antigeno leucocito 37 (cd37) biespecificos, anticuerpos anti antigeno leucocito 37 (cd37) monoclonales y metodos de uso de los mismos.
KR102376863B1 (ko) 2017-05-12 2022-03-21 하푼 테라퓨틱스, 인크. 메소텔린 결합 단백질
CA3062656A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Boston Biomedical, Inc. Methods for treating cancer
CA3061959A1 (en) 2017-06-09 2018-12-13 Providence Health & Services - Oregon Utilization of cd39 and cd103 for identification of human tumor reactive t cells for treatment of cancer
CN107446046A (zh) * 2017-07-05 2017-12-08 无锡傲锐东源生物科技有限公司 抗cd20蛋白单克隆抗体及其用途
JP2020528061A (ja) 2017-07-26 2020-09-17 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト ＢＥＴ阻害剤、Ｂｃｌ−２阻害剤及び抗ＣＤ２０抗体を用いた併用療法
WO2019036855A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Adagene Inc. ANTI-CD137 MOLECULES AND THEIR USE
WO2019048040A1 (en) 2017-09-06 2019-03-14 Ganymed Pharmaceuticals Gmbh ANTIBODIES USEFUL IN THE DIAGNOSIS OF CANCER
IL315737A (en) 2017-10-13 2024-11-01 Harpoon Therapeutics Inc B-cell maturation antigen-binding proteins
WO2019077123A1 (en) 2017-10-20 2019-04-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) METHODS AND KITS FOR IDENTIFYING WHETHER A SUBJECT IS REACHED OR RISK OF BEING WITH AUTOIMMUNE MYOPATHY
US11638760B2 (en) 2017-11-27 2023-05-02 Mersana Therapeutics, Inc. Pyrrolobenzodiazepine antibody conjugates
CA3079039A1 (en) 2017-12-14 2019-06-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of a cea cd3 bispecific antibody and a pd-1 axis binding antagonist in a dosage regime to treat cancer
CN111757757A (zh) 2017-12-21 2020-10-09 梅尔莎纳医疗公司 吡咯并苯并二氮呯抗体共轭物
JP2021508477A (ja) 2017-12-29 2021-03-11 オンコラス， インコーポレイテッド 治療用ポリペプチドの腫瘍溶解性ウイルス送達
EP3743440A1 (en) 2018-01-24 2020-12-02 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
CN112218658A (zh) 2018-03-12 2021-01-12 国家健康科学研究所 热量限制模拟物用于增强癌症治疗的化学免疫疗法的用途
TWI841551B (zh) 2018-03-13 2024-05-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 使用靶向4-1bb (cd137)之促效劑的組合療法
BR112020015568A2 (pt) 2018-03-13 2020-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Agonista de 4-1bb (cd137), produto farmacêutico, composição farmacêutica, uso de uma combinação de um agonista de 4-1bb e método para tratar ou retardar a progressão do câncer
US20210238296A1 (en) 2018-05-03 2021-08-05 Genmab B.V. Antibody variant combinations and uses thereof
EP3810109B1 (en) 2018-05-31 2024-08-07 Peloton Therapeutics, Inc. Compounds and compositions for inhibiting cd73
EP3807410A1 (en) 2018-06-15 2021-04-21 MiNA Therapeutics Limited Combination therapies comprising c/ebp alpha sarna
US12227565B2 (en) 2018-06-20 2025-02-18 Biora Therapeutics, Inc. Method of formulating a pharmaceutical composition comprising administering an immune modulator to the small intestine
WO2019246312A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
EP3810649A1 (en) 2018-06-22 2021-04-28 Genmab A/S Method for producing a controlled mixture of two or more different antibodies
MA52951A (fr) 2018-06-22 2021-04-28 Genmab Holding B V Anticorps anti-cd37 et anticorps anti-cd20, compositions et méthodes d'utilisation de ceux-ci
CN112384219A (zh) * 2018-07-09 2021-02-19 千禧制药公司 Sumo-激活酶抑制剂和抗cd20抗体的施用
GB201811408D0 (en) 2018-07-12 2018-08-29 F Star Beta Ltd CD137 Binding Molecules
JP2021534101A (ja) 2018-08-09 2021-12-09 ヴェルソー セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｃｃｒ２及びｃｓｆ１ｒを標的とするためのオリゴヌクレオチド組成物ならびにその使用
KR20210054528A (ko) 2018-08-31 2021-05-13 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Cd3/c20 이중특이적 항체에 대한 사이토카인 방출 증후군을 경감시키는 투약 전략
WO2020048942A1 (en) 2018-09-04 2020-03-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for enhancing cytotoxic t lymphocyte-dependent immune responses
CN112955172A (zh) 2018-09-17 2021-06-11 美国卫生和人力服务部 靶向cd19和cd20的双顺反子嵌合抗原受体及其用途
JP7618950B2 (ja) 2018-09-19 2025-01-22 インサーム （インスティテュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ ルシェルシェ メディカル） 免疫チェックポイント治療に抵抗性のある癌の治療のための方法および医薬組成物
US12195544B2 (en) 2018-09-21 2025-01-14 Harpoon Therapeutics, Inc. EGFR binding proteins and methods of use
CA3114038A1 (en) 2018-09-25 2020-04-02 Harpoon Therapeutics, Inc. Dll3 binding proteins and methods of use
WO2020070053A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of inhibitors of stress granule formation for targeting the regulation of immune responses
MA53812A (fr) 2018-10-04 2021-08-11 Genmab Holding B V Compositions pharmaceutiques comprenant des anticorps anti-cd37 bispécifiques
KR102262012B1 (ko) 2018-10-15 2021-06-09 연세대학교 산학협력단 생산성이 향상된 항체 및 이의 제조방법
AU2019367218A1 (en) * 2018-10-26 2021-06-03 TeneoFour, Inc. Heavy chain antibodies binding to CD38
AU2019369340A1 (en) 2018-10-29 2021-05-20 Mersana Therapeutics, Inc. Cysteine engineered antibody-drug conjugates with peptide-containing linkers
KR20210095165A (ko) 2018-11-19 2021-07-30 프로제너티, 인크. 바이오의약품으로 질환을 치료하기 위한 방법 및 디바이스
MX2021005808A (es) 2018-11-20 2021-07-02 Univ Cornell Complejos macrociclicos de radionucleidos alfa-emisores y su uso en radioterapia focalizada de cancer.
EP3887823B1 (en) 2018-11-28 2024-01-17 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods and kit for assaying lytic potential of immune effector cells
CA3119798A1 (en) 2018-12-06 2020-06-11 Genentech, Inc. Combination therapy of diffuse large b-cell lymphoma comprising an anti-cd79b immunoconjugates, an alkylating agent and an anti-cd20 antibody
EP3891270A1 (en) 2018-12-07 2021-10-13 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Use of cd26 and cd39 as new phenotypic markers for assessing maturation of foxp3+ t cells and uses thereof for diagnostic purposes
CA3117710A1 (en) 2018-12-11 2020-06-18 Theravance Biopharma R&D Ip, Llc Alk5 inhibitors
US20220047556A1 (en) 2018-12-17 2022-02-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of sulconazole as a furin inhibitor
CN113508129B (zh) 2019-01-15 2025-02-18 法国国家健康和医学研究院 突变的白介素-34(il-34)多肽及其在治疗中的用途
WO2020169472A2 (en) 2019-02-18 2020-08-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of inducing phenotypic changes in macrophages
CN113660953A (zh) 2019-04-01 2021-11-16 豪夫迈·罗氏有限公司 用于稳定含蛋白质制剂的组合物和方法
WO2020201362A2 (en) 2019-04-02 2020-10-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of predicting and preventing cancer in patients having premalignant lesions
EP3952850A1 (en) 2019-04-09 2022-02-16 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Use of sk2 inhibitors in combination with immune checkpoint blockade therapy for the treatment of cancer
WO2020212484A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treatment of nlrp3 inflammasome mediated il-1beta dependent disorders
CN114206340A (zh) 2019-05-14 2022-03-18 豪夫迈·罗氏有限公司 使用抗cd79b免疫缀合物治疗滤泡性淋巴瘤的方法
CN114729383A (zh) 2019-07-02 2022-07-08 弗莱德哈钦森癌症研究中心 重组ad35载体及相关基因疗法改进
CN110551221B (zh) * 2019-07-02 2021-03-05 广州爱思迈生物医药科技有限公司 一种双特异性抗体及其制备方法与应用
WO2021024020A1 (en) 2019-08-06 2021-02-11 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 and immune checkpoint inhibitors for treatment of cancer
US20240059785A1 (en) * 2019-08-30 2024-02-22 Qilu Puget Sound Biotherapeutics Corporation Anti-cd20 antibodies, anti-cd37 antibodies, and mixtures thereof
KR20220062025A (ko) 2019-09-11 2022-05-13 노파르티스 아게 요법 교체에 의한 rms의 치료
CN114375306A (zh) 2019-09-11 2022-04-19 诺华股份有限公司 奥法木单抗治疗患者中除多发性硬化症以外病症的管理
EP4438057A3 (en) 2019-09-12 2025-01-01 F. Hoffmann-La Roche AG Compositions and methods of treating lupus nephritis
WO2021058091A1 (en) 2019-09-24 2021-04-01 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Treatment involving therapeutic antibody and interleukin-2 (il2)
EP3800201A1 (en) 2019-10-01 2021-04-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Cd28h stimulation enhances nk cell killing activities
EP4037710A1 (en) 2019-10-04 2022-08-10 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods and pharmaceutical composition for the treatment of ovarian cancer, breast cancer or pancreatic cancer
CA3153880A1 (en) 2019-10-18 2020-06-09 Juana Elva HERNANDEZ MONTALVO Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma
EP4055046A1 (en) 2019-11-06 2022-09-14 Genmab B.V. Antibody variant combinations and uses thereof
CN114728941A (zh) 2019-11-22 2022-07-08 施万生物制药研发Ip有限责任公司 作为alk5抑制剂的经取代的1,5-萘啶或喹啉
CN111100204B (zh) * 2019-11-26 2022-03-11 山东立菲生物产业有限公司 靶向cd20的抗体、其制备方法和应用
CN115666704A (zh) 2019-12-13 2023-01-31 比奥拉治疗股份有限公司 用于将治疗剂递送至胃肠道的可摄取装置
JP2023507120A (ja) * 2019-12-18 2023-02-21 テネオフォー， インコーポレイテッド Ｃｄ３８に結合する重鎖抗体
CN115427814A (zh) 2020-02-21 2022-12-02 根马布有限公司 用于定量糖蛋白的方法
US11673879B2 (en) 2020-03-31 2023-06-13 Theravance Biopharma R&D Ip, Llc Substituted pyrimidines and methods of use
IL296701A (en) 2020-04-09 2022-11-01 Novartis Ag Ofatumumab for the treatment of multiple sclerosis while maintaining IgG in the serum
JP2023522691A (ja) 2020-04-21 2023-05-31 ユニバーシティ オブ ロチェスター ヒト精巣上体タンパク質４の阻害剤
JP2023524639A (ja) 2020-04-22 2023-06-13 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 患者特異的免疫療法用細胞の製造調整システム及び調整方法
AU2021259861A1 (en) 2020-04-24 2022-11-17 Genentech, Inc. Methods of using anti-CD79b immunoconjugates
EP4146175A1 (en) 2020-05-08 2023-03-15 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
WO2021245071A1 (en) 2020-06-03 2021-12-09 Mv Biotherapeutics Sa Combination of an atp-hydrolyzing enzyme and an immune checkpoint modulator and uses thereof
EP4165041A1 (en) 2020-06-10 2023-04-19 Theravance Biopharma R&D IP, LLC Naphthyridine derivatives useful as alk5 inhibitors
WO2021260675A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. Agents for sensitizing solid tumors to treatment
IL298993A (en) 2020-07-07 2023-02-01 BioNTech SE Therapeutic rna for hpv-positive cancer
CA3184940A1 (en) 2020-07-07 2022-01-13 Jennifer Donglan WU Mic antibodies and binding agents and methods of using the same
US20230295146A1 (en) 2020-07-24 2023-09-21 The University Of Rochester Inhibitors of interleukin-1 receptor-associated kinases 1 and 4
CN112062855B (zh) * 2020-08-26 2024-08-30 北京天诺健成医药科技有限公司 一种含有衔接器的药物治疗剂的开发和应用
WO2022043415A1 (en) 2020-08-27 2022-03-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for detecting the presence of pemphigus-specific autoantibodies in a sample
KR20230066392A (ko) 2020-09-10 2023-05-15 젠맵 에이/에스 미만성 대 b-세포 림프종을 치료하기 위한 조합 요법에서의 cd3 및 cd20에 대한 이중특이적 항체
AU2021339954A1 (en) 2020-09-10 2023-04-13 Genmab A/S Bispecific antibody against CD3 and CD20 in combination therapy for treating follicular lymphoma
EP4210747A1 (en) 2020-09-10 2023-07-19 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
AU2021342342A1 (en) 2020-09-10 2023-04-13 Genmab A/S Bispecific antibodies against CD3 and CD20 for treating chronic lymphocytic leukemia
EP4210743A1 (en) 2020-09-10 2023-07-19 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating follicular lymphoma
CN116782933A (zh) 2020-09-10 2023-09-19 健玛保 用于治疗弥漫性大b细胞淋巴瘤的联合疗法中的针对cd3和cd20的双特异性抗体
KR20230107281A (ko) 2020-11-11 2023-07-14 비온테크 에스이 프로그램된 사멸-1 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 의약에서의 용도
WO2022130206A1 (en) 2020-12-16 2022-06-23 Pfizer Inc. TGFβr1 INHIBITOR COMBINATION THERAPIES
WO2022135666A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Treatment schedule for cytokine proteins
TW202245808A (zh) 2020-12-21 2022-12-01 德商拜恩迪克公司 用於治療癌症之治療性ｒｎａ
WO2022135667A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Therapeutic rna for treating cancer
WO2022148732A1 (en) 2021-01-06 2022-07-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy employing a pd1-lag3 bispecific antibody and a cd20 t cell bispecific antibody
CA3213599A1 (en) 2021-03-15 2022-09-22 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating lupus nephritis
AU2022241765A1 (en) 2021-03-24 2023-11-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bicistronic chimeric antigen receptors designed to reduce retroviral recombination and uses thereof
TW202304506A (zh) 2021-03-25 2023-02-01 日商安斯泰來製藥公司 涉及抗claudin 18.2抗體的組合治療以治療癌症
JP2024511189A (ja) 2021-03-26 2024-03-12 ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア がんの処置における抗ｃａ１９－９抗体およびｆｏｌｆｉｒｉｎｏｘを用いた組合せ療法。
CN117279664A (zh) 2021-04-10 2023-12-22 普方生物制药美国公司 Folr1结合剂、其偶联物及其使用方法
KR20230170923A (ko) 2021-04-14 2023-12-19 노파르티스 아게 아시아인 환자들에서 ms 치료용 오파투무맙
US20250066490A1 (en) 2021-04-23 2025-02-27 Profoundbio Us Co. Anti-cd70 antibodies, conjugates thereof and methods of using the same
US20240207304A1 (en) 2021-04-28 2024-06-27 Mina Therapeutics Limited Combination Therapies Comprising C/EBP Alpha saRNA
CN117321078A (zh) 2021-04-30 2023-12-29 豪夫迈·罗氏有限公司 针对用抗cd20/抗cd3双特异性抗体和抗cd79b抗体药物缀合物进行组合治疗的给药
EP4329800A1 (en) 2021-04-30 2024-03-06 F. Hoffmann-La Roche AG Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody
BR112023022133A2 (pt) 2021-05-07 2023-12-26 Viela Bio Inc Uso de um anticorpo anti-cd19 para tratar miastenia gravis
TW202310876A (zh) 2021-05-12 2023-03-16 美商建南德克公司 使用抗ｃｄ７９ｂ免疫結合物治療瀰漫性大ｂ細胞淋巴瘤之方法
WO2022251359A1 (en) 2021-05-26 2022-12-01 Theravance Biopharma R&D Ip, Llc Bicyclic inhibitors of alk5 and methods of use
EP4347647A1 (en) 2021-06-01 2024-04-10 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Use of b cell depleting agents for the treatment of rheumatic heart disease
EP4351595A1 (en) 2021-06-07 2024-04-17 Providence Health & Services - Oregon Cxcr5, pd-1, and icos expressing tumor reactive cd4 t cells and their use
WO2022262959A1 (en) 2021-06-15 2022-12-22 Astellas Pharma Europe Bv Bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3
CA3220318A1 (en) 2021-06-17 2022-12-22 Glaxosmithkline Intellectual Property Limited Anti-baff antibodies for use in a method of treatment of long covid and/or post-acute sequelae sars-cov-2 infection (pasc)
WO2023280790A1 (en) 2021-07-05 2023-01-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Gene signatures for predicting survival time in patients suffering from renal cell carcinoma
MX2024000674A (es) 2021-07-13 2024-02-07 BioNTech SE Agentes de union multiespecificos contra cd40 y cd137 en terapia de combinacion.
US20240336697A1 (en) 2021-08-07 2024-10-10 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma
US20240343821A1 (en) 2021-08-16 2024-10-17 Novartis Ag Ofatumumab for treating pediatric ms
TW202333802A (zh) 2021-10-11 2023-09-01 德商拜恩迪克公司 用於肺癌之治療性rna(二)
US20250090680A1 (en) 2021-11-19 2025-03-20 Ardeagen Corporation Gpc3 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
JP2025503177A (ja) 2022-01-28 2025-01-30 ジェンマブ エー／エス びまん性大細胞型ｂ細胞リンパ腫を治療するための併用療法におけるｃｄ３及びｃｄ２０に対する二重特異性抗体
MX2024008833A (es) 2022-01-28 2024-07-25 Genmab As Anticuerpo biespecifico contra cumulo de diferenciacion 3 (cd3) y cumulo de diferenciacion 20 (cd20) en terapia combinada para tratar linfoma difuso de celulas b grandes.
MX2024011468A (es) 2022-03-23 2024-09-25 Hoffmann La Roche Tratamiento conjunto de un anticuerpo biespecifico anti-cd20/anti-cd3 y quimioterapia.
WO2023198839A2 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
TW202404637A (zh) 2022-04-13 2024-02-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３雙特異性抗體之醫藥組成物及使用方法
EP4507704A1 (en) 2022-04-15 2025-02-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Til expansion processes using specific cytokine combinations and/or akti treatment
EP4522654A1 (en) 2022-05-12 2025-03-19 BioNTech SE Monoclonal antibodies directed against programmed death-1 protein and their use in medicine
CN116162153B (zh) * 2022-09-01 2024-09-10 复旦大学附属中山医院 一种乙肝病毒表面抗原的单克隆抗体及其应用
WO2024052356A1 (en) 2022-09-06 2024-03-14 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Inhibitors of the ceramide metabolic pathway for overcoming immunotherapy resistance in cancer
US20240174761A1 (en) 2022-11-02 2024-05-30 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20 for treating richter's syndrome
WO2024094741A1 (en) 2022-11-03 2024-05-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with anti-cd19/anti-cd28 bispecific antibody
WO2024102734A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating childhood onset idiopathic nephrotic syndrome
WO2024112571A2 (en) 2022-11-21 2024-05-30 Iovance Biotherapeutics, Inc. Two-dimensional processes for the expansion of tumor infiltrating lymphocytes and therapies therefrom
WO2024126457A1 (en) 2022-12-14 2024-06-20 Astellas Pharma Europe Bv Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and immune checkpoint inhibitors
WO2024153636A1 (en) 2023-01-17 2024-07-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Vasorin as a biomarker and biotarget in nephrology
WO2024173607A2 (en) 2023-02-14 2024-08-22 Evolveimmune Therapeutics, Inc. Combination of bispecific antibodies and chimeric antigen receptor t cells for treatment
WO2024182516A1 (en) 2023-02-28 2024-09-06 Juno Therapeutics, Inc. Cell therapy for treating systemic autoimmune diseases
WO2024213754A1 (en) 2023-04-13 2024-10-17 Genmab A/S Methods of treating lymphoma with bispecific antibodies against cd3 and cd20
WO2024213767A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Engraftment of mesenchymal stromal cells engineered to stimulate immune infiltration in tumors
WO2024261302A1 (en) 2023-06-22 2024-12-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Nlrp3 inhibitors, pak1/2 inhibitors and/or caspase 1 inhibitors for use in the treatment of rac2 monogenic disorders
WO2025003193A1 (en) 2023-06-26 2025-01-02 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Sertraline and indatraline for disrupting intracellular cholesterol trafficking and subsequently inducing lysosomal damage and anti-tumor immunity
WO2025012417A1 (en) 2023-07-13 2025-01-16 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Anti-neurotensin long fragment and anti-neuromedin n long fragment antibodies and uses thereof
WO2025021782A1 (en) 2023-07-24 2025-01-30 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods of determining whether a subject suffering from lupus nephritis (ln) will achieve a response with an induction therapy
WO2025045894A1 (en) 2023-08-28 2025-03-06 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and kits for diagnosing cause of nephrotic syndrome and guiding therapy
WO2025052098A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 Mina Therapeutics Limited Tmem173 sarna compositions and methods of use

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002012437A2 (en) * 2000-08-03 2002-02-14 Schooten Wim Van Production of humanized antibodies in transgenic animals
US20020064823A1 (en) * 2000-03-30 2002-05-30 Welcher Andrew A. CD20/IgE-receptor like molecules and uses thereof

Family Cites Families (108)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5247069A (en) 1986-06-13 1993-09-21 Oncogen Ligands and methods for augmenting B-cell proliferation
US5182368A (en) 1986-06-13 1993-01-26 Ledbetter Jeffrey A Ligands and methods for augmenting B-cell proliferation
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
IL85035A0 (en) * 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
AU612370B2 (en) 1987-05-21 1991-07-11 Micromet Ag Targeted multifunctional proteins
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5506126A (en) 1988-02-25 1996-04-09 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
US6218525B1 (en) 1988-02-25 2001-04-17 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding CD28
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP0814159B1 (en) 1990-08-29 2005-07-27 GenPharm International, Inc. Transgenic mice capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992022645A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
EP0593592B1 (en) 1991-07-08 1998-03-25 The University Of Massachusetts At Amherst Thermotropic liquid crystal segmented block copolymer
US6136310A (en) 1991-07-25 2000-10-24 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant anti-CD4 antibodies for human therapy
US5756096A (en) 1991-07-25 1998-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant antibodies for human therapy
NZ243706A (en) 1991-07-25 1994-08-26 Idec Pharma Corp Recombinant monkey antibodies, pharmaceutical compositions
IE922437A1 (en) 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5540926A (en) 1992-09-04 1996-07-30 Bristol-Myers Squibb Company Soluble and its use in B cell stimulation
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
PT752248E (pt) * 1992-11-13 2001-01-31 Idec Pharma Corp Aplicacao terapeutica de anticorpos quimericos e marcados radioactivamente contra antigenios de diferenciacao restrita de linfocitos b humanos para o tratamento do linfoma de celulas b
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
US6096878A (en) 1993-05-10 2000-08-01 Japan Tobacco Inc. Human immunoglobulin VH gene segments and DNA fragments containing the same
US5595721A (en) 1993-09-16 1997-01-21 Coulter Pharmaceutical, Inc. Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
CA2761116A1 (en) 1995-04-27 1996-10-31 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US20010056066A1 (en) 1996-07-26 2001-12-27 Smithkline Beecham Corporation Method of treating immune cell mediated systemic diseases
EP0938334A4 (en) 1996-07-26 2004-12-15 Smithkline Beecham Corp IMPROVED METHOD FOR TREATING IMMUNE-MEDIATED SYSTEMIC DISEASES
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6183744B1 (en) 1997-03-24 2001-02-06 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
EP1015616A2 (en) 1997-09-19 2000-07-05 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Intrabody-mediated control of immune reactions
DE69839529D1 (de) 1997-12-24 2008-07-03 Ludwig Inst Cancer Res Expressionsvektoren und zellinien zur expression von vaskulärem wachstumsfaktor d, sowie verfahren zur behandlung von melanomen
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
WO2000003733A1 (en) 1998-07-16 2000-01-27 Vincent Marinkovich Methods and compositions for cancer treatment
EP1112084B2 (en) 1998-08-11 2012-04-25 Biogen Idec Inc. Combination therapies for b-cell lymphomas comprising administration of anti-cd20 antibody
US6224866B1 (en) 1998-10-07 2001-05-01 Biocrystal Ltd. Immunotherapy of B cell involvement in progression of solid, nonlymphoid tumors
US20010033839A1 (en) 1999-10-04 2001-10-25 Emilio Barbera-Guillem Vaccine and immunotherapy for solid nonlymphoid tumor and related immune dysregulation
EP1131093A4 (en) * 1998-11-09 2002-05-02 Idec Pharma Corp TREATMENT OF HEMATOLOGICAL VILTIES ASSOCIATED WITH CIRCULATING TUMOR CELLS USING CHIMERIC ANTI-CD20 ANTIBODIES
BR9915149A (pt) 1998-11-09 2001-08-07 Idec Pharma Corp Tratamento com anticorpo anti-cd20 quimérico de pacientes recebendo transplantes de bmt ou de pbsc
CA2944644C (en) * 1999-05-07 2017-08-22 Genentech, Inc. Use of rituximab to treat pemphigus
AU782160B2 (en) 1999-06-09 2005-07-07 Immunomedics Inc. Immunotherapy of autoimmune disorders using antibodies which target B-cells
CA2379274A1 (en) 1999-07-12 2001-01-18 Genentech, Inc. Blocking immune response to a foreign antigen using an antagonist which binds to cd20
CA2380813A1 (en) 1999-07-29 2001-02-08 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to her2/neu
US8557244B1 (en) 1999-08-11 2013-10-15 Biogen Idec Inc. Treatment of aggressive non-Hodgkins lymphoma with anti-CD20 antibody
CN101259270A (zh) 1999-08-11 2008-09-10 拜奥根Idec公司 用抗cd20抗体治疗累及骨髓的非霍奇金淋巴瘤患者
CA2589418A1 (en) 1999-08-24 2001-03-01 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
US20020028178A1 (en) 2000-07-12 2002-03-07 Nabil Hanna Treatment of B cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
MXPA02004599A (es) 1999-11-08 2002-10-23 Idec Pharma Corp Tratamiento de tumores malignos de celula b utilizando anticuerpos anti-cd40l en combinacion con anticuerpos anti-cd20 y/o agentes quimioterapeuticos y radioterapia.
US20020006404A1 (en) 1999-11-08 2002-01-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Treatment of cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
ATE373719T1 (de) 2000-02-03 2007-10-15 Millennium Pharm Inc Humanisierte antikörper gegen ccr2 und verfahren zur deren verwendung
EP1125905A1 (en) 2000-02-16 2001-08-22 Pepscan Systems B.V. Segment synthesis
EP1267927A1 (en) 2000-03-24 2003-01-02 Chiron Corporation Methods of therapy for non-hodgkin's lymphoma using a combination of an antibody to cd20 and interleukin-2
CA2404365A1 (en) 2000-03-31 2001-10-11 Idec Pharmaceutical Corporation Combined use of anti-cytokine antibodies or antagonists and anti-cd20 for the treatment of b cell lymphoma
WO2001080884A1 (en) 2000-04-25 2001-11-01 Idec Pharmaceuticals Corporation Intrathecal administration of rituximab for treatment of central nervous system lymphomas
JP2004512262A (ja) 2000-06-20 2004-04-22 アイデック　ファーマスーティカルズ　コーポレイション 非放射性抗ｃｄ２０抗体／放射標識抗ｃｄ２２抗体の組合せ
JP2003535907A (ja) 2000-06-22 2003-12-02 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション 抗体誘導性細胞溶解を促進し、そして癌を処置するための方法
CN1446104A (zh) 2000-07-12 2003-10-01 Idec药物公司 利用b细胞排除抗体和免疫调制抗体联合治疗b细胞恶性肿瘤的相关应用
US20020048550A1 (en) 2000-07-20 2002-04-25 Vallera Daniel A. Radiolabeled immunotoxins
KR20040023565A (ko) 2000-09-18 2004-03-18 아이덱 파마슈티칼즈 코포레이션 Ｂ 세포 고갈/면역조절 항체 조합을 이용한 자가면역질환의 치료를 위한 조합 요법
AU2002213357A1 (en) 2000-10-20 2002-05-06 Idec Pharmaceuticals Corporation Variant igg3 rituxan r and therapeutic use thereof
PT1354034E (pt) 2000-11-30 2008-02-28 Medarex Inc Roedores transgénicos transcromossómicos para produção de anticorpos humanos
WO2002062946A2 (en) 2000-12-08 2002-08-15 Duke University Identification of novel ms4a gene family members expressed by hematopoietic cells
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CA2436180C (en) 2001-01-31 2011-11-08 Idec Pharmaceutical Corporation Immunoregulatory antibodies and uses thereof
IL157145A0 (en) 2001-01-31 2004-02-08 Idec Pharma Corp Use of dc23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders
US20020159996A1 (en) 2001-01-31 2002-10-31 Kandasamy Hariharan Use of CD23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders
WO2002079255A1 (en) 2001-04-02 2002-10-10 Idec Pharmaceuticals Corporation RECOMBINANT ANTIBODIES COEXPRESSED WITH GnTIII
EP1558648B1 (en) 2002-10-17 2012-01-11 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd20
EP2231183A2 (en) 2007-12-21 2010-09-29 Genentech, Inc. Therapy of rituximab-refractory rheumatoid arthritis patients

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020064823A1 (en) * 2000-03-30 2002-05-30 Welcher Andrew A. CD20/IgE-receptor like molecules and uses thereof
WO2002012437A2 (en) * 2000-08-03 2002-02-14 Schooten Wim Van Production of humanized antibodies in transgenic animals

Also Published As

Publication number Publication date
KR20110140142A (ko) 2011-12-30
CY2012019I1 (el) 2015-08-05
EP2330130A1 (en) 2011-06-08
HK1077590A1 (en) 2006-02-17
KR20100050587A (ko) 2010-05-13
US20140093454A1 (en) 2014-04-03
EP3284753B1 (en) 2019-06-05
CN1729203B (zh) 2014-02-19
BRPI0315295C1 (pt) 2021-05-25
PL218660B1 (pl) 2015-01-30
AU2003301445A1 (en) 2004-05-04
US20040167319A1 (en) 2004-08-26
CN101928344B (zh) 2014-08-13
EP1558648A4 (en) 2006-02-15
IL221193A0 (en) 2012-09-24
EP3284753A2 (en) 2018-02-21
JP2010042002A (ja) 2010-02-25
EA200500679A1 (ru) 2006-02-24
ES2524694T3 (es) 2014-12-11
PL376351A1 (en) 2005-12-27
BR0315295A (pt) 2005-08-30
FR21C1028I1 (fr) 2021-08-27
CN103709250A (zh) 2014-04-09
KR100944575B1 (ko) 2010-02-25
EP2316856B1 (en) 2017-08-09
EA201492217A1 (ru) 2015-06-30
NZ581541A (en) 2011-07-29
KR20120128151A (ko) 2012-11-26
BRPI0315295B1 (pt) 2018-12-26
KR20110017020A (ko) 2011-02-18
PL402418A1 (pl) 2013-05-27
EP3284753A3 (en) 2018-03-14
JP5155968B2 (ja) 2013-03-06
ES2380621T3 (es) 2012-05-16
HUS2100026I1 (hu) 2021-07-28
CA3029035C (en) 2023-03-07
KR101348472B1 (ko) 2014-01-07
JP5767041B2 (ja) 2015-08-19
EP2330130B1 (en) 2014-08-27
PT3284753T (pt) 2020-05-04
WO2004035607A2 (en) 2004-04-29
US20200317799A1 (en) 2020-10-08
ES2744275T3 (es) 2020-02-24
IL167851A0 (en) 2009-02-11
JP2012005485A (ja) 2012-01-12
DK3284753T3 (da) 2021-07-05
CA3029035A1 (en) 2004-04-29
KR20080090565A (ko) 2008-10-08
CN103709250B (zh) 2016-08-10
SI1558648T1 (sl) 2012-05-31
IL167851A (en) 2013-12-31
KR20050049552A (ko) 2005-05-25
JP4662473B2 (ja) 2011-03-30
JP2006507844A (ja) 2006-03-09
DK1558648T3 (da) 2012-04-23
US8529902B2 (en) 2013-09-10
BRPI0315295B8 (pt) 2019-08-20
CA2502552A1 (en) 2004-04-29
CN101928344A (zh) 2010-12-29
NZ568769A (en) 2010-04-30
CA2502552C (en) 2019-02-12
ATE540978T1 (de) 2012-01-15
LTC3284753I2 (ru) 2022-09-12
EP2316856A1 (en) 2011-05-04
LTPA2021514I1 (ru) 2021-07-26
MXPA05004022A (es) 2005-10-05
KR100932340B1 (ko) 2009-12-16
EP1558648B1 (en) 2012-01-11
PL216630B1 (pl) 2014-04-30
WO2004035607A8 (en) 2004-06-17
LU92041I9 (ru) 2019-01-03
CN1729203A (zh) 2006-02-01
CY1112750T1 (el) 2015-08-05
PT1558648E (pt) 2012-04-23
EP1558648A2 (en) 2005-08-03
CY2012019I2 (el) 2015-08-05
WO2004035607A3 (en) 2004-08-12
LT3284753T (lt) 2020-06-10
HUE046695T2 (hu) 2020-03-30
LU92041I2 (fr) 2014-01-11
KR20090088973A (ko) 2009-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA021644B1 (ru) Человеческое моноклональное антитело против cd20 и его применение
EA013677B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против cd25 и их применение
AU2011202520B2 (en) Human monoclonal antibodies against CD20
AU2019204903B2 (en) Human monoclonal antibodies against CD20
EA043675B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против cd20

Legal Events

Date Code Title Description
ND4A Extension of term of a eurasian patent
ND4A Extension of term of a eurasian patent