EA012407B1 - Гуманизированный иммуноглобулин, который специфически связывается с бета-амилоидным пептидом, и способы его применения - Google Patents

Abstract

Изобретение охватывает улучшенный гуманизированный иммуноглобулин, специфически связывающийся с бета-амилоидным пептидом (Аβ), или его антигенсвязывающий фрагмент и способы лечения заболеваний, ассоциированных с амилоидными отложениями Aβ в мозгу пациента.

Description

Предпосылки создания изобретения

Болезнь Альцгеймера (АО) является прогрессирующим заболеванием, приводящим к старческому слабоумию (сенильной деменции). См. в общем 8с1кос. ΤΙΝ8, 16:403 (1993); Нагбу е! а1., Международная заявка АО 92/13069; 8е1кое, 1. №игора11ю1. Ехр. №иго1. 53:438 (1994); БиГГ е! а1., №ш.1гс 373:476 (1995); батек е! а1., №1Ц1ге 373:523 (1995). Вообще говоря, заболевание делится на две категории: позднее заболевание, которое возникает в старости (в 65 лет и старше), и раннее заболевание, которое развивается ранее старческого возраста, т.е. в 35-60 лет. В обоих типах заболевания патология одинакова, но в случаях, начинающихся в более раннем возрасте, наблюдается тенденция к более тяжёлым и обширным нарушениям. Заболевание характеризуется по меньшей мере двумя типами патологических изменений в мозгу: нейрофибриллярные узлы и сенильные бляшки. Нейрофибриллярные узлы представляют собой внутриклеточные отложения связанного с микротрубочками тау-белка, состоящего из двух попарно скрученных нитей. Сенильные бляшки (т.е. амилоидные бляшки) представляют собой участки беспорядочного сплетения нервных клеток (нейропиль) до 150 мкм в ширину с внеклеточными амилоидными отложениями в центре, которые видны при изучении под микроскопом срезов тканей мозга. Аккумуляция амилоидных бляшек в мозге также связана с синдромом Дауна и другими когнитивными нарушениями.

Основным составляющим бляшек является пептид, называемый Αβ, или β-амилоидный пептид. Αβ пептид представляет собой внутренний фрагмент из 39-43 аминокислот размером 4 кДа, более протяжённого трансмембранного гликопротеина, называемого амилоидным белком-предшественником (АБП, АРР). Образующийся в результате протеолитического процессирования АРР под действием различных секретаз Αβ первоначально обнаружен как в короткой форме протяжённостью 40 аминокислот, так и в длинной форме протяжённостью 42-43 аминокислоты. Участок гидрофобного трансмембранного домена АРР обнаружен на карбоксиконце Αβ, и он может быть ответственен за способность Αβ к агрегации в бляшки, в особенности в случае длинной формы. Симптомы аккумуляции, обусловленные этим типом нервного истощения, характеризуют болезнь Альцгеймера.

Несколько мутаций в белке АРР коррелировали с болезнью Альцгеймера. См., например, боа!е е! а1., №!иге, 349:704 (1991) (уа1ше⁷¹⁷ в изолейцин); Сйагйег Наг1ап е! а1. №!иге, 353:844 (1991) (валин⁷¹⁷ в глицин); Мигге11 е! а1., 8с1епсе 254:97 (1991) (валин⁷¹⁷ в фенилаланин); Ми11ап е! а1., №1Ц.1ге бепе!. 1:345 (1992) (двойная мутация с заменой лизина⁵⁹⁵-метионина⁵⁹⁶ на аспарагин⁵⁹⁵-лейцин⁵⁹⁶). Полагают, что такие мутации вызывают болезнь Альцгеймера под действием повышенного или изменённого процессирования АРР в Αβ, в частности процессирование АРР в повышенные количества длинной формы Αβ (т.е. Αβ1-42 и Αβ1-43). Полагают, что мутации в других генах, таких как гены пресенилина, Р81 и Р82, опосредованно влияют на процессирование АРР с образованием длинной формы Αβ (см. Нагбу, ΤΙΝ8, 20:154 (1997)).

Для установления роли амилоидных бляшек в болезни Альцгеймера с успехом применялись мышиные модели (батек е! а1., см. выше, 1ойпкоп-Аооб е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8с1. И8А, 94:1550(1997)). В частности, когда трансгенным мышам РБАРР (которые экспрессируют мутантную форму человеческого АРР и у которых в раннем возрасте развивается болезнь Альцгеймера) инъецируют длинную форму Αβ, у них наблюдают как ускорение прогрессирования болезни Альцгеймера, так и повышение титров антител к Αβ пептиду (8сйеик е! а1., №!иге, 400, 173 (1999)). Обсуждавшиеся выше наблюдения показывают, что Αβ, в особенности в длинной форме, является одной из причин (причинным элементом) болезни Альцгеймера.

Следовательно, существует необходимость в новых лекарственных веществах и реагентах для лечения болезни Альцгеймера, в частности в лекарственных веществах и реагентах, способных вызывать терапевтический эффект в физиологических (например, нетоксических) дозах.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение включает новые иммунологические реагенты, в частности терапевтические антитела, для предупреждения и лечения амилоидогенного заболевания (например, болезни Альцгеймера). Данное изобретение основано, по меньшей мере частично, на идентификации и определении характеристик моноклонального антитела, 12А11, которое специфически связывается с Αβ пептидом и эффективно снижает количество бляшек (нагрузку), ассоциированных с амилоидогенным заболеванием. Структурный и функциональный анализ этого антитела приводит к дизайну различных гуманизированных антител для профилактического и/или терапевтического применения. В частности, данное изобретение включает гуманизацию вариабельных участков этого антитела и, следовательно, охватывает цепи гуманизированного иммуноглобулина или антитела, интактные гуманизированные иммуноглобулины или антитела и функциональные фрагменты иммуноглобулина или антитела, в частности антигенсвязывающие фрагменты антитела по изобретению.

Также охватываются полипептиды, содержащие гипервариабельные участки (СБК.) моноклонального антитела по изобретению, а также полинуклеотидные реагенты, векторы и клетки-хозяева, пригодные для кодирования указанных полипептидов.

Раскрываются способы лечения амилоидогенных заболеваний или нарушений (например, болезни Альцгеймера), так же как и фармацевтические композиции и наборы для таких применений.

-1 012407

Также охватываются способы идентификации остатков в моноклональных антителах, которые важны для соответствующей иммунологической функции и для идентификации остатков, подлежащих замене при дизайне гуманизированных антител с повышенной аффинностью и/или пониженной иммуногенностью, для использования в качестве терапевтических реагентов.

Также охватываются антитела (например, гуманизированные антитела), имеющие изменённые эффекторные функции, и их терапевтическое применение.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 графически изображены результаты эксперимента, в котором изучается эффективность различных антител, включая 12А11, при очищении от Αβ бляшек при анализе на фагоцитоз ίη и ех νίνο.

На фиг. 2А графически показаны результаты эксперимента, в котором изучается эффективность различных антител, включая 12А11, при снижении уровней тотального Ав. Столбцы представляют собой средние (медианные) значения, а пунктирная горизонтальная линия показывает контрольный уровень.

На фиг. 2В графически показаны результаты эксперимента, в котором изучается эффективность различных антител, включая 12А11, при снижении дистрофии (дегенерации) нейритов. Столбцы изображают средние (медианные) значения, а пунктирная горизонтальная линия показывает контрольный уровень. Показаны данные для отдельных животных, выраженные в процентах нейритной дистрофии относительно среднего контрольного значения (принятого за 100%).

На фиг. ЗА показана последовательность ДНК, включая мышиную последовательность 12А11 УЪ цепи, и предсказанная (расшифрованная) аминокислотная последовательность УЪ цепи (8Е0 ΙΌ N0:5 и соответственно). Зрелая УЪ цепь показана жирной сплошной линией. СБЯ показан очерченными нежирной линией прямоугольниками.

На фиг. ЗВ показана последовательность ДНК, включая мышиную последовательность 12А11 УН цепи, и предсказанная (расшифрованная) аминокислотная последовательность УН цепи (8Е0 ΙΌ N0:6 и соответственно). Зрелая УН цепь показана жирной сплошной линией. СБЯ показан очерченными нежирной линией прямоугольниками. Последовательности ДНК включают сайты клонирования и последовательности Козака (против хода транскрипции (3'-5') от кодирующей последовательности) и сайты сплайсинга и клонирования (по ходу транскрипции (5'-3').

На фиг. 4 графически показаны результаты ΕΕΙ8Α, полученные в эксперименте, в котором определяют связывание химерного 12А11, химерного и гуманизированного 3Ό6 и химерного и гуманизированного 12В4 с Αβ1-42.

На фиг. 5А показано выравнивание аминокислотных последовательностей лёгкой цепи мышиного (или химерного) 12А11 (8Е0 ΙΌ N0:2), гуманизированного 12А11 (зрелый пептид, 8Е0 ΙΌ N0:7), депонированного в СепВапк под номером ВАС01733 (8Е0 ΙΌ N0:8), антител и антитела зародышевой линии А19 (Х63397, 8Е0 ΙΌ N0:9). СБВ области обведены рамкой. Остатки упаковки подчёркнуты. Нумерация от первого метионинового остатка, номенклатура не по КаЬа1.

На фиг. 5В показано выравнивание аминокислотных последовательностей тяжёлой цепи мышиного (или химерного) 12А11 (8Е0 ΙΌ N0:4), гуманизированного 12аА11 (версия 1) (зрелый пептид, 8Е0 ΙΌ N0:10), депонированного в СепВапк под номером ААА69734 (8Е0 ΙΌ N0:11) антител и депонированного в СепВапк под номером 567123 (8Е0 ΙΌ N0:12) антитела зародышевой линии. Остатки упаковки подчёркнуты, канонические остатки закрашены сплошным, а остатки зоны Вернье выделены пунктиром. Нумерация от первого метионинового остатка, номенклатура не по КаЬа1.

На фиг. 6А, В показано выравнивание аминокислотных последовательностей тяжёлых цепей гуманизированного 12А11 ν1 (8ЕО ΙΌ N0:10), ν2 (8ЕО ΙΌ N0:13), ν2.1 (8ЕО ΙΌ N0:14), ν3 (8ЕО ΙΌ N0:15), ν4.1 (8ЕО ΙΌ N0:16), ν4.2 (8ЕО ΙΌ, N0:17), ν4.3 (8ЕО ΙΌ N0:18),ν4.4 ν5.1 (8ЕО ΙΌ N0:20), ν5.2 (8ЕО ΙΌ N0:21), ν5.3 (8ЕО ΙΌ N0:22),ν5.4 ν5.5 (8ЕО ΙΌ N0:24), ν5.6 (8ЕО ΙΌ N0:25), ν6.1 (8ЕО ΙΌ N0:26),ν6.2 ν6.3 (8ЕО ΙΌ N0:28), ν6.4 (8ЕО ΙΌ N0:29), ν7 (8ЕО ΙΌ N0:30) и ν8 (8ЕО ΙΌ N0:31).

На фиг. 6С представлены обратные мутации, осуществлённые в гуманизированных 12А11 ν1-ν8 антител.

(8ЕО ΙΌ N0:19), (8ЕО ΙΌ N0:23), (8ЕО ΙΌ N0:27),

На фиг. 7 показаны результаты анализа ЕЫ8А агрегированного Αβ (1-42), сравниваются химерное 12А11, гуманизированное 12А11 ν1, гуманизированное 12А11 ν2, гуманизированное 12А11 ν2.1 и гуманизированное 12А11 ν3 антитела.

На фиг. 8 показаны результаты конкурентного анализа ЕЕ-ΙδΑ конкурентного связывания Αβ1-42, сравниваются мышиное 12А11, химерное 12А11 и Й12А11 ν1 антитела.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение охватывает новые иммунологические реагенты и способы предупреждения и лечения болезни Альцгеймера или других амилоидогенных заболеваний. Изобретение базируется, по меньшей мере частично, на свойствах моноклонального иммуноглобулина, 12А11, эффективно связывающего бета-амилоидный белок (Λβ) (например, связывающего растворимый и/или агрегированный Аβ), опосредующего фагоцитоз (например, агрегированного Аβ), снижающего количество (предрасположенность к образованию) бляшек и/или уменьшающего дистрофию (дегенерацию) нейритов (напри мер, у пациента). Кроме того, изобретение основано на определении структурных характеристик первичной и вторичной структуры вариабельной области лёгкой и тяжёлой цепей 12А11 иммуноглобулина и идентификации остатков, важных для активности и иммуногенности.

Охватываются иммуноглобулины, которые включают вариабельную область лёгкой цепи и/или вариабельную область тяжёлой цепи моноклонального иммуноглобулина 12А11 по данному описанию. Охватываются предпочтительные иммуноглобулины, например терапевтические иммуноглобулины, которые включают вариабельную область гуманизированной лёгкой и/или вариабельную область гуманизированной тяжёлой цепи. Предпочтительные вариабельная область лёгкой и/или вариабельная область тяжёлой цепи включают гипервариабельный участок (ΟΌΚ.) 12А11 иммуноглобулина (например, донорного иммуноглобулина) и вариабельные каркасные участки из человеческого акцепторного иммуноглобулина или в основном (практически) человеческого акцепторного иммуноглобулина. Выражение в основном (практически) из человеческого акцепторного иммуноглобулина означает, что основная часть или главные каркасные остатки взяты из человеческой акцепторной последовательности, однако при этом допускается замена остатков в некоторых положениях на остатки, выбранные для повышения активности гуманизированного иммуноглобулина (например, для изменения активности таким образом, чтобы она более похоже имитировала активность донорного иммуноглобулина) или выбранные для снижения иммуногенности гуманизированного иммуноглобулина.

В одном варианте изобретение охватывает лёгкую или тяжёлую цепь гуманизированного иммуноглоблина, которая включает гипервариабельные участки (ΟΌΚ.) вариабельной области (т.е. включает один, два или три ΟΌΚ. участка последовательности вариабельной области лёгкой цепи, представленной 8ЕО ΙΌ N0:2, или включает один, два или три ΟΌΚ. участка последовательности вариабельной области тяжёлой цепи, представленной 8Е0 ΙΌ N0:4) и включает вариабельную каркасную область последовательности лёгкой или тяжёлой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина, необязательно содержащую по меньшей мере один каркасный остаток, обратно мутировавший в соответствующий мышиный остаток, при этом указанная обратная мутация практически не влияет на способность цепи направлять Αβ-связывание.

В одном варианте изобретение охватывает лёгкую или тяжёлую цепь гуманизированного иммуноглобулина, которая включает гипервариабельные участки (ΟΌΚ.) вариабельной области 12А11 (т.е. включает один, два или три ΟΌΚ. участка последовательности вариабельной области лёгкой цепи, представленной 8Е0 ΙΌ N0:2, или включает один, два или три ΟΌΚ. участка последовательности вариабельной области тяжёлой цепи, представленной 8Е0 ΙΌ N0:4) и включает вариабельную каркасную область последовательности лёгкой или тяжёлой цепи в основном (практически) человеческого акцепторного иммуноглобулина, необязательно содержащую по меньшей мере один каркасный остаток, обратно мутировавший в соответствующий мышиный остаток, при этом указанная обратная мутация практически не влияет на способность цепи направлять Αβ-связывание.

В другом варианте данное изобретение охватывает лёгкую или тяжёлую цепь гуманизированного иммуноглобулина, которая включает гипервариабельные участки (ΟΌΚ.) вариабельной области 12А11 (например, включает один, два или три ΟΌΚ. участка последовательности вариабельной области лёгкой цепи, представленной 8Е0 ΙΌ N0:2, и/или включает один, два или три ΟΌΚ. участка последовательности вариабельной области тяжёлой цепи, представленной 8Е0 ΙΌ N0:4) и включает вариабельную каркасную область последовательности лёгкой или тяжёлой цепи в основном (практически) человеческого акцепторного иммуноглобулина, необязательно содержащую по меньшей мере один каркасный остаток, замещённый соответствующим аминокислотным остатком из последовательности вариабельной области лёгкой или тяжёлой цепи мышиного 12А11, где каркасный остаток выбирают из группы, состоящей из (а) остатка, который нековалентной связью непосредственно связывается с антигеном; (б) остатка, прилегающего к ΟΌΚ.; (в) остатка, взаимодействующего с ΟΌΚ. (например, идентифицированного моделированием лёгкой или тяжёлой цепи на разрешённой структуре гомологичной известной цепи иммуноглобулина); и (д) остатка, принимающего участие в интерфейсе (граничная поверхность) УЬ-УН.

В другом варианте изобретение охватывает лёгкую или тяжёлую цепь гуманизированного иммуноглобулина, которая включает участки ΟΌΚ. вариабельной области и вариабельные каркасные участки последовательности лёгкой или тяжёлой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина, необязательно содержащие по меньшей мере один каркасный (остовной) остаток, замещённый на соответствующий аминокислотный остаток из последовательности вариабельной области лёгкой или тяжёлой цепи мышиного 12А11, где каркасный остаток способен влиять на конформацию или функцию вариабельной области лёгкой цепи, как определено анализом трёхмерной модели вариабельной области, например остаток, способный взаимодействовать с антигеном, остаток, проксимальный к сайту связывания антигена, остаток, способный взаимодействовать с ΟΌΚ, остаток, прилегающий к ΟΌΚ, остаток, находящийся в пределах 6 А от остатка ΟΌΚ, канонический остаток, остаток в зоне Вернье, остаток межцепной упаковки, необычный остаток или остаток сайта гликозилирования на поверхности структурной модели.

В другом варианте данное изобретение охватывает, помимо описанных выше замен, замену по меньшей мере одного редкого (нетривиального) человеческого каркасного остатка. Например, редкий остаток можно заменять аминокислотным остатком, обычным для человеческих последовательностей вариабельной области в этом положении. Или же редкий остаток можно заменять на соответствующий аминокислотный остаток гомологичной последовательности вариабельной области зародышевой линии.

В другом варианте изобретение охватывает гуманизированный иммуноглобулин, который включает лёгкую цепь и тяжёлую цепи, описанные выше, или антигенсвязывающий фрагмент указанного иммуноглобулина. В типичном варианте изобретения гуманизированный иммуноглобулин связывается (например, специфически связывается) с бета-амилоидным пептидом (Άβ) с аффинностью связывания по меньшей мере 10⁷, 10⁸ или 10⁹ М^-1. В другом варианте изобретения иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент включает тяжёлую цепь изотипа γ1. В другом варианте изобретения иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент связывается (например, специфически связывается) с (любым из) одним растворимым бета-амилоидным пептидом (Αβ) или агрегированным Αβ или с обоими. В другом варианте изобретения иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент захватывает растворимый Αβ (например, растворимый Αβ1-42). В другом варианте изобретения иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент опосредует фагоцитоз (например, индуцирует фагоцитоз) бета-амилоидного пептида (Αβ). Ещё в одном варианте изобретения иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент проникает через гематоэнцефалический барьер у субъекта. Ещё в одном варианте изобретения иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент снижает либо только нагрузку бета-амилоидного пептида (Αβ) или только нейритную дистрофию у субъекта, либо и то, и другое.

В другом варианте изобретение охватывает химерные иммуноглобулины, которые включают вариабельные области 12Ά11 (например, последовательности вариабельных областей, представленные как 8ЕО ГО N0:2 или 8Е0 ГО N0:4). Ещё в одном варианте изобретения иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно включает константные области из 1дС1.

Иммуноглобулины по данному описанию особенно пригодны для применения в терапевтических способах, имеющих целью предупреждение или лечение амилоидогенных заболеваний. В одном варианте изобретение охватывает способ предупреждения или лечения амилоидогенного заболевания (например, болезни Альцгеймера), которое включает введение пациенту эффективной дозы гуманизированного иммуноглобулина по данному описанию. В другом варианте изобретение охватывает фармацевтические композиции, которые включают гуманизированный иммуноглобулин по данному описанию и фармацевтический носитель. Также охватываются выделенные нуклеотидные молекулы, векторы и клетки-хозяева для продуцирования иммуноглобулинов и фрагментов или цепей иммуноглобулинов по данному описанию, а также способы продуцирования указанных иммуноглобулинов, фрагментов иммуноглобулинов или цепей иммуноглобулинов.

Далее настоящее изобретение охватывает способ идентификации остатков 12Ά11, предрасположенных к замене при продуцировании гуманизированного 12Ά11 иммуноглобулина соответственно. Например, способ идентификации остатков вариабельной каркасной области, склонных к замене, включает моделирование трёхмерной структуры вариабельной области 12Ά11 на разрешённой гомологичной структуре иммуноглобулина и анализ указанной модели на остатки, способные влиять на конформацию или функцию вариабельной области иммуноглобулина 12Ά11 так, чтобы идентифицировать такие остатки, склонные к замене. Далее данное изобретение охватывает применение последовательности вариабельной области, представленной как 8Е0 ГО N0:2 или 8Е0 ГО N0:4, или её любого участка для создания трёхмерного изображения 12Ά11 иммуноглобулина, цепи 12Ά11 иммуноглобулина или её домена.

Настоящее изобретение охватывает далее иммуноглобулины, имеющие изменённую эффекторную функцию, такую как способность связываться с эффекторными молекулами, например комплементом или рецептором на эффекторной клетке. В частности, в иммуноглобулине по изобретению изменяли константную область, например Те-область, причём по меньшей мере один аминокислотный остаток в Теобласти заменяли отличным остатком или боковой цепью. В одном варианте изобретения модифицированный иммуноглобулин 1дО класса содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в Теобласти, так что иммуноглобулин имеет изменённую эффекторную функцию, например, по сравнению с немодифицированным иммуноглобулином. В особых вариантах иммуноглобулин по изобретению имеет изменённую эффекторную функцию, так что он становится менее иммуногенным (например, не вызывает нежелательной активности, нежелательного лизиса эффекторной клетки или нежелательного связывания комплемента с эффекторной клеткой), имеет улучшенный клиренс амилоида и/или имеет требуемый период полужизни.

До начала описания изобретения для лучшего понимания его целесообразно ввести определения некоторых терминов, используемых далее в данном описании.

Термин иммуноглобулин или антитело (применяемые в данном описании поочерёдно) относится к белку, имеющему основную четырёхполипептидную структуру цепи, состоящую из двух тяжёлых и двух лёгких цепей, причём указанные цепи стабилизированы, например, межцепными дисульфидными связями, который (белок) способен специфически связываться с антигеном.

Термин одноцепочечный иммуноглобулин или одноцепочечное антитело (применяемые в данном описании поочерёдно) относится к белку, имеющему двухполипептидную структуру, состоящую из тяжёлой и лёгкой цепей, причём указанные цепи стабилизированы, например, межцепными пептидными линкерами, который (белок) способен специфически связываться с антигеном.

Термин домен относится к глобулярной области полипептида тяжёлой или лёгкой цепи, содержащей пептидные петли (например, содержащей 3-4 пептидных петли), стабилизированные, например, с помощью β-складок и/или межцепной дисульфидной связью. Домены называют далее в данном описании как константные или вариабельные, в зависимости от относительной недостаточности вариаций последовательности внутри доменов различных членов класса в случае константного домена или от значительной вариации внутри доменов различных членов класса в случае вариабельного домена. Домены антитела или полипептида часто в уровне технике взаимозаменяемо (равнозначно) называют области (участки). Константные домены лёгкой цепи антитела равнозначно называют константные области лёгкой цепи, константные домены лёгкой цепи, СЬ области или СЬ домены. Константные домены тяжёлой цепи антитела равнозначно называют константные области тяжёлой цепи, константные домены тяжёлой цепи, СН области или СН домены. Вариабельные домены лёгкой цепи антитела равнозначно называют вариабельные области лёгкой цепи, вариабельные домены лёгкой цепи, УЪ области или УЪ домены. Вариабельные домены тяжёлой цепи антитела равнозначно называют вариабельные области тяжёлой цепи, вариабельные домены тяжёлой цепи, УН области или УН домены.

Термин область может также относиться к части или участку цепи антитела или домену цепи антитела (например, часть или участок тяжёлой или лёгкой цепи или часть или участок константного или вариабельного домена, по определению в данном описании), а также к более дискретным частям или участкам указанных цепей или доменов. Например, лёгкая и тяжёлая цепи или вариабельные домены лёгкой и тяжёлой цепей включают гипервариабельные участки или СЭЯ, вкрапленные среди каркасных (остовных) областей или РК, по данному описанию.

Иммуноглобулины или антитела могут существовать в мономерной или полимерной форме, например 1дМ антитела, которые существуют в пентамерной форме, и/или 1дСЛ антитела, которые существуют в мономерной, димерной или мультимерной форме.

Термин фрагмент относится к части или участку антитела или цепи антитела, содержащим меньше аминокислотных остатков, чем интактное или полное антитело или цепь интактного или полного антитела. Фрагменты можно получать действием химических и ферментативных реагентов на интактное или полное антитело или на цепь интактного или полного антитела. Фрагменты можно получать также методами рекомбинантной ДНК. Примеры фрагментов включают фрагменты РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')₂, РаЬс и/или Ρν.

Термин антигенсвязывающий фрагмент относится к полипептидному фрагменту иммуноглобулина или антитела, который связывается с антигеном или конкурирует с интактным антителом (т.е. с интактным антителом, из которого они образованы) за связывание с антигеном (т.е. специфическое связывание).

Термин конформация относится к третичной структуре белка или полипептида (например, антитела, цепи антитела, его домена или участка). Например, выражение конформация лёгкой (или тяжёлой) цепи относится к третичной структуре вариабельной области лёгкой (или тяжёлой) цепи, а выражение конформация антитела или конформация фрагмента антитела относится к третичной структуре антитела или его фрагмента.

Специфическое связывание антитела означает, что антитело проявляет заметное сродство (аффинность) к конкретному антигену или эпитопу и, как правило, не проявляет заметной кроссреактивности. В типичных вариантах изобретения антитело не проявляет кроссреактивности (например, не реагирует перекрёстно с не-Αβ пептидами или с удалёнными эпитопами на Ав). Заметное или предпочтительное связывание включает связывание с аффинностью по меньшей мере 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ или 10 М^-1. Более предпочтительна аффинность выше 10⁷ М^-1, предпочтительно выше 10 М^-1 и выше. Предполагается, что в объём настоящего изобретения также входят значения, промежуточные между представленными в данном описании, и предпочтительные значения аффинности связывания могут быть указаны в виде интервала аффинностей, например 10⁶-10¹⁰ М^-1, предпочтительно 10⁷-10¹⁰ М^-1, более предпочтительно 10⁸-10¹⁰ М^-1. Антитело, которое не проявляет значительной кроссреактивности, представляет собой антитело, которое не связывается в заметной (ощутимой, оценимой) степени с нежелательным объектом (например, нежелательным белковым объектом). Например, антитело, которое специфически связывается с Αβ, в значительной степени связывает Αβ, но не реагирует в заметной степени с не-Αβ белками или пептидами (например, не-Αβ белками или пептидами, входящими в состав бляшек). Например, антитело, специфичное к конкретному эпитопу, в незначительной степени будет перекрёстно реагировать с удалёнными эпитопами на том же белке или пептидами. Специфическое связывание можно определить любым признанным в технике способом определения такого связывания. Предпочтительно специфическое связывание определяют по методу и/или анализами конкурентного связывания.

Связывающие фрагменты получают методами рекомбинантной ДНК или ферментативным или химическим расщеплением интактных иммуноглобулинов.

-5 012407

Связывающие фрагменты включают РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')₂, РаЬс, Ρν, одиночные цепи и одноцепочечные антитела. Предполагают, что у иммуноглобулина или антитела, иных, нежели биспецифические или бифункциональные иммуноглобулины или антитела, каждый из имеющихся в нём сайтов связывания идентичен. Биспецифическое или бифункциональное антитело представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две различные пары тяжёлой/лёгкой цепей и два различных сайта связывания. Биспецифические антитела можно получать различными методами, включая слияние гибридом или связывание РаЬ'-фрагментов. См., например, Ξοηβδίνίΐηί & Ьасйтапп, С1т. Ехр. 1ттипо1. 79:315-321 (1990); Ко81е1пу е1 а1., 1. 1ттипо1. 148, 1547-1553 (1992).

Термин гуманизированный иммуноглобулин или гуманизированное антитело относится к иммуноглобулину или антителу, которое включает по меньшей мере одну гуманизированную цепь иммуноглобулина или антитела (т.е. по меньшей мере одну гуманизированную лёгкую или тяжёлую цепь).

Термин гуманизированная цепь иммуноглобулина или гуманизированная цепь антитела (т.е. гуманизированная лёгкая цепь иммуноглобулина или гуманизированная тяжёлая цепь иммуноглобулина) относится к цепи иммуноглобулина или антитела (т.е. к лёгкой или тяжёлой цепи соответственно), имеющей вариабельную область, которая включает вариабельный каркасный участок в основном (практически) человеческого иммуноглобулина или антитела и гипервариабельные участки (СОВ) (например, по меньшей мере один СОВ, предпочтительно два СОВ, более предпочтительно три СОВ) в основном (практически) нечеловеческого иммуноглобулина или антитела и, кроме того, включает константные области (например, по меньшей мере одну константную область или её часть, в случае лёгкой цепи, и предпочтительно три константные области в случае тяжёлой цепи).

Термин гуманизированная вариабельная область (например, гуманизированная вариабельная область лёгкой цепи или гуманизированная вариабельная область тяжёлой цепи) относится к вариабельной области, которая включает вариабельный каркасный участок (область) в основном (практически) человеческого иммуноглобулина или антитела и гипервариабельные участки (области) (СОВ) в основном (практически) нечеловеческого иммуноглобулина или антитела.

Выражение в основном (из) человеческого иммуноглобулина или антитела или в основном (практически) человеческий означает, что при выравнивании с последовательностью человеческого иммуноглобулина или антитела в целях сравнения область идентична по меньшей степени на 80-90%, 90-95% или 95-99% (т.е. локальная идентичность последовательностей) с человеческой каркасной последовательностью или с человеческой последовательностью константной области, допуская, например, консервативные замены, замены согласованной (консенсусной) последовательности, замены зародышевой линии, обратные мутации и т. п. Введение консервативных замен, замен согласованной последовательности, замен зародышевой линии обратных мутаций и т.п. часто называют оптимизацией гуманизированного антитела или гуманизированной цепи.

Выражение в основном (практически, главным образом) (из) нечеловеческого иммуноглобулина или антитела или практически нечеловеческий означает наличие последовательности иммуноглобулина или антитела, по меньшей мере на 80-95%, предпочтительно по меньшей мере на 90-95%, более предпочтительно на 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности нечеловеческого организма, например, отличного от человека млекопитающего.

Соответственно, все области или остатки гуманизированного иммуноглобулина или антитела или гуманизированной цепи иммуноглобулина или антитела, за исключением, возможно, СОВ, практически (в основном) идентичны соответствующим областям или остаткам одной или более нативных последовательностей человеческих иммуноглобулинов.

Термин соответствующая область (участок) или соответствующий остаток относится к области или к остатку во второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая (или который) занимает то же самое (т.е. эквивалентное) положение в качестве области или остатка в первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, когда первую и вторую последовательности оптимально выравнивают в целях сравнения.

Термин значительная идентичность, значительная степень идентичности означает, что две полипептидные последовательности при оптимальном выравнивании, таком как с помощью программ САР или ВЕ8ТР1Т с применением средневзвешенных гэпов по умолчанию, имеют по меньшей мере 50-60%-ную идентичность последовательностей, предпочтительно по меньшей мере 60-70%-ную идентичность последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 70-80%-ную идентичность последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 80-90%-ную идентичность последовательностей, ещё более предпочтительно по меньшей мере 90-95%-ную идентичность последовательностей, и ещё более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную идентичность последовательностей или более (например, последовательности идентичны на 99% или выше).

Термин практически идентичный (практическая идентичность) означает, что две полипептидные последовательности, при оптимальном выравнивании, таком как с помощью программ САР или ВЕ8ТР1Т с применением средневзвешенных гэпов по умолчанию, имеют по меньшей мере 80-90%-ную идентичность последовательностей, предпочтительно, по меньшей мере 90-95%-ную идентичность последовательностей и ещё более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную идентичность последовательностей или более (например, последовательности идентичны на 99% или выше). Для сравнения последовательностей, как правило, одну последовательность используют в качестве эталонной последовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемые и эталонная последовательности вводят в компьютер, определяют координаты подпоследовательностей, если необходимо, и определяют параметры алгоритмической программы последовательности. Затем, используя алгоритм сравнения последовательностей, рассчитывают процент идентичности последовательностей для испытуемой(ых) последовательности(ей) относительно эталонной последовательности исходя из определённых параметров программы.

Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, например, при использовании алгоритма локального выравнивания Смита-Ватермана, Λάν. Αρρί. Ма111. 2:482 (1981), алгоритма гомологического выравнивания Нидлмана-Вунша, 1. Μοί. Βίοί. 48:443 (1970), метода поиска подобия Пирсона и Липмана, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А, 85:2444 (1988), с помощью компьютерных программ (САР, ΒΕ8ΤΡΙΤ, РА8ТА и ТРА8ТА в ^зсоизш Сепейсз 8оП\сагс Раскаде, Сепейсз СотриГег Сгоир, 575 8с1еисе Όγ., МаФзоп, XVI) или визуальным исследованием (см. в целом Аи8иЬе1 е! а1., СштепГ Рго!осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду). Одним примером алгоритма, подходящего для определения процента идентичности последовательностей и подобия последовательностей, является алгоритм ВЬА8Т, описанный А11зс1и.11 е! а1., 1. Мо1. Вю1. 215:403 (1990). Программа осуществления ВЬА8Т анализов является общедоступной с помощью №Шопа1 СепГег Гог Вю1ес1шо1оду 1пГогта1юп (общедоступен через интернетсервер №Шопа1 1п5(11и(е8 оГ Неайй ЫСВ1). Как правило, для проведения сравнения последовательностей можно применять параметры программы по умолчанию, хотя можно также использовать специальные параметры (характеристики). Для аминокислотных последовательностей программа ВЬА8ТР в качестве параметров по умолчанию использует длину слова (V) 3, ожидание (Е) 10 и матрицу ВЕО8ИМ62 (см. НешкоГГ&НешкоГГ, Ргос. ЫаД. Асаб. 8οΐ. И8А, 89:10915 (1989)).

Предпочтительно положения неидентичных остатков отличаются консервативными аминокислотными заменами. С целью классификации аминокислотных замен как консервативных или неконсервативных аминокислоты группируют следующим образом:

группа I (гидрофобные боковые цепи): 1еи, те!, а1а, νаί, 1еи, 11е;

группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи): суз, зег, 1Пг;

группа III (кислые боковые цепи): азр, д1и;

группа IV (основные боковые цепи): азп, д1п, Ыз, 1уз, агд;

группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепи): д1у, рго и группа VI (ароматические боковые цепи): Ггр, !уг, р1е.

Консервативные замены включают замены аминокислот одного и того же класса. Неконсервативные замены представляют собой замену члена одного из этих классов на член другого класса.

Предпочтительно гуманизированные иммуноглобулины или антитела связывают антиген с аффинностью, которая в три, четыре или в пять раз выше аффинности соответствующего негуманизированного антитела. Например, если величина аффинности связывания негуманизированного антитела 10⁹ М^-1, аффинность связывания гуманизированных антител составляет по меньшей мере 3х10⁹ М^-1, 4х10⁹ М^-1 или 5х10⁹ М^-1. При описании связывающих свойств цепи иммуноглобулина или антитела цепь можно описывать с учётом её способности направлять связывание с антигеном (например, Ав). Говорят, что цепь направляет (нацеливает, регулирует) связывание с антигеном, когда она сообщает интактному иммуноглобулину или антителу (или его антигенсвязывающему фрагменту) признак специфического связывания или аффинность связывания. Говорят, что мутация (например, обратная мутация) в значительной степени (заметно) влияет на способность тяжёлой или лёгкой цепи направлять связывание антигена, если она изменяет (например, понижает) величину аффинности связывания интактного иммуноглобулина или антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), содержащего боковую цепь, по меньшей мере, на порядок по сравнению с аффинностью антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), содержащего эквивалентную цепь, в которой отсутствует указанная мутация. Мутация практически не влияет (например, понижает) на способность цепи направлять связывание антигена, если она изменяет (например, понижает) аффинность связывания интактного иммуноглобулина или антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), содержащего боковую цепь, только в два, три или четыре раза по сравнению с антителом (или его антигенсвязывающим фрагментом), содержащим эквивалентную цепь без указанной мутации.

Термин химерный иммуноглобулин или химерное антитело относится к иммуноглобулину или антителу, вариабельная область которого образована из первого вида, а константные области образованы из второго вида. Химерные иммуноглобулины или антитела можно конструировать, например, методами рекомбинантной ДНК, при использовании генных сегментов, кодирующих иммуноглобулины, принадлежащих к различным видам. Не предполагается, что термины гуманизированный иммуноглобулин или гуманизированное антитело охватывают химерные иммуноглобулины или антитела по определению ниже. Хотя гуманизированные иммуноглобулины или антитела являются химерными по своей кон струкции (т.е. содержат области из более одного вида белка), они включают дополнительные признаки (т.е. вариабельные области, содержащие донорные СЭР остатки и акцепторные каркасные остатки), не обнаруженные в химерных иммуноглобулинах и антителах по данному описанию.

Антиген представляет собой объект (например, белковый объект или пептид), с которым антитело связывается специфически.

Термин эпитоп или антигенная детерминанта относится к сайту на антигене, с которым иммуноглобулин или антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) специфически связывается. Эпитопы могут образовываться как из соседних (непрерывных) аминокислот, так и не из соседних (не непрерывных) аминокислот, расположенных рядом вследствие скручивания белка (третичная структура). Эпитопы, образованные из соседних аминокислот, как правило, сохраняются при экспозиции с денатурирующими растворителями, тогда как эпитопы, образованные за счёт третичной структуры (скручивание), как правило, утрачиваются под действием денатурирующих растворителей. Как правило, эпитоп включает по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают, например, рентгеновскую кристаллографию и 2-мерный ядерный магнитный резонанс. См., например, Ерйоре Марρίη§ Рго1осо1к ίη МеШойк ίη Мо1еси1аг Вю1оду, νοί. 66, С.Е. Мотлк, Ей. (1996).

Антитела, которые распознают одинаковый эпитоп, можно идентифицировать простым иммуноанализом, показывающим способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью, т. е. анализом конкурентного связывания. Конкурентное связывание определяется анализом, в котором тестируемый иммуноглобулин ингибирует специфическое связывание эталонного антитела (антитела сравнения) с обычным антигеном, таким как Αβ. Известно множество типов анализа конкурентного связывания, например твердофазный прямой или непрямой радиоиммуноанализ (ΚΙΑ), твердофазный прямой или непрямой ферментный иммуноанализ (ΕΙΑ), конкурентный сэндвичанализ (см. 8ΐ;·ι1ι1ί е1 а1., МеШойк ίη Епхуто1оду. 9:242 (1983)); твердофазный прямой ΕΙΑ с мечением комплексом биотин-авидин (см. КпИзпй е1 а1., 1. ^тишк 137:3614 (1986)); твердофазный прямой анализ с меткой, твердофазный прямой сэндвич-анализ с меткой (см. Наг1о\у апй Тале, Αηΐ^Ьοй^еκ: Α ЬаЬогаЮгу Мапиа1., Со1й 8рппд НагЬог Ргекк (1988)); твердофазный прямой ΡΙΑ с 1-125 в качестве метки (см. Моге1 е1 а1., Мо1. Iттиηο1. 25(1):7 (1988)); твердофазный прямой ΕΙΑ с мечением комплексом биотин-авидин (см. Скешщ е1 а1., Уйо1оду, 176:546 (1990)) и прямой ΚΙΑ с меткой (МоНеОи-шег е1 а1., Зсаий. 1. Iттиηο1. 32:77 (1990)). Как правило, такой анализ включает применение очищенного антигена, связанного с твёрдой поверхностью, или клетками, несущими любой из двух иммуноглобулинов: немеченый тестируемый иммуноглобулин и меченый эталонный иммуноглобулин. Конкурентное ингибирование измеряют, определяя количество метки, связанной с твёрдой поверхностью или клетками, в присутствии тестируемого иммуноглобулина. Обычно тестируемый иммуноглобулин присутствует в избытке. Обычно, когда конкурентное антитело присутствует в избытке, оно ингибирует специфичное связывание эталонного антитела с обычным антигеном по меньшей мере на 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% или более.

Эпитоп также распознаётся иммунологическими клетками, например В-клетками и/или Т-клетками. Клеточное распознавание эпитопа можно определить с помощью анализов ίη νίΙΐΌ, в которых измеряют антигензависимую пролиферацию, как определяют с помощью введения ³Н-тимидина, секреции цитокинов, секреции антител или антигензависимого киллинга (анализ цитотоксических лимфоцитов).

Примеры эпитопов или антигенных детерминант можно найти в (внутри) человеческом амилоидном белке-предшественнике (ΑΡΡ), но предпочтительно их находят внутри Αβ пептида ΑΡΡ. Существует множество изоформ ΑΡΡ, например ΑΡΡ⁶⁹⁵, ΑΡΡ⁷⁵¹ и ΑΡΡ⁷⁷⁰. Аминокислотам внутри (в) ΑΡΡ присваиваются номера в соответствии с последовательностью изоформы ΑΡΡ⁷⁷⁰ (см., например, 6еηВаηк Αссеκκ^οη Ио. Ρ05067). Αβ (также называемый в данном описании бета-амилоидный пептид и А-бета) пептид представляет собой внутренний фрагмент протяжённостью 4 кДа, из 39-43 аминокислот ΑΡΡ (Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 и Αβ43). Например, Αβ40 состоит из остатков 672-711, а Αβ42 состоит из остатков 673-713 ΑΡΡ. В результате протеолитического процессинга ΑΡΡ под действием различных секретаз ίη νί\Ό или ίη νίΙΐΌ Αβ обнаруживают как в короткой форме протяжённостью 40 аминокислот, так и в длинной форме протяжённостью 42-43 аминокислоты. Предпочтительные эпитопы, или антигенные детерминанты, по данному описанию расположены в Ν-конце Αβ пептида и включают остатки в пределах аминокислот Αβ, предпочтительно остатки 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 или 3-7 Αβ42 пептида. Дополнительные вышеупомянутые эпитопы или антигенные детерминанты включают остатки 2-4, 5, 6, 7 или 8 Αβ, остатки 3-5, 6, 7, 8 или 9 Αβ или остатки 4-7, 8, 9 или 10 Αβ42. Когда говорят, что антитело связывается с эпитопом в пределах конкретных остатков, таких как Αβ 3-7, это означает, что антитело специфически связывается с полипептидом, содержащим конкретные остатки (например, в данном примере Αβ 3-7). Такое антитело не обязательно контактирует с каждым остатком в пределах Αβ 3-7. Не обязательно каждая единичная аминокислотная замена или делеция в Αβ 3-7 в значительной степени влияет на аффинность связывания.

Термин амилоидогенное заболевание включает любое заболевание, ассоциированное с (или вызванное) образованием или отложением нерастворимых амилоидных фибрилл. Примеры амилоидогенных заболеваний включают, но без ограничения, системный амилоидоз, болезнь Альцгеймера, диабет взрослых, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, фронтотемпоральную деменцию и прионные трансмиссивные губкообразные энцефалопатии (куру и болезнь Крейтцфельда-Якоба у людей и почесуха и В8Е у овец и крупного рогатого скота соответственно). Различные амилоидогенные заболевания определяют или характеризуют в зависимости от природы полипептидного компонента отлагающихся фибрилл. Например, у субъектов или пациентов, больных болезнью Альцгеймера, β-амилоидный белок (например, дикого типа, вариант или усечённый (процессированный) β-амилоидный белок) является отличительным (характеризующим) пептидным компонентом амилоидного отложения. Следовательно, болезнь Альцгеймера является примером заболевания, характеризующегося отложениями Αβ, или заболевания, ассоциированного с (обусловленного) отложениями Αβ, например, в мозгу субъекта или пациента. Термины β-амилоидный белок, β-амилоидный пептид, β-амилоид, Αβ и Αβ пептид применяются в данном описании взаимозаменяемо, на равных основаниях.

Иммуногенный агент или иммуноген способен индуцировать иммунологический ответ против самого себя при введении млекопитающему, необязательно в сочетании с адъювантом.

Термин лечение, обработка по данному описанию определяется как применение или введение терапевтического агента пациенту либо применение или введение терапевтического агента в выделенную ткань или клеточную линию пациента, имеющего заболевание, симптом заболевания или предрасположенность к заболеванию, с целью лечения, исцеления, ослабления, облегчения, изменения, излечения, уменьшения интенсивности, улучшения или влияния на заболевание, симптомы заболевания или предрасположенности к заболеванию.

Термин эффективная доза, эффективная дозировка определяется как количество, достаточное для достижения или, по меньшей мере, частичного достижения желаемого эффекта.

Термин терапевтически эффективная доза определяется как количество, достаточное для излечения или, по меньшей мере, частичного подавления заболевания и его осложнений у больного, уже страдающего этим заболеванием. Количества, эффективные для этой цели, зависят от опасности (тяжести) инфекции и общего состояния собственной иммунной системы пациента.

Термин пациент (больной) включает человека или другого млекопитающего субъекта, который получает либо профилактическое, либо терапевтическое лечение.

Растворимый или диссоциированный Αβ относится к неагрегированному или дезагрегированному Αβ полипептиду, включая мономерный растворимый, а также олигомерный растворимый Αβ полипептид (например, растворимые Αβ димеры, тримеры и т.п.). Нерастворимый Αβ относится к агрегированному Αβ полипептиду, например Αβ, удерживаемому вместе за счёт нековалентных связей. Полагают, что Αβ (например, Αβ42) агрегируется, по меньшей мере частично, вследствие присутствия гидрофобных остатков на С-конце пептида (часть трансмембранного домена ΑΡΡ). Растворимый Αβ можно обнаружить ίη νίνο в биологических жидкостях, таких как спинно-мозговая (цереброспинальная) жидкость и/или сыворотка. Или же растворимый Αβ можно получать, растворяя лиофилизированный пептид в чистом ДМСО под действием ультразвука. Полученный раствор центрифугируют (например, при 14000хд, 4°С, 10 мин) для удаления нерастворимых макрочастиц.

Термин эффекторная функция относится к активности, которая расположена в Ре-области антитела (например, 1дС антитела) и включает, например, способность антитела связывать эффекторные молекулы, такие как комплемент и/или Рс-рецепторы, которая может контролировать некоторые иммунные функции антитела, такие как активность эффекторной клетки, лизис, комплемент-опосредованная активность, клиренс антитела и период полужизни антитела.

Термин эффекторная молекула относится к молекуле, которая способна связываться с Рсобластью антитела (например, 1дС антитела), включая, но без ограничения, белок комплемента или Рсрецептор.

Термин эффекторная клетка относится к клетке, способной связываться с Рс участком антитела (например, 1дС антитела), как правило, за счёт Рс-рецептора, экспрессированного на поверхности эффекторной клетки, включая, но без ограничения, лимфоциты, например антигенпрезентирующие клетки и Т-клетки.

Термин Рс-область (участок) относится к С-концевой области 1дС антитела, в частности С-концевой области тяжёлой(ых) цепи(ей) указанного 1дС антитела. Хотя границы Рс-области тяжёлой цепи 1дС могут немного меняться, Рс-область, как правило, определяют как интервал примерно от аминокислотного остатка Су§22б до карбоксильного конца тяжёлой(ых) цепи(ей) 1дС.

Термин номенклатура КаЬаР', если не указано иначе, определяется как нумерация остатков, например, антитела с тяжёлой цепью 1дС с применением ЕЙ индекса по КаЬа! с1 а1. (8сс.|испсс5 о£ РгсИсиъ о£ 1тшипо1ощса1 1п1сгс51. 5'¹' Ей. РиЬНс Неа1111 8еМсе, Ыайопа1 1п51Ш.11е5 о£ НсаНН, Вс111С5Йа. Мй. (1991)), специально вводимом в данное описание в качестве ссылки.

Термин Рс-рецептор или РсВ относится к рецептору, который связывается с Рс-областью антитела. Типичные Рс-рецепторы, которые связываются с Рс-областью антитела (например, 1дС антитела), включают, но без ограничения, рецепторы подклассов РсуКЙ, РсуКЛ и РсуКШ, включая аллельные варианты и формы альтернативного сплайсинга этих рецепторов. Обзоры по Рс-рецепторам см. в К^е1сЬ апй

К1пе!, Аппи. Кеу. 1ттипо1. 9:457-92 (1991); Саре1 е! а1., 1ттипоте!Ноб8, 4:25-34 (1994) и бе Наак е! а1., 1. ЬаЬ. Сбп. Меб. 126:330-41 (1995).

I. Иммунологические и терапевтические реагенты.

Иммунологические и терапевтические реагенты по изобретению содержат иммуногены или антитела или их функциональные или антигенсвязывающие фрагменты по данному описанию или состоят из иммуногенов или антител или их функциональных или антигенсвязывающих фрагментов. Известно, что основная структурная единица антитела представляет собой тетраметр субъединиц. Каждый тетраметр состоит из двух идентичных пар полипептидньгх цепей, причём каждая пара имеет одну лёгкую (около 25 кДа) и одну тяжёлую (около 50-70 кДа) цепь. Аминоконцевой участок каждой цепи включает вариабельную область примерно из 100-110 или более аминокислот, главным образом ответственных за распознавание антигена. Карбоксиконцевой участок каждой цепи определяет константную область, прежде всего ответственную за эффекторную функцию.

Лёгкие цепи классифицируются либо как каппа (к), либо как лямбда (λ) и имеют протяжённость около 230 остатков. Тяжёлые цепи классифицируются как гамма (γ), мю (μ), альфа (α), дельта (δ) или ипсилон (ε), имеют протяжённость около 450-600 остатков и определяют изотип антитела как 1дС. 1дМ, 1дА, 1дЭ и 1дЕ, соответственно. Как тяжёлые, так и лёгкие цепи скручиваются в домены. Термин домен относится к глобулярной области белка, например иммуноглобулина или антитела. Домены иммуноглобулина или антитела включают, например, три или четыре пептидные петли, стабилизированные с помощью β-складки и межцепной дисульфидной связи. Интактные лёгкие цепи имеют, например, два домена (УЬ и СЬ), а интактные тяжёлые цепи имеют, например, четыре или пять доменов (УН, СН1, СН2 и СН3).

В пределах лёгкой и тяжёлой цепей вариабельные и константные области соединяются 1 (шарнирной) областью, состоящей примерно из 12 или более аминокислот, при этом тяжёлая цепь может также включать Ό область, содержащую около 10 или более аминокислот (см. в общем Еипбатеп!а1 1ттипо1оду (Раи1, ^., 2^пб еб. Кауеп Ргекк, Ν.Υ. (1989), СН. 7, вводится в данное описание во всей полноте в качестве ссылки для всех целей).

Вариабельные области каждой пары лёгкой/тяжёлой цепей образуют сайт связывания антитела. Следовательно, интактное антитело имеет два сайта связывания. За исключением бифункциональных, или биспецифических антител два сайта связывания в антителах одинаковы. У всех цепей наблюдается одинаковая общая структура относительно консервативных каркасных участков (областей) (ЕК), соединённых тремя гипервариабельными участками, также называемыми областями, определяющими комплементарность, или СИК. Природные цепи или цепи, полученные методом рекомбинантной ДНК, могут экспрессироваться при использовании лидерной последовательности, которая удаляется при клеточном процессинге, давая зрелую цепь. Зрелые цепи можно также получать методом рекомбинантной ДНК (рекомбинантного продуцирования) с использованием неприродной лидерной последовательности, например, для повышения секреции или изменения процессинга конкретной представляющей интерес цепи.

Области СИК двух зрелых цепей каждой пары выравнивают по каркасным участкам, давая возможность связываться со специфичным эпитопом. От Ν-конца до С-конца как лёгкая, так и тяжёлая цепи содержат домены ЕК1, СИК1, ЕК2, СИК2, ЕК3, СИК3 и ЕК4. В уровне техники область ЕК4 также называют Ό/1 участок вариабельной области тяжёлой цепи и 1 участок вариабельной области лёгкой цепи. Отнесение аминокислот к каждому домену делается в соответствии с определениями КаЬа! е! а1. 8ес.|иепее5 ок Рго!ет§ ок 1ттипо1ощса1 1п!еге§!, (№1Нопа1 1п8Й!и!е8 ок НеаИЪ, ВеФекба, ΜΌ, 1987 апб 1991). Альтернативное определение структуры предложено С1о11иа е! а1., Т Мо1. Вю1. 196:901 (1987); №!иге, 342:878 (1989) и 1. Мо1. Вю1. 186:651 (1989) (в целом далее в данном описании эти материалы обозначаются С1о!Ыа е! а1. и вводятся ссылкой во всей полноте для всех целей).

А. Αβ антитела.

Терапевтические агенты по изобретению включают антитела, которые специфически связываются с Αβ или другими компонентами амилоидной бляшки. Предпочтительными антителами являются моноклональные антитела. Некоторые такие антитела специфически связываются с агрегированной формой Αβ, не связываясь с растворимой формой. Некоторые антитела специфически связываются с растворимой формой, не связываясь с агрегированной формой. Некоторые антитела связываются как с агрегированной, так и с растворимой формами. Антитела, применяющиеся в терапевтических методах, предпочтительно имеют интактную константную область или по меньшей мере часть константной области, достаточную для того, чтобы взаимодействовать с Ес-рецептором. Предпочтительными антителами являются антитела, эффективно стимулирующие Ес-опосредованный фагоцитоз Αβ в бляшках. Предпочтительным является человеческий изотип 1дО1 вследствие его наиболее высокой из человеческих изотипов аффинности к ЕсК1 рецептору на фагоцитарных клетках (например, в находящихся в мозгу макрофагах или микроглиальных клетках). Человеческий 1дО1 является эквивалентом мышиного 1§С2а, таким образом, последний пригоден для проверки ш у1уо эффективности на животных (например, на мышиных) моделях болезни Альцгеймера. Также можно использовать биспецифические ЕаЬ-фрагменты, в которых одно плечо антитела имеет специфичность к Αβ, а другое - к Ес-рецептору. Предпочтительные антитела свя зываются с Αβ с аффинностью связывания, более высокой, чем (или равной) примерно 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ или 10¹⁰ М^-1 (включая промежуточные между этими величинами значения аффинности).

Моноклональные антитела связываются со специфическим эпитопом в Αβ, который может быть конформационным или неконформационным эпитопом.

Профилактическую и терапевтическую эффективность антител можно проверить по методикам с применением трансгенной животной модели, описанным в примерах. Предпочтительные моноклональные антитела связываются с эпитопом в пределах остатков 1-10 Αβ (при этом первый Ν-концевой остаток природного Αβ обозначается 1), более предпочтительно с эпитопом в остатках 3-7 Αβ. В некоторых методах используют множество моноклональных тел, имеющих специфичности связывания с различными эпитопами, например антитело, специфичное к эпитопу в пределах остатков 3-7 Αβ, можно вводить совместно с антителом, специфичным к эпитопу вне остатков 3-7 Αβ. Такие антитела можно вводить последовательно или одновременно. Можно также использовать (например, вводить или совместно вводить) антитела к амилоидным компонентам, иным, нежели Αβ.

Эпитопную специфичность антитела можно определить, например, путём создания на основе фагового дисплея библиотеки, в которой различные члены визуализируют различные субпоследовательности Αβ. Затем из библиотеки на основе фагового дисплея проводят селекцию членов, специфически связывающихся с испытуемым антителом. Выделяют семейство последовательностей. Как правило, такое семейство содержит обычную ядерную последовательность и фланкирующие последовательности изменяющейся протяжённости у разных членов. Наиболее короткая ядерная последовательность, проявляющая специфическое связывание с антителом, определяет эпитоп, связанный с антителом. Антитела также можно проверять на эпитопную специфичность конкурентным анализом с антителом, чья эпитопная специфичность уже определена. Например, антитела, которые конкурируют с антителом 12А11 за связывание с Αβ, связываются с тем же или аналогичным эпитопом, что и 12А11, т.е. в пределах остатков 3-7 Αβ. Скрининг антител на эпитопную специфичность является полезным прогнозом терапевтической эффективности. Например, антитело, определённое как связывающееся с эпитопом в пределах остатков 1-7 Αβ, вероятно, является эффективным для предупреждения и лечения болезни Альцгеймера по методам настоящего изобретения.

Антитела, которые специфически связываются с предпочтительным сегментом Αβ, не связываясь с другими участками Αβ, имеют ряд преимуществ перед моноклональными антителами, связывающимися с другими участками, или поликлональными сыворотками к интактному Аβ. Во-первых, при равных массовых дозах антител, дозы антител, специфически связывающихся с предпочтительными сегментами, содержат более высокие молярные дозы антител, эффективно очищают (просветляют) амилоидные бляшки. Во-вторых, антитела, специфически связывающиеся с предпочтительными сегментами, могут индуцировать реакцию очищения в отношении амилоидных отложений, не индуцируя реакцию очищения в отношении интактного Αβ полипептида, тем самым уменьшая возможные побочные эффекты.

1. Получение нечеловеческих антител.

Настоящее изобретение охватывает нечеловеческие антитела, например антитела, имеющие специфичность к предпочтительным Αβ эпитопам по изобретению.

Такие антитела можно использовать при приготовлении различных терапевтических композиций по изобретению или предпочтительно для создания гипервариабельных участков с целью получения гуманизированных химерных антител (подробно описанных ниже). Получение нечеловеческих моноклональных антител, например мышиных, морских свинок, приматов, кролика или крысы, можно выполнять, например, иммунизацией животного с помощью Αβ. Можно также использовать более протяжённый полипептид, содержащий Αβ или иммуногенный фрагмент Αβ, или антиидиотипические антитела к антителу к Αβ (см. выше учебник Наг1о^&Ьапе, вводимый в данное описание в качестве ссылки для всех целей). Такой иммуноген можно получать из природного источника, пептидным синтезом или рекомбинантной экспрессией. Необязательно, иммуноген можно вводить слитым или в виде иного комплекса с белком-носителем, описанным ниже. Необязательно, иммуноген можно вводить с адъювантом. Термин адъювант относится к соединению, которое при совместном введении с антигеном повышает иммунный ответ на антиген, но при индивидуальном введении не вызывает иммунный ответ на антиген. Адъюванты могут усиливать иммунный ответ по нескольким механизмам, включая рекрутинг лимфоцитов, стимуляцию В- и/или Т-клеток и стимуляцию макрофагов. Некоторые типы адъювантов можно использовать, как описано ниже. Для иммунизации лабораторных животных предпочтительно применять полный адъювант Фрейнда с последующим применением неполного адъюванта.

Кроликов или морских свинок, как правило, применяют для получения поликлональных антител. Примерное получение поликлональных антител, например, для пассивной защиты можно осуществлять следующим образом. 125 нетрансгенных мышей иммунизируют с помощью 100 мкг Αβ1-42 плюс адъювант СРЛ/ΙΡΑ и подвергают эвтаназии через 4-5 месяцев. Собирают кровь иммунизированных мышей. 1§С отделяют от других компонентов крови. Антитела, специфичные к иммуногену, можно частично очистить аффинной хроматографией. В среднем от одной мыши получают 0,5-1,0 мг иммуноген

-11 012407 специфичного антитела, что в целом даёт 60-120 мг.

Мышей обычно используют для получения моноклональных антител. Моноклональные антитела против фрагмента можно получать, инъецируя мышам фрагмент или более протяжённую форму Αβ, получая гибридомы и проводя скрининг гибридом на антитело, которое специфически связывается с Αβ. Необязательно, проводят скрининг антител на связывание с конкретным участком или заданным фрагментом Ав без связывания с другими неперекрывающимися фрагментами Αβ. Последний скрининг можно выполнять, определяя связывание антитела с коллекцией мутантов с делецией Αβ пептида и определяя, какие мутанты с делецией связываются с антителом. Связывание можно оценивать, например, Вестерн-блоттингом или методом ЕЫ8А. Наименьший фрагмент, проявляющий специфическое связывание с антителом, определяет эпитоп антитела. Или же эпитопную специфичность можно определить конкурентным анализом, в котором тестируемое и эталонное антитела конкурируют за связывание с Αβ. Если тестируемое и конкурентное антитела конкурируют, значит, они связываются с одним и тем же эпитопом или эпитопами, достаточно проксимальными, так что связывание одного антитела мешает связыванию другого. Предпочтительным изотипом для таких антител является мышиный изотип 1дС2а или эквивалентный изотип других видов. Мышиный изотип 1дС2а является эквивалентом человеческого изотипа 1дС1 (например, человеческого (й) 1дС1).

2. Химерные и гуманизированные антитела.

Настоящее изобретение также охватывает химерные и/или гуманизированные антитела (т.е. химерные и/или гуманизированные иммуноглобулины), специфичные к бета-амилоидному пептиду. Химерные и/или гуманизированные антитела имеют специфичность связывания и аффинность, одинаковую с или аналогичную специфичности связывания и аффинности мышиного или другого нечеловеческого антитела, которое обеспечивает исходный материал для конструкции химерного или гуманизированного антитела.

а) Получение химерных антител.

Термин химерное антитело относится к антителу, гены лёгкой и тяжёлой цепи которого создают, как правило, методами рекомбинантной ДНК из сегментов генов иммуноглобулинов, принадлежащих к разным видам. Например, вариабельные (V) сегменты генов мышиного моноклонального антитела можно соединять с человеческими константными (С) сегментами, такими как 1дС1 и 1дС4. Предпочтительным является человеческий изотип 1дС1. Таким образом, типичное химерное антитело представляет собой химерный белок, состоящий из V или антигенсвязывающего домена мышиного антитела и из С или эффекторного домена человеческого антитела.

б) Получение гуманизированных антител.

Термин гуманизированное антитело относится к антителу, содержащему по меньшей мере одну цепь, включающую каркасные остатки вариабельной области, главным образом, цепи человеческого антитела (называемого акцепторым иммуноглобулином или антителом), и по меньшей мере один гипервариабельный участок, главным образом, мышиного антитела (называемого донорным иммуноглобулином или антителом). См., Циееп е! а1., Ргос. №111. Αεαά. 8с1. ϋδΑ, 86:10029-10033 (1989), патенты США 5530101, 5585089, 5693761, 5693762, 8е11ск е! а1., Международная заявка АО 90/07861 и Аш!ет, патент США 5225539 (вводимые в данное описание в качестве ссылки для всех целей). Константная(ые) область(и), если она(и) присутствует(ют), также состоят в основном (практически) или полностью из человеческого иммуноглобулина.

Наиболее вероятно, что замена мышиных СИЯ на каркасный участок человеческого вариабельного домена приведёт к сохранению их корректной пространственной ориентации, если каркасный участок вариабельной области принимает конформацию, такую же или аналогичную конформации каркасного участка мышиного вариабельного домена, из которого происходят СИЯ. Этого достигают, получая человеческие вариабельные домены из человеческих антител, каркасные последовательности которых проявляют высокую степень идентичности каркасным участкам вариабельных доменов, из которых образованы СЭЯ. Каркасные участки вариабельных доменов тяжёлой и лёгкой цепей можно получать из одинаковых или различных последовательностей человеческого антитела. Последовательности человеческого антитела могут быть последовательностями природных человеческих антител или могут быть консенсусными последовательностями нескольких человеческих антител. См. Кей1еЬогоидй е! а1., Рто!еш Еид1иеетшд 4:773 (1991); Ко1Ьшдет е! а1., Рто!еш Еидтеетшд 6:971 (1993) и Сайет е! а1., Международная заявка АО 92/22653.

После идентификации гипервариабельных участков мышиного донорного иммуноглобулина и соответствующих человеческих акцепторных иммуноглобулинов следующей стадией является определение, какие, если таковые есть, остатки из этих компонентов следует заменить для оптимизации свойств полученного гуманизированного антитела. Вообще говоря, замену человеческих аминокислотных остатков на мышиные следует свести к минимуму, так как введение мышиных остатков повышает риск того, что антитело вызовет реакцию человеческого антитела против мышиного антитела (ΗΑΜΑ) у людей. Можно применять признанные в технике методы определения иммунного ответа для мониторинга ΗΑΜΑ ответа у конкретного пациента или в ходе клинических испытаний. У пациентов, которым вводят гуманизированные антитела, можно проводить оценку иммуногенности в начале и в ходе проведения указанной терапии. НАМА ответ измеряют, например детектируя антитела к гуманизированному терапевтическому реагенту, в сывороточных образцах пациента по методу, известному специалисту в данной области техники, включая метод поверхностного плазмонного резонанса (В1асоге) и/или твердофазный ЕЫ8А анализ.

Некоторые аминокислоты их каркасных остатков вариабельной области выбирают для замены с учётом их возможного влияния на СЭК конформацию и/или связывание с антигеном. Необычное наложение мышиных СОК участков и каркасного участка человеческой вариабельной области может вызвать необычные конформационные ограничения (затруднения), которые, если не корректировать путём замены некоторых аминокислотных остатков, приводят к утрате аффинности связывания.

Выбор аминокислотных остатков для замены определяют, частично, компьютерным моделированием. Аппаратное и программное компьютерное обеспечение указано в данном описании для получения трёхмерных изображений молекул иммуноглобулинов. Как правило, молекулярные модели получают, опираясь на решённые структуры цепей иммуноглобулинов или их доменов. Цепи, которые следует моделировать, сравнивают для установления сходства их аминокислотных последовательностей с аминокислотными последовательностями цепей или доменов решённых трёхмерных структур, и цепи или домены, в которых имеется наибольшее сходство (подобие) последовательностей, выбираются в качестве исходных для построения молекулярной модели. Цепи или домены с идентичностью последовательностей по меньшей мере 50% выбирают для моделирования и предпочтительно для моделирования выбирают цепи или домены с идентичностью последовательностей по меньшей мере 60, 70, 80, 90% или более. Решённые начальные (исходные) структуры модифицируют таким образом, чтобы допустить различия между действительными аминокислотами в моделируемых цепях или доменах иммуноглобулина и в исходной структуре. Затем модифицированные структуры собирают в составной иммуноглобулин. Наконец, модель уточняют на основе минимизации энергии и подтверждают, что все атомы находятся на соответствующих расстояниях друг от друга и что длины связей и углы находятся в химически допустимых пределах.

Выбор аминокислотных остатков для замены можно также определить, частично изучая характеристики аминокислот в конкретных местоположениях, или эмпирическим изучением эффектов замены или мутагенеза конкретных аминокислот. Например, если имеется отличие аминокислоты между каркасным остатком мышиной вариабельной области и выбранным каркасным остатком человеческой вариабельной области, человеческую каркасную аминокислоту обычно заменяют на эквивалентную каркасную аминокислоту из мышиного антитела, когда имеются основания ожидать, что аминокислота:

(1) непосредственно связывается с антигеном нековалентной связью;

(2) прилегает к СОК участку;

(3) иным образом взаимодействует с СОК участком (например, находится на расстоянии около 3-6 А от участка СОК, как определено на компьютерной модели) или (4) принимает участие в УЪ-УН интерфейсе (поверхности раздела).

Остатки, которые непосредственно связываются с антигеном нековалентной связью (нековалентно), включают аминокислоты в положениях в каркасных участках (областях), которые имеют хорошую возможность непосредственно взаимодействовать с аминокислотами на антигене в соответствии с известными химическими силами, например, за счёт водородных связей, сил Ван-дер-Ваальса, гидрофобных взаимодействий и т. п.

СОК и каркасные области определяют по КаЬа! е! а1. или по С1о1Ыа е! а1., см. выше. Если каркасные остатки, определяемые по КаЬа! е! а1., см. выше, составляют остатки структурной петли, определяемые по С1о!Ыа е! а1., см. выше, мышиное антитело можно выбрать для замены в гуманизированное антитело. Остатки, которые прилегают к СОК участку (области), включают аминокислотные остатки в положениях, непосредственно прилегающих к одному или более СОК в первичной последовательности гуманизированной цепи иммуноглобулина, например в положениях, непосредственно прилегающих к СОК по КаЬа! или СОК по С1о!Ыа (см., например, С1о!Ыа апб Ьекк, 1МВ, 196:901 (1987)). Весьма вероятно, что эти аминокислоты взаимодействуют с аминокислотами в СОК и, будучи выбраны из акцептора, искажают донорные СОК и снижают аффинность. Кроме того, прилегающие аминокислоты могут взаимодействовать непосредственно с антигеном (ΛιηίΙ е! а1., 8с1епсе, 233:747 (1986), вводится в данное описание в качестве ссылки), и выбор этих аминокислот из донора может быть желательным для всех сохранений контактов с антигеном, которые обеспечивают аффинность начального (исходного) антитела.

Остатки, которые иным образом (иначе) взаимодействуют с СОК областью, включают такие остатки, которые, по определению с помощью анализа вторичной структуры, имеют пространственную ориентацию, достаточную для того, чтобы влиять на СОК область. В одном варианте изобретения остатки, которые иным образом взаимодействуют с СОК областью, определяют анализом трёхмерной модели донорного иммуноглобулина (например, компьютерной модели). Анализ трёхмерной модели, как правило, исходного (начального) донорного антитела показывает, что некоторые аминокислоты вне СОК расположены близко к СОК и имеют хорошую возможность взаимодействовать с аминокислотами в СОК за счёт водородных связей, сил Ван-дер-Ваальса, гидрофобных взаимодействий и т.д. В этих ами нокислотных положениях может быть предпочтительным выбрать аминокислоту донорного иммуноглобулина, нежели аминокислоту акцепторного иммуноглобулина. Аминокислоты согласно этому критерию, как правило, имеют в боковой цепи атом в пределах около 3 А от некоего атома в СЭВ и должны содержать атом, который мог бы взаимодействовать с атомами СЭВ за счёт известных химических сил, таких как перечисленные выше.

Для атомов, которые могут образовывать водородную связь, расстояние 3 А измеряют между ядрами атомов, но для атомов, которые не образуют связь, расстояние 3 А измеряют между их ван-дерваальсовыми поверхностями. Следовательно, в последнем случае ядра должны быть в пределах около 6 А (3 А плюс сумма ван-дер-ваальсовых радиусов) для атомов, рассматриваемых как способные взаимодействовать. Во многих случаях ядра находятся на расстоянии от 4 или 5 до 6 А. При определении, может ли аминокислота реагировать с СЭК. предпочтительно не рассматривать последние 8 аминокислот СЭВ2 тяжёлой цепи как часть СЬВ областей, так как с точки зрения структуры эти 8 аминокислот ведут себя скорее как часть каркаса.

Аминокислоты, которые способны взаимодействовать с аминокислотами в СЭВ, можно определить и другим способом. Площадь доступной для растворителя поверхности каждой каркасной аминокислоты вычисляют двумя путями: (1) для интактного антитела и (2) для гипотетической молекулы, состоящей из антитела с удалёнными СЭВ. Заметная разница между этими показателями, примерно 10 квадратных ангстрем или более, показывает, что доступ каркасной кислоты к растворителю, по меньшей мере, частично блокирован областями СЭВ и, следовательно, аминокислота находится в контакте с СЭВ Площадь доступной для растворителя поверхности аминокислоты можно вычислить на основе трёхмерной модели антитела, используя известные из уровня технике алгоритмы (например, Соппо11у, 1. Арр1. Сгу81. 16:548 (1983) и Ьее апб В1сйатб8, 1. Мо1. Вю1. 55:379 (1971), каждая из этих статей вводится в данное описание в качестве ссылки). Иногда каркасные аминокислоты могут также взаимодействовать с областями СИВ не непосредственно, влияя на конформацию другой каркасной аминокислоты, которая, в свою очередь, контактирует с СИВ.

Известно, что каркасные аминокислоты в некоторых положениях важны для определения СИВ конформации (например, способные взаимодействовать с СИВ) во многих антителах (С1о1Ыа апб Ьекк, см. выше, С1о11на е1 а1., см. выше и ТгашоШапо е1 а1., 1. Мо1. Вю1. 215:175 (1990), каждый из этих материалов вводится в данное описание в качестве ссылки). Эти авторы определяли консервативные каркасные остатки, важные для СИВ конформации, анализируя структуры нескольких известных антител. Анализируемые антитела на основании конформации областей СИВ относятся к ограниченному числу структурных или канонических классов. Консервативные каркасные остатки среди членов канонических классов называются каноническими остатками. Канонические остатки включают остатки 2, 25, 29, 30, 33, 48, 64, 71, 90, 94 и 95 лёгкой цепи и остатки 24, 26, 29, 34, 54, 55, 71 и 94 тяжёлой цепи. Дополнительные остатки (например, остатки, определяющие структуру СИВ) можно определить по методологии Майш апб ТНоИоп (1996), 1. Мо1. Вю1. 263:800. Следует отметить, что аминокислоты в положениях 2, 48, 64 и 71 лёгкой цепи и 26-30, 71 и 90 тяжёлой цепи (номенклатура КаЬа!), как известно, могут взаимодействовать с областями СИВ во многих антителах. Аминокислоты в положениях 35 лёгкой цепи и 93 и 103 в тяжёлой цепи также, по-видимому, взаимодействуют с областями СИВ. Дополнительные остатки, которые могут влиять на конформацию областей СИВ, можно определить по методу Роо1е апб Аш1ет (1992), 1. Мо1. Вю1. 224:487. Такие остатки называются остатки вернье (уетшет) и представляют собой остатки в каркасной области, лежащие в основании (т.е. образующие платформу под) СЭВ. Во всех этих пронумерованных положениях выбор донорной аминокислоты для гуманизированного иммуноглобулина предпочтительнее акцепторной аминокислоты. С другой стороны, некоторые остатки, способные взаимодействовать с областью СЭВ, такие как первые 5 аминокислот лёгкой цепи, можно иногда выбирать из акцепторного иммуноглобулина без потери аффинности в гуманизированном иммуноглобулине.

Остатки, которые принимают участие в УЪ-УН интерфейсе (границе раздела) или остатки упаковки включают остатки в поверхности раздела (интерфейсе) между УЪ и УН по определению, например в Ыоуо1пу апб НаЬег, Ргос. Ыаб. Асаб. 8с1. И8А, 82:4592-66(96?) (1985) или С1о11па е! а1., см. выше. Как правило, необычные остатки упаковки должны сохраняться в гуманизированном антителе, если они отличаются от остатков в человеческих каркасных участках.

В целом, одна или более аминокислот, удовлетворяющих вышеуказанным критериям, могут быть заменены. В некоторых вариантах изобретения все или большинство аминокислот, удовлетворяющих вышеуказанным критериям, заменяются. Иногда, когда имеется некоторая неясность насчёт того, удовлетворяет ли конкретная аминокислота вышеуказанным критериям, получают альтернативные вариантные иммуноглобулины, один из которых содержит эту конкретную замену, а другой не содержит. Альтернативные вариантные иммуноглобулины, полученные таким образом, можно исследовать любым из аналитических методов на заданную активность по данному описанию, и выбирают предпочтительный иммуноглобулин.

Обычно области СЭВ в гуманизированных антителах практически идентичны и более обычно идентичны соответствующим областям СЭВ донорного антитела. Однако в некоторых вариантах изобретения может быть желательным модифицировать одну или более областей СЭВ с целью модификации антигенсвязывающей специфичности антитела и/или уменьшения иммуногенности антитела. Как правило, один или более остатков СЭК изменяют для модификации связывания с целью достижения более предпочтительной скорости оп (включения) связывания, более предпочтительной скорости оГГ (выключения) связывания или обеих, так что достигается идеальная константа связывания. С применением этой стратегии можно получить антитело со сверхвысокой аффинностью связывания, например 10¹⁰ М^-1 или выше. Коротко, донорную СОК. последовательность называют основной последовательностью, в которой затем меняют один или более остатков. Методы созревания аффинности по данному описанию можно использовать для изменения области(ей) СОК, с последующим скринингом полученных связывающих молекул на заданное изменение связывания. Можно использовать также способ изменения донорного СОК, как правило мышиного СОК, чтобы эта область стала менее иммуногенной, так чтобы свести к минимуму или избежать возможного ответа человеческого антитела против мышиного антитела (ΗΑΜΑ). Следовательно, при изменении областей СОК можно проводить мониторинг и оценку изменения аффинности связывания, а также иммуногенности, так чтобы оптимизировать антитело для достижения наивысшего общего (объединённого) связывания и низкой иммуногенности (см., например, патент США 6656467 и опубликованную патентную заявку США И8 20020164326Ά1).

В другом способе СОК участки антитела анализируют с целью определения вклада каждого отдельного участка СОК в связывание антитела и/или иммуногенность, систематически заменяя каждый из донорных участков СОК на человеческий эквивалент. Затем полученную панель гуманизированных антител оценивают на аффинность связывания и потенциальную иммуногенность каждого участка (области) СОК. Таким образом определяют два клинически важных свойства кандидатной связывающей молекулы, т. е. связывание с антигеном и низкую иммуногенность. Если доступны сыворотки пациента против соответствующей мышиной или СЭК-трансплантированной (гуманизированной) формы антитела, тогда можно подвергнуть скринингу всю панель антител, представляющих систематические изменения человеческих СОК, с целью определения антиидиотипического ответа пациентов против каждого донорного СОК (технические подробности см. Ινηκίιί е! а1., Мо1. 1ттипо1. 36:1079-91 (1999)). Такой подход позволяет идентифицировать основные (существенные, важные) донорные СОК области, отличить их от неосновных (несущественных) донорных СОК. Несущественные донорные СОК области можно затем заменить на человеческие эквивалентные СОК. Если существенную (основную) область СОК нельзя заменить без неприемлемой утраты функции, идентификацию остатков, определяющих специфичность (8ЭК) областей СОК, проводят, например, с помощью сайт-направленного мутагенеза. Таким образом, СОК можно затем воссоздать (реконструировать) так, чтобы сохранились только участки 8ЭК и чтобы области СОК были человеческими и/или минимально иммуногенными в остальных аминокислотных положениях по всей области СОК. Такой подход, если трансплантируется только часть донорного СОК, также сокращенно называется СЭК-графтинг (прививка, трансплантация, дгайшд) (технические подробности см., например, Татига е! а1., I. оГ 1ттипо1оду, 164(3):1432-41. (2000); Сопха1ек е! а1., Мо1 1ттипо1. 40:337-349 (2003); КакЬтш е! а1., Сгй. Кеу. 0псо1. Нета!о1. 36:3-16 (2001) и Эе РакскБк е! а1., I. оГ 1ттипо1оду, 169(6):3076-84 (2002)).

Кроме того, иногда можно сделать одну или более аминокислотных замен остатков СОК, не оказывая существенного влияния на аффинность связывания полученного гуманизированного иммуноглобулина. Под консервативными заменами полагают такие комбинации, как д1у, а1а; уа1, 11е, 1еи; акр, д1и; акп, д1п; кег, П1г; 1ук, агд и рНе, 1уг.

Дополнительные кандидаты на замену представляют собой акцепторные человеческие каркасные аминокислоты, необычные или редкие для человеческого иммуноглобулина в данном положении. Эти аминокислоты можно заменять аминокислотами в эквивалентном положении мышиного донорного антитела или в эквивалентном положении более типичных человеческих иммуноглобулинов.

Например, замена может быть желательной, когда аминокислота в человеческой каркасной области акцепторного иммуноглобулина является редкой для этого положения, а соответствующая аминокислота в донорном иммуноглобулине является обычной для этого положения в человеческих последовательностях иммуноглобулина или когда аминокислота в акцепторном иммуноглобулине является редкой для этого положения и соответствующая аминокислота в донорном иммуноглобулине является также редкой по сравнению с другими человеческими последовательностями. Когда при выборе остатков для обратной мутации учитывают вклад в СЭК конформацию, следует также принимать во внимание, является ли остаток редким для акцепторных человеческих последовательностей. Например, если обратная мутация приводит к замене остатка, редкого для акцепторных человеческих каркасных последовательностей, гуманизированное антитело можно тестировать на активность с или без (обратной мутации?). Если обратная мутация не является необходимой для активности, её можно исключить, чтобы не волноваться по поводу иммуногенности. Например, обратные мутации в следующих остатках могут ввести остаток, редкий в акцепторных человеческих каркасных последовательностях: ик=у2 (2,0%), Ь3 (0,4%), Т7 (1,8%), 018 (0,2%), Ь83 (1,2%), Ι85 (2,9%), Ά100 (0,3%) и Ь106 (1,1%) и уБ=Т3 (2,0%), К5 (1,8%), Ι11 (0,2%), 823 (1,5%), Т24 (1,5%), 841 (2,3%), К71 (2,4%), К75 (1,4%), Ι82 (1,4%), Ό83 (2,2%) и Ь109 (0,8%). Эти критерии помогают гарантировать, что атипическая аминокислота в человеческой каркасной области не нарушит структуру антитела.

-15 012407

Кроме того, с помощью замены необычной человеческой акцепторной аминокислоты на аминокислоту донорного антитела, что является типичным для человеческих антител, гуманизированное антитело можно сделать менее иммуногенным.

Термин редкий, по данному описанию, указывает, что аминокислота встречается в этом положении менее чем примерно в 20%, предпочтительно менее чем примерно в 10%, более предпочтительно менее чем примерно в 5%, ещё предпочтительно менее чем примерно в 3%, ещё предпочтительно менее чем примерно в 2% и ещё предпочтительно менее чем примерно в 1% последовательностей в репрезентативной выборке последовательностей, а термин обычный, по данному описанию, показывает, что аминокислота встречается более чем примерно в 25%, но более обычно более чем примерно в 50% последовательностей в репрезентативной выборке. Например, при решении, является ли человеческая акцепторная последовательность редкой или обычной, часто предпочтительно рассматривать только последовательности человеческих вариабельных областей, а при решении, является ли мышиная аминокислота редкой или обычной, предпочтительно рассматривать только последовательности мышиных вариабельных областей. Кроме того, все человеческие последовательности вариабельной области лёгких и тяжёлых цепей группируют в подгруппы последовательностей, которые особенно гомологичны друг с другом и имеют одинаковые аминокислоты в некоторых важных положениях (КаЬа! с1 а1., см. выше). При решении, является ли аминокислота в человеческой акцепторной последовательности редкой или обычной среди человеческих последовательностей, часто предпочтительно рассматривать только эти человеческие последовательности в той же подгруппе, к которой относится акцепторная последовательность.

Дополнительными кандидатами на замену являются акцепторные человеческие каркасные аминокислоты, которые обычно идентифицируют как часть СЭЯ области по альтернативному определению, предложенному С1о11иа с1 а1., см. выше. Дополнительными кандидатами на замену являются акцепторные человеческие каркасные аминокислоты, которые обычно идентифицируют как часть СОЯ области определяемых АЬМ и/или контактов.

Дополнительными кандидатами на замену являются акцепторные каркасные остатки, которые соответствуют редкому или необычному донорному каркасному остатку. Редкие или необычные донорные каркасные остатки представляют собой такие остатки, которые являются редкими или необычными (по данному описанию) для мышиных антител в данном положении. Для мышиных антител подгруппу можно определить по КаЬа! и по положениям идентифицированных остатков, которые отличаются от консенсусной последовательности. Эти донор-специфические различия могут указать на соматические мутации в мышиной последовательности, которые повышают активность. Необычные остатки, предположительно влияющие на связывание (например, канонические остатки упаковки и/или вернье-остатки), сохраняют, тогда как остатки, предположительно неважные для связывания, можно заменить. Редкие остатки в последовательности 12А11 ИК включают 185 (3,6%). Редкие остатки в последовательности 12А11 ν1 включают Т3 (1,0%), 111 (1,7%), Ь12 (1,7%), 841 (2,8%), Ό83 (1,8%) и А85 (1,8%).

Дополнительными кандидатами на замену являются остатки не зародышевой линии, встречающиеся в акцепторной каркасной области. Например, когда цепь акцепторного антитела (т.е. человеческую цепь антитела, имеющую значительную степень идентичности последовательности с последовательностью цепи донорного антитела) выравнивают с цепью антитела зародышевой линии (также в значительной степени идентичной донорной цепи), несовпадающие остатки акцепторной каркасной цепи и каркасной цепи зародышевой линии можно заменить на соответствующие остатки последовательности зародышевой линии.

Иные, нежели обсуждавшиеся выше специфичные аминокислотные замены, каркасные области гуманизированных иммуноглобулинов обычно практически (в основном) идентичны и более обычно идентичны каркасным областям человеческих антител, из которых они образованы. Конечно, многие аминокислоты каркасной области вносят малый или не прямой вклад в специфичность или аффинность антитела. Поэтому многие отдельные консервативные замены каркасных остатков можно допустить без заметного изменения специфичности или аффинности полученного гуманизированного иммуноглобулина. Так, в одном варианте изобретения вариабельная каркасная область гуманизированного иммуноглобулина по меньшей мере на 85% идентична последовательности человеческой вариабельной каркасной области или консенсусу таких последовательностей. В другом варианте изобретения вариабельная каркасная область гуманизированого иммуноглобулина по меньшей мере на 90% , предпочтительно на 95%, более предпочтительно на 96, 97, 98 или на 99% идентична последовательности человеческой вариабельной каркасной области или консенсусу таких последовательностей. В целом, однако, такие замены нежелательны.

В примерах вариантов изобретения гуманизированные антитела по изобретению проявляют аффин789 101 ность специфичного связывания с антигеном по меньшей мере 10 , 10 , 10 или 10 М^- . В других вариантах антитела по изобретению могут иметь аффинность связывания по меньшей мере 10¹⁰, 10¹¹ или 10¹² М^-1. Обычно верхний предел аффинности связывания гуманизированных антител с антигеном в три, четыре или в пять раз выше аффинности связывания донорного иммуноглобулина. Часто нижний предел аффинности связывания также в три, четыре или в пять раз выше аффинности связывания донорного иммуноглобулина. Или же аффинность связывания можно сравнивать с аффинностью связывания гуманизированного антитела, не содержащего замен (например, антитела, содержащего донорные СИЯ и акцепторные РК, но не содержащее РЯ замен). В таких примерах связывание оптимизированного антитела (с заменами) предпочтительно по меньшей мере в два-три раза или в три-четыре раза выше, чем связывание незамещённого антитела. С целью проведения сравнения можно определить активность различных антител, например, методом В1асоге (т.е. методом поверхностного плазмонного резонанса с применением немеченых реагентов) и методами анализа конкурентного связывания.

с) Получение гуманизированных 12А11 антител.

Предпочтительный вариант настоящего изобретения включает гуманизированное антитело к №концу Αβ для применения в терапевтических и/или диагностических методах по данному описанию. Особенно предпочтительным исходным материалом для получения гуманизированных антител является моноклональное антитело 12А11. 12А11 специфично к №концу Αβ и, как было показано, (1) имеет высокую авидность к агрегированному Αβ 1-42; (2) способно захватывать растворимый Αβ и (3) опосредует фагоцитоз (например, индуцирует фагоцитоз) амилоидной бляшки (см. пример Ι). Ιη νίνο эффективность антитела 12А11 описана в примере ΙΙ. Клонирование и секвенирование кДНК, кодирующей вариабельные области тяжёлой и лёгкой цепи антитела 12А11, описаны в примере ΙΙΙ.

Подходящие последовательности человеческого акцепторного антитела можно идентифицировать с помощью компьютерного сравнения аминокислотных последовательностей мышиных вариабельных областей с последовательностями известных человеческих антител. Сравнение проводят отдельно для тяжёлой и лёгкой цепей, но принципы сравнения аналогичны. В частности, вариабельные домены человеческих антител, каркасные последовательности которых имеют высокую степень идентичности последовательностей с мышиными УЬ и УН каркасными областями, идентифицируют по запросу, например, из базы данных КаЬа1 или из базы данных белковых последовательностей Ι§0, используя NСВI Ι§0 ВЬА8Т (общедоступный через Интернет-сервер №Нопа1 [П8111и1е8 о£ НеаИЪ NСВI) с соответствующими мышиными каркасными последовательностями. В одном варианте изобретения выбирают акцепторные последовательности, более чем на 50% идентичные мышиным донорным последовательностям, например донорные каркасные (РЯ) последовательности. Предпочтительно выбирают последовательности акцепторного антитела с идентичностью последовательностей 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% и выше.

Компьютерное сравнение 12А11 показало, что лёгкая цепь 12А11 (подгруппа мышей ΙΙ) проявляет наибольшую идентичность последовательности с человеческими лёгкими цепями подтипа каппа ΙΙ и что тяжёлая цепь 12А11 (подгруппа мышей ПЬ) проявляет наибольшую идентичность последовательности с человеческими тяжёлыми цепями подтипа ΙΙ, определение по КаЬа1 е1 кирга. Человеческие каркасные области лёгкой и тяжёлой цепей можно образовать из человеческих антител этих субтипов или из консенсусных последовательностей таких субтипов. При первой попытке гуманизации вариабельные каркасные области лёгкой цепи были образованы из человеческих антител субгруппы ΙΙ. Исходя из предыдущих экспериментов, поставленных с целью достичь высоких уровней экспрессии гуманизированных антител, имеющих вариабельные каркасные области тяжёлых цепей, образованные из человеческих антител субгруппы ΙΙ, было найдено, что уровни экспрессии таких антител иногда низки. Соответственно, на основании рассуждений, описанных в 8а14апйа е1 а1., (1999), Мо1. Iттиηο1., 36:709-19, предпочтительно выбирают каркасные области человеческих антител субгруппы ΙΙ, нежели человеческой субгруппы ΙΙ.

Как было идентифицировано при использовании нерезервированной NСВI базы данных, человеческое антитело К64 субгруппы ΙΙ (ΛΙΜ84) (депонировано под номером ВАС01733) имеет значительную идентичность последовательности с вариабельными областями лёгкой цепи антитела 12А11. Как было идентифицировано при использовании нерезервированной NСВI базы данных, человеческое антитело М72 субгруппы ΙΙΙ (депонировано под номером ААА69734) имеет значительную идентичность последовательности с вариабельными областями тяжёлой цепи антитела 12А11 (см. также 8сЬгое4ег ап4 \Уап§ (1990), Ргос. №11. Аса4. 8с1. И.8.А. 872:6146-6150). Альтернативные акцепторные последовательности лёгкой цепи включают, например, номер депонирования в ΡΌΒ 1КРА (§124158782), номер депонирования в ΡΌΒ 1КРА (§124158784), номер депонирования в ЕМВЬ САЕ75574.1 (§138522587), номер депонирования в ЕМВЬ САЕ75575.1 (§138522590), номер депонирования в ЕМВЬ САЕ84952.1 (§139838891), номер депонирования в И1В ВАС01734.1 (§121669419), номер депонирования в ИХВ ВАС01730.1 (§121669411), номер депонирования в ΡΙΚ 840312 (§1481978), номер депонирования в ЕМВЬ САА51090.1 (§13980118), номер депонирования в СепВапк ААН63599.1 (§139794308), номер депонирования в ΡΙΚ 822902 (§1106540), номер депонирования в ΡΙΚ 842611 (§1631215), номер депонирования в ЕМВЬ САА38072.1 (§1433890), номер депонирования в СепВапк АА000856.1 (§14100384), номер депонирования в ЕМВЬ САА39072.1 (§134000), номер депонирования в ΡΙΚ 823230 (§1284256), номер депонирования в ИВ1 ВАС01599.1 (§121669149), номер депонирования в ИВ1 ВАС01729.1 (§121669409), номер депонирования в ИВ1 ВАС01562.1 (§121669075), номер депонирования в ЕМВЬ САА85590.1 (§1587338), номер депонирования в СепВапк ААР99243.1 (§137694665), номер депонирования в ААК94811.1 (§118025604), номер депонирования в ЕМВЬ САВ51297.1 (§15578794), номер депонирования в ИВ1 ВАС01740.1 (§121669431) и номер депонирования в ИВ1 ВАС01733.1 (§121669417). Альтернативные акцепторные по следовательности тяжёлой цепи включают, например, номер депонирования в СепБапк ΑΑΒ35009.1 (§11041885), номер депонирования в ΌΒΙ ВЛС’01904.1 (§121669789), номер депонирования в ΑΑΌ53816.1 (§15834100), номер депонирования в ОепВапк ΑΑ886081.1 (§146254223), номер депонирования в ΌΒΙ ΒΑΟ01462.1 (§121668870), номер депонирования в ОепВапк ААС18191.1 (§13170773), номер депонирования в ΌΒΙ ΒΑΟ02266.1 (§121670513), номер депонирования в ОеηΒаηк ΑΑΌ56254.1 (§15921589), номер депонирования в ОепΒапк ΑΑΌ53807.1 (§15834082), номер депонирования в ΌΒΙ ΒΑ002260.1 (§121670501), номер депонирования в ОеηΒаηк ΑΑΟ18166.1 (§13170723), номер депонирования в ΕΜΒΕ САА49495.1 (§133085), номер депонирования в Р1Я 831513 (§1345903), номер депонирования в ОеηΒаηк ΑΑ886079.1 (§146254219), номер депонирования в ΌΒΙ ВАС01917.1 (§121669815), номер депонирования в ΌΒΙ ВАС01912.1 (§121669805), номер депонирования в ОеηΒаηк ААС18283.1 (§13170961), номер депонирования в ΌΒΙ ВАС01903 (§121669787), номер депонирования в ΌΒΙ ΒΑΟ01887.1 (§121669755), номер депонирования в ΌΒΙ ΒΑΟ02259.1 (§121370499), номер депонирования в ΌΒΙ ВАС01913.1 (§121669807), номер депонирования в ΌΒΙ ΒΑΟ01910.1 (§121669801), номер депонирования в ΌΙΒ ΒΑΟ02267.1 (§121670515), номер депонирования в ОеηΒаηк ААС18306.1 (§13171011), номер депонирования в ΟепΒапк ΑΑΌ53817.1 (§15834102), номер депонирования в Р1Я Ε36005 (§1106423), ΕΜΒΕ СЛΒ37129.1 (§14456494), ΟепΒапк ΑΑΑ68892.1 (§1186190).

В примерах изобретения гуманизированные антитела по изобретению включают области СЭЯ и РЯ 12Α11 из акцепторной последовательности, перечисленной выше.

Остатки в пределах каркасных областей, важных для СЭЯ конформации и/или активности по данному описанию, выбирают для обратной мутации (при различии между донорной и акцепторной последовательностями).

Затем выбирают остатки для замены следующим образом. Если аминокислоты в вариабельной каркасной области 12А11 и в эквивалентной человеческой вариабельной каркасной области различаются, аминокислоту в человеческой каркасной области, как правило, следует заменить на мышиную аминокислоту, если резонно ожидать, что аминокислота:

(1) непосредственно связывается с антигеном нековалентной связью (нековалентно);

(2) прилегает к СЭЯ области или является частью СЭЯ области по альтернативному определению, предложенному Сйо1Ыа е! а1., см. выше, или иным образом взаимодействует с СЭЯ областью (например, в пределах около 3А от СЭЯ области) или (3) принимает участие в УЪ-УН интерфейсе.

Структурный анализ вариабельных областей тяжёлой и лёгкой цепей антитела 12А11 и гуманизация антитела 12А11 описаны в примере У. Коротко говоря, изучают трёхмерные модели решённых структур мышиных антител 1КТЯ для лёгкой цепи и 11ЯН и 1ΕΤΖ для тяжёлой цепи. Альтернативные трёхмерные модели, которые можно изучить для идентификации остатков, важных для СЭЯ конформации (например, остатков вернье зоны), включают номер депонирования в ΡΌΒ 2ΙΕΕ (§13212688), номер депонирования в ΡΌΒ 1ΤΕΤ (§1494639), номер депонирования в ΡΌΒ ИР5 (§116975307), номер депонирования в ΡΌΒ 1СΒУ (§1493917), номер депонирования в ΡΌΒ 2РСР (§14388943), номер депонирования в ΡΌΒ 1191 (§12050118), номер депонирования в ΡΌΒ 1ΟΕΖ (§11827926), номер депонирования в ΡΌΒ 1РЬ6 (§117942615) и номер депонирования в ΡΌΒ 1КЕЬ (§11942968) для лёгкой цепи и номер депонирования в ΡΌΒ 1ОО1 (§1442938), номер депонирования в ΡΌΒ 1ΟΟΒ (§1442934), номер депонирования в ΡΌΒ 1Ν5Υ (§128373913), номер депонирования в ΡΌΒ 2НМ1 (§13891821), номер депонирования в ΡΌΒ 1ΡΌΕ (§1229915), номер депонирования в ΡΌΒ 1К1Р (§11942788), номер депонирования в ΡΌΒ 1К1Ц (§11942791) и номер депонирования в ΡΌΒ 1ΥΡΑ (§1576325) для тяжёлой цепи.

Информация о трёхмерной структуре антител по данному описанию является общедоступной, например, из Банка данных белков Яезеагсй Со11аЬога1огу £ог 81гис1ига1 Β^о^ηΓо^таΐ^С8' Рго1ет Эа1а Βапк (ΡΌΒ). ΡΌΒ имеет свободный доступ через Интернет (иге) и описан Βе^таη е! а1. (2000) М.1с1е1с Ααάδ ЯезеагсЬ, 28:235. Изучение решённых трёхмерных структур позволяет идентифицировать СЭЯ-взаимодействующие остатки в (в пределах) 12А11. Или же трёхмерные модели для УН и УЪ цепей антитела 12А11 можно получить с помощью компьютерной программы. Коротко говоря, трёхмерную модель строят на основании ближайших решённых структур мышиного антитела для тяжёлой и лёгкой цепей. Для этой цели в качестве матрицы для моделирования лёгкой цепи 12А11 можно использовать 1КТЯ, а в качестве матриц для моделирования тяжёлой цепи можно использовать 1ΕΤΖ и 11ЯН. Модель можно дополнительно уточнять с помощью ряда стадий минимизации энергии, чтобы отбросить нежелательные атомные контакты и оптимизировать взаимодействия за счёт электростатических и ван-дерваальсовых сил. Дополнительный трёхмерный анализ и/или моделирование можно осуществлять, используя 2ΙΕΕ (2,5 А) и/или 1ТЕТ (2,3 А) для лёгкой цепи и 1ΟΟΙ (2,8 А) для тяжёлой цепи (или другие антитела, представленные выше), учитывая сходство между этими решёнными мышиными структурами и соответствующими цепями 12А11.

Компьютерная модель структуры 12Α11 может далее служить в качестве исходной для прогнозирования трёхмерной структуры антитела, содержащего гипервариабельные участки 12А11, замещённые в человеческих каркасных структурах. Можно создать дополнительные модели, представляющие собой структуру с дополнительно введёнными аминокислотными заменами.

-18 012407

Вообще желательна замена одной, большинства или всех аминокислот, отвечающих вышеуказанным критериям. Соответственно, гуманизированные антитела по настоящему изобретению обычно содержат замену каркасного остатка человеческой лёгкой цепи, соответствующего остатку 12А11 по меньшей мере в 1, 2, 3 или более выбранных положениях. Гуманизированные антитела также обычно содержат замену каркасного остатка человеческой тяжёлой цепи, соответствующего остатку 12А11 по меньшей мере в 1, 2, 3 или более выбранных положениях.

Однако иногда существует некая неопределённость относительно того, отвечает ли конкретная аминокислота вышеуказанным критериям, тогда получают альтернативные вариантные иммуноглобулины, один из которых содержит конкретную замену, а другой не содержит. В примерах (в случаях), когда замена на мышиный остаток вводит остаток, редкий в человеческих иммуноглобулинах в конкретном положении, может быть желательно проверить антитело на активность с конкретной заменой или без неё. Если активность (например, аффинность связывания и/или специфичность связывания) примерно одинакова с заменой или без неё, может быть предпочтительным антитело без замены, так как в этом случае можно меньше ожидать НАМА ответа по данному описанию.

Другими кандидатами на замену являются акцепторные человеческие каркасные аминокислоты, необычные для человеческого иммуноглобулина в данном положении. Эти аминокислоты можно заменять на аминокислоты в эквивалентном положении более типичных человеческих иммуноглобулинов. Или же, аминокислоты из эквивалентных положений в мышином 12А11 можно вводить в человеческие каркасные области, когда такие аминокислоты являются типичными для человеческого иммуноглобулина в эквивалентных положениях.

Другие кандидаты на замену представляют собой остатки незародышевой линии, встречающиеся в каркасной области. С помощью компьютерного сравнения 12Α11 с известными последовательностями зародышевой линии можно идентифицировать зародышевые последовательности с наибольшей степенью идентичности тяжёлой или лёгкой цепи. Выравнивание каркасной области и последовательности зародышевой линии показывает, какие остатки можно выбрать для замены на соответствующие остатки зародышевой линии. Не совпадающие остатки выбранной акцепторной области лёгкой цепи и одной из этих последовательностей зародышевой линии можно выбрать для замены на соответствующий остаток зародышевой линии.

Редкие мышиные остатки идентифицируют, сравнивая донорную УЪ и/или УН последовательности с последовательностями других членов субгруппы (подгруппы), к которой принадлежат донорные УЪ и/или УН последовательности (по номенклатуре КаЬа!), и идентифицируя положения остатков, которые отличаются от консенсусных. Эти донор-специфические отличия могут указать на соматические мутации, которые повышают активность. Необычные или редкие остатки, близкие к сайту связывания, могут, вероятно, контактировать с антигеном, поэтому желательно сохранить мышиный остаток. Однако, если необычный мышиный остаток не важен для связывания, применение соответствующего акцепторного остатка является предпочтительным, так как мышиный остаток может создать иммуногенные неоэпитопы в гуманизированном антителе, которые повышают активность. В ситуации, когда необычный остаток в донорной последовательности в действительности является обычным остатком в соответствующей акцепторной последовательности, предпочтительный остаток, несомненно, является акцепторным остатком.

-19 012407

В табл. 1 А кратко изложен анализ последовательностей УН и УБ областей 12А11. Таблица 1 Краткие сведения о последовательности V области антитела 12А11

Цепь	УБ	УН
Подгруппа мышей	II	1Ъ
Подгруппа человека	II	II
Редкие аминокислоты в мышиной νί (% встречаемости)	185 (3.6%)	111 (1.7%)
Канонический класс по С1о1Ыа	Б1: класс 6[16ί] Б2: класс 1 [7] БЗ: класс 1[9]	Н1: класс 3 [7] Н2: класс 1 [16] НЗ1
Ближайшая решённая структура мышиного МАЬ	1ΚΊΒ2	1ΕΤΖ3 (2.6А) и ивн4
Гомология с матрицей для моделирования	94%	83% и 86%
Человеческая каркасная последовательность	К64 (ВАС01733) (87% ГВ, 67% всего)	М72 (ААА69734) (61% РВ, 45% всего)
Примечания к донору	Ни к ЕС подгруппа II СЭВ из той же канонической структурной группы, что и 12А11	Ни НС подгруппа III СПК из той же канонической структурной группы, что и 12А11
Примечания к обратным мутациям	нет	А24Р, Р29Е:Н1 В71К: каноническая, Н2 У371: упаковка 2'288. У48Е, Р67Е Ν73Τ, Е78У: Вернье
Эталон, зародышевая линия для Ни Рг	А19 УЕУк2- 28 мРНК: Х63397.1 (01:33774)	ААА69731.1 (01:567123)

'Не канонический класс, но может образовывать изогнутое основание по правилам

8Ыга1 е! а1. (1999), РЕВ8 Бей. 455:188-197. ²КаиГтапп е! а1. (2002), I. Мо1. Вю1. 318:135-147. ³СиЮа1 е! а1. (2000), I. Мо1. Вю1. 302:853-872. ⁴8одаЬе е! а1. (1997), I. Мо1. Вю1. 273:882-897.

Представлены последовательности зародышевой линии, которые можно использовать при выборе аминокислотных замен.

Информация о трёхмерной структуре антител по данному описанию является общедоступной, например, из банка данных белков Векеагсй Со11аЬога1огу Гог 81гис1ига1 ВютГогтаЦсК Рго1ет Иа1а Вапк (РЭВ). РЭВ имеет свободный доступ через Интернет (тетете) и описан Вегтап е! а1. (2000), Иис1е1с АсИк Векеагсй, р. 235-242. Последовательности зародышевой линии, которые упоминаются в данном описании, являются общедоступными, например в базе данных последовательностей Национального центра информации по биотехнологии (№11юпа1 Сеп!ег Гог Вю1есйпо1о§у 1пРогта1юп (ИСВ1) в коллекциях V генов 1§11. 1д каппа и 1д лямбда зародышевой линии (отделение Национальной медицинской библиотеки (№1юпа1 ЫЬгагу оГ МеФсте, ИЬМ) при Национальном институте здоровья (Иа1юпа1 1п8Й1и1е8 оГ НеаИй (ΝΙΗ))). Поиск гомологий в базе данных ИСВ1 1д Сегтйпе Сепек обеспечивается 1дС ВЬА8Т™.

В примере варианта изобретения гуманизированное антитело по настоящему изобретению содержит (ί) лёгкую цепь, содержащую вариабельный домен, включающий мышиные 12А11 УБ СИВ области и человеческий акцепторный каркасный участок, причём в каркасном участке имеется ноль, один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или более остатков, заменённых на соответствующий остаток 12А11, и (ίί) тяжёлую цепь, содержащую 12А11 УБ СИВ области и человеческий акцепторный каркасный участок, причём в каркасном участке имеется по меньшей мере один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или более остатков, заменённых на соответствующий остаток 12А11, и, необязательно, по меньшей мере один, предпочтительно два или три остатка, замещённых на соответст вующий остаток человеческой зародышевой линии.

В другом примере варианта изобретения гуманизированное антитело по настоящему изобретению содержит (ί) лёгкую цепь, содержащую вариабельный домен, включающий мышиные 12А11 УЬ СЭР области и человеческий акцепторный каркасный участок, причём в каркасном участке имеется по меньшей мере один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или более остатков, полученных в результате обратной мутации (т.е. заменённых на соответствующий остаток 12Α11), причём обратная(ые) мутация(и) в канонических остатках, остатках упаковки и/или в вернье-остатках, и (ίί) тяжёлую цепь, содержащую 12А11 УЪ СОЯ области и человеческий акцепторный каркасный участок, причём в каркасном участке имеется по меньшей мере один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или более остатков обратной мутации, причём обратная(ые) мутация(и) в канонических остатках, остатках упаковки и/или в вернье-остатках. В некоторых вариантах изобретения обратные мутации только в остатках упаковки и/или канонических остатках или, главным образом, в канонических остатках и/или остатках упаковки (например, только 1 вернье-остаток или 2 вернье-остатка из вернье-остатков, различающихся между донорной и акцепторной последовательностью, получен обратной мутацией).

В других вариантах изобретения гуманизированные антитела включают наименьшее число обратных мутаций, возможных при сохранении аффинности связывания, сравнимой с аффинностью связывания донорного антитела (или его химерной версии). Для того чтобы прийти к таким версиям (вариантам), можно исключить различные комбинации обратных мутаций, а полученные антитела проверить на эффективность (например, аффинность связывания). Например, обратные мутации (например, 1, 2, 3 или 4 обратные мутации) в вернье-остатках можно исключить или обратные мутации в комбинациях вернье и упаковки, вернье и канонических или упаковки и канонических можно исключить.

В другом варианте изобретения гуманизированное антитело по настоящему изобретению имеет структурные признаки по данному описанию и дополнительно имеет по меньшей мере одну (предпочтительно две, три, четыре или все) из следующих активностей: (1) связывает растворимый Αβ; (2) связывает агрегированный Αβ1-42 (например, по определению ЕЫ8Л); (3) захватывает растворимый Αβ; (4) связывает Αβ в бляшках (например, окрашивание ΑΌ и/или ΡΌΑΡΡ бляшек); (5) связывается с Αβ с аффинностью не меньшей аффинности, в два-три раза более низкой, чем аффинность химерного 12А11 (например, 12А11, имеющего последовательности мышиной вариабельной области и последовательности человеческой константной области); (6) опосредует фагоцитоз Αβ (например, в ех νίνο анализе на фагоцитоз по данному описанию) и (7) проникает через гематоэнцефалический барьер (например, наблюдается кратковременная локализация в мозгу на животной модели ΡΌΑΡΡ по данному описанию).

В другом варианте изобретения гуманизированное антитело по данному изобретению имеет структурные признаки по данному описанию, так что оно связывает Αβ таким образом или с аффинностью, достаточной, чтобы выявить по меньшей мере один из следующих ίη νίνο эффектов: (1) снижение предрасположенности к образованию (количества, содержания) Αβ бляшек; (2) предупреждение образования бляшек; (3) снижение уровней растворимого Αβ; (4) снижение нейритной патологии, связанной с амилоидогенным нарушением; (5) уменьшение или облегчение по меньшей мере одного физиологического симптома, обусловленного амилоидогенным нарушением; и/или (6) улучшение когнитивной функции.

В другом варианте изобретения гуманизированное антитело по данному изобретению имеет структурные особенности по данному описанию и специфично связывается с эпитопом, содержащим остатки 3-7 Αβ.

Ещё в одном варианте изобретения гуманизированное антитело по данному изобретению имеет структурные признаки по данному описанию, так что оно связывается с Ν-концевым эпитопом в пределах Αβ (например, связывается с эпитопом в пределах аминокислот 3-7 Αβ) и способно снижать (1) уровни Αβ пептида; (2) предрасположенность к образованию (количество, содержание) Αβ бляшек и (3) нейритную нагрузку или нейритную дистрофию, связанную с амилоидогенным нарушением.

Активности, описанные выше, можно определять, применяя любой из ряда анализов по данному описанию или описанных в уровне техники (например, анализы связывания, анализы на фагоцитоз и т.д.). Активности можно анализировать либо ίη νίνο (например, с применением меченых аналитических компонентов и/или методов визуализации), либо ίη νίίτο (например, используя пробы или образцы, взятые у субъекта). Активности можно анализировать либо непосредственно, либо опосредованно. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения анализируют нейрологические показатели (конечные точки), например амилоидная нагрузка, нейритная нагрузка и т.д.. Такие показатели можно анализировать в живых субъектах (например, на животных моделях болезни Альцгеймера или на людях, например, проходящих иммунотерапию), используя методы неинвазивного обнаружения. Или же такие показатели можно анализировать в субъектах рой тойет (посмертно). Анализ таких показателей на животных моделях и/или на людях рой то Пет применим при оценке эффективности различных агентов (например, гуманизированных антител) для аналогичного применения в иммунотерапии. В других предпочтительных вариантах изобретения поведенческие или нейрологические характеристики можно оценивать как индикаторы вышеуказанных нейропатологических активностей или показателей (конечных точек).

-21 012407

3. Получение вариабельных областей.

Если мысленно выбирать СБ К и каркасные компоненты гуманизированных иммуноглобулинов, множество методов годится для получения таких иммуноглобулинов. В общем, один или более мышиных гипервариабелъных участков (областей) (СБК) тяжёлой и/или лёгкой цепи антитела можно гуманизировать, например помещать в окружение одной или более человеческих каркасных областей с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР, РСК) с применением праймеров. Коротко говоря, создают праймеры, способные отжигаться (связываться) с нацеленным(и) мышиным(и) СБК участком(ами), которые также содержат последовательность, перекрывающую человеческую каркасную область и способную с ней отжигаться (связываться). Соответственно, в подходящих условиях праймеры могут амплифицировать мышиный СБК при использовании матричной нуклеиновой кислоты, кодирующей мышиное антитело, и добавлять к амплифицированной матрице участок человеческой каркасной последовательности. Аналогично, можно создать праймеры, способные связываться (отжигаться) с нацеленной(ыми) человеческой(ими) каркасной(ыми) областью(ями), при этом реакция ПЦР с применением этих праймеров приводит к амплифицировнной(ым) человеческой(им) каркасной(ым) области(ям). Если каждый продукт амплификации затем денатурировать, объединить и отжечь с другим продуктом, мышиный СБК участок, перекрывающийся с человеческой каркасной последовательностью с амплифицированной человеческой каркасной последовательностью, может быть генетически связан. Соответственно, в одной или более таких реакций один или более мышиных СБК можно генетически связать с имеющимися человеческими каркасными областями.

В некоторых вариантах изобретения праймеры могут также содержать нужные последовательности, распознаваемые рестриктазами, для того, чтобы облегчить сборку результирующих ПЦРамплифицированных последовательностей методом рекомбинантной ДНК (генетической инженерии) в генетический сегмент большего размера, например вариабельный сегмент лёгкой или тяжёлой цепи, тяжёлую цепь или вектор. Кроме того, праймеры, применяемые для амплификации либо мышиных СБК участков, либо человеческих каркасных областей, могут иметь нужные ошибочные спаривания (несовпадения), так что в мышиный СБК или в человеческую каркасную область вводится другой кодон. Типичные ошибочные спаривания вводят изменения в человеческие каркасные области, которые сохраняют или улучшают структурную ориентацию мышиного СБК и, тем самым, аффинность связывания по данному описанию.

Следует понимать, что вышеописанный способ можно использовать для введения одного, двух или всех трёх мышиных СБК участков в имеющееся окружение человеческих каркасных областей. Методы амплификации и связывания различных последовательностей с применением ПЦР с праймерами описаны, например, в 8атЬгоок, Вгйксй апб Машайк, Мо1еси1аг С1ошпд: Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк (1989): ΌΝΑ С1ошпд, уо1к. 1 апб 2, (Ό.Ν. О1оуег, Еб. 1985); РСК НапбЬоок Сиггеп! Рго!осо1к ш ШсЮс Ас1б Сйет1к!гу, Веаисаде, Еб., Ло11п Айеу&8опк (1999); Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, ебк. АикиЬе1 е! а1., 1ойп А11еу&8опк (1992).

Вследствие вырожденности генетического кода различные нуклеотидные последовательности кодируют каждую аминокислотную последовательность иммуноглобулина. Нужные нуклеотидные последовательности можно получать с помощью бе поуо твердофазного синтеза ДНК или ПЦР мутагенеза ранее полученного варианта нужного полинуклеотида. Опосредованный олигонуклеотидами мутагенез является предпочтительным методом получения вариантов с заменами, делециями и инсерциями ДНК целевых полипептидов. См. Абе1тап е! а1., ΌΝΑ 2:183 (1983). Коротко говоря, ДНК целевого полипептида изменяют гибридизацией олигонуклеотида, кодирующего нужную мутацию, с однотяжевой (одноцепочечной) ДНК матрицей. После гибридизации используют ДНК-полимеразу для синтеза полной второй комплементарной цепи матрицы, которая вводит олигонуклеотидный праймер и кодирует выбранное изменение в ДНК целевого полипептида.

4. Выбор константных областей.

Вариабельные сегменты антител, полученных по вышеприведённому описанию (например, вариабельные области тяжёлой и лёгкой цепей химерных или гуманизированных антител), как правило, связываются, по меньшей мере, с участком константной области иммуноглобулина (Вс), обычно константной области человеческого иммуноглобулина. Последовательности ДНК человеческой константной области можно выделять по общеизвестным методикам из различных человеческих клеток, но предпочтительно из иммортализованных В-клеток (КаЬа! е! а1., см. выше, и Ыи е! а1., Международная заявка АО87/02671) (каждый из этих материалов вводится ссылкой во всей полноте для всех целей). Обычно антитело содержит константные области как лёгкой, так и тяжёлой цепей. Константная область тяжёлой цепи обычно включает СН1, шарнирную, СН2, СН3 и СН4 области. Антитела по данному описанию включают антитела, имеющие все типы константных областей, включая 1дМ, 1дО, 1дБ, 1дА и 1дЕ, и любые изотипы, включая 1дО1, 1§С2, 1дС3 и 1дО4. Если нужно, чтобы антитело (например, гуманизированное антитело) проявляло цитотоксическую активность, константный домен обычно представляет собой фиксирующий комплемент класса, как правило, 1дС. Предпочтительным является человеческий изотип ЦС1. Константные области лёгкой цепи могут быть лямбда или каппа. Гуманизированное антитело может содержать последовательности более чем одного класса или изотипа. Антитела могут экспрессиро ваться в виде тетрамеров, содержащих две лёгких и две тяжёлых цепи, в виде отдельных тяжёлых цепей, лёгких цепей, в виде ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')₂ и Εν или в виде одноцепочечных антител, в которых вариабельные домены тяжёлой и лёгкой цепей связаны через спейсер.

5. Экспрессия рекомбинантных антител.

Химерные и гуманизированные антитела обычно получают рекомбинантной экспрессией. Нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельные области лёгкой и тяжёлой цепей, необязательно, связанные с константными областями, встраивают в векторы экспрессии. Лёгкую и тяжёлую цепи можно клонировать в одни и те же или в различные экспрессирующие векторы. ДНК сегменты, кодирующие цепи иммуноглобулина, функционально связаны с контролирующими (экспрессию) последовательностями в экспрессирующем(их) векторе(ах), которые обеспечивают экспрессию полипептидов иммуноглобулина. Последовательности, контролирующие экспрессию, включают, но без ограничения, промоторы (например, связанные с природными или гетерологичные промоторы), сигнальные последовательности, энхансерные элементы и последовательности терминации транскрипции. Предпочтительно последовательности, контролирующие экспрессии, представляют собой промоторные системы эукариот в векторах, способные трансформировать или трансфецировать эукариотические клетки-хозяева (например, С08 клетки). Когда вектор введён в подходящего хозяина, хозяин сохраняется в условиях, пригодных для экспрессии высоких уровней нуклеотидных последовательностей, и сбора, и очистки перекрёстнореактивных антител.

Эти экспрессирующие векторы обычно реплицируются в организмах хозяев либо в виде эписом, либо в виде составной части хромосомной ДНК хозяина. Обычно экспрессирующие векторы (векторы экспрессии) содержат селективные маркёры (например, резистентности (устойчивости) к ампициллину, резистентности к гигромицину, резистентности к канамицину и резистентности к неомицину) для обнаружения клеток, трансформированных заданными последовательностями ДНК (см., например, Пакша е1 а1., патент США 4704362).

Е.со11 являются одними из прокариотических клеток-хозяев, особенно применимых для клонирования полинуклеотидов (например, последовательностей ДНК) по настоящему изобретению. Другие микробные хозяева для применения включают бациллы, такие как ВасШик киЬП1ик, и другие энтеробактерии, такие как 8а1топе11а, 8еггаПа и различные виды Ркеиботопак. В этих прокариотических хозяевах можно также получать экспрессирующие векторы, которые, как правило, содержат последовательности, контролирующие экспрессию, совместимые с клеткой-хозяином (например, ориджин репликации). Кроме того, присутствует некоторое количество из множества общеизвестных промоторов, таких как промоторная система лактозы, промоторная система триптофана (Пр), промоторная система бета-лактамазы или промоторная система фага лямбда. Промоторы, как правило, контролируют экспрессию, необязательно с использованием операторной последовательности, и имеют последовательности сайта связывания рибосом и т. п. для инициации и завершения транскрипции и трансляции.

Другие микробы, такие как дрожжи, также применимы для экспрессии. Клетки дрожжей 8ассПаготусек являются предпочтительными клетками-хозяевами с использованием подходящих векторов, содержащих последовательности, контролирующие экспрессию (например, промоторы), ориджин репликации, последовательности терминации и т.п., по желанию. Типичные промоторы включают 3-фосфоглицерат киназу и другие гликолитические ферменты. Индуцибельные дрожжевые промоторы включают, среди прочего, промоторы из алкогольдегидрогеназы, изоцитохрома С и ферментов, отвечающих за утилизацию мальтозы и галактозы.

Помимо микроорганизмов, для экспрессии и продуцирования полипептидов по настоящему изобретению (например, полинуклеотидов, кодирующих иммуноглобулины или их фрагменты) можно также использовать культуру тканевых клеток млекопитающих. См. ХУтпаскег. Егот Се пек 1о С1опек, УСН РиЬПкПегк, КУ., КУ. (1987). На самом деле предпочтительными являются клетки эукариот, так как в уровне техники получен ряд подходящих клеток-хозяев, способных секретировать гетерологичные белки (например, интактных иммуноглобулинов), они включают СНО клеточные линии, различные клеточные линии С08, клетки НеЬа, предпочтительно клеточные линии миеломы, или трансформированные Вклетки, или гибридомы. Предпочтительно клетки не являются человеческими клетками. Экспрессирующие векторы для этих клеток могут включать последовательности, контролирующие экспрессию, такие как ориджин репликации, промотор и энхансер (Спеем е1 а1., Iттиηο1. Пет. 89:49 (1986)), и необходимые сайты информации о процессинге, такие как сайты связывания рибосом, сайты сплайсинга при образовании РНК и последовательности терминации транскрипции. Предпочтительными последовательностями, контролирующими экспрессию, являются промоторы из генов иммуноглобулинов, 8У40, аденовируса, вируса бычьей папилломы, цитомегаловируса и т.п. Со е1 а1., 1. Тттипок 148:1149(1992).

Или же кодирующие антитело последовательности можно встраивать в трансгены для введения в геном трансгенного животного и последующей экспрессии в молоке трансгенного животного (см., например, ЭеЬоег е1 а1., патент США 5741957, Кокеп, патент США 5304489 и МеаПе е1 а1., патент США 5849992). Подходящие трансгены включают кодирующие последовательности для лёгкой и/или тяжёлой цепей, функционально связанные с промотором и энхансером из специфичного гена желез млекопитающих, такого как казеин или бета-лактаглобулин.

-23 012407

Или же антитела (например, гуманизированные антитела) по изобретению могут продуцироваться в трансгенных растениях (например, в табаке, кукурузе, сое и люцерне). Усовершенствованные векторы растительных антител (р1апйЬойу) (Непйу е1 а1. (1999), ί. 1шшипо1. Ме11юЙ5 231:137-146) и стратегии очистки в сочетании с увеличением трансформируемых видов сельскохозяйственных культур сделают эти методы практическими и эффективными способами получения рекомбинантных иммуноглобулинов не только для терапии человека и животных, но также для промышленного применения (например, каталитические антитела). Кроме того, показано, что антитела, продуцируемые в растениях, безопасны и эффективны и позволяют избежать применения животных материалов и, следовательно, риска комбинации с агентом трансмиссивной губкообразной энцефалопатии (Т8Е). Кроме того, различия типов гликозилирования растительных антител и антител, продуцированных в клетках млекопитающих, оказывают малое влияние или не оказывают никакого влияния на связывание антигена или специфичность. Кроме того, нет доказательства токсичности или наблюдаемых НАМА у пациентов, получающих местно перорально растительное секреторное димерное ΙβΑ антитело (см. Ьаглск е1 а1. (1998), Ке8. 1шшипо1. 149:603-608).

Для экспрессии рекомбинантных антител в трансгенных растениях можно применять различные методы. Например, тяжёлую и лёгкую цепи антитела можно независимо клонировать в экспрессирующие векторы (например, векторы ЛдгоЬасЮгшп ШшеГааепк) с последующей трансформацией растительной ткани 1п ν 11го с использованием рекомбинантной бактерии или непосредственной трансформацией, используя, например, частицы, покрытые векторами, которые затем физически вводят в растительную ткань, используя, например, баллистику. Затем целые растения, экспрессирующие отдельные цепи, восстанавливают с последующим их половым скрещиванием, что приводит, наконец, к продуцированию полностью собранного и функционального антитела. Аналогичные протоколы использованы для экспрессии функциональных антител в растениях табака (см. ΗίηΙΙ е1 а1. (1989), ЫаШге 342:76-87). В различных вариантах изобретения могут использоваться сигнальные последовательности для промотирования экспрессии, связывания и скручивания цепей несобранного антитела направлением цепей в соответствующую растительную среду (например, водную среду апоплазмы или других специфических растительных тканей, включая клубень, плод или семя) (см. Р1ей1ег е1 а1. (1995), Вю/ТесЬпо1оду, 13:1090-1093). Растительные биореакторы можно также использовать для повышения выхода антител и для значительного снижения стоимости.

Векторы, содержащие полинуклеотидные последовательности, представляющие интерес (например, последовательности, кодирующие тяжёлую и лёгкую цепи, и последовательности, контролирующие экспрессию), можно перенести в клетку-хозяина общеизвестными методами, которые меняются в зависимости от типа клетки-хозяина. Например, трансфекцию с помощью хлористого кальция обычно используют для прокариотических клеток, тогда как обработку фосфатом кальция, электропорацию, липофекцию, метод бомбардировки микрочастицами или вирусную трансфекцию можно использовать для других клеток-хозяев (см. в общем ЗашЬгоок е1 а1., Мо1еси1аг С1ошпд: Α ЬаЬога1огу Мапиа1. Со1й Зрппд НагЬог Рге§8, 2^пй ей., (1989), вводится в данное описание ссылкой во всей полноте для всех целей). Другие способы, применяемые для трансформации клеток млекопитающих, включают применение полибрена, слияние протопластов, липосомы, электропорацию и микроинъекцию (общие сведения ЗашЬгоок е1 а1., см. выше). Для получения трансгенных животных трансгены можно микроинъецировать в оплодотворённые ооциты или можно включить в геном стволовых клеток эмбриона, ядра таких клеток переносят в безъядерные ооциты.

Если тяжёлую и лёгкую цепи клонируют в различных экспрессирующих векторах, векторы котрансфецируют, чтобы экспрессировать и собрать интактные иммуноглобулины. После экспрессии целые антитела, их димеры, отдельные лёгкие и тяжёлые цепи или другие формы иммуноглобулинов по настоящему изобретению можно очищать стандартными методами, известными в уровне техники, включая осаждение сульфатом аммония, аффинную хроматографию на колонке, колоночную хроматографию, очистку методом ВЭЖХ, электрофорез в геле и т.п. (см. в общем 8соре§, Рго1ею РигШсайоп, ЗрппдегУег1ад, Ν.Υ., (1982)). Для фармацевтических целей предпочтительными являются практически чистые иммуноглобулины с гомогенностью по меньшей мере 90-95%, наиболее предпочтительно с гомогенностью 98-99% или выше.

6. Фрагменты антител.

Также в объёме настоящего изобретения рассматриваются фрагменты антител. В одном варианте изобретения охватываются фрагменты нечеловеческих и/или химерных антител. Обычно эти фрагменты проявляют специфическое связывание с антигеном с аффинностью по меньшей мере 10⁷ и более обычно 10⁸ или 10⁹ М^-1. Фрагменты гуманизированного антитела включают отдельные тяжёлые цепи, лёгкие цепи, РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')₂, РаЬс и Εν. Фрагменты получают методами рекомбинантной ДНК или ферментативным или химическим делением иммуноглобулинов.

-24 012407

7. Эпитопное картирование.

Для того чтобы определить, какая антигенная детерминанта или эпитоп Αβ распознаётся антителом, можно осуществить эпитопное картирование. В одном варианте изобретения эпитопное картирование осуществляют в соответствии с анализом Кер1асетеШ ΝΕΤ (гИЕТ). Анализ эпитопной карты гИЕТ даёт информацию о вкладе отдельных остатков в пределах эпитопа в общую активность связывания антитела. В гИЕТ анализе используются синтезированные систематические однозамещённые (с единственной заменой) пептидные аналоги. Связывание тестируемого антитела определяют против нативного пептида (нативный антиген) и против 19 альтернативных однозамещённых пептидов, причём в каждом пептиде имеется замена в первом положении на одну из 19 ненативных для этого положения аминокислот. Получают профиль, отражающий влияние замены в этом положении на различные ненативные остатки. Таким образом получают профили в последовательных положениях вдоль антигенного пептида. Объединённый профиль, или эпитопную карту (отражающую замену в каждом положении на все 19 ненативных остатков), можно затем сравнить с картой, созданной подобным образом, для второго антитела. Практически аналогичные или идентичные карты указывают на то, что сравниваемые антитела имеют одинаковую или сходную эпитопную специфичность.

8. Тестирование антител на терапевтическую эффективность на животных моделях.

Каждой мыши из групп 7-9-месячных мышей ΡΌΑΡΡ инъецируют по 0,5 мг поликлональных антител против Αβ или специфичных моноклональных антител против Αβ в ΡΒ8. Все препараты антител очищают так, чтобы они имели низкие уровни эндотоксина. Моноклональные антитела можно получать против фрагмента, инъецируя мыши фрагмент или более протяжённую форму Αβ, получая гибридомы и проводя скрининг гибридом на антитело, которое специфично связывается с нужным фрагментом Αβ, не связываясь с другими неперекрывающимися фрагментами Αβ.

Мышей инъецируют интраперитонеально, как требуется, через 4 месяца для поддержания в кровотоке концентрации антител, определяемой титром ЕЕ-ЬА, более 1/1000 от определённого методом ЕЕ-ЬА, к Αβ42 или другому иммуногену. Титры контролируют и мышей умерщвляют к концу 6 месяцев после инъекций. Гистохимические показатели, уровни Αβ и токсикологические показатели определяют роЧ тойет. В группе имеется десять мышей.

9. Скрининг антител на активность очищения.

Изобретение также включает способы скрининга антитела на активность очищения от амилоидного отложения, или любого другого антигена, или ассоциированного биологического организма, для которого требуется активность очищения. Для скрининга на активность против амилоидного отложения образец ткани мозга больного болезнью Альцгеймера или животной модели с патологией, характерной для болезни Альцгеймера, контактирует с фагоцитарными клетками, несущими Гс-рецептор, такими как микроглиальные клетки, и испытуемым антителом в среде ίη νίΙΐΌ. Фагоцитарные клетки могут быть первичной культурой или клеточной линией и могут быть мышиного (например, клетки ВУ-2 или С8-В4) или человеческого происхождения (например, клетки ТНР-1). В некоторых способах компоненты объединяют в одном микроскопическом препарате для упрощения мониторинга микроскопических исследований. В некоторых способах в лунках микротитрационного планшета проводят серийные реакции. В таком формате отдельные миниатюрные микроскопические препараты можно помещать в отдельные лунки или можно использовать немикроскопический формат детектирования, такой как детектирование Αβ методом ЕМЗЛ. Предпочтительно делают ряд измерений количества амилоидного отложения в ίη νίΙΐΌ реакционной смеси, начиная с исходного значения до начала реакции, и в ходе реакции делают одно или более измерений. Антиген можно обнаруживать окрашиванием, например, с помощью меченого флуоресцентной меткой антитела к Αβ или другому компоненту амилоидных бляшек. Антитело, используемое для окрашивания, может быть или может не быть тем же самым, что и антитело, тестируемое на (очищающую) активность очищения. Уменьшение амилоидных отложений относительно начальной линии показывает, что испытуемое антитело обладает очищающей активностью. Такие антитела, повидимому, применимы для предупреждения или лечения болезни Альцгеймера и других амилоидогенных заболеваний. Антитела, особенно применимые для предупреждения или лечения болезни Альцгеймера и других амилоидогенных заболеваний, включают антитела, способные очищать (осветлять) как компактные, так и диффузные амилоидные бляшки, например антитело 12А11 по настоящему изобретению или его химерные или гуманизированные варианты.

Аналогичные методы можно применять для скрининга антител на активность клиринга (очищения, осветления) других типов биологических объектов (организмов). Анализ можно использовать для обнаружения активности очищения фактически от любого вида биологических организмов. Как правило, биологический организм играет некоторую роль в болезни человека или животного. Биологический объект (организм) может быть в виде тканевых образцов или в изолированной (выделенной) форме. Если биологический организм находится в виде тканевого образца, то он предпочтительно не фиксирован, для того чтобы обеспечить свободный доступ к компонентам тканевого образца и для того чтобы избежать нарушения конформации компонентов, сопутствующего фиксации. Примеры тканевых образцов, которые можно тестировать в данном анализе, включают раковые ткани, предраковые ткани, ткани, содер жащие доброкачественные опухоли, такие как бородавки или родимые пятна, ткани, инфицированные патогенными микроорганизмами, ткани, инфильтрированные воспалительными клетками, ткани, несущие патологические матрицы в межклеточном пространстве (например, фибринозный перикардит), ткани, несущие аберрантные антигены, и рубцовые ткани.

Примеры выделенных биологических объектов (организмов), которые можно использовать, включают Ав, вирусные антигены или вирусы, протеогликаны, антигены других патогенных микроорганизмов, опухолевые антигены и адгезивные молекулы. Такие антигены можно получать, среди прочего, из природных источников, рекомбинантной экспрессией или химическим синтезом. Тканевый образец или выделенный биологический объект контактирует с фагоцитарными клетками, несущими Ес-рецепторы, такими как моноциты или микроглиальные клетки, и испытуемым антителом в среде. Антитело можно направлять на испытуемый биологический объект или на антиген, ассоциированный с объектом. В последнем случае целью испытания является определить, фагоцитируется ли объект антигеном. Обычно, хотя не обязательно, антитело и биологический объект (иногда с ассоциированным антигеном) контактируют друг с другом перед добавлением к фагоцитарным клеткам. Затем проводят мониторинг концентрации биологического объекта и/или (если он присутствует) ассоциированного антигена, остающегося в среде. Снижение количества или концентрации антигена или ассоциированного биологического объекта в среде показывает, что наблюдается осветляющий (очищающий) ответ антитела против антигена и/или ассоциированного биологического объекта в сочетании с фагоцитарными клетками.

10. Химерные/гуманизированные антитела с изменённой эффекторной функцией.

Для вышеописанных антител по изобретению, содержащих константную область (Ес-область) может быть также желательно изменить эффекторную функцию молекулы. Как правило, эффекторная функция антитела находится в константной, или Ес, области молекулы, которая может опосредовать связывание с различными эффекторными молекулами, например белками комплемента или Ес-рецепторами. Связывание комплемента с Ес является важным, например, при опсонизации и лизисе клеточных патогенов и активации воспалительных реакций. Связывание антитела с Ес-рецепторами, например, на поверхности эффекторных клеток может включать ряд важных и разнообразных биологических реакций (ответов), включая, например, поглощение и деструкцию покрытых антителом патогенов или частиц, клиренс иммунных комплексов, лизис покрытых антителом клеток-мишеней киллерными клетками (т.е. антителозависимая клеточная цитотоксичность, или АЭСС), высвобождение воспалительных медиаторов, перенос антител через плаценту и контроль продуцирования иммуноглобулина.

Соответственно, в зависимости от конкретного терапевтического или диагностического применения могут быть желательны вышеупомянутые иммунные функции или только выбранные иммунные функции. Путём изменения Ес-области антитела достигаются различные аспекты эффекторной функции молекулы, включая усиление или подавление различных реакций иммунной системы, при положительных эффектах в диагностике и терапии.

Можно получать антитела по изобретению, которые реагируют только с определёнными типами Есрецепторов, например, с помощью делеции или изменения сайта связывания с Ес-рецептором, расположенного в Ес-области антитела, антитела по изобретению можно модифицировать таким образом, чтобы они связывались только с определёнными Ес-рецепторами или, по желанию, чтобы совершенно отсутствовало Ес-рецепторное связывание,. Другие желательные изменения Ес-области антитела по изобретению перечислены ниже. Как правило, номенклатуру КаЬа! используют для того, чтобы показать, какой(ие) аминокислотный(ые) остаток(ки) Ес-области (например, ^С антитела) изменяют (например, с помощью аминокислотной замены), чтобы достичь нужного изменения эффекторной функции. Номенклатуру также используют для сравнения антител на протяжении вида так, чтобы нужную эффекторную функцию, наблюдаемую, например, в мышином антителе, затем можно было систематически ввести в человеческое, гуманизированное или химерное антитело по изобретению.

Например, наблюдалось, что антитела (например, ^С антитела) можно разделить на группы, которые, как было найдено, проявляют прочное, промежуточное или слабое связывание с Ес-рецептором (например, Ес-рецептором на человеческих моноцитах (ЕсуК1). Путём сравнения аминокислотных последовательностей в различных группах аффинности был идентифицирован моноцитсвязывающий сайт в области шарнирного звена (Ьеи234-8ег239). Более того, человеческий ЕсуК! рецептор связывается с человеческим ^С1 и мышиным ^С2а в качестве мономера, но связывание мышиного ^С2Ь в 100 раз слабее. Сравнение последовательности этих белков в области шарнирного звена показывает, что последовательность от 234 до 238, т.е. Ьеи-Ьеи-С1у-С1у-Рго (8ΕΟ ΕΌ N0:32) в сильных связующих становится Ьеи-С1и-С1у-С1у-Рго (8Ε0 Ш N0:33) в мышином гамма 2Ь, т.е. слабым связующим. Следовательно, если требуется пониженное ЕсуК! рецепторное связывание, можно сделать соответствующее изменение в человеческой шарнирной последовательности. Понятно, что для достижения таких же или аналогичных результатов можно сделать другие изменения. Например, аффинность ЕсуК! рецепторного связывания можно изменить, заменяя конкретный остаток на остаток с неадекватной функциональной группой в его боковой цепи или путём введения несущей заряд функциональной группы (например, С1и или Азр) или, например, ароматического неполярного остатка (например, Р1е, Туг или Тгр).

-26 012407

Эти изменения равным образом можно применить к мышиной, человеческой системам или системе крысы при условии гомологии последовательностей между различными иммуноглобулинами. Показано, что для человеческого 1дС, который связывается с человеческим РсуК1 рецептором, замена Ьеи 235 на С1и нарушает взаимодействие мутанта с рецептором. Таким образом, сайт связывания с этим рецептором может включаться и выключаться с помощью соответствующей мутации.

Мутации в прилегающих или близких сайтах в области шарнирного звена (например, замены остатков 234, 236 или 237 на А1а) показывают, что изменения в остатках 234, 235, 236 или 237, по меньшей мере, влияют на аффинность к РсуК1 рецептору. Следовательно, антитела по изобретению могут также содержать изменённую по сравнению с немодифицированным антителом Рс-область с изменённой Рс аффинностью связывания с РсуК1 рецептором. Такое антитело обычно имеет модификацию в аминокислотном остатке 234, 235, 236 или 237).

Подобным образом можно менять аффинность к другим Рс-рецепторам для регулирования иммунного ответа различными способами.

В качестве дополнительного примера литические свойства ЦС антител после связывания С1 компонента комплемента могут изменяться.

Первый компонент системы комплемента С1 содержит три белка, известных как С1ц. С1г и С1к, которые прочно связаны вместе. Показано, что Ск| ответственен за связывание комплекса из трёх белков с антителом.

Следовательно, Ск|-связывающую активность антитела можно изменять, вводя в антитело изменённый СН2 домен, в котором по меньшей мере один из аминокислотных остатков 318, 320 и 322 тяжёлой цепи заменён на остаток с отличной боковой цепью. Нумерация (номенклатура) остатков в тяжёлой цепи - это номенклатура ЕЙ указателя (см. выше КаЬа! е! а1.). Другие подходящие замены с целью изменения, например ослабления или уничтожения специфического С1д-связывания, включают замену любого из остатков 318 (С1и), 320 (Ьук) и 322 (Ьук) на А1а.

Кроме того, с помощью мутаций в этих остатках было показано, что Ск|-связывание сохраняется до тех пор, пока в остатке 318 имеется боковая цепь, связывающаяся водородной связью, а боковая цепь в обоих остатках, 320 и 322, имеет положительный заряд.

Ск|-связывающую активность можно упразднить заменой любого из трёх специфичных остатков на остаток с неподходящей функциональностью в боковой цепи. Не обязательно заменять ионные остатки только на А1а для уничтожения Ск|-связывания. Также можно использовать другие алкилзамещённые неионные остатки, такие как С1у, 11е, Ьеи или Уа1, или такие ароматические неполярные остатки, как Рйе, Туг, Тгр и Рго, вместо любого из трёх остатков, чтобы отменить Ск|-связывание. Кроме того, можно также использовать такие неионные полярные остатки, как 8ет, Тйт, Сук и Ме! вместо остатков 320 и 322, но не 318, чтобы упразднить Ск|-связывающую активность.

Отмечается также, что ионные или неионные полярные остатки боковых цепей способны образовывать водородные связи аналогично связям, образуемым остатком С1и. Следовательно, замена остатка 318 (С1и) на полярный остаток может модифицировать, но не уничтожить Ск|-связывающую активность.

Известно также, что замена остатка 297 (Акп) на А1а приводит к исчезновению литической активности, в то же время лишь немного снижая (ослабляя примерно в три раза) аффинность к Ск|. Это изменение аннулирует сайт гликозилирования и присутствие углевода, требующееся для активации комплемента. Любая другая замена в этом сайте также нарушает сайт гликозилирования.

Данное изобретение также включает антитело с изменённой эффекторной функцией, причём антитело содержит модифицированную шарнирную область. Модифицированная шарнирная область может представлять собой полную шарнирную область из СН1 домена антитела другого класса или подкласса. Например, константный домен (СН1) антитела класса 1дС может быть связан с шарнирной областью антитела класса 1дС4. Или же новая шарнирная область может содержать часть природного шарнира или повторяющуюся структурную единицу (повторяющееся звено), в которой каждая единица повтора образована из природной шарнирной области. В одном примере природную шарнирную область изменяют, превращая один или более цистеиновых остатков в нейтральный остаток, такой как аланин, или превращая соответствующим образом расположенные остатки в цистеиновые остатки. Такие замены проводят с применением методов, известных в химии белков, и предпочтительно методами рекомбинантной ДНК, по данному описанию.

В одном варианте изобретения число цистеиновых остатков в шарнирной области антитела уменьшают, например, до одного. Эта модификация имеет то преимущество, что упрощает сборку антитела, например молекул биспецифического антитела, и молекул антитела, в которых Рс участок заменён на эффекторную или репортёрную молекулу, так как он необходим только для образования единичной дисульфидной связи. Эта модификация также обеспечивает специфическую мишень для связывания шарнирной области либо с другой шарнирной областью, либо с эффекторной или репортёрной молекулой, непосредственно или опосредованно, например, химическими способами.

Напротив, число цистеиновых остатков в шарнирной области антитела увеличивают, например, по меньшей мере на один по сравнению с числом обычно имеющихся цистеиновых остатков. Увеличение числа цистеиновых остатков можно использовать для стабилизации взаимодействия между прилегающими шарнирами. Другим преимуществом этой модификации является то, что она облегчает применение тиольных групп цистеина для связывания эффекторных или репортёрных молекул с изменённым антителом, например с радиоактивной меткой.

Следовательно, изобретение включает обмен шарнирными областями между классами антител, в частности 1§С классами, и/или увеличение или уменьшение числа цистеиновых остатков в шарнирной области для получения изменённой эффекторной функции (см., например, патент США 5677425, который специально вводится в данное описание). Определение изменённой эффекторной функции антитела осуществляют методами анализов по данному описанию или другими известными в уровне техники методами.

Важно отметить, что полученное в результате антитело может проверяться одним или более аналитическими методами для оценки любого изменения биологической активности по сравнению с исходным антителом. Например, способность антитела с изменённой Ес-областью связывать комплемент или Есрецепторы можно оценивать методами анализа по данному описанию, а также любым методом анализа, известным в уровне техники.

Получение антител по изобретению осуществляют любым подходящим методом, включая методы по данному описанию, а также методами, известными специалистам в данной области техники. Так, можно синтезировать подходящую белковую последовательность, например образующую часть релевантного константного домена или целый релевантный домен, например Ес-область, т.е. СН2 и/или СН3 домен(ы) антитела, и включающую соответствующим образом изменённый(е) остаток(ки), а затем химически ввести (связать) в подходящее место в молекуле антитела.

Предпочтительно для получения изменённого антитела применяют методы рекомбинантной ДНК. Предпочтительные методы включают, например, получение подходящих праймеров для применения в полимеразной цепной реакции (ПЦР) таким образом, чтобы по меньшей мере часть тяжёлой цепи 1дС, например Ес или константная область (например, СН2 и/или СН3), изменялась в одном или более остатков. Затем сегмент можно функционально связывать с остальной частью антитела, например вариабельной областью антитела, и требующимися регуляторными элементами экспрессии в клетке.

Настоящее изобретение также включает векторы, применяемые для трансформации клеточной линии, векторы, применяемые для продуцирования трансформирующих векторов, клеточных линий, трансформированных трансформирующими векторами, клеточных линий, трансформированных препаративными векторами, и методы их получения.

Предпочтительно клеточная линия, трансформированная для продуцирования антитела с изменённой Ес-областью (т.е. изменённой эффекторной функцией), является иммортализованной клеточной линией млекопитающего (например, СНО клетки).

Хотя клеточная линия, используемая для продуцирования антитела с изменённой Ес-областью, предпочтительно является клеточной линией млекопитающего, можно в качестве альтернативы использовать любую другую подходящую клеточную линию, такую как бактериальная клеточная линия или клеточная линия дрожжей.

11. Созревание аффинности.

Антитела (например, гуманизированные антитела) по изобретению можно модифицировать с целью получения улучшенной функции, используя любые методы созревания аффинности. Обычно идентифицируют кандидатную молекулу с аффинностью связывания с данной молекулой-мишенью, а затем дополнительно улучшают или дают созреть методами мутагенеза, получая в результате один или более родственных кандидатов с более желательным связывающим взаимодействием с молекулой-мишенью. Как правило, модифицируется именно аффинность антитела (или авидность, т.е. объединённые аффинности антитела к целевому антигену), однако используя методы созревания аффинности либо отдельно, либо параллельно с аффинностью, можно также модифицировать другие свойства молекулы, такие как устойчивость (стабильность), эффекторная функция, клиренс, секреция или транспортная функция молекул.

В примерах вариантов изобретения аффинность антитела (например, гуманизированного антитела по настоящему изобретению) повышается. Например, антитела, имеющие аффинность связывания по меньшей мере 10⁷, 10⁸ или 10⁹ М^-1, могут в результате созревания иметь аффинность по меньшей мере 10⁹, 10¹⁰ или 10¹² Μ^-1.

Один способ созревания аффинности, связывающей молекулы, представляет собой синтез нуклеиновой кислоты, кодирующей связывающую молекулу, или её часть, которая (нуклеиновая кислота) кодирует нужное изменение или нужные изменения. Синтез олигонуклеотидов общеизвестен в уровне техники и легко автоматизируется для получения одной или более нуклеиновых кислот, имеющих любое(ые) заданное(ые) изменение(я) кодона(ов). Сайты рестрикции, молчащие мутации и применение предпочтительного кодона также можно ввести подобным образом. Или же один или более кодонов можно изменить, чтобы представить субпопуляцию конкретных аминокислот, например субпопуляцию, которая исключает цистеины, способные образовывать дисульфидные связи, и ограничивается определённой областью, например СОЯ областью или её частью. Или же область может быть представлена частично или полностью произвольным (случайным, рандомизированным) набором аминокислот (подробнее см., например, в патентах США 5830650; 5798208; 5824514; 5817483; 5814476; 5723323; 4528266; 4359266; 435953(?); 5840479 и 5869644).

Понятно, что вышеуказанные способы можно осуществлять частично или полностью с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая хорошо известна в технике и имеет преимущество, так как вводит олигонуклеотиды, например праймеры, или одноцепочечные нуклеиновые кислоты, например с заданным(и) изменением(ями), в двухцепочечную нуклеиновую кислоту, и в амплифицированных количествах применима для других манипуляций, таких как методы генетической инженерии в подходящий экспрессирующий или клонирующий вектор. Такую ПЦР можно также проводить в условиях, допускающих ошибку включения нуклеотидов, с целью введения тем самым дополнительной вариабельности в амлифицированные нуклеиновые кислоты. Экспериментальные подробности проведения ПЦР и относящиеся к ней наборы, реагенты и дизайн праймеров можно найти, например, в патентах США 4683202; 4683195; 6040166 и 6096551. Методы введения СЭК областей в каркасные области антитела с помощью ПЦР с применением праймеров описаны, например, в патенте США 5858725. Методы ПЦР амплификации с применением праймеров библиотек антител (и библиотек, полученных этим методом) с применением минимального набора праймеров, способных находить гомологию последовательностей с большим набором молекул антитела, так что можно эффективно амплифицировать больший набор молекул антитела, описаны, например, в патентах США 5780225; 6303313 и 6479243. Можно также использовать неПЦР методы сайт-направленного мутагенеза, они включают Кипке1 мутагенез, который использует однонитевые урацилсодержащие матрицы и праймеры, которые гибридизуются и вводят мутацию при прохождении через штамм Е.со11 (см., например, патент США 4873192).

Дополнительные методы изменения последовательности антитела или его части включают нуклеотидный синтез или ПЦР нуклеиновых кислот в неоптимальных (т. е. склонных к ошибкам) условиях, денатурацию и ренатурацию (отжиг) таких нуклеотидов, расщепление с помощью экзонуклеаз и/или эндонуклеаз с последующей повторной сборкой лигированием или ПЦР (шаффлинг нуклеиновых кислот) или комбинацию одного или более вышеприведённых методов, описанных, например, в патентах США 6440668; 6238884; 6171820; 5965408; 6361974; 6358709; 6352842; 4888286; 6337186; 6165793; 6132970; 6117679;5830721 и 5605793.

В конкретном варианте изобретения библиотеки антител (или библиотеки созревания аффинности), содержащие семейство молекул кандидатных антител, имеющих разнообразие в некоторых участках молекулы кандидатного антитела, например, в одной или более СЭК области (или её части), в одной или более каркасной области и/или в одной или более константной области (например, в константной области, имеющей эффекторную функцию), можно экспрессировать и подвергнуть скринингу на заданные свойства известными методами (см., например, патенты США 6291161; 6291160; 6291159 и 6291158). Например, можно создать экспрессирующие библиотеки вариабельных доменов антител, имеющих разнообразие (множественность) СЭК3 последовательностей, и методы получения библиотек человеческих антител, имеющих разнообразие (множественность) СЭК3 последовательностей, вводя с помощью мутагенеза множественность (разнообразие) СЭК3 последовательностей и восстанавливая библиотеку (см., например, патент США 6248516).

Наконец, для экспрессии зрелых по аффинности антител нуклеотидные кислоты, кодирующие молекулы кандидатного антитела, можно вводить в клетки в подходящем экспрессирующем формате, например в виде тяжёлой и лёгкой цепей полноразмерного антитела (например, 1дО), ЕаЬ-фрагментов антитела (например, ЕаЬ, Е(аЬ')₂) или в виде одноцепочечных антител (ксЕу), используя стандартный вектор и методы трансфекции/трансформации клеток (см., например, патенты США 6331415; 6103889; 5260203; 5258498 и 4946778).

В. Нуклеиновая кислота, кодирующая иммунологические и терапевтические агенты.

Иммунные ответы (реакции) на амилоидные отложения можно также вызывать, вводя нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела и составляющие их цепи, применяемые для пассивной иммунизации. Такие нуклеиновые кислоты могут представлять собой ДНК или РНК. Нуклеотидный сегмент, кодирующий иммуноген, как правило, связан с регуляторными элементами, такими как промотор и энхансер, которые разрешают экспрессию ДНК сегмента в предполагаемой клетки-мишени пациента. Для экспрессии в гемоцитах, желательной для индукции иммунного ответа, типичные промоторный и энхансерный элементы включают промотор и энхансер генов лёгкой и тяжёлой цепей иммуноглобулина и/или ранний промотор и энхансер основного интермедиата СМУ (ЬШъкк патенты США 5168062 и 5385839). Связанные регуляторные элементы и кодирующие последовательности часто клонируют в вектор. Для введения двухцепочечных антител две цепи можно клонировать в один и тот же вектор или в различные векторы.

Ряд вирусных векторных систем является доступным, включая ретровирусные системы (см., например, Ьа\упе апб Титю, Сиг. Орт. Сепе!. Эеуе1ор. 3:102-109 (1993)); аденовирусные векторы (см., например, Ве!! е! а1., 1 У1го1. 67:5911 (1993)); аденоассоциированные вирусные векторы (см., например, 21юи е! а1., 1 Ехр. Меб. 179:1867 (1994)), вирусные векторы семейства поксвирусов, включая вирус коровьей оспы и вирус оспы птиц, вирусные векторы рода альфа-вирусов, такие как векторы Синдбисвируса (8шбЬ15) и вируса лесов Семлики (8ет11к1) (см., например, ЭиЬепкку е! а1., к У1го1. 70:508 (1996)), вируса венесуэльского лошадиного энцефалита (см., например, 1оЬпк1оп е! а1., патент США 5643576) и рабдовирусов, таких как везикулярный вирус стоматита (см. Воке, патент США 6168943) и вирусы папилломы (011с е! а1., Нитап Сепе Тйегару, 6:325 (1995); XVоо е! а1., Международная заявка 94/12629 и Х1ао&Вгапбкта, МШею Лобк. Век. 24, 2630-2622 (1996)).

ДНК, кодирующая иммуноген, или вектор, содержащий эту ДНК, могут быть упакованы в липосомы. Подходящие липиды и родственные аналоги описаны Еррк1ет е! а1., патент США 5208036, Ее1дпег е! а1., патент США 5264618, Воке, патент США 5279833 и Ерапб е! а1., патент США 5283185. Векторы и ДНК, кодирующие иммуноген, можно также адсорбировать на носителях, состоящих из макрочастиц, или ассоциировать с этими носителями, примеры которых включают полимеры полиметилметакрилат и полилактиды и сополимеры лактидов с гликолидами, см., например, МсСее е! а1., ί. М1сго Епсар. (1996).

Векторы генной терапии или голые полинуклеотиды (например, ДНК) можно доставлять ш νί\Ό введением отдельному пациенту, как правило, с помощью системного введения (например, внутривенной, интраперитонеальной, назальной, желудочной, интрадермальной, внутримышечной, подкожной или интракраниальной инфузией) или местным применением (см., например, Апбегкоп е! а1., патент США 5399346).

Термин голый полинуклеотид относится к полинуклеотиду, доставляемому не в виде ассоциата с агентом, содействующему доставке. Голые полинуклеотиды иногда клонируют в плазмидный вектор. Такие векторы могут дополнительно содержать агенты, облегчающие доставку (содействующие доставке), такие как бупивакаин ^ешег е! а1., патент США 5593972). ДНК можно также вводить с помощью генной пушки. См. выше Х1ао&Вгапбкта. ДНК, кодирующую иммуноген, осаждают на поверхности металлических микробусин. Микроснаряды ускоряются под действием ударной волны или расширяющегося газообразного гелия и проникают в ткани на глубину семи слоев клеток. Например, годится устройство генной доставки Ассе1™, производимое в ЛдпсеШк, 1пс. М1бб1е!оп VI. Или же голые ДНК могут проникать через кожу в ток крови при простом нанесении пятна с помощью химического или механического раздражения (см. Но\\'е11 е! а1., Международная заявка νθ 95/05853).

В другом варианте векторы, кодирующие иммуногены, можно доставлять в клетки ех νίνΌ, такие как клетки, эксплантированные из отдельного пациента (например, лимфоциты, аспираты костного мозга, биопсия тканей), или универсальные гемопоэтические стволовые клетки, с последующей реимплантацией клеток в организм пациента, обычно после селекции клеток, которые включают вектор.

II. Профилактические и терапевтические методы.

Настоящее изобретение относится, среди прочего, к лечению болезни Альцгеймера и других амилоидогенных заболеваний путём введения пациенту терапевтических иммунологических реагентов (например, гуманизированных иммуноглобулинов) к специфическим эпитопам в Αβ в условиях, в которых возникает благоприятный терапевтический ответ (например, индукция фагоцитоза Αβ, снижение количества бляшек, ингибирование образования бляшек, снижение нейритной дистрофии, улучшение когнитивной функции и/или реверсия, лечение или предупреждение прогрессирования когнитивного заболевания) у пациента, например, для предупреждения или лечения амилоидогенного заболевания. Изобретение также относится к применению описанных иммунологических реагентов (например, гуманизированных иммуноглобулинов) в производстве медицинского препарата для лечения или предупреждения амилоидогенного заболевания.

В одном аспекте изобретение охватывает методы предупреждения или лечения заболевания, ассоциированного с амилоидными отложениями Αβ в мозгу пациента. Такие заболевания включают болезнь Альцгеймера, синдром Дауна и когнитивную недостаточность. Последняя может встречаться с другими признаками амилоидогенного заболевания или без таких признаков. Некоторые методы по изобретению включают введение пациенту эффективной дозы антитела, которое специфически связывается с компонентом амилоидного отложения. Такие методы особенно применимы для предупреждения или лечения болезни Альцгеймера у людей. Типичные методы включают введение эффективной дозы антитела, которое связывается с Αβ. Предпочтительные методы включают введение эффективной дозы антитела,

которое специфически связывается с эпитопом в пределах остатков 1-10 Αβ,	например антител,
которые	специфически	связываются	с	эпитопом	в	пределах	остатков	1-3	Αβ,	антител,
которые	специфически	связываются	с	эпитопом	в	пределах	остатков	1-4	Αβ,	антител,
которые	специфически	связываются	с	эпитопом	в	пределах	остатков	1-5	Αβ,	антител,
которые	специфически	связываются	с	эпитопом	в	пределах	остатков	1-6	Αβ,	антител,
которые	специфически	связываются	с	эпитопом в	пределах остатков 1-7	Αβ,	или	антител,

которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 3-7 Αβ.

Ещё в одном аспекте изобретение включает введение антител, которые связываются с эпитопом, содержащим свободный Ν-концевой остаток Αβ. Ещё в одном аспекте изобретение включает введение антител, которые связываются с эпитопом в пределах остатков 1-10 Αβ, причём остаток 1 и/или остаток 7 Αβ представляет собой аспарагиновую кислоту. Ещё в одном аспекте изобретение охватывает введение антител, которые специфически связываются с Αβ пептидом, не связываясь с полноразмерным амилоидным белком-предшественником (ΑΡΡ). Ещё в одном аспекте изотип антитела представляет собой 1дС1.

-30 012407

Ещё в одном аспекте изобретение охватывает введение антител, которые связываются с амилоидным отложением в организме пациента и индуцируют реакцию очищения (осветления) от амилоидного отложения. Например, такой ответ очищения может осуществляться с помощью Рс опосредованного фагоцитоза.

Терапевтические агенты по изобретению, как правило, практически не содержат нежелательных примесей. Это означает, что агент, как правило, имеет чистоту по меньшей мере около 50 вес.% (вес./вес.), а также практически не содержит вредных белков и загрязняющих веществ (примесей). Иногда агенты имеют чистоту по меньшей мере около 80 вес.% и более предпочтительно по меньшей мере 90 или около 95 вес.%. Однако, применяя обычные методы очистки белков, можно получать гомогенные пептиды по меньшей мере 99 вес.% чистоты.

Эти способы можно применять как в отношении бессимптомных пациентов, так и в отношении пациентов, у которых уже наблюдаются симптомы болезни. Антитела, используемые в таких методах, могут быть человеческими, гуманизированными, химерными или нечеловеческими антителами или их фрагментами (например, антигенсвязывающими фрагментами) и могут быть моноклональными или поликлональными по данному описанию. Ещё в одном аспекте изобретение охватывает введение антител, полученных от человека, иммунизированного Ав пептидом, причём этот человек может быть пациентом, которого следует лечить антителом.

В другом аспекте изобретение охватывает введение антитела с фармацевтическим носителем в виде фармацевтической композиции. Или же антитело можно вводить пациенту путём введения полинуклеотида, кодирующего по меньшей мере одну цепь антитела. Полинуклеотид экспрессируется, продуцируя цепь антитела в организме пациента. Необязательно, полинуклеотид кодирует тяжёлую и лёгкую цепи антитела. Полинуклеотид экспрессируется, продуцируя в организме пациента тяжёлую и лёгкую цепи. В типичных примерах проводят мониторинг уровня введённого антитела в крови пациента.

Таким образом, данное изобретение восполняет долгожданную необходимость в терапевтической схеме предупреждения или ослабления нейропатологии и, у некоторых пациентов, когнитивной недостаточности, обусловленных болезнью Альцгеймера.

A. Пациенты, подлежащие лечению.

В число пациентов, подлежащих лечению, входят индивидуумы с повышенным риском заболевания, но не проявляющие симптомов, а также пациенты уже с проявленными симптомами. В случае болезни Альцгеймера фактически любой человек находится в состоянии повышенного риска заболеть болезнью Альцгеймера, если он живёт достаточно долго. Следовательно, способы по настоящему изобретению можно применять профилактически к целой популяции, при этом не обязательна какая-либо оценка степени риска у пациента. Способы по настоящему изобретению особенно применимы к людям с известным генетическим риском заболевания болезнью Альцгеймера. К таким пациентам относятся люди, имеющие родственников, болеющих этой болезнью, и те, повышенный риск заболевания у которых определён анализом генетических или биохимических маркёров. Генетические маркёры повышенного риска в отношении болезни Альцгеймера включают мутации в АРР гене, в особенности мутации в положении 717 и в положениях 670 и 671, называемые мутации Нагбу и 8\\ό6ιχ1ι соответственно (Нагбу, см. выше). Другие маркёры повышенного риска представляют собой мутации в генах пресенилина, Р8с.| и Р82 и АроЕ4, АО, гиперхолестеринемия или атеросклероз в анамнезе. Людей, в данный момент страдающих болезнью Альцгеймера, можно определить по характерному слабоумию, а также по наличию факторов риска, описанных выше. Кроме того, для определения больных АО доступен ряд диагностических тестов. Эти тесты включают измерение уровней С8Р тау и Ав42. Повышенные уровни тау и пониженные уровни Ав42 определяют наличие АО. Людей, страдающих болезнью Альцгеймера, можно также диагностировать по критериям АВОА, обсуждаемым в разделе примеры.

У бессимптомных пациентов лечение можно начинать в любом возрасте (например, в 10, 20, 30 лет). Однако обычно нет необходимости начинать лечение до 40, 50, 60 или 70 лет. Как правило, лечение включает многократные дозы во времени. Лечение можно контролировать, анализируя уровни антител во времени. Если реакция ослабевает, показана бустерная доза. У пациентов с возможным синдромом Дауна лечение можно начинать в дородовом периоде, вводя терапевтический агент матери, или вскоре после рождения.

B. Схемы лечения и лечебные дозы.

В профилактических целях фармацевтические композиции или лекарственные вещества вводят пациенту, восприимчивому к болезни Альцгеймера или имеющему другие факторы повышенного риска заболеть болезнью Альцгеймера, в количестве, достаточном для упразднения или снижения риска, уменьшения тяжести или замедления начала заболевания, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнения и промежуточные патологические фенотипы, появляющиеся в процессе прогрессирования заболевания. Для применения в терапии композиции или лекарственные вещества вводят пациенту с подозрением на то, что он страдает, или уже страдающему таким заболеванием в количестве, достаточном для лечения или, по меньшей мере, частичного угнетения симптомов заболевания (биохимических, гистологических и/или поведенческих), включая его ос ложнения и промежуточные патологические фенотипы, появляющиеся в процессе прогрессирования заболевания.

В некоторых способах применение агентов уменьшает или ликвидирует миокогнитивную недостаточность у пациентов, у которых ещё не развилась патология, характерная для болезни Альцгеймера. Количество, адекватное осуществлению терапевтического или профилактического лечения, определяют как терапевтически или профилактически эффективную дозу. Как по схеме профилактического лечения, так и по схеме терапевтического лечения агенты обычно вводят в виде нескольких доз до получения удовлетворительного иммунного ответа.

Термин иммунный ответ (иммунная реакция) или иммунологический ответ (иммунологическая реакция) включает развитие гуморального (опосредованного антителом) и/или клеточного (опосредованного антигенспецифическими Т-клетками или продуктами их секреции) иммунного ответа против антигена в реципиенте. Такой ответ может быть активным ответом, т. е. вызванным введением иммуногена, или пассивным ответом, т. е. вызванным введением иммуноглобулина или антитела или примированных Т-клеток. Как правило, иммунный ответ контролируют и многократные дозы дают, если иммунный ответ начинает ослабевать.

Эффективные дозы композиций по данному изобретению для лечения вышеописанных состояний меняются в зависимости от многих различных факторов, включая способы применения, нацеленный сайт, физиологическое состояние пациента, является ли пациент человеком или животным, другие принимаемые лекарственные средства, и от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Обычно пациентом является человек, но также можно лечить отличных от человека млекопитающих, включая трансгенных млекопитающих. Лечебные дозы следует титровать с целью оптимизации безопасности и эффективности.

Для пассивной иммунизации антителом интервалы доз составляют примерно 0,0001-100 мг/кг и более обычно 0,01-5 мг/кг (например, 0,02, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2 мг/кг и т.д.) веса тела хозяина. Например, дозы могут составлять 1 или 10 мг/кг веса тела либо быть в интервале 1-10 мг/кг, предпочтительно по меньшей мере 1 мг/кг. В другом примере дозы могут быть 0,5 мг/кг веса тела или составлять интервал 0,5-15 мг/кг, предпочтительно по меньшей мере 1 мг/кг. Предполагается, что промежуточные дозы в указанных интервалах также входят в объём изобретения. Можно вводить эти дозы субъектам ежедневно, через день, еженедельно или в соответствии с любой другой схемой, определённой эмпирическим анализом. Типичное лечение включает введение многократных доз в течение продолжительного времени, например по меньшей мере в течение шести месяцев. Дополнительные типичные схемы лечения включают введение препарата или лекарственного вещества один раз в две недели, или один раз в месяц, или один раз каждые 3 или 6 месяцев. Типичные схемы введения доз включают 1-10 или 15 мг/кг в последующие дни, 30 мг/кг через день или 60 мг/кг еженедельно. По некоторым способам одновременно вводят два или более моноклональных антитела с различными специфичностями связывания, в этом случае доза каждого вводимого антитела находится в указанных интервалах.

Антитело обычно вводят многократно. Интервалы между разовыми дозами могут быть неделя, месяц или год. Интервалы также могут быть нерегулярными, по показаниям измерения уровней в крови пациента антитела к Αβ. В некоторых способах дозу корректируют, чтобы достичь концентрации антитела в плазме 1-1000 мкг/мл, а в некоторых способах - 25-300 мкг/мл. Или же антитело можно вводить в виде препарата пролонгированного действия, в этом случае требуется менее частое введение. Доза и частота введения меняются в зависимости от периода полужизни антитела в организме пациента. В целом, гуманизированные антитела имеют наиболее продолжительный период полужизни, за ними идут химерные антитела и нечеловеческие антитела.

Дозировка и частота введения могут меняться в зависимости от того, является лечение профилактическим или терапевтическим. При профилактическом применении композиции, содержащие антитела по настоящему изобретению или их коктейль, вводят пациенту ещё не в стадии заболевания с целью повышения резистентности пациента. Такое количество определяют как профилактически эффективная доза. При таком применении точные количества опять же зависят от состояния здоровья пациента и общего иммунитета, но обычно находятся в интервале 0,1-25 мг на дозу, но главным образом 0,5-2,5 мг на дозу. Относительно низкую дозу вводят со сравнительно нечастыми интервалами в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение в течение всей жизни.

При терапевтическом применении иногда требуются сравнительно высокие дозы (например, около 1-20 мг антитела на дозу, но, более обычно, 5-25 мг) через сравнительно короткие интервалы до тех пор, пока прогрессирование заболевания не замедлится или не прекратится, и предпочтительно до тех пор, пока у пациента не будет наблюдаться частичное или полное уменьшение интенсивности симптомов заболевания. После этого больного можно перевести на профилактический режим.

Интервалы доз нуклеиновых кислот, кодирующих антитела, составляют примерно 10 нг-1г, 100 нг100 мг, 1мкг-10 мг или 30-300 мкг ДНК на пациента. Дозы инфекционных вирусных векторов меняются от 10 до 100 вирионов на дозу.

-32 012407

Терапевтические агенты можно вводить парентерально, местно, внутривенно, перорально, подкожно, интраартериально, интракраниально, интраперитонеально, интраназально или внутримышечно для профилактического и/или терапевтического лечения. Наиболее обычным способом введения иммуногенного агента является подкожный, хотя другие способы могут быть равно эффективны. Следующим наиболее обычным способом является внутримышечная инъекция. Этот тип инъекции наиболее обычно осуществляют в мышцы руки или ноги. В некоторых способах агенты инъецируют непосредственно в конкретную ткань, в которой аккумулируются отложения, например внутричерепная (интракраниальная) инъекция. Внутримышечная инъекция или внутривенная инфузия предпочтительны для введения антитела. В некоторых методах конкретные терапевтические антитела инъецируют непосредственно в череп. В некоторых способах антитела вводят в виде композиции или устройства пролонгированного действия, например в виде системы подкожной вакцинации Меб1раб™.

Άгенты по изобретению можно, необязательно, вводить в комбинации с другими агентами, которые, по меньшей мере, частично эффективны при лечении амилоидогенного заболевания. В некоторых вариантах изобретения гуманизированное антитело по изобретению (например, гуманизированное антитело 12Ά11) вводят в комбинации со вторым иммуногенным или иммунологическим агентом. Например, гуманизированное антитело 12Ά11 по изобретению можно вводить в комбинации с другим гуманизированным антителом к Άβ. В других вариантах изобретения гуманизированное антитело 12Ά11 вводят пациенту, который получил или получает вакцину Αβ. В случае болезни Лльцгеймера и синдрома Дауна, когда в мозгу обнаруживаются амилоидные отложения, агенты по изобретению можно также вводить в сочетании с другими агентами, которые повышают прохождение агентов по изобретению через гематоэнцефалический барьер. Άκπγβι по изобретению можно вводить в комбинации с другими агентами, которые повышают доступ терапевтического агента к нацеленной клетке (клетке-мишени) или ткани, например, такими как липосомы. Совместное введение таких агентов может понизить дозу терапевтического агента (например, терапевтического антитела или цепи антитела), необходимую для получения нужного эффекта.

С. Фармацевтические композиции.

Άгенты по изобретению часто вводят в виде фармацевтических композиций, содержащих активный терапевтический агент, т.е. плюс множество других фармацевтически приемлемых компонентов (см. Кеттд1оп'к РБагтасеи!1са1 8с1епсе, 15¹¹' еб. Маск РиЫЕЫпд Сотрапу, Еак!оп, Реппкукаша (1980)). Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Композиции могут также включать, в зависимости от заданного состава, фармацевтически приемлемые, нетоксические носители или разбавители (дилюенты), которые определяются как наполнители, обычно применяемые для приготовления фармацевтических композиций для введения животному или человеку. Разбавитель (дилюент) выбирают таким образом, чтобы не повлиять на биологическую активность комбинации. Примерами таких дилюентов являются дистиллированная вода, забуференный фосфатом физиологический солевой раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и раствор Хэнка (Напк). Кроме того, фармацевтическая композиция или препарат могут также включать другие носители, адъюванты или нетоксические, нетерапевтические, неиммуногенные стабилизаторы и т.п.

Фармацевтические композиции могут также включать большие медленно метаболизирующиеся макромолекулы, такие как белки, полисахариды, например хитозан, полимолочные кислоты, полигликолевые кислот и сополимеры (такие как латексная функционализованная сефароза (ТМ), агароза, целлюлозы и т. п.), полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и липидные агрегаты (такие как масляные (висячие) капли или липосомы). Кроме того, эти носители могут функционировать в качестве иммуностимулирующих агентов (т. е. адъювантов).

Для парентерального применения агенты по изобретению можно вводить в виде инъецируемых доз раствора или суспензии вещества в физиологически приемлемом разбавителе с фармацевтическим носителем, который может быть стерильной жидкостью, такой как вода, масла, физиологический раствор, глицерин или этанол. Кроме того, в композициях могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как увлажняющие и эмульгирующие агенты, поверхностно-активные вещества, рН буферизующие вещества и т.п. Другими компонентами фармацевтических композиций являются вазелин, животное, растительное или синтетическое масло, например арахисовое масло, соевое масло, и минеральное масло. Обычно предпочтительными жидкими носителями, в особенности для инъецируемых растворов, являются гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль. Άнтитела можно вводить в виде депоинъекции или имплантированного препарата, который можно готовить таким образом, чтобы допустить пролонгированное высвобождение активного ингредиента. Типичная композиция содержит моноклональное антитело с концентрацией 5 мг/мл, приготовленное в водном буфере, состоящем из 50 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, с рН, с помощью НС1 доведённым до 6,0.

Как правило, композиции готовят в виде инъецируемых жидких растворов или суспензий; также можно готовить твёрдые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. Препарат может также быть эмульгированным или инкапсулированным в липосомах или микрочастицах, таких как полилактид, полигликолид или сополимер, для усиления действия адъю ванта, обсуждавшегося выше (см. Ьапдег, 8с1епсе, 249:1527 (1990) и Напек, А4тапсе4 Эгид ОеПтегу Яеν^е№, 28:97 (1997)). Агенты по данному изобретению можно вводить в форме депоинъекции или имплантированного препарата, который можно приготовить в такой форме, чтобы обеспечить пролонгированное или пульсовое высвобождение активного ингредиента.

Дополнительные препараты, пригодные для других способов применения, включают оральные, интраназальные или лёгочные препараты, суппозитории и препараты для трансдермального введения. Связующие и носители для суппозиториев включают, например, полиалкиленгликоли или триглицериды; такие суппозитории можно приготовить из смесей, содержащих активный ингредиент в пределах 0,5-10%, предпочтительно 1-2%. Оральные препараты включают эксципиенты, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натрия сахарин, целлюлоза и карбонат магния, - все фармацевтической степени чистоты. Эти композиции бывают в виде растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, препаратов пролонгированного действия или в виде порошков и содержат 10-95% активного ингредиента, предпочтительно 25-70%.

Для местного применения используют трансдермальную или интрадермальную доставку. Местное введение можно облегчить с помощью совместного введения агента с токсином холеры или его нейтрализованными (детоксифицированными) производными или субъединицами или с другими аналогичными бактериальными токсинами (см. С1епп е1 ай, №11иге. 391, 851 (1998)). Совместное введение можно осуществлять, используя компоненты в виде смеси или в виде связанных молекул, полученных химическим сшиванием или экспрессией в виде слитого (составного) белка.

Или же трансдермальную доставку можно осуществлять с помощью кожных пластырей или трансферосом (1гапк£егокотек, переносимые частицы) (Таи1 е1 а1., Еиг. ί. Iттиηο1. 25:3521 (1995); Сеνс е1 а1., Вюсйет. Вюрйук. Ас1а, 1368:201-15 (1998)).

Ό. Мониторинг эффективности лечения.

Изобретение включает в себя способы мониторинга эффективности лечения пациента, страдающего болезнью Альцгеймера или восприимчивого к болезни Альцгеймера, т.е. мониторинга эффективности в ходе лечения, получаемого пациентом. Можно использовать способы контроля как терапевтического лечения симптомных больных, так и профилактического лечения бессимптомных пациентов. В частности, способы применимы для мониторинга пассивной иммунизации (например, измерение уровня введённого антитела).

Некоторые способы включают определение исходной (начальной) величины, например уровня или профиля антител у пациента, до введения дозы агента и сравнение этой величины с величиной профиля или уровня после лечения. Заметное повышение (т.е. более обычного предела ошибки эксперимента при повторных измерениях одного и того же образца, выраженной как стандартное отклонение (девиация) от среднего значения для таких экспериментов) при оценке уровня или профиля свидетельствует о положительном результате лечения (т. е. о том, что применение агента вызывает нужный ответ). Если величина иммунного ответа заметно не меняется или снижается, это указывает на отрицательный результат лечения.

В других способах контрольную величину (т.е. среднее и стандартное отклонение) уровня или профиля определяют для контрольной популяции. Как правило, субъекты из контрольной популяции не получали лечения ранее. Величины уровня или профиля, измеренные у пациента после введения терапевтического агента, сравнивают с контрольным значением. Заметное повышение по сравнению с контрольной величиной (т.е. более одного стандартного отклонения от среднего значения) свидетельствует о положительном или удовлетворительном результате лечения. Отсутствие заметного повышения или понижение сигнализирует об отрицательном или неудовлетворительном результате лечения. Применение агента обычно продолжают, в то время как уровень по сравнению с контрольным значением повышается. Как и ранее, достижение плато сравнительно с контрольными значениями - есть профиль того, что лечение можно прервать или уменьшить дозу и/или частоту введения.

В других способах контрольную величину уровня или профиля (например, среднее и стандартное отклонение) определяют у пациентов контрольной популяции, которые получали лечение терапевтическим агентом и уровни или профили которых в результате лечения на графике имели вид плато. Измеренные величины уровней или профилей у пациента сравнивают с контрольным значением. Если измеренный уровень у пациента незначительно отличается (например, более одного стандартного отклонения) от контрольного значения, лечение можно прервать. Если уровень у пациента значительно ниже контрольного значения, продолжительное введение агента оправдано. Если уровень у пациента продолжает упорно падать ниже контрольного значения, тогда может быть показано изменение лечения.

В других способах у пациента, который в настоящее время не получает лечение, но проходил курс лечения раньше, проверяют уровни или профили антитела для того, чтобы определить, требуется ли возобновление лечения. Измеренный у пациента уровень или профиль можно сравнить с величиной, достигнутой у пациента ранее в результате предыдущего курса лечения. Значительное снижение относительно предыдущих значений (т.е. более одной типичной предельной ошибки при повторных измерениях одного и того же образца) является показателем, что лечение можно возобновить. Или же, результат измерения у пациента можно сравнить с контрольной величиной (среднее плюс стандартная девиация), определённой в популяции пациентов после прохождения курса лечения. Или же результат измерения у пациента можно сравнить с контрольной величиной в популяции профилактически пролеченных пациентов, у которых продолжают отсутствовать симптомы заболевания, или популяции терапевтически пролеченных пациентов, у которых наблюдается улучшение характеристик заболевания. Во всех этих случаях заметное снижение относительно контрольного уровня (т. е. более одной стандартной девиации) является показателем того, что лечение пациента следует возобновить.

Тканевый образец для анализа обычно представляет собой кровь, плазму, сыворотку, слизистую жидкость или спинно-мозговую (цереброспинальную) жидкость пациента. Образец анализируют, например, на уровни или профили антител к Ав пептиду, например уровни или профили гуманизированных антител. Методы ЕЫ8А обнаружения антител, специфичных к Ав, описаны в разделе Примеры. В некоторых методах уровни или профили введённого антитела определяют анализом очищения (осветления), например ίη νίΐΐΌ анализом на фагоцитоз по данному описанию. В таких методах испытуемый тканевый образец, взятый у пациента, контактирует с амилоидным отложением (например, мыши РИАРР) и фагоцитарными клетками, несущими Ес-рецепторы. Затем проводят мониторинг последующего очищения (клиринга) амилоидного отложения. Наличие и степень очищающего ответа являются показателем наличия и количества антител, эффективно очищающих от Ав в тканевом образце, взятом у проверяемого пациента.

Профиль антитела после пассивной иммунизации, как правило, показывает промежуточное максимальное значение (пик) концентрации антитела с последующим экспоненциальным распадом (падением). Без введения дополнительной дозы падение приводит к уровням до лечения за время от нескольких дней до нескольких месяцев в зависимости от периода полужизни введённого антитела.

В некоторых способах начальные (базовая линия) измерения антитела к Ав у пациента делают перед введением, а второе измерение делают вскоре после введения с целью определения максимального (пик) уровня антитела, а ещё одно или более измерений делают с интервалами с целью мониторинга падения уровней антител. Когда уровень антитела опустится до базовой линии (начального значения) или до значения ниже базового на заданный максимальный (пик) процент (например, 50, 25 или 10%), вводят дополнительную дозу антитела. В некоторых способах максимальное значение (пик) или последующие определяемые уровни ниже фонового сравнивают со стандартными уровнями, определёнными ранее, чтобы воспроизвести целебную схему профилактического или терапевтического лечения других пациентов. Если измеренный уровень антитела значительно ниже стандартного уровня (например, ниже среднего минус одно стандартное отклонение от стандартного значения в популяции пациентов, на которых лечение оказало благоприятное воздействие), показано введение дополнительной дозы антитела.

Дополнительные способы включают мониторинг, в ходе лечения, любого общеизвестного в технике физиологического симптома (например, физического или ментального симптома), на который обычно опираются исследователи или врачи при диагностике или мониторинге амилоидогенных заболеваний (например, болезни Альцгеймера). Например, можно контролировать когнитивную недостаточность. Последняя является симптомом болезни Альцгеймера и синдрома Дауна, но может также встречаться без других признаков любого из этих заболеваний. Например, когнитивную недостаточность можно проверять, определяя показатель ММ8Е (мини-исследование ментального статуса), как обычно, в ходе всего лечения.

Е. Наборы.

Изобретение далее включает наборы для осуществления описанных выше методов мониторинга. Как правило, такие наборы содержат агент, который специфически связывается с антителами к Ав. Набор может также включать метку. Для детектирования антител к Ав метка обычно бывает в виде меченых антиидиопатических антител. Для обнаружения антител агент может поставляться в виде предварительно связанного с твёрдой фазой, такой как лунки микротитрационного планшета. Наборы также обычно содержат маркировку (этикетки, ярлыки, вкладыши) с сопроводительными инструкциями по применению набора. Маркировка может также включать схему или другую корреспонденцию (информацию), в которой коррелируются уровни измеряемой метки с уровнями антител к Ав.

Термин маркировка (этикетка, ярлык, вкладыш) относится к любому написанному материалу или материалу на диске, который прилагается к набору или иным образом сопровождает набор всё время в процессе производства, транспорта, продажи или применения. Например, термин маркировка (этикетка, вкладыш, бирка, ярлык) охватывает рекламные листки и брошюры, упаковочные материалы, инструкции, аудио- или видеокассеты, компьютерные диски, а также надписи непосредственно на наборах.

Изобретение также включает диагностические наборы, например наборы для исследования, обнаружения и/или диагностики (например, для осуществления ίη νί\Ό визуализации). Обычно такие наборы содержат антитело для связывания с эпитопом Ав предпочтительно в пределах остатков 1-10. Предпочтительно антитело является меченым или в набор входит реагент для вторичного мечения. Предпочтительно набор сопровождается инструкциями по осуществлению предполагаемого применения, например по осуществлению визуализации ίη νί\Ό. Типичными антителами являются антитела по данному описанию.

-35 012407

Е. Ιη у1уо визуализация.

Данное изобретение включает способы ίη у1уо визуализации амилоидных отложений у пациента. Такие способы пригодны для диагностики или подтверждения диагноза болезнь Альцгеймера или предрасположенности к ней. Например, способы можно применять для пациента с имеющимися уже симптомами слабоумия. Если у пациента имеются аномальные амилоидные отложения, то пациент, повидимому, страдает болезнью Альцгеймера. Способы также можно применять к бессимптомным пациентам. Присутствие аномальных отложений амилоида указывает на предрасположенность к симптомному заболеванию в будущем. Способы также применимы для мониторинга прогрессирования заболевания и/или ответа на лечение у пациентов с ранее диагностированной болезнью Альцгеймера.

Способы работают с помощью введения пациенту реагента, такого как антитело, которое связывается с Αβ, а затем детектирования агента, после того как он связывается. Предпочтительные антитела связываются с отложениями Αβ у пациента, не связываясь с полноразмерным ΑΡΡ полипептидом. Особенно предпочтительны антитела, связывающиеся с эпитопом в пределах аминокислот 1-10 Αβ. В некоторых способах антитело связывается с эпитопом в пределах аминокислот 7-10 Αβ. Такие антитела обычно связываются, не вызывая значительного очищающего (осветляющего) ответа. По другим способам антитело связывается с эпитопом в пределах аминокислот 1-7 Αβ. Такие антитела обычно связываются и индуцируют очищающий ответ на Αβ. Однако очищающего ответа можно избежать, используя фрагменты антитела с отсутствующей полноразмерной константной областью, такой как ЕаЬ§. При других способах одно и то же антитело может служить в качестве реагента для лечения и диагностики. В целом, в случае антител, связывающихся с эпитопами на С-конце к остатку 10 Αβ, не наблюдается такой сильный сигнал, как в случае антител, связывающихся с эпитопами в пределах остатков 1-10, повидимому, потому что С-концевые эпитопы недоступны в амилоидных отложениях. Следовательно, такие антитела менее предпочтительны.

Диагностические реагенты можно вводить пациенту с помощью внутривенной инъекции или непосредственно в мозг внутричерепной инъекцией или просверливая отверстие в черепе. Доза реагента должна быть в тех же пределах, что и в методах лечения. Как правило, реагент является меченым, хотя в некоторых методах первичный реагент с аффинностью к Αβ является немеченым, и вторичный реагент для мечения используют для связывания с первичным реагентом. Выбор метки зависит от способа обнаружения. Например, флуоресцентная метка пригодна для оптического обнаружения. Применение парамагнитных меток пригодно для томографического обнаружения без хирургического вмешательства. Радиоактивные метки можно также обнаруживать с помощью РЕТ или 8РЕСТ.

Диагностику осуществляют, сравнивая число, размер и/или интенсивность меченых локусов с соответствующими исходными (начальными) величинами. Исходные величины могут представлять собой средние уровни в популяции здоровых (не больных) индивидуумов. Исходные величины могут также представлять собой предыдущие уровни, определённые у того же пациента. Например, исходные величины можно определить у пациента перед началом лечения и измеренные впоследствии величины сравнивать с исходными (начальными) величинами. Понижение величины относительно исходного значения сигнализирует о положительном ответе на лечение.

Настоящее изобретение подробнее описано с помощью нижеприведённых не ограничивающих примеров.

Примеры

Следующие обозначения последовательностей используются в разделе Примеры для названия нуклеотидных и аминокислотных последовательностей вариабельной области цепей иммуноглобулина.

Антитело	ντ нукпео-	ΥΕ аминоки-	УН нуклео-	УН аминоки-
	тидная после-	слотная после-	тидная после-	слотная после-
	довательность	довательность	довательность	довательность
12А11	8Εζ>ΙΟΝΟ:1	8ЕЦ ГО N0:2	8Еф ГО N0:3	8Е0 ГО N0:4
	(кодирующая)		(кодирующая)
12Α11νΙ	8ЕЦ ГО N0:34	8ЕЦ ГО N0:7	8Е0 ГО N0:35	8Е0 П) N0:10
12АШ2		5ΕφΙΟΝΟ:7		8Ε0ΙΟΝΟ:13
12А11ν2.1		8ЕЦ ГО N0:7		8ΕφΙΟΝΟ:14
12А11ν3		8ЕЦ ΙΟ N0:7		8ΕφΙΟΝΟ:15
12А11	ΞΕζ) ГО N0:5		8Е0 ГО N0:6

Последовательность антитела или иммуноглобулина по данному описанию, содержащая АЪ и νΗ последовательность, представленную любой из ЗЕЦ ΙΌ N0:1-4, может содержать либо полную последовательность, либо зрелую последовательность (т. е. зрелый пептид без сигнальной или лидерной последовательности).

-36 012407

Предыдущие исследования показали, что можно прогнозировать ίη νί\Ό эффективность различных Αβ антител при снижении Л^-ассоциированной патологии (например, предрасположенность к образованию (количество) бляшек) по способности антител связываться с бляшками ех νί\Ό (например, в ΑΟ отделах мозга) и/или включать клиренс бляшек в ех νί\Ό анализе на фагоцитоз (Вагй е! а1. (2000), №11. Мей. 6:916-919). Корреляция подтверждает мнение, что Гс-зависимый фагоцитоз под действием микроглиальных клеток и/или макрофагов важен для процесса клиренса бляшек ίη νί\Ό. Однако сообщалось также, что эффективность антитела ίη νί\Ό можно также получать по механизмам, независимым от Гс взаимодействий (Вас§ка1 е! а1. (2002), ί. ИеигоксЕ 22:7873-7878). Исследования показали, что, по-видимому, антитело против средней части Αβ, которое не может распознавать амилоидные бляшки, связывается с растворимым Αβ и уменьшает отложение бляшек (ОеМайок е! а1. (2001), Бгос. №111. Αсай. δα. υδΑ, 98:88508855).

Для характеристики возможной ίη νί\Ό эффективности мышиного моноклонального антитела 12А11 (изотип 1дС1) сначала проводят различные ех νί\Ό анализы.

Авидность тЛЬ 12Α11 к Αβ1-42.

Связывание моноклонального антитела 12А11 с агрегированным синтетическим Αβ1-42 осуществляют методом ευδΑ, описанным в 8сЫеηк е! а1. (№аШге, 400:13 (1999)). Для сравнения также анализируют тЛЬ 12В4 и 10Ό5. Растворимым Αβ1-42 называется синтетический пептид Αβ1-42, подвергшийся действию ультразвука в диметилсульфоксиде (ДМСО). Серийные разведения антител по 20 мкг/мл инкубируют с 50000 срт (импульсов в минуту) [¹²⁵Ι]Αβ1-42 (190 мкКи/мкмоль; мечение реагентом Шйодегт Е1егсе) в течение ночи при комнатной температуре. 50 мкл суспензии, содержащей 75 мг/мл протеин-Асефарозы (АтегШат Ρίιαηηααα) и 200 мкг антитела кролика к мышиному ЦС (Н+Ь) (^аск5οη IттиηοΚ.екеагсй) инкубируют с разведёнными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре, дважды отмывают и считают на гамма-счётчике Аа11ас (Тегкт-Ейпег). Все стадии проводят в ΒΙΑ буфере, состоящем из 10 мМ Тп8, 0,5 М №аС1, 1 мг/мл желатина и 0,5% Иошйе! Ρ-40, рН 8.0.

Результаты исследования авидности показаны в табл. 2.

Таблица 2

Антитело	Эпитоп	Изотип	ЕО50 на агрегиро-	% Захвата
			ванном Αβ-42 пМ	растворимого АВ 1-42
1005 +	Αβ3-7	Ι§οι	53	1
12В4 +	Αβ3-7	1§62а	667	8
12А11	Αβ3-7	1ё<Э1	233	30

⁺Антитела 10Б5 и 12В4 подробно описаны в Международной заявке 02/46237 и Международной патентной заявке ΡСΤ/υ803/07715 соответственно.

Для сравнения, антитело 266 с концентрацией 10 мкг/мл захватывает 70% Αβ 1-42.

Все тестируемые антитела проявляют высокую авидность к агрегированному Αβ1-42. Кроме того, антитела 12В4 и 12А11 заметно поглощают (захватывают) растворимый Αβ1-42 при концентрациях антитела 20 мкг/мл. Как показано в табл. 2, ЦС1 антитело 12А11 поглощает Αβ1-42 более эффективно, чем антитело 12В4 изотипа ЦСЗа или антитело 10Ό5 изотипа ЦСЕ

Способность различных антител (включая 12А11) захватывать (поглощать, улавливать) растворимый Αβ исследуют далее следующим образом. Различные концентрации антитела (вплоть до 10 мкг/мл) инкубируют с 50000 срт ¹²⁵Ι-Αβ1-42 (или ¹²⁵Ι-Αβ1-40). Концентрацию антитела, достаточную для того, чтобы связать 25% радиоактивных импульсов, определяют радиоиммуноанализом (антигенсвязывающим радиоиммуноанализом). Для антител, не способных связывать 25% импульсов при концентрации 10 мкг/мл, определяют процент импульсов, связанных при 10 мкг/мл. Антитело 12А11 связывает 20% радиоактивных импульсов (т.е. ¹²⁵Ι-Αβ) при концентрации 10 мкг/мл. Это больше, чем количество, связанное двумя другими тестируемыми антителами к Αβ3-7, а именно 12В4 и 10Ό5 (связывание 7 и 2% при концентрации 10 мкг/мл соответственно). Таким образом, из проверенных антител к Ν-концу (эпитоп Αβ3-7) антитело 12А11 проявляет наиболее ощутимую способность захватывать Αβ.

Как мера их способности включать Гс-опосредованный клиренс бляшек антитела также сравнивают с помощью ех νί\Ό анализа на фагоцитоз с первичными мышиными микроглиальными клетками и тканями отделов мозга мышей ΡΌΑΡΡ. Нерелевантные антитела к ЦС1 и ЦС 2а, не реакционноспособные к Αβ или к другим компонентам анализа, используют в качестве негативного контроля совпадения по изотипу. Коротко говоря, мышиные первичные микроглиальные клетки культивируют с нефиксированными криостатными срезами мозга мышей ΡΌΑΡΡ в присутствии антител. Инкубируют в течение 24 ч и методом Ε^I8Α определяют общий уровень Αβ, оставшегося в культурах. Для количественного определения степени клиренс бляшек/Αβ разрушения Αβ экстрагируют из культур микроглии и срезов мозга (η=3) с помощью 8 М раствора мочевины для анализа Ε^I8Α. Данные анализируют методом ΑΝΘΥΑ с после дующим тестом Даннета (Липпе!).

Как показано на фиг. 1, антитело 12В4 эффективно снижает уровни Αβ (73% для 12В4; Р<0,001), при этом антитело 12А11 проявляет несколько более низкую, но статистически значимую эффективность (48% для 12А11, Р<0,05). Показатель 12А11 в ех νί\Ό анализе на фагоцитоз можно повысить при превращении в 1дО2а изотип, который является предпочтительным изотипом для фагоцитоза микроглиальных клеток.

Пример II. 1п νί\Ό эффективность мышиного антитела 12А11.

Мышиное антитело 12Α11 уменьшает альцгеймероподобную нейропатологию ш νί\Ό. Для определения ш νί\Ό эффективности 12А11 антитела (включая 12А11, 12В4 или 10Ό5) вводят мышам в дозе 10 мг/кг в виде еженедельных интраперитонеальных инъекций в течение 6 месяцев, как описано у Βηγ6 е! а1. (2000), №1!. Меб. 6:916. По окончании исследования общие уровни кортикального Αβ определяют методом ΕΗ8Α. Как показано на фиг. 2А, каждое из антител значительно снижает общие уровни Αβ по сравнению с ΡΒ8 контролем (Р<0,001), т.е. 12В4 снижает на 69%, 10Ό5 снижает на 52%, а 12А11 снижает на 31%.

Затем определяют уровень нейритной дистрофии в срезах тканей мозга вышеуказанных мышей с целью определения связи между клиренсом бляшек и нейронной защитой. Данные анализов изображения мозга, определяющих процент лобной коры с нейритной дистрофией, показаны на фиг. 2В. Эти данные показывают, что антитела 10Ό5 и 12А11 неэффективно снижают нейритную дистрофию, тогда как 12В4 значительно снижает нейритную дистрофию (12В4, Р<0,05; ΑΝ0ΥΑ с последующим тестом Даннета), как определено анализом по данному описанию, и снова эту активность 12А11 можно повысить при превращении 12А11 в 1дО2а изотип (мышиная эффективность). Что касается гуманизированных версий 12А11, 1дО1 изотипы предпочтительны для снижения нейритной дистрофии.

Эксперименты, демонстрирующие свойства связывания и ш νί\Ό эффективность антитела 12А11, также описаны в статье Βηγ6. е! а1. ΡΝΑ8, 100:2023 (2003), вводимой в данное описание в качестве ссылки.

Если суммировать вышесказанное, все антитела проявляют значительную авидность к агрегированному Αβ и включают клиренс бляшек в анализе ех νί\Ό. 1дО2а изотип (аффинность к Рс-рецепторам, в частности к РсуЯГ), по-видимому, является важным свойством как для клиренса Αβ, так и для защиты против нейритной дистрофии. Антитело 12А11 (1дО1) связывает растворимый мономерный Αβ1-42 более эффективно, чем 12В4 (1дО2а) или 10Ό5 (1дО1), но не эффективно для снижения нейритной дистрофии. Повышенная эффективность при снижении количества (уменьшении) бляшек и уменьшении нейритной дистрофии может быть достигнута путём создания антител к ним, которые имеют изотип, максимально поддерживающий фагоцитоз. Особенно эффективные антитела связываются с эпитопами в пределах Ν-конца Αβ.

Пример III. Клонирование и секвенирование вариабельных областей мышиного антитела 12Α11.

Клонирование и анализ последовательностей УН 12Α11.

Области УН и УЪ антитела 12А11 клеток гибридомы клонируют с помощью ЯТ-РСЯ (ПЦР) 5' ЯΑСΕ, используя мРНК клеток гибридомы и стандартную методику клонирования. Нуклеотидная последовательность (кодирующая, 8ΕΟ ГО N0:3) и предсказанная (расшифрованная) аминокислотная последовательность (8ΕΟ ГО N0:4), полученная при использовании независимых клонов кДНК, кодирующей предполагаемый УН домен 12А11, представлены в табл. 3 и 4 соответственно.

Таблица 3 Последовательность ДНК мышиного УН домена 12А11 АТС6АСАСССТТАСТАСТТСАТТССТССТССТОАТТСТСССТССАТАТСТСТГ 6ТСССААОТТАСТСТАААА<ЭАОТСТ<3(ЗСССТ6(ЗСАТАТТОАА<ЗСССТСАСАО АСССТСАаТСТОАСТТОТТСТТТСТСТСООТТТТСАСТОАбСАСТТСТООТАТ ОАОТОТАОССТООАТТСОТСАОССТТСАОССААСОСТСТбОАОТООСТССС АСАСАТТТООТбООАТОАТбАТААОТАСТАТААСССАТСССТОААОАОСССО СТСАСААТСТССААООАТАССТССАСАААССА6СТАТТССТСААСтАТСАССА ОТСТОСАСАСТССАОАТАСТСССАСТТАСТАСТОТССТССААОААСТАСТАС бССТСАСТАСТТТСССТАСТСОССгССААСОСАССАСТСТСАСАСтТСТССТСА (5ЕС) ГО N0:3)

Таблица 4 Аминокислотная последовательность мышиного УН домена 12А11 т6гШзЛШураууЕЦУТЕК±:ЗОРО£ЕКР80ТЕ8ЕТСЗР80Р5Е8Е£т₅У£ВДЯЦР8аКО ЕЕТЛЪАЫтр/6сИкуупр51кзЯЕТ13КЛТЗЯНЦУЕЕК1Т8УЛТАЛТАТУУСАКгШас1уРа у\УО0ОТТЕТУЗЗ(ЗЕЦ ГО ΝΟ: 4)

Лидерный пептид и СБЯ показаны строчными буквами (нижний регистр).

-38 012407

Клонирование и анализ последовательностей УЪ 12Α11.

Вариабельную область лёгкой цепи УЪ клонируют аналогично УН области. Нуклеотидная последовательность (кодирующая, 8ЕЦ ΙΌ N0:1) и предсказанная (расшифрованная) аминокислотная последовательность (8ЕЦ ГО N0:2), полученная при использовании двух независимых клонов кДНК, кодирующих предполагаемый УЪ домен 12А11, представлены в табл. 5 и 6 соответственно.

Таблица 5 Последовательность ДНК мышиного УЪ домена 12Α11

АТСААаТТОССТбТТАОССТбТТССТССТбАТСТТСТССАТТССТОСТТССАО

САСТСАТСТТТТСАТСАСССАААСТССАСТСТСССТаССТСТСАСТСТТОСАО атсаассстссатстсттосаоатстаотсасаосаттстасатаотаатсс АААСАССТАСТТАОААТбСТАССТССАОАААССАССССАОТСТССАААОСТ ССТ(1АТСТАСАЛА0ТТТССА.АСС0АТПТСтаС6ОТСССА0АСА0СТТСАСТ аОСАОТОСтАТСАССОАСАбАТТТСАСАСТСААСАТСАССАОАСТСЮАОССТ САООАТСТСССААТТГАТТАСТбСТТТСАААСТТСАСАТОТГССТСТСАССТТ СООТССТССОАССААОСТССАбСТСААА (8Ε0ΙΏΝΟ:1)

Таблица 6 Аминокислотная последовательность мышиного УЪ домена 12А11 ткйругПу1п1£мраз5зОУЬМТ0ТР1_5ЬРУ8ЪОО0А818Сге8_Чк1уЬ5ПЕп1у]еУПТ0КРбр БРКЬЫУкУЗпгГзОУРПКЕЗСЗОЗСТПЕГШЗКУЕЛЕОЬОГГУСГямкурНРСтАбТК

ЬЕЬК (5Е0 ГО N0:2)

Лидерный пептид и области СОК показаны строчными буквами (нижний регистр).

Последовательности УЪ и УН антитела 12А11 отвечают критериям для функциональных У областей, поскольку они содержат непрерывную 0КР от начального метионина до С-участка и имеют общие консервативные остатки, характерные для генов У областей иммуноглобулина. От Ν- до С-конца как лёгкая, так и тяжёлая цепи содержат домены РК1, СОК1, РК2, СОК2, РК3, СЭК3 и РК4.

Пример ГУ Экспрессия химерного антитела 12Α11.

Экспрессия химерного антитела 12А11.

Вариабельные области тяжёлой и лёгкой цепей воссоздают (методом рекомбинантной ДНК) с целью кодировать донорные сайты сплайсинга 3' относительно точек соединения УЭУ и У1 областей и клонируют в экспрессирующий вектор млекопитающего рСМУ-1у 1 для тяжёлой цепи и рСМУ-1к 1 для лёгкой цепи. Эти векторы кодируют человеческие у1 и Ск константные области в виде экзонных фрагментов 3' от встроенного кластера вариабельной области. После верификации последовательностей экспрессирующие векторы тяжёлой цепи и лёгкой цепей котрансфецируют в клетки С08. Различные клоны тяжёлой цепи независимо с различными химерными клонами лёгкой цепи подтверждают воспроизводимость результата. Антитела иммунопреципитируют из сред, кондиционированных клетками С08, с применением протеин-А-сефарозы. Цепи антитела детектируют иммуноблоттингом после электрофореза в 8^8-ΡЛСЕ гелях. Обнаружение выполняют, используя антитело козы к человеческому ГдС (Н+Ь) при разведении 1:5000 при комнатной температуре в течение 1 ч. Значительные количества Н+Ь цепи 12А11 обнаруживают в кондиционированных средах.

Непосредственное связывание антитела 12А11 с Αβ определяют с помощью метода ΞυδΑ. На фиг. 4 показано, что, как обнаружено, химерное антитело 12А11 связывается с Αβ с высокой авидностью, аналогичной авидности, проявляемой химерным и гуманизированным 3Ό6. (Клонирование, характеристики и гуманизация 3Ό6 описаны в патентной заявке США 10/010942, полное содержание которой вводится в данное описание в качестве ссылки). Авидность связывания также аналогична авидности связывания, проявляемой химерным и гуманизированным 12В4. (Клонирование, характеристики и гуманизация 12В4 описаны в патентной заявке США 10/338214, полное содержание которой вводится в данное описание в качестве ссылки).

Пример У. Гуманизация 12А11.

А. Гуманизированное 12А11 антитело, вариант 1.

Анализ гомологии/молекулярной модели.

Для идентификации ключевых структурных каркасных остатков в мышином 12Α11 антителе изучают трёхмерные модели с целью найти решённые мышиные антитела, имеющие гомологию с тяжёлой и лёгкой цепями антитела 12А11. Выбирают антитело, обозначенное 1КТК, имеющее близкую гомологию с лёгкой цепью 12А11, и два антитела, обозначенных ΓβΤΖ и 1ГКН, имеющие близкую гомологию с тяжёлой цепью 12А11. У этих мышиных антител наблюдается жёсткая консервация последовательностей с 12А11 (94% идентичность 112 аминокислот для Ук и 83% идентичность 121 аминокислот, соответствен но, для УН). Последовательность (структуру) тяжёлой цепи ΓΞΤΖ налагают на структуру тяжёлой цепи 1КТК. Помимо этого, по Ук СБК петли выбранного антитела попадают в те же самые канонические структурные классы С1о!Ыа, что и СБК петли УЪ 12А11. Кристаллические структуры этих антител изучают на наличие остатков, по прогнозам являющихся важными для функции антитела и, по аналогии, для функции сходного антитела 12А11.

Отбор последовательностей человеческого акцепторного антитела.

Подходящие последовательности человеческого акцепторного антитела идентифицируют, проводя компьютерное сравнение аминокислотных последовательностей мышиных вариабельных областей с последовательностями известных человеческих антител. Сравнение осуществляют отдельно для тяжёлой и лёгкой цепей 12А11. В частности, вариабельные домены человеческих антител, каркасные последовательности которых проявляют высокую степень идентичности последовательностей с мышиными УЪ и УН каркасными областями, идентифицируют, сравнивая, по запросу из базы данных 1д NСВI с помощью NСВI ВЪА8Т (общедоступной через NСВI Интернет-сервер Национального института здравоохранения), с соответствующими мышиными каркасными последовательностями. Две кандидатные последовательности выбирают в качестве акцепторных последовательностей на основании следующих критериев: (1) гомология с последовательностью-предметом разговора; (2) канонические СБК структуры, общие с донорной последовательностью; и/или (3) не содержат редких аминокислотных остатков в каркасных областях. Отобранная акцепторная последовательность для УЪ представляет собой ВАС01733 в NСВI 1д базе неизбыточных данных. Отобранная акцепторная последовательность для УН представляет собой ААА69734 в NСВI 1д базе неизбыточных данных. ААА69734 представляет собой антитело человеческой подгруппы ΙΙΙ (скорее, нежели подгруппы ΙΙ), но его выбирают в качестве исходного акцепторного антитела, по меньшей мере частично, на основании мотивировок, представленных 8а1бапНа е! а1. (1999), Мо1. 1ттипо1. 36:709. Для первых вариантов гуманизированного 12А11 антитела используют эти последовательности отобранного акцепторного антитела. Антитело описано в 8сНгоебег апб Аапд (1990), Ргос. Νίώ. Асаб. 8сВ И8А 872:6146.

Замена аминокислотных остатков.

Как отмечается выше, гуманизированные антитела по изобретению содержат вариабельные каркасные области, главным образом (практически) из человеческого иммуноглобулина (акцепторного иммуноглобулина), и гипервариабельные области, главным образом (практически) мышиного иммуноглобулина (донорного иммуноглобулина), названного 12А11. После идентификации гипервариабельных областей 12А11 и соответствующих человеческих акцепторных иммуноглобулинов следующей стадией является определение, какие остатки, если таковые имеются, этих компонентов следует заменить, чтобы оптимизировать свойства полученного гуманизированного антитела.

Изменённая У область лёгкой цепи.

Выравнивание аминокислотной последовательности изменённой У области лёгкой цепи показано на фиг. 5А. Выбор акцепторного каркаса (ВАС01733) из той же самой человеческой подгруппы обусловлен тем, что он соответствует мышиной У области, не содержит необычных каркасных остатков и области СБК принадлежат к тем же каноническим структурных группам С1о11иа. В варианте 1 гуманизированного 12А11 нет никаких обратных мутаций.

Изменённая У область тяжёлой цепи.

Выравнивание аминокислотной последовательности изменённой У области тяжёлой цепи показано на фиг. 5В. Акцепторный каркас (ААА69734) выбран из человеческой подгруппы III (как описано ранее) и не содержит необычных каркасных остатков. Структурный анализ мышиной УН цепи (ΒΞΤΖ и 1ВКН) в сочетании с выравниванием аминокислотной последовательности ААА69734 с мышиной последовательностью диктует наличие 9 обратных мутаций в варианте (версии) 1 (ν1) изменённой тяжёлой цепи: А24В Τ288 В29Ъ У371 У48Ъ В67Ъ К71К Ν73Τ Ъ78У (номенклатура КаЬа!). Обратные мутации в выравнивании аминокислотных последовательностей выделены звёздочками на фиг. 5В.

Из 9 обратных мутаций 3 диктуются моделью, так как эти остатки являются каноническими остатками (А24В, В29Ъ и К71К, сплошная раскраска), т.е. каркасные остатки, которые могут внести вклад в связывание с антигеном вследствие близости к СБК остаткам. Имеется одна обратная мутация в следующем наиболее важном классе остатков, в остатках интерфейса (поверхности раздела), участвующих во взаимодействиях УН-УЪ упаковки (подчёркнута), т.е. У371. Мутация Ν37Τ в вернье-остатке (выделена пунктиром) на конце сайта связывания, вероятно, взаимодействующего с 830, прилегающим к СБК1. Остальные 4 остатка, намеченных для обратной мутации (Τ288, У48Ъ, В67Ъ, Ъ78У, номенклатура КаЬа!), также попадают в вернье класс (непрямой, опосредованный вклад в СБК конформацию, выделены пунктиром на фиг. 5В).

Замены, включённые в вариант (версию) 1 гуманизированного 12А11, кратко представлены в табл. 7.

-40 012407

Таблица 7

Краткие сведения о заменах в гуманизированном 12 А Ι1.νΙ

В табл. 8 и 9 представлены указатели к номенклатуре КаЬаБ для различных лёгкой и тяжёлой цепей соответственно. Таблица 8 Указатель к номенклатуре КаЬаБ для лёгкой цепи 12А11

КАВ	#	ТИП	мы	Ι111Π1	ВАС	А19-	Приме-
#			ш,12	12А11	01733	Зарод.	чаиия
			АН	УЬ		ЛИНИЯ
			УЪ
I	I	РК.1	ϋ	ϋ	ϋ	β
2	2		V	V	V	I	канонический
3	3		ь	V	V	V
4	4		м	м	м	м	вернъе
5	5		т	т	т	т
6	6		с	Ω	ф	<2
7	7		т	8	8	8
8	8		Р	Р	Р	Р
9	9		ь	ь	ь	ь
10	10		8	8	8	8

-41 012407

11	11	Б	Е	ь	Е
12	12		Р	Р	Р	Р
13	13		V	V	V	V
14	14		8	т	т	т
15	15		б	Р	Р	Р
16	16		С	о	б	б
17	17		ϋ	Е	Е	Е
18	18		9	Р	Р	Р
19	19		А	А	А	А
20	20		8	8	8	8
21	21		I	I	I	I
22	22		8	8	8	8
23	23		С	С	С	С
24	24	СОЮ	К	В	К	К.
25	25		8	8	8	8
26	26		8	8	8	8
27	27		9	9	9	9
27А	28		8	8	8	8
27В	29		I	I	Е	Е
27С	30		V	V	б	Е
27Ό	31		н	н	н	Н
27Е	32		8	8	8	8
28	33		N	N	N	N
29	34		С	О	б	б
30	35		N	N	Υ	Υ
31	36		Т	Т	N	N
32	37		Υ	Υ	Υ	Υ
33	38		ί	ь	Е	Е
34	39		Е	Е	ϋ	Э
35	40	РК2	XV	XV	XV	XV
36	41		Υ	Υ	Υ	Υ	упаковка
37	42		Е	ь	ь	Б
38	43		9	9	9	9	упаковка
39	44		К	К	к	к
40	45		Р	Р	Р	Р	вернъе
41	46		с	а	с	О
42	47		9	Ω		9

-42 012407

43	48	5	8	8	3
44	49		Ρ	Р	Р	Р	упаковка
45	50		к	<2	<2	<2
46	51		I	ь	ь	β	упаковка
47	52		г	ь	ь	ь	вернее
48	53		г	I	I	I	канонический
49	54		Υ	Υ	Υ	Υ	вернее
50	55	СОК2	к	к	ь	ь
51	56		V	V	О	о
52	57		8	8	8	8
53	58		N	N	N	N
54	59		К.	К.	К.	к
55	60		Р	Р	А	А
56	61		8	8	8	8
57	62	гкз	О	О	О	О
58	63		V	V	V	V
59	64		Р	Р	Р	Р
60	65		ϋ	ϋ	β	ϋ
61	66		η	Ώ	15	т>
62	67		Ρ	Р	Р	Ρ
63	68		5	3	3	3
64	69		С	О	<3	6	канонический
65	70		5	3	8	8
66	71		О	с	6	О	вернее
67	72		8	3	3	8
68	73		С	с	<3	α	вернее
69	74		т	т	т	т	вернее
70	75		ϋ	ϋ	ϋ	ϋ
71	76		Р	Р	Р	Ρ	канонический
72	77		т	т	т	τ
73	78		ь	β	β	β
74	79		к	к	к	κ
75	80		I	[	I	I
76	81		8	3	3	8
77	82		Р.	Р	к	Π
78	83		V	V	V	V
79	84		Е	Е	Е	Ε

-43 012407

80	85	А	А	А	А
81	86		Е	Е	Е	Е
82	87		0	ϋ	ϋ	ϋ
83	88		Σ	V	V	V
84	89		С	О	О	О
85	90		I	V	V	V
86	91		Υ	Υ	Υ	Υ
87	92		Υ	Υ	Υ	Υ	упаковка
88	93		С	с	с	с
89	94	СйК.3	Е	Р	м	м
90	95		Ω	Ω	б	б
91	96		5	8	А	А
92	97		8	8	ь	Ь
93	98		Н	Н	<2	<2
94	99		V	V	т	т
95	100		Р	Р	Р	Р
96	101		ί	ί	Υ
97	102		т	т	т
98	103	РК.4	Р	Е	Р		упаковка
99	104		с	О	а
100	105		А	<Э	<2
101	106		О	О	с
102	107		т	т	т
103	108		к	к	к
104	109		ь	ь	ь
105	110		Е	Е	Е
106	111		ь	I	I
106А	112		к	к	К

-44 012407

Таблица 9

Указатель к номенклатуре КаЬа! для тяжёлой цепи 12А11

КА В	#	ТИП	мы	Нит	ААА	567123	Примечания
#			ш.12	12А11	69734	Зарод.
			Л11	УН		линия
			УН
I	1	ΡΚ.Ι	<2	<3	<2	Р
2	2		V	V	V	V	вернье
3	3		т	<2	Р	<2
4	4		ь	Б	ь	ь
5	5		к	V	V	V
6	6		Е	Е	Е	Е
7	7		5	8	8	8
8	8		а	6	О	О
9	9		Р	С	<3	6
10	10		с	а	О	С
И	И		I	V	V	V
12	12		ь	V	V	V
13	13		к	Р	<2	<2
14	14		Р	Р	Р	Р
15	15		8	6	о	с
16	16		<2	к	к	к
17	17		т	8	8	8
18	18		ь	Ь	Ь	Е
19	19		8	К	В	Я
20	20		ь	ь	ь	Ь
21	21		т	8	8	8
22	22		с	С	С	С
23	23		5	А	А	А
24	24		Р	Р	А	А	канонический для	Н1-
							обратная мутация в νί
25	25		8	8	8	8
26	26		О	О	О	σ	канонический
27	27		Р	Р	Р	Р	канонический
28	28		8	8	т	т	вернье, близкий к обратная мутация в νί	Н1-
29	29		Ь	Ь	Р	Р	канонический для	Н1-

-45 012407

	обратная мутация в νί
30	30		8	8	8	8
31	31	СПК.1	Т	т	8	8
32	32		8	8	Υ	Υ
33	33		0	С	А	А
34	34		м	М	М	М
35	35		8	8	Н	н
35А	36		V	V	-	-
35В	37		6	0	-	-
36	38	Гк2	А	А	А	А
37	39		I	I	V	V	упаковка- обратная мутация в νί
38	40		к	Я	к	к
39	41		с?	<2	<2	<2	упаковка
40	42		Р	А	А	А
41	43		8	Р	Р	Р
42	44		6	6	О	С
43	45		К	К	к	к
44	46		6	0	с	с
45	47		ь	ь	ь	ь	упаковка
46	48		Е	Е	Е	Е
47	49		А	А	А	А	упаковка
48	50		Ь	Е	V	V	вернье (под Н2)- обратная мутация в ν 1
49	51		А	А	А	А
50	52	СПК2	Н	Н	V	V
51	53		I	I	1	I
52	54		Л¥	а	8	8
53	55		к	А	Υ	Υ
54	56		ϋ	ϋ	ϋ	ϋ
55	57		п	ϋ	о	С
			-	-	8	8
56	58		ϋ	э	N	N
57	59		к	к	К	К
58	60		Υ	Υ	Υ	Υ
59	61		Υ	Υ	Υ	Υ
60	62		N	N	А	А

-46 012407

61	63	Р	Р	ϋ	ϋ
62	64	8	8	8	8
63	65	Ь	Ь	V	V
64	66	К	К	К	К
65	67	8	8	с	с
66	68 РКЗ	К.	К	к	в
67	69	ь	Ь	Р	Р вернье (под Н2, возможно, взаимодей- ствует с Ε63ίобратная мутация в νί
68	70	т	т	т	Т
69	71	I	I	I	I
70	72	8	8	8	8
71	73	К	К	К	К канонический для Н2- обратная мутация в νί
72	74	ϋ	ϋ	ϋ	ϋ
73	75	т	т	N	N вернье (конец сайта связывания, возможно, взаимодействует с 830)обратная мутация в νί
74	76	8	8	8	8
75	77	К	К	К	К
76	78	N	N	N	N
77	79	Ω	Т	Т	Т
78	80	V	V	ь	Ь вернье (скрыт под Н1, возможно, взаимодей- ствует с Ύ35Α)- обратная мутация в νί
79	81	Р	Υ	Υ	Υ
80	82	ь	ь	ь	Б
81	83	к	<2	9	<2
82	84	I	м	м	м
82А	85	т	N	N	N
82В	86	8	8	8	8
82С	87	V	Ь	Ь	Ь
83	88	ϋ	К	К	К
84	89	т	А	А	А
85	90	А	Е	Е	Е
86	91	ϋ	О	ϋ	ϋ
87	92	Т	Т	Т	Т
88	93	А	А	А	А
89	94	Т	V	V	V

-47 012407

90	95	Υ	Υ	Υ	Υ
91	96		Υ	Υ	Υ	Υ	упаковка
92	97		с	с	С	с
93	98		А	А	А	А	упаковка
94	99		К	В	К	В	упаковка
			-	-	ϋ	ц
95	100	сокз	в.	к	В.	-
96	101		т	т	н	-
97	102		т	т	8	-
98	103		т	т	8	-
99	104		А	А	8	А
100	105		ϋ	ϋ	\ν	К
100 А	106		Υ	Υ	Υ	Б
100В	107		Е	Г	Υ	Е
101	108		А	А	О	М
102	109		Υ	Υ	м	Е
			-	-	ϋ	Е
			-	-	V	I
103	110		XV	χν	IV	8	упаковка
104	111		О	с	с	6
105	112		9	9	<2	А
106	113		О	6	О	К
107	114	РР.4	т	т	т	С
108	115		т	т	т	Ω
109	116		Б	V	V	\ν
110	117		т	т	т	8
111	118		V	V	V	Р
112	119		8	8	8	3
113	120		8	8	8	Б

Гуманизированные антитела предпочтительно проявляют аффинность специфичного связывания к

789 101

Αβ по меньшей мере 10 , 10 , 10 или 10 М^- . Обычно верхний предел аффинности связывания гуманизированных антител к Αβ в три, четыре или в пять раз выше этого показателя у 12А11 (т.е. ~10⁹ М^-1). Часто нижний предел аффинности связывания также в три, четыре или в пять раз выше этого показателя у 12А11.

Сборка и экспрессия УН и УЪ гуманизированного 12А11.

Вариант 1.

Для получения Н12Р11 ν I с применением подходящих олигонуклеотидных праймеров используют сборку посредством ПЦР. Нуклеотидные последовательности УЪ гуманизированного 12А11 (вариант 1) (8ЕО ГО N0:34) и УН 12А11 (вариант 1) (8Еф ГО N0:35) представлены в табл. 11 и 12 соответственно.

Таблица 10 Нуклеотидная последовательность гуманизированной УЪ 12Α11ν.1 аЕдаддсЕсссСдсЕсадсЬссЕддддсЕдсЬдаЕдсЕсЕдддЕсЕсСддсЕссадЕдддаАТСТТСТСАТ (ЗАСССААТСТССАСТСТСССтеССТСТСАЕТССТОСАОАСССАСССТССАТСТСТТеСАСАТСТАСТСАОА ОСАТТСТаСАТА(ЗТААТеОАААСАССТАССТ(ЗСААТС(ЗТАССТ6САОАААССАССССАСТСТССАСАбСТС

СТСЗАТСТАСАААСТТТССААСССЕАТТТТСТСОССТСССАОАСАОСТТСАСТЗССАСТСОАТСАОООАСАОА Т1ТСАСАСТСААОАТСАаСАаАСТ<ЗОА(ЭОСТОА[3(ЗАТаТ<Эа5АСТТТАТГАСТ(ЗСТТТСАААСТТСАСАТС ТТССТСТСАСеТТССМТСАасаСАССААССТОаАСАТСААА (2Е<2 ΙΠ N0:34)

Лидерный пептид, кодированный последовательностью А19 зародышевой линии, образованной из х63397 лидерного пептида (верхний регистр показывает только УЪ).

-48 012407

Таблица 11 Нуклеотидная последовательность УН гуманизированного 12 А 11ν1 аЬ дд ад бб С ддд с Е дадс Ьддд б Ь. б Ь с с С сд Ε ί дс Б сЬ 1: с Ьдададд Цдъ с сад Сд ЕС ААОТТСАБСТССТ ОСАСТСТ<ЮС&ОаЗС<ЗСТСЗаТССАОСССООАСОБТСССТСАСБСТСТСТТСЗТССТТТСТСТОССТТТТСАС ТОАаСАСЗ?ТСТООТДТаАСТСТСОасТССАТТССТСАОССТССАОС<ЗАДССЗ<ЗТСТСаАаТвССТ<ЗССАСАС АТТГССТСОБАТБАТБАТААСТАСТАТААСССАТСССТСААСАССССССТСАСААТСТССААОСАТАССТС САААААСАСССтаТАССТССАСАТСААСАСТСТССб|ЗаСТСААаАТАСТ6СССТСТАСТАСТСТССТССАА СААСТАСТАССаСТОАСТАСТТГОССТАСТОСООССААСССАССАСТатСАСАСТСТССТСА (5ЕО Ю N0:35)

Лидерный пептид (нижний регистр, строчные буквы) образован из УН донорной последовательности, депонированной под номером М34030.1/ааа69734/М72.

Аминокислотные последовательности УЬ гуманизированного 12А11 (вариант 1) (8Е0 ΙΌ N0:7) и УН 12А11 (вариант 1) (8Е0 ΙΌ N0:10) изображены на фиг. 5А и 5В соответственно.

B. Гуманизированные антитела 12А11, варианты 2, 2.1 и 3.

Остатки вернье (например, 828Т, У48Ь, Р68Ь, Ь78У) опосредованно вносят вклад в конформацию СОЯ и, как предполагают, имеют наименьшее влияние на нарушение конформации. Остатки, намеченные в качестве мишеней, мутируют с помощью сайт-направленного мутагенеза с применением набора 81га1а§епе и 1112Р11УН\'1 в плазмиде рСЯ8 в качестве матрицы для мутагенеза, в результате появляются клоны, соответствующие варианту 2. Секвенированный верифицированный инсерт У области варианта 2 субклонируют в сайты ВатШ/НтШП экспрессирующего вектора тяжёлой цепи рСМУ-Су1 для получения рекомбинантного антитела й 12А11 ν2. Аналогично получают антитело варианта 2.1, имеющее каждую из вышеуказанных мутаций вернье-остатков (т.е. элиминация обратных мутаций), помимо мутации в положении N37^ Аналогично, антитело варианта 3 содержит каждую из вышеприведённых мутаций, N288, Ь48У, Ь67Р, У78Ь, помимо мутации в положении К71Я.

C. Гуманизированные антитела 12А11, варианты 4-6.

Созданы дополнительные варианты гуманизированного 12А11, в которых сохраняются обратные мутации в канонических остатках и остатках упаковки, но исключаются обратные мутации в одном (варианты 4.1-4.4), двух (варианты 5.1-5.6) или трёх (6.1-6.4) вернье-остатках. Сайт-направленный мутагенез и конструкцию клона осуществляют, как описано выше в подразделе С. Рекомбинантные антитела экспрессируют в клетках С08 и очищают от С08-клеточного супернатанта. Дополнительные варианты могут включать комбинации вышеуказанных вариантов, например человеческие аминокислотные остатки в 1, 2, 3, 4 и 5 вернье-остатках в комбинации по меньшей мере с одним остатком упаковки и/или каноническим аминокислотным остатком (например, человеческие остатки в положениях 28, 37, 48, 67, 71 и 78 или человеческие остатки в положениях 28, 37, 48, 67, 71, 73 и 78).

Ό. Гуманизированные антитела 12А11, варианты 7 и 8.

Создают седьмой вариант гуманизированного 12А11, содержащий каждую из обратных мутаций, указанных для варианта 1, за исключением обратной мутации Т^8 в остатке 28 (вернье) и обратной мутации У-^Ι в остатке 37 (упаковка). Создают восьмой вариант гуманизированного 12А11, содержащий каждую из обратных мутаций, указанных для варианта 1, за исключением обратной мутации Н^Т в остатке 73 (вернье). Аминокислотные последовательности тяжёлых цепей вариантов 7 и 8 гуманизированного 12А11 представлены в виде 8Е0 ΙΌ N0:30 и 31 соответственно.

По сравнению с вариантом 1 вариант 7 содержит только 7 обратных мутаций. Обратная мутация Т288 является консервативной и исключается в варианте 7 тяжёлой цепи. Обратная мутация в остатке упаковки У37I также исключается в варианте 7. По сравнению с вариантом 1 вариант 7 содержит только 8 обратных мутаций. В варианте 8 обратная мутация №3Т (вернье) исключается.

Дополнительные варианты могут включать комбинации приведённых выше вариантов, например человеческие остатки (например, элиминация обратной мутации) в 1, 2, 3, 4 (или 5) остатках, выбранных их положений 28, 48, 78 и 73, необязательно в комбинации с элиминацией обратной мутации по меньшей мере в одном остатке упаковки (например, положение 37) и/или по меньшей мере в одном каноническом остатке.

Пример УТ. Функциональное тестирование гуманизированных 12А11 антител.

Гуманизированное антитело 12А11, вариант 1 клонируют, как описано в примере У. Гуманизированное антитело 12А11 получают транзиторной экспрессией в клетках С08 и очищают общеизвестными в технике методами. Активность связывания гуманизированного антитела сначала демонстрируют анализом ЕЫ8А (данные не показаны). Далее гуманизированное 12А11, вариант 1 сравнивают с его мышиными и химерными аналогами по двум показателям: связывание с антигеном (количественный Αβ ЕЫ8А) и относительная аффинность. Активность связывания й12 А 11ν1 определяют количественным Аβ ЕЫ8А, найдено, что она идентична активности связывания мышиной и химерной формам 12А11 (см. фиг. 7).

-49 012407

Аффинность антитела Η12Α11ν1 сравнивают с мышиным и химерным антителами 12А11 также конкурентным Αβ ΕΠδΑ. Для анализа конкурентного связывания используют конъюгированное с биотином рекомбинантное мышиное антитело 12А11Су2а (переключение изотипа 12А11). Активность связывания биотинилирования т12А11Су2а с агрегированным Αβ1-42 подтверждают методом ΕΠδΑ, используя в качестве репортёра стрептавидин-ΗΚΡ. Прямое сравнение Αβ связывания двумя изоформами 12А11 (Су1, Су2а) с применением конъюгированного с пероксидазой хрена (ΗΚΡ) антитела козы против мышиного иммуноглобулина с ΗΚΡ меткой в качестве маркёра (репортёра) подтверждает, что конъюгированное с биотином рекомбинантное антитело 12А11Су2а сравнимо с исходным мышиным антителом Су1.

При изучении конкурентного связывания используют конъюгированное с биотином т12А11Су2а в постоянной концентрации, конкурирующее с испытуемыми антителами в интервале концентраций, как видно на фиг. 8. На фиг. 8 показаны результаты конкурентного анализа Ε12Α11ν1, в котором сравнивают Η12Α11ν1 с химерными и мышиными формами. Гуманизированное 12Α11ν1 конкурирует в пределах величины 2Х 1С₅₀ со своими мышиными и химерными аналогами. Эти данные согласуются с определением аффинности методом В1асоге (данные не представлены), которые показывают, что значения КО составляют 38 и 23 нМ для мышиного Су2а и Μ2Α11ν1 соответственно. Суммируя, можно сказать, что данные наводят на мысль, что Ε12Α11ν1 сохраняет свойства связывания с антигеном и аффинности исходного мышиного аналога.

Клетки СО8 транзиторно трансфецируют с применением различных комбинаций гуманизированной 12Α11νΗ и ΠΡΑΗν^! Кондиционированные среды собирают через 72 ч после трансфекции. Концентрацию антитела в кондиционированных средах трансфецированных клеток СО8 определяют количественным анализом ΕΠδΑ человеческого 1дС. Количественный анализ связывания с агрегированным Аβ(1-42) подтверждает, что связывание 1112А11ν2, ν2.1 и ν3 с антигеном сравнимо с 1112А11у1 и с химерным 12А11. Кроме того, варианты 5.1-5.6 и 6.1-6.3 проявляют сходную активность связывания при изучении этим анализом связывания. Вариант 6.4 проявляет некоторую потерю активности в этом анализе, но активность заметно восстанавливается в ν2.

Свойства связывания мышиного 12А11 и Μ2Α11ν1 сравнивают также методом В1асоге. Мышиное 12А11 и Μ2Α11ν1 показывают сходные профили связывания при экспозиции с иммобилизованным Αβпептидом как низкой, так и высокой плотности (био-^ЛΕ пептид). Также проводят кинетический анализ мышиного 12А11 в сравнении с Μ2Ά11ν1. В этих исследованиях для измерения связывания растворимого антитела со связанным с твёрдой фазой биотинилированным ΩΑΕ пептидом используют метод В1асоге. Пептид иммобилизуют на сенсорном чипе со стрептавидином, варьируемые концентрации каждого антитела применяют в тройном повторе и связывание измеряют как функцию времени. Кинетические данные анализируют, используя программное обеспечение ВIΑеνа1иаί^οη, прилагаемое к бивалентной модели. Средние константы скорости диссоциации (к,|) и ассоциации (к_а) вычисляют по подходящим областям сенсограмм, используя глобальный анализ. Константу аффинности взаимодействия между биоΟΑΕ^ и антителами вычисляют исходя из кинетических констант скорости. На основании этих измерений вычисляют средние константы скорости диссоциации (к<|) и ассоциации (к_а), которые используют для расчёта величины К_с взаимодействия. Табл. 12 включает обобщённые результаты кинетического анализа связывания Αβ антителами 12Α11 по определению анализом В1асоге.

Таблица 12

Бивалентная модель (глобальный анализ)
Антитело	Ка(1/М. сек)	Кб(1/сек)	КА (1/М)	КО(нМ)	СЫ2
т12А11	1.05Е+05	3.98Е-03	2.64Е + 07	38.00	0.247
Μ2ΑΙ1ν1	1.47Е + 05	3.43Е-03	4.29Е + 07	23.30	0.145

Данные показывают, что гуманизированное антитело 12А 11ν1 имеет аффинность к Αβ пептиду, сходную с аффинностью к Αβ исходного мышиного антитела 12А11.

Пример VII. Предупреждение заболевания у человека и лечение людей.

Для определения безопасности для человека проводят испытания фазы Ι в однократной дозе. Терапевтический агент вводят в увеличивающихся дозах различным пациентам, начиная примерно с 0,01 уровня предполагаемой эффективности, и увеличивают в три раза до тех пор, пока не достигнут уровня, примерно равного 10-кратной эффективной мышиной дозе.

Для определения терапевтической эффективности проводят испытания фазы II. Отбирают больных болезнью Альцгеймера, начавшейся в раннем и среднем возрасте, определённой как вероятная ΑΌ болезнь по критериям ассоциации Болезнь Альцгеймера и родственные заболевания (ΑΌΚΟΑ). Подходящие пациенты имеют показатель в интервале 12-26 в соответствии с мини-исследованием ментального статуса (ΜΜ8Ε). Другим критерием отбора является вероятность того, что пациенты перенесут исследование, и отсутствие осложняющих обстоятельств, таких как применение других препаратов, которые могли бы оказать вредное воздействие. Фоновые (начальные) оценки функции пациента делают на основании классических психометрических измерений, таких как ММ8Е и ΑΌΑ8, которые представляют собой полную шкалу для оценки пациентов со статусом и функцией болезнь Альцгеймера. Эти психометрические шкалы позволяют измерять прогрессирование состояние при болезни Альцгеймера. Для мониторинга лечения можно также использовать подходящие шкалы оценки качества жизни. Прогрессирование заболевания можно также контролировать с помощью МЯ1. Характеристики крови пациентов можно также контролировать с помощью анализов иммуногенспецифических антител и Т-клеточных реакций.

После измерений фона (начальных) пациенты начинают получать лечение. Их рандомизируют и лечат либо терапевтическим агентом, либо плацебо слепым методом.

Пациентов контролируют по меньшей мере каждые шесть месяцев. Эффективность проверяют по значительному уменьшению прогрессирования (заболевания) в группе, получающей терапевтическое средство, по сравнению с группой плацебо.

Испытания II фазы проводят для оценки перехода пациентов от не являющейся болезнью Альцгеймера ранней потери памяти, иногда называемой возрастным снижением (ухудшением) памяти (ΑΑМI) или лёгкой когнитивной недостаточностью (МО), к вероятной болезни Альцгеймера по критериям ΑΌΚΟΑ. Пациентов с повышенным риском перейти к болезни Альцгеймера отбирают из популяции неклинических пациентов скринингом стандартных (эталонных) популяций на ранние признаки ухудшения памяти или другие затруднения, ассоциированные с пре-альцгеймеровой симптоматологией, болезнь Альцгеймера в семейном анамнезе, генетические факторы риска, возраст, пол и другие признаки, по которым, как обнаружено, можно прогнозировать повышенный риск заболевания болезнью Альцгеймера. Объединяют начальные оценки в соответствующих системах (шкалах), включая ММ8Е и ΑΌΑ8, вместе с другими показателями, предназначенными для оценки более нормальной популяции. Эти популяции пациентов делят на соответствующие группы с целью сравнения групп плацебо с группами, принимающими различные дозы агента. Эти популяции пациентов идут с интервалами около шести месяцев и конечная точка для каждого пациента - превратится ли он в больного вероятной болезнью Альцгеймера по критериям ΑΌΚΟΑ к концу наблюдения.

Хотя данное изобретение описано выше подробно для чёткости понимания, очевидно, что при практическом применении изобретения можно сделать некоторые модификации.

Из вышеприведённого ясно, что данное изобретение охватывает ряд применений. Например, изобретение включает применение любого из описанных выше антител к Αβ для лечения, профилактики или диагностики амилоидогенного заболевания или в производстве лекарственного средства или диагностической композиции для вышеуказанного применения.

-51 012407

Список последовательностей <110> Ньюралаб Лимитед, Вайет <120> ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА, РАСПОЗНАЮЩИЕ БЕТА-АМЮТОИДНЫЙ ПЕПТИД <130> ЕЬН-028РС <150>'60/474654 <151> 2003-05-30 <160> 35 <170> Р'азбЗЕО Гог ИГпйоы® Уегзгоп 4.0 <210> 1 <211> 5:93 <212> ДНК <213> Мышияая <220>

<221> СОЗ <222> (1)...(393) <220>

<221> сиг. пептид <222> (1)...(57)

<400> 3

дбд Уа1

сод Ьеи -10

абд Меб

ббс РЬе

ьдд Тгр

абб Не

со! Рго -5

дсб А1а

4 8

абд МеО

аас( Ьуз

Ьеи

сс-е Рго

д26 Уа1 -15

адд Агд

ебд Ьеи

77д Ьеи

Осс

аде:

адт

да!

дЬЬ

ббд

абд

асе

саа

асб

сса

сбс

бсс

ебд

ссГ

дбе

96

Зег

Зег

бег

Азр

Уа1

Ьеи

Меб

ТЬг

31п

ТЬг

Рго

Ьеи

Зег

Ьеи

Рго

Уа1

1

5

10

адб

с 0 2

дда

дас

саа

дес

Осс

абс

ЬсЬ

бде

ада

ЬсС

адб

сад

где

аН

144

Зег

Ьеи

Сз 1 у

Азр

С1п

А1а

Зег

Не

Зег

Су®

Агд

5ег

Зет

61п

5ег

Не

15

20

25

дба

саб

ад1.

ааг

дда

аас

асе

бас

с Да

даа

бдд

бас

ебд

сад

айй

сса

192

Уа1

Нтз

5ег

Азп

С1у

Азп

ТЬг

Туг

Ьеи

С1и

Тгр

Туг

Ьеи

31п

Ьуз

Рго

30

35

40

45

ддс

сад

ϊοΐ:

сса.

аад

сбс

ебд

абс

бас

ааа

дбб

бсс

аас

еда

ббб

бсб

240

<31 у

С1п

Зег

Рго

Ьуа

Ъеи

Ьеи

11е

Туг

Ьу®

Уа1

Зег

Азп

Агд

Е’Ье

Зег

50

55

60

ддд

дбе

сса

дас

адд

ббс

адб

ддс

адб

дда

Сса

ддд

аса

даб

ббс

аса

238

С1у

Уай

Рго

Азр

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зет

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

65

70

75

сбс

аад

ЙиС

аде

ада

дЬд

дад

дсб

дад

даб

ебд

дда

абб

бас

бас

бде

336

Ьеи

Ьуз

Ле

Зег

Агд

Уа1

С1и

А1а

С1и

Азр

Ьеи

С1у

Не

Туг

Туг

Суз

80

85

90

-52 012407

«2 РЬе

саа С1п 95

адр Зег

Рса Зег

саР ΗΪΞ

д22 Уа1

сер Рго 100

сРс Ьеи

асд ТНг

РРс РНе

дде С1у

дсР А1а 105

ддд С1у

асе ТЬг

аад Ьуз

ерд Ьеи

384

дад

сед

ааа

393

С1ц

Ьеи

Ьуз

по

<210>	2
<211>	131
<212>	Белок
<213>	Мышиный
<220>
<221>	Сигнальный
<222>	(1)...(19)
<400>	2

Ме!

Ьуз

Ьеи

Рго

\7а1 -15

Агд

Ьеи

Ьеи

У а 1

Ьеи -10

Ме!

РНе

Тгр

Не

Рго -5

А1а

Зег

Зег

5

Азр

Уа1

Ьеи

Ме!

ТНг

С1п

ТНг

Рго

Ьеи

Зег

Ьеи

Рго

Уа1

1

5

10

Зег

Ьеи

СТу

Азо

31 Г;

А1а

Зег

Не

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

61п

Зег

Не

15

2 0

25

Та1

Н1з

Азп

3 у

Азп

Таг

Туг-

Ьеи

61и

Тгр

Туг

Ьеи

Сл п

Ьуз

Рго

3 0

35

40

45

С:1у

61 η

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Пе

Туг

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Агд

РНе

Зег

50

5 5

60

С1у

Уа1

Рго

Азр

Агд

РНе

Зет

61у

Зег

61у

Зег

61 у

ТИг

Азр

РНе

ТНг

65

70

75

Ьеи

Ьуз

Не

Зег

Агд

Уа1

61и

А.1а

61и

Азр

Ьеи

61у

11е

Туг

Туг

Суз

80

85

90

Иле

61 η

Зег

Зег

Н18

Уа1

Ρ1Ό

Ьеи

ТНг

РНе

61у

А1а

51у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

95

100

105

б!и Ьеи Ьуз

110 <2ΐα> з <211> 417 <212> ДНК <213> Мьпииная <220>

<221> СЬЗ <222> (1)...(417) <220>

<221> сиг. пептид <222> (1)...(57) <400> 3

агд

дас

адд

СРР

ас!

асЬ

Оса

сРд

сРд

сРд

аРР

дрс

ссР дса

На!

48

Не!

Азр

Агд

Ьеи

ТНг

Τηχ

Зег

РНе

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Не

Уа1

Рго А1а

Туг

-15

-10

-5

д'сс

Ь ид

1:сс

саа

дРР

асЬ

сРа

ааа

дад

Р.сР

ддс

ССР

ддд

аРа РРд

аад

96

Уа1

Ьеи

Зег

61п

Уа1

ТНг

Ьеи

Ьуз

С1и

Зег

С1у

Рго

61у

Не Ьеи

Ьуз

1

5

10

-53 012407

ССС Рго

Аса Зег 15

сад 61П

асе ТНг

сАс Ьеи

адА Зег

сАд Ьеи 20

асА ТНг

АдА Суз

АсА Зег

ААс РЬе

АсА Зег 25

ддд 31у

СНА РНе

Аса Зег

сАд Ьеи

аде

асА

АСА

ддн

аАд

адА

дПа

ддс

Пдд

аНА

сдН

сад

ССА

Аса

ддд

аад

Зег

ТНг

Зег

С1у

МеН

Зег

УаЬ

С1у

Тгр

11е

Агд

СЬп

Рго

Зег

С1у

Ьуз

30

35

40

45

ддб

сНд

дад

Ндд

сАд

дса

сас

аАН

Адд

Адд

даН

даА

даН

аад

Нас

АаН

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Ьеи

А1а

Нез

11е

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

50

55

60

эас

оса

АСС

сНд

аад

аде

едд

САС

аса

аАс

Асе

аад

даН

асе

Асе

ада

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

ТНг

Не

Зег

Ьуз

Азр

ТНг

Зег

Агд

65

70

75

аас

сад

дна

ААс

сНс

аад

аАс

асе

адА

дАд

дао

асА

дса

даН

асН

дсс

Азп

СЬп

Н'а!

РНе

Ьеи

Ьуз

Не

ТНг

Зег

7а1

Азр

ТНг

А1а

Азр

ТНг

А1а

80

85

90

асН

Нас

Н ас

НдН

дсА

еда

ада

асН

асН

асд

дсА

дас

Нас

НАН

дсс

Нас

ТНг

Туг

Туг

Су®

А1 а

Агд

Агд

ТНг

ТНг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РНе

А1а

Туг

95

100

105

Гдд

ддс

с:аа

ддс

асе

асН

сНс

аса

д 1 с

ί СС

Аса

Тгр

<51 у

с;1п

С1у

ТНг

ТНг

Ьеи

ТНг

Уа1

Йег

Зег

110

115

120

<210> 4 <211> 139 <212> Белок <213> Мышиный <220>

<221> Сигнальный <222> (1)...(19) <400> 4

Мен

Азр

Агд

Ьеи

ТНг -15

Тпг

Зег

РНе

Ьеи

Ьеи -10

Ьеи

Не

Уа1

Рго

А1а -5

Тух

νύΐ

Ьеи

Зег

С1п

Уа1

ТЬг

Ьеи

Ьуз

31 и

Зег

С1у

Рго

С1у

Пе

Ьеи

Ьуз

1

5

10

Рго

Зег

31 п

ТНг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТНг

Суз

Зег

РНе

Зег

<31 у

РЪе

Зег

Ьеи

15

20

25

Зег

ТНг

Зег

(Пу

Мен

Зег

УаЬ

С1у

Тгр

Не

Агд

СЬп

Рго

Зег

С1у

Ьуз

30

35

40

45

31у

Ьеи

С1и

Тгр

Ьеи

А1а

Нгз

Не

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

50

55

60

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Ьуз

Зег

Анд

Ьеи

ТНг

Не

Зег

Ьуз

Азр

ТНг

Зег

Агд

65

70

75

Азп

СЬп

Уа1

РНе

Ьеи

Ьуз

Не

ТНг

Зег

Оа1

Азр

ТНг

А1а

Азр

ТНг

А1а

80

85

90

ТНг

Туг

Туг

Суз

А1а

Агд

Агд

ТНг

ТНг

ТНг

АЬа

Азр

Туг

РНе

АЬа

Туг

95

100

105

Тгр

61у

С1п

31 у

ТНг

ТНг

Ьеи

ТНг

Уа1

Зег

Зег

110

115

120

-54 012407 <210> 5 <211> 429 <212> ДНК <21 3> Искусственная последовательность <220>

<223> синтетическая <400> 5 стдтаадсЕЕ дссдссасса ЕдаадЕЕдсс ЕдЕЕаддсЕд ЕЕддСдсЕда рдЕЕсЕддаР60

ЕссЕдсЕРсс адсадЕдаЕд ЕЕЕЕдаРдас ссааасРсса сЕсЕсссЕдс сРдгсадРсР120

РддадаРсаа дссрссаРср сЕРдсадаРс РадРсададс аРРдРасаРа дРааРддааа180 сассРасРРа даарддрасс Рдсадааасс аддссадрср ссааадсРсс РдаРсРасаа240 адРРРссаас сдаРЬРРсРд дддрсссада саддррсадб ддсадрддар садддасада300

РРЕсасасРс аадабсадса дадрддаддс РдаддаРсРд ддааРРРаРР асРдсРЕРса360 аадРРсасаР дЕРссРсРса сдЕЕсддЕдс Едддассаад сРддадсрда васдРдадРд120 даРссРтдр429 <210> 6 <211> 445’ <212> ДНК <213> Искуственная последовательность <220>

<223> синтетическая <4 0О> 6 аадсррдссд ссассаРдда саддсРЕаср асЕРсаРЕсс РдсРдсРдаР РдРсссРдса60

РаСдЕсРЕд·: сссаадРРас ЕсЕаааадад ЕсЕддсссЕд ддаРаРЕдаа дсссРсасад120 асссРоадЕс ЕдасРРдЕРс РЕРсЕсЕддд ЕЕРРсасЕда дсасррсрдд РаРдадРдРа180 ддсРддаЕРс дРсадссРРс адддаадддР сбддадрддс ЕддсасасаР РРддРдддаР240 дардараад·; асСаРаассс аРсссРдаад адссддсЕса саабсРссаа ддаЕассЕсс300 адааассадд РаРРссвсаа даРсассадЕ дрддасасрд садаЕасЕдс сасЕЕастсас360 рдрдсрсдаа даасЕасЕас ддсЕдасРас РЕРдссЕасЕ ддддссаадд сассасЕсЕс420 асадСсЕссс саддрдадрд даЕсс44 5 <210> 7 <211> 112 <212> Белок <213> Искуственная последовательность <220>

<223> синтетическая Η12Α11ν1 - УД область <400> 7

Азр

Уа1

Уа1

Мер

ТНг

61п

Зег

Рго

Ьеи

Зег

Ьеи

Рго

Уа1

ТНг

Рго

61у

1

5

10

15

31и

Рго

А1а

Зег

Не

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

61п

Зег

Не

Уа1

ΗΪ8

Зет

20

25

30

Азп

С1у

Азп

ТНг

Тут

Ьеи

С1и

Тгр

Туг

Ьеи

С1п

Ьуз

Рго

61у

С1п

Зег

35

40

45

Рго

61 η

Ьеи

Кеи

Не

Туг

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Агд

РНе

Зег

С1у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РНе

Зет

С1у

Зет

С1у

Зег

31у

ТНг

Азр

РНе

ТНг

Ьеи

Ьуз

Не

65

70

75

80

Зег

Агд

Уа1

С1и

А1а

(3111

Азр

Уа1

31у

Уа1

Тут

Туг

Суз

РНе

С1п

Зег

85

90

95

Зег

Н1з

ν=1

Рхо

Деи

ТНг

РНе

61у

61п

Сту

ТНг

Ьуз

Ьеи

61и

Не

Ьуз

100

105

110

-55 012407

<210>	8
<211>	134
<212>	Белок
<2ЬЗ>	Ното зарЬепз
<220>
<221>	Сигнальный
<222>	(1)...(22)
<400>	8

Ме!

Ьуз

Туг -20

Ьеи

Ьеи

Рго

ТНг

АЬа -15

АЬа

АЬа

С1у

Ьеи

Ьеи -10

Ьеи

Ьеи

АЬа

АЬа

СЬп

Рго

АЬа

МеЬ

А1а

Азр

УаЬ

Уа1

МеТ

ТЬх

СЬп

Зег

Рго

Ьеи

Зег

-5

1

5

10

Беи

Рго

УаЬ

ТЬг

Рго

С1у

СЬи

Рго

А1а

Зег

Не

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

15

20

25

С1п

Бег

Ьеи

Ьеи

НЬг

Зег

Аап

СЬу

Туг

Азп

Туг

Ьеи

Азр

Тгр

Туг

Ьеи

30

35

40

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

Зег

₽Г0

С1п

Ьеи

Ьеи

Не

Туг

Ьеи

С1у

Зег

Азп

4 5

50

55

Агд

А1а

Зег

С1у

ϋ31

Рго

Азр

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

СЬу

Зег

СЬу

ТЬг

60

65

70

Азр

РЬе

Тог

Ьеи

Ьуз

Пе

Зег

Агд

УаЬ

СЬи

АЬа

СЬи

Азр

УаЬ

С1у

УаЬ

35

80

85

90

Туг

Туг

С/з

Мег

СЬп

АЬа

Ьеи

С1п

ТЬг

Рго

Туг

ТЬг

РНе

СЬу

С1п

С1у

95

100

105

ТЬг

Ьуз

Ьеи

СЬи

ЬЬе

Ьуз

120

<210> 9 <211> 120 <212> Белок <213> Ното зарЬепз <220>

<221> Сигнальный <222> (1)...(20) <400> 9

Ме“ -20

Агд

Ьеи

Рго

А1а

С1п -15

Ьеи

Ьеи

СЬу

Ьеи

Ьеи -10

МеГ

Ьеи

Тгр

Уа1

Зег - 5

С1у

5ег

Зег

С1у

Азр

Пе

УаЬ

МеЕ

ТЬг

С1п

Зег

Рго

Ьеи

Зег

Ьеи

Рго

1

5

10

УаЬ

ТНг

Рго

С1у

С1и

Рго

АЬа

Зег

11е

Зег

Суз

Агд

5ег

Зег

С1п

Зег

15

20

25

Ьеи

Ьеи

Нтз

Зег

Азп

С1у

Туг

Азп

Туг

Ьеи

Азр

Тгр

Туг

Ьеи

С1п

Ьуз

35

35

40

Рго

СЬу

СЬп

Зег

Рго

СЬп

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Ьеи

СЬу

5ег

Азп

Агд

АЬа

45

50

55

60

Зег

СЬу

УаЬ

Рго

Азр

Агд

РЬе

Зег

СЬу

Зег

С1у

Зег

СЬу

ТЬг

Азр

РЬе

65

70

75

ТЬг

Ьеи

Ьуз

11е

Зег

Агд

Уа1

СЬи

А1а

С1и

Азр

Уа1

СЬу

Уа1

Туг

Туг

80

85

90

Суз

Мег

С/_п

АЬа

Ьеи

СЬп

ТЬг

Рго

$5

100

-56 012407 <210> 10 <211> 120 <212> Белок <213> Искуственная последовательности <220>

<223> Ы2А11У1 - УН область <40()> 10

С1п 1

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1 5

(31и

Зег

С1у

С1у

61у 10

Уа1

Уа1

С1п

Рго

С1у 15

Агд

Бег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

РЬе

Зег

(Ну

РЬе

Зег

Ьеи

Зег

ТЬг

Зег

20

25

30

<31у

Меб

5ег

Уа1

61у

Тгр

Не

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Ьеи

А1а

ΗΪ3

11е

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

5ег

Агд

Ьеи

ТЬг

Пе

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азг.

ТЬг

Уа1

65

70

75

80

Туг

Ьеи

31П

Мер

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

Тпг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

Тгр

С1у

С1г.

100

105

110

С1у

ТКг

Т^г

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115 120

<21С>	11
<2 11 >	141
<212>	Белок
<213>	Ното заргепз
<220>
<221>	Сигнальный
<222>	(11... (19)
<400>	11

МеЬ

С1и

РЬе

С1у

Ьеи -15

Зег

Тгр

Уа1

РЬе

Ьеи -10

АЬа

Ьеи

Ьеи

Агд -5

С1у

Уа1

(31п

Суз

С1п

Уа 1

С1п

Ьеи

Уа1

С1и

Зег

С1у

С1у

С1у

Уа1

Уа1

С1п

1

5

10

Рго

С1у

Агд

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

С1у

РЬе

ТЬг

РЬе

15

20

25

Зег

Зег

Туг

А1а

Меб

Низ

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

30

35

40

45

С1и

Тгр

Ра1

А1а

Уа1

11е

Зег

Туг

Азр

С1у

5ег

Азп

Ьуз

Туг

Туг

А1а

50

5 5

60

Азр

Зег

Уа1

Ьуз

С1у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

65

70

75

ТЬг

Ьеи

Туг

Ьеи

61п

Ме!

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

V а 1

80

85

90

Туг

Туг

Суз

А 1а

Агд

Азр

Агд

Н1з

Зег

Зег

5ег

Тгр

Туг

Туг

С1у

Ме1

95

100

105

Азр

Уа1

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

7а1

Зег

Зег

110

115

120

-57 012407 <210> 12 <211> 137 <212> Белок <213> Ното зарБепз <220>

<221> Сигнальный <222> (1)...(19) <400> 12

МеГ

СГа

РЬе

С1у

Ьеи -15

Зег

Тгр

9а 1

РНе

Беи -10

7а1

А1а

Беи

Беи

Агд -5

31 у

Та1

С1п

Суз

С1ь

С1п

Беи

Та 1

С1и

Зег

С1у

С1у

С1у

Уа1

ν31

С1ь

1

5

10

Рго

С1у

Агд

Зег

Ьеи

Агд

Беи

Зег

Суз

А1а

А1а

8ег

(Ну

РЬе

ТНг

РЬе

15

20

25

Зег

Зег

Туг

А1а

МеН

Н15

Тгр

Уа1

Агд

СБп

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Беи

30

35

40

45

С1и

Тгр

Уа1

711а

Уа1

Не

Зег

Туг

Азр

61у

Зег

Азп

Ьуз

Туг

Туг

А1а

50

55

60

Азр

Зег

Уа1

йуз

С1у

Агд

РЬе

ТНг

Не

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Буз

Азп

65

70

75

ТНг

Беа

Туг

Беи

С1п

Мес

Азп

Зег

Беи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТНг

А1а

νβΐ

5 0

95

90

Туг

Т ул-

Суз

А1а

Агд

Азр

А1а

Буз

Беи

Беи

Ьеи

Беи

Не

Зег

С1у

95

100

105

А1а

Ьуз

01 у

Б1п

Тгр

Зег

Рго

Зег

Беи

110 115 <210> 13 <2Н> 120 <212> Белок <213> Искустаенная последовательность <220>

<223> синтетическое антитело Η12Α11ν2 <4 00> 13

С1п 1

7а1

С1п

Ьеи

7а1 5

С1и

Зег

С1у

С1у

С1у 10

Уа1

7а1

С1п

Рхо

С1у 15

Агд

Зег

Ьеи

Агд

Беи

Зег

Суз

А1а

РЬе

Зег

С=1у

РНе

ТЬг

Ьеи

Зег

ТЬг

Зех

20

25

30

С1у

Мес

Зег-

7а1

<31у

Тгр

Не

Агд

С1ь

А1а

Рго

С1у

Буз

С1у

Беи

С1и

35

40

45

Тгр

А1а

ΗΪΞ

11е

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьу2

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Беи

Ьуз

Зег

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Буз

Азр

ТНг

Зех

Буз

Азп

ТЬг

Беи

65

70

55

80

Туг

Ьеи

С1п

МеС

Азп

Зег

Беи

Агд

А1а

С1и

Аэр

Тпг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

74гд

Агд

ТНг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Тух

Тгр

31 у

С1п

100

105

НО

31 у

ТНг

ТНг

Уа!

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

120

-58 012407 <210> 14 <2Η> 120 <212> Белок <213> Искуственная последовательность <220>

<223> синтетическое антитело Ь12А11ч2.1 <400> 14

С1п 1

Уа1

С1п

Ьеи

7а1 5

С1и

Зег

С1у

С1у

С1у 10

Уа1

\5а1

С1п

Рго

С1у 15·

Агд

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

РЬе

Зег

С1у

РНе

ТНг

Ьеи

Зег

ТНг

Зег

20

25

30

31 у

Мер

Зег

7а1

С1у

Тгр

11е

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

7а1

А1а

Н1з

Не

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рю

Зег

50

55

60

Беа

Ьуз

Зег

Агд

РЬе

ТНг

Не

Зег

Ьуз

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

Те г

Ьеи

65

70

75

80

Туг

Ьеи

С1п

МеЬ

Азп

Зет

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТНг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суе

А1а

Агд

Агд

ТЬг

ТНг

ТНг

Айа

Азр

Туг

РНе

А1а

Туг

Тгр

С1у

С1п

100

105

110

<31у

ТНг

ТЬг

Уа1

ТНг

Уа1

Зег

Зег

115 120

<210> <2Н> <212> <213>	15 120 Белок Искусственная	последовательность
<220>
<223>	синтетическое	антитело Η12Α11ν3

<400> 15

С1п 1

Уа1

С1 п

Беи

7а1 5

С1и

Зег

С1у

С1у

С1у 10

7а1

Уа1

С1п

Рго

С1у 15

Агд

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

РЬе

Зег

С1у

РЬе

ТНг

Ьеи

Зег

ТНг

Зег

2ΰ

25

30

С1у

Мер

Зег

С1у

Тгр

11е

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

!31у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Уа1

А1а

1415

Не

Тгр

Тгр

Азр

Азр

.Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

РЬе

ТНг

Не

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТНг

Ьеи

65

70

75

80

Туг

Ьеи

С1п

Ме!

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

ТНг

ТНг

ТНг

А1а

Азр

Туг

РНе

А1а

Туг

Тгр

01 у

С1п

100

105

110

С1у

ТНг

ТНг

7а1

ТНг

Уа1

Зег

Зег

115

120

<210> 16 <211> 120 .

<212> Белок <213> Искустаенная последовательность <220>

-59 012407 <223> синтетическое антитело Ы2А11и4.1 <4 00> 16

С1п

ν^ι

С1п

Ьеи

Уа1

ΰΐυ.

5ег

С1у

С1у

С1у

Уа1

Уа1

С1п

1

5

10

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Сув

А1а

РНе

Зег

С1у

РЬе

ТЬг

Ьеи

20

25

С1у

МеЕ

Зег

Уа1

С1у

Тгр

Не

Агд

С1П

А1а

Рго

С1у

ьуз

35

40

45

Тгр

Ьеи

А1а

Н1в

Не

Тгр

Тгр

Азр

Авр

Авр

Ьуз

Туг

Туг

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

Авр

ТЬг

Зег

Ьуз

65

70

7 5

Туг

Ьеи

С1п

Не!

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1й

85

90

Суз

А1а

Агд

Агд

ТНг

ТЬг

ТА г

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

100

105

С1у

ТНг

ТЬг

Уа1

ТНг

Уа1

Зег

Зег

115

120

Рго	61 у	Агд
	15
Зег	ТЬг	Зег
30
С1у	Ъе:1	С1и
Азп	Рго	Зег
Азп	ТЬг	Уа1
		80
Уа1	Тус	Туг
	95
Тгр	С1у	С1п
110

<210> 17 <211> 120 <212> Белок <213> Искуственная последовательность <220>

<223> синтетическое антитело Η12Α11ν4.2 <4 00> 17

С1п 1

Уа!

С1п

Ьеи

'Уа! 5

С1и

Зег

С1у

С1у С1у 10

Уа1

Уа!

С1п

Рго

С1у 15

Агд

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Сув

А1а

РНе

5ег

С1у

РНе

Зег

Ьеи

Зег

ТЬс

Зег

20

2 5

30

С1у

Мес

Зег

7а1

С1у

Тгр

Не

Агд

С1п

А! а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ье и

С1и

35

40

45

Тгр

Уа1

А1а

Н15

Не

Тгр

Тгр

Аер

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Авп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

Не

5ег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Уа1

65

70

75

80

Туг

ьеи

С1п

Мер

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1 а

Агд

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РНе

А1а

Туг

Тхр

С1 у

С1п

100

105

110

С1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа!

Зех

Зег

115

120

<210> 18 <211> 120 .

<212> Белок ’ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> синтетическое антитело Η12Α11ν4.3 <400> 18

<31 п 1

Уэ1

С1п

Ьеи 7а1 5

С1и

5ег

С1у

61у

С-1у Уа1 10

Уа1

С1п

Рго

С1у Агд 15

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

РНе

Зег

С1у

РЬе

Зег

Ьеи

Зег

ТЬг

Зег

20

25

30

-60 012407

С1уМеЬ

5ег 35

Уа1

С1у Тгр

Не

Агд 40

31п

А1а

Рго С1у

Ьуз С1у 45

Ьеи

С1и

Тгр

Ьеи

А1а

Н13

11е

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Тут

Туг

Азп

Рго

Зет

50

55

60

Ьеи

Ъуа

Зег

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Уа1

65

70

75

80

Тут

Ьеи

С1п

МеС

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суе

А1а

Агд

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

Тгр

0,1 у

С1п

100

105

110

31 у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зет

Зет

115

120

<210> 1?

<211> 120 <212> Белок <21 3> Искуственная последовательность <220>

<223> синтетическое антитело Ы2А11л4.4 <4С>0> 19

С1п 1

Уа1

С1 п

Ьеи

Уа1 5

С1и

Зег

С1у С1у

С1у 10

Уа1

Уа1

С1п

Рго

С1у 15

Агд

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

РЬе

Зег

С1у

РЬе

Зег

Ьеп

Зег

ТЬг

Зек

20

25

30

С1 у

МеС

Зег

Уа1

С1у

Тгр

Не

Агд

С1п

А1а

Рго

61у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Ьеи

А1а

Н13

Пе

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

5ег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

11 е

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

65

70

7 5

80

Туг

Ьеи

С1п

МеС

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

8 5

90

95

Суа

А1а

Агд

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

Тгр

Е1у

С1п

100

105

110

С1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

120

<210> 20 <211> 120 <212> Белок <213> Искуственная последовательность <220>

<22'3> синтетическое антитело Ь12А11у5.1 <400> 20

31п Уа1 1

С1п

Ьеи

5

С1и

Зег

31у

31у

С1у 10

Уа1

ν^ι

С1п

Рго

С1у 15

Агд

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

5ег

Суз

А1а

РЬе

Зег

С1у

РЬе

ТЬк

Ьеи

Йег

ТЬг

Зег

20

25

30

С1у

МеС

Зег

Уа 1

С1у

Тгр

Пе

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Уа1

А1а

Н13

11¾

Тгр

Тгр

Азр

.Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

ты

Т1 е

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зек

Ьуз

Азп

ТЬг

Уа1

65

70

75

80

-61 012407

Туг

Ьеи СЬп

Мер

Азп 85

Зег

Ьеи Агд

А1а

61и 90

Азр

ТНг

АБа

Уа1

Туг 95

Туг

Суз

АБа

Агд

Агд

ТНг

ТНг

ТЬг

АБа

Азр

Туг

РНе

А1а

Туг

Тгр

С1у

С1п

100

105

110

С1у

Гл г

ТЬг

УаБ

ТНг

Уа1

Зег

Зег

115

120

<210> 21 <2Η> 120 <212> Белок <213> Искустэенная последовательность <220>

<223> синтетическое антитело Μ2Α11ν5.2 <400> 21

С1п

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1

СБи

Зег

С1у

С1у

СБу Уа1

УаБ

Е1п

Рго

СБу

Агд

1

5

10

15

5ех

Беи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

АБа

РЬе

Зег

СБу

РЬе

ТНг

Беи

Зег

ТНг

Зег

20

25

30

61у

Ме5

Зег

УаБ

С1у

Тгр

Не

Агд

Й1п

А1а

Рго

СБу

Ьуз

СБу

Ьеи

СБи

35

40

45

Тгр

Беи.

А1а

Η1Ξ

Не

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Буз

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

50

5 5

60

Ьеи

Буз

Зег

Агд

РЬе

ТНГ

Не

Зег

Буз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

УаБ

65

70

75

80

Туг

Ьеи

С1П

Мес

Азп

Зег

Ьеи

Агд

АБа

СБи

Азр

ТЬг

АБа

УаБ

Туг

Туг

8 5

90

95

Су®

А1а

Ард

Агд

Тпг

Тпг

ТЬг

АБа

Азр

Туг

РЬе

АБа

Туг

Тгр

СБу

61п

100

105

110

С1у

ТНг

ТНг

1

ТЬг

УаБ

Зег

Зег

115

120

<210> 22 <211> 121 <212> Белок <213> Искуственная последовательность <220 <223> синтетическое антитело Н12А11У5.3 <400> 22

ЗБп 1

УаБ

Й1п

Ьеи

УаБ 5

С1и

Зег СБу

С1у

С1у 10

УаБ

УаБ

СБп

Рго

СБу 15

Агд

Зег

Беи

Агд

Беи

Зег

Суз

АБа РЬе

Зег

СБу

РЬе

ТНг

Ьеи

Зег

ТЬг

Зег

20

25

30

СБу

Мер

Зег

УаБ

СБу

Тгр

Не Аид

С1п

АБа

Рго

СБу

Був

Б1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Беи

АБа

Н1з

11е

Тгр

Тгр Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Беи

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

11е Зег

Ьуз

Азр

ТНг

Зег

Буз

Азп

ТНг

Ьеи

65

70

75

80

Туг

Беи

С1п

Азп.

Зег

Беи Агд

АБа

СБи

Азр

ТЬг

АБа

УаБ

Туг

Гуг

85

90

95

Суз

АБа

Агд

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬх АБа

Азр

Туг

РЬе

АБа

Туг

Тгр

СБу

С1п

100

105

НО

-62 012407

61у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег Уа1

115 120 <210> 23 <211> 121 <212> Белок <213> Искуственная последовательность <22О>

<223> синтетическое

антитело Ь12А11ч5.4

<400> 2

3

31п

Уа1

С1п

Ъеи

Уа1

31и

Зег

61у

С1у

С1у

Уа1

С1п

Рго

С1у

Агд

1

5

10

15

Зег

Ъеи

Агд

Ъеи

Зег

Суз

А1а

РЬе

Зег

С1у

Рпе

Зег

Ъеи

£ег

ТЬг

Зег

20

25

30

С1у

Меб

Зег

Уа1

61у

Тгр

11е

Агд

С1ь

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ъеи

С1и

35

40

45

Тгр

Уа1

А1а

Юз

Не

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ъу5

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ъеи

Ьуз

Зег

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

Азр

ТНг

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Уа1

65

70

75

80

Туг

Ъеи

С1п

Мер

Азп

Зег

Ъеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

35

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РАе

А1а

Туг

Тгр

С1у

С1п

100

105

110

С1у

ТЬг

ТЬг

ν3ι

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

Ма1

115

120

<210>	24
<211>	120
<2 12>	Белок
<213>	Искуственная последовательность

<220>

<223> синтетическое антитело Μ2Α11ν5.5 <400> 24

С1п 1

νβΐ

С1п

Ъеи

Да1 5

С1и

Зег

С1у

С1у

СИу 10

Уа1

Уа1

С1п

Рго

С 1у 15

Агд

Зег

Ъеи

Агд

Ъеи

Зег

Суз

А1а

РЬе

Зег

С1у

РЬе

Зег

Ъеи

Зег

ТЬг

Зег

20

25

30

С1у

Мер

5ег

Уа1

С1у

Тгр

11е

Агд

С1л

А1а

Рго

31 у

Ьуз

С1у

Ъеи

С1и

35

4 0

45

Тгр

Уа1

А1а

ΗΪ8

11е

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ъуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ъеи

Ьуз

8ег

Агд

Ъеи

ТЬг

11е

Зег

Ъуз

Азр

ТЬг

Зег

Ъуз

Азп

ТЬг

Ъеи

65

70

75

80

Туг

Ъеи

С1п

М = 5

Азп

Зег

Ъеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1э

Агд

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

Тгр

С1у

С1п

100 105 110

С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег

115 120 <210> 25 <211> 120 <212> Белок

-63 012407 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> синтетическое антитело Η12Α11ν5.6 <400> 25

С1п Уа1 С1п Ьей Уа1

Й1и

Зег

й1у С1у 61у 10

Уа1

7а1

С1п

Рго

61у Агд 15

1

5

Зег Ьей

Агд Ьей Зег

Суз

А1а

РНе

Зег

61у

РЬе

Зег

Ьей

Зег

ТЬг

Зег

20

25

30

С1у Ме·:

Зег Ча1 С1у

Тгр

Не

Агд

С1п

А1а

Рго

61у

Ьуз

С1у

Теп

С1и

35

40

45

Тгр Ьей

А1а Н15 Не

Тгр

ТГР

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Тух

Азп

Рхо

Зег

50

55

60

Беи Ьуз

Зег Агд РНе

ТНг

11е

Зег

Ьуз

Азр

ТНг

Зег

Ьуз

Азп

ТНг

Ьей

65

70

75

80

Туг Ьей

61п МеС _Аап

Зег

Ьей

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз А1а

Агд Агд ТНг

ТНг

ТНг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

Тгр

С.1 у

С1п

100

105

НО

С1у ТНг

ТНг Уа1 ТНг

ν31

Зег

Зег

115

120

<210> 26 <211> 120 <212> Белок

<213> Ис

:куственная последовательность

<220>

<223> а-

1нтетмнескос

ант:·

[тело 1ί12Ά11(

ΐ. 1

<400> 2(

>

С1п Уа1

С1п Ьей Уа1

С1и

Зег

С1у

С1у

61 у

Уа1

Уа1

С1п

Рхо

С1у

Агд

1

5

10

1 5

Зег Ьей

Агд Ьеы Зег

Суз

А1а

РЬе

Зег

С1у

РЬе

ТЬг

Ьей

Зег

ТНг

Зег

20

25

30

61 у Ме!

Зег Уа1 61у

Тгр

11е

Агд

61п

А1 а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

1.еи

С1и

35

40

45

Тгр Уа1

А1а Нтз Не

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рхо

Зег

50

55

60

Неи Ьуз

Зег Агд Рпе

ТНх

Не

Зег

Ьуз

Азр

ТНг

Зех

Ьуз

Азп

ТНг

Уа1

65

70

75

80

Туг Ьей

С1п Ме(: Азп

Зег

Ьеч

Агд

А1а

С1и

Азр

ТНг

А1а

Уа1

Тух

Туг

85

90

95

Суз А1а

Агд Агд ТНг

ТЬг

ТНг

А1 а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Тух

Тгр

С1у

С1п

' 100

105

110

С1у ТНг

ТНг Уа1 ТНг

Уа1

Зег

Зег

115

120

<210> 27

<211> 120 <212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетическое

антитело

Ы2А11У6.2

<400> 27 (31 η ..

С1п Беи Уа1

Й1и

Зег

(Ну

С1у

С1у

Уа1

Уа1

С1п

Рго

С1у

Агд

-64 012407

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

РЬе

Зег

С1у

РЬе

ТЬг

Ьеи

Зег

ТЬг

Зег

20

25

30

31 у

МЫ

Зег

Уа1

С1у

Тгр

Не

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

35

40

4 5

Тгр

7а1

А1а

Н1з

Не

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

Азр

Т’Ьг

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

65

70

75

80

Туг

Ьеи

СИп

Мер

Азп

Зет

Ьеи

Агд

А1а

(Ии

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

ТЬг

ТЫ

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

Тгр

С1у

С1п

100

105

110

С1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЫ

Уа1

5ег

Зег

115

120

<210> 23 <211> 120 <212> Белок <213> Искустзенная последовательность <220>

<223> синтетическое антитело Ь12А11ч6.3 <400> 28

(Нп 1

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1 5

С1и

Зег

С1у

С1у

С-У 10

Уа1

Уа1

21 п

Рго

32у 15

Агд

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

5ег

Суз

А1 з

РЬе

Зег

С1у

РЬе

ТЬг

Ьеи

Зег

Зег

20

25

30

(Пу

МеЬ

Зег

Уа1

С-1у

Тгр

Не

Агд

(Ип

А1а

Рго

(Пу

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Ьеи

А1а

Н1з

Не

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Рпе

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

65

70

75

ВО

Туг

Ьеи

С1п

Мес

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

61и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

93

Суз

А1а

Агд

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

Тгр

(Ну

С1п

100

105

110

С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Заг Бег

115 120 <210> 29 <211> 120 <212> Валок <213> Йскуственная последовательность <220>

<223> синтетическое антитело Ь12А11ч6.4 <400> 29

С1п

Уа1. С1п

Ьеи

7а1

(Ни

5ег

С1у

С1у

С1у

Уа1

Уа1

С1п

Рго

С1у

Агд

1

С

10

15

Зег

ьеи Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

РЬе

Зег

С1у

РЬе

Зег

Ьеи

Зег

ТЬг

Зег

20

25

30

С1у

Ме1; Зег

С1у

Тгр

Т1е

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

(Ии

35

40

45

-65 012407

Тгр

7а1

А1а

ΗΪ5

115

Тхр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Ргс

Бег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Рле

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Теи

65

70

75

80

Тух

Ьеи

51л

Ме!.

Αξγ.

Зег

Ьеи

Агд

_А1а

51и

Азр

ТЬг

Αία

Уа1

Тух

- уг

9 5

90

95

Суз

А1а

А.хд

Агд

ТА г

ТЬг

ТА г

Ах а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Тух

Тгр

51 у

С1п

о о

105

110

51 у

ТЬг

ТЬг

г - ι •си.

ТАг

Уа1

Бег

Бег

115

120

<21 0>	30
<211>	120
<212>	Белок
<213>	Искустленнал лослелователвноссь

<22 О >

<223>

синтетическое антитело Π2Α11ν<

<400 30

С1п

Ла1 61п

Теи

7а 1

31и

Бег

ЗТу

С1у

С1у

Уа1

7а1

51п

Рго

61у

Агд

5

10

15

Бех

Ьеи Агд

Теи

£ех

Су5

А1а

Рпе

Зех

Ну

РОе

Тог

Ьеи

Зег

ТЬт

Зег

2 С

25

30

С1у

!Иеь Зег

а -

С1у

Т гр

”а1

Агд

51 п

А1а

Рго

31у

Ьуз

•31 у

Ьеи

А1и

3 5

40

45

Тгр

Ьеи А1а

Н15

1—5

Тгр

Тгр

Аер

Азр

Аер

Туз

Туг

Туг

Азп

Ргс-

Зег

50

55

60

Ьеи

Ьуз Зег

Агд

Теи

Тог

I Те

Бег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

ТЬ:

Аа 1

65

7 и

7

8 Э

Тух

1 е с А1 г.

Тес

А? л

5 -

Теи

Агд

А1 а

•3 1 и

Азр

т 'ι τ'·

А1а

7а1

Тут-

Тиг

8 5

90

95

Суз

А1а .Агд

Агд

Тг.г

Т Λι-

Тлг

А1а

Азр

Туг

Рое

А1а

Тух

Тгр

52у

31Л

' д 0

10 =

110

51 у

ТЬг ТЬг

7а1

Тс г

νοί

Зег

Бег

120 <21ϋ> 31 <211> 120 <212> ύ-еллк <213> Искусевенная последовательность <220>

<223> суштетисеское антитело Η12Α11ν8 <400> 31

Сап \?аУ

А1п

•и ей

νβΐ

51и

Зег

51у

С1у

С1у

7а1

V а 1

С1п

Рго

61 у .Агд

1

5

70

15

Зег

Теи

Ахд

Теи

Зег

Суз

А1а

РЬе

Зег

С1у

РЬе

Зег

Ьеи

Бег

ТЬг

бег

3 0

25

30

(И у

Ме!

Зе χ-

С_ у

Тгр

Не

Агд

С1п

А1а

Рго

Зху

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

ΟΟ

40

45

Тгр

ьеи

А1а

Н15

Не

Тгр

Тгр

.Азр

.Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Алл

?го

8ег

50

55

60

Ьи& Ь1

1Л’3

Зег

Ахд

Таи

ΙΤι1_

Ί · -

5ег

Т ,,с

Азе

Аги

Зег

Ь\'3

Азл

ТЬл

7а1

65

7 5

30

Тух

Теи

иТп

Ме!

Азл

Зег

Теи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТИх

А1а

Уа1

Тух

Туг

85

90

95

-66 012407

Суз А1а Агд Агд ТЬг ТЬг ТЬг А1 а .Азр Туг РЬе А1а Туг Тгр 61у з!п

100 105 НО '

С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег

115 120 <210 32 <211> 5 <212> Белс-к <213> Искустве.чная последовательность <220>

<22 3> синтетическая шарнирная область бдд (иьшуноглобулине С·· <4 00 32

Тес Ьеи СО у 31 у Рго

<210	33
<211>	5
СЮ	Б еле к
<213>	Искуотсекшая последовательность

< 2 2 0 >

<22 3>	синтетическая шарнирная область ьдд (иммуноглобулина С:
< 4 С 0 >	~ 3

ьеи С-_- С-Ιν 31 ν Рго

<210	34
<211>	396

<212> ДНК

<213>

Искус-твекная последовательность

<2 2С>

<223> гуманизированная 12А11 νί ТЬ последовательность < 2 2 0 >

<221 > сиг. пептид <222> (1} . . .:60;

<4 00 34

абдаддсб сс	с-Ьдоесадсс	ссбддддсбд	сбдабдсссб	дддбеоебдд	сбссадбддд	60
дабдб б дб де	едаоссааОс	бссасс оссс	ссдссбдаса	сбссбддада	дссадссбсс	120
аЮсИ дса	даί сбадбса	дадсасбдбд	с. а б а д т а а б д'	дааасассба	ссбддаабдд	180
исс( дсада	•аассаодсса	дссб ссасад	сссобдабсб	асааадбб бс	сааосдаббН	240
бсбддддб се	садасаддДб	садбддсадб	ддабсаддда	садабббсас	асбсаадабс	300
адсадассдд	атдебдадда	0дГддс;адг б	1: а ΐ: 63θ6ςοΐ	ббсааадббс	асабдсбссб	3 60
сбсассббсд	дгезддддас	саадссддад	абсааа			396
<210> 35
<210 417
<212> ДНК
<213> Мегус	:тьенная пос	1 ле ^оеа тель-	ι г, с ь

<220 <223> гуманизированная 12Λ.13 νί 1ΊΗ последовательность <220>

<221> сиг. пептид <222> ¢1)...(57)

<400> 35 абддадбббд	ддебдадебд	ддбббсссбс	дббдебеббс	бдададдбде	ссадгдбсаа	60
дббсадсбдд	бддадбетдд	еддеддддбд	дбдсадсссд	дасддбсссс	саддссдссб	120
бдбдсссбсб	с~ дддб£ с с	асбдадсасб	бебддбабда	дбдбдддебд	даббедбеад	18 0
дсбссаддда	адддссбдда	д-ддебддса	сасагбеддб	дддабдабда	Ξ ·,С С с αί	24 0
аасссабссс	бдаададссд	дсбсасаабс	бссааддаба	ссбссааааа	сассдьдбас	300
сбссадаб да	асздбссдсд	ддебдаадаб	аебдеедбдб	асб асб дбде	бсдаадаасб	3 60
асбассдсбд	ась.аоюг.дс	ебаебддддс	сааддсзсса	сбдбсасадб	об ос-' са	417

Claims (27)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Гуманизированный иммуноглобулин, специфически связывающийся с бета-амилоидным пептидом (Αβ), или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий:

   (ί) лёгкую цепь, содержащую три вариабельных участка, определяющих комплементарность (СОЯз) из последовательности вариабельной области лёгкой цепи мышиного иммуноглобулина 12А11, представленной как БЕР ΙΌ N0:2, и вариабельную каркасную область из последовательности лёгкой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина, и (ίί) тяжёлую цепь, содержащую три вариабельных участка, определяющих комплементарность (СОЯз) из последовательности вариабельной области тяжёлой цепи мышиного иммуноглобулина 12А11, представленной как БЕР ΙΌ N0:4, и вариабельную каркасную область из последовательности тяжёлой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина.
2. 2. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, у которого по меньшей мере один каркасный остаток лёгкой или тяжёлой цепи замещён на соответствующий аминокислотный остаток из последовательности вариабельной области лёгкой или тяжёлой цепи указанного иммуноглобулина 12А11, причём каркасный остаток выбран из группы, состоящей из:

   (а) остатка, который непосредственно связывается с антигеном нековалентной связью;

   (б) остатка, прилегающего к СОЯ участку;

   (в) остатка, взаимодействующего с СОЯ участком; и (г) остатка, находящегося на границе раздела АЕ-АН.
3. 3. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по п.2, отличающийся тем, что указанный каркасный остаток лёгкой цепи замещён по меньшей мере в одном положении, соответствующем лёгкой цепи иммуноглобулина 12А11, выбранном из группы, состоящей из Ь2, Ь4, Ь36, Ь38, Ь40, Ь44, Ь46, Ь47, Ь48, Ь49, Ь64, Ь66, Ь68, Ь69, Ь71, Ь87 и Ь98 (нумерация по КаЬа!).
4. 4. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.2 и 3, отличающийся тем, что указанный каркасный остаток тяжёлой цепи замещён по меньшей мере в одном положении, соответствующем тяжёлой цепи иммуноглобулина 12А11, выбранном из группы, состоящей из Н2, Н24, Н26, Н27, Н28, Н29, Н37, Н39, Н45, Н47, Н48, Н67, Н71, Н73, Н78, Н91, Н93, Н94 и Η103 (нумерация по КаЬа!).
5. 5. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по п.4, отличающийся тем, что указанный каркасный остаток тяжёлой цепи замещён по меньшей мере в одном положении тяжёлой цепи иммуноглобулина 12А11, выбранном из группы, состоящей из Н24, Н28, Н29, Н37, Н48, Н67, Н71, Н73 и Н78 (нумерация по КаЬа!).
6. 6. Гуманизированный иммуноглобулин по любому из пп.1-5, который содержит Ес-область с изменённой эффекторной функцией.
7. 7. Антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, представляющий собой ЕаЬ-фрагмент.
8. 8. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что тяжёлая цепь относится к изотипу гамма 1.
9. 9. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8, который специфически связывается с Αβ с аффинностью связывания по меньшей мере 10^-7 М.
10. 10. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-9, который ί) связывается как с растворимым Αβ, так и с агрегированным Αβ, ίί) связывается с эпитопом в пределах остатков 3-7 Αβ, ίίί) опосредует фагоцитоз Αβ, ίν) проникает через гематоэнцефалический барьер у субъекта или ν) снижает предрасположенность к образованию бляшек из Αβ у субъекта.
11. 11. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-10, имеющий аминокислотную последовательность вариабельной области лёгкой цепи, представленную как БЕР ΙΌ N0:7, и аминокислотную последовательность вариабельной области тяжёлой цепи, выбранную из группы, состоящей из БЕР ΙΌ N0:10, БЕР ΙΌ N0:13, БЕР ΙΌ N0:14, БЕР ΙΌ N0:15, БЕО ΙΌ N0:16, БЕр ΙΌ N0:17, БЕр ΙΌ N0:18, БЕр ΙΌ N0:19, БЕр ΙΌ N0:20, БЕр ΙΌ N0:21, БЕО ΙΌ N0:22, БЕО ΙΌ N0:23, БЕО ΙΌ N0:24, БЕО ΙΌ N0:25, БЕО ΙΌ N0:26, БЕО ΙΌ N0:27, БЕО ΙΌ N0:28, БЕО ΙΌ N0:29, БЕО ΙΌ N0:30 и БЕО ΙΌ N0:31.
12. 12. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11, имеющий аминокислотную последовательность вариабельной области лёгкой цепи, представленную как БЕР ΙΌ N0:7, и аминокислотную последовательность вариабельной области тяжёлой цепи, представленную как БЕр ΙΌ N0:10.
13. 13. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-12, имеющий аминокислотную последовательность вариабельной области лёгкой цепи, представленную как остатки 1-112 БЕр ΙΌ N0:2, и аминокислотную последовательность вариабельной области тяжёлой цепи, представленную как остатки 1-120 БЕр ΙΌ N0:4.
14. 14. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по п.13, содержащий по меньшей мере одну консервативную аминокислотную замену в вариабельной области лёгкой цепи, отличающийся тем, что он сохраняет способность специфически связываться с Αβ с аффинностью связывания по меньшей мере 10⁷ М^-1.
15. 15. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по п.13, содержащий по меньшей мере одну консервативную аминокислотную замену в вариабельной области тяжёлой цепи, отличающийся тем, что он сохраняет способность специфически связываться с Аβ с аффинностью связывания по меньшей мере 10⁷ М^-1.
16. 16. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-15, содержащий аминокислотные остатки 24-39 8ЕЦ ΙΌ N0:2, аминокислотные остатки 55-61 8Е0 ΙΌ N0:2 и аминокислотные остатки 94-102 8ЕЦ ΙΌ N0:2, аминокислотные остатки 31-37 8Е0 ΙΌ N0:4, аминокислотные остатки 52-67 8ЕЦ ΙΌ N0:4 и аминокислотные остатки 100-109 5ЕО ΙΌ N0:4.
17. 17. Фармацевтическая композиция, содержащая гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-16 и фармацевтически приемлемый носитель.
18. 18. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая лёгкую цепь гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-16.
19. 19. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая ί) тяжёлую цепь гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-16, ίί) лёгкую цепь гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-16, ίίί) гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-16, ίν) вариабельную область лёгкой цепи гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-16, содержащую аминокислотные остатки 1-112 8ЕЦ ΙΌ N0:2, или вариабельную область тяжёлой цепи гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-16, содержащую аминокислотные остатки 1-120 8ЕЦ ΙΌ N0:4, или ν) вариабельную область гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-16, по меньшей мере на 85% идентичную аминокислотным остаткам 1-112 8ЕЦ ΙΌ N0:2 или аминокислотным остаткам 1-120 8ЕЦ ΙΌ N0:4.
20. 20. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.19.
21. 21. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.19.
22. 22. Способ получения иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-16, заключающийся в культивировании клетки-хозяина по п.21 в условиях, при которых продуцируется иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент, и в выделении указанного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента из клетки-хозяина или культуральной среды.
23. 23. Набор для визуализации амилоидных отложений в мозгу пациента, включающий гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-16 и инструкцию по его применению.
24. 24. Набор по п.23, отличающийся тем, что антигенсвязывающий фрагмент представляет собой ЕаЬфрагмент.
25. 25. Применение гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-16 для приготовления лекарства для лечения или предупреждения амилоидогенного заболевания у субъекта.
26. 26. Применение по п.25, отличающееся тем, что заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.
27. 27. Применение по п.25, отличающееся тем, что гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с растворимым Αβ в сыворотке крови, крови или спинномозговой жидкости субъекта.