JP2635444B2 - 自己抗体の経口投与による自己免疫性疾患の治療 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本出願は、1990年２月21日にファイルされた米国出願
番号07/460,852の一部継続であり、その米国出願は、19
88年６月24日にファイルされたPCT/US88/02139の国内段
階であり、そのPCT出願は、1987年６月24日にファイル
された米国出願番号065,734の一部継続出願である。そ
れらはすべて参考文献として、ここに挙げてある。

発明の分野 本発明は、自己免疫性疾患、特にＴ細胞仲介またはＴ
細胞依存性の自己免疫疾患の治療分野に関する。特に、
本発明は、そのような自己免疫性疾患の予防上、治療上
の処理のための、自己抗体、あるいはその断面（fragme
nt）または類自体の投与を提供する。

背景技術の簡単な説明 I.一般的な自己免疫性疾患 自己免疫性疾患は、正常な組織に対する抗体または細
胞の応答を含む、異常な免疫応答によって起こる。自己
免疫性疾患を抑制するために、多くの方法が発達してき
ているが、注目すべき薬品のほとんどが免疫応答を非特
異的に抑制するものである。自己免疫応答抑制のため
に、抗体を経口投与することにより免疫耐性を誘起する
方法は、ウェルスによって最初に提唱された（Wells,
H.,J.Infect.Dis.9,147（1911））。しかし、いくつか
のＴ細胞依存性抗体について、経口誘導の非応答性も示
されている（Ngan,J.,et al.,J.Immunol.135,2975（198
5）,Titus,R.,et al.,Int.Arch.Allergy Appl.Immun.,6
5,323（1981））。また、経口経路による抗原誘引の予
防的免疫耐性が、いくつかの実験的自己免疫性疾患にお
いて、免疫調節器治療上のアプローチとして働くことが
示されている（Higgins,P.J.,et al.,140,440（1988）,
Lider,O.,et al.,J.Immunol.,142,748−752（1989）,Bi
tar,D.M.,et al.,Cell.Immunol.,112,364（1988）,Nuss
enblatt,R.B.,et al.,J.Immunol.,144,1689（1990）,Na
gler−Anderson,C.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8
3,7443−7446（1986）,Thompson,H.S.G.,et al.,Clin.E
xp.Immunol.,64,581−586（1986））。

II.実験的なアレルギー性脳脊髄炎 科学者は、種々の動物モデルにおいて、自己免疫性疾
患を抑制する方法もまた研究した。実験的アレルギー性
脳脊髄炎（EAE）は、ミエリン塩基性タンパク（MBP）に
対するＴ細胞仲介自己免疫性疾患であり、数種のほ乳類
における多発性硬化症のモデルとして研究されている。
E.アルボード（Alvord）ら著、「実験的アレルギー性脳
脊髄炎−−多発性硬化症の有用なモデル」（Allan R.Li
ss、ニューヨーク、1984）参照。EAEの免疫調節は、サ
プレッサーＴ細胞（Ts）に、少なくとも部分的に依存し
ていることが知られている。Tsは、EAEから回復したラ
ットに存在していることが示されている（Swierkosz,
J.,et al.,J.Immunol.,119,1501（1977））。さらに、
数種のマウス系統によって示されたEAEに対する非応答
性が、サプレッサーＴ細胞によることが示されている
（Lando,Z.,et al.,Nature,287,551（1980））。

様々な方法が、EAEの抗原特異的抑制を誘発するため
に採用されている。例えば、Lando,Z.,et al.,J.Immuno
l.,126,1526（1981）に示されているような、不完全フ
ロインドアジュバンド中に乳化されたMBPの免疫化や、S
tiram,S.,et al.,Cell.immunol.,75,378（1983）に示さ
れているように、MBPが結合したリンパ様細胞の静脈内
注射が用いられている。

アルボードらの３種の論文が,Annals of Neulogyの第
６巻（1979年）、461−468、468−473、474−482頁に各
々報告されている。これらの論文のうち、第１と第２の
ものは、例えば抗生物質やステロイドのような非特異的
付加成分と共に投与したときのみの、MBPの非経口的投
与による猿のEAEの抑制について開示している。第３の
論文は、MBPを抗原的に活性なペプチド断片に変性させ
る数種のプロテアーゼが、多発性硬化症患者の脳脊髄液
中に存在することを開示している。

トラウゴット（Traugott）ら、（J.Neurological Sci
ence,56,65−73（1982））、及びレイネ（Reine）ら、
（Lab.Investigation,48,275−84（1983））の論文は、
MBEの単独、あるいは不完全フロインドアジュバント（I
FA）中、またはミエリンの脂質ハプテン、即ちガラクト
セレブロシドと組み合わせた非経口的投与による、慢性
的に再発するEAEにかかったモルモットの系統の治療
が、EAEの臨床的症状を抑制することを示している。

さらに、マッケナ（McKenna）ら、（Cell.Immun.,81,
391−402（1983））は、不完全フロインドアジュバンド
中のモルモットMBEを用いて、同系の脾臓白血球または
同系の赤血球に結合したモルモットMBPをラットに前も
って注射することが、EAEの引き続く誘導を抑制するこ
とを示している。抑制の度合は、投与したMBPの量に正
に相関している。

ストレージャン（Strejan）ら、（Cell.Immun.,84,17
1−184（1984））の報告は、ホスファチジルセリンリポ
ソームとカプセル化したモルモットMBPをラットに前も
って注射することが、完全フロインドアジュバント中の
モルモットMBPを注射したラットに発現する臨床的徴候
や症状を抑制することを開示している。

マッケナの別の論文（Cell.Immun.,88,251−259（198
4））は、サプレッサーＴリンパ球の生成を阻害する試
薬であるシクロホスホアミドで前処理した場合、彼らの
1983年の報告に開示されているモルモットMBP白血球複
合体の注射の抑制効果がなくなることを示している。

クランスナー（Kransner）ら、（Neurology,36,92−9
4（1986））の報告は、動物をEAEから守ることから、多
発性硬化症の治療として試験されていた、合成Ｃ共重合
体Ｉが、MBP免疫的交差反応性を表さないことを開示し
ている。

さらに、ベリック（Belik）ら（Vopr.Med.Khim.,24,3
72−377（1978））は、「アルカリミエリンタンパク質
断片」と、「合成起脳炎ペプチド）を、EAEとともにモ
ルモットに非経口的に投与することを開示している。
「アルカリミエリンタンパク質断片」を、ウシの「アル
カリミエリンタンパク質断片」または「合成起脳炎ペプ
チド」で感作された動物に投与した後、動物は回復し
た。

EAEとEAUの以前の研究は、MBPまたはＳ−Agの投与量
の増加が、より良い疾患防御に結び付くことを示してお
り（Higgins,P,J.,et al.,J.Immunol.,140,440（198
8）,Nussenblatt,R.B.,et al.,J.Immunol.,144,1689（1
990））、また、一般的に、実験者は、より多くの抗体
量を与えることが、経口耐性を増進することを報告して
いる（Mowat,A.M.,Immunol.Today,8,93（1987））。

ある報告は、経口的に耐性のある動物から、CD8⁺T細
胞を養子移入することにより、EAEが抑制されることを
示唆している（Lider,O.,et al.,J.Immunol.142,748−7
52（1989））。

しかし、この技術において、苦しんでいる動物にEAE
自体が発現した後にEAEをうまく治療することは、まだ
知られていない。また、この技術において、患者に多発
性硬化症自体が発現した後に多発性硬化症をうまく治療
することもまた、まだ知られていない。従って、多発性
硬化症を抑制し、治療する方法の必要性は、いまだに存
在している。

III.アジュバント関節炎 アジュバント関節炎（Adjuvant arthritis）（AA）
は、炎症性関節疾患の実験的モデル、特にリューマチ性
関節炎のモデルである。アジュバント関節炎は、結核菌
（MT）の油中の懸濁液を皮下注射することにより誘起さ
れる（Pearson,C.M.,J.Chronic Dis.,16,863−874（196
3））。注射の後10〜15日の間に、動物は重篤で進行性
の関節炎になる。

それは、臨床的にも組織病理学的にも特徴がヒトのリ
ューマチ性関節炎に似ているため（Jasin,H.E.,Federat
ion Proc.,32,147（1972））、AAは、免疫媒介炎症性関
節疾患の機構の実験や、組織特異的自己免疫性疾患の治
療法の実験に用いられてきた。

アジュバント関節炎は、細胞媒介自己免疫性疾患であ
り、細胞群またはＴ細胞のMT特異的クローンによって転
移される（Taurog,J.D.,et al.,Cell.Immunol.75,271
（1983）,Taurog,J.D.,et al.,Cell.Immunol.80,198（1
983）,Cohen,L.R.,et al.,Arthrits and Rhem.,28,841
（1985））。研究によると、アジュバント関節炎の主要
な自己抗原は65−kdミコバクテリア熱衝撃タンパク質
（HSP）であることが示唆されている（van Eden,W.,et
al.,Nature,331,171（1988））。このタンパク質は、連
鎖球菌細胞壁関節炎において重要であることが明らかに
されている（Dejoy,S.Q.,et al.,J.Exp.Med.,170,369
（1989）,van den Broek,M.,et al.,J.Exp.Med.,170,36
9（1989））。アジュバント関節炎には、タイプIIコラ
ーゲンに対する免疫性があることが示されている（Tren
tham,D.E.,et al.,J.Clin.Invest.,66,1109（198
0））。

コラーゲンの経口及び静脈内投与に伴う耐性化が、コ
ラーゲン誘引関節炎（CIA）と名付けられた他の型の関
節炎を抑制することが示されている。タイプIIコラーゲ
ン（C II）の経口投与によるDBAマウスのCIAの抑制は、
投与量に依存しており、3mgでなく0.5mgを２週間にわた
って８回与えたとき、抑制が観察された（Nagler−Ande
rson,C.,et al.,Proc.Natl,Acad.Sci.USA,83,7443−744
6（1986））。同様の結果は、ラットのCIAについても報
告され、C IIを2.5μg/g与えた方が25μg/g与えた場合
より大きな抑制が見られた（Thompson,H.S.G.,et al.,C
lin.Exp.Immunol.,64,581−586（1986））。i.v.耐性の
点から見ると、DBAマウスのCIAを抑制するために、1mg
が与えられる（Myers,L.K.,et al.,J.Exp.Med.,170,199
9（1989））。

CIA関節炎に対する阻害の養子移入が、C IIを静脈内
処理した動物に対しては報告されているが（Myers,L.,
K.,et al.,J.Immunol.,143,3976（1989））、経口耐性
についてではない（Nagler−Anderson,C.,et al.,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,83,7443−7446（1986）,Thompson,
H.S.G.,et al.,Clin.Exp.Immunol.,64,581−586（198
6））。

しかしながら、ヒトのリューマチ性関節炎の動物モテ
ルとC IIの経口投与がAAを抑制すること、そして、この
抑制が脾臓のＴ細胞によってC IIを与えられた動物から
養子移入され得ることは、まだ知られていない。

従って、自己免疫性疾患の治療、特にＴ細胞仲介ある
いはＴ細胞依存性の自己免疫性疾患の治療の必要性が存
在している。

発明の要旨 本発明は、そのような治療を必要とする患者に、Ｔ細
胞仲介あるいはＴ細胞依存性の自己免疫性疾患の治療方
法を提供する。その治療方法は、自己抗原、自己抗原の
断片、特定の自己免疫性疾患に特異的な自己抗原と構造
的に関連している類自体を、そのような患者に、自己免
疫性疾患の治療に有効な量を経口投与することからな
る。

そのような自己免疫性疾患の、臨床的及び組織学的影
響の両方が、本発明の方法による投与量依存の手法で抑
制される。さらに、そのような抑制は、自己抗原の投与
が自己免疫性疾患の発現の前であろうと後であろうと発
揮される。

本発明の方法によると、Ｔ細胞依存性自己免疫性疾患
は、非疾患誘起性及び疾患誘起性の自己抗原断片の経口
投与によっても抑制される。従って、自己抗原の経口投
与は、それによって自己免疫性疾患は自然に免疫調節さ
れる、効果的で簡単な方法を意味している。

本発明のさらなる面では、EAE及び多発性硬化症の治
療及び抑制方法を提供する。その方法は、そのような治
療を必要とする患者に、ミエリン塩基性タンパク質の特
異的断片の経腸投与を提供し、自己免疫性疾患の発現の
前または後で有効である。

本発明のさらなる面では、アジュバント関節炎及びリ
ューマチ性関節炎の治療及び抑制方法を提供する。その
方法は、タイプIIコラーゲン（C II）を、そのような治
療を必要とする患者に経腸投与し、自己免疫性疾患の発
現の前または後で有効である 図面の簡単な説明 図1:ルイスラット（Lewis rat）における増殖応答の、
経口的に誘起された抑制の抗原特異性。動物は、７、
５、２日前に500μｇのMBPまたはBSAを与えた後、CFA中
の100μｇのMBPで免疫化し、その日を０日とした。免疫
化の９日後に、リンパ節を取り出し、MBP、BSA及びPPD
（すべて50μg/ml）に対する増殖応答を、実施例３で述
べるように同定した。

刺激指環＝（試験cpm）/c対照cpm） 図2:関節部の腫れによって測定した、経口的に誘起され
た抑制。

図3:EAEの再発誘起の実験 図4:SJLマウスにおけるリンパ様細胞増殖の、経口的に
誘起された抑制。動物は、２週間にわたって400μｇのM
BPを７回与えた後、CFA（0.6mg/ml結核菌）中の400μｇ
のMBPで免疫化させた。刺激指標は、MBP誘起増殖をバッ
クグラウンドで割った商である。

図5:ミエリン塩基性タンパク質（MBP）を与えたラット
から得られた脾臓及び腸間膜リンパ節細胞（LNC）によ
る、膝窩排出リンパ節細胞（PLNC）の抗体特異的抑制。
結果は、MBPに対する（丸印）、結核菌に対する（四角
形印）、抑制パーセントで表した。黒丸印と黒四角形印
は、脾臓細胞の応答を表し、白丸印と白四角形印は、腸
間膜リンパ節細胞の応答を表している。

図6:経口MBP投与後の、MBPに対するIgG応答の特異的抑
制。ラットは、間欠的に出血させ、血清を抗OVA（図6
A、白丸印）、抗MBP（図6B、黒丸印）抗体を試験した。
これらの血清は、非投与で攻撃された動物（黒印）と比
較した。結果は、ELISA O.D.492レベル±標準偏差で示
した。

図7:ルイスラットは、７、５、２日前にMT（Ａ）または
C II（Ｂ）を与えた。その後、動物に、10mg/mlのMTを
含むCFAを尾の根本に皮下注射し、その日をAA誘起の０
日とした。最初の13日に、動物はAAの臨床的徴候を検査
し、個々に記録した。「関節炎評点」は、各々の時点に
おける各々のグループの５−10の個々のラットからの平
均の関節炎評点（４つの足の合計）を表している。

図8:ルイスラットは、７、５、２日前に緩衝液のみ（対
照）または示したような種々の投与量のC IIを与えた。
その後、動物に、10mg/mlのMTを含むCFAを尾の根本に皮
下注射した。一ヶ月後、動物は20μｇのC II（Ａ）また
は10μｇのMT（Ｂ）で攻撃した。注射前と注射後48時間
に耳の厚さを測定した。Ｐ値は投与動物と対照の比較で
あり、nsは重大でないことを意味する。

図9:ルイスラットは、７、５、２日前に種々の投与量の
MT与えた後、尾の根本への0.1mlのCFAで免疫化して、そ
の日を０日とした。排出リンパ節を、９日後に回収し
て、増殖応答を計測した。

図10:ルイスラットは、10mg/mlのMTを含むCFAの皮下注
射により関節炎を引き起こした。最初の徴候は、疾患誘
起後13−14日に現れた。17日目に、動物を疾患の重さに
応じて２つのグループに分けた。対照グループは治療し
ないでおき、一方、治療グループには、１週間に３回、
１日おきに３μｇのＣ＝を経口で与えた。両方のグルー
プの動物を、34日目まで、関節炎について記録した。デ
ータは、実際の関節炎評点±標準誤差として示した。

好ましい具体例の説明 I.定義 以下の説明においては、免疫学で用いられる多くの用
語が広範に使用されている。明細書及び特許請求の範囲
の明確で首尾一貫した理解を提供するため、そのような
用語が与えられた見方を含めて、以下の定義を提供す
る。

自己免疫性疾患 自己免疫性疾患は、ヒトを含めた動物の免疫機序の機
能不全であり、その免疫組織が、その動物の外部の基質
と、その動物の正常な成分の一部分である基質との識別
を誤っている。

自己抗原 「自己抗原」は、自己免疫性疾患の様な異常な状態に
ある動物に通常見られる物質であり、その動物のリンパ
球や抗体によって、それがその動物自身の一部分である
ことが認識されない限り、免疫調整機序によって、外部
物質として攻撃される。

生物学的活性断片 自己抗原の「生理学的活性断片」という用語は、自己
抗原の、ある一部のアミノ酸配列を含んでおり、その部
分的アミノ酸配列は、全ての長さの自己抗原と同様の生
理学的応答、即ち、経口的導入でＴ細胞仲介あるいはＴ
細胞依存性の自己免疫性応答を抑制したり除いたりする
能力を誘起することができる。

類自体 自己抗原の「類自体」という用語は、自己抗原と同様
の生物学的活性、即ち、自己抗原の投与でＴ細胞仲介あ
るいはＴ細胞依存性と同じまたは等価の自己免疫性応答
を除いたり抑制したりする能力を持つように、自己抗原
と構造的に関連した化合物を含んでいる。そのように、
この用語は、自己抗原のアミノ酸配列と、１以上のアミ
ノ酸が異なる、（しかし自己抗原と等価の生物学的活性
は維持している）アミノ酸配列を、疾患の症状を抑制し
たり緩和したりする能力で、自己抗原の生物学的活性を
まねた化合物と同様に含んでいる。そのような化合物
は、自己免疫製疾患の攻撃部位である目的の期間からの
組織からなっていても良い。

動物 「動物」という用語は、免疫調節機序を入し、従って
自己免疫性疾患に感受性があり、ヒトを含むすべての生
物形態を包含している。

治療 「治療」という用語は、そのような自己免疫性疾患を
防ぐための予防的処理と、そのような自己免疫性疾患の
攻撃の後に、症状を抑制したり緩和したりすることも同
様に含むことを意味する。

投与 そのような自己抗原による治療を必要としている患者
への、自己抗原の「導入」あるいは「投与」という用語
によって、自己抗原、その生理学的に活性な断片、生物
学的に活性な類自体を、そのような患者に、意図された
有益な効果を提供するのに充分な時間の長さに、そのよ
うな自己抗体の治療的有効性を保持する手法で供給する
ことを意味している。好ましい具体例においては、自己
抗体は、そのような患者に、経口経路で胃に導入され
る。しかし、「経口」という用語によって、出願人は、
投与を経口で供給されることに限定するのではなく、そ
のような抗原を、患者の胃や消化器官に供給する任意の
投与を意味している。

タイプIIコラーゲン タイプIIコラーゲン（C II）は、中でも、軟骨、椎間
板、及び硝子体に見られるコラーゲンの型である。タイ
プIIコラーゲンは、３本のα１（II）鎖（［α１（I
I）］_３）を有する。

この分野で知られているように、線維状タンパク質の
系統であり、多くの構造的、遺伝学的に異なった型に分
類されている（Stryer,L.,Biochemistry,2nd Edition,
W.H.Freeman ＆ Co.,1981,pp184−199）。タイプＩコラ
ーゲンは、最も普通の形態であり、中でも、皮膚、腱、
角膜、及び骨に見られ、α１（Ｉ）コラーゲンの２つの
サブユニットと、α２と呼ばれ異なった配列を持つ１つ
のサブユニットからなる。タイプIIコラーゲンを含む他
の型のコラーゲンは、各々が1000のアミノ酸からなる、
３つの同一のサブユニットまたは鎖からなっている。タ
イプIIIコラーゲンは、中でも、血管内、心臓及び血管
系、及び胎児の皮膚に見られ、３本のα（III）鎖
（［α（III）］_３）を含有する。タイプIVコラーゲン
は、中でも、基部膜に極在し、３本のα（IV）鎖（［α
（IV）］_３）を含有する。

本発明は、そのような自己免疫性疾患に特異的な自己
抗原、その自己抗原と同様に生物学的に活性な、断片、
そしてその類自体を、経口投与することによる、Ｔ細胞
仲介またはＴ細胞依存性自己免疫性疾患に関する。

本発明が主に使用されるのは、大きな範ちゅうの疾患
の治療である。それは、その疾患の攻撃に先立って及び
／又は後に使用され、その疾患は、集合的に自己免疫性
疾患と呼ばれるような疾患であり、多発性硬化症、重症
筋無力症、リューナチ性関節炎、糖尿病、及び特に若年
性糖尿病、全身性狼そう紅斑症、自己免疫性甲状腺炎、
自己免疫性溶血性貧血、例えばpoison ivyのような植物
体によって生じる接触感受性疾患を含むが、それらに限
られるものではない。

従って、本発明の方法によれば、多発性硬化症の下敷
になっている自己免疫性応答は、MBPあるいはその生理
学的活性部分の投与によって治療される。また、本発明
の方法によれば、リューマチ性関節炎の下敷になってい
る自己免疫性応答は、C IIあるいはその生物学的活性部
分の投与によって治療される。

本発明は、MBPの経口あるいは経腸投与が、慢性及び
急性の単相性EAEを抑制するための有効な手段であるこ
との発見と確認に基づいている。非常に好適な具体例で
は、そのような投与は経口である。疾患が発現した後の
MBPの経腸投与によるEAEの抑制は、予想できない。

本発明は、さらに、タイプIIコラーゲンの経腸投与
が、アジュバント関節炎の抑制の有効な方法であること
の発見にも基づいている。タイプIIコラーゲンによるア
ジュバント関節炎の抑制は、特に驚異的である。なぜな
らタイプIIコラーゲンは、アジュバント関節炎の抑制
に、MTより予期しないほど大きな効果を有しているから
である。好適な具体例では、そのような投与は経口であ
る。

EAE及びアジュバント関節炎の両方における経腸的に
誘起された耐性は、投与量に依存しており、疾患の臨床
的、組織学的徴候は分断されて減少する。例えばウシ血
清アルブミン（BSA）のような無関係な抗原あるいはコ
ラーゲンや「Ｓ」抗原（実験的自己免疫性葡萄膜炎を含
む自己免疫）のような他の抗原の経口投与は、EAEに対
する感受性に何も影響せず、経口的に誘起されるEAEに
対する耐性は、MBPに特異的であり、疾患を媒介するＴ
細胞に対する抗原が検知される。

さらに、ラットに対するMBPの経口投与は、MBPに対す
る免疫応答の抑制を誘起する。例えば、リンパ細胞増殖
と、抗MBP抗体の生成は、ともに減少する。疾患の抑制
と、抗原特異的な細胞のインビトロの応答の抑制の両面
に感応できる細胞は、Ｔ細胞起源であり、サプレッサー
／細胞障害性CD8＋リンパ球である。

従って、下記で述べるように、多発性硬化症のEAE動
物モデルを用いること、AAの動物モデルを用いること
は、各々MBPやC IIのような自己抗原を投与する簡単な
方法であり、本発明によって教えられているように、特
定の自己免疫性疾患の進行や抗原に対するある免疫応
答、そしてそのような疾患自体が患者で発現した後の進
行抑制するための有効な治療である。

一般に、自己抗原、断片、あるいは類似体は、１日に
１から1000mgの量を経口的に導入され、それは、単独投
与形態あるいは複数投与形態で投与されてよい。好まし
くは、自己抗原、断片、あるいは類自体は、１日に25か
ら850mg投与される。当業者には理解されている様に、
投与量は、患者の年齢、性別、体調と同様に、同時に行
われている治療によって計算される。そのような製剤
を、そのような自己免疫性疾患の治療を必要としている
動物に投与し、疾患の重篤度を改善し、除去し、緩和
し、回復し、減少させてよい。そのような製剤を、その
自己免疫性新刊が進行するように前処理した動物に投与
し、そのような疾患の攻撃を阻害し、あるいはそのよう
な疾患が発現したとき、その重篤度を減少するようにし
てもよい。

自己抗原、断片、あるいは類似が経口的に投与される
場合、それは、他の食物形態に混合してもよいし、固
体、半固体、懸濁液、乳化液形態で使用してもよい。そ
のような自己抗原は、製薬上許容されている塩、キャリ
ア、芳香剤、等と混合してもよい。

抗原は、そのような抗原を必要としている患者への投
与のために、他の適当な抗原と組み合わせて投与しても
よい。たとえば、１つ以上の組織原または種からのタイ
プIIコラーゲンを使用してもよい。本発明の自己抗原
は、そのような抗原を必要としている患者への投与のた
めに、適当な薬理学的キャリアと組み合わせて投与して
もよい。そのような抗原は、ヒト及び動物の自己免疫性
疾患の予防的、緩和的、予防の、あるいは状況回復する
硬化を持つ任意の形態で投与することができる。

本発明の自己抗原は、経口投与用の、錠剤、カプセル
剤、粉体小包、液状溶液のような形態で、そのような投
与形態にすることによって、自己抗原の生物学的活性が
破壊されない限り、採用されることができる。

経口投与のための、本発明の自己抗原は、乾燥粉体、
食品材料、水性あるいは非水性溶媒、懸濁液あるいは乳
化液として提供される抗原を含む。非水性溶媒の例は、
プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、野菜
油、魚油、及び注射可能な有機エステルである。水性キ
ャリアは、水、水−アルコール溶液、懸濁液または乳化
液を含み、それらは、塩化ナトリウム溶液、リンガーの
デキストロース溶液、塩化ナトリウム及びデキストロー
ス溶液、リンガーの乳糖含有溶液、または固形油を含
む、塩水や緩衝した医学的経口賦型剤を含んでいる。

自己抗原、断片、あるいは類似体が経腸的に投与され
る場合、それは、固体、半固体、懸濁液、乳化液の形態
で導入されてよく、水、懸濁剤、乳化剤を含む製薬上許
容されたキャリアをホストとして混合してもよい。

本発明の抗原は、特に、患者の自己免疫性疾患の進行
を阻害するように予防的測定として投与されたり、すで
に確立された自己免疫性疾患を改善したり遅延させたり
するように投与されるとき、ポンプによって、あるいは
放出が維持された形態で投与してもよい。

本発明の自己抗原を含み、本発明の方法で有用な製薬
組成物は、それ自体知られている方法で作製される。例
えば、抗原は、従来の混合、顆粒化、糖衣粒作製、溶
解、凍結乾燥、または類似の方法による製薬組成物とし
て提供されてよい。そのような組成物は、中にそしてそ
れ自体に、慢性あるいは急性の自己免疫性疾患の抑制に
有用性が見られる。

さらに、そのような組成物の低い潜在能力版は、軽
い、慢性、あるいは急性の自己免疫性病気の取扱いに有
用である。

実質的に自然汚染物のない自己抗原は、自然あるいは
組換え体の原料から、従来この分野でそのようなタンパ
ク質を単離するのに用いられたことが知られている条件
や技術、即ち抽出、沈澱、クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、電気泳動等によって単離
し、精製することができる。

当業者は、過度の実験をすることなく、この分野で知
られている技術を用いて自己抗原の抗原ドメインを同定
することができ、そのようなドメインは、本発明の方法
において好適である。例えば、元の自己抗体の誘導体、
あるいは、組換えで生成した自己抗体の誘導体は、全長
タンパクを通常のプロテアーゼ、例えばトリプシン、キ
モトリプシン、サブチリジン、でタンパク質切断するこ
とにより作製できる。アクチン誘導樹脂のアフィニティ
ークロマトグラフィーは、自己免疫性疾患抑制能力のた
めに、そのようなフラグメントの検定に使用してよい。

自己免疫性疾患抑制活性を有する化合物や断片を同定
したい場合は、そのような化合物や断片は、その分野で
知られている技術により同定することができる。

さらに、そのような断片は、機能が相同性（homolog
y）に従うと予想される他の知られた自己免疫性ドメイ
ンに対する相同性によって同定してもよい。

例えば、本発明の方法で有用な自己抗原は、自己免疫
性疾患に悩まされているあるいは前もって処理された患
者に対し、そのような抗原を投与したときに自己抗原誘
起の自己免疫性疾患を抑制する、その自己抗原の能力に
よって、同定してもよい。本発明の方法においては、自
己免疫性疾患は、疾患の徴候が現れる前あるいは現れた
後に、抗原を投与することにより、自己免疫性疾患が抑
制される。

今まで本発明を一般的に説明したが、引き続く実施例
は、本発明を実施する上において使用される材料及び方
法をさらに説明する。本発明は、実施例に限られるもの
ではない。

実施例 A.方法 動物：体重150〜220g（年令６〜８週間）の雌のルイス
ラットまたはウィスターファース（Wister Furth）ラッ
トを、ウィルミントン,MAのチャールズリバー研究所、
あるいはインディアナポリス,INのハーランスプレイジ
デューレー社から入手し、すべての実験において使用し
た。

動物の免疫化：ラットを、その両後足において、完全フ
ロイントアジュバント（CFA）に乳化した50μｇのモル
モットMBPで、免疫化した。いくつかの実験では、50μ
ｇのオボアルブミン（OVA）（シグマ社）を乳化抗原に
添加して、同じように注入した。EAEは、手足の麻痺に
よって特徴付け、次のように評点した。０）病気でな
い;1）手足の末端の活性が減ってきている;2）軽い麻
痺、不安定な足取り;3）手足のさらに広い範囲において
の中程度の麻痺;4）四肢の麻痺。

経口許容量の誘導：ラットに、MBPあるいはウシ血清ア
ルブミン（BSA）を、３日の間隔５回、PBS（H₂O1000ml
中、8gmNaCl,0.2gmKCl,1.44gmNa₂HPO₄,0.24gmKH₂PO₄）1
ml中1mgずつ、プラスチックチューブ被覆した23ゲージ
針を使って与えた。

増殖検査：免疫処理の後９日後に、ラットを犠牲にし、
それらの膝窩リンパ節を取り出した。圧力をかけてリン
パ節をステンレス鋼メッシュに通すことによって単一細
胞懸濁液を用意した。総数10⁵のリンパ節細胞（LNC）
を、指定された数の照射（2000ラド）LNC、あるいは投
与ラットから誘導された未処理LNCとともに培養したも
のを、丸底の96ウェルプレート（コースター）で４つ用
意した。MBPと結核菌（Mt）を50μg/ml、容積20μｌの
培養液に添加した。培養液は80時間温置し、培養の最後
の16時間は、１μCi［³H］TdR/ウェルで標識した。それ
から、培養液を自動細胞収集容器で収集し、標準液体シ
ンチレーション計数管で読み取った。

開始LNC（PLNC）増殖の抑制パーセントは、次式によ
って計算した。

増殖培地：すべての実験においてRPMI（ギブコ製）を使
用した。培地は、２×10^-5M 2−メルカプトエタノール,
1％ピルビル酸ナトリウム,1％ペニシリンとストレプト
マイシン,1％非必須アミノ酸および１％の自家血清を添
加した後、無菌濾過した。

異なる細胞群の精製：脾臓細胞からのCD3,CD4,CD8群の
喪失のために、負の選択をした。ペトリ皿を、PBS/BSA
中10mlの1/1000やぎ抗マウスIgG＋IgM抗体（タゴ製）
で、１昼夜４℃でコーティングした。それから、皿を洗
って、PBS中３％のウシ胎児血清で、30分20℃でコーテ
ィングし、再び洗った。ルイスLNCは、PBS中1/100に希
釈されたCD3（MRC,OX/38）,CD4（W3/25）あるいはCD8
（OX/8）用のマウス抗ラットの単クローン抗体（セロテ
ック／バイオプロダクツ製）で染色した。細胞は、氷上
で30分染色し、洗った後、一皿当り5mlPBS中1500万細胞
を、４℃で、予めプレコートされたペトリ皿に播種し
た。非粘着性の細胞を含む上澄みを、60分後に穏やかに
吸引し、細胞検査および計数の前に２度遠心分離した。
この実験は、膜免疫蛍光法を実施することによって、蛍
光標示式細胞分取器で検査したところ、約85〜95％の純
度の細胞群を得た。

養子免疫移入実験：提供側ラットには、MBAかBSAのいず
れかを、1mgずつ５回、３〜４日の間隔で投与し、最後
の投与の４日後、犠牲にした。腸間膜のLNCと脾臓細胞
を収集して、直ちに、あるいはコンカバリン−Ａ（Con
−Ａ）で活性化した後、増殖培地中1.5μm/mlを、48時
間で腹膜内に注入した。養子免疫移入実験で注入された
細胞数は、次の通りであった：活性あるいは不活性を含
む全LNC群が120×10⁶;CD3を喪失したLNCが60×10⁶;CD4
を喪失した群が80×10⁶;CD8を喪失したLNCが95×10⁶で
あった。受容側ルイスラットには、４時間後に、EAE誘
導のために、BP/CFAで免疫処理を施した。

抗体の血清レベル:MBPとOVAに対する抗体力価を決定す
るために、固相酵素結合免疫吸収剤検査法（ELISA）を
採用した。微滴定用の皿を、10μｇ抗原/mlのウェル当
り0.1mlで温置したものを、蒸留水中に２つ用意した。
皿は、18時間25℃で温置した。PBS/トウィーン−20（バ
イオラド製）,pH7.5で３回洗った後、皿を３％BSA/PBS
で２時間37℃で温置し、２回洗い、100μｌの希釈血清
を４倍量になるように加えた。皿を２時間37℃で温置し
た。PBS/トウィーン−20で３回リンスした後、皿を、１
％BSA/PBSで1:1000に希釈された100μl/ウェルのペルオ
キシダーゼ−結合やぎ抗ラットIgG抗体（タゴ製,USA）
で、１時間25℃で温置した。彩色反応は、30％H₂O₂を含
むＤ−フェニレンジアミン（0.4mg/mlリン酸塩）クエン
酸緩衝液,pH5.0）に浸すことによって得られた。反応
は、0.4N H₂SO₄を添加することによって停止し、ELISA
読み取り器でOD492nmを読み取った。

抗体生成の生体外測定：膝窩と脾臓のLNCは、投与され
た純粋でかつ免疫性テストに使われたラットから得ら
れ、ペトリ皿に1ml当り10⁷細胞の濃度で単独に播種さ
れ、あるいは他のPLNCとともに指示通りに照射（2000ラ
ド）された。培養液を、抗原有り（20μg/ml）あるいは
無しで、増殖培地中で、３日間恒温器内に保持し、その
後収集した。生体外での生成とIgG抗体の分泌を実験す
るために、希釈上澄みを使用し、前述した通りにして、
ELISAテスト法を用いて抗体生成の測定を行った。

異なる領域のミエリン塩基性タンパク質分子のEAE抑制
に対する応答の同定:1〜37領域のモルモットミエリン塩
基性タンパク質の重複断片を、固相ペプチド技術,Hough
ten,R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5131〜5135（198
5）を用いて合成した。そして、これらの断片を、全ミ
エリン塩基性タンパク質の15mgに等しいモル濃度になる
ように経口投与した。それらは、免疫化より−7,−５そ
して−２日前に投与した。そして、既に確立されている
方法にしたがってフロイントアジュバントの塩基性タン
パク質で、動物の免疫性テストを行い、そして評点し
た。

タンパク質抗原を投与する経口ルートがどの断片に免疫
応答があるのかを決定することの証明：動物には、全ミ
エリン塩基性タンパク質を与え、その足にフロイントア
ジュバントで免疫処理を施すか、あるいは経口投与のい
ずれかを行った。その後７〜10日で、脾臓とリンパ節細
胞を取り出し、生体外にて再び、ミエリン塩基性タンパ
ク質分子の異なる断片で、刺激を与えた。

コラーゲンとアジュバント：可溶性形態のニワトリのタ
イプIIコラーゲンを、ボストン,MAのゲンザイムコーポ
レーションから入手した。ウシのタイプIIIコラーゲン
は、バーミントン,ALのサザンバイオテクノロジーアソ
シエイツ株式会社から購入し、また、タイプＩコラーゲ
ンは、ボストン,MAのベス イスラエル病院のD.トレン
タン博士から寄贈された。結核菌と不完全フロイントア
ジュバント（IFA）は、デトロイト,MIのディフコ研究所
から購入した。完全フロイントアジュバント（CFA）
は、微粉にIFAとMT基質を混合することによって準備し
た。

経口投与実験：抗原は、疾患を誘発する前に３回（−7,
−5,−２日）、18Gボールペン針を備えたシリンジを通
して、容積1mlを経口投与した。コラーゲンは、リン酸
カリウム緩衝液（pH7.6）に溶解したのに対し、MTは、
投与用のリン酸緩衝塩類液（PBS）に懸濁させた。

関節炎の誘発:10mg/mlの結核菌を含むCFA0.1mlで、尾の
付け根に皮下注射することで、動物にアジュバント関節
炎を誘発した。

関節炎の評価：関節炎の発生は、疾患誘発後35日以内に
関節炎の臨床的証明がなされたラットの数で評価した。
関節炎の程度は、標準方法（Trentham,D.E.et al.,J.Ex
p.Med.146:857（1977））にしたがって等級付けした。
４本の足のそれぞれは、次のような等級付けした:0＝平
常,1＝単に赤色,2＝赤色＋軽い腫れ,3＝ひどい腫れ,4＝
関節部の変形。それぞれの動物の関節炎の点数は、４本
の手足の各点数の合計とした。最大の関節炎点数は、疾
患の進行中において、個々の動物の最高点数である。す
べての評価は、扱ったグループの知識なしに盲状態で実
施した。

リンパ球の増殖検査：ラットには、1mg/mlMTを含むCFA
を0.1ml,尾の付け根に注入した。９日後、排出リンパ節
を取り出し、単一細胞懸濁液を用意した。２回洗った
後、１％グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイ
シン、１％非必須アミノ酸、５％ウシ胎児血清および５
×10^-5M2−メルカプトエタノールを含むRPMI1640で、細
胞を再び懸濁させた。その後、濃度2.5×10⁵細胞数／ウ
ェルのものを４つ、96ウェル平底皿に播種し、５％CO₂
で37℃でMTの濃度を種々に変えて72時間培養した。その
後、トリチウム化チミジンを１μCi/ウェルで培養液に
添加した。細胞は、標識後６時間で収集し、増殖は、液
シンチレーション計数機によって測定したとおり、トリ
チウム化チミジン結合によって決定した。

遅延型過敏性（DTH）応答:DTH応答は、免疫化の後30日
後に測定した。ラットには、50μ1PBS中20μｇのC IIの
MT10μｇを、両耳に皮下注射した。耳の腫れは、マイク
ロメータ測径器を用いて、注射前と注射後48時間で測定
した耳の厚さの違いから判った。また、DTH応答は、非
免疫化の動物とC IIのみを与えられた動物において実施
した。

抑制の養子免疫移入：提供者側ラットには、２〜３日の
間隔で、C II3μｇずつを３回投与した。最後の投与を
してから７日後、彼らの脾臓を取り出し、単一細胞懸濁
液を用意した。トリス−NH₃Cl,pH7.26で赤血球を溶解し
た後、スプレノサイトを、ハンクス液（HBSS）で２回洗
った。いくつかの実験においては、スプレノサイトは、
ナイロンウールカラムを使うことによって、Ｔあるいは
Ｂ細胞に分離させた。１×10⁸の細胞を、各受容体に腹
膜内注射した。受容体には、同日あるいは２日後のいず
れかに、関節炎を引き起こすために、CFAを注射した。
また、対照標準用として、投与されていない通常のラッ
トからスプレノサイトを用いた。

実施例１ MBPとその断片の投与の効果 急性の単一位相性EAEへの感受性と重篤性に対するMBP
とそのペプチド断片の投与の効果を、ルイスラットで研
究した。その結果は、寛容誘導の自然ルートが、疾患の
進行とMBPへの免疫応答の両方を抑制することを示して
いる。

EAEの経口誘導抑制のために、ルイスラットに、モル
モットの脳（Diebler,G.,et al.,Prep.Biochem.2:139
（1972））から精製したMBPを、20Gボールペン針付きの
シリンジを使って投与した。対照標準用の動物には、等
量のウシ血清アルブミン（BSA）あるいは塩類液を投与
した。EAEは、200μｇの結核菌を含む完全フロイントア
ジュバント（CFA）に乳化されたMBP50μｇを後ろ足に注
射することによって免疫化した。疾患は、免疫化の後通
常12から15日の間に、後ろ手足の麻痺と失禁によって特
徴付け、すべての場合において、ラットは16日で回復し
た。第１の実験では、投与の回数とMBPの用量が疾患の
発現に与える効果について調査した。ラットには、免疫
化（０日）の７日前（−７）に１回、あるいは−14、−
７および０の３回のいずれかに、種々の量のMBPを与え
た。結果（表１）は、ラットに投与したMBPがEAEを抑制
することと、経口誘導抑制が用量依存性であることを証
明するものであった。500μｇの投与を複数回行うこと
は、結果として、疾患を完全に抑制し、この用量で一回
の投与をするよりさらに効果的であった。EAEの臨床的
発現に加えて、ラットの疾患の組織学的証拠を調査し
た。免疫の後16日で、ラットを犠牲にし、脳を取り除い
てホルマリン溶液に固定した。固定液は、100mlの70％
エタノール、10mlの37％ホルマリンおよび5mlの氷酢酸
の溶液とした。パラフィン固定組織のスライドを、各ラ
ットから用意し、ヘマトキシリンとエオシンで染色し
た。血管周辺の炎症の病巣を、既に確立されている手順
（Sobel,R.,et al.,J.Immunol.132:2393（1984））にし
たがって、遺伝暗号スライド上で定量化した。表１に示
したように、−14、−７および０日に500μgMBPを投与
したラットは、脳の炎症数に明らかな減少を引き起こし
ていた。中程度の減少は、100μｇ投与の動物で見ら
れ、またあまり顕著でない炎症の減少は、25μgMBPを投
与したラットにおいて見られた。

前以て抗原に晒しておくことが抑制に及ぼす効果 第２の実験では、経口誘導抑制が、抗原に前以て晒し
ておくことによって影響を受けるか否かを決定するため
に、MBPで免疫化する前あるいは後でMBPを投与すること
の効果を調査した。これらの実験のために、動物には、
500μｇのMBPを、疾患の能動誘導（MBPでの免疫化）の
前あるいは後のいずれかに、３回投与した。結果（表
２）は、動物に感作の前あるいは後にMBPを与えたかど
うかで、疾患の臨床発現が抑制されることを証明してお
り、その効果は、抗原が免疫化の前に投与されている場
合に、より完全なものとなる。しかしながら、組織学的
調査によれば、MBPへの感作の前あるいは後のいずれか
にMBPを与えられたラットにおいて、血管周辺の湿潤物
の劇的な減少が示された。また、ラットに免疫化の後＋
５あるいは＋７日からの３回の投与を開始した場合に、
疾患の60％上の抑制が起こった（データは示されていな
い）。

さらに、MBPで免疫化する前と後に、ラットに100μｇ
のMBPを種々回数を変えて与え、実験を行った。表３に
示すように、疾患の抑制は、免疫化の前あるいは後に１
回だけ投与した場合に見られた。

実施例３ MBPの経口投与がMBPに対する細胞性およびホルモン性の
免疫応答に与える効果 MBPの経口投与が、MBPに対するう細胞性およびホルモ
ン性の免疫応答に与える効果について調べた。MBPに対
する増殖応答は、MBPの種々異なる用量をラットに与え
た後、またさらに免疫化に関して種々異なる回数与えた
後、調査した。免疫化の10日後に、ラットを犠牲にし、
排出（膝窩の）リンパ節の単一細胞懸濁液を用意した。
細胞を、４日間ミクロウェルで培養し、最後の24時間
で、3H−チジミンを添加した。２％グルタミン、１％ペ
ニシリン／ストレプトマイシン、５×10^-5Mの２−メル
カプトエタノールおよび５％ウシ胎児血清を含むRPMI16
40中に４×10⁵の細胞を含有する0.2mlを、、各ミクロウ
ェルに添加し、MBPを50μg/ml添加した。ウェルを、１
μCiトリチウム化チミジンで標識し、マルチハーベスタ
ーを使ってファイバーグラスフィルター上に収集し、標
準液体シンチレーション技術にしたがって計測した。

結果（表１および２）は、MBP投与が、MBPに対する増
殖応答に著しい減少（75から92％）を引き起こすとを示
している。増殖の抑制は、疾患の抑制と違って、すべて
の用量で起こり、また免疫化後の投与も含めて、テスト
した摂生投与でも起こった。MBPに対する増殖応答の経
口誘導抑制は、表１に示すように、抗原特異性である。
特に、MBP投与は、精製したタンパク質誘導体（PPD）、
すなわちCFAで免疫化した結果としての増殖応答を誘導
する結核菌から引き起こされた抗原に対する増殖応答は
抑制しない。不適切な抗原、すなわちBSAを投与するこ
とは、PPDに対する増殖応答に影響を与えず、MBPに対す
る増殖応答をわずかに抑制するだけである。

実施例４ MBP投与がMBPに対する抗体生成に与える効果 MBP投与が、MBPに対する抗体生成に与える効果につい
て調べた。MBPを投与されたラットを免疫化し、免疫化
の後16日後に心臓を穿刺することによって、血液を採取
した。血清中の抗MBP抗体のレベルを、ELISAによって計
測した。ミクロウェル当り、0.1mlのMBP溶液（PBS中に
0.05mg/ml）を加え、37℃で３時間温置した。ウェル
を、0.05％トウィーンを含むPBS（PBST）で洗い、PBS中
の５％BSA,pH9.0で、４℃で一昼夜ブロックした。PBST
でウェルを洗浄した後、希釈したラットの血清を加え
て、室温にて３時間温置し、PBSTで２度目の洗浄をした
後、抗体（やぎ抗ラット結合ペルオキシダーゼ）を、室
温にて12時間添加した。基質を加え、0.1MのNaFlで反応
を停止した。プレートは、タイターテックマルチスキャ
ンで450nmで読み取った。また、CFAだけで免疫化したラ
ットからの血清についても、Abs₄₅₀を決定し、それをバ
ックグラウンドとして、すべての値から差し引いた。

実質的にすべての用量と、テストした摂生投与におい
て見られた増殖応答の抑制とは違って、抗体生成の抑制
は、動物が、−14、−７および０日に、テストした最大
用量を投与した場合にのみ見られた（66％抑制、表
１）。記すべきことに、−７、−５および−２日に500
μｇのMBPを投与したラット（表２）において抑制が欠
落したことは、同じ用量のMBPを投与している時間的流
れが、抗体応答の抑制にとって重要であることを示唆し
ている。

（ａ）ラットには、指示された日に種々の用量のMBPを
投与し、０日にCFA中50μgMBP（200μｇ結核菌）で免疫
化した。免疫化した全体数のうち疾患になったラットの
数を示した。免疫化対照は、BSAあるいは塩類液を投与
した。

（ｂ）ラットは、免疫化の後16日後に犠牲にし、脳を取
り出して固定した。動物当りの血管周辺の炎症の平均数
を示した。NDは、決定していないということである。

（ｃ）MBPに対する増殖応答は、ラットを免疫化した後1
0日後に、排出リンパ節細胞について測定した。２％グ
ルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、５×
10^-5Mの２−メルカプトエタノールおよび５％ウシ胎児
血清を含む0.2mlを、各ミクロウェルに添加し、MBPを50
μg/ml添加した。ウェルを、１μCiトリチウム化チミジ
ンで標識し、マルチハーベスターを使ってファイバーグ
ラスフィルター上に収集し、標準液体シンチレーション
技術によって計測した。免疫制御基に関するMBPへの増
殖応答の抑制パーセントを示した。免疫化対照の平均的
刺激の指標（MBP刺激cpm/バックグラウンドcpm）は、6.
0（29888cpm/4960cmp）であった。

（ｄ）ラットは、16日後に犠牲にし、心臓穿刺によって
血液を採取した。血清を、1/15625に希釈し、抗MBP抗体
レベルを、ELISAによって決定した。ミクロウェル当
り、MBP溶液（PBS中0.05mg/ml）0.1mlを添加し、37℃で
３時間温置した。ウェルを0.05％トウィーンを含むPBS
（PBST）で洗い、PBS中５％BSA、pH9.0で、４℃にて一
昼夜ブロックした。PBSTでウェルを洗った後、希釈した
ラットの血清を添加し、室温で３時間温置し、PBSTで２
度目の洗浄をした後、抗体（ペルオキシダーゼ結合やぎ
抗ラット）を室温にて１時間加えた。さらに基質を加
え、タイターテックマルチスキャンで450nmを読み取っ
た。また、CFAでのみ免疫化したラットからの血清につ
いても、Abs₄₅₀を決定し、すべての値から、バックグラ
ウンドとして差し引いた。ペルオキシダーゼ基質の450n
mでの吸光度によって測定したように、免疫制御に関し
て、抗体レベルのパーセント減少を示した（差し引かれ
たバックグラウンドでの免疫制御のA₄₅₀における吸収
は、0.148であった。）。

（ｅ）グループを一自由度のカイ二乗分析によって比較
した。^＊ｐ＜.05、^＊＊ｐ＜0.1、^＊＊＊ｐ＜0.01。

（ａ）ラットには、指示された日に500μｇのMBPを与
え、０日にCFA中50μgMBPで免疫化した。免疫化対照
は、BSAあるいは塩類液を投与した。

（ｂ）表１参照 （ｃ）表１参照。免疫化対照の平均的刺激指標は、9.4
（82247cpm/8718cpm）であった。

（ｄ）表１参照。バックグラウンドとして減じた免疫化
対照のA450での平均吸収は、0.403であった。

（ｅ）表１参照。

表３ ルイスラットにおけるEAEの経口誘導抑制投与スケジュール ＃疾患のラット／全体 なし 11/16 −14,−7,0,＋７ 0/13 −14 1/5 −７ 0/5 ０ 1/5 ＋７ 1/5 ラットには、指示された日（免疫化の日を０日とし
て）に、100μｇのMPBを与え、CFA（.5mg/ml、結核菌）
とともに50μｇのMBPで免疫化した。

実施例５ EAEに抗する経口誘導保護の持続 EAEに抗する経口誘導保護の持続を決定するために、
さらに実験を行った。500μｇのMBPで−７、−５および
−２日に投与した後、ラットを、最後の給餌後に種々の
長さに時間経過後とに免疫化した。EAEは、投与後４週
間まで、ラット内で完全に抑制されていた。８週間で
は、MBPを与えられたラットの50％が、疾患に抵抗して
いた。表４に示したように、結果は、最後の投与の後少
なくとも４週間は、疾患に対する耐性が維持され、投与
の後８週間で、疾患の誘発に感応が現われ始めることを
示唆している。

表４ ルイスラットの経口誘導耐性の持続 疾患のラット／全体 対照 9/14 投与 免疫化日０ 0/4 ＋７ 0/4 ＋14 0/4 ＋28 0/3 ＋56 4/8 ラットには、−７、−５および−２日に500μｇのMBP
を与え、CFA中50μｇのMBPで指示された日に免疫化し
た。対照標準用ラット（BSA投与している）も、同様に
免疫化した。

実施例６ EAEの進行に及ぼすMBP断片の効果 ラット内のモルモットMBPの起脳炎領域が、75〜84残
基に位置する特異的デカペプチドシーケンスであり、そ
れ自身EAEを誘導できるが、分子の他の領域は非脳炎誘
発性であることが知られている（Hashim,G.,Myelin:Che
mistry and Biology,Alan R.Liss,N.Y.（1980））。さ
らに、他の抗原については、明白な抑制決定因子が、免
疫決定因子とは異なった部位に存在していることが報告
されている（Yowell,R.,et al.,Nature 279:70（197
9））。したがって、MBPの脳炎誘発性断片および非脳炎
誘発性断片の両方が、経口投与を経てEAEを阻害するこ
とができるかどうかを調査してきた。モルモットMBPの
断片は、限界ペプシン消化によって生成し、カラムクロ
マトグラフィーによって分離される（Whitaker,J.,et a
l.,J.Biol.Chem.250:9106:（1975））。３つの異なる断
片を、ラットに与え、それから、全MBPで動物を免疫化
した。疾患誘導（44〜89断片）と非脳炎誘発性（１〜37
断片と90〜170断片）のペプチドの両方とも、ラットに
投与した場合において、EAEを抑制し、さらに非脳炎誘
発性断片の方が、脳炎誘発性断片よりも疾患を抑制する
効果の大きいということが見い出された（表５）。単一
アミノ酸置換によって脳炎誘発性シーケンス（75〜84残
基）とは異なったデカペプチド（S79）を合成し、ラッ
トにCFA（Kardys,E.,et al.,J.Immunol.127:862（198
1））を注射した時に抑制効果を誘発することが報告さ
れている。S79（Ala−Gln−Gly−His−Arg−Pro−Gln−
Asp−Glu−Gly）は、動物に与え、またEAEを抑制するこ
とが見い出された（表５）。ウシのMBPは、脳炎誘発性
シーケンスを含むいくつかの部位においてモルモットMB
Pとは異なるが、モルモットMBPの脳炎誘発用量でも、ラ
ットの場合には脳炎誘発性ではない（Holoshitz,J.,et
al.,J.Immunol.131:2810（1983））。また、免疫化の前
に、動物に投与すると、抑制される。

表５ 脳炎誘発性および非脳炎誘発性断片がルイスラットにお
けるEAEの発展に及ぼす効果 EAEの臨床的発現 免疫化対照 19/25 MBP断片１〜37（109μｇ） 0/9^ａ＊＊＊ MBP断片44〜89（135μｇ） 3/11^＊＊ MBP断片90〜170（235μｇ） 0/4^＊＊ ペプチドS79（30μｇ） 1/8^＊＊＊ ウシMBP（500μｇ） 0/10^＊＊＊ ルイスラットには、示された量のMBP断片あるいはペ
プチド（全モルモットMBP500μｇに等モル）を、−７、
−５および−２日前に投与し、０日に、CFAとともに50
μｇのモルモットMBPで免疫化した。免疫化された総数
のうち疾患になったラットの数を示してある。（ａ）グ
ループは、カイ二乗分析によって免疫化制御と比較され
る。：^＊＊ｐ＜.01、^＊＊＊ｐ＜.001。

実施例７ ミコバクテリア投与によるアジュバンド誘導関節炎の抑
制 尾の付け根に10mg/mlの完全フロイントアジュバント
0.1mlで免疫化することによって、雌のルイスラット
に、アジュバンド関節炎を誘導した。免疫化０日より前
−７、−５および−２日と、免疫化の後＋７および＋14
日に、リンパ酸緩衝塩類液中2.0mgの結核菌を、動物に
与えた。免疫化の後３週間の関節の腫れを測定すること
によって、関節炎を定量化した（表４および図２）。次
の研究では、図２に示したような結果は時々得られるも
のであるが、多くの例では結核菌をを動物に与えること
によってアジュバント関節炎が抑制されるものではない
ことを示した。したがって、結核菌の投与でアジュバン
ト関節炎を抑制する能力は、非常に変異的なものなので
ある。この変異性の理由はまだ判っていない。

表６ 21日目の関節部の腫れ（mm） 対照 7.61±1.4 ミコバクテリア投与日 −7,−5,−２ 5.61±1.1^＊ −7,−5,−2,＋7,＋14 6.07±0.9^＊ 関節部の腫れとは、測定日における関節部の厚さであ
る。^＊ ｐ＜0.01制御に比較して（４動物／グループの代表的
実験） 実施例８ SJLマウスにおけるEAEの養子免疫移入モデル 実施できかつ再現できる養子移入再発EAEモデルは、S
JLマウスで確立した。このモデルの実験は、Mokhtaria
n,et al.,Nature309:356（1984）から採用した。この実
験は、図３に図示されている。簡単に言えば、提供側の
動物は、CFA中400μｇのMBPと30μｇの結核菌を含むエ
マルジョンで免疫化した。その10日後に、排出リンパ節
細胞を取り出して、50μg/mlのMBPと４日間培養し、大
量に洗った後、４〜６×10⁷の生存細胞を雌の受容側動
物に静脈注射した。動物には、標準スケールを使って、
臨床EAE用の評点を行い、標準Ｈ＆Ｅ組織学的分析法（B
rown,A.,et al.,Lab Invest.45:278（1981）,Lublin,
f.,et al.,J.Immunol.126:819（1981）,Bernard,C.et a
l.,Eur.J.Immunol.16:655（1976））を用いて病理学的
評点を行った。動物は、移入後少なくとも100日間監視
し、再発の数を決定できるようにした。

実施例９ SLJマウスにおける増殖応答の経口誘導抑制 CFA中400μｇのMBP（0.6mg/ml結核菌）で免疫化する
前の２週間、１日おきに（全部で７回の投与）、400μ
ｇのMBPを投与して、MBP免疫化に対する応答におけるリ
ンパ節細胞の増殖を抑制した。結果を、図４に示す。こ
の図には、バックグラウンドによって割ったMBP誘導増
殖（刺激指標）の関数として、対照の結果対投与の結果
が描かれている。

本発明は、この応用における方法および具体例と、前
述したような具体例に限定されるのではない。本発明
は、本発明によって教示されたような自己免疫疾患の抑
制を生じさせるような任意の変更を含んでいる。これら
の等価体は、特許請求の範囲で定義されている保護範囲
内に含まれるものである。

実施例10 MBP投与した提供側ラットから純粋な同系の受容側ラッ
トへのEAE発展に対する保護抵抗の養子免疫移入 提供側ラットには、３〜４日の間隔で1mgを５回、MBP
あるいはBSAのいずれかを投入し、最後の投与から４日
後に犠牲にした。腸間膜リンパ節細胞（LNC）と脾臓細
胞を収集して、すぐにあるいはコンカナバリン−Ａ（Co
n−Ａ）で活性化した後のいずれかに、48時間にわたり
増殖媒体中1.5μg/mlを腸膜内に注射した。養子免疫移
入実験のために注射された細胞数は、次の通りであっ
た：活性化したものもしていないものも含めた全LNC群
が120×10⁶;CD3を喪失したLNCが60×10⁶;CD4を喪失した
群が80×10⁶;CD8を喪失したLNCが95×10⁶。受容側のル
イスラットは、EAEの誘導後４時間後に、MBP/CFAで免疫
化した。投与した提供側ラットから純粋な同系の受容側
ラットへのEAE発展に対する養子免疫陰通抵抗の能力
は、表７に示した通りである。投与していないラットあ
るいはウシ血清アルブミン（BSA）投与ラットから得ら
れたLNCは、EAEに対する移入保護に失敗した。しかし、
MBP投与提供者から得られた脾臓細胞あるいは腸間膜（M
ES）リンパ節細胞は両方とも、受容者において誘導され
たEAEに対する相対的移入保護の能力がある。実際、そ
れぞれ50％および57％の疾患抑制が証明されている。ま
た疾患の最高の重篤性は、MBP投与提供側ラットから得
られた脾臓細胞あるいは腸間膜リンパ節細胞のいずれか
の受容者においてもまた顕著に低下された。これらの結
果は、EAE誘導に対する経口寛容が細胞起源であるこ
と、また保護に関与する細胞が腸間膜リンパ節と脾臓の
両方に集中して存在していることが見い出されたことを
証明するものである。

ルイスラットには、MBPあるいはBSAのいずれかを、３
日の間隔で、１回の投与当り1mgずつ５回投与し、また
は未処理のまま保持した。その後、ラットを犠牲にし、
それらの脾臓と腸間膜リンパ節を取り除いた。LNCを収
集し、Con−Ａの存在下で48時間活性化した、リンパ芽
球を集めて、３回洗い、そして純粋な同系のラットに腹
膜内注射した。受容側ラットは、EAE誘導のために、４
時間後にMBP/CFAで免疫性テストした。疾患は、10日目
から毎日評点した（^＊結果は、統計学的に有意である,p
＜0.05）。

実施例11 EAEに対する抵抗を仲介するリンパ節細胞亜群の同定 MBP投与提供側ラットから得たCon−Ａ活性化脾臓細胞
（SPC）を、Ｔ細胞、ヘルパーＴリンパ球（CD4）または
サプレッサー／細胞障害性Ｔリンパ球（CD8）が喪失さ
れる前または後のどちらかに、純粋な同系ラットに移植
した。脾臓細胞からの、CD3、CD4、及びCD8群の喪失の
ために、負の選択を用いた。ペトリ皿を、一晩中４℃
で、PBS/PSA中の10mlの1/1000ヤギの抗マウスIgG＋IgM
抗体（Tago）でコートした。その後プレートを洗浄し、
PBS中の３％ウシ胎児血清を、20℃で30分間コートし、
再び洗浄した。ルイスLNCを、PBS中で1/100に希釈したC
D3（MRC,Ox/38）、CD4（W3/25）またはCD8（Ox/8）に対
するマウス抗ラットモノクローナル抗体（セロテック／
バイオプロダクト製）で染色した。細胞は、30分間氷上
で染色し、洗浄して、前コートしたペトリ皿に、15,00
0,000細胞/5mlPBS/プレート、４℃で播種した。非付着
細胞を含む上澄み液を、60分後緩やかに吸引し、細胞試
験と計数を行なう前に２回遠心した。この実験で、膜免
疫蛍光法の試験による蛍光標示式細胞分取機における試
験で、細胞群が約85−95％純度を生み出した。結果を表
８に示した。結果は、SPCは、EAEに対する移入阻害がで
きるが（50％発現）、一方、SPCを喪失したＴ細胞は、
受容側ラットを防御する能力を失うこと（グループ２）
を示している。したがって、移入阻害できる脾臓細胞
は、Ｔリンパ球であるように見える。しかし、CD8細胞
の喪失（グループ４）は、移入阻害につながらず、一
方、CD4＋を喪失したSPCは、EAEに対してラットを防御
するかなりの能力を示した。従って、MBPの経口投与後
に生成され、疾患誘起に対する抵抗を仲介する、抗原特
異性Ｔリンパ球が、サプレッサー／細胞障害性サブセッ
トであることは明かである。

提供側ラットは、MBPを投与され、表１の凡例に示し
たように処理した。Con−Ａ活性化SPCは、純粋な受容側
ラットに、ある亜群の喪失前（グループ１）、または後
（グループ２−４）に注射した。CD3,CD4,またはCD8リ
ンパ球の喪失は、モノクローナルIgGのSPCへのカップリ
ングとパニング（panning）によって行った。受容側ラ
ットは、MBP/CFAで免疫化し、EAEは10日から記録した
（＊結果は、統計的に有意義である、ｐ＜0.05）。

実施例12 MBP投与ラットからのリンパ節細胞による、インビトロ
での抗MBP−Ｔ細胞応答の抑制 ラットはMPB/CFAで免疫化し、それらの主要な膝窩排
出リンパ節（PLNC）を、９日後に取り出した。そのリン
パ節を、ステンレス・メッシュを圧通させることによ
り、単一細胞懸濁液を作製した。合計10⁵のLNCを、表示
した数の照射をした、あるいは投与ラットから導いた未
処理のLNCとともに、丸底96ウェルプレート（コースタ
ー）４つで培養した。MBPと結核菌の50μg/mlを、容積2
0μｌの培地に加えた。その培地は80時間培養し、培養
の最終16時間に１μCi［³H］TdR/wellで標識した。培地
は、自動細胞収集器で収集し、標準液体シンチレーショ
ン計数機で読み取った。

感作LNC（PLNC）の増殖の抑制比率は、次式によって
計算した。

PLNCは、照射SPC、または純粋なあるいはMBP投与ラッ
トからの腸間膜LNCとともに、MBPまたは結核菌存在下で
培養した。最後の投与後、異なった日に、MBP投与提供
側ラットから得られたLNCを試験した。結果を図５に示
した。実験の時間フレームとともに、投与ラットから得
られたLNCが、結核菌に応答するPLNCに影響しなくなっ
たことがわかる。しかし、投与ラットから得られたSPC
と腸間膜LNCの両方が、MBPに対するPLNC増殖を抑制でき
た。PLNC応答の抗原特異的抑制は、腸間膜LNCよりもSPC
を使用した方が大きかった。抑制は、最後のMBP投与後
５日から36日に明確に現れており、抑制の誘起は投与の
すぐ後に達成され、比較的長期にわたって維持されるこ
とを示している。

従って、EAE誘起に対する耐性を与えられたラットか
ら得られたLNCは、抗原特異的リンパ球であり、それ
は、投与に用いられた抗体にのみ対する細胞性免疫応答
を抑制することができる。

実施例13 MBP投与ラットから得られた、照射SPCとその亜群存在下
での、PINCの抗MBP応答の抑制 抑制に関与するSPCの亜群を試験するために、最終の
投与から20日後のMBP投与ラットから得たSPCを、あるリ
ンパ球群を喪失させ、照射し、MBP/CFA免疫化ラットか
らMBPとともに得られたPLNCと混合した。膝窩及び脾臓L
NCを、10⁷細胞/mlペトリ皿の濃度で、単独あるいは他の
標識したPNLCとともに照射（2000Reds）とし、播種し
た。培地は、増殖媒体中に、抗体（20μg/ml）とともに
又は抗体無しで、３日間恒温器内に維持し、その後取り
入れた。希釈された上澄み液は、IgG抗体のインビトロ
生成と分泌の試験に使用し、ELISA試験を用いて抗体生
成を測定した。微量滴定プレートは、２度蒸留水中で、
10μｇ抗体/mlの、0.1ml/ウェルで培養した。プレート
は、25℃で18時間培養した。PBS/トウィーン−20（バイ
オラド製）、pH7.5で３回洗浄の後、フレートを３％BSA
/PBSで２時間、37℃で培養し、２回洗浄の後、100μｌ
の希釈血清を４回加えた。プレートは、２時間、37℃で
培養した。PBS/トウィーン−20で３回リンスした後、１
％BSA/PBSで1:1000に希釈した過酸化物接合ヤギ抗ラッ
トIgG抗体（タゴ製,USA）の、100μl/ウェルで、１時間
25℃で培養した。発色反応は、30％のH₂O₂を含む、Ｄ−
フェニレンジアミン（0.4mg/mlリン酸クエン酸緩衝液、
pH5.0）に晒すことにより得た。その反応は、0.4NのH₂S
O₄を加えることにより停止させ、OD492nmをELISAリーダ
ーで読み取った。表９に示した結果は、MBP投与ラット
から得られたSPC存在下でのPLNCによる抗体増殖抑制の
比率を、未処理ラットから得たSPC存在下でのMBPに対す
るそれらの応答に比較して示している。MBP投与ラット
から得たSPC（グループ１）は、MBPに対するPLNCの応答
を抑制することを示している（70％）。Ｔ細胞の喪失
（グループ２）あるいはサプレッサー／細胞障害性Ｔリ
ンパ球の喪失（グループ３）は、抑制効果をなくしてい
る。しかし、ヘルパーＴリンパ球の喪失（CD4、グルー
プ４）は、PLNCの抗MBP増殖応答の阻害を促進してい
る。CD4喪失SPCを希釈することは、抑制を96％（1:1比
率）から18％（SPC:PLNCの比率が1:100）に減少させ
る。

これらの結果は、疾患抑制とインビトロの抗原特異的
細胞性応答の両方に関与する細胞がＴ細胞起源のもので
あり、それはサプレッサー／細胞障害性Ｔリンパ球であ
るということを示唆している。

MBP投与ルイスラットから脾臓を取り出した後、細胞
を取り出し、照射し、MBP/CFA免疫化同系ラットから取
り出したレスポンダーPLNCとともに播種した。SPCは、
未処理の細胞として、あるいは、カップリングやパニン
グに適当なモノクローナル抗体を用いてCD3,CD4またはC
D8喪失リンパ球として使用した。結果は、MBPに対するP
LNC応答抑制の比率で示し、それは、非投与ラットから
取り出した照射SPCの存在下でのPLNC応答に対する相対
値である。

実施例14 MBPに対する経口耐性に誘起された抗MBPのIgG生成の体
液抑制 ルイスラットを、MBPを投与または未処理のままにし
た後、CFA中で乳化したオボアルブミン（OVA）に混合し
たMBPで攻撃した。ラットは種々の時間間隔で出血さ
せ、血清をOVAまたは抗MBP抗体で試験した。図6Aに示す
ように、OVAに対するIgG血清レベルは、MBP投与ラット
では影響されないが、一方、MBP投与ラットにおけるMBP
に対するIgG血清レベルは減少した（6b）。

実施例15 インビトロでのIgG生成抑制に関与する細胞型の同定 ルイスラットを、MBPを投与または未処理のままにし
た後、MBP＋OVA/CFAで免疫化した。PLNを12日後に取り
出し、そのPLNをMBPまたはOVA存在下で３日間培養し
た。その上澄み液を回収し、1:20に希釈してIgG含有量
を測定した。表10に示したように、投与ラットから得た
PLNC（グループ２）で、インビトロでMBPとともに培養
したものは、MBPに対するIgG生成という面では、未処理
ラットから得たPLNC（グループ１、45％抑制）に比較し
て、応答が劣っている。同じラットから得たPLNCにおけ
る抗OVA IgGの産生は、影響を受けない（グループ４対
５）。さらに、MBP投与され、免疫化されたラットから
得た照射PLNCと、MBPとともに培養された免疫化ラット
のPLNC混合は、後に抗体生成を減少させるが（グループ
３、35％抑制）、一方、OVAに対する抗体力価は影響さ
れない（グループ６）。さらに、CD8＋細胞を取り除く
ことは、抗MBP体の抑制をなくし、CD8＋細胞が、養子移
入や増殖応答のようなかたちで、抑制に関与しているこ
とを示している。

ラットは、MBP＋OVAとCFAで免疫化した（MBPの５回目
の投与後数３日）。12日後、それらのPLNCを取り出し、
MBP（グループ１−４）またはOVA（グループ５−７）と
ともに、３日間培養した。いくつかのグループでは、MB
P投与し、照射したラットから得た照射PLNCを、照射
し、免疫化したPLNCとともに、MBP存在下（グループ
３）またはOVA存在下（グループ７）で培養した。これ
らの刺激物の上澄み液を回収し、希釈して、ELISAによ
りIgGレベルを同定した。

実施例15 MBPのペプチドの、重複合成を用いた、EAEを効果的に抑
制するMBP領域の同定 モルモットのミエリン塩基性タンパク質のアミノ酸１
−37断片の重複断片を、固相ペプチド技術を用いて合成
した。Houghten,R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,5131−
5134（1985）。これらの断片の、15gの全ミエリン塩基
性タンパク質と同当量を経口投与した。それらは、免疫
化の７日、５日及び２日前に投与した。動物は、フロイ
ントアジュバント塩基性タンパク質で、確立された方法
に従って攻撃し、記録した。

動物の、死亡率、疾患の有無、疾患の重篤度について
記録した。表11に示すように、6/6の対照動物は、死亡
率3/6の病気になった。重複ペプチド断片を受けた動物
においては、断片１−10を除く全ての断片で、死亡率が
低下した。疾病の重篤度の面から見た場合、アミノ酸５
−20の間の分子領域が、疾病の最も顕著な減少を示し
た。これらの結果は、それ自体がサプレッソゲニック断
片であるアミノ酸領域１−37において、分子に特異的な
領域は、経口投与した際、その抑制が大きくまたは小さ
くなることを示している。

モルモットのミエリン塩基性タンパク質の１−37領域
の重複断片を、固相ペプチド技術を用いて合成した。こ
れらの断片は、15mgの全ミエリン塩基性タンパク質と同
モル濃度で、経口投与した。それらは、免疫化の７日、
５日、及び２日前に投与した。動物は、フロイントアジ
ュンバンド塩基性タンパク質で、確立された方法に従っ
て攻撃し、記録した。

実施例16 タンパク質質抗原投与の経口経路が、免疫応答がある断
片を決定することの説明 足においてフロイントアジュバントで免疫化された動
物、または、経口投与された動物に、全ミエリン塩基性
タンパク質を与えた。その後７日から10日後に、脾臓及
びリンパ節細胞を取り出し、インビトロで、塩基性タン
パク質分子の異なった断片で再刺激した。

表12に示すように、ミエリン塩基性タンパク質を、フ
ロイントアジュバント中で、末端投与した場合、主要な
応答は、増殖によって測られるように、44−89の起脳炎
領域に対してである。しかし、表13に見られるように、
経口投与した場合、主要な応答は、非起脳炎抑制剤決定
因子である断片１−37に対してである。

表12 全MBPで免疫化されたLewisラットにおけるMBP断片に対
する増殖 １分当りの計数 刺激指標 バックグラウンド 3,292 −− 全MBP 10,142 3.1 MBP断片１−37 3,360 1.0 MBP断片44−89 10,054 3.0 動物は、後ろ足において、CFA中の50μｇのMBPで免疫
化した。10日後、リンパ節細胞を取り出し、インビトロ
で、10μｇのMBPまたは同モル量のMBP断片で刺激した。

表13 MBPを経口投与したルイスラットにおけるMBP断片に対す
る増殖 LNCの起源 全MBP １−37 44−89 SPC 5.10±1.6 5.05±1.8 2.41±0.9 腸間膜LNC 8.61±1.9 9.88±1.5 3.53±0.8 頚部 4.58±1.3 6.42±0.9 2.51±0.6 動物は、1mgの全MBPを３回投与し、投与から15日に種
々の器官から細胞を取り出し、増殖を測定した。結果
は、単独で培養した細胞との比較で、cpm×10^-3の変化
として表した。

実施例17 アジュバント関節炎に対する結核菌またはタイプIIコラ
ーゲン投与の効果 アジュバント関節炎（AA）は結核菌（MT）を含むCFA
によって誘発されるので、この問題に関する研究はま
ず、種々な投与量のMTを動物に投与することから始め
た。しかし、３μｇ、30μｇ、300μｇ、又は3mgのMTを
免疫化に先立つ−7,−5,および−２日に投与するという
広範な投与範囲にわたって、関節炎脚の出現率、発病
日、または最大関節炎評点によって測定するとき、予期
に反して疾患の抑制は全く観察されなかった。動物を３
μｇで前処理したときの代表的なデータを図7Aに示す。

AAを保有するラットにおけるコラーゲンに対する自己
免疫性発現についての研究報告（Trentham,D.E.、J.Cli
n.Invest.66、1109（1980））に基づいて、AAに対する
タイプIIコラーゲンの経口投与の効果を試験した。図7B
および表14に示すように、C IIを前投与したラットは、
その最も著しい効果がC IIの３μｇまたは30μｇ投与群
に見られるように、投与量に依存してAAを著しく抑制し
た。ときには、300μｇにおいても抑制が見られた。３
μｇまたは30μｇを投与した動物においては、関節炎脚
の発生率が減少し、また、最大関節炎評点により測定す
るとき、症状が緩和された。さらに、３μｇのC IIを投
与した動物では、発病日も遅延された。C IIの経口投与
が実験的な自己免疫疾患に対する非選択的抑制効果をも
つかどうかを測定するために、全く同一の投与範囲のC
IIを、CFA中のミエリン塩基性タンパク質で免疫化した
動物に投与し、実験的な自己免疫性脳脊髄炎（EAE）を
誘発させた（Higgins,P.J.、J.Immunol.140、440（198
8））。C IIを投与した後、EAEの発現には全く効果がな
いことが観察された。

ルイスラットに、バッファ液（対照グループ）か、も
しくは種々な投与量のC IIのいずれかを投与した。投与
は、−７、−５、および−２日目に３回行った。そし
て、０日に、アジュバント関節炎を誘発させるために、
1mgのMTを含むCFAを尾の基部に皮下注射した。関節炎
は、12日目から31日目まで、２〜３日毎に評定した。ｐ
−値は、対照グループ（PBS投与）に対するC II投与グ
ループを表す。ns＝重大でない。^a p＜0.001対 対照^b p＜0.05 対 対照^c p＜0.01 対 対照 実施例18 タイプIIコラーゲンとMTの経口投与後の遅延型感作性反
応 C IIとMTとの双方に対する免疫性がAAに現れることが
報告されている（Trenthham,D.E.、J.Clin.Invest.66、
1109（1980））。DTH（遅延型過感作性）反応は、イン
ビボにおいて、MTとC IIとの双方に反応性のＴ細胞にC
IIを供給するときの効果を測定して行った。図8Aに示す
ように、CAで免疫化された動物は、C IIに対してDTHを
現すが、ただし、MTに対するDTHほど顕著ではない（図8
B）。さらに、C IIの経口投与は、AAを保有する動物に
おけるC IIに対するDTH反応を減少させる一方、MTに対
するDTH反応には何ら効果がない。C IIによってDTHを抑
制する投与量の応答範囲は、C IIによって疾患を抑制す
る場合と同一である。即ち、最も顕著な抑制は、３μｇ
ないし30μｇでみられる。注目すべきことに、引き続く
免疫化を行わずに３μｇだけを投与した動物には、C II
に対する感作性がまったくない。次に、抗体を経口投与
した後の、MTに対する細胞性免疫反応の抑制を試験し
た。図９に示すように、３μｇないし30μｇのMTを投与
した動物において、MTに対する増殖的な反応は抑えられ
ている。同様な抑制作用は、DTH反応による測定の際に
も認められた。

実施例18 経口的にC II耐性化されたラットからのＴ細胞の養子移
入により、アジュバント関節炎が抑制される。

既に述べたように、ミエリン塩基性タンパク質の経口
投与に伴うEAEの抑制は、投与動物からの脾臓Ｔ細胞に
よって養子移入させることができる（Lider,O、J.Immun
ol.142、748−752（1989））。そして、同様な結果は、
自己免疫性ブドウ膜炎モデルにおいても得られている。
表15に示すように、AAに対する保護作用は、C IIに経口
的に耐性化されたラットから得られた脾臓Ｔ細胞によっ
て、無感染ラットに養子移入された。−２日目に脾臓細
胞が移入されたとき、またＢ細胞に対して脾臓Ｔ細胞が
移入されたとき、保護作用はさらに顕著になった。

ルイスラットに、種々な投与量のC IまたはC IIIを投
与した。投与は、−７、−５、および−２日目に３回行
った（対照動物はバッファのみを投与）。ｐ−値は対照
グループに対する投与グループを表す。ns＝重大でな
い。^a p＜0.01 対 対照^b p＜0.04 対 対照^c p＜0.001 対 対照 実施例19 発病後のC IIの経口投与によるAAの抑制 C IIの投与が、すでに発現したAAを改善し得るかどう
かを測定するために、動物に、発病後にC IIを投与し
た。CFAで疾患を誘発した後、13〜14日目に、関節炎の
初兆が現れた。17日目に動物を、疾患の重篤度を揃えて
２グループに分けた。対照グループを無処置のまま残
し、一方、処置グループには、１日おきに週３回、３μ
ｇのC IIを経口投与した。両グループの動物について、
34日目まで関節炎の評定を行った。図10に示すように、
C IIで処置された動物は関節炎が緩和され、対照グルー
プより速やかに快復した。

実施例20 AAに対する非軟骨質コラーゲンの投与効果 C IIの分子構造が、他のコラーゲン、例えばタイプＩ
（C I）やタイプIII（C III）コラーゲンにきわめて近
似しているとはいえ、これらのコラーゲン類の分布は全
く異なっている（Seyer,J.M.,ほか,In:Text Book of Rh
eumatorogy,第３版，（Kelly,ほか，編），第22頁，サ
ウンダース，フィラデルフィア（1989））。C IIは通
常、関節の軟骨部に存在するのに対して、タイプＩおよ
びタイプIIIコラーゲンは主として骨、皮膚、および他
の軟組織中に見いだされる。表16に示すように、C Iの
経口投与は、関節炎脚の発生率および症状の重篤度によ
って測定するとき、C IIと同じ投与範囲でAAを抑制する
ことがわかった。C IIIを投与した動物については、発
病日の遅延は認められたが、症状の重篤度に関しては何
等の効果も認められなかった。無関係なタンパク質抗
体、ミエリン塩基性タンパク質の経口投与は、AAを抑制
しなかった。

提供体ルイスラットは、無投与、または３μｇのC II
を２〜３日間隔で３回、前投与した。最終投与後７日目
に脾臓を取り出し、１×10⁸の脾臓細胞またはナイロン
ウール分離のＢ細胞（付着性）またはＴ細胞（非付着
性）を、i.p.注射によって、直ちに、または養子移入の
２日後にAA誘発された各受容体に移入した。^a p＜0.05 ,2グループ 対 １グループ^b p＜0.001,4グループ 対 ３グループ^c p＜0.01 ,4グループ 対 ３グループ^d p＜0.05 ,3グループ 対 １グループ リンパ球の増殖および上記のDTH実験は、MTの経口投
与が、臨床的な疾患を阻止せずに、MTに対する細胞性免
疫反応を抑制したことを示した。それにもかかわらず、
MTに対する細胞性免疫性は、経口耐性によって根底から
抑制されることはなく、MT免疫性をより効果的に抑制す
るような食餌療法が疾患を抑制すると思われる。この観
点からは、AAの抑制に対する油脂中65kd HSPの投与に
よる効果（BIllingham,M.E.J.,ほか,J.Exp.Med.171、33
9（1990））、またはMTの皮下または静脈内投与による
効果（Larsson,P.,ほか,J.Cell.Biochemistry、40、49
（1989）;Gery,I.,ほか,Int.Arch.Allergy、31、57（19
67））、が報告されている。

C IIの経口投与によるAAの抑制は、C IIに対する病理
学的な免疫生がAA中に現れるか、またはMTとC IIとの間
に交差反応エピトープがあるか、いずれかであることを
示唆している。注目すべきことに、C II T細胞系統がＴ
細胞接種によってAAの改善に少し効果があり（Holoshit
z,J.,ほか,Science、219、56（1983））、また65kg HS
PによってCIAの僅かな抑制が認められた（Billingham,
M.E.J.,ほか,J.Exp.Med.171、339（1990））ことが報告
されている。ある研究者は、C IIの静脈内投与によるAA
の抑制を報告している（Phadke,K.,ほか,Arthritis Rh
eum.27、797（1984）とはいえ、これは常にみられるも
のではない（Cremer,M.A.,ほか,J.Immunol.131:2995（1
983））。本発明者らの研究は、他の研究者がC IIのi.
v.投与によるAAの抑制効果を明示することができなかっ
た（Cremer,M.A.,ほか,J.Immunol.131、2995（1983））
わけは、あまりに大量の投与量、即ち、Img、を用いた
ことと関係しているであろうことを示唆している。予備
的な実験において、MTとC IIとの間のある主の交差反応
性が増殖試験によって見いだされているとはいえ、C II
の経口投与によるAAの抑制作用がMTとC IIとの間の交差
反応に係わっているかどうかはまだ確認されていない。
チキンタイプIIコラーゲンとMTの65kd衝撃タンパク質の
ペプチド180−188との間のアミノ酸配列の相同性は見い
だされていない。この相同性は、ラットにおける関節炎
を仲介するクローンをシミュレートするものと報告され
ている（van Eden.W.,ほか,Nature、331、171（198
8））。最近、C IIからの26−アミノ酸配列がコラーゲ
ン誘発関節炎を抑制すると報告された（Myers,L.K.,ほ
か,J.Exp.Med.170、1999（1989））。しかし、このペプ
チドと65kdペプチドとの間には相同配列は存在しない。
MTとC IIとの双方の大きさに対応して、容易には同定で
きない交差反応エピトープが存在することは確かであろ
う。あるいはまた、MTが、C IIに対する病理学的免疫応
答に導く連鎖欠損を誘発するのかもしれない。

抗体の経口投与の後で実際の抑制効果が発現すること
（Ngan,J.,ほか,J.Immunol.120、861（1978）;Mattingl
y,J.A.,ほか,J.Immunol.125、1044（1980）;Mattingly,
J,A.,Cell.Immunol.86、46（1984）;Zhang,Z.,ほか,Cel
l.Immunol.104、426（1987）、および経口的に耐性化さ
れた動物からのCD8⁺T細胞の養子移入によってEAEが抑制
できること（Lider,O.,ほか,J.Immunol.142、748−752
（1989））は、すでに報告されている。

実施例21 多発性硬化症患者の治療 治療に用いた薬剤は、マサチュセッツ州ボストンのバ
イオピュア社製のウシ・ミエリンエキストラクトであ
る。ウシ・ミエリンは動物に投与するとき無毒性であ
り、慢性再発性EAEの改善に有効である。バイオピュア
社のウシ・ミエリンは、ショ糖傾斜上でシャープレス遠
心分離器による密度遠心分離を経て調製され、SDSペー
ジ電気泳動によって分析されたものである。このミエリ
ンは、マサチュセッツ州の地区屠殺場から得たウシ脳か
ら抽出したもので、純度が試験され、また、調製単位毎
に、寒天ゲル電気泳動、タンパク質測定、脂質分析、ア
ミノ酸測定、および免疫学的反応性について標準化され
ている。これはまた、細菌およびウイルスの存在につい
ても試験されている。

このミエリンは、100mgカプセルとして、多発性硬化
症の患者に、１日３回、総投与量が600mg/日となるよう
に投与する。

実施例22 自己免疫性関節炎患者の治療 治療に用いたタイプIIコラーゲンは、マサチュセッツ
州ボストンのジェンザイムコーポレーションから得られ
たC II製剤（可溶性チキンタイプIIコラーゲン）であ
る。この製剤はアジュバント関節炎の改善に有効であ
る。

このC IIは、自己免疫性関節炎の患者に、１日10μｇ
ないし100mgの投与量で経口投与する。C IIは乾燥形態
でまたは液体に溶かして（そして増量して）、患者が耐
性を獲得し得る量が投与される。好ましい実施例では、
１日あたり100μｇから30mgまでの総投与量が投与され
る。この投与量は、１日あたりの総投与量を患者に与え
ることができるように数回に分けて投与してもよい。好
ましい実施例では、１日あたりの投与回数は３回であ
る。

ここに引用した全ての文献は、参考までに掲げたにす
ぎない。ここに述べた本発明は、広くかつ同等な条件、
パラメータその他の範囲内で、本発明またはその実施例
の発想または観点を損なうことなく実施し得るものと理
解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ ｇｙ，Ｖｏｌ．75，Ｎｏ．２（1983）, ＰＰ．378−382 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．83（1986），Ｐ Ｐ．7443−7446

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】タイプＩ、タイプII、またはタイプIIIコ
   ラーゲンを活性成分として有効量含み、経口または経腸
   で投与されることを特徴とするリューマチ性関節炎の治
   療薬。
2. 【請求項２】前記有効量が、ヒトに対する、タイプＩ、
   タイプII、またはタイプIIIコラーゲンの１日当たりの
   投与量を、10μｇから100mgの範囲とする量であること
   を特徴とする請求項１記載の治療薬。
3. 【請求項３】前記有効量が、ヒトに対する、タイプＩ、
   タイプII、またはタイプIIIコラーゲンの１日当りの投
   与量を、10μｇから30mgの範囲とする量であることを特
   徴とする請求項２記載の治療薬。