KR101455479B1 - 베타 아밀로이드 펩티드를 인식하는 인간화된 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 환자의 뇌에서 Aβ의 아밀로이드 침전물과 관련된 질병의 치료를 위한 개선된 제제 및 방법을 제공한다. 바람직한 제제는 항체, 예, 인간화된 항체를 포함한다.

Description

베타 아밀로이드 펩티드를 인식하는 인간화된 항체{HUMANIZED ANTIBODIES THAT RECOGNIZE BETA AMYLOID PEPTIDE}

본 출원은 "베타 아밀로이드 펩티드를 인식하는 인간화된 항체"라는 제목의 선출원된 미국 특허출원 제 60/474,654호(2003년 5월 30일에 출원)의 이익을 주장한다. 상기 출원의 전체 내용은 참고로 본원에 통합된다.

알츠하이머 병(AD)은 노인 치매를 야기하는 진행성 질병이다. 일반적으로, Selkoe, TINS 16: 403(1993) ; Hardy et al., WO 92/13069호; Selkoe, J.Neuropathol. Exp.Neurol. 53 :438 (1994); Duff et al., Nature 373: 476 (1995); Games et al., Nature 373: 523 (1995)를 참고한다. 넓게 말하면, 이 질병은 두 부류로 나뉜다: 노령(65세 이상)에 발생하는 후기 발병, 및 노년기 이전, 즉 35세 내지 60세 사이에 발생하는 조기 발병. 두 타입에서, 병리학은 동일하지만 젊은 나이에 시작되는 경우에 이상이 더 심각하고 광범위한 경향이 있다. 이 질병은 뇌에서 적어도 두 가지 타입의 병변, 즉 신경섬유매듭 및 노인 플라크를 특징으로 한다. 신경섬유매듭은 쌍으로 서로 꼬인 두 필라멘트로 구성된 미세관 연합된 타우 단백질의 세포내 침착물이다. 노인 플라크(즉, 아밀로이드 플라크)는 뇌 조직의 단면의 현미경 분석에 의해 보이는, 중앙의 세포외 아밀로이드 침착물이 교차하는 최대 150 ㎛의 탈조직화된 신경망 영역이다. 뇌내의 아밀로이드 플라크의 축적은 또한 다운 증후군 및 다른 인지 장애와 관련된다.

플라크의 주요 구성원은 Aβ 또는 β-아밀로이드 펩티드로 불리는 펩티드이다. Aβ 펩티드는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로 불리는 더 큰 경막 당단백질 명명된 단백질의 39-43 아미노산의 4-kDa 내부 단편이다. 상이한 세크레타제 효소에 의한 APP의 단백질분해 프로세싱 결과, Aβ는 40 아미노산 길이의 짧은 형태와 42-43 아미노산 길이의 긴 형태 두 가지로 주로 발견된다. APP의 소수성 경막 도메인의 일부는 Aβ의 카르복시 말단에서 발견되며, 특히 긴 형태의 경우 Aβ가 플라크로 응집되는 능력을 설명할 수 있다. 뇌에서 아밀로이드 플라크의 축적은 궁극적으로는 신경 세포 사멸로 이끈다. 이러한 타입의 신경 황폐와 관련된 물리적 증상들이 알츠하이머 병을 특징짓는다.

APP 단백질내의 몇 가지 돌연변이들이 알츠하이머 병의 존재와 상관되어졌다. 예를 들어, Goate et al., Nature 349: 704 (1991)(발린⁷¹⁷ 이 이소루이신으로); Chartier Harlan et al. Nature 353: 844 (1991)(발린^7l7 이 글리신으로); Murrell et al., Science 254: 97 (1991)(발린⁷¹⁷ 이 페닐알라닌으로) ; Mullan et al., Nature Genet. 1: 345 (1992) (라이신⁵⁹⁵-메티오닌⁵⁹⁶ 을 아스파라긴⁵⁹⁵-루이신⁵⁹⁶으로 변화시키는 이중 돌연변이)를 참고한다. 그러한 돌연변이는 APP의 Aβ로의 프로세싱의 증가 또는 변화, 특히 APP의 증가된 양의 긴 형태의 Aβ(즉, Aβ1-42 및 Aβ1-43)로의 프로세싱에 의해 알츠하이머 병을 야기하는 것으로 생각된다. 프리세닐린 유전자 PS1 및 PS2와 같은 다른 유전자에서의 돌연변이는 APP의 프로세싱에 간접적으로 영향을 미쳐 긴 형태 Aβ 양을 증가시키는 것으로 생각된다(Hardy, TINS 20: 154(1997) 참고).

마우스 모델은 알츠하이머에서 아밀로이드 플라크의 중요성을 결정하는 데 있어 성공적으로 이용되었다(Games et al., supra, Johnson-Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1550 (1997)). 특히, (인간 APP의 돌연변이 형태를 발현하며 어린 나이에 알츠하이머 병을 일으키는) PDAPP 형질전환 마우스에 긴 형태의 Aβ를 주사할 경우, 이들은 알츠하이머 진행 및 Aβ 펩티드에 대한 항체 역가의 증가 둘다에서의 감소를 나타낸다(Schenk et al., Nature 400,173 (1999)). 전술한 관찰은 Aβ, 특히 긴 형태가 알츠하이머 병에서 원인 인자임을 나타낸다.

따라서, 알츠하이머 병의 치료를 위한 새로운 치료 및 시약, 특히 생리학적(예, 비독성) 투여량에서 치료 효과를 나타낼 수 있는 치료 및 시약이 필요하다.

발명의 개요

본 발명은 아밀로이드원성 질병(예, 알츠하이머 병)의 예방 및 치료를 위한 새로운 면역 시약, 특히 치료 항체 시약을 특징으로 한다. 본 발명은 적어도 부분적으로, Aβ 펩티드에 특이적으로 결합하며 아밀로이드원성 장애와 관련된 플라크 부담을 감소시키는 데 효과적인 모노클로날 항체 12A11의 확인 및 특성규명에 기초한다. 이 항체의 구조 및 기능 분석 결과, 예방 및/또는 치료 용도를 위한 다양한 인간화된 항체가 고안된다. 구체적으로, 본 발명은 이 항체의 가변 영역의 인간화를 특징으로 하며, 따라서 인간화된 면역글로불린 또는 항체 쇄, 본래의 인간화된 면역글로불린 또는 항체, 및 특징 항체의 기능성 면역글로불린 또는 항체 단편, 구체적으로, 항원 결합 단편을 제공한다.

특징 모노클로날 항체의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 폴리펩티드가 또한 개시되며, 상기 폴리펩티드를 암호하는 데 적합한 폴리뉴클레오티드 시약, 벡터 및 숙주 세포가 개시된다.

아밀로이드원성 질병 또는 장애(예, 알츠하이머 병)를 치료하는 방법이 개시되며, 그러한 용례에 사용하기 위한 약학 조성물 및 키트가 개시된다.

적절한 면역 기능에 중요한 특징 모노클로날 항체내의 잔기의 확인 방법 및 치료 시약으로 사용될 때, 개선된 결합 친화성 및/또는 감소된 면역원성을 갖는 인간화된 항체의 고안에서 치환될 수 있는 잔기를 확인하는 방법 또한 특징이다.

변형된 효과인자 기능을 갖는 항체(예, 인간화된 항체), 및 그 치료 용도 또한 특징이다.

본 발명은 알츠하이머 병 또는 다른 아밀로이드원성 질병을 예방하거나 치료하기 위한 새로운 면역학적 시약 및 방법을 특징으로 한다. 본 발명은 적어도 부분적으로, 베타 아밀로이드 단백질(Aβ)에 결합하거나(예, 가용성 및/또는 응집된 Aβ에 결합), (예를 들어 응집된 Aβ의) 식균작용을 매개하거나, 플라크 부담을 감소시키고/시키거나 (예를 들어 환자에서) 신경염 이상증을 감소시키는 데 효과적인 모노클로날 면역글로불린 12A11의 특성규명에 기초한다. 본 발명은 추가로 12A11 면역글로불린의 가변 경쇄 및 중쇄의 일차 및 이차 구조의 결정 및 구조적 특성규명 및 활성 및 면역원성에 중요한 잔기의 확인에 추가로 기초한다.

여기서 개시된 12A11 모노클로날 면역글로불린의 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄를 포함하는 면역글로불린을 특징으로 한다. 인간화된 가변 경쇄 및/또는 인간화된 가변 중쇄를 포함하는 바람직한 면역글로불린, 예, 치료성 면역글로불린이 특징이다. 바람직한 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄는 12A11 면역글로불린(예, 공여체 면역글로불린)으로부터의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 어셉터 면역글로불린으로부터의 또는 실질적으로 그로부터의 가변 골격 영역을 포함한다. "실질적으로 인간 어셉터 면역글로불린으로부터"는 대다수 또는 핵심 골격 잔기가 인간 어셉터 서열로부터 유래하지만 일부 위치의 잔기가 인간화된 면역글로불린의 활성을 개선(예, 활성을 변화시켜 공여체 면역글로불린의 활성을 더 모방함)하도록 선택되거나 또는 인간화된 면역글로불린의 면역원성을 감소시키도록 선택된 잔기로 치환되도록 함을 의미한다.

한 구체예에서, 본 발명은 12A11 가변 영역 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하며(즉, 서열 번호 2에 개시된 경쇄 가변 영역 서열로부터의 1,2, 또는 3 CDR을 포함하거나 또는 서열 번호 4에 개시된 중쇄 가변 영역 서열로부터의 1,2, 또는 3 CDR을 포함), 인간 어셉터 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 서열로부터의 가변 골격 영역을 포함하며 골격 잔기 중 적어도 하나의 잔기가 선택적으로 상응하는 쥐 잔기로 역돌연변이되며, 이때 상기 역돌연변이는 상기 쇄가 Aβ 결합을 지시하는 능력에 크게 영향을 미치지 않는 인간화된 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄를 특징으로 한다.

한 구체예에서, 본 발명은 12A11 가변 영역 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하며(즉, 서열 번호 2에 개시된 경쇄 가변 영역 서열로부터의 1,2, 또는 3 CDR을 포함하거나 또는 서열 번호 4에 개시된 중쇄 가변 영역 서열로부터의 1,2, 또는 3 CDR을 포함), 실질적으로 인간 어셉터 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 서열로부터의 가변 골격 영역을 포함하며 골격 잔기 중 적어도 하나의 잔기가 선택적으로 상응하는 쥐 잔기로 역돌연변이되며, 이때 상기 역돌연변이는 상기 쇄가 Aβ 결합을 지시하는 능력에 크게 영향을 미치지 않는 인간화된 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄를 특징으로 한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 12A11 가변 영역 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하며(예, 서열 번호 2에 개시된 경쇄 가변 영역 서열로부터의 1,2, 또는 3 CDR을 포함하고/하거나 서열 번호 4에 개시된 중쇄 가변 영역 서열로부터의 1,2, 또는 3 CDR을 포함), 실질적으로 인간 어셉터 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 서열로부터의 가변 골격 영역을 포함하며 선택적으로 마우스 12A11 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 서열로부터의 상응하는 아미노산 잔기로 치환된 골격 잔기 하나 이상을 가지는 인간화된 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄를 특징으로 하며, 이때 상기 골격 잔기는 (a) 항원에 직접적으로 비공유적으로 결합하는 잔기; (b) CDR에 인접한 잔기; (c) CDR-상호작용 잔기(예, 상동성의 공지의 면역글로불린 쇄의 해명된 구조에서 경쇄 또는 중쇄를 모델링하여 확인됨); 및 (d) VL-VH 계면에 참여하는 잔기 로 구성되는 군으로부터 선택된다.

다른 구체예에서, 본 발명은 12A11 가변 영역 CDR 및 인간 어셉터 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 서열로부터의 가변 골격 영역을 포함하며, 선택적으로 마우스 12A11 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 서열로부터의 상응하는 아미노산 잔기로 치환된 골격 잔기 하나 이상을 가지는 인간화된 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄를 특징으로 하며, 이때 상기 골격 잔기는 가변 영역의 3차원 모델의 분석에 의해 확인할 때 경쇄 가변 영역 형태 또는 기능에 영향을 줄 수 있는 잔기, 예를 들어, 항원과 상호작용할 수 있는 잔기, 항원 결합 부위에 이웃한 잔기, CDR과 상호작용할 수 있는 잔기, CDR에 인접한 잔기, CDR 잔기의 6Å 이내의 잔기, 공인 잔기, 베르니에 구역 잔기, 쇄간 패킹 잔기, 특이 잔기, 또는 구조적 모델의 표면상의 당화 부위 잔기이다.

다른 구체예에서, 본 발명은 전술한 치환에 더하여, 적어도 하나의 희귀 인간 골격 잔기의 치환을 특징으로 한다. 예를 들어, 희귀 잔기는 그 위치에서 인간 가변 쇄 서열에 일반적인 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 다르게는, 희귀 잔기는 상동성 생식세포 가변 쇄 서열로부터의 상응하는 아미노산 잔기로 치환될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 전술한 경쇄 및 중쇄를 포함하는 인간화된 면역글로불린, 또는 상기 면역글로불린의 항원 결합 단편을 특징으로 한다. 예시적인 구체예에서, 인간화된 면역글로불린은 적어도 10⁷ M^-1,10⁸ M^-1, 또는 10⁹M^-l의 결합 친화성으로 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ)에 결합한다(예, 특이적으로 결합한다). 다른 구체예에서, 면역글로불린 또는 항원 결합 단편은 아이소타입 γ1을 갖는 중쇄를 포함한다. 다른 구체예에서, 면역글로불린 또는 항원 결합 단편은 가용성 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ) 및 응집된 Aβ 중 어느 하나 또는 둘다에 결합(예, 특이적으로 결합)한다. 다른 구체예에서, 면역글로불린 또는 항원 결합 단편은 가용성 Aβ(예, 가용성 Aβ1-42)를 포획한다. 다른 구체예에서, 면역글로불린 또는 항원 결합 단편은 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ)의 식균 작용을 매개(예, 식균 작용을 유도)한다. 다른 구체예에서, 면역글로불린 또는 항원 결합 단편은 개체에서 혈액-뇌 장벽을 가로지른다. 또 다른 구체예에서, 면역글로불린 또는 항원 결합 단편은 개체에서 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ) 부담 및 신경염 이상증 중 어느 하나 또는 둘다를 감소시킨다.

다른 구체예에서, 본 발명은 12A11 가변 영역(예, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 개시된 가변 영역 서열)을 포함하는 키메라 면역글로불린을 특징으로 한다. 또 다른 구체예에서, 면역글로불린 또는 그 항원-결합 단편은 추가로 IgG1으로부터의 불변 영역을 포함한다.

여기서 개시된 면역글로불린은 아밀로이드원성 질병을 예방하거나 치료하는 것을 목적으로 하는 치료적 방법에 사용하기에 특히 적합하다. 한 구체예에서, 본 발명은 여기서 개시된 인간화된 면역글로불린의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 아밀로이드원성 질병(예, 알츠하이머 병)을 예방하거나 치료하는 방법을 특징으로 한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 여기서 개시된 인간화된 면역글로불린 및 약학적 담체를 포함하는 약학 조성물을 특징으로 한다. 여기서 개시된 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편 또는 쇄를 생산하기 위한 분리된 핵산 분자, 벡터 및 숙주 세포, 및 상기 면역글로불린, 면역글로불린 단편 또는 면역글로불린 쇄를 생산하는 방법 또한 특징이다.

본 발명은 인간화된 12A11 면역글로불린을 생산할 때 치환이 일어날 수 있는 12A11 잔기를 확인하는 방법을 특징으로 한다. 예를 들어, 치환될 수 있는 가변 골격 영역 잔기를 확인하는 방법은 해명된 상동성 면역글로불린 구조상의 12A11 가변 영역의 3차원 구조를 모델링하고, 12A11 면역글로불린 가변 영역 형태 또는 기능에 영향을 줄 수 있는 잔기를 위해 상기 모델을 분석하여, 치환될 수 있는 잔기를 확인하는 것에 관련된다. 본 발명은 추가로 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 개시된 가변 영역 서열 또는 임의의 그 일부를 12A11 면역글로불린, 12A11 면역글로불린 쇄, 또는 그 도메인의 3차원 영상을 생성하는 데 이용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 예를 들어, 보체 또는 효과인자 세포상의 어셉터와 같은 효과 인자 분자에 결합하는 능력과 같은, 효과 인자 기능의 변화를 갖는 면역글로불린을 특징으로 한다. 구체적으로, 본 발명의 면역글로불린은 변화된 불변 영역, 예, Fc 영역을 가지며, 이때 Fc 영역의 아미노산 잔기 적어도 하나는 다른 잔기 또는 측쇄로 치환되었다. 한 구체예에서, 변형된 면역글로불린은 IgG 부류이며, Fc 영역에서 적어도 하나의 아미노산 잔기 치환을 포함하여 면역글로불린은 예를 들어 변화되지 않은 면역글로불린과 비교할때 변화된 효과인자 기능을 갖는다. 특정 구체예에서, 본 발명의 면역글로불린은 변화된 효과인자 기능을 가져 덜 면역원성이며(예, 원치않는 효과인자 세포 활성, 용혈, 또는 보체 결합을 야기하지 않는다), 개선된 아밀로이드 소거 특성을 가지며, 및/또는 원하는 반감기를 갖는다.

본 발명을 설명하기 앞서, 이하에서 사용될 일부 용어의 정의를 개시하는 것이 이해에 도움이 될 수 있다.

용어 "면역글로불린" 또는 "항체"(여기서 상호교환적으로 이용됨)는 2 중쇄 및 2 경쇄로 구성된 기본적인 4-폴리펩티드 쇄 구조를 갖는 단백질을 말하며, 상기 쇄들은 예를 들어 쇄간 이황화 결합에 의해 안정화되며 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다. 용어 "단일-쇄 면역글로불린" 또는 "단일-쇄 항체"(여기서 상호교환적으로 사용)는 중쇄 및 경쇄로 구성되는 2-폴리펩티드 쇄 구조를 갖는 단백질을 말하며, 상기 쇄는 예를 들어 쇄간 펩티드 링커에 의해 안정화되며, 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다. 용어 "도메인"은 예를 들어, β-플리티드(pleated) 시트 및/또는 쇄내 이황화 결합에 의해 안정화된 펩티드 루프를 포함하는(예, 3 내지 4 펩티드 루프를 포함) 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드의 구형 영역을 의미한다. 도메인은 "불변" 도메인의 경우에는 다양한 부류 구성원의 도메인내에서 서열 변이가 상대적으로 없음을 기초로, 또는 "가변" 도메인의 경우에는 다양한 부류 구성원의 도메인내에서의 상당한 변이를 기초로, "불변" 또는 "가변"으로 여기서 언급된다. 항체 또는 폴리펩티드 "도메인"은 종종 당업계에서 상호교환적으로 항체 또는 폴리펩티드 "영역"으로 불린다. 항체 경쇄의 "불변" 도메인은 "경쇄 불변 영역", "경쇄 불변 도메인", "CL" 영역 또는 "CL" 도메인으로 상호교환적으로 불린다. 항체 중쇄의 "불변" 도메인은 "중쇄 불변 영역", "중쇄 불변 도메인", "CH 영역" 또는 "CH" 도메인으로 상호교환적으로 불린다. 항체 경쇄의 "가변" 도메인은 "경쇄 가변 영역", "경쇄 가변 도메인", "VL" 영역 또는 "VL" 도메인으로 상호교환적으로 불린다. 항체 중쇄의 "가변" 도메인은 "중쇄 불변 영역", "중쇄 불변 도메인", "VH" 영역 또는 "VH" 도메인으로 상호교환적으로 불린다.

용어 "영역"은 또한 항체 쇄 또는 항체 쇄 도메인의 일부 또는 부분(예, 중쇄 또는 경쇄의 일부 또는 부분 또는 불변 또는 가변 도메인의 일부 또는 부분), 및 상기 쇄 또는 도메인의 더욱 구별되는 일부 또는 부분을 말할 수 있다. 예를 들어, 경쇄 및 중쇄 또는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 여기서 정의된 대로, "골격 영역" 즉 "FR"중에 산재된 "상보성 결정 영역" 즉 "CDR"을 포함한다.

면역글로불린 또는 항체는 단량체 또는 다량체 형태로 존재할 수 있으며, 예를 들어, 5량체 형태로 존재하는 IgM 항체 및/또는 단량체, 이량체 또는 다량체 형태로 존재하는 IgA 항체가 있다. 용어 "단편"은 본래의 또는 완전한 항체 또는 항체 쇄보다 적은 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 쇄의 일부 또는 부분을 말한다. 단편은 본래 또는 완전한 항체 또는 항체 쇄의 화학적 또는 효소적 처리를 통해 얻어질 수 있다. 단편은 또한 재조합 수단에 의해 얻어질 수 있다. 예시적인 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fabc 및/또는 Fv 단편을 포함한다. 용어 "항원-결합 단편"은 항원에 결합하거나 또는 항원 결합(즉, 특이적 결합)을 위해 본래 항체(즉, 그들이 유래된 본래 항체)와 경쟁하는 면역글로불린 또는 항체의 폴리펩티드 단편을 밀한다.

용어 "형태"는 단백질 또는 폴리펩티드(예, 항체, 항체 쇄, 그 도메인 또는 영역)의 3차 구조를 말한다. 예를 들어, "경(또는 중)쇄 형태"는 경(또는 중)쇄 가변 영역의 3차 구조를 말하며, "항체 형태" 또는 "항체 단편 형태"는 항체 또는 그 단편의 3차 구조를 말한다.

항체의 "특이적 결합"은 항체가 특정 항원 또는 에피토프에 대해 감지할 수 있는 친화성을 나타내며 일반적으로 큰 교차반응성을 나타내지 않음을 의미한다. 예시적인 구체예에서, 항체는 교차반응성을 나타내지 않는다(예, 비-Aβ 펩티드 또는 Aβ상의 떨어진 에피토프와 교차반응하지 않음). "감지할 수 있는" 또는 바람직한 결합은 적어도 10⁶,10⁷,10⁸,10⁹ M^-1, 또는 10^l0 M^{- 1} 의 친화성을 갖는 결합을 포함한다. 10⁷ M^-1 보다 큰, 바람직하게는 10⁸ M^-1 보다 큰 친화성이 더욱 바람직하다. 여기서 개시된 값의 중간 값은 또한 본 발명의 범위내이며, 바람직한 결합 친화성은 친화성의 범위, 예를 들어, 10⁶ 내지 10¹⁰ M^-1, 바람직하게는 10⁷ 내지 10¹⁰ M^-1, 더욱 바람직하게는 10⁸ 내지 10¹⁰ M^{- 1} 로 표시될 수 있다. "큰 교차반응성을 나타내지 않는" 항체는 원치않는 실체(예, 원치않는 단백질성 실체)에 감지할 수 있을 정도로 결합하지 않는 것이다. 예를 들어, Aβ에 특이적으로 결합하는 항체는 Aβ에 감지할 수 있게 결합하지만 비- Aβ 단백질 또는 펩티드(예, 플라크에 포함된 비- Aβ 단백질 또는 펩티드)와 크게 반응하지 않을 것이다. 특정 에피토프에 특이적인 항체는 예를 들어, 동일한 단백질 또는 펩티드상의 떨어진 에피토프와 크게 교차반응하지 않을 것이다. 특이적 결합은 그러한 결합을 결정하기 위한 임의의 공지 수단에 따라 결정될 수 있다. 바람직하게는, 특이적 결합은 스캐챠드(Scatchard) 분석 및/또는 경쟁적 결합 분석에 따라 결정된다.

결합 단편은 재조합 DNA 기법에 의해, 또는 본래 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산된다. 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, 단일쇄, 및 단일쇄 항체를 포함한다. "이특이적" 또는 "이기능적" 면역글로불린 또는 항체외에, 면역글로불린 또는 항체는 그 결합 부위의 각각이 동일한 것으로 이해된다. "이특이적" 또는 "이기능적 항체"는 두 개의 상이한 중/경쇄 쌍 및 두 개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공적인 하이브리드 항체이다. 이특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 비롯한 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321(1990) ; Kostelny et al.,J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)를 참고한다.

용어 "인간화된 면역글로불린" 또는 "인간화된 항체"는 적어도 하나의 인간화된 면역글로불린 또는 항체 쇄(즉, 적어도 하나의 인간화된 경쇄 또는 중쇄)를 포함하는 면역글로불린 또는 항체를 말한다. 용어 "인간화된 면역글로불린 쇄" 또는 "인간화된 항체 쇄"(즉, "인간화된 면역글로불린 경쇄" 또는 "인간화된 면역글로불린 중쇄")는 실질적으로 인간 면역글로불린 또는 항체로부터의 가변 골격 영역 및 실질적으로 비-인간 면역글로불린 또는 항체로부터의 상보성 결정 영역(CDR)(예, 적어도 하나의 CDR, 바람직하게는 두개의 CDR, 더욱 바람직하게는 세 개의 CDR)을 포함하는 가변 영역을 갖는 면역글로불린 또는 항체 쇄(즉, 각각 경쇄 또는 중쇄)를 말하며, 추가로 불변 영역(예, 경쇄의 경우, 적어도 하나의 불변 영역 또는 그 일부, 및 바람직하게는 중쇄의 경우 세 개의 불변 영역)을 포함한다. 용어 "인간화된 가변 영역"(예, "인간화된 경쇄 가변 영역" 또는 "인간화된 중쇄 가변 영역")은 실질적으로 인간 면역글로불린 또는 항체로부터의 가변 골격 영역 및 실질적으로 비-인간 면역글로불린 또는 항체로부터의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 가변 영역을 말한다.

"실질적으로 인간 면역글로불린 또는 항체로부터" 또는 "실질적으로 인간"은 비교 목적을 위하여 인간 면역글로불린 또는 항체 아미노산 서열에 배열될 때, 영역이 인간 골격 또는 불변 영역 서열과 적어도 80-90%, 90-95%, 또는 95-99% 동일성(즉, 국소 서열 동일성)을 가져, 예를 들어, 보존적 치환, 컨센서스 서열 치환, 생식세포 치환, 역돌연변이 등을 허용함을 의미한다. 보존적 치환, 컨센서스 서열 치환, 생식세포 치환, 역돌연변이 등의 도입은 종종 인간화된 항체 또는 쇄의 "최적화"로 불린다. "실질적으로 비-인간 면역글로불린 또는 항체로부터" 또는 "실질적으로 비-인간"은 면역글로불린 또는 항체 서열이 비-인간 유기체, 예, 비-인간 포유류의 서열과 적어도 80-95%, 바람직하게는 적어도 90-95%, 더욱 바람직하게는 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일함을 의미한다.

따라서, 인간화된 면역글로불린 또는 항체, 또는 인간화된 면역글로불린 또는 항체 쇄의 모든 영역 또는 잔기는, 가능하게는 CDR을 제외하고는, 하나 이상의 천연 인간 면역글로불린 서열의 상응하는 영역 또는 잔기와 실질적으로 동일하다. 용어 "상응하는 영역" 또는 "상응하는 잔기"는 첫번째 및 두번째 서열을 비교를 위하여 적절히 배열할 때, 첫번째 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열상의 영역 또는 잔기와 동일한(즉, 대등한) 위치를 차지하는 두번째 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열상의 영역 또는 잔기를 말한다.

용어 "상당한 동일성"은 디폴트 갭 웨이츠를 이용하여 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해서와 같이, 적절히 배열될 때, 두 폴리펩티드 서열이 적어도 50-60% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 60-70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 70-80% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 80-90% 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90-95% 동일성, 그리고 더욱 더 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성 또는 그 이상(예, 99% 서열 동일성 또는 그 이상)을 공유함을 의미한다. 용어 "실절적인 동일성"은 디폴트 갭 웨이츠를 이용하여 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해서와 같이, 적절히 배열될 때, 두 폴리펩티드 서열이 적어도 80-90% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90-95% 서열 동일성, 그리고 더욱 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성 또는 그 이상(예, 99% 서열 동일성 또는 그 이상)을 공유함을 의미한다. 서열 비교를 위하여, 일반적으로 한 서열은 시험 서열이 비교되는 기준 서열로 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 이용할 경우, 시험 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요하면 하위서열 코디네이트를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 이어서 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 파라미터에 기초하여, 기준 서열에 대하여 시험 서열을 위한 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.

비교를 위한 서열의 적절한 배열은 예를 들어, Smith & Waterman, Adv.Appl. Math. 2: 482(1981)의 국소 상동성 알고리즘에 의해, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)의 상동성 배열 알고리즘에 의해, Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA85 : 2444 (1988)의 유사성 조사 방법에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행에 의해 (위스콘신주 매디슨 575 사이언스 드라이브에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 또는 시각적 관찰에 의해(일반적으로 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology 참고) 실시될 수 있다. 퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 한 예는 Altschul et al., J.Mol. Biol. 215: 403 (1990)에 개시되는 BLAST 알고리즘이다. BLAST 분석을 실시하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터(국립 보건원 NCBI 인터넷 서버를 통해 대중이 접근 가능)를 통해 이용할 수 있다. 일반적으로, 디폴트 프로그램 파라미터를 이용하여 서열 비교를 실시할 수 있으나, 맞춤 파라미터 또한 이용될 수 있다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서, 3의 단어길이(W), 10의 예상치(E), 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스를 이용한다( Henikoff & Henikoff, Proc.Natl.Acad. Sci. USA 89: 10915(1989) 참고).

바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. 아미노산 치환을 보존적 또는 비보존적으로 분류하기 위한 목적을 위하여, 아미노산은 하기와 같이 나눠진다: 그룹 I(소수성 측쇄): leu, met, ala, val, leu, ile; 그룹 II (중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr ; 그룹 III (산성 측쇄): asp, glu; 그룹 IV (염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; 그룹 V (쇄 배향에 영향을 주는 잔기): gly, pro; 및 그룹 VI (방향족 측쇄): trp, tyr, phe. 보존적 치환은 같은 부류내의 아미노산 간의 치환에 관련된다. 비보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 다른 부류의 구성원을 위해 교환하는 것을 구성한다.

바람직하게는, 인간화된 면역글로불린 또는 항체는 상응하는 비인간화된 항체의 친화성의 3,4, 또는 5 인자내의 친화성으로 항원에 결합한다. 예를 들어, 비인간화된 항체가 10⁹ M^-1의 결합 친화성을 가지면, 인간화된 항체는 적어도 3 x 10⁹ M^-1, 4 x10⁹ M^-l 또는 5 x10⁹ M^-1의 결합 친화성을 가질 것이다. 면역글로불린 또는 항체 쇄의 결합 특성을 설명할 때, 쇄는 "항원(예, Aβ) 결합을 지시"하는 능력에 기초하여 설명될 수 있다. 쇄는 그것이 본래의 면역글로불린 또는 항체(또는 항원 결합 단편)에 특이적 결합 특성 또는 결합 친화성을 부여할 때 "항원 결합을 지시"한다고 말한다. 돌연변이(예, 역돌연변이)는 그것이 상기 쇄를 포함하는 본래의 면역글로불린 또는 항체(또는 그 항원 결합 단편)의 결합 친화성에 적어도 상기 돌연변이가 없는 등가의 쇄를 포함하는 항체(또는 그 항원 결합 단편)에 비교되는 양의 차수만큼 영향을 주면(예, 감소시키면), 중쇄 또는 경쇄가 항원 결합을 지시하는 능력에 실질적으로 영향을 주는 것으로 말한다. 돌연변이는 그것이 상기 돌연변이가 결핍된 등가 쇄를 포함하는 항체(또는 그 항원 결합 단편)의 결합 친화성의 2,3, 또는 4의 인자만큼만 상기 쇄를 포함하는 본래 면역글로불린 또는 항체(또는 그 항원 결합 단편)의 결합 친화성에 영향을 주면(예, 감소), "쇄가 항원 결합을 지시하는 능력에 크게 영향(예, 감소)을 주지 않는다".

용어 "키메라 면역글로불린" 또는 항체는 그 가변 영역이 첫번째 종에서 유래하고 그 불변 영역이 두번째 종에서 유래하는 면역글로불린 또는 항체를 말한다. 키메라 면역글로불린 또는 항체는 예를 들어, 유전자 조작에 의해, 다른 종에 속하는 면역글로불린 유전자 절편으로부터 구성될 수 있다. 용어 "인간화된 면역글로부린" 또는 "인간화된 항체"는 이하에서 정의된 대로 키메라 면역글로불린 또는 항체를 포함하지 않는다. 인간화된 면역글로불린 또는 항체가 그 구성에 있어 키메라임에도 불구하고(즉, 하나보다 많은 종의 단백질로부터의 영역을 포함), 그들은 여기서 정의된 대로, 키메라 면역글로불린 또는 항체에서 발견되지 않는 추가의 특징(즉, 공여체 CDR 잔기 및 어셉터 골격 잔기를 포함하는 가변 영역)을 포함한다.

"항원"은 항체가 특이적으로 결합하는 실체(예, 단백질성 실체 또는 펩티드)이다.

용어 "에피토프" 또는 "항원 결정인자"는 면역글로불린 또는 항체(또는 그 항원 결합 단편)이 특이적으로 결합하는 항원상의 부위를 말한다. 에피토프는 연속적인 아미노산 또는 단백질의 삼차원 접힘에 의해 나란히 놓이는 이웃하지 않는 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 이웃한 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 일반적으로 변성 용매에 노출시 보유되는 한편, 삼차원 접힘에 의해 형성된 에피토프는 일반적으로 변성 용매로 처리시에 손실된다. 에피토프는 일반적으로 독특한 공간 형태에 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14 또는 15 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간 형태를 결정하는 방법은 예를 들어, X-선 결정학 및 2-차원 핵 자기 공명을 포함한다. 예를 들어, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)를 참고한다.

동일한 에피토프를 인식하는 항체는 하나의 항체가 다른 항체가 표적 항원에 결합하는 것을 차단하는 능력을 나타내는 간단한 면역분석, 즉, 경쟁적 결합 분석에서 확인될 수 있다. 경쟁적 결합은 시험되는 면역글로불린이 Aβ와 같은 공통 항원에의 기준 항체의 특이적 결합을 억제하는 분석에서 결정된다. 많은 유형의 경쟁적 결합 분석이 알려져 있으며, 예를 들어, 고체 상 직접 또는 간접 방사선면역분석(RIA), 고체 상 직접 또는 간접 효소 면역분석(EIA), 샌드위치 경쟁 분석( Stahli et al., Methods in Enzymology 9: 242 (1983) 참고) ; 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (Kirkland et al., J. Immunol. 137: 3614(1986) 참고) ; 고체 상 직접 표지된 분석, 고체 상 직접 표지된 샌드위치 분석 (Harlow and Lane, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988) 참고) ; I-125 라벨을 이용하는 고체 상 직접 라벨 RIA (Morel et al., Mol. Immunol. 25(1) : 7 (1988) 참고) ; 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (Cheung et al., Virology 176: 546 (1990) 참고) ; 및 직접 표지된 RIA (Moldenhauer et al.,Scand. J. Immunol. 32: 77 (1990))가 있다. 일반적으로, 그러한 분석은 고체 표면에 결합된 정제된 항원 또는 미표지된 시험 면역글로불린 및 표지된 기준 면역글로불린 중 어느 것을 보유한 세포의 사용에 관련된다. 경쟁적 억제는 시험 면역글로불린의 존재하에서 세포 또는 고체 표면에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 일반적으로 시험 면역글로불린은 과량으로 존재한다. 대개, 경쟁 항체가 과량으로 존재할 때, 그것은 적어도 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% 또는 그 이상만큼 공통 항원에의 기준 항체의 특이적 결합을 억제할 것이다.

에피토프는 또한 면역 세포, 예, B 세포 및/또는 T 세포에 의해 인식된다. 에피토프의 세포 인식은 ³H-티미딘 통합에 의해, 사이토카인 분비에 의해, 항체 분비에 의해, 또는 항원-의존성 사멸(세포독성 T 림프구 분석)에 의해 결정되는, 항원-의존성 증식을 측정하는 생체외 분석에 의해 결정될 수 있다.

예시적인 에피토프 또는 항원성 결정인자는 인간 아밀로이드 전구체 단백질(APP)내에서 발견될 수 있으나, 바람직하게는 APP의 Aβ 펩티드내에서 발견된다. 다수의 APP의 아이소형태(isoform)가 존재하며, 예를 들어, APP⁶⁹⁵ APP⁷⁵¹ 및 APP⁷⁷⁰이 있다. APP 내의 아미노산은 APP⁷⁷⁰ 아이소형태의 서열에 따라 번호가 주어진다(예, 젠뱅크 기탁 번호 P05067참고). Aβ (여기서 베타 아밀로이드 펩티드 및 A-베타로도 불림) 펩티드는 APP의 39-43 아미노산의 약 4-kDa 내부 단편이다(Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 및 Aβ43). 예를 들어, Aβ40은 APP의 잔기 672-711로 구성되며 Aβ42는 APP의 잔기 673-713으로 구성된다. 생체내 또는 생체외에서 상이한 세크레타제 효소에 의한 APP의 단백질분해 프로세싱 결과, Aβ는 40 아미노산 길이의 "짧은 형태", 및 42-43 아미노산 길이의 "긴 형태" 둘다로 발견된다. 여기서 개시된 대로 바람직한 에피토프 또는 항원성 결정인자는 Aβ 펩티드의 N-말단내에 위치하며 Aβ의 아미노산 1-10내의 잔기, 바람직하게는 Aβ42의 잔기 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 또는 3-7을 포함한다. 추가의 바람직한 에피토프 또는 항원성 결정인자는 Aβ의 2-4, 5, 6, 7 또는 8, Aβ의 잔기 3-5, 6, 7, 8, 또는 9, 또는 Aβ42의 잔기 4-7, 8, 9 또는 10을 포함한다. 항체가 Aβ 3-7과 같은 특정 잔기내의 에피토프에 결합한다고 하면, 그것은 항체가 그 특정 잔기(이 예에서는 Aβ 3-7)를 함유하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합함을 의미한다. 그러한 항체는 반드시 Aβ 3-7내의 모든 잔기와 접촉할 필요는 없다. Aβ3-7내의 모든 단일 아미노산 치환 또는 결실이 결합 친화성에 반드시 크게 영향을 주지는 않는다.

용어 "아밀로이드원성 질병"은 불용성 아밀로이드 섬유의 형성 또는 침전과 관련된(또는 이에 의해 야기된) 임의의 질병을 포함한다. 예시적인 아밀로이드원성 질병은 전신성 아밀로이드증, 알츠하이머 병, 성숙 개시 당뇨병, 파킨슨 병, 헌팅톤 병, 이마관자 치매, 및 프리온-관련 전염성 스폰지형태 뇌병증(인간에서의 쿠루 및 크루츠펠트-야콥 병 및 양과 소에서의 면양떨림병 및 BSE)를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 상이한 아밀로이드원성 병은 침전된 섬유의 폴리펩티드 성분의 특성에 의해 정의되거나 특징지어진다. 예를 들어, 알츠하이머 병을 가진 개체 또는 환자에서, β-아밀로이드 단백질(예, 야생형, 변이체, 또는 절단된 β-아밀로이드 단백질)은 아밀로이드 침전의 특징적인 폴리펩티드 성분이다. 따라서, 알츠하이머 병은 예를 들어, 개체 또는 환자의 뇌에서, "Aβ의 침전을 특징으로 하는 병" 또는 "Aβ의 침전과 관련된 병"의 예이다. 용어 "β-아밀로이드 단백질", "β-아밀로이드 펩티드", "β-아밀로이드", "Aβ" 및 "Aβ 펩티드"는 여기서 상호교환적으로 사용된다.

"면역원성 제제" 또는 "면역원"은 선택적으로 아쥬반트와 함께 포유류에 투여시 그 자체에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.

여기서 이용될 때 용어 "치료"는 환자에의 치료제의 적용 또는 투여, 또는 질병, 질병의 증상 또는 질병에 대한 소인을 치료, 치유, 완화, 경감, 변화, 치료, 완화, 개선 또는 영향을 줄 목적으로, 질병, 질병의 증상 또는 질병에 대한 소인을 갖는 환자로부터의 분리된 조직 또는 세포주에 치료제를 적용 또는 투여하는 것으로 정의된다.

용어 "유효량" 또는 "유효 투여량"은 원하는 효과를 이루거나 적어도 부분적으로 이루기 위해 충분한 양으로 정의된다. 용어 "치료적 유효량"은 이미 질병을 앓고 있는 환자에서 질병 및 그 합병증을 치료하거나 적어도 부분적으로 중지시키기에 충분한 양을 의미한다. 이 용도에 효과적인 양은 감염의 심각성 및 환자 자신의 면역 체계의 일반 상태에 의존할 것이다.

용어 "환자"는 예방적 또는 치료적 처리를 받는 인간 및 다른 포유류 개체를 포함한다.

"가용성" 또는 "해리된" Aβ는 단량체 가용성 및 올리고머 가용성 Aβ 폴리펩티드(예, 가용성 Aβ 이량체, 삼량체, 등)을 비롯한 비응집성 또는 탈응집된 Aβ 폴리펩티드를 의미한다. "불용성" Aβ는 응집성 Aβ 폴리펩티드, 예를 들어, 비공유 결합에 의해 결합되는 Aβ를 말한다. Aβ(예, Aβ42)는 적어도 부분적으로는 펩티드의 C-말단(APP의 경막 도메인의 일부)에서의 소수성 잔기의 존재로 인해 응집하는 것으로 생각된다. 가용성 Aβ는 뇌척수 액 및/또는 혈청과 같은 생물 유체에서 생체내에서 발견될 수 있다. 다르게는, 가용성 Aβ는 동결건조된 펩티드를 니트 DMSO에서 초음파처리로 용해시켜 제조될 수 있다. 생성된 용액은 원심분리하여(예, 14,000 X G, 4 ℃, 10 분) 임의의 불용성 입자를 제거한다.

용어 "효과인자 기능"은 항체(예, IgG 항체)의 Fc 영역내에 존재하는 활성을 말하며 예를 들어, 효과인자 세포 활성, 용혈, 보체-매개 활성, 항체 소거, 및 항체 반감기와 같은 항체의 몇몇 면역 기능을 조절할 수 있는 보체 및/또는 Fc 어셉터와 같은 효과 인자 분자에 항체가 결합하는 능력을 포함한다.

용어 "효과인자 분자"는 보체 단백질 또는 Fc 어셉터를 포함하며 이에 한정되지 않는, 항체(예, IgG 항체)의 Fc 영역에 결합할 수 있는 분자를 말한다.

용어 "효과인자 세포"는 일반적으로 림프구, 예를 들어 항원 제시 세포 및 T 세포를 포함하며 이에 한정되지 않는 효과인자 세포의 표면에 발현된 Fc 어셉터를 통하여 항체(예, IgG 항체)의 Fc 부분에 결합할 수 있는 세포를 말한다.

용어 "Fc 영역"은 IgG 항체의 C-말단 영역, 특히 상기 IgG 항체의 중쇄의 C-말단 영역을 말한다. IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계가 약간 변할 수 있지만, Fc 영역은 일반적으로 IgG 중쇄의 아미노산 잔기 약 Cys226에서 카르복시 말단까지 부분으로 정의된다.

달리 특정되지 않으면 용어 "카바트 넘버링"은 예를 들어 IgG 중쇄 항체에서 명시적으로 본원에 참고로 포함되는 카바트 등(Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))에서처럼 EU 인덱스를 사용하는 잔기의 넘버링으로 정의된다.

용어 "Fc 어셉터" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 어셉터를 말한다. 항체(예, IgG 항체)의 Fc 영역에 결합하는 일반적인 Fc 어셉터는 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 서브클래스의 어셉터를 포함하며 이에 한정되지 않으며, 이들 어셉터의 대립유전자 변이체 및 다르게 스플라이스된 형태를 포함한다. Fc 어셉터는 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457- 92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)에 소개된다.

I. 면역학적 시약 및 치료 시약

본 발명의 면역학적 및 치료 시약은 면역원 또는 항체, 또는 그 기능성 또는 항원 결합 단편을 포함하거나 이로 구성된다. 기본 항체 구조 단위는 서브유닛의 사량체를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각 사량체는 두 개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 구성되며, 각 쌍은 하나의 "경" 쇄(약 25 kDa) 및 하나의 "중"쇄(약 50-70 kDa)을 갖는다. 각 쇄의 아미노-말단 부분은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 쇄의 카르복시-말단 부분은 효과인자 기능을 책임지는 불변 영역을 정의한다.

경쇄는 카파 또는 람다로 분류되며 약 230 잔기 길이이다. 중쇄는 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ), 또는 입실론(ε)으로 분류되며, 약 450-600 잔기 길이이며, 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로서 항체의 아이소타입을 정의한다. 중쇄 및 경쇄 둘다 도메인으로 접힌다. 용어 "도메인"은 단백질, 예를 들어, 면역글로불린 또는 항체의 구형 영역을 말한다. 면역글로불린 또는 항체 도메인은 예를 들어 β-플리티드 시트 및 쇄간 이황화 결합에 의해 안정화된 3 또는 4 펩티드 루프를 포함한다. 본래의 경쇄는 예를 들어, 두 도메인(V_L 및 C_L)을 가지며 본래의 중쇄는 예를 들어 4 또는 5 도메인(V_H, C_H1,C_H2, 및 C_H3)을 갖는다.

경쇄 및 중쇄내에서, 가변 영역 및 불변 영역은 약 12 이상 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되며, 중쇄는 또한 약 10 이상 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. (일반적으로 Fundamental Immunology (Paul, W. , ed. , 2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989), Ch. 7)를 참고하며 전체가 참고로 여기에 포함된다).

각 경/중 쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 본래 항체는 두개의 결합 부위를 갖는다. 이기능성 또는 이특이적 항체에서를 제외하고, 2 결합 부위는 동일하다. 쇄는 모두 상보성 결정 영역 즉 CDR로도 불리는 3개의 고가변 영역에 의해 연결된 상대적으로 보존된 골격 영역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 천연 발생 쇄 또는 재조합적으로 생산된 쇄는 세포 프로세싱동안 제거되어 성숙 쇄를 생산하는 리더 서열과 함께 발현될 수 있다. 성숙 쇄는 또한 예를 들어, 분비를 개선하거나 특정 관심 쇄의 프로세싱을 변화시키기 위해 비천연 발생 리더 서열을 갖도록 재조합적으로 생산될 수 있다.

각 쌍의 두 성숙 쇄의 CDR은 골격 영역에 의해 배열되어 특정 에피토프에의 결합을 가능하게 한다. N-말단에서 C-말단으로, 경쇄 및 중쇄 둘다 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. "FR4"는 또한 당업계에서 가변 중쇄의 D/J 영역으로 그리고 가변 경쇄의 J 영역으로 불린다. 각 도메인에의 아미노산의 할당은 카바트의 정의, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991)에 따른다. 다른 구조적 정의는 Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901(1987) ; Nature 342:878 (1989); 및 J. Mol. Biol. 186 : 651 (1989)(이하에서 총체적으로 "초티아 등"으로 불리며 참고로 전체가 본원에 포함됨)에 의해 제안되었다.

A. Aβ 항체

본 발명의 치료제는 Aβ 또는 아밀로이드 플라크의 다른 성분에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 바람직한 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 그러한 항체는 가용성 형태에의 결합없이 Aβ의 응집 형태에 특이적으로 결합한다. 일부는 응집 형태에는 결합하지 않고 가용성 형태에만 특이적으로 결합한다. 일부는 응집 형태 및 가용성 형태 둘다에 결합한다. 치료 방법에 사용되는 항체는 바람직하게는 그대로의 불변 영역 또는 적어도 Fc 어셉터와 상호작용하기에 충분한 불변 영역을 갖는다. 바람직한 항체는 플라크에서 Aβ의 Fc-매개된 식균작용을 자극하는데 효과적인 것들이다. 인간 아이소타입 IgG1은 식균작용 세포(예, 뇌 거주 대식세포 또는 미세아교세포)상의 FcRI 어셉터에 대한 인간 아이소타입의 높은 친화성때문에 바람직하다. 인간 IgG1은 쥐의 IgG2a의 등가물이며, 후자는 따라서 알츠하이머의 동물(예, 마우스) 모델에서 생체내 효능을 시험하는 데 적합하다. 이특이적 Fab 단편이 또한 이용될 수 있으며, 여기서 항체의 한 아암(arm)은 Aβ에 대해 특이적이며, 다른 아암은 Fc 어셉터에 대해 특이적이다. 바람직한 항체는 약 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 또는 10¹⁰ M^-1 (이들 값의 중간 친화성 포함)보다 큰(또는 같은) 결합 친화성으로 Aβ에 결합한다.

모노클로날 항체는 형태적 또는 비형태적 에피토프일 수 있는 Aβ내의 특정 에피토프에 결합한다. 항체의 예방 및 치료 효능은 실시예에서 개시되는 형질전환 동물 모델 과정을 이용하여 시험할 수 있다. 바람직한 모노클로날 항체는 Aβ의 잔기 1-10이내의 에피토프(천연 Aβ의 첫번째 N 말단 잔기가 1로 지정됨), 더욱 바람직하게는 Aβ의 잔기 3-7 이내의 에피토프에 결합한다. 일부 방법에서는, 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 다수의 모노클로날 항체가 이용되며, 예를 들어, Aβ의 잔기 3-7 내의 에피토프에 대해 특이적인 항체는 Aβ의 잔기 3-7의 밖의 에피토프에 대해 특이적인 항체와 공동투여될 수 있다. 그러한 항체는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. Aβ외의 다른 아밀로이드 성분에 대한 항체 또한 이용될 수 있다(예, 투여 또는 공동 투여).

항체의 에피토프 특이성은 예를 들어, 다른 구성원이 Aβ의 다른 하위서열을 나타내는 파아지 디스플레이 라이브러리를 형성하여 결정할 수 있다. 이어서, 파아지 디스플레이 라이브러리를 시험중인 항체에 특이적으로 결합하는 구성원에 대해 선택한다. 일군의 서열을 분리한다. 일반적으로, 그러한 서열군은 공통된 코어 서열을 함유하며, 다른 구성원에서는 인접 서열의 길이가 상이하다. 항체에의 특이적 결합을 나타내는 최단의 코어 서열이 항체에 의해 결합되는 에피토프를 정의한다. 항체는 또한 그 에피토프 특이성이 이미 결정된 항체와의 경쟁 분석에서 에피토프 특이성에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, Aβ에의 결합을 위하여 12A11 항체와 경쟁하는 항체는 잔기 Aβ 3-7내의, 12A11과 동일하거나 유사한 에피토프에 결합한다. 에피토프 특이성에 대해 항체를 스크리닝하는 것은 치료 효능의 유용한 예측자이다. 예를 들어, Aβ의 잔기 1-7내의 에피토프에 결합하는 것으로 결정된 항체는 본 발명의 방법에 따라 알츠하이머 병을 예방하고 치료하는 데 효과적이기 쉽다.

Aβ의 다른 영역에 결합하지 않고 Aβ의 바람직한 분절에 특이적으로 결합하는 항체는 다른 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 본래 Aβ에 대한 폴리클로날 혈청에 비하여 많은 잇점을 갖는다. 먼저, 동일한 질량 투여량의 경우, 바람직한 분절에 특이적으로 결합하는 항체의 투여량은 아밀로이드 플라크를 소거하는 데 효과적인 항체의 더 높은 몰농도의 투여량을 함유한다. 두번째, 바람직한 분절에 특이적으로 결합하는 항체는 본래 APP 폴리펩티드에 대한 소거 반응을 유도하지 않고 아밀로이드 침전물에 대한 소거 반응을 유도하여 잠재적인 부작용을 감소시킨다.

1. 비인간 항체의 생산

본 발명은 비인간 항체, 예를 들어, 본 발명의 바람직한 Aβ 에피토프에 대해 특이성을 갖는 항체를 특징으로 한다. 그러한 항체는 본 발명의 다양한 치료 조성물을 조제하는 데 이용되거나, 또는 바람직하게는 인간화된 또는 키메라 항체(이하에서 상세히 개시)의 생산을 위한 상보성 결정 영역을 제공할 수 있다. 비인간 모노클로날 항체, 예, 쥐, 기니아 피그, 영장류, 토끼 또는 래트의 비인간 모노클로날 항체의 생산은 예를 들어 Aβ로 동물을 면역시켜 이루어질 수 있다. Aβ 또는 Aβ의 면역원성 단편을 포함하는 더 긴 폴리펩티드 또는 Aβ에 대한 항체에 대한 항-이디오타입 항체 또한 이용될 수 있다. 참고로 여기에 포함되는 상기한 Harlow & Lane을 참고한다. 그러한 면역원은 천연 공급원으로부터, 펩티드 합성에 의해 또는 재조합 발현에 의해 얻을 수 있다. 선택적으로, 면역원은 후술하는 담체 단백질과 융합되거나 다르게는 복합되어 투여될 수 있다. 선택적으로, 면역원은 아쥬반트와 함께 투여될 수 있다. 용어 "아쥬반트"는 항원과 함께 투여될 때 항원에 대한 면역 반응을 증대시키지만 단독으로 투여될 때는 항원에 대한 면역반응을 생성하지 않는 화합물을 말한다. 아쥬반트는 림프구 보충, B 및/또는 T 세포의 자극, 및 대식세포의 자극을 비롯한 몇몇 기작에 의해 면역 반응을 증대시킬 수 있다. 몇가지 타입의 아쥬반트를 후술하는 대로 이용할 수 있다. 완전 프로인트 아쥬반트 및 후속하여 불완전 아쥬반트가 실험 동물의 면역에 바람직하다.

토끼 또는 기니아 피그는 일반적으로 폴리클로날 항체를 만드는 데 이용된다. 예를 들어, 수동적인 보호를 위한, 폴리클로날 항체의 예시적인 제조는 하기와 같이 이루어질 수 있다. 125 마리의 비형질전환 마우스를 100 ㎍ Aβ1-42 및 CFA/IFA 아쥬반트로 면역시키고 4-5개월 후에 안락사시킨다. 면역된 마우스로부터 혈액을 수집한다. 다른 혈액 성분들로부터 IgG를 분리한다. 면역원에 대해 특이적인 항체는 친화성 크로마토그래피에 의해 부분 정제할 수도 있다. 평균 약 0.5-1 mg의 면역원-특이적 항체를 마우스마다 얻어 총 60-120 mg을 얻는다.

마우스는 일반적으로 모노클로날 항체를 제조하기 위해 이용된다. 모노클로날 항체는 Aβ의 단편 또는 더 긴 형태를 마우스내로 주사하고, 하이브리도마를 제조하고, Aβ에 특이적으로 결합하는 항체를 위한 하이브리도마를 스크리닝함으로써 단편에 대하여 제조될 수 있다. 선택적으로, 항체는 Aβ의 다른 중복되지 않는 단편에는 결합하지 않고 Aβ의 특정 영역 또는 원하는 단편에 결합하는 것에 대해 스크린된다. 후자의 스크리닝은 Aβ 펩티드의 결실 돌연변이의 집합에 대한 항체의 결합을 결정하고, 어느 결실 돌연변이가 항체에 결합하는 지를 결정함으로써 이루어질 수 있다. 결합은 예를 들어, 웨스턴 블롯 또는 ELISA에 의해 평가할 수 있다. 항체에의 특이적 결합을 나타내는 최소 단편이 항체의 에피토프를 정의한다. 다르게는, 에피토프 특이성은 시험 항체 및 기준 항체가 Aβ에의 결합에 대해 경쟁하는 경쟁 분석에 의해 결정될 수 있다. 만일 시험 및 기준 항체가 경쟁하면, 이들은 동일한 에피토프 또는 충분히 가까운 에피토프에 결합하여 한 항체의 결합이 다른 항체의 결합을 방해한다. 그러한 항체를 위한 바람직한 아이소타입은 마우스 아이소타입 IgG2a 또는 다른 종의 등가 아이소타입이다. 마우스 아이소타입 IgG2a는 인간 아이소타입 IgG1(예, 인간 IgG1)의 등가물이다.

2. 키메라 및 인간화된 항체

본 발명은 또한 베타 아밀로이드 펩티드에 대해 특이적인 키메라 및/또는 인간화된 항체(즉, 키메라 및/또는 인간화된 면역글로불린)를 특징으로 한다. 키메라 및/또는 인간화된 항체는 키메라 또는 인간화된 항체의 구성을 위한 출발 물질을 제공하는 마우스 또는 다른 비인간 항체와 동일하거나 유사한 결합 특이성 및 친화성을 갖는다.

a. 키메라 항체의 생산

용어 "키메라 항체"는 경쇄 및 중쇄 유전자가 일반적으로 유전자 조작에 의해, 다른 종에 속하는 면역글로불린 유전자 분절로부터 구성된 항체를 말한다. 예를 들어, 마우스 모노클로날 항체로부터의 유전자의 가변(V) 분절은 IgG1 및 IgG4와 같은 인간 불변(C) 분절에 연결될 수 있다. 인간 아이소타입 IgG1이 바람직하다. 따라서 일반적인 키메라 항체는 마우스 항체로부터의 V 또는 항원-결합 도메인 및 인간 항체로부터의 C 또는 효과인자 도메인으로 구성된 하이브리드 단백질이다.

b. 인간화된 항체의 생산

용어 "인간화된 항체"는 실질적으로 인간 항체 쇄(어셉터 면역글로불린 또는 항체라 불림)로부터의 가변 영역 골격 잔기 및 실질적으로 마우스 항체(공여체 면역글로불린 또는 항체라 불림)로부터의 상보성 결정 영역 적어도 하나를 포함하는 적어도 하나의 쇄를 포함하는 항체를 말한다. Queen et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA86 : 10029-10033(1989), 미국 특허 제5,530,101호, 미국 특허 제5,585, 089호, 미국 특허 제5,693,761호, 미국 특허 제5,693,762호, Selick et al., WO 90/07861호 및 Winter, 미국 특허 제5,225,539호를 참고한다(전체가 참고로 본원에 포함됨). 존재하면, 불변 영역 또한 실질적으로 또는 전적으로 인간 면역글로불린에서 유래한다.

마우스 CDR의 인간 가변 도메인 골격내로의 치환은 만일 인간 가변 도메인 골격이 CDR이 기원하는 마우스 가변 골격과 동일하거나 유사한 형태를 취하면 그들의 정확한 공간 배향을 보유할 가능성이 높다. 이것은 골격 서열이 CDR이 유래한 쥐의 가변 골격 도메인과 높은 서열 동일성을 나타내는 인간 항체로부터 인간 가변 도메인을 얻음으로써 이루어진다. 중쇄 및 경쇄 가변 골격 영역은 동일하거나 상이한 인간 항체 서열로부터 유래할 수 있다. 인간 항체 서열은 자연 발생 인간 항체의 서열이거나 또는 몇몇 인간 항체의 컨센서스 서열일 수 있다. Kettleborough et al., Protein Engineering 4 : 773 (1991); Kolbinger et al., Protein Engineering 6: 971 (1993) 및 Carter et al., WO 92/22653호를 참고한다.

쥐의 공여체 면역글로불린의 상보성 결정 영역 및 적절한 인간 어셉터 면역글로불린을 확인하면, 다음 단계는 생성되는 인간화된 항체의 특성을 최적화하기 위해 이들 성분으로부터의 어느 잔기가 치환되어야 할지를 결정하는 것이다. 일반적으로, 인간 아미노산 잔기를 쥐로 치환하는 것은 최소화되어야 하며, 이는 쥐의 잔기의 도입은 인간에서 항체가 인간-항-마우스-항체(HAMA) 반응을 유발할 위험을 증가시키기 때문이다. 면역 반응을 결정하는 업계에 공지된 방법을 실시하여 구체적인 환자에서 또는 임상 시험동안 HAMA 반응을 모니터할 수 있다. 인간화된 항체가 투여된 환자는 상기 치료제 투여의 초기에 그리고 투여동안 면역원성 평가를 받을 수 있다. HAMA 반응은 예를 들어, 표면 플라스몬 공명 기법(BIACORE) 및/또는 고체 상 ELISA 분석을 비롯한 공지의 방법을 이용하여 환자로부터의 혈청 샘플에서 인간화된 치료 시약에 대한 항체를 검출함으로써 측정된다.

인간 가변 영역 골격 잔기로부터의 일부 아미노산은 CDR 형태 및/또는 항원에의 결합에 대한 그들의 가능한 영향에 기초하여 치환을 위해 선택된다. 쥐의 CDR 영역을 인간 가변 골격 영역과 인위적으로 병치시키면 비천연 형태 억제가 야기될 수 있으며, 이는 일부 아미노산 잔기의 치환에 의해 바로잡지 않으면 결합 친화성의 손실을 야기한다.

치환을 위한 아미노산 잔기의 선택은 부분적으로 컴퓨터 모델링에 의해 결정된다. 면역글로불린 분자의 삼차원 영상을 생성하기 위한 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어가 여기서 개시된다. 일반적으로, 분자 모델은 면역글로불린 쇄 또는 그 도메인을 위한 해명된 구조로부터 시작하여 생성된다. 모델링될 쇄를 해명된 삼차원 구조의 쇄 또는 도메인과 아미노산 서열 유사성에 대해 비교하며, 최대의 서열 유사성을 나타내는 쇄 또는 도메인을 분자 모델의 구성을 위한 출발점으로 선택한다. 적어도 50% 서열 동일성을 공유하는 쇄 또는 도메인을 모델링을 위해 선택하며, 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80% 90% 서열 동일성 또는 그 이상을 공유하는 것들을 모델링을 위해 선택한다. 해명된 출발 구조는 모델링될 면역글로불린 쇄 또는 도메인내의 실제 아미노산과 출발 구조내의 아미노산 사이의 차이를 허용하도록 변형된다. 이어서 변형된 구조는 복합 면역글로불린으로 조립된다. 마지막으로, 모델은 에너지 최소화에 의해 그리고 모든 원자가 서로 적절한 거리내에 있으며 결합 길이와 각이 화학적으로 허용되는 한계내에 있음을 확인함으로써 순화된다.

치환을 위한 아미노산 잔기의 선택은 또한 부분적으로는 특정 위치에서 아미노산의 특성의 검사, 또는 특정 아미노산의 치환 또는 돌연변이유발의 효과의 실험적 관찰에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 아미노산이 쥐의 가변 영역 골격 잔기와 선택된 인간 가변 영역 골격 잔기 사이에서 상이할 때, 인간 골격 아미노산은 대개 그 아미노산이 (1) 항원에 직접 비공유적으로 결합하며, (2) CDR 영역에 이웃하며, (3) 다르게는 CDR 영역과 상호작용하며(예, 컴퓨터 모델링에 의해 결정할 때 CDR 영역의 약 3-6 Å 이내), 또는 (4) VL-VH 계면에 참여하는 것이 합리적으로 예상될 경우 마우스 항체로부터의 등가의 골격 아미노산에 의해 치환되어야 한다.

"직접 항원에 비공유적으로 결합"하는 잔기는 확립된 화학적 힘, 예를 들어, 수소 결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호작용 등에 따라 항원상의 아미노산과 직접 상호작용할 가능성이 우수한 골격 영역내의 위치의 아미노산을 포함한다.

CDR 및 골격 영역은 상기한 카바트 등 또는 초티아 등에 의해 정의된 대로이다. 상기한 카바트 등에 의해 정의된 골격 잔기가 상기의 초티아 등에 의해 정의된 구조적 루프 잔기를 구성할 경우, 마우스 항체에 존재하는 아미노산은 인간화된 항체내로의 치환을 위해 선택될 수 있다. "CDR 영역에 이웃한" 잔기는 인간화된 면역글로불린 쇄의 일차 서열내의 CDR 중 하나 이상에 직접 이웃한 위치의 아미노산 잔기, 예를 들어, 카바트 등에 의해 정의된 CDR 또는 초티아(예, Chothia and Lesk JMB 196: 901(1987))에 의해 정의된 CDR에 바로 이웃한 위치의 아미노산 잔기를 포함한다. 이들 아미노산은 특히 CDR내의 아미노산과 상호작용하고, 만일 어셉터로부터 선택되면, 공여체 CDR을 왜곡시키고 친화성을 감소시킬 가능성이 높다. 더욱이, 이웃한 아미노산은 항원과 직접 상호작용할 수도 있으며(Amit et al., Science, 233: 747(1986), 참고로 본원에 포함됨) 공여체로부터 이들 아미노산의 선택은 원래 항체에서 친화성을 제공하는 모든 항원 접촉을 유지하기 위해 바람직할 수 있다.

"다르게는 CDR 영역과 상호작용하는" 잔기는 이차 구조 분석에 의해 CDR 영역에 영향을 주기에 충분한 공간 배향에 있는 것으로 결정된 것을 포함한다. 한 구체예에서, "다르게는 CDR 영역과 상호작용하는" 잔기는 공여체 면역글로불린의 삼차원 모델(예, 컴퓨터-생성된 모델)을 분석함으로써 확인된다. 일반적으로 원래 공여체 항체의 삼차원 모델은 CDR 밖의 일부 아미노산이 CDR에 가까우며 수소 결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호작용 등에 의해 CDR내의 아미노산과 상호작용할 확률이 높음을 보여준다. 이들 아미노산 위치에서, 어셉터 면역글로불린 아미노산외의 공여체 면역글로불린 아미노산이 선택될 수 있다. 이 기준에 따른 아미노산은 일반적으로 CDR내의 일부 원자의 약 3 Å 단위이내에 측쇄 원자를 가지며, 전술한 것들과 같은 확립된 화학적 힘에 따라 CDR 원자와 상호작용할 수 있는 원자를 함유해야 한다.

수소 결합을 형성할 수 있는 원자의 경우, 3 Å은 그들의 핵 사이에서 측정되지만, 결합을 형성하지 않는 원자의 경우, 3 Å은 그들의 반데르 발스 표면 사이에서 측정된다. 따라서, 후자의 경우, 원자가 상호작용할 수 있는 것으로 간주되기 위해서는 핵은 6 Å(3 Å 더하기 반데르발스 반경의 합)이내에 있어야 한다. 많은 경우에 핵은 4 또는 5 내지 6 Å 떨어져 있을 것이다. 아미노산이 CDR과 상호작용할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 중쇄 CDR 2의 마지막 8 아미노산을 CDR의 일부로 고려하지 않는 것이 바람직하며, 이는 구조의 관점에서, 이들 8 아미노산은 골격의 일부처럼 행동하기 때문이다.

CDR 내의 아미노산과 상호작용할 수 있는 아미노산은 다른 방식으로 확인될 수 있다. 각 골격 아미노산의 용매 접근성 표면적은 두 방식으로 계산된다: (1) 본래 항체에서, 및 (2) 그 CDR이 제거된 항체로 구성된 가설적 분자에서. 약 10 제곱 Å 이상의 이들 숫자 사이의 상당한 차이는 골격 아미노산의 용매에의 접근이 적어도 부분적으로 CDR에 의해 차단되며, 따라서 아미노산이 CDR과 접촉함을 보여준다. 아미노산의 용매 접근성 표면적은 공지된 알고리즘을 이용하여(예, Connolly, J. Appl. Cryst. 16: 548 (1983) 및 Lee and Richards, J. Mol. Biol. 55: 379 (1971), 둘다 참고로 본원에 포함됨) 항체의 삼차원 모델에 기초하여 계산될 수도 있다. 골격 아미노산은 또한 교대로 CDR과 접촉하는 다른 골격 아미노산의 형태에 영향을 줌으로써, 때때로 간접적으로 CDR과 상호작용할 수도 있다.

골격내의 몇몇 위치의 아미노산은 많은 항체에서 CDR 형태(예, CDR과 상호작용할 수 있는)를 결정하는 데 중요한 것으로 알려져 있다(Chothia and Lesk, supra, Chothia et al., supra 및 Tramontano et al., J. Mol. Biol. 215: 175 (1990), 모두 참고로 본원에 포함됨). 이들 저자는 몇몇 공지 항체의 구조 분석에 의해 CDR 형태에 중요한 보존된 골격 잔기를 확인하였다. 분석된 항체는 CDR의 형태에 기초한 제한된 수의 구조적 또는 "공인" 부류에 속한다. 공인 부류의 구성원내의 보존된 골격 잔기는 "공인" 잔기로 불린다. 공인 잔기는 경쇄의 잔기 2, 25, 29, 30, 33, 48, 64, 71, 90, 94 및 95 및 중쇄의 잔기 24, 26, 29, 34, 54, 55, 71 및 94를 포함한다. 추가의 잔기(예, CDR 구조-결정 잔기)는 Martin and Thorton (1996) J. Mol. Biol. 263: 800의 방법에 따라 확인될 수 있다. 주목할만하게, 경쇄의 위치 2, 48, 64 및 71 및 중쇄의 26-30, 71 및 94에서의 아미노산(카바트에 따른 넘버링)은 많은 항체에서 CDR과 상호작용할 수 있는 것으로 알려져 있다. 경쇄의 위치 35 및 중쇄의 위치 93 및 103의 아미노산은 또한 CDR과 상호작용하기 쉽다. CDR의 형태에 영향을 줄 수 있는 추가의 잔기는 Foote and Winter (1992) J.Mol. Biol. 224: 487의 방법에 따라 확인될 수 있다. 그러한 잔기는 "베르니에" 잔기로 불리며 CDR 바로 아래에 놓이는(즉, CDR 아래의 "플랫폼"을 형성) 골격 영역내의 잔기이다. 모든 이들 넘버링된 위치에서는, (그들이 상이할 경우) 어셉터 아미노산이 아닌 공여체 아미노산이 인간화된 면역글로불린내에 있도록 선택하는 것이 바람직하다. 한편, 경쇄의 처음 5 아미노산과 같은, CDR 영역과 상호작용할 수 있는 일부 잔기는 때때로 인간화된 면역글로불린에서 친화성의 손실없이 어셉터 면역글로불린으로부터 선택될 수도 있다.

"VL-VH 계면에 참여"하는 잔기 즉 "패킹 잔기"는 예를 들어, Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 4592-66 (1985) 또는 상기의 초티아 등에 의해 정의된 VL과 VH 사이의 계면에서의 잔기를 포함한다. 일반적으로, 특이한 패킹 잔기는 그들이 인간 골격내의 것들과 상이하면 인간화된 항체에 보유되어야 한다.

일반적으로, 상기 기준을 충족하는 아미노산 중 하나 이상이 치환될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 기준을 충족하는 아미노산 전부 또는 대부분이 치환된다. 때때로, 특정 아미노산이 상기 기준을 충족하는 지에 대해 불명료함이 있으며, 대안 변이체 면역글로불린이 생산되며, 그 중 하나는 그 특정 치환을 가지며, 다른 하나는 그렇지 않다. 그렇게 생산된 대안 변이체 면역글로불린은 원하는 활성에 대해 여기서 개시된 분석에서 시험될 수 있으며 바람직한 면역글로불린이 선택된다.

대개 인간화된 항체내의 CDR 영역은 실질적으로 동일하며, 보다 일반적으로는, 공여체 항체의 상응하는 CDR 영역에 동일하다. 하지만, 일부 구체예에서, 항체의 항원 결합 특이성을 변화시키고/거나 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 하나 이상의 CDR 영역을 변화시키는 것이 바람직할 수 있다. 일반적으로, CDR의 하나 이상의 잔기는 결합의 보다 우호적인 온레이트(on-rate), 결합의 보다 우호적인 오프레이트(off-rate), 또는 둘다를 이루어 이상적인 결합 상수가 얻어지도록 하기 위하여 결합을 변화시키도록 변화된다. 이 전략을 이용하여, 예를 들어, 10¹⁰ M^-1 이상의 극히 높은 결합 친화성을 갖는 항체가 얻어질 수 있다. 요약하면, 공여체 CDR 서열은 하나 이상의 잔기가 이어서 변화되는 기본 서열로 불린다. 여기서 개시된 대로, 친화성 성숙 기법을 이용하여 CDR 영역을 변화시키고, 결합에서의 원하는 변화에 대하여 생성된 결합 분자를 스크리닝한다. 상기 방법은 또한 공여체 CDR, 일반적으로 마우스 CDR이 덜 면역원성이도록 변화시켜 잠재적인 인간 항마우스 항체(HAMA) 반응이 최소화되거나 피해지도록 할 수 있다. 따라서, CDR이 변화될 경우, 결합 친화성 및 면역원성의 변화가 모니터되고 기록되어 최선의 조합된 결합 및 저 면역원성을 위해 최적화된 항체가 얻어진다(예, 미국 특허 제6,656,467호 및 미국 특허 공개 US20020164326A1 참고).

다른 접근법에서는, 항체의 CDR 영역을 분석하여 공여체 CDR의 각각을 인간 대응부로 전신성으로 치환함으로써 각 개별 CDR의 항체 결합 및/또는 면역원성에의 기여를 결정한다. 이어서 인간화된 항체의 생성된 패널을 항원 친화성 및 각 CDR의 잠재적인 면역원성에 대해 점수를 매긴다. 이 방식으로, 후보 결합 분자의 두 가지 임상적으로 중요한 특성, 즉, 항원 결합 및 낮은 면역원성을 결정한다. 만일 상응하는 쥐 항체 또는 CDR-이식된(인간화된)항체 형태에 대한 환자 혈청이 이용가능하면, 체계적인 인간 CDR 교환을 나타내는 전체 항체 패널을 스크린하여 각 공여체 CDR에 대한 환자 항이디오타입 반응을 결정할 수 있다(기술적 상세사항을 위해서는 Iwashi et al., Mol. Immunol. 36: 1079-91 (1999)를 참고). 그러한 접근은 비필수 공여체 CDR로부터 필수 공여체 CDR 영역을 확인하도록 한다. 이어서 비필수 공여체 CDR 영역은 인간 대응부 CDR과 교환될 수 있다. 필수 CDR 영역이 허용할 수 없는 기능 손실없이 교환될 수 없는 경우, CDR의 특이성-결정 잔기(SDR)의 확인은 예를 들어, 부위 지시된 돌연변이유발에 의해 실시된다. 이러한 방식으로, 이어서 CDR은 SDR만을 보유하며 CDR 전체에 걸쳐 나머지 아미노산 위치에서 인간 및/또는 최소 면역원성이도록 재조작될 수 있다. 공여체 CDR의 일부만이 이식되는 경우, 그러한 접근은 또한 약칭 CDR-이식으로 불린다(전술한 기법의 기술적 상세 사항을 위해서는, 예를 들어, Tamura et al., J. of Immunology 164 (3): 1432-41. (2000); Gonzales et al., Mol. Immunol 40: 337-349 (2003); Kashmiri et al., Crit. Rev. Oyacol. Hemato. 38: 3-16 (2001); 및 De Pascalis et al., J. of Immunology 169 (6): 3076- 84. (2002)를 참고한다).

더욱이, 생성된 인간화된 면역글로불린의 결합 친화성에 크게 영향을 주지 않고 CDR 잔기의 보존적 아미노산 치환 하나 이상을 만드는 것이 때때로 가능하다. 보존적 치환은 gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln ; ser, thr; lys, arg; 및 phe, tyr과 같은 조합을 말한다.

치환을 위한 추가의 후보는 그 위치에서 인간 면역글로불린을 위해 특이하거나 "희귀"한 어셉터 인간 골격 아미노산이다. 이들 아미노산은 마우스 공여체 항체의 등가 위치로부터 또는 보다 전형적인 인간 면역글로불린의 등가 위치로부터의 아미노산으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 어셉터 면역글로불린의 인간 골격 영역에서의 아미노산이 그 위치에 대해 희귀하며 공여체 면역글로불린에서 상응하는 아미노산이 인간 면역글로불린 서열에서 그 위치에 대해 일반적일 때, 또는 어셉터 면역글로불린의 아미노산이 그 위치에 대해 희귀하며 공여체 면역글로불린에서 상응하는 아미노산이 또한 다른 인간 서열에 비하여 희귀할 때, 치환이 바람직할 수 있다. 잔기가 어셉터 인간 골격 서열에 대해 희귀한 지 여부는 또한 CDR 형태에 대한 기여에 기초한 역돌연변이를 위한 잔기를 선택할 때 고려되어야 한다. 예를 들어, 역돌연변이가 어셉터 인간 골격 서열에 대해 희귀한 잔기의 치환을 야기하면, 인간화된 항체는 활성에 대해 시험될 수 있다. 만일 역돌연변이가 활성에 필요하지 않으면, 면역원성 염려를 감소시키기 위하여 제거될 수도 있다. 예를 들어, 하기 잔기에서의 역돌연변이는 어셉터 인간 골격 서열에서 희귀한 잔기를 도입할 수 있다; uk= v2 (2.0%), L3 (0.4%), T7 (1.8%), Q18 (0.2%), L83 (1.2%), I85 (2.9%), A100(0.3%) 및 L106(1.1%) ; 및 vh = T3 (2.0%), K5 (1.8%), I11 (0.2%), S23 (1.5%), F24 (1.5%), S41 (2.3%), K71 (2.4%), R75 (1.4%), I82 (1.4%), D83 (2.2%) 및 L109 (0.8%). 이들 기준은 인간 골격에서 일반적이지 않은 아미노산이 항체 구조를 파괴하지 않도록 하는 것을 돕는다. 더욱이, 특이한 인간 어셉터 아미노산을 인간 항체에 대해 전형적인 공여체 항체로부터의 아미노산으로 치환함으로써, 인간화된 항체는 덜 면역원성이 될 수 있다.

여기서 이용될 때, 용어 "희귀한"은 대표적인 서열 샘플에서 서열의 약 20% 미만, 바람직하게는 약 10% 미만, 더욱 바람직하게는 약 5% 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 3% 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 2% 미만 그리고 더욱 더 바람직하게는 약 1% 미만에서 그 위치에서 발생하는 아미노산을 나타내며, 여기서 이용될 때 용어 "일반적인"은 대표 샘플에서 서열의 약 25% 초과에서 하지만 대개는 약 50% 초과에서 발생하는 아미노산을 나타낸다. 예를 들어, 인간 어셉터 서열에서 아미노산이 "희귀"한지 또는 "일반적"인지를 결정할 때, 단지 인간 가변 영역 서열만을 고려하는 것이 바람직할 것이며 마우스 아미노산이 "희귀"한지 "일반적"인지를 결정할 때는 단지 마우스 가변 영역 서열만을 고려할 것이다. 더욱이, 모든 인간 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열은 각각 서로 특히 상동성이며 일부 중요 위치에서 동일한 아미노산을 갖는 서열들의 "하위그룹" 내로 분류된다(상기한 카바트 등). 인간 어셉터 서열에서 아미노산이 인간 서열중에서 "희귀"한지 또는 "일반적"인지 결정할 때, 어셉터 서열과 동일한 하위그룹내의 인간 서열만을 고려하는 것이 종종 바람직할 것이다.

치환을 위한 추가의 후보는 상기한 초티아 등에 의해 제안된 대안 정의하에서 CDR 영역의 일부로서 확인될 어셉터 인간 골격 아미노산이다. 치환을 위한 추가의 후보는 AbM 및/또는 접촉 정의하에서 CDR 영역의 일부로서 확인될 어셉터 인간 골격 아미노산이다.

치환을 위한 추가의 후보는 희귀 또는 특이 공여체 골격 잔기에 해당하는 어셉터 골격 잔기이다. 희귀 또는 특이 공여체 골격 잔기는 그 위치에서 쥐의 항체의 경우 희귀하거나 특이한(여기서 정의) 것이다. 쥐 항체의 경우, 하위그룹은 카바트 및 컨센서스와 상이한 것으로 확인된 잔기 위치에 따라 결정될 수 있다. 이들 공여체 특이적 차이는 쥐 서열에서 활성을 증가시키는 체세포 돌연변이를 나타낼 수 있다. 결합에 영향을 주는 것으로 예상되는 특이 잔기(예, 패킹 공인 및/또는 베르니에 잔기)는 보유되는 한편, 결합에 중요하지 않을 것으로 예상되는 잔기는 치환될 수 있다. 12A11 UK 서열내의 희귀 잔기는 I85(3.6%)를 포함한다. 12A11 vh 서열내의 희귀 잔기는 T3 (1.0%), I11 (1.7%), L12 (1.7%), S41 (2.8%), D83 (1.8%) 및 A85 (1.8%)를 포함한다.

치환을 위한 추가의 후보는 어셉터 골격 영역에서 발생하는 비생식세포 잔기이다. 예를 들어, 어셉터 항체 쇄(즉, 공여체 항체 쇄와 상당한 서열 동일성을 갖는 인간 항체 쇄)가 생식세포 항체 쇄(유사하게 공여체 쇄와 상당한 서열 동일성을 보유함)에 배열될 때, 어셉터 쇄 골격과 생식세포 쇄 골격 사이에 매치하지 않는 잔기는 생식세포 서열로부터의 상응하는 잔기로 치환될 수 있다.

전술한 특정 아미노산 치환외에, 인간화된 면역글로불린의 골격 영역은 대개 실질적으로 동일하며, 더욱 일반적으로는, 그들이 유래된 인간 항체의 골격 영역과 동일하다. 물론, 골격 영역내의 아미노산의 다수는 항체의 특이성 또는 친화성에 거의 또는 전혀 기여하지 않는다. 따라서, 골격 잔기의 다수의 개별 보존적 치환은 생성된 인간화된 면역글로불린의 특이성 또는 친화성의 인식할만한 변화없이 허용될 수 있다. 따라서, 한 구체예에서 인간화된 면역글로불린의 가변 골격 영역은 인간 가변 골격 영역 서열 또는 그러한 서열의 컨센서스에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다. 다른 구체예에서, 인간화된 면역글로불린의 가변 골격 영역은 인간 가변 골격 영역 서열 또는 그러한 서열의 컨센서스와 적어도 90%, 바람직하게는 95%, 더욱 바람직하게는 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 하지만, 일반적으로, 그러한 치환은 바람직하지 않다.

예시적인 구체예에서, 본 발명의 인간화된 항체는 적어도 10⁷, 10⁸, 10⁹ 또는 10¹⁰ M^-1의 항원에 대한 특이적 결합 친화성을 나타낸다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 적어도 10¹⁰, 10¹¹ 또는 10¹² M^-1의 결합 친화성을 가질 수 있다. 대개 인간화된 항체의 항원에 대한 결합 친화성의 상한선은 공여체 면역글로불린의 친화성의 3,4, 또는 5의 인자 이내이다. 종종 결합 친화성의 보다 낮은 한계가 또한 공여체 면역글로불린의 친화성의 3,4, 또는 5의 인자 이내이다. 다르게는, 결합 친화성은 치환을 갖지 않는 인간화된 항체(예, 공여체 CDR 및 어셉터 FR을 갖지만 FR 치환이 없는 항체)의 친화성에 비교될 수 있다. 그러한 경우에, 최적화된 항체(치환 있음)의 결합은 바람직하게는 미치환 항체의 적어도 2 내지 3배 더 크거나 또는 3 내지 4배 더 크다. 비교를 위해, 다양한 항체의 활성을 예를 들어, BIACORE(즉, 미표지 시약을 이용하는 표면 플라스몬 공명) 또는 경쟁적 결합 분석에 의해 결정할 수 있다.

c. 인간화된 12A11 항체의 생산

본 발명의 바람직한 구체예는 Aβ의 N-말단에 대한 인간화된 항체, 특히 여기서 개시된 치료 및/또는 진단 방법에 사용하기 위한 항체를 특징으로 한다. 인간화된 항체의 생산을 위한 특히 바람직한 출발 물질은 모노클로날 항체 12A11이다. 12A11은 Aβ의 N-말단에 대해 특이적이며 (1) 응집된 Aβ1-42에 대해 높은 친화력을 가지며, (2) 가용성 Aβ를 포획하는 능력을 가지며, 그리고 (3) 아밀로이드 플라크의 식균작용을 매개(예, 식균작용을 유도)하는 것으로 나타났다. 12A11 항체의 생체내 효능은 실시예 II에 개시된다. 12A11 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호하는 cDNA의 클로닝 및 서열결정은 실시예 III에 개시된다.

적합한 인간 어셉터 항체 서열은 마우스 가변 영역의 아미노산 서열을 공지의 인간 항체의 서열과 컴퓨터 비교함으로써 확인할 수 있다. 비교는 중쇄 및 경쇄를 위해 별도로 실시되지만 원리는 각각에 대해 유사하다. 구체적으로, 골격 서열이 쥐의 VL 및 VH 골격 영역과 높은 서열 동일성을 나타내는 인간 항체로부터의 가변 도메인은 예를 들어, NCBI IgG BLAST(국립보건원 NCBI 인터넷 서버를 통해 접근 가능)를 이용하여 IgG 단백질 서열 데이터베이스 또는 카바트 데이터베이스를 각 쥐 골격 서열로 조사하여 확인된다. 한 구체예에서, 쥐 공여체 서열, 예, 공여체 골격(FR) 서열과 50% 초과 서열 동일성을 갖는 어셉터 서열이 선택된다. 바람직하게는, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 서열 동일성 또는 그 이상을 갖는 어셉터 항체 서열이 선택된다.

12A11의 컴퓨터 비교 결과, 12A11 경쇄(마우스 하위그룹 II)는 서브타입 카파 II의 인간 경쇄에 대해 최대의 서열 동일성을 나타내며 12A11 중쇄(마우스 서브그룹 Ib)는 상기의 카바트 등에 의해 정의한 대로, 서브타입 II의 인간 중쇄에 대해 최대의 서열 동일성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 경쇄 및 중쇄 인간 골격 영역은 이들 서브타입의 인간 항체로부터, 또는 그러한 서브타입의 컨센서스 서열로부터 유래될 수 있다. 첫번째 인간화 노력에서, 경쇄 가변 골격 영역은 인간 서브그룹 II 항체로부터 유래되었다. 인간 하위그룹 II 항체로부터 유래된 중쇄 가변 골격 영역을 갖는 인간화된 항체의 발현의 고 수준을 이루기 위해 고안된 이전 실험에 기초하여, 그러한 항체의 발현 수준이 때때로 낮은 것으로 발견되었다. 따라서, Saldanha et al. (1999) Mol Immunol. 36:709-19에 개시된 논리에 기초하여, 인간 서브그룹 II가 아닌 III 항체로부터의 골격 영역이 선택되었다.

12A11의 경쇄 가변 영역내에서 상당한 서열 동일성을 갖는 인간 하위그룹 II 항체 K64(AIMS4)(기탁 번호 BAC01733)가 NCBI 비-풍부(non-redumdant) 데이터베이스로부터 확인되었다. 12A11의 중쇄 가변 영역내에서 상당한 서열 동일성을 갖는 인간 하위그룹 III 항체 M72(기탁 번호 AAA69734)가 NCBI 비-풍부 데이터베이스로부터 확인되었다(또한, Schroeder and Wang (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 872: 6146- 6150를 참고).

다른 경쇄 어셉터 서열은 예를 들어, PDB 기탁 번호 1KFA(gi24158782), PDB 기탁 번호 1KFA(gi24158784), EMBL 기탁 번호 CAE75574.1 (gi38522587), EMBL 기탁 번호 CAE75575.1(gi38522590), EMBL 기탁 번호 CAE84952.1 (gi39838891), DJB 기탁 번호 BAC01734.1 (gi21669419), DJB 기탁 번호 BAC01730.1 (gi21669411), PIR 기탁 번호 S40312 (gi481978), EMBL 기탁 번호 CAA51090.1 (gi3980118), GenBank 기탁 번호 AAH63599.1 (gi39794308), PIR 기탁 번호 S22902 (gi106540), PIR 기탁 번호 S42611 (gi631215), EMBL 기탁 번호 CAA38072.1 (gi433890), GenBank 기탁 번호 AAD00856.1 (gi4100384), EMBL 기탁 번호 CAA39072.1 (gi34000), PIR 기탁 번호 S23230(gi284256), DBJ 기탁 번호 BAC01599.1(gi21669149), DBJ 기탁 번호 BAC01729.1(gi21669409), DBJ 기탁 번호 BAC01562.1(gi21669075), EMBL 기탁 번호 CAA85590.1 (gi587338), GenBank 기탁 번호 AAQ99243.1 (gi37694665), GenBank 기탁 번호 AAK94811.1(gi18025604), EMBL 기탁 번호 CAB51297.1 (gi5578794), DBJ 기탁 번호 BAC01740.1 (gi21669431), 및 DBJ 기탁 번호 BAC01733.1 (gi21669417)를 포함한다. 다른 중쇄 어셉터 서열은 예를 들어, GenBank 기탁 번호 AAB35009.1(gi1O41885), DBJ 기탁 번호 BAC01904.1(gi21669789), GenBank 기탁 번호 AAD53816.1 (gi5834100), GenBank 기탁 번호 AAS86081.1 (gi46254223), DBJ 기탁 번호 BAC01462.1(gi21668870), GenBank 기탁 번호 AAC18191.1(gi3170773), DBJ 기탁 번호 BAC02266.1(gi21670513), GenBank 기탁 번호 AAD56254.1 (gi5921589), GenBank 기탁 번호 AAD53807.1 (gi5834082), DBJ 기탁 번호 BAC02260.1(gi21670501), GenBank 기탁 번호 AAC18166.1(gi3170723), EMBL 기탁 번호 CAA49495.1 (gi33085), PIR 기탁 번호 S31513 (gi345903), GenBank 기탁 번호 AAS86079. 1 (gi46254219), DBJ 기탁 번호 BAC01917.1 (gi21669815), DBJ 기탁 번호 BAC01912.1 (gi21669805), GenBank 기탁 번호 AAC18283.1 (gi3170961), DBJ 기탁 번호 BAC01903 (gi21669787), DBJ 기탁 번호 BAC01887.1 (gi21669755), DBJ 기탁 번호 BAC02259.1 (gi21370499), DBJ 기탁 번호 BAC01913.1 (gi21669807), DBJ 기탁 번호 BAC01910.1 (gi21669801), DJB 기탁 번호 BAC02267.1 (gi21670515), GenBank 기탁 번호 AAC18306.1 (gi3171011), GenBank 기탁 번호 AAD53817.1 (gi5834102), PIR 기탁 번호 E36005 (gi106423), EMBL CAB37129.1 (gi4456494) 및 GenBank AAA68892. 1 (gi186190)를 포함한다.

예시적인 구체예에서, 본 발명의 인간화 항체는 상기 열거된 어셉터 서열로부터의 12A11 CDR 및 FR을 포함한다. 여기서 개시된 CDR 형태 및/또는 활성에 중요한 골격 영역내의 잔기는 (만일 공여체와 어셉터 서열간에 상이하면) 역돌연변이를 위해 선택된다.

이어서 치환을 위한 잔기가 하기와 같이 선택된다. 아미노산이 12A11 가변 골격 영역과 등가의 인간 가변 골격 영역 사이에서 상이할 경우, 인간 골격 아미노산은 대개 그 아미노산이 (1) 항원에 직접 비공유적으로 결합하며, (2) CDR 영역에 이웃하거나, 상기의 초티아 등에 의해 제안된 다른 정의하에서 CDR 영역의 일부이거나, 또는 다르게는 CDR 영역과 상호작용하며(예, CDR 영역의 약 3 Å 이내), 또는 (3) VL-VH 계면에 참여하는 것이 합리적으로 예상될 경우 등가의 마우스 아미노산에 의해 치환되어야 한다.

12A11 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 구조적 분석 및 12A11 항체의 인간화가 실시예 V에 개시된다. 요약하면, 경쇄를 위한 해명된 쥐 항체 구조 1KTR을 위한 삼차원 모델 및 중쇄를 위한 1JRH 및 1ETZ의 삼차원 모델이 연구되었다. CDR 형태를 위해 중요한 잔기(예, 베르니에 잔기)의 확인을 위해 연구될 수 있는 다른 삼차원 모델은 경쇄를 위한 PDB 기탁 번호 2JEL (gi3212688), PDB 기탁 번호 1TET (gi494639), PDB 기탁 번호 IJP5 (gi16975307), PDB 기탁 번호 1CBV (gi493917), PDB 기탁 번호 2PCP (gi4388943), PDB 기탁 번호 1I9I (gi2050118), PDB 기탁 번호 1CLZ (gi1827926), PDB 기탁 번호 1FL6 (gi17942615) 및 PDB 기탁 번호 1KEL (gi 1942968) 그리고 중쇄를 위한 PDB 1GGI (gi442938), PDB 기탁 번호 1GGB (gi442934), PDB 기탁 번호 1N5Y (gi28373913), PDB 기탁 번호 2HMI (gi3891821), PDB 기탁 번호 1FDL (gi229915), PDB 기탁 번호 1KIP (gi1942788), PDB 기탁 번호 1KIQ (gi1942791) 및 PDB 기탁 번호 1VFA (gi576325)를 포함한다.

여기서 개시된 항체를 위한 삼차원 구조 정보는 예를 들어, 구조 생물정보 단백질 데이터 뱅크(PDB)를 위한 리서치 콜래보래토리로부터 이용할 수 있다. PDB는 월드 와이드 웹을 통해 자유롭게 접근할 수 있으며 Berman et al. (2000) Nucleic Acids Research, 28: 235에 의해 개시된다. 해명된 삼차원 구조의 연구는 12A11내의 CDR-상호작용 잔기의 확인을 허용한다. 다르게는, 12A11 VH 및 VL 쇄를 위한 삼차원 모델은 컴퓨터 모델링 소프트웨어를 이용하여 생성될 수 있다. 요약하면, 중쇄 및 경쇄를 위한 가장 밀접한 해명된 쥐 항체 구조를 기초로 삼차원 모델이 생성된다. 이 목적을 위하여, 1KTR이 12A11 경쇄를 모델링하기 위한 주형으로 이용될 수 있으며, 1ETZ 및 1JRH가 중쇄 모델링을 위한 주형으로 이용될 수 있다. 모델은 추가로 바람직하지 못한 원자 접촉을 경감시키고 정전기적 및 반데르발스 상호작용을 최적화하기 위해 에너지 최소화 단계에 의해 정제될 수 있다. 추가의 삼차원 분석 및/또는 모델링은 이들 해명된 쥐 구조와 각 12A11 쇄 사이의 유사성에 기초하여 경쇄를 위해 2JEL(2.5 Å) 및/또는 1TET(2.3 Å) 및 중쇄(또는 전술한 다른 항체)를 위해 1GGI(2.8 Å)를 이용하여 실시될 수 있다.

12A11의 구조의 컴퓨터 모델은 추가로 인간 골격 구조에서 치환된 12A11 상보성 결정 영역을 함유하는 항체의 삼차원 구조를 예측하기 위한 출발점으로 작용할 수 있다. 추가 아미노산 치환이 도입될 때 구조를 나타내는 추가의 모델이 구성될 수 있다.

일반적으로, 상기 기준을 충족하는 아미노산의 하나, 대부분 또는 모두의 치환이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 인간화된 항체는 선택된 위치 중 적어도 1,2,3 또는 그 이상에서 상응하는 12A11 잔기로 인간 경쇄 골격 잔기가 치환될 것이다. 인간화된 항체는 또한 대개 선택된 위치중 적어도 1,2,3 또는 그 이상에서 인간 중쇄 골격 잔기가 상응하는 12A11 잔기로 치환된다.

하지만, 때때로, 구체적인 아미노산이 상기 기준을 충족하는 지에 대해 명확하지 않을 수 있으며, 다른 변이체 면역글로불린이 생성되며, 그 중 하나는 상기 특정 치환을 가지며, 다른 것은 그렇지 않다. 쥐 잔기를 이용한 치환이 특정 위치에서 인간 면역글로불린에서 희귀한 잔기를 도입하는 경우에는, 상기 특정 치환이 있거나 없이 활성에 대해 항체를 시험하는 것이 바람직할 수도 있다. 만일 활성(예, 결합 친화성 및/또는 결합 특이성)이 치환이 있거나 없을 때 거의 동일하다면, 치환이 없는 항체가 바람직 할 수도 있으며, 이는 여기서 개시된 대로 HAMA 반응을 덜 유발할 것이다.

치환을 위한 다른 후보는 그 위치에서 인간 면역글로불린을 위해 특이한 어셉터 인간 골격 아미노산이다. 이들 아미노산은 보다 전형적인 인간 면역글로불린의 등가 위치로부터의 아미노산으로 치환될 수 있다. 다르게는, 마우스 12A11에서 등가 위치로부터의 아미노산은 그러한 아미노산이 등가 위치에서 인간 면역글로불린의 전형일 때 인간 골격 영역내로 도입될 수 있다.

치환을 위한 다른 후보는 골격 영역에서 발생하는 비생식세포 잔기이다. 공지의 생식세포 서열과 12A11을 컴퓨터에 의해 비교함으로써, 중쇄 또는 경쇄에 대해 최대의 서열 동일성을 갖는 생식세포 서열이 확인될 수 있다. 골격 영역과 생식세포 서열의 배열은 상응하는 생식세포 잔기로 치환하기 위해 어느 잔기가 선택될 수 있는지를 밝힐 것이다. 선택된 경쇄 어셉터 골격과 이들 생식세포 서열 중 하나 사이에 매치하지 않는 잔기는 상응하는 생식세포 잔기에 의한 치환을 위해 선택될 수도 있다.

희귀한 마우스 잔기는 공여체 VL 및/또는 VH 서열을 공여체 VL 및/또는 VH 서열이 속하는(카바트에 따라) 하위그룹 중 다른 구성원의 서열과 비교하고 컨센서스와 상이한 잔기 위치를 확인함으로써 확인된다. 이들 공여체 특이적 차이는 활성을 증가시키는 체세포 돌연변이를 나타낼 수 있다. 결합 부위에 인접한 특이한 또는 희귀한 잔기는 아마도 항원과 접촉할 수 있어, 마우스 잔기를 보유하는 것이 바람직하도록 한다. 하지만, 만일 특이한 마우스 잔기가 결합에 중요하지 않다면, 마우스 잔기는 인간화된 항체에서 면역원성 신에피토프를 생성할 수 있으므로 상응하는 어셉터 잔기의 사용이 바람직하다. 공여체 서열에서 특이한 잔기가 실제로 상응하는 어셉터 서열에서 일반적인 잔기인 경우, 바람직한 잔기는 명백히 어셉터 잔기이다.

표 1A는 12A11 VH 및 VL 영역의 서열 분석을 요약한다.

12A11 V 영역 서열의 요약

쇄	VL	VH
마우스 하위그룹	II	Ib
인간 하위그룹	II	II
마우스 vk에서 희귀 아미노산(% 빈도)	I85(3.6%)	I11(1.7%)
초티아 공인 부류	L1 : 부류 4[16f] L2 : 부류 1[7] L3 : 부류 1[9]	H1 : 부류 3[7] H2 : 부류 1[16] H31
가장 밀접한 마우스 MAb 해명 구조	1KTR2	1ETZ3(2.6Å) 및 1JRH4
모델링 주형과의 상동성	94%	83% 및 86%
인간 골격 서열	K64(BAC01733)(87% FR, 67% 전체)	M72(AAA69734)(61% FR, 45% 전체)
공여체 노트	12A11과 동일한 공인 구조 그룹으로부터의 Hu k LC 하위그룹 II CDR	12A11과 동일한 공인 구조 그룹으로부터의 HU HC 하위그룹 III CDR
역돌연변이 노트	없음	A24F, F29L : H1 R71K : 공인, H2 V371: 패킹 T28S, V48L, F67L, N73T, L78V : 베르니에
Hu Fr을 위한 생식세포 ref	A19 VL Vk2-28 mRNA : X63397.1 (GI:33774)	AAA69731.1 (GI:567123)

1 공인 부류 없지만 Shirai et al. (1999) FEBS Lett. 4 55 : 188-197의 규칙에 따라 꼬인 염기를 형성할 수 있음.

2 Kaufmann et al. (2002) J Mol Biol. 318: 135-147.

3 Guddat et al. (2000) J Mol Biol. 302: 853-872.

4 Sogabe et al. (1997) J MoI Biol. 273: 882-897.

아미노산 치환을 선택하는 데 이용될 수 있는 생식세포 서열이 개시된다.

여기서 개시된 항체를 위한 삼차원 구조 정보는 예를 들어, 구조 생물정보 단백질 데이터 뱅크(PDB)를 위한 리서치 콜래보래토리로부터 이용할 수 있다. PDB는 월드 와이드 웹인터넷을 통해 자유롭게 접근할 수 있으며 Berman et al. (2000) Nucleic Acids Research, 28: 235-242에 의해 개시된다. 여기서 참고된 생식세포 유전자 서열은 예를 들어 Igh, Ig 카파 및 Ig 람다 생식세포 V 유전자의 집합에서 국립 생물공학 정보 센터(NCBI)서열 데이터베이스로부터(국립 보건원(NIH)의 국립 의료 도서관(NLM)의 디비젼) 얻을 수 있다. NCBI "Ig 생식세포 유전자"의 상동성 조사는 IgG BLASTTM에 의해 제공된다.

예시적인 구체예에서, 본 발명의 인간화된 항체는 (i) 쥐 12A11 VL CDR 및 인간 어셉터 골격을 포함하는 가변 도메인을 포함하며, 상기 골격은 0,1,2,3,4,5,6,7,8,9 또는 그 이상의 잔기가 상응하는 12A11 잔기로 치환된 경쇄 및 (ii) 12A11 VH CDR 및 인간 어셉터 골격을 포함하며 상기 골격은 적어도 1,2,3,4,5,6,7,8,9 또는 그 이상의 잔기가 상응하는 12A11 잔기로 치환되며 선택적으로 적어도 하나, 바람직하게는 둘 또는 세 잔기가 상응하는 인간 생식세포 잔기로 치환된 중쇄를 함유한다.

다른 예시적인 구체예에서, 본 발명의 인간화된 항체는 (i) 쥐 12A11 VL CDR 및 인간 어셉터 골격을 포함하는 가변 도메인을 포함하며, 상기 골격은 적어도1,2,3,4,5,6,7,8,9 또는 그 이상의 잔기가 역돌연변이된(즉, 상응하는 12A11 잔기로 치환된)(이때 역돌연변이는 공인, 패킹 및/또는 베르니에 잔기에서 있음) 경쇄 및 (ii) 12A11 VH CDR 및 인간 어셉터 골격을 포함하며 상기 골격은 적어도 1,2,3,4,5,6,7,8,9 또는 그 이상의 잔기가 역돌연변이된(이때 역돌연변이는 공인, 패킹 및/또는 베르니에 잔기에서 있음) 중쇄를 함유한다. 일부 구체예에서, 역돌연변이는 패킹 및/또는 공인 잔기에서만 있거나 주로 공인 및/또는 패킹 잔기에서 있다(예, 공여체 및 어셉터 서열간에 상이한 베르니에 잔기 중 단지 1 또는 2 베르니에 잔기만이 역돌연변이됨).

다른 구체예에서, 인간화된 항체는 가능한 최소의 수의 역돌연변이를 포함하는 한편 공여체 항체(또는 그 키메라 버젼)에 견줄만한 결합 친화성을 보유한다. 그러한 버젼에 도달하기 위해, 다양한 조합의 역돌연변이를 제거할 수 있으며 생성된 항체를 효능(예, 결합 친화성)에 대해 시험한다. 예를 들어, 베르니에 잔기에서의 역돌연변이(예, 1, 2, 3 또는 4 역돌연변이)를 제거하거나 또는 베르니에와 패킹, 베르니에와 공인 또는 패킹과 공인 잔기의 조합에서의 역돌연변이를 제거할 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 인간화된 항체는 여기서 개시된 구조적 특징을 가지며, 추가로 하기 활성 중 적어도 하나(바람직하게는 둘, 셋, 넷 또는 모두)를 갖는다: (1) 가용성 Aβ에 결합; (2) 응집된 Aβ1-42에 결합(예, ELISA에 의해 결정); (3) 가용성 Aβ를 포획; (4) 플라크내의 Aβ에 결합(예, AD 및/또는 PDAPP 플라크의 염색); (5) 키메라 12A11(예, 쥐 가변 영역 서열 및 인간 불변 영역 서열을 갖는 12A11)보다 2-3배 이상 더 낮은 친화성으로 Aβ에 결합; (6) Aβ의 식균 작용을 매개(예, 여기서 개시된 대로 엑스 비보 식균작용 분석에서); 및 (7) 혈액-뇌 장벽을 가로지름(예, 예를 들어, 여기서 개시된 대로 PDAPP 동물 모델에서 단기 뇌 국소화를 입증함).

다른 구체예에서, 본 발명의 인간화된 항체는 여기서 개시된 구조적 특징을 가지며, 하기의 생체내 효과 중 적어도 하나를 유발하는 방식으로 또는 그에 충분한 친화성으로 Aβ에 결합한다: (1) Aβ 플라크 부담을 감소; (2) 플라크 형성 예방; (3) 가용성 Aβ의 수준을 감소; (4) 아밀로이드원성 장애와 관련된 신경염 병리학을 감소; (5) 아밀로이드원성 장애와 관련된 적어도 하나의 생리학적 증상을 감소 또는 완화; 및/또는 (6) 인지 기능을 개선.

다른 구체예에서, 본 발명의 인간화된 항체는 여기서 개시된 구조적 특징을 가지며, Aβ의 잔기 3-7을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 인간화된 항체는 여기서 개시된 구조적 특징을 가져, Aβ내의 N-말단 에피토프에 결합하며(예, Aβ의 아미노산 3-7내의 에피토프에 결합), (1) Aβ 펩티드 농도; (2) Aβ 플라크 부담; 및 (3) 아밀로이드원성 장애와 관련된 신경염 부담 또는 신경염 이상증을 감소시킬 수 있다.

전술한 활성은 여기서 개시되거나 공지된 다양한 분석 중 어느 하나(예, 결합 분석, 식균작용 분석 등)를 이용하여 결정할 수 있다. 활성은 생체내(예, 표지된 분석 성분 및/또는 영상화 기법을 이용) 또는 생체외(예, 개체로부터 유래된 샘플 또는 견본을 이용)에서 분석할 수 있다. 활성은 직접 또는 간접적으로 분석할 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 신경학적 엔드포인트(예, 아밀로이드 부담, 신경염 부담 등)을 분석한다. 그러한 엔드포인트는 비침입성 검출 방법을 이용하여 살아있는 개체(예, 알츠하이머 병의 동물 모델에서 또는 예를 들어 면역치료를 받고 있는 인간 에서)에서 분석할 수 있다. 다르게는, 그러한 엔드포인트는 사후 개체에서 분석할 수 있다. 동물 모델에서 및/또는 사후 인간 개체에서 그러한 엔드포인트의 분석은 유사한 면역치료 용례에서 이용될 다양한 제제(예, 인간화된 항체)의 효과를 평가하는 데 유용하다. 다른 바람직한 구체예에서, 행동 또는 신경학적 파라미터는 상기 신경병리학적 활성 또는 엔드포인트의 지표로서 평가될 수 있다.

3. 가변 영역의 생산

인간화된 면역글로불린의 CDR 및 골격 성분을 개념적으로 선택한 후, 그러한 면역글로불린을 생산하기 위해 다양한 방법이 이용가능하다. 일반적으로, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 쥐 상보성 결정 영역(CDR) 중 하나 이상이 프라이머계 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 인간화될 수 있어, 예를 들어 하나 이상의 인간 골격 영역에 놓일 수 있다. 요약하면, 인간 골격 영역과 중복하며 이와 어닐할 수 있는 서열을 함유하는 표적 쥐 CDR 영역(들)에 어닐할 수 있는 프라이머를 고안한다. 따라서, 적절한 조건하에서, 프라이머는 쥐 항체 주형 핵산으로부터 쥐 CDR을 증폭시킬 수 있으며 인간 골격 서열의 일부를 증폭된 주형에 첨가할 수 있다. 유사하게, 표적 인간 골격 영역에 어닐할 수 있는 프라이머를 고안할 수 있으며 이들 프라이머를 이용하는 PCR 반응은 인간 골격 영역이 증폭되도록 한다. 이어서 각 증폭 생성물이 변성되고, 결합되고, 다른 생성물에 어닐될 때, 증폭된 인간 골격 서열을 가진 중복하는 인간 골격 서열을 갖는 쥐 CDR 영역이 유전적으로 연결될 수 있다. 따라서, 하나 이상의 그러한 반응에서, 하나 이상의 쥐 CDR 영역이 개재된 인간 골격 영역에 유전적으로 연결될 수 있다.

일부 구체예에서, 프라이머는 또한 생성된 PCR 증폭된 서열을 더 큰 유전자 분절, 예를 들어 가변 경쇄 또는 중쇄 분절, 중쇄 또는 벡터내로 유전자 조작하는 것을 촉진하기 위해 바람직한 제한 효소 인식 서열을 포함할 수 있다. 또한, 쥐 CDR 영역 또는 인간 골격 영역을 증폭하기 위해 이용되는 프라이머는 바람직한 미스매치를 가져 상이한 코돈이 쥐 CDR 또는 인간 골격 영역내로 도입되도록 할 수도 있다. 전형적인 미스매치는 쥐 CDR의 구조적 배향을 보존하거나 개선하여 그 결합 친화성을 보존하거나 개선하는 인간 골격 영역에서의 변화를 도입한다.

전술한 방법이 하나, 둘 또는 셋 모두의 쥐 CDR 영역을 개재된 인간 골격 영역내로 도입하기 위해 이용될 수 있음이 이해되어야 한다. 프라이머계 PCR 을 이용하여 상이한 서열을 증폭하고 연결하는 방법은 예를 들어, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning :Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); DNA Cloning, Vols. 1 and 2, (D. N. Glover, Ed. 1985); PCR Handbook Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Beaucage, Ed. John Wiley & Sons (1999) (Editor); Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992)에 개시된다.

코드의 축퇴성때문에, 다양한 핵산 서열이 각 면역글로불린 아미노산 서열을 암호할 것이다. 원하는 핵산 서열은 드 노보(de novo) 고체상 DNA 합성에 의해 또는 원하는 폴리뉴클레오티드의 앞서 제조된 변이체의 PCR 돌연변이유발에 의해 생산될 수 있다. 올리고뉴클레오티드-매개 돌연변이유발은 표적 폴리펩티드 DNA의 치환, 결실 및 삽입 변이체를 제조하기 위해 바람직한 방법이다. Adelman et al., DNA 2: 183 (1983)를 참고한다. 요약하면, 표적 폴리펩티드 DNA는 원하는 돌연변이를 암호하는 올리고뉴클레오티드를 단일쇄 DNA 주형에 하이브리드시켜 변형된다. 하이브리드화 후, DNA 폴리머라제를 이용하여 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하며 표적 폴리펩티드 DNA에서 선택된 변화를 암호하는, 주형의 전체 두번째 상보성 쇄를 합성한다.

4. 불변 영역의 선택

전술한 대로 생산된 항체의 가변 분절(예, 키메라 또는 인간화된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역)은 일반적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc 영역)의 적어도 일부, 일반적으로 인간 면역글로불린의 일부에 연결된다. 인간 불변 영역 DNA 서열은 다양한 인간 세포로부터, 하지만 바람직하게는 불멸화된 B 세포로부터 공지의 과정에 따라 분리될 수 있다(상기 카바트 등 및 Liu et al., WO87/02671 참고)(각각은 전체가 참고로 본원에 포함된다). 보통, 항체는 경쇄 및 중쇄 불변 영역 모두를 함유할 것이다. 중쇄 불변 영역은 대개 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 CH4 영역을 포함한다. 여기서 개시된 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE 및 IgGI, IgG2, IgG3 및 IgG4를 비롯한 임의의 아이소타입을 비롯한 모든 타입의 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 항체(예, 인간화된 항체)가 세포독성 활성을 갖는 것이 바람직할 경우, 불변 도메인은 대개 보체 고정 불변 도메인이며 부류는 일반적으로 IgG1이다. 인간 아이소타입 IgG1이 바람직하다. 경쇄 불변 영역은 람다 또는 카파일 수 있다. 인간화된 항체는 하나보다 많은 부류 또는 아이소타입으로부터의 서열을 포함할 수 있다. 항체는 두 경쇄 및 두 중쇄를 함유하는 사량체로서, 별도의 중쇄, 경쇄로서, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv로서, 또는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 스페이서를 통해 연결된 단일쇄 항체로서 발현될 수 있다.

5. 재조합 항체의 발현

키메라 및 인간화된 항체는 일반적으로 재조합 발현에 의해 생산된다. 선택적으로 불변 영역에 연결된, 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 암호하는 핵산은 발현 벡터내로 삽입된다. 경쇄 및 중쇄는 동일하거나 상이한 발현 벡터에 클론될 수 있다. 면역글로불린 쇄를 암호하는 DNA 분절은 면역글로불린 폴리펩티드의 발현을 보장하는 발현 벡터에서 조절 서열에 작동적으로 연결된다. 발현 조절 서열은 프로모터(예, 자연적으로-연합된 또는 이종성 프로모터), 시그널 서열, 인핸서 요소, 및 전사 종결 서열을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 발현 조절 서열은 진핵 숙주 세포(예, COS 세포)를 형질전환시키거나 형질감염시킬 수 있는 벡터내의 진핵 프로모터 시스템이다. 일단 벡터가 적절한 숙주내로 통합되면, 숙주는 뉴클레오티드 서열의 고 수준 발현, 및 교차반응성 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건하에서 유지된다.

이들 발현 벡터는 일반적으로 에피좀으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 일부로서 숙주 유기체에서 복제가능하다. 일반적으로, 발현 벡터는 원하는 DNA 서열로 형질전환된 세포의 검출을 허용하기 위한 선택 마커(예, 암피실린-내성, 하이그로마이신-내성, 테트라사이클린 내성, 카나마이신 내성 또는 네오마이신 내성)을 함유한다(예, Itakura et al.의 미국 특허 제 4,704,362호 참고).

이.콜리는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(예, DNA 서열)을 클로닝하는 데 특히 유용한 하나의 원핵 숙주이다. 사용하기에 적합한 다른 미생물 숙주는 바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis)와 같은 바실러스, 및 살모넬라( Salmonella ), 세라티아( Serratia)와 같은 다른 엔테로박테리아, 및 다양한 슈도모나스( Pseudomouas ) 종을 포함한다. 이들 원핵 숙주에서는, 일반적으로 숙주 세포와 융화성인 발현 조절 서열(예, 복제 기원)을 함유하는 발현 벡터를 만들 수 있다. 또한, 락토스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파아지 람다로부터의 프로모터 시스템과 같은 다양한 공지의 프로모터가 존재할 것이다. 프로모터는 일반적으로 선택적으로 오퍼레이터 서열과 함께 발현을 조절할 것이며, 전사 및 번역을 개시하고 완결하기 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 갖는다.

효모와 같은 다른 미생물은 또한 발현에 유용하다. 사카로마이세스(Saccharomyces)는 발현 조절 서열(예, 프로모터), 복제 기원, 종결 서열 등을 필요에 따라 갖는 적합한 벡터와 함께 바람직한 효모 숙주이다. 일반적인 프로모터는 3-포스포글리서레이트 키나제 및 다른 당분해 효소를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는 다른 것들 중에서도 알콜 디하이드로게나제, 이소시토크롬 C, 및 말토스와 갈락토스 이용을 일으키는 효소로부터의 프로모터를 포함한다.

미생물에 더하여, 포유류 조직 세포 배양물 또한 본 발명의 폴리펩티드를(예, 면역글로불린 또는 그 단편을 암호하는 폴리뉴클레오티드) 발현하고 생산하기 위해 이용될 수 있다. Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N. Y. , N. Y. (1987)를 참고한다. 이종성 단백질(예, 본래의 면역글로불린)을 분비할 수 있는 많은 적합한 숙주 세포주가 당업계에서 개발되었기 때문에 진핵 세포가 사실상 바람직하며, CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, 바람직하게는 골수종 세포주, 또는 형질전환된 B-세포 또는 하이브리도마를 포함한다. 바람직하게는, 세포는 비인간성이다. 이들 세포를 위한 발현 벡터는 복제 기원, 프로모터, 및 인핸서(Queen et al., Immunol. Rev. 89: 49(1986))와 같은 발현 조절 서열, 및 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결 서열과 같은 필요한 프로세싱 정보 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 발현 조절 서열은 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 소 파필로마 바이러스, 사이토메갈로바이러스 등으로부터 유래된 프로모터이다. Co et al., J. Immunol. 148: 1149 (1992)를 참고한다.

다르게는, 항체-암호 서열은 형질전환 동물의 게놈내로의 도입 및 형질전환 동물의 우유에서의 발현을 위해 트랜스유전자내로 통합될 수 있다(예, Deboer et al., 미국 특허 제 5,741,957호, Rosen, 미국 특허 제5,304,489호, 및 Meade et al., 미국 특허 제5,849,992호 참고). 적합한 트랜스유전자는 카제인 또는 베타 락토글로불린과 같은 포유류 유선 특이적 유전자로부터의 프로모터와 인핸서에 작동적으로 연결된 경쇄 및/또는 중쇄를 위한 암호 서열을 포함한다.

다르게는, 본 발명의 항체(예, 인간화된 항체)는 형질전환 식물(예, 담배, 옥수수, 대두 및 알팔파)에서 생산될 수 있다. 개선된 "플랜티바디" 벡터(Hendy et al. (1999) J.Immunol. Methods 231: 137-146) 및 형질전환성 작물 종에서의 증가와 결합된 정제 전략은 인간 및 동물 치료를 위해서뿐만 아니라 산업적 용례를 위해서(예, 촉매 항체) 그러한 방법이 재조합 면역글로불린을 생산하는 실질적이고 효과적인 수단이도록 한다. 더욱이, 식물에서 생산된 항체는 안전하고 효과적인 것으로 나타났으며 동물-유래 물질의 사용 및 그에 따른 전염성 스폰지형태 뇌병증(TSE) 제제에 의한 오염의 위험을 피한다. 더욱이, 식물 및 포유류 세포-생산된 항체의 당화 패턴의 차이는 항원 결합 또는 특이성에 거의 또는 전혀 영향이 없다. 또한, 독성 또는 HAMA의 증거가 식물-유래 분비성 이량체 IgA 항체를 국소 경구 투여하는 환자에서 관찰되지 않았다(Larrick et al. (1998) Res. Immunol. 149:603-608).

형질전환 식물에서 재조합 항체를 발현하기 위해 다양한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 항체 중쇄 및 경쇄는 독립적으로 발현 벡터내로 클론되고(예, 아그로박테리움 투메파시엔스( Agrobacteriun tumefaciens) 벡터), 이어서 식물 조직을 생체외에서 재조합 박테리아로 형질전환시키거나 또는 예를 들어 벡터로 코팅되고 이어서 물리적으로 탄도학을 이용하여 식물 조직내로 도입되는 입자를 이용하여 직접 형질전환시킨다. 이어서, 개별 쇄를 발현하는 전체 식물을 재구성하고 이어서 그들을 유성 교배시켜 완전히 조립되고 기능적인 항체를 생산한다. 유사한 프로토콜이 담배 식물에서 기능성 항체를 발현시키기 위해 이용되었다(Hiatt et al. (1989) Nature 342: 76-87). 다양한 구체예에서, 시그널 서열은 적절한 식물 환경(예, 아포플라즘의 수성 환경 또는 덩이줄기, 과일 또는 종자를 비롯한 다른 특정 식물 조직)에 쇄를 보냄으로써 미조립 항체 쇄의 발현, 결합 및 접힘을 촉진하기 위해 이용될 수 있다(Fiedler et al. (1995) Bio Technology 13: 1090-1093). 식물 생물반응기 또한 항체 수율을 높이고 비용을 감소하기 위해 이용될 수 있다.

대상 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한 벡터(예, 경쇄 및 중쇄 암호 서열 및 발현 조절 서열)는 공지의 방법에 의해 숙주 세포내로 전달될 수 있으며, 방법은 세포 숙주의 타입에 따라 변한다. 예를 들어, 칼슘 클로라이드 형질감염은 원핵 세포를 위해 흔히 이용되는 한편, 칼슘 포스페이트 처리, 전기천공, 지질감염, 바이오리스틱스 또는 바이러스계 형질감염은 다른 세포 숙주를 위해 이용될 수 있다. (일반적으로 Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed. , 1989)를 참고)(참고로 전체가 본원에 포함됨). 포유류 세포를 형질전환하기 위해 이용되는 다른 방법은 폴리브렌의 사용, 원형질체 융합, 리포좀, 전기천공, 및 미세주사를 포함한다(일반적으로, 상기 Sambrook 등을 참고). 형질전환 동물의 생산을 위해서는, 트랜스유전자를 융합된 난모세포내로 미세주사하거나, 또는 배아 줄기 세포의 게놈내로 통합할 수 있으며, 그러한 세포의 핵은 핵이 제거된 난모세포내로 옮겨진다.

중쇄 및 경쇄가 별도의 발현 벡터내로 클론될 경우, 벡터는 본래 면역글로불린의 발현 및 조립을 위해 동시형질감염된다. 일단 발현되면, 전체 항체, 그들의 이량체, 개별 경쇄 및 중쇄, 또는 본 발명의 다른 면역글로불린 형태는 암모늄 설페이트 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, HPLC 정제, 젤 전기영동 등을 비롯한 당업계의 표준 과정에 따라 정제될 수 있다(일반적으로 Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N. Y. , (1982)) 참고). 적어도 약 90 내지 95% 균질성의 실질적으로 순수한 면역글로불린이 바람직하며, 98 내지 99% 또는 그 이상의 균질성이 약학적 사용을 위해 가장 바람직하다.

6. 항체 단편

항체 단편 또한 본 발명의 범위내에 고려된다. 한 구체예에서, 비인간, 및/또는 키메라 항체의 단편이 제공된다. 다른 구체예에서는, 인간화된 항체의 단편이 제공된다. 일반적으로, 이들 단편은 적어도 10⁷, 그리고 더욱 일반적으로는 10⁸ 또는 10⁹ M^-1의 친화성으로 항원에 특이적으로 결합한다. 인간화된 항체 단편은 별도의 중쇄, 경쇄, Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, 및 Fv를 포함한다. 단편은 재조합 DNA 기법에 의해 또는 본래 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 분리에 의해 생산된다.

7. 에피토프 맵핑

에피토프 맵핑은 Aβ의 어느 항원 결정인자 또는 에피토프가 항체에 의해 인식되는지를 결정하기 위해 실시할 수 있다. 한 구체예에서, 에피토프 맵핑은 리플레이스먼트 NET(rNET) 분석에 따라 실시된다. rNET 에피토프 맵 분석은 에피토프내의 개별 잔기가 항체의 전체 결합 활성에 기여하는 것에 대한 정보를 제공한다. rNET 분석은 합성된 체계적인 단일 치환된 펩티드 유사체를 이용한다. 시험될 항체의 결합이 천연 펩티드(천연 항원)에 대해 그리고 19개의 대안 "단일 치환된" 펩티드에 대해 결정되며, 각 펩티드는 그 위치를 위한 19개의 비-천연 아미노산 중 하나로 첫번째 위치에서 치환된다. 프로파일은 다양한 비천연 잔기에 의한 그 위치에서의 치환의 효과를 반영하여 생성된다. 프로파일은 항원성 펩티드를 따라 연속적인 위치에서 유사하게 생성된다. 결합된 프로파일, 또는 에피토프 맵(모든 19개 비천연 잔기에 의한 각 위치에서의 치환을 반영)을 이어서 두번째 항체에 대해 유사하게 생성된 맵에 비교할 수 있다. 실질적으로 유사하거나 동일한 맵은 비교되는 항체가 동일하거나 유사한 에피토프 특이성을 가짐을 나타낸다.

8. 동물 모델에서 치료 효능에 대한 항체의 시험

7-9개월 된 PDAPP 마우스의 그룹을 폴리클로날 항-Aβ 또는 특이적 항-Aβ 모노클로날 항체의 PBS중의 0.5 mg으로 주사한다. 모든 항체 제제는 낮은 내독소 수준으로 정제된다. 모노클로날은 Aβ의 단편 또는 더 긴 형태를 마우스내로 주사하고, 하이브리도마를 제조하고 Aβ의 다른 비중복 단편에는 결합하지 않고 Aβ의 원하는 단편에 특이적으로 결합하는 항체에 대해 하이브리도마를 스크리닝함에 의해 단편에 대해 제조될 수 있다.

마우스를 필요에 따라 4개월에 걸쳐 복강내 주사하여 ELISA 역가에 의해 측정할 때 Aβ42 또는 다른 면역원에 대한 ELISA에 의해 정의된 1/1000보다 큰 순환 항체 농도를 유지한다. 역가를 모니터하고 6개월 주사 후에 마우스를 안락사시킨다. 조직화학, Aβ 수준 및 독성학을 사후에 실시한다. 그룹 당 10마리의 마우스를 이용한다.

9. 소거 활성에 대한 항체의 스크리닝

본 발명은 또한 소거 활성이 필요한 아밀로이드 침전물 또는 임의의 다른 항원, 또는 관련 생물학적 실체를 소거하는 활성에 대해 항체를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 아밀로이드 침전물에 대한 활성을 스크린하기 위해, 알츠하이머병을 가진 환자 또는 특징적인 알츠하이머의 병리를 가진 동물 모델로부터의 조직 샘플을 미세아교 세포와 같은 Fc 어셉터를 보유한 식균작용 세포, 및 배지중의 시험되는 항체와 생체외에서 접촉시킨다. 식균작용 세포는 일차 배양물 또는 세포주일 수 있으며, 쥐과(예, BV-2 또는 C8-B4 세포) 또는 인간 기원(예, THP-1 세포)일 수 있다. 일부 방법에서, 성분들은 현미경 슬라이드상에서 합쳐져서 현미경 모니터링을 촉진한다. 일부 방법에서는, 미세적정 디쉬의 웰에서 다수의 반응을 병행 실시한다. 그러한 포맷에서, 별도의 소형 현미경 슬라이드를 별도의 웰에 탑재할 수 있으며, 또는 Aβ의 ELISA 검출과 같은 비현미경 검출 포맷을 이용할 수 있다. 바람직하게는, 반응 진행 전의 기본 값에서 시작하여, 생체외 반응 혼합물에서 아밀로이드 침전물의 양을 연속 측정하여 반응동안 하나 이상의 시험 값을 얻는다. 항원은 예를 들어 Aβ 또는 아밀로이드 플라크의 다른 성분에 대한 형광 표지된 항체로 염색하여 검출할 수 있다. 염색에 이용되는 항체는 소거 활성에 대해 시험되는 항체와 동일하거나 동일하지 않을 수 있다. 반응동안 아밀로이드 침전물의 기본에 비한 감소는 시험중인 항체가 소거 활성을 가짐을 나타낸다. 그러한 항체는 알츠하이머 및 다른 아밀로이드원성 질병을 예방 또는 치료하는 데 유용할 가능성이 높다. 알츠하이머 및 다른 아밀로이드원성 질병의 예방 또는 치료하기에 특히 유용한 항체는 빽빽한 아밀로이드 플라크 및 확산 아밀로이드 플라크 둘다를 소거할 수 있는 것을 포함하며, 예를 들어, 본 발명의 12A11 항체, 또는 그 키메라 또는 인간화 버젼을 포함한다.

다른 타입의 생물학적 실체를 소거하는 활성에 대해 항체를 스크린하기 위하여 유사한 방법을 이용할 수 있다. 분석은 사실상 임의의 종류의 생물학적 실체에 대한 소거 활성을 검출하기 위하여 이용할 수 있다. 일반적으로, 생물학적 실체는 인간 또는 동물 질병에서 일부 역할을 갖는다. 생물학적 실체는 조직 샘플로서 또는 분리된 형태로 제공될 수 있다. 만일 조직 샘플로서 제공된다면, 조직 샘플은 바람직하게는 조직 샘플의 성분에의 쉬운 접근을 허용하고 고정에 따르는 성분의 형태 교란을 피하기 위하여 고정되지 않는다. 이 분석에서 시험될 수 있는 조직 샘플의 예는 암성 조직, 전암 조직, 사마귀 또는 모반과 같은 양성 성장물을 함유하는 조직, 병원성 미생물로 감염된 조직, 염증성 세포로 침윤된 조직, 세포 사이에 병리학적 매트릭스를 보유한 조직(예, 섬유성 심장막염), 이상 항원을 보유한 조직, 및 상처 조직을 포함한다. 이용될 수 있는 분리된 생물학적 실체의 예는 Aβ, 바이러스 항원 또는 바이러스, 프로테오글리칸, 다른 병원성 미생물의 항원, 종양 항원, 및 부착 분자를 포함한다. 그러한 항원은 다른 수단중에서 천연 공급원으로부터, 재조합 발현 또는 화학적 합성으로 얻어질 수 있다. 조직 샘플 또는 분리된 생물학적 실체는 단핵구 또는 미세아교 세포와 같은 Fc 어셉터를 보유한 식균작용 세포, 및 배지중의 시험될 항체와 접촉된다. 항체는 시험중인 생물학적 실체 또는 그 실체와 관련된 항원에 대해 생성될 수 있다. 후자의 경우, 목적은 생물학적 실체가 항원으로 식균되는지를 시험하는 것이다. 대개, 반드시는 아니지만, 항체 및 생물학적 실체(때때로 항원과 연합됨)는 식균작용 세포를 첨가하기 전에 서로 접촉된다. 있다면, 배지에 남아있는 생물학적 실체 및/또는 관련 항원의 농도를 이어서 모니터한다. 배지중의 항원 또는 관련 생물학적 실체의 양 또는 농도의 감소는 항체가 식균작용 세포와 함께 항원 및/또는 연합된 생물학적 실체에 대해 소거 반응을 가짐을 나타낸다.

10. 변화된 효과인자 기능을 갖는 키메라 /인간화된 항체

불변 영역(Fc 영역)을 포함하는 본 발명의 전술한 항체의 경우, 분자의 효과인자 기능을 변화시키는 것이 바람직할 수 있다. 일반적으로, 항체의 효과인자 기능은 다양한 효과인자 분자, 예, 보체 단백질 또는 Fc 어셉터에의 결합을 매개할 수 있는 그 분자의 불변 즉 Fc 영역에 존재한다. Fc 영역에의 보체의 결합은 예를 들어, 세포 병원균의 옵소닌화 및 용혈 및 염증성 반응의 활성화에서 중요하다. 예를 들어, 효과인자 세포의 표면상의 Fc 어셉터에의 항체의 결합은 예를 들어, 항체-코팅된 병원균 또는 입자의 탐식 및 파괴, 면역 복합체의 소거, 킬러 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해(즉, 항체-의존성 세포-매개 세포독성, 또는 ADCC), 염증성 매개자의 방출, 항체의 태반 전이, 및 면역글로불린 생산의 조절을 비롯한 많은 중요하고 다양한 생물학적 반응을 야기할 수 있다.

따라서, 구체적인 치료 또는 진단 용례에 따라, 전술한 면역 기능, 또는 단지 선택된 면역 기능이 바람직할 수 있다. 항체의 Fc 영역을 변화시킴으로써, 면역 시스템의 다양한 반응을 증가 또는 억제하는 것을 비롯한 분자의 효과인자 기능의 다양한 태양이 진단 및 치료에서의 유익한 효과를 가지고 얻어진다.

일부 타입의 Fc 어셉터와만 반응하는 본 발명의 항체가 생산될 수 있으며, 예를들어, 본 발명의 항체는 단지 일부 Fc 어셉터에만 결합하거나 또는 원한다면 Fc 어셉터 결합이 전적으로 없도록, 항체의 Fc 영역에 위치한 Fc 어셉터 결합 부위의 결실 또는 변화에 의해 변화될 수 있다. 본 발명의 항체의 Fc 영역의 다른 바람직한 변화는 하기에 분류된다. 일반적으로 효과인자 기능에서 원하는 변화를 이루기 위해 (예, IgG 항체의)Fc 영역의 어느 아미노산 잔기가 변화되는지(예, 아미노산 치환에 의해)를 나타내기 위해 카바트 넘버링 시스템이 이용된다. 상기 넘버링 시스템은 또한 종간 항체 비교에 이용되어 예를 들어 마우스 항체에서 관찰된 원하는 효과인자 기능은 이어서 본 발명의 인간, 인간화된, 또는 키메라 항체내로 체계적으로 조작될 수 있다.

예를 들어, 항체(예, IgG 항체)는 Fc 어셉터(예, 인간 단핵구상의 Fc 어셉터(FcγRI))에 대해 단단한, 중간의, 또는 약한 결합을 나타내는 것으로 발견된 것들로 그룹지어질 수 있다. 이들 다른 친화성 그룹에서 아미노산 서열의 비교에 의해, 힌지-링크 영역(Leu234-Ser239)내의 단핵구-결합 부위가 확인되었다. 더욱이, 인간 FcγRI 어셉터는 단량체로서 인간 IgG1 및 마우스 IgG2a에 결합하지만, 마우스 IgG2b의 결합은 100배 약하다. 힌지-링크 영역에서 이들 단백질의 서열의 비교는 강한 결합체내의 서열 234 내지 238, 즉, Leu-Leu-Gly-Gly-Pro (서열 번호 32)가 마우스 감마 2b, 즉 약한 결합체에서는 Leu-Glu-Gly-Gly-Pro (서열 번호 33)이 됨을 나타낸다. 따라서, 인간 항체 힌지 서열에서의 상응하는 변화는 만일 감소된 FcγI 어셉터 결합이 필요하면 만들어질 수 있다. 동일하거나 유사한 결과를 이루기 위해 다른 변화를 만들 수 있음이 이해된다. 예를 들어, FcγRI 결합의 친화성은 특정 잔기를 그 측쇄상에 부적절한 기능기를 갖는 잔기로 대체함으로써, 또는 하전된 기능기(예, Glu 또는 Asp) 또는 예를 들어 방향족 비극성 잔기(예, Phe, Tyr, 또는 Trp)를 도입함에 의해 변화될 수 있다.

이들 변화는 상이한 면역글로불린 사이의 서열 상동성이 주어지면 쥐, 인간 및 래트 시스템에 동등하게 적용될 수 있다. 인간 FcγRI 어셉터에 결합하는 인간 IgG3의 경우, Leu235를 Glu로 변화시키면 어셉터에 대한 돌연변이의 상호작용을 파괴한다. 따라서 이 어셉터를 위한 결합 부위는 적절한 돌연변이를 만들므로써 켜지거나 꺼질 수 있다.

힌지 링크 영역에서 이웃하거나 가까운 부위의 돌연변이(예, 잔기 234, 236 또는 237을 Ala로 대체함)는 잔기 234, 235, 236 및 237에서의 변화가 적어도 FcγRI 어셉터에 대한 친화성에 영향을 줌을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 항체는 또한 변형되지 않은 항체와 비교하여 FcγRI에 대해 변형된 결합 친화성을 갖는 변화된 Fc 영역을 가질 수 있다. 그러한 항체는 편리하게 아미노산 잔기 234, 235,236 또는 237에서 변형을 갖는다.

다른 Fc 어셉터에 대한 친화성은 다른 방식으로 면역 반응을 조절하기 위해, 유사한 방법에 의해 변화될 수 있다.

추가의 예로서, 보체의 C1 성분의 결합에 이은 IgG 항체의 용해 특성이 변화될 수 있다.

보체 시스템의 첫번째 성분, C1은 서로 단단하게 결합하는, C1q, C1r, 및 C1s로 알려진 세 단백질을 포함한다. C1q는 세 단백질 복합체가 항체에 결합하도록 하는 것으로 알려져 있다.

따라서, 항체의 C1q 결합 활성은 중쇄의 아미노산 잔기 318, 320, 및 322 중 적어도 하나가 다른 측쇄를 갖는 잔기로 변화된 변형 CH2 도메인을 갖는 항체를 제공함으로써 변화될 수 있다. 중쇄에서 잔기의 번호매김은 EU 인덱스의 번호매김이다(상기 카바트 등 참고). 항체에의 특이적인 C1q-결합을 변화, 예, 감소 또는 폐지하기 위한 다른 적합한 변화는 잔기 318(Glu), 320(Lys) 및 322(Lys) 중 하나의 Ala로의 변화를 포함한다.

더욱이, 이들 잔기에서 돌연변이를 만들므로써, C1q 결합은, 잔기 318이 수소결합 측쇄를 가지며 잔기 320과 322 둘다가 양성 하전된 측쇄를 갖기만 하면 보유되는 것으로 나타났다.

C1q 결합 활성은 세 개의 특정 잔기 중 하나를 그 측쇄상에 부적절한 기능기를 갖는 잔기로 치환함으로써 폐지될 수 있다. C1q 결합을 폐지하기 위해 이온성 잔기를 Ala만으로 치환할 필요는 없다. 또한 Gly, Ile, Leu, 또는 Val과 같은 다른 알킬-치환된 비이온성 잔기, 또는 Phe, Tyr, Trp 및 Pro와 같은 방향족 비극성 잔기를 C1q 결합을 없애기 위하여 세 잔기 중 어느 하나 대신 이용하는 것 또한 가능하다. 또한, Ser, Thr, Cys 및 Met와 같은 극성 비이온성 잔기를 C1q 결합 활성을 없애기 위하여 잔기 320과 322 대신에(318은 아님) 사용하는 것 또한 가능하다.

이온성 또는 비이온성 극성 잔기상의 측쇄가 Glu 잔기에 의해 형성된 결합과 유사한 방식으로 수소 결합을 형성할 수 있을 것임이 주목된다. 따라서, 극성 잔기에 의한 318(Glu) 잔기의 치환은 C1q 결합 활성을 변형시키지만 없애지는 않을 수도 있다.

잔기 297(Asn)를 Ala로 치환하면 용해 활성을 제거시키는 한편 C1q에 대한 친화성을 약간 감소(약 3배 약함)시키는 것이 알려져 있다. 이 변화는 당화 부위 및 보체 활성화에 필요한 탄수화물의 존재를 파괴한다. 이 부위에서의 임의의 다른 치환은 또한 당화 부위를 파괴할 것이다.

본 발명은 또한 변화된 효과인자 기능을 갖는 항체를 제공하며 이때 항체는 변화된 힌지 영역을 갖는다. 변형된 힌지 영역은 CH1 도메인과 다른 항체 부류 또는 하위부류의 항체로부터 유래된 완전한 힌지 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 부류 IgG 항체의 불변 도메인(CH1)은 부류 IgG4 항체의 힌지 영역에 부착될 수 있다. 다르게는, 새로운 힌지 영역은 천연 힌지의 일부 또는 반복 단위를 포함할 수 있으며 이때 반복되는 각 단위는 천연 힌지 영역에서 유래한다. 한 실시예에서, 천연 힌지 영역은 하나 이상의 시스테인 잔기를 알라닌과 같은 중성 잔기로 전환하거나, 또는 적합하게 위치된 잔기를 시스테인 잔기로 전환시켜 변화된다. 그러한 변화는 공지된 단백질 화학 및 바람직하게는 여기서 개시된 유전자 조작 기법을 이용하여 실시된다.

본 발명의 한 구체예에서, 항체의 힌지 영역에서의 시스테인 잔기의 수는 예를 들어, 하나의 시스테인 잔기로 감소된다. 이 변형은 항체, 예를 들어, 이특이성 항체 분자 및 Fc 부분이 효과인자 또는 리포터 분자에 의해 치환된 항체 분자의 조립을 촉진하는 효과를 가지며, 이는 단일 이황화 결합을 형성하는 것만이 필요하기 때문이다. 이 변형은 또한 힌지 영역을 다른 힌지 영역에 또는 효과인자 또는 리포터 분자에 직접 또는 간접적으로, 예를 들어, 화학적 수단에 의해, 부착하기 위한 특이적 표적을 제공한다.

역으로, 항체의 힌지 영역에서의 시스테인 잔기의 수는 예를 들어 정상적으로 발생하는 시스테인 잔기의 수보다 적어도 하나 더 많게 증가된다. 시스테인 잔기의 수의 증가는 이웃한 힌지 사이의 상호작용을 안정화시키기 위해 이용될 수 있다. 이 변형의 다른 효과는 그것이 효과인자 또는 리포터 분자를 변형된 항체, 예를 들어, 방사성표지에 부착하기 위한 시스테인 티올 기의 이용을 촉진하는 것이다.

따라서, 본 발명은 항체 부류, 특히 IgG 부류 사이의 힌지 영역의 교환, 및/또는 힌지 영역에서 시스테인 잔기의 수의 증가 또는 감소를 제공하여 효과인자 기능 변화를 이룬다(예를 들어, 본원에 포함되는 미국 특허 제5,677,425호 참고). 변형된 항체 효과인자 기능의 결정은 여기서 개시된 분석 또는 다른 공지의 기법을 이용하여 이루어진다.

중요하게도, 생성된 항체는 출발 항체에 비하여 생물학적 활성의 변화를 평가하기 위하여 하나 이상의 분석이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 변화된 Fc 영역을 갖는 항체가 보체 또는 Fc 어셉터에 결합하는 능력은 공지의 분석 및 여기서 개시된 분석을 이용하여 평가할 수 있다.

본 발명의 항체의 생산은 여기서 개시된 기법 및 공지의 기법을 비롯한 임의의 적합한 기법에 의해 실시된다. 예를 들어, 항체의 관련 불변 도메인, 예, Fc 영역, 즉, CH2 및/또는 CH3 도메인의 일부 또는 모두를 형성하며 적절하게 변형된 잔기를 포함하는 적절한 단백질 서열이 합성될 수 있으며 이어서 항체 분자내의 적절한 위치내로 화학적으로 연결될 수 있다.

바람직하게는, 유전자 조작 기법이 변형된 항체를 생산하기 위해 이용된다. 바람직한 기법은 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 사용하기 위한 적합한 프라이머를 제조하여 IgG 중쇄의 적어도 일부, 예, Fc 또는 불변 영역(예, CH2 및/또는 CH3)을 암호하는 DNA 서열이 하나 이상의 잔기에서 변화되도록 하는 것을 포함한다. 이어서 상기 분절은 항체의 나머지 부분, 예를 들어 항체의 가변 영역 및 세포에서의 발현에 필요한 조절 요소에 작동적으로 연결될 수 있다.

본 발명은 또한 세포주를 형질전환시키기 위해 이용되는 벡터, 형질전환 벡터를 생산하는 데 사용되는 벡터, 형질전환 벡터로 형질전환된 세포주, 제조성 벡터로 형질전환된 세포주, 및 그 생산 방법을 포함한다.

바람직하게는, 변형된 Fc 영역(즉, 변형된 효과인자 기능)을 갖는 항체를 생산하기 위해 형질전환되는 세포주는 불멸화된 포유류 세포주이다(예, CHO 세포).

변형된 Fc 영역을 갖는 항체를 생산하기 위해 이용되는 세포주는 바람직하게는 포유류 세포주이지만, 박테리아 세포주 또는 효모 세포주와 같은 임의의 다른 적합한 세포주가 대신 이용될 수도 있다.

11. 친화성 성숙

본 발명의 항체(예, 인간화된 항체)는 많은 친화성 성숙 기법 중 임의의 것을 이용하여 기능 개선을 위해 변형될 수 있다. 일반적으로, 주어진 표적 분자에 대해 결합 친화성을 갖는 후보 분자가 확인되고 이어서 추가로 돌연변이유발 기법을 이용하여 개선되거나 "성숙"되어 표적 분자와 보다 바람직한 결합 상호작용을 갖는 하나 이상의 관련 후보가 얻어진다. 일반적으로, 변형되는 것은 항체의 친화성이지만(또는 친화력, 즉 표적 항원에 대한 항체의 결합된 친화성), 안정성, 효과인자 기능, 소거, 분비, 또는 수송 기능과 같은 분자의 다른 특성 또한 별도로 또는 친화성과 함께 친화성 성숙 기법을 이용하여 변형될 수도 있다.

예시적인 구체예에서, 항체(예, 본 발명의 인간화된 항체)의 친화성이 증가된다. 예를 들어, 적어도 10⁷ M^-1, 10^-8 M^-1, 또는 10⁹ M^{- 1} 의 결합 친화성을 갖는 항체가 성숙되어 그들의 친화성은 적어도 10⁹ M^-1, 10¹⁰ M^-1, 또는 10¹² M^-1 가 된다.

결합 분자를 친화성 성숙시키기 위한 한 가지 방법은 원하는 변화 또는 변화들을 암호하는 결합 분자 또는 그 일부를 암호하는 핵산을 합성하는 것이다. 올리고뉴클레오티드 합성은 공지되어 있으며 임의의 원하는 코돈 변화를 갖는 핵산 하나 이상을 생산하기 위해 쉽게 자동화된다. 제한 부위, 침묵 돌연변이, 및 선호 코돈 사용 또한 이 방식으로 도입될 수 있다. 다르게는, 하나 이상의 코돈이 특정 아미노산의 서브세트, 예를 들어, 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 배제하며 한정된 영역, 예, CDR 영역 또는 그 일부에 제한되는 서브세트를 나타내기 위해 변형될 수 있다. 다르게는, 상기 영역은 부분적으로 또는 전체적으로 임의의 세트의 아미노산에 의해 나타내질 수도 있다(추가적인 상세사항을 위해서는, 예를 들어, 미국 특허 제5,830,650호; 제5,798,208호; 제5,824,514호; 제5,817,483호; 제5,814,476호; 제5,723,323호; 제4,528,266호; 제4,359,53호; 제5,840,479호; 및 제5,869,644호를 참고).

상기 접근법은 부분적으로 또는 완전히 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 실시될 수 있으며, 이 반응은 공지되어 있으며 올리고뉴클레오티드, 예, 원하는 변화를 갖는 프라이머 또는 단일쇄 핵산을 이중쇄 핵산내로 그리고 유전자 조작과 같은 다른 조작에 적합한 증폭된 양으로 적절한 발현 또는 클로닝 벡터내로 포함시킬 수 있는 이점을 갖는다. 그러한 PCR은 또한 뉴클레오티드가 잘못 포함되도록 하는 조건하에서 실시되어 증폭되는 핵산 내로 추가의 변이성을 도입할 수 있다. PCR 및 관련 키트를 실시하는 실험적 상세사항, 시약, 및 프라이머 고안은 예를 들어, 미국 특허 제4,683,202호, 제4,683,195호, 제6,040,166호, 및 제6,096,551호에서 찾을 수 있다. 프라이머계 PCR을 이용하여 항체 골격 영역내로 CDR 영역을 도입하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,858,725호에 개시된다. 더 큰 항체 분자 세트와의 서열 상동성을 찾을 수 있어 더 크고 다양한 항체 분자 세트가 효율적으로 증폭될 수 있는 프라이머의 최소 세트를 이용하는 항체 라이브러리의 프라이머계 PCR 증폭의 방법(및 그 방법에 따라 만들어진 라이브러리)이 예를 들어, 미국 특허 제5,780,225호, 제6,303,313호 및 제6,479,243호에 개시된다. 부위 지시된 돌연변이유발을 실시하는 비 PCR-계 방법이 또한 이용될 수 있으며, 단일쇄 우라실 함유 주형 및 이.콜리의 특정 균주를 통과시킬 때 하이브리드하여 돌연변이를 도입하는 "컨켈(kunkel)" 돌연변이유발을 포함한다(예, 미국 특허 제4,873,192호 참고).

항체 서열 또는 그 일부를 변화시키기 위한 추가의 방법은 적절하지 못한(즉, 에러-프론) 조건하에서의 핵산 합성 또는 핵산의 PCR, 그러한 핵산의 변성 및 재생(어닐링), 엑소뉴클레아제 및/또는 엔도뉴클레아제 분해 및 이어서 결찰 또는 PCR에 의한 재조립(핵산 셔플링), 또는 전술한 기법 중 하나 이상의 조합을 포함하며 이들은 예를 들어, 미국 특허 제6,440,668호; 제6,238,884호 ; 제6,171,820호; 제5,965,408호; 제6,361,974호; 제6,358,709호; 제6,352,842호; 제4,888,286호; 제6,337,186호; 제6,165,793호 ; 제6,132,970호; 제6,117,679호; 제5,830,721호; 및 제5,605,793호에 개시된다.

일부 구체예에서, 후보 항체 분자의 일부 부분에서, 예를 들어, 하나 이상의 CDR 영역(또는 그 일부), 하나 이상의 골격 영역 및/또는 하나 이상의 불변 영역(예, 효과인자 기능을 갖는 불변 영역)에서 다양성을 갖는 후보 항체 분자 패밀리를 포함하는 항체 라이브러리(또는 친화성 성숙 라이브러리)를 발현시킬 수 있으며 공지의 기법을 이용하여 원하는 특성에 대하여 스크린할 수 있다(예, 미국 특허 제6,291,161호, 제6,291,160호, 제6,291,159호, 및 제6,291,158호 참고). 예를 들어, CDR3 서열의 다양성을 갖는 항체 가변 도메인의 발현 라이브러리, 및 다양한 CDR3 서열을 도입, 돌연변이유발함에 의해 다양한 CDR3 서열을 갖는 인간 항체 라이브러리를 생산하고 라이브러리를 회수하는 방법을 구성할 수 있다(예, 미국 특허 제6,248,516호).

마지막으로, 친화성 성숙된 항체를 발현시키기 위해, 후보 항체 분자를 암호하는 핵산을 적절한 발현 포맷으로, 예를 들어, 전길이 항체 중쇄 및 경쇄(예, IgG)로서, 항체 Fab 단편으로서(예, Fab, F(ab')2), 또는 단일쇄 항체(scFv)로서 표준 벡터 및 세포 형질감염/형질전환 기법을 이용하여 세포내로 도입할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,331,415호; 제6,103,889호 ; 제5,260,203호; 제5,258, 498호; 및 제4,946,778호).

B. 면역 제제 및 치료 제제를 암호하는 핵산

아밀로이드 침전물에 대한 면역 반응은 또한 수동 면역을 위해 이용되는 항체 및 그들의 성분 쇄를 암호하는 핵산의 투여에 의해 유도될 수 있다. 그러한 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 면역원을 암호하는 핵산 분절은 일반적으로 환자의 의도한 표적 세포에서 DNA 분절의 발현을 허용하는 프로모터와 인핸서와 같은 조절 요소에 연결된다. 면역 반응의 유도에 바람직한 것처럼, 혈액 세포에서의 발현의 경우, 예시적인 프로모터 및 인핸서 요소는 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 유전자로부터의 것 및/또는 CMV 주요 중간 초기 프로모터 및 인핸서를 포함한다(Stinski, 미국 특허 제 5,168,062호 및 제5,385,839호). 연결된 조절 요소 및 암호 서열은 종종 벡터내로 클론된다. 이중쇄 항체의 투여의 경우, 두 쇄는 동일한 벡터 또는 별도의 벡터내로 클론될 수 있다.

레트로바이러스 시스템(예, Lawrie and Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109 (1993) 참고), 아데노바이러스 벡터(예, Bett et al., J. Virol. 67: 5911 (1993) 참고), 아데노-연합 바이러스 벡터(예, Zhou et al., J. Exp.Med. 179: 1867 (1994) 참고), 백시니아 바이러스 및 조류 농포성 피부병 바이러스를 비롯한 농포성 피부병 패밀리로부터의 바이러스 벡터, 신드비스(Sindbis) 및 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스로부터 유래한 것과 같은 알파 바이러스 속으로부터의 바이러스 벡터(예, Dubensky et al., J.Virol. 70:508 (1996) 참고), 베네주엘라 말 뇌염 바이러스(Johnston et al., 미국 특허 제5,643,576호) 및 소낭 구내염 바이러스(Rose, 미국 특허 제6,168,943호) 및 파필로마바이러스(Ohe et al., Human Gene Therapy 6: 325 (1995); Woo et al., WO 94/12629호 및 Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24,2630-2622(1996))와 같은 랍도바이러스를 비롯한 많은 바이러스 벡터 시스템이 이용가능하다.

면역원을 암호하는 DNA, 또는 이를 함유하는 벡터는 리포좀내로 패키징될 수 있다. 적합한 지질 및 관련 유사체는 Eppstein et al., 미국특허 제5,208,036호, Felgner et al., 미국 특허 제5,264,618호, Rose, 미국 특허 제5,279,833호 및 Epand et al., 미국 특허 제5,283,185호에 의해 개시된다. 벡터 및 면역원을 암호하는 DNA는 또한 입자성 담체에 흡착되거나 연합될 수 있으며, 그 예는 폴리메틸 메타크릴레이트 중합체 및 폴리락티드 및 폴리(락티드-공-글리콜라이드)를 포함하며, 예를 들어, McGee et al., J. Micro Encap. (1996)를 참고한다.

유전자 치료 벡터 또는 천연 폴리펩티드(예, DNA)는 일반적으로 전신 투여(예, 정맥내, 복강내, 비강, 위장관, 진피내, 근육내, 피하, 또는 두개내 주입) 또는 국소 인가(예, Anderson et al., 미국 특허 제5,399,346호)에 의해 개별 환자에 투여되어 생체내로 전달될 수 있다. 용어 "천연(naked) 폴리뉴클레오티드"는 형질감염 촉진 제제와 연합되어 전달되지 않는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 천연 폴리뉴클레오티드는 때때로 플라스미드 벡터에 클론된다. 그러한 벡터는 추가로 부피바케인과 같은 촉진 제제를 포함할 수 있다(Weiner et al., 미국 특허 제5,593,972호). DNA는 또한 유전자 총을 이용하여 투여될 수 있다. 상기한 Xiao & Brandsma 참고. 면역원을 암호하는 DNA는 미세 금속 비드의 표면상에 침전된다. 마이크로프로젝타일은 충격파 또는 확장성 헬륨 가스로 가속되며, 몇몇 세포층의 깊이까지 조직을 침투한다. 예를 들어, 와이오밍주의 미들톤에 소재하는 아그리세투스 인코포레이티드에 의해 제조된 Accel^TM Gene Delivery Device가 적합하다. 다르게는, 천연 DNA는 화학적 또는 기계적 자극을 이용하여 피부상에 DNA를 점적함으로써 간단하게 피부를 통과하여 혈류내로 통과할 수 있다(Howell et al., WO 95/05853호 참고).

추가의 변형에서, 면역원을 암호하는 벡터는 개별 환자로부터 외삽된 세포(예, 림프구, 골수 흡입물, 조직 생검) 또는 유니버설 공여체 조혈 줄기 세포와 같은 세포로 엑스 비보로 전달되고, 이어서 대개 벡터를 포함하는 세포의 선별 후 세포가 환자내로 재이식된다.

II . 예방 및 치료 방법

본 발명은 특히 Aβ내의 특이적 에피토프에 대한 치료적 면역 시약(예, 인간화된 면역글로불린)을 예를 들어, 아밀로이드원성 질병의 예방 또는 치료를 위해, 환자에서 유익한 치료 반응(예, Aβ의 식균작용의 유도, 플라크 부담의 감소, 플라크 형성의 억제, 신경염 이상증의 감소, 인지 기능의 개선, 및/또는 인지 쇠퇴의 역전, 치료 또는 예방)을 생성하는 조건하에서 환자에게 투여함으로써 알츠하이머 및 다른 아밀로이드원성 질병을 치료하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 아밀로이드원성 질병의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에서 개시된 면역학적 시약(예, 인간화된 면역글로불린)의 용도에 관한 것이다.

한 태양에서, 본 발명은 환자의 뇌에서 Aβ의 아밀로이드 침전물과 연합된 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 그러한 질병은 알츠하이머 병, 다운 증후군 및 인지 손상을 포함한다. 후자는 아밀로이드원성 질병의 다른 특성을 갖거나 갖지 않고 발생할 수 있다. 본 발명의 일부 방법은 아밀로이드 침전물의 성분에 특이적으로 결합하는 항체의 유효량을 환자에 투여하는 것을 포함한다. 그러한 방법은 인간 환자에서 알츠하이머 병을 예방하거나 치료하는 데 특히 유용하다. 예시적인 방법은 Aβ에 결합하는 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 방법은 Aβ의 잔기 1-10내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어, Aβ의 잔기 1-3내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, Aβ의 잔기 1-4내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, Aβ의 잔기 1-5내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, Aβ의 잔기 1-6내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, Aβ의 잔기 1-7내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 Aβ의 잔기 3-7내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 Aβ의 자유 N-말단 잔기를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체를 투여하는 것을 특징으로 한다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 Aβ의 잔기 1-10내의 에피토프에 결합하는 항체를 투여하는 것을 특징으로 하며 이때 Aβ의 잔기 1 및/또는 잔기 7은 아스파르트산이다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 전길이 아밀로이드 전구체 단백질(APP)에 결합하지 않고 Aβ 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 투여하는 것을 특징으로 한다. 또 다른 태양에서, 항체의 아이소타입은 인간 IgG1이다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 환자의 아밀로이드 침전물에 결합하여 아밀로이드 침전물에 대한 소거 반응을 유도하는 항체를 투여하는 것을 특징으로 한다. 예를 들어, 그러한 소거 반응은 Fc 어셉터 매개 식균작용에 의해 이루어질 수 있다.

본 발명의 치료제는 일반적으로 원치않는 오염물로부터 실질적으로 순수하다. 이것은 제제가 일반적으로 적어도 약 50% w/w(중량/중량) 순수하며, 실질적으로 간섭 단백질 및 오염물이 없음을 의미한다. 때때로 제제는 적어도 약 80% w/w, 더욱 바람직하게는 적어도 90 또는 약 95% w/w 순수하다. 하지만, 종래의 단백질 정제 기법을 이용하여 적어도 99% w/w 순수한 균질한 펩티드를 얻을 수 있다.

상기 방법은 증상이 없는 환자 및 현재 질병의 증상을 나타내는 환자 모두에서 사용될 수 있다. 그러한 방법에 사용되는 항체는 인간, 인간화, 키메라 또는 비인간 항체, 또는 그 단편(예, 항원 결합 단편)일 수 있으며 여기서 개시된 대로 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 Aβ 펩티드로 면역된 인간으로부터 제조된 항체를 투여하는 것을 특징으로 하며, 상기 인간은 항체로 치료될 환자일 수 있다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 약학적 담체와 함께 항체를 약학 조성물로서 투여하는 것을 특징으로 한다. 다르게는, 항체는 적어도 하나의 항체 쇄를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 투여함에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 환자에서 항체 쇄를 생산하기 위해 발현된다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호한다. 폴리뉴클레오티드는 환자에서 중쇄 및 경쇄를 생산하기 위해 발현된다. 예시적인 구체예에서, 환자는 환자의 혈액내의 투여된 항체의 수준에 대해 모니터된다.

본 발명은 따라서 신경병증 및 일부 환자에서는 알츠하이머 병과 관련된 인지 손상을 예방 또는 완화하기 위한 치료 요법에 대한 오랜동안의 필요를 충족한다.

A. 치료를 받을 수 있는 환자

치료를 받을 수 있는 환자는 질병의 위험의 있으나 증상을 나타내지 않는 개인 및 현재 증상을 나타내는 환자를 포함한다. 알츠하이머 병의 경우, 사실상 누구든지 오래 산다면 알츠하이머 병을 앓을 위험이 있다. 따라서, 본 방법은 대상 환자의 위험의 평가가 필요없이 일반 집단에 예방적으로 투여될 수 있다. 본 방법은 특히 알츠하이머 병의 유전적 위험을 가진 개체에 유용하다. 그러한 개인은 이 병을 경험한 친척을 가진 인간들, 및 유전적 또는 생화학적 마커의 분석에 의해 위험이 결정된 인간들을 포함한다. 알츠하이머 병에 대한 위험의 유전적 마커는 APP 유전자의 돌연변이, 특히 각각 하디 및 스웨디시 돌연변이로 불리는 위치 717 및 위치 670과 671에서의 돌연변이를 포함한다(상기한 Hardy 참고). 위험의 다른 마커는 프리세닐린 유전자, PS1과 PS2, 및 ApoE4의 돌연변이, AD의 가족력, 고콜레스테롤혈증 또는 아테롬성경화증이다. 현재 알츠하이머 병을 앓고 있는 개인은 특징적인 치매 및 전술한 위험 인자의 존재로부터 인식될 수 있다. 또한, AD를 가진 개인을 확인하기 위한 많은 진단 시험이 이용가능하다. 이들은 CSF tau 및 Aβ42 수준의 측정을 포함한다. 증가된 tau 및 감소된 Aβ42 수준은 AD의 존재를 의미한다. 알츠하이머 병을 앓고 있는 개인은 또한 실시예 부분에서 개시되는 ADRDA 기준에 의해 진단될 수 있다.

증상이 없는 환자의 경우, 치료는 임의의 연령에 시작할 수 있다(예, 10, 20, 30). 하지만, 대개 환자가 40, 50, 60 또는 70이 될 때까지는 치료를 시작할 필요가 없다. 치료는 일반적으로 일정 기간동안 여러번 투여하는 것에 관련된다. 치료는 시간에 따른 항체 수준을 분석함으로써 모니터될 수 있다. 반응이 떨어지면, 부스터 투여량이 표시된다. 잠재적인 다운 증후군 환자의 경우, 치료는 엄마에게 또는 출생 직후에 치료제를 투여함으로써 출생전에 시작할 수 있다.

B. 치료 요법 및 투여량

예방 용례의 경우, 약학 조성물 또는 의약은 알츠하이머 병에 만감하거나 또는 다르게는 그 위험이 있는 환자에게, 그 위험을 제거하거나 감소시키거나, 심각성을 경감시키거나, 또는 그 병의 생화학적, 조직학적 및/또는 행동적 증상, 그 합병증 및 병의 발생동안 나타나는 중간 병리학적 표현형을 비롯한 병의 개시를 지연시키기에 충분한 양으로 투여된다. 치료 용례에서는, 조성물 또는 의약을 그러한 질병이 의심되거나 이미 병을 앓고 있는 환자에게, 그 합병증 및 병의 발생에서의 중간 병리학적 표현형을 비롯한 병의 증상(생화학적, 조직학적 및/또는 행동학적)을 치료, 또는 적어도 부분적으로 중지하기에 충분한 양으로 투여된다.

일부 방법에서, 제제의 투여는 아직 특징적인 알츠하이머 병리를 발생하지 않은 환자에서 근육인지 손상을 감소시키거나 제거한다. 치료 또는 예방 처리를 이루기에 적절한 양은 치료적 또는 예방적 유효량으로 정의된다. 예방 및 치료 요법 모두에서, 제제는 대개 충분한 면역 반응이 얻어질 때까지 여러번의 투여량으로 투여된다. 용어 "면역 반응" 또는 "면역학적 반응"은 수용 개체에서 항원에 대해 형성된 체액성(항체 매개) 및/또는 세포성(항원 특이적 T-세포 또는 그들의 분비 생성물에 의해 매개)의 발생을 포함한다. 그러한 반응은 면역원의 투여에 의해 유도된 활성 반응, 또는 면역글로불린 또는 항체 또는 프라임된 T 세포의 투여에 의해 유도된 수동 반응일 수 있다. 일반적으로, 면역 반응은 모니터되며 면역 반응이 없어지기 시작하면 반복 투여량이 주어진다.

전술한 상태들의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 동물인지 여부, 투여되는 다른 의약, 및 치료가 예방적인지 또는 치료적인지 여부를 비롯한 많은 상이한 인자들에 따라 변한다. 대개, 환자는 인간이지만 형질전환포유류를 비롯한 비인간 포유류 또한 치료될 수 있다. 치료 투여량은 안전성과 효능을 최적화하기 위하여 적정되어야 한다.

항체를 이용한 수동 면역화의 경우, 투여량은 약 0.0001 내지 100 mg/kg 숙주 체중, 그리고 더욱 일반적으로는 0.01 내지 5 mg/kg 숙주 체중(예, 0.02 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg 등) 범위이다. 예를 들어, 투여량은 1 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중 또는 1-10 mg/kg 범위내, 바람직하게는 적어도 1 mg/kg일 수 있다. 다른 예에서, 투여량은 0.5 mg/kg 체중 또는 15 mg/kg 체중 또는 0.5-15 mg/kg 범위, 바람직하게는 적어도 1 mg/kg일 수 있다. 상기 범위에서 중간의 투여량 또한 본 발명의 범위내이다. 개체는 그러한 투여량을 매일, 2일마다, 주마다 또는 실험적 분석에 의해 결정된 임의의 다른 스케쥴에 따라 투여받을 수 있다. 예시적인 치료는 적어도 6개월의 기간에 걸쳐 다수의 투여량으로 투여하는 것을 포함한다. 추가의 예시적인 치료 요법은 2주마다 한번 또는 한달에 한번 또는 매 3 내지 6개월 마다 한번 투여하는 것을 포함한다. 예시적인 투여량 스케쥴은 연속하여 1-10 mg/kg 또는 15 mg/kg, 2일마다 30 mg/kg, 또는 매주 60 mg/kg을 포함한다. 일부 방법에서는, 상이한 결합 특이성을 가진 둘 이상의 모노클로날 항체가 동시에 투여되며, 이 경우 투여되는 각 항체의 투여량은 나타낸 범위내에 속한다.

항체는 대개 여러 번 투여된다. 단일 투여량 사이의 간격은 주, 월 또는 년일 수 있다. 간격은 또한 환자에서 Aβ에 대한 항체의 혈액 수준을 측정하여 나타난 대로 불규칙적일 수 있다. 일부 방법에서, 투여량은 1-1000 ㎍/ml의 혈장 항체 농도를 그리고 일부 방법에서는 25-300 ㎍/ml의 농도를 이루기 위해 조절된다. 다르게는, 항체는 서방성 제제로 투여될 수 있으며, 이 경우 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자에서 항체의 반감기에 따라 변한다. 일반적으로, 인간화된 항체가 최장의 반감기를 나타내며, 이어서 키메라 항체 및 비인간 항체이다.

투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 변할 수 있다. 예방적 용례의 경우, 본 항체 또는 그 혼합물을 함유하는 조성물은 질병 상태에 있지 않은 환자에게 환자의 내성을 증가시키기 위해 투여된다. 그러한 양은 "예방적 유효량"으로 정의된다. 이 용도에서, 정확한 양은 환자의 건강 상태 및 일반적인 면역성에 의존하지만, 일반적으로 0.1 내지 25 mg/투여량, 특히 0.5 내지 2.5 mg/투여량 범위이다. 상대적으로 낮은 투여량이 장기간에 걸쳐 상대적으로 덜 빈번한 간격으로 투여된다. 일부 환자는 그들의 남은 생애동안 계속 치료를 받는다.

치료 용례에서, 상대적으로 짧은 간격으로 상대적으로 높은 투여량(약 1 내지 200 mg 항체/투여량, 5 내지 25 mg이 보다 흔히 이용되는 투여량임)이 때때로 질병의 진전이 감소되거나 종결될 때까지, 그리고 바람직하게는 환자가 부분적인 또는 완전한 병의 증상의 완화를 나타낼 때까지 요구된다. 그 후, 환자는 예방적 요법이 투여될 수 있다.

항체를 암호하는 핵산의 투여량은 환자 당 약 10 ng 내지 1 g, 100 ng 내지 100 mg, 1 ㎍ 내지 10 mg, 또는 30-300 ㎍ 범위이다. 감염성 바이러스 벡터를 위한 투여량은 10-100, 또는 그 이상의 비리온/투여량이다.

치료제는 비경구, 국소, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 복강내, 비강내 또는 근육내 수단에 의해 예방적 및/또는 치료적 처리를 위해 투여될 수 있다. 면역 제제의 가장 일반적인 투여 경로는 피하이며 다른 경로도 동등하게 효과적일 수 있다. 다음으로 가장 일반적인 경로는 근육내 주사이다. 이 주사 타입은 팔 또는 다리 근육에 가장 일반적으로 실시된다. 일부 방법에서는, 제제는 침전물이 축적된 특정 조직내로 직접 주사되며, 예를 들어 두개내 주사가 있다. 근육내 주사 또는 정맥내 주입은 항체 투여에 바람직하다. 일부 방법에서는, 특정 치료 항체는 직접 두개골내로 주사된다. 일부 방법에서는, 항체는 Medipad^TM 장치와 같은 서방성 조성물 또는 장치로서 투여된다.

본 발명의 제제는 선택적으로 적어도 부분적으로 아밀로이드원성 질병의 치료에 효과적인 다른 제제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 인간화된 항체(예, 인간화된 12A11)는 제 2의 면역원성 또는 면역학적 제제와 함께 투여된다. 예를 들어, 본 발명의 인간화된 12A11 항체는 Aβ에 대한 다른 인간화된 항체와 함께 투여될 수 있다. 다른 구체예에서는, 인간화된 12A11 항체는 Aβ 백신을 받았거나 받고 있는 환자에 투여된다. 아밀로이드 침전물이 뇌에 발생하는 알츠하이머 및 다운 증후군의 경우, 본 발명의 제제는 또한 본 발명의 제제의 혈액-뇌 장벽 통과를 증가시키는 다른 제제와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 제제는 또한 표적 세포 또는 조직에 대한 치료제의 접근을 증가시키는 다른 제제, 예를 들어, 리포좀 등과 함께 투여될 수 있다. 그러한 제제의 공동투여는 원하는 효과를 이루는 데 필요한 치료제(예, 치료 항체 또는 항체 쇄)의 투여량을 감소시킬 수 있다.

C. 약학적 조성물

본 발명의 제제는 종종 활성 치료제 및 다양한 다른 약학적 허용 성분을 포함하는 약학 조성물로서 투여된다. Remington's Pharmaceutical Science(15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania(1980))를 참고한다. 바람직한 형태는 의도하는 투여 모드 및 치료 용례에 의존한다. 상기 조성물은 또한 원하는 제제에 따라, 동물 또는 인간 투여를 위한 약학 조성물을 조제하기 위해 흔히 이용되는 비히클로 정의되는 약학적 허용성의 비독성 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 희석제는 그 조합의 생물 활성에 영향을 주지 않도록 선택된다. 그러한 희석제의 예는 증류수, 생리학적 인산염-완충된 염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 및 행크 용액이다. 또한, 약학 조성물 또는 제제는 또한 다른 담체, 아쥬반트, 또는 비독성의, 비치료적이고 비면역원성인 안정제 등을 포함할 수 있다.

약학 조성물은 또한 단백질, 키토산, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 공중합체(라텍스 관능화된 세파로즈(TM), 아가로즈, 셀룰로즈, 등)과 같은 다당류, 중합성 아미노산, 아미노산 공중합체, 및 지질 응집체(오일 소적 또는 리포좀)와 같은 크고 느리게 대사되는 거대분자를 포함할 수 있다. 부가적으로, 이들 담체는 면역자극제(즉, 아쥬반트)로서 기능할 수 있다.

비경구 투여의 경우, 본 발명의 제제는 물, 오일, 염수, 글리세롤 또는 에탄올과 같은 멸균 액체일 수 있는 약학적 담체와 함께 생리학적 허용성 희석제내의 상기 물질의 용액 또는 현탁액의 주사가능한 투여량으로 투여될 수 있다. 추가로, 습윤제 또는 유화제, 계면활성제, pH 완충 물질 등과 같은 보조 물질이 조성물에 존재할 수 있다. 약학 조성물의 다른 성분은 석유, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 것, 예를 들어, 땅콩유, 대두유 및 광유이다. 일반적으로, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 바람직한 액체 담체이며, 특히 주사용 용액을 위해 그러하다. 항체는 저장 주사 또는 이식 제제 형태로 투여될 수 있으며, 이들은 활성 성분의 느린 방출을 허용하는 방식으로 조제된다. 예시적인 조성물은 HCl로 pH 6.0으로 조절된, 50 mM L-히스티딘, 150 mM NaCl로 구성된 수성 완충액에 조제된, 5 mg/ml의 모노클로날 항체를 포함한다.

일반적으로, 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사제로 제조되며, 주사에 앞서 액체 비히클내의 용액 또는 현탁액을 위해 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 제제는 또한 유화되거나, 리포좀 또는, 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 또는 아쥬반트 효과를 증가시킬 수 있는 공중합체와 같은 미세 입자내에 캡슐화될 수 있다. (Langer, Science 249: 1527 (1990) 및 Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97 (1997) 참고). 본 발명의 제제는 저장 주사 또는 이식 제제의 형태로 투여될 수 있으며, 이는 활성 성분의 느린 또는 간헐적인 방출을 허용하는 방식으로 조제될 수 있다.

다른 투여 모드에 적합한 추가 제제는 경구, 비강내, 및 폐 제제, 좌약, 및 경피 적용을 포함한다. 좌약의 경우, 결합제 및 담체는 예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함하며, 그러한 좌약은 0.5% 내지 10%, 바람직하게는 1% -2%의 범위로 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다. 경구 제제는 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 및 마그네슘 카보네이트와 같은 부형제를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 알약, 캡슐, 서방성 제제 또는 분말의 형태를 가지며 10%-95%의 활성 성분, 바람직하게는 25%-70%를 함유한다.

국소 적용은 경피 또는 진피내 전달을 야기할 수 있다. 국소 투여는 콜레라 독소 또는 그 탈독성화된 유도체 또는 서브유닛 또는 다른 유사한 박테리아 독소와 함께 제제를 공동투여함에 의해 촉진될 수 있다(Glenn et al., Nature 391,851 (1998) 참고). 공동-투여는 성분을 혼합물로서 또는 화학적 가교 또는 융합 단백질로서의 발현에 의해 얻어진 연결된 분자로 이용함으로써 이루어질 수 있다.

다르게는, 경피 전달은 피부 패치를 이용하거나 또는 트랜스페로좀을 이용하여 이루어질 수 있다( Paul et al., Eur. J. Immunol. 25: 3521 (1995); Cevc et al.,Biochem. Biophys. Acta 1368: 201-15 (1998)).

D. 치료 과정의 모니터링

본 발명은 알츠하이머에 민감하거나 이를 앓고 있는 환자에서 치료를 모니터하는 방법, 즉 환자에게 투여되고 있는 치료 과정을 모니터하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 증상이 있는 환자에서의 치료적 처리 및 무증상 환자에서의 예방적 처리 둘다를 모니터하기 위해 이용될 수 있다. 특히, 상기 방법은 수동 면역화를 모니터(예, 투여된 항체의 수준을 측정)하기 위해 유용하다.

일부 방법은 제제의 투여량을 투여하기 전에 환자에서 항체 수준 또는 프로파일의 기본 값을 결정하고, 이것을 치료 후 프로파일 또는 수준을 위한 값과 비교하는 것을 포함한다. 상기 수준 또는 프로파일의 값에서 상당한 증가(즉, 반복 측정의 평균으로부터의 표준 편차로 표현된, 동일한 샘플의 반복 측정에서의 실험적 오차의 일반적인 범위보다 큼)는 양성 치료 결과를 신호한다(즉, 제제의 투여가 원하는 반응을 이루었음). 만일 면역 반응을 위한 값이 크게 변하지 않거나, 감소하면, 음성 치료 결과가 나타내진다.

다른 방법에서는, 수준 또는 프로파일의 대조값(즉 평균 및 표준 편차)을 대조 집단에 대해 결정한다. 일반적으로 대조 집단의 개인은 선행 치료를 받지 않았다. 치료제의 투여 후 환자에서 수준 또는 프로파일의 측정 값을 이어서 대조값과 비교한다. 대조값에 비하여 상당한 증가(예, 평균으로부터의 표준편차보다 큼)는 양성 또는 충분한 치료 결과를 신호한다. 상당한 증가의 결핍 또는 감소는 음성 또는 불충분한 치료 결과를 신호한다. 제제의 투여는 일반적으로 수준이 대조값에 비하여 증가하고 있는 동안 계속된다. 이전처럼, 대조 값에 비한 고평부의 획득은 치료의 투여가 중지되거나 투여량 및/또는 빈도가 감소될 수 있음을 나타낸다.

다른 방법에서는, 수준 또는 프로파일의 대조 값(예, 평균 및 표준 편차)을 치료제를 이용한 치료를 받았으며 그 수준 또는 프로파일이 치료에 대한 반응으로 고평화된 개인의 대조 집단으로부터 결정한다. 환자에서 수준 또는 프로파일의 측정 값을 대조 값에 비교한다. 만일 환자에서 측정된 값이 대조 값과 크게 상이하지(예, 한 표준 편차보다 큼) 않으면, 치료를 중단할 수 있다. 만일 환자에서 수준이 대조 값보다 상당히 낮으면, 제제의 연속 투여가 보장된다. 만일 환자에서 수준이 계속 대조 값 미만이면, 치료의 변화가 표시된다.

다른 방법에서는, 현재 치료를 받고 있지 않으나 이전에 치료를 받은 환자를, 치료의 재개가 필요한지를 결정하기 위해 항체 수준 또는 프로파일을 모니터한다. 환자에서 측정된 수준 또는 프로파일을 이전 치료 과정 후에 환자에서 이전에 얻어졌던 값과 비교할 수 있다. 이전 치료에 비하여 상당한 감소(즉, 동일한 샘플의 반복 측정에서의 일반적인 오차 범위보다 큼)는 치료가 재개될 수 있음을 나타낸다. 다르게는, 환자에서 측정된 값을 치료 과정을 지난 후 환자 집단에서 결정된 대조 값(평균 더하기 표준 편차)에 비교할 수 있다. 다르게는, 환자에서 측정된 값을, 병의 증상이 없는 예방적으로 치료된 환자 집단 또는 질병 특징의 완화를 나타내는 치료적으로 치료된 환자 집단에서의 대조 값에 비교할 수 있다. 이 모든 경우에, 대조 수준에 비하여 상당한 감소(즉, 표준 편차보다 큼)는 치료가 환자에서 재개되어야 함을 나타낸다.

분석을 위한 조직 샘플은 일반적으로 환자로부터의 혈액, 혈장, 혈청, 점액 또는 뇌척수액이다. 샘플은 예를 들어, Aβ 펩티드에 대한 항체의 수준 또는 프로파일, 예, 인간화된 항체의 수준 또는 프로파일에 대해 분석된다. Aβ에 특이적인 항체를 검출하는 ELISA 방법은 실시예 부분에 개시된다. 일부 방법에서, 투여된 항체의 수준 또는 프로파일은 소거 분석, 예를 들어, 여기서 개시된 생체외 식균작용 분석을 이용하여 결정된다. 그러한 방법에서, 시험중인 환자로부터의 조직 샘플을 (예, PDAPP 마우스로부터의) 아밀로이드 침전물 및 Fc 어셉터를 보유한 식균작용 세포와 접촉시킨다. 이어서 아밀로이드 침전물의 후속 소거를 모니터한다. 소거 반응의 존재 및 정도는 시험중인 환자의 조직 샘플에서 Aβ를 소거하는 데 효과적인 항체의 존재 및 수준의 지표를 제공한다.

수동 면역화에 이어지는 항체 프로파일은 일반적으로 항체 농도에서의 즉각적인 피크 및 이어지는 지수적 감소를 나타낸다. 추가의 투여가 없으면, 감소는 투여된 항체의 반감기에 따라 수일 내지 수개월 내에 치료전 수준으로 접근한다.

일부 방법에서, 환자에서 Aβ에 대한 항체의 기본 측정은 투여 전에 이루어지며, 두번째 측정은 그 후 곧 이루어져 피크 항체 수준을 결정하며, 한번 이상의 추가 측정이 일정 간격으로 이루어져 항체 수준의 감소를 모니터한다. 항체의 수준이 기본 또는 피크에서 기본을 공제한 값의 예정된 퍼센티지로 감소하면(예, 50%, 25% 또는 10%), 추가 투여량의 항체 투여가 이루어진다. 일부 방법에서, 피크 또는 후속 측정 수준에서 배경을 공제한 값을, 다른 환자에서 유익한 예방적 또는 치료적 처리 요법을 구성하기 위해 이전에 결정된 기준 수준과 비교한다. 만일 측정된 항체 수준이 기준 수준보다 상당히 적으면(예, 치료를 받고 있는 환자 집단에서 기준 값의 평균 마이너스 표준 편차 미만), 추가 투여량의 항체 투여가 표시된다.

추가의 방법은 치료 과정에 걸쳐, 아밀로이드원성 질병을 진단하거나 모니터하기 위해 연구자 또는 의사가 일상적으로 의존하는 공지의 생리학적 증상(예, 물리적 또는 정신적 증상)을 모니터하는 것을 포함한다. 예를 들어, 인지 손상을 모니터할 수 있다. 후자는 알츠하이머 병 및 다운 증후군의 증상이지만 또한 이들 질병의 다른 특징없이 발생할 수 있다. 예를 들어, 인지 손상은 치료 과정동안 협의에 따라 최소-정신 상태 검사에서 환자의 점수를 결정함으로써 모니터할 수 있다.

E. 키트

본 발명은 추가로 전술한 모니터링 방법을 실시하기 위한 키트를 제공한다. 일반적으로, 그러한 키트는 Aβ에 대한 항체에 특이적으로 결합하는 제제를 함유한다. 키트는 또한 라벨을 포함할 수 있다. Aβ에 대한 항체의 검출의 경우, 라벨은 일반적으로 표지된 항-이디오타입 항체 형태이다. 항체의 검출의 경우, 제제는 미세적정 디쉬의 웰과 같은 고체 상에 미리결합되어 공급될 수 있다. 키트는 또한 일반적으로 키트의 사용을 위한 지시를 제공하는 라벨링을 함유한다. 라벨링은 또한 측정된 라벨의 수준을 Aβ에 대한 항체의 수준과 상관시키는 차트 또는 다른 대응 체재를 포함할 수 있다. 용어 라벨링은 그 제조, 수송, 판매 또는 사용동안 임의의 시점에 키트에 부착되거나 수반되는 임의의 쓰여지거나 기록된 물질을 말한다. 예를 들어, 용어 라벨링은 광고 전단 및 브로셔, 포장 재료, 안내서, 오디오 또는 비디오카세트, 컴퓨터 디스크 및 키트에 직접 인쇄된 기재를 포괄한다.

본 발명은 또한 진단 키트, 예를 들어, (예, 생체내 영상화를 실시하기 위한)연구, 검출 및/또는 진단 키트를 제공한다. 그러한 키트는 일반적으로 Aβ의 에피토프, 바람직하게는 잔기 1-10내의 에피토프에의 결합을 위한 항체를 함유한다. 바람직하게는, 항체는 표지되거나 또는 이차 표지 시약이 키트에 포함된다. 바람직하게는, 키트는 의도하는 용례를 실시하기 위한, 예를 들어, 생체내 영상화 분석을 실시하기 위한 지시서를 갖는다. 예시적인 항체는 여기서 개시된 것들이다.

F. 생체내 영상화

본 발명은 환자에서 아밀로이드 침전물을 생체내 영상화하는 방법을 제공한다. 그러한 방법은 알츠하이머 병 또는 그에 대한 민감성을 진단하거나 진단을 확인하는 데 유용하다. 예를 들어, 상기 방법은 치매의 증상을 나타내는 환자에서 사용될 수 있다. 만일 환자가 비정상적인 아밀로이드 침전물을 가지면, 환자는 알츠하이머 질병을 앓고 있을 가능성이 많다. 상기 방법은 또한 무증상 환자에 이용될 수 있다. 아밀로이드의 비정상 침전물의 존재는 미래 증상성 질병에 대한 민감성을 나타낸다. 상기 방법은 또한 질병 진전 및/또는 이전에 알츠하이머 병으로 진단받은 환자에서 치료에 대한 반응을 모니터하는 데 유용하다.

상기 방법은 Aβ에 결합하는 항체와 같은 시약을 환자에게 투여하고 이어서 그것이 결합한 후 제제를 검출함으로써 작용한다. 바람직한 항체는 전길이 APP 폴리펩티드에 결합하지 않고 환자에서 Aβ 침전물에 결합한다. 아미노산 1-10 이내의 Aβ의 에피토프에의 항체 결합은 특히 바람직하다. 일부 방법에서, 항체는 Aβ의 아미노산 7-10 이내의 에피토프에 결합한다. 그러한 항체는 일반적으로 상당한 소거 반응을 유도하지 않고 결합한다. 다른 방법에서, 항체는 Aβ의 아미노산 1-7 이내의 에피토프에 결합한다. 그러한 항체는 일반적으로 Aβ에 결합하여 Aβ에 대한 소거 반응을 유도한다. 하지만, 소거 반응은 Fab와 같은 전길이 불변 영역이 없는 항체 단편을 이용함으로써 피할 수 있다. 일부 방법에서, 동일한 항체가 치료 및 진단 시약 둘다로 작용할 수 있다. 일반적으로, 에피토프 C-말단 내지 Aβ의 잔기 10에의 항체 결합은 잔기 1-10 이내의 에피토프에의 항체 결합만큼 강한 신호를 나타내지 않으며, 이는 아마도 C-말단 에피토프가 아밀로이드 침전물에 접근할 수 없기 때문이다. 따라서, 그러한 항체는 덜 바람직하다.

진단 시약은 환자 신체내로의 정맥내 주사에 의해, 또는 두개내 주사에 의해 또는 두개골에 구멍을 뚫어 뇌내로 직접 투여될 수 있다. 시약의 투여량은 치료 방법의 경우와 동일한 범위내이어야 한다. 일반적으로, 시약은 표지되며, 일부 방법에서는 Aβ에 대한 친화성을 갖는 일차 시약은 비표지되며 이차 표지 제제가 일차 시약에 결합하도록 이용된다. 라벨의 선택은 검출 수단에 의존한다. 예를 들어, 형광 라벨은 광학 검출에 적합하다. 상자성 라벨의 사용은 외과적 개입없이 단층 X선 촬영 검출에 적합하다. 방사성 라벨 또한 PET 또는 SPECT를 이용하여 검출할 수 있다.

진단은 표지된 위치의 수, 크기 및/또는 강도를 상응하는 기본 값에 비교하여 실시된다. 기본 값은 질병이 없는 개인 집단에서 평균 수준을 나타낼 수 있다. 기본 값은 또한 동일한 환자에서 결정된 이전 수준을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 기본 값은 치료를 시작하기 전에 환자에서 결정될 수 있으며, 그 이후 측정된 값은 기본 값과 비교된다. 기본에 비하여 값의 감소는 치료에 대한 양성 반응을 신호한다.

본 발명은 하기하는 비제한적인 예에 의해 보다 완전히 설명된다.

본 발명은 환자의 뇌에서 Aβ의 아밀로이드 침전물과 관련된 질병의 치료를 위한 개선된 제제 및 방법을 제공한다.

도 1은 엑스 비보(ex vivo) 식균작용 분석에서 Aβ 플라크를 소거함에 있어서, 12A11을 비롯한 다양한 항체의 효과를 검사하는 실험으로부터의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 2A는 전체 Aβ 수준을 감소시킴에 있어서, 12A11을 비롯한 다양한 항체의 효과를 검사하는 실험으로부터의 결과를 그래프로 나타낸다. 막대는 중앙 값을 나타내며, 대쉬된 수평선은 대조구 수준을 나타낸다. 도 2B는 신경염 이상증을 감소시킴에 있어서, 12A11을 비롯한 다양한 항체의 효과를 분석하는 실험으로부터의 결과를 그래프로 나타낸다. 막대는 중앙 값을 나타내며, 대쉬된 수평선은 대조구 수준을 나타낸다. 데이터는 개별 동물에 대해 나타나며 대조구의 평균(100%로 고정)에 대하여 신경염 이상증의 퍼센티지로 표현한다.
도 3A는 쥐의 12A11 VL 쇄 서열을 포함하는 DNA 서열 및 VL 쇄를 위한 추론된 아미노산 서열(각각 서열 번호 5 및 2)을 나타낸다. 성숙 VL 쇄는 진한 검은색 막대로 표시된다. CDR은 흰색 막대로 표시된다. 도 3B는 쥐의 12A11 VH 쇄 서열을 포함하는 DNA 서열 및 VH 쇄를 위한 추론된 아미노산 서열(각각 서열 번호 6 및 3)을 나타낸다. 성숙 VH 쇄는 진한 검은색 막대로 표시된다. CDR은 흰색 막대로 표시된다. DNA 서열은 클로닝 부위 및 코작(Kozak) 서열(암호 서열의 상부) 및 스플라이스와 클로닝 서열(하부)을 포함한다.
도 4는 키메라 12A11, 키메라 및 인간화된 3D6, 및 키메라 및 인간화된 12B4의 Aβ1-42에의 결합을 측정하는 실험으로부터의 ELISA 결과를 그래프로 나타낸다.
도 5A는 쥐(또는 키메라) 12A11(서열 번호 2), 인간화된 12A11(성숙 펩티드, 서열 번호 7), 젠뱅크 BAC01733(서열 번호 8) 및 생식세포 A19(X63397, 서열 번호 9) 항체의 경쇄의 아미노산 서열의 배열을 나타낸다. CDR 영역이 박스로 표시된다. 패킹 잔기는 밑줄쳐진다. 카바트 넘버링이 아니라, 첫번째 메티오닌부터 번호를 붙인다. 도 5B는 쥐(또는 키메라) 12A11(서열 번호 4), 인간화된 12aA11(버젼 1)(성숙 펩티드, 서열 번호 10), 젠뱅크 AAA69734(서열 번호 11), 및 생식세포 젠뱅크 567123 항체(서열 번호 12)의 중쇄의 아미노산 서열 배열을 나타낸다. 패킹 잔기는 밑줄 쳐지며, 공인 잔기는 진하게 칠해지며 베르니에 잔기는 점선으로 채워진다. 카바트 넘버링이 아니라, 첫번째 메티오닌으로부터 번호가 붙여진다.
도 6A-B는 인간화된 12A11 vl (서열 번호 10), v2 (서열 번호 13), v2.1 (서열 번호 14), v3 (서열 번호 15), v4.1 (서열 번호 16), v4.2 (서열 번호 17), v4.3 (서열 번호 18), v4.4 (서열 번호 19), v5.1 (서열 번호 20), v5.2 (서열 번호 21), v5.3 (서열 번호 22), v5.4 (서열 번호 23), v5.5 (서열 번호 24), v5.6 (서열 번호 25), v6.1 (서열 번호 26), v6.2 (서열 번호 27), v6.3 (서열 번호 28), v6.4 (서열 번호 29), v7 (서열 번호 30) 및 v8 (서열 번호 31)의 중쇄의 아미노산 서열의 배열을 나타낸다. 도 6C는 인간화된 12A11 v1 내지 v8에서 만들어진 역돌연변이를 개시한다.
도 7은 키메라 12A11, 인간화된 12A11 v1, 인간화된 12A11 v2, 인간화된 12A11 v2.1, 및 인간화된 12A11 v3을 비교하는, 응집된 Aβ(1-42) ELISA로부터의 결과를 나타낸다.
도 8은 쥐 12A11, 키메라 12A11 및 h12A11 v1을 비교하는, 경쟁적 Aβ1-42 ELISA 결합 분석의 결과를 나타낸다.

하기 서열 확인자는 면역글로불린 쇄 가변 영역 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 의미하기 위해 실시예 부분 전체에서 사용된다.

여기서 사용될 때, 서열 번호 1-4 중 어느 하나에 개시된 VL 및/또는 VH 서열을 포함하는 항체 또는 면역글로불린 서열은 전체 서열을 포함하거나 또는 성숙 서열(즉, 시그널 또는 리더 펩티드가 없는 성숙 펩티드)를 포함할 수 있다.

이전의 연구는 항체가 엑스 비보에서(예, PDAPP 또는 AD 뇌 부분에서) 플라크에 결합하고 및/또는 엑스 비보 식균작용 분석에서 플라크 소거를 야기하는 능력에 의해, AD-연합 신경병증(예, 플라크 부담)을 감소하는 데 있어서 다양한 Aβ 항체의 생체내 효능을 예측하는 것이 가능함을 보여주었다(Bard et al. (2000) Nat.Med.6:916-919). 상기 상관성은 미세아교 세포 및/또는 대식세포에 의한 Fc-의존성 식균작용이 생체내에서 플라크 소거 과정에 중요하다는 생각을 지지한다. 하지만, 항체 효능이 또한 Fc 상호작용과 독립적인 기작에 의해 생체내에서 얻어질 수 있음이 보고되었다(Bacskai et al.(2002) J.Neurosci.22:7873-7878). 연구는 아밀로이드 플라크를 인식할 수 없는, Aβ의 중간부분에 대해 형성된 항체는 가용성 Aβ에 결합하며 플라크 침전을 감소시키는 것으로 나타남을 보여준다(DeMattos et al.(2001) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:8850-8855).

쥐 모노클로날 항체 12A11(아이소타입 IgG1)의 잠재적인 생체내 효능을 규명하기 위하여, 다양한 엑스 비보 분석을 먼저 실시하였다.

Aβ1-42에 대한 mAb 12A11의 친화력.

응집된 합성 Aβ1-42에 대한 모노클로날 항체 12A11의 결합을 Schenk, et al.(Nature 400L173(1999))에서 개시된 대로 ELISA에 의해 실시하였다. 비교 목적으로, mAb 12B4, 및 10D5 또한 분석하였다. 가용성 Aβ1-42는 디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 초음파처리된 합성 Aβ1-42 펩티드를 말한다. 20 ㎍/ml의 항체의 연속 희석물을 실온에서 밤새 50,000 cpm[¹²⁵I]Aβ1-42(190 μCi/μmol; 이오도젠 시약으로 표지화, 피어스사)와 함께 항온처리하였다. 75 mg/ml 단백질 A 세파로즈(Amersham Pharmacia) 및 200 ㎍의 토끼 항-마우스 IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch)를 함유하는 슬러리 50 마이크로리터를 희석된 항체와 함께 실온에서 1시간동안 항온처리하고, 두번 세척하고, 웰락 감마 카운터(Perkin-Elmer)에서 계수하였다. 모든 단계는 10 mM Tris, 0.5 M NaCl, 1 mg/ml 젤라틴, 및 0.5% Nonidet P-40, pH 8.0으로 구성된 RIA 완충액에서 실시하였다.

친화력 연구로부터의 결과는 하기 표 2에 나타난다.

[표 2]

+ 항체 10D5 및 12B4는 WO02/46237호 및 국제 특허 출원 제 PCT/US03/07715호에 각각 개시된다.

* 비교로서, 10 ㎍/ml의 항체 266은 Aβ1-42의 70%를 포획할 것이다.

시험된 모든 항체는 응집된 Aβ1-42에 대해 높은 친화력을 나타내었다. 더욱이, 항체 12B4와 12A11은 20 ㎍/ml의 항체 농도에서 가용성 Aβ1-42를 감지할 수 있게 포획하였다. 표 2에 나타난 대로, IgG1 항체 12A11은 IgG2a 항체 12B4 또는 IgG1 항체 10D5보다 더 효율적으로 Aβ1-42를 포획하였다.

(12A11을 비롯하여) 다양한 항체가 가용성 Aβ를 포획하는 능력을 추가로 하기와 같이 분석하였다. 다양한 농도의 항체(최대 10 ㎍/ml)을 50,000 CPM의 ¹²⁵I-Aβ1-42(또는 ¹²⁵I-Aβ1-40)과 항온처리하였다. 방사성 계수의 25%에 결합하는 데 충분한 항체의 농도는 포획 방사성면역분석에서 결정하였다. 10 ㎍/ml에서 계수의 25%에 결합할 수 없는 항체의 경우, 10 ㎍/ml에서 결합된 계수의 퍼센티지를 결정하였다. 12A11은 10 ㎍/ml에서 방사성 계수(즉, ¹²⁵I-Aβ)의 20%에 결합하였다. 이것은 시험된 두가지 다른 Aβ3-7 항체, 즉 12B4 및 10D5(각각, 10 ㎍/ml에서 7% 및 2% 결합함)에 의해 결합된 양보다 컸다. 따라서, 시험된 N-말단(에피토프 Aβ3-7) 항체 중, 12A11이 Aβ를 포획하는 가장 큰 능력을 나타내었다.

그들이 Fc-매개된 플라크 소거를 야기하는 능력의 척도로서, 항체를 또한 일차 마우스 미세아교 세포 및 PDAPP 마우스로부터의 뇌 조직의 절편을 이용한 엑스 비보 식균작용 분석에서 비교하였다. Aβ 또는 분석의 다른 성분에 대해 반응성이 없는 무관한 IgG1 및 IgG2a 항체를 아이소타입-매치된 음성 대조구로서 이용하였다. 요약하면, 쥐 일차 미세아교 세포를 항체의 존재하에서 PDAPP 마우스 뇌의 고정되지 않은 저온유지 절편과 배양하였다. 24시간동안 항온처리 후, 배양물에 남아있는 Aβ의 전체 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 플라크 소거/Aβ 분해의 정도를 정량하기 위하여, Aβ를 ELISA 분석을 위하여 미세아교세포 및 뇌 절편(n=3)의 배양물로부터 8 M 우레아를 이용하여 추출하였다. 데이터를 ANOVA 및 이어서 던네트(Dunnett's) 시험으로 분석하였다.

도 1에 나타난 대로, 12B4 항체는 Aβ 수준을 효율적으로 감소시켰으며(12B4를 위해 73%; P<0.001) 12A11은 통계적으로 유의함에도 불구하고, 다소 덜 효율적이었다(12A11의 경우 48%, P<0.05). 10D5 항체는 Aβ 수준을 크게 감소시키지 않았다. 엑스 비보 식균작용 분석에서 12A11의 성능은 미세아교 식균작용을 위해 바람직한 아이소타입인 IgG2a 아이소타입으로의 전환시 개선될 수 있다.

실시예 II . 마우스 12A11 항체의 생체내 효능

마우스 항체 12A11은 생체내에서 알츠하이머-유사 신경병리학을 감소시킨다.

12A11의 생체내 효능을 결정하기 위하여, 항체(12A11, 12B4, 또는 10D5 포함)를 Bard et al.(2000) Nat.Med.6:916에 개시된 대로 6개월동안 매주 복강내 주사에 의해 10 mg/kg으로 마우스에 투여하였다. 연구 마지막에, 피질 Aβ의 전체 수준을 ELISA에 의해 결정하였다. 도 2A에 나타난 대로, 항체의 각각은 PBS 대조구와 비교하여 전체 Aβ 수준을 크게 감소시켜(P<0.001), 즉, 12B4는 69% 감소, 10D5는 52% 감소, 그리고 12A11은 31% 감소를 나타내었다.

이어서 신경염 이상증의 수준을 전술한 마우스로부터의 뇌 조직 절편에서 검사하여 플라크 소거와 신경 보호 사이의 관련성을 결정하였다. 신경 이상증에 의해 차지되는 전면 피질의 퍼센티지를 검사하는 뇌 영상 분석으로부터의 데이터가 도 2B에 나타난다. 이들 데이터는 여기서 개시된 분석에 의해 결정할 때, 항체 10D5 및 12A11이 신경염 이상증을 감소시키는 데 효과적이지 않은 반면, 12B4는 신경염 이상증을 크게 감소시킴을 나타낸다(12B4, P<0.05; ANOVA 및 이어지는 던네트 시험). 다시, 12A11의 이 활성은 12A11을 IgG2a 아이소타입으로 전환시킴으로써 개선될 수 있다(쥐 효능). 12A11의 인간화된 버젼의 경우, IgG1 아이소타입이 신경염 이상증 감소에 바람직하다.

항체 12A11의 결합 특성 및 생체내 효능을 입증하는 실험은 또한 여기서 참고로 포함되는 Bard, et al. PNAS 100:2023(2003)에 개시된다.

요약하면, 모든 항체는 응집된 Aβ에 대해 상당한 친화력을 가지며 엑스 비보 분석에서 플라크 소거를 야기하였다. IgG2a 아이소타입(Fc 어셉터, 특히 FcγRI에 대한 친화성)은 Aβ의 소거 및 신경염 이상증에 대한 보호 둘다를 위해 중요한 기여를 하는 것으로 나타난다. 항체 12A11(IgG1)은 12B4(IgG2a) 또는 10D5(IgG1)보다 더 효율적으로 가용성 단량체 Aβ1-42를 포획하였으나 신경염 이상증을 감소시키는데 효과적이지는 않았다. 플라크 부담을 감소시키고 신경염 이상증을 감소시키는 데 있어서의 효능의 증가는 항체를 조작하여 식균작용을 최대한 지지하는 아이소타입을 갖도록 함으로써 이루어질 수 있다. 특히 효율적인 항체는 Aβ의 N 말단내의 에피토프에 결합한다.

실시예 III . 마우스 12A11 가변 영역의 클로닝 및 서열결정

12A11 VH 의 클로닝 및 서열 분석.

하이브리도마 세포로부터의 12A11의 VH 및 VL 영역을 RT-PCR 및 하이브리도마 세포로부터의 mRNA를 이용하는 5' RACE 및 표준 클로닝 방법에 의해 클로닝하였다. 가정된 12A11 VH 도메인을 암호하는 독립적인 cDNA 클론으로부터 유래된 뉴클레오티드 서열(암호, 서열 번호 3) 및 추론된 아미노산 서열(서열 번호 4)이 각각 표 3 및 표 4에 개시된다.

[표 3]

마우스 12A11 VH DNA 서열

[표 4]

마우스 12A11 VH 아미노산 서열

* 리더 펩티드 및 CDR은 소문자임.

12A11 VL 의 클로닝 및 서열 분석.

12A11의 경쇄 가변 VL 영역을 VH 영역과 유사한 방식으로 클로닝하였다. 가정된 12A11 VL 도메인을 암호하는 두 개의 독립적인 cDNA 클론으로부터 유래된 뉴클레오티드 서열(암호, 서열 번호 1) 및 추론된 아미노산 서열(서열 번호 2)는 표 5와 표 6에 각각 개시된다.

[표 5]

마우스 12A11 VL DNA 서열

[표 6]

마우스 12A11 VL 아미노산 서열

* 리더 펩티드와 CDR은 소문자임.

12A11 VL 및 VH 서열은 그들이 개시자 메티오닌으로부터 C-영역까지의 연속적인 ORF를 함유하며 면역글로불린 V 영역 유전자의 특징적인 보존된 잔기를 보유하는 한은 기능성 V 영역을 위한 기준을 만족한다. N-말단에서 C-말단으로, 경쇄 및 중쇄 둘다 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다.

실시예 IV : 키메라 12A11 항체의 발현

키메라 12A11 항체의 발현: 가변 중쇄 및 경쇄 영역을 재조작하여 각 VDJ 또는 VJ 연결부의 하류의 스플라이스 공여 서열을 암호하도록 하고, 중쇄를 위해서는 포유류 발현 벡터 pCMV-hγ1 그리고 경쇄를 위해서는 pCMV-hκ1 내로 클로닝하였다. 이들 벡터는 삽입된 가변 영역 카세트의 하부의 엑손 단편으로서 인간 γ1 및 Cκ 불변 영역을 암호한다. 서열 확인 후, 중쇄 및 경쇄 발현 벡터를 COS 세포내로 동시형질감염시켰다. 다양한 중쇄 클론을 독립적으로 상이한 키메라 경쇄 클론들과 동시형질감염시켜 결과의 재현성을 확인하였다. 항체를 단백질 A 세파로즈를 이용하여 COS 세포 조절된 배지로부터 면역침전시켰다. 항체 쇄를 SDS-PAGE 젤의 면역블롯에서 검출하였다. 검출은 1:5000 희석의 염소-항-인간-IgG(H+L) 항체를 이용하여 1시간동안 실온에서 이루어졌다. 상당량의 12A11 H+L 쇄를 조절된 배지에서 검출하였다.

Aβ에의 키메라 12A11 항체의 직접적인 결합을 ELISA 분석에 의해 시험하였다. 도 4는 키메라 12A11이 키메라 및 인간화된 3D6에 의해 입증된 것과 유사한, 높은 친화력으로 Aβ에 결합하는 것으로 발견되었다. (3D6의 클로닝, 특성규명 및 인간화는 미국 특허 출원 제 10/010,942호에 개시되며, 그 전체가 참고로 본원에 포함됨). 결합 친화력은 또한 키메라 및 인간화된 12B4에 의해 입증된 것과 유사하였다. (12B4의 클로닝, 특성규명 및 인간화는 미국 특허 출원 제 10/388,214호에 개시되며, 그 전체가 참고로 본원에 포함됨).

실시예 V. 12A11 인간화

A. 12A11 인간화된 항체, 버젼 1

상동성 /분자 모델 분석.

쥐 12A11 항체에서 핵심 구조 골격 잔기를 확인하기 위하여, 12A11 중쇄 및 경쇄에 상동성을 갖는 해명된 쥐 항체에 대하여 삼차원 모델을 연구하였다. 12A11 경쇄에 대해 밀접한 상동성을 갖는 1KTR로 지정된 항체를 선택하고 12A11 중쇄에 대한 밀접한 상동성을 갖는 1ETZ 및 1JRH로 지정된 두 항체를 선택하였다. 이들 마우스 항체는 12A11과 강한 서열 보존을 나타낸다(Vk를 위한 112 아미노산에서 94% 동일성 및 각각 Vh를 위한 126 아미노산에서 83% 동일성 및 121 아미노산에서 86% 동일성). 1ETZ의 중쇄 구조는 1KTR의 구조상에 겹쳤다. 또한, Vk의 경우 선택된 항체의 CDR 루프는 12A11 VL의 CDR 루프와 동일한 공인 초티아 구조 부류에 속한다. 이들 항체의 결정 구조는 항체의 기능 그리고 비교에 의해, 유사한 12A11 항체의 기능에 중요한 것으로 예상된 잔기에(예, CDR 형태에 중요한 FR 잔기 등) 대해 검사하였다.

인간 어셉터 항체 서열의 선택.

적합한 인간 어셉터 항체 서열을 마우스 가변 영역의 아미노산 서열과 공지의 인간 항체의 서열을 컴퓨터 비교하여 확인하였다. 비교는 12A11 중쇄 및 경쇄에 대해 별도로 실시하였다. 특히, 그 골격 서열이 쥐 VL 및 VH 골격 영역과 높은 서열 동일성을 나타내는 인간 항체로부터의 가변 도메인을, 각 쥐 골격 서열로 NCBI BLAST(국립 보건원 NCBI 인터넷 서버를 통해 접근가능)를 이용하여 NCBI Ig 데이터베이스의 질문에 의해 확인하였다.

하기 기준에 기초하여 두 후보 서열을 어셉터 서열로 선택하였다: (1) 대상 서열과의 상동성; (2) 공여체 서열과 공인 CDR 구조를 공유; 및/또는 (3) 골격 영역에서 희귀한 아미노산 잔기를 함유하지 않음. VL을 위해 선택된 어셉터 서열은 NCBI Ig 비-풍부(redundant) 데이터베이스에서 BAC01733이다. VH를 위한 선택된 어셉터 서열은 NCBI Ig 비-풍부 데이터베이스에서 AAA69734이다. AAA69734는 인간 하위그룹 III 항체(하위그룹 II가 아님)이지만 적어도 부분적으로 Saldanha et al.(1999) Mol.Immuno. 36:709에서의 논리에 기초하여 초기 어셉터 항체로서 선택되었다. 인간화된 12A11항체의 첫번째 버젼은 이들 선택된 어셉터 항체 서열을 이용한다. 항체는 Schroeder and Wang(1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872:6146에 개시된다.

아미노산 잔기의 치환.

전술한 대로, 본 발명의 인간화된 항체는 실질적으로 인간 면역글로불린(어셉터 면역글로불린)으로부터의 가변 골격 영역 및 실질적으로 12A11로 불리는 마우스 면역글로불린(공여체 면역글로불린)으로부터의 상보성 결정 영역을 포함한다. 12A11의 상보성 결정 영역 및 적절한 인간 어셉터 면역글로불린을 확인 한 후, 다음 단계는 만일 있다면, 이들 성분으로부터의 어느 잔기가 생성된 인간화된 항체의 특성을 최적화하기 위해 치환될 것인지를 결정하는 것이었다.

재성형된 경쇄 V 영역:

재성형된 경쇄 V 영역의 아미노산 배열은 도 5A에 나타난다. 어셉터 골격(BAC01733)의 선택은 쥐 V 영역에 해당하는 것과 동일한 인간 하위그룹으로부터이며, 특이한 골격 잔기를 갖지 않으며, CDR은 동일한 초티아 공인 구조 그룹에 속한다. 인간화된 12A11의 버젼 1에서 역돌연변이는 만들어지지 않았다.

재성형된 중쇄 V 영역:

재성형된 중쇄 V 영역의 아미노산 배열이 도 5B에 나타난다. 어셉터 골격(AAA69734)의 선택은 인간 하위그룹 III(이전에 개시)으로부터이며 특이한 골격 잔기를 갖지 않는다. 쥐 VH 쇄(1ETZ 및 1JRH)의 구조 분석은 쥐 서열에 대한 AAA69734의 아미노산 배열과 함께, 재성형된 중쇄의 버젼 1(v1)에서 9 역돌연변이를 나타낸다: A24F T28S F29L V37I V48L F67L R71K N73T L78V(카바트 넘버링). 역돌연변이는 도 5B에 나타난 아미노산 배열에서 별표로 표시된다.

9개의 역돌연변이중에서, 3개는 잔기들이 공인 잔기(A24F, F29L, &R71K, 진한 색), 즉 CDR 잔기에 가까워 항원 결합에 기여할 수 있는 골격 잔기이므로 상기 모델에 의해 지배된다. 다음으로 중요한 잔기 부류, VH-VL 패킹 상호작용(밑줄그어짐)에 관여하는 계면 잔기, 즉 V37I에 하나의 역돌연변이가 있다. N73T 돌연변이는 결합 부위의 가장자리상의 베르니에 잔기(점선으로 채워짐)에 있어, 가능하게는 CDR1에 이웃한 S30과 상호작용한다. 역 돌연변이에 대해 표적화된 나머지 4 잔기(T28S, V48L, F67L, L78V, 카바트 넘버링)는 또한 베르니에 부류에 속한다(CDR 형태에 간접적 기여, 도 5B에서 점선으로 채워짐).

인간화된 12A11의 버젼 1내에 포함된 변화의 요약이 표 7에 제시된다.

[표 7]

인간화된 12A11.v1에서 변화의 요약

표 8 및 9는 각각 다양한 경쇄 및 중쇄를 위한 카바트 넘버링 키를 개시한다.

[표 8]

12A11 경쇄를 위한 카바트 넘버링에 대한 키

[표 9]

12A11 중쇄를 위한 카바트 넘버링에 대한 키

인간화된 항체는 바람직하게는 적어도 10⁷, 10⁸, 10⁹, 또는 10¹⁰ M^-1의 Aβ에 대한 특이적 결합 친화성을 나타낸다. 대개 Aβ에 대한 인간화된 항체의 결합 친화성의 상한선은 12A11의 친화성의 3,4, 또는 5의 인자 이내(즉, ~ 10⁹ M^-1)이다. 종종 더 낮은 한계의 결합 친화성이 또한 12A11의 친화성의 3,4, 또는 5의 인자 이내이다.

인간화된 12A11 VH 및 VL , 버젼 1의 조립 및 발현

PCR-매개된 조립을 이용하여 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 h12A11v1을 생성하였다. 인간화된 12A11VL(버젼 1)(서열 번호 34)와 12A11VH(버젼 1)(서열 번호 35)의 뉴클레오티드 서열이 각각 하기 표 10과 11에 열거된다.

[표 10]

인간화된 12A11VL v1의 뉴클레오티드 서열.

(대문자 VL 분절만) x63397 리더 펩티드로부터 유래된 A19 생식세포 서열에 의해 암호된 리더 펩티드

[표 11]

인간화된 12A11VH v1의 뉴클레오티드 서열

VH 공여체 서열 기탁 M34030.1/aaa69734/M72로부터 유래된 리더 펩티드(소문자).

인간화된 12A11VL(버젼 1)(서열 번호 7) 및 12A11VH(버젼 1)(서열 번호 10)의 아미노산 서열은 각각 도 5A 및 5B에 나타난다.

B. 인간화된 12A11 항체 - 버젼 2.2.1 및 3

베르니에 잔기(예, S28T, V48L, F67L, L78V)는 CDR 형태에 간접적으로 기여하며 형태 교란에는 덜 중요한 것으로 생각되었다. 표적화된 잔기를 스트라타젠의 키트 및 돌연변이 주형으로서 pCRS 플라스미드내의 h12A11VHv1을 이용하여 부위 지시된 돌연변이유발에 의해 돌연변이시켜 버젼 2에 해당하는 클론에서 생겨나게 하였다. 버젼 2의 서열결정되고 확인된 V-영역 삽입체를 중쇄 발현 벡터 pCMV-C감마 1의 BamH1/HindIII 부위내로 서브클론시켜 재조합 h12A11v2 항체를 생산하였다. 위치 T73N에서의 돌연변이에 더하여 상기 베르니에 잔기 돌연변이(즉, 역돌연변이의 제거)의 각각을 갖는 버젼 2.1 항체를 유사하게 생성하였다. 버젼 3 항체는 유사하게 위치 K71R에서의 돌연변이에 더하여, 상기 돌연변이, T28S, L48V, L67F, V78L의 각각을 가졌다.

C. 인간화된 12A11 항체 - 버젼 4 내지 6

공인 및 패킹 잔기에서 역돌연변이를 보유하지만 하나(버젼 4.1 내지 4.4), 둘(버젼 5.1 내지 5.6) 또는 셋(버젼 6.1 내지 6.4) 베르니에 잔기에서의 역돌연변이를 제거한 추가의 인간화된 12A11 버젼을 고안하였다. 부위 지시된 돌연변이유발 및 클론 구성을 상기 C 부분에서 개시한 대로 실시하였다. 재조합 항체를 COS 세포에서 발현시키고 COS 세포 상등액으로부터 정제하였다. 추가의 버젼은 상기의 조합, 예를들어, 적어도 하나의 패킹 및/또는 공인 잔기(위치 28, 37, 48, 67, 71 및 78에서의 인간 잔기 또는 위치 28, 37, 48, 67, 71, 73 및 78에서의 인간 잔기)와 조합된 1, 2, 3, 4 또는 5 베르니에 잔기에서의 인간 잔기를 포함할 수 있다.

D. 인간화된 12A11 항체 - 버젼 7 및 8

잔기 28(베르니에)에서 T → S 역돌연변이, 및 잔기 37(패킹)에서 V →I 역돌연변이를 제외하고는, 버젼 1에 대해 나타낸 역돌연변이의 각각을 갖는 인간화된 12A11의 일곱번째 버젼을 생성한다. 잔기 73(베르니에)에서 N → T 역돌연변이를 제외하고는, 버젼 1에 대해 나타낸 역돌연변이 각각을 갖는 인간화된 12A11의 여덟번째 버젼을 생성한다. 인간화된 12A11 버젼 7과 8 중쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 30과 31에 각각 개시된다.

버젼 1에 비하여, 버젼 7은 단지 7개의 역돌연변이를 함유한다. T28S 역돌연변이는 보존적이며 중쇄의 버젼 7에서 제거된다. 패킹 잔기 V37I에서의 역돌연변이는 또한 버젼 7에서 제거된다. 버젼 1에 비하여, 버젼 7은 단지 8개의 역돌연변이를 함유한다. 버젼 8에서, N73T(베르니에) 역돌연변이가 제거된다.

추가의 버젼은 상기의 조합, 예를 들어, 위치 28, 48, 78 및 73으로부터 선택된 1,2,3,4(또는 5) 잔기에서의 인간 잔기(예, 역돌연변이의 제거)를 선택적으로 적어도 하나의 패킹 잔기(예, 위치 37) 및/또는 적어도 하나의 공인 잔기에서의 역돌연변이의 제거와 함께 포함할 수 있다.

실시예 VI : 인간화된 12A11 항체의 기능적 텍스팅

인간화된 12A11 버젼 1을 실시예 V에 개시된 대로 클로닝하였다. 인간화된 12A11을 COS 세포에서의 일시적 발현에 의해 생산하고, 공지의 방법에 따라 정제하였다. 인간화된 항체의 결합 활성을 먼저 정성적 ELISA 분석(데이터 안나타남)에 의해 입증하였다. 입간화된 12A11 버젼 1을 추가로 두 가지 특성, 즉 항원 결합(정량적 Aβ ELISA) 및 상대적 친화성에 대해 그 쥐 및 키메라 대응체에 비교하였다. h12A11v1의 결합 활성은 정량적 Aβ ELISA에서 확인하였으며 12A11의 쥐 및 키메라 형태와 동일한 것으로 밝혀졌다(도 7 참고).

h12A11v1 항체의 친화성을 또한 경쟁적 Aβ ELISA에 의해 쥐 및 키메라 12A11 항체와 비교하였다. 경쟁적 결합 분석을 위하여, 비오틴 접합된 재조합 마우스 12A11Cγ2a(아이소타입 전환된 12A11)를 이용하였다. 응집 Aβ1-42에 대한 비오틴화된 m12A11 Cγ2a의 결합 활성을 스트렙타비딘-HRP를 리포터로 이용하여 ELISA 분석에 의해 확인하였다. HRP 접합된 염소 항-마우스 HRP를 리포터로 이용하여, 12A11의 두 아이소형태(Cγ1, Cγ2a)에 의한 Aβ 결합의 직접적인 비교 결과, 비오틴 접합된 재조합 12A11Cγ2a가 원래의 Cγ1 마우스 항체와 비교할만함을 확인하였다.

경쟁 결합 연구는 고정된 농도의 비오틴 접합된 m12A11 Cγ2a 및 도 8에 나타난 대로 시험 항체의 일정 범위의 농도와의 경쟁을 이용하였다. 도 8은 h12A11v1을 키메라 및 쥐 형태와 비교하는 h12A11v1 경쟁 분석의 결과를 보여준다. 인간화된 12A11v1은 2X IC50 값내에서 그 쥐 및 키메라 대응체와 경쟁하였다. 이 데이터는 쥐 Cγ2a 및 h12A11v1 각각에 대해 38 nM 및 23 nM의 KD 값을 나타낸 비아코어 기술(데이터 안나타남)을 이용한 친화성 결정과 일치한다. 요약하면, 발견 사항은 h12A11v1이 그 쥐 대응체의 항원 결합 특성 및 친화성을 보유함을 제안한다.

COS 세포를 상이한 조합의 인간화된 12A11VH 및 h12A11VLv1로 일시적으로 형질감염시켰다. 조절된 배지를 형질감염 후 72시간에 수집하였다. 형질감염된 COS 세포로부터의 조절된 배지에서 항체 농도를 정량적 인간 IgG ELISA에 의해 결정하였다. 정량적 Aβ(1-42) 응집물 결합 분석 결과 h12A11v2, v2.1 및 v3이 항원 결합에 대하여 h12A11v1 및 키메라 12A11에 비교할만 함을 확인하였다. 더욱이, 버젼 5.1-5.6 및 6.1-6.3은 이 결합 분석에서 시험할 때 유사한 결합 활성을 나타낸다. 버젼 6.4는 분석에서 활성의 일부 손실을 나타냈으나 활성은 v2에서는 주목할정도로 회복되었다.

쥐 12A11 및 h12A11v1을 위한 결합 특성을 또한 비아코어 기법을 이용하여 비교하였다. 쥐 12A11 및 h12A11v1은 저밀도 또는 고밀도 고정 Aβ 펩티드(바이오-DAE 펩티드)에 노출될 때 유사한 결합 프로파일을 나타냈다. 쥐 12A11 대 h12A11v1의 동력학 분석을 또한 실시하였다. 이들 연구에서, 비아코어 기법을 이용하여 고체상 결합된 비오틴화된 DAE 펩티드에의 가용성 항체의 결합을 측정하였다. 펩티드를 스트렙타비딘 바이오센서 칩에 고정시키고, 이어서 각 항체의 변하는 농도를 세벌로 가하고 시간의 함수로서 결합을 측정하였다. 동력학 데이터는 이가 모델에 적용된 BIA 평가 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 겉보기 해리(k_d) 및 결합(k_a) 속도 상수를 구형 분석을 이용하여 센서그램의 적절한 영역으로부터 계산하였다. 바이오-DAE10과 항체 사이의 상호작용의 친화성 상수를 동력학 속도 상수로부터 계산하였다. 이들 측정값으로부터 겉보기 해리(kd) 및 결합(ka) 속도 상수를 유도하여 상호작용을 위한 K_D 값을 계산하기 위하여 이용하였다. 표 12는 비아코어 분석에 의해 결정된 12A11 항체의 Aβ 결합의 동력학 분석의 요약을 포함한다.

[표 12]

데이터는 인간화된 12A11 v1이 모 쥐 12A11과 비교할 때 Aβ 펩티드에 대해 유사한 친화성을 가짐을 나타낸다.

실시예 VII . 인간 개체의 예방 및 치료

인간에서의 안전성을 결정하기 위하여 단일-투여 제 1상 시험을 실시한다. 치료제를 가정된 효능의 약 0.01 수준에서 시작하여 효과적인 마우스 투여량의 약 10배 수준에 도달할 때까지 3의 인자만큼씩 증가하는 투여량으로 상이한 환자에게 투여한다.

제 2상 시험은 치료 효능을 결정하기 위하여 실시된다. 가능한 AD를 위한 알츠하이머 병 및 관련 질환 연합(ADRDA) 기준을 이용하여 정의된 초기 내지 중기 알츠하이머 병을 갖는 환자가 선택된다. 적합한 환자는 최소-정신 상태 검사(MMSE)에서 12-26 범위로 기록한다. 다른 선택 기준은 환자가 연구동안 생존할 가능성이 높으며 방해할 수 있는 수반되는 의약의 사용과 같은 복잡한 이슈가 없다는 것이다. 환자 기능의 기본 평가는 알츠하이머 병 상태 및 기능을 가진 환자를 평가하기 위한 포괄적인 스케일인 ADAS 및 MMSE와 같은 전통적인 정신측정학적 수단을 이용하여 만들어진다. 이들 정신측정학적 스케일은 알츠하이머 상태의 진전의 척도를 제공한다. 적합한 정성적인 수명 스케일을 또한 치료의 모니터를 위하여 이용할 수 있다. 질병 진전은 또한 MRI에 의해 모니터될 수 있다. 환자의 혈액 프로파일은 또한 면역원-특이적 항체 및 T-세포 반응의 분석을 비롯하여 모니터될 수 있다.

기본 측정에 이어, 환자는 치료를 받기 시작한다. 그들은 임의화되어 블라인드 방식으로 치료제 또는 위약으로 치료된다. 환자를 적어도 6개월마다 모니터한다. 효능은 위약 그룹에 비하여 치료 그룹의 진전에서 상당한 감소에 의해 결정한다.

제 2상 시험은 때때로 연령-관련 기억 손상(AAMI) 또는 온화한 인지 손상(MCI)로 불리는 비-알츠하이머 병 초기 기억 손실에서 ADRAD 기준에 의해 정의된 가능한 알츠하이머 병으로의 환자의 전환을 평가하기 위해 실시한다. 알츠하이머 병으로의 전환 위험이 높은 환자는 기억 손실의 초기 신호 또는 프리-알츠하이머 증상과 관련된 다른 어려움, 알츠하이머병의 가족력, 유전적 위험 인자, 연령, 성별, 및 알츠하이머 병의 고위험을 예측하는 것으로 발견된 다른 특징에 대해 기준 집단을 스크린함으로써 비임상 집단으로부터 선택된다. 보다 정상적인 집단을 평가하기 위해 고안된 다른 미터법과 함께 MMSE 및 ADAS를 비롯한 적합한 미터법에서의 기준 점수를 수집한다. 이들 환자 집단을 제제를 이용한 대안의 투여에 대한 위약 비교를 갖는 적합한 그룹으로 나눈다. 이들 환자 집단을 약 6개월 간격으로 팔로우하며, 각 환자를 위한 종말점은 그 또는 그녀가 관찰 마지막에 ADRDA 기준에 의해 정의된 가능한 알츠하이머 병으로 전환하는 지 여부이다.

전술한 발명이 이해를 명확히 하기 위하여 상세히 개시되었지만, 일부 변형이 첨부된 청구범위의 범위내에서 실시될 수 있음이 명백할 것이다. 여기서 언급된 모든 문헌 및 특허 문서 및 도면 과 서열 목록에서 나타나는 문서는 각각이 개별적으로 명시된 것과 마찬가지로 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.

상기로부터, 본 발명이 많은 용도를 제공함이 명백할 것이다. 예를 들어, 본 발명은 아밀로이드원성 질병의 치료, 예방 또는 진단에서, 또는 이때 사용하기 위한 의약 또는 진단 조성물의 제조에서 전술한 Aβ에 대한 항체의 용도를 제공한다.

SEQUENCE LISTING <110> Neuralab Limited, Wyeth et al. <120> HUMANIZED ANTIBODIES THAT RECOGNIZE BETA AMYLOID PEPTIDE <130> ELN-028PC <150> 60/474654 <151> 2003-05-30 <160> 35 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 393 <212> DNA <213> Murine <220> <221> CDS <222> (1)...(393) <220> <221> sig_peptide <222> (1)...(57) <400> 1 atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct 48 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala -15 -10 -5 tcc agc agt gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96 Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 1 5 10 agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc att 144 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile 15 20 25 gta cat agt aat gga aac acc tac tta gaa tgg tac ctg cag aaa cca 192 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 30 35 40 45 ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct 240 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu 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ELN-028PC - 1 -

Claims (11)

1. 아밀로이드 베타 펩티드(Aβ)에 특이적으로 결합하는 인간화된 12A11 항체로서, 인간화된 경쇄 가변 영역은 서열 번호 7의 1-112번 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 가지고, 인간화된 중쇄 가변 영역은 서열번호 22 또는 서열번호 23의 1-121번 아미노산; 또는 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28로 구성되는 군으로부터 선택된 서열의 1-120번 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 것인 인간화된 12A11 항체.
2. 제1항의 인간화된 중쇄 가변 영역을 암호화하는 분리된 핵산.
3. 제1항의 인간화된 경쇄 가변 영역을 암호화하는 분리된 핵산.
4. 제1항의 인간화된 중쇄 가변 영역 및 인간화된 경쇄 가변 영역을 각각 암호화하는 분리된 핵산.
5. 제4항의 핵산을 포함하는 벡터.
6. 제5항의 벡터를 포함하는 분리된 숙주 세포.
7. 제6항의 숙주 세포를 항체 또는 항원 결합 단편이 생산되는 조건하에서 배양하는 단계, 및 숙주 세포 또는 배양물로부터 항체를 분리하는 단계를 포함하는, 인간화된 12A11 항체의 제조 방법.
8. 제1항의 인간화된 12A11 항체 및 약학적 담체를 포함하는 아밀로이드원성 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 아밀로이드원성 질병은 전신성 아밀로이드증, 알츠하이머 병, 성숙 개시 당뇨병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 이마관자 치매, 또는 인간에서의 쿠루 및 크루츠펠트-야콥 병 그리고 양과 소에서의 면양떨림병 및 BSE와 같은 프리온-관련 전염성 스폰지형태 뇌병증인 것인 약학 조성물.
9. 제8항에 있어서, 아밀로이드원성 질병은 알츠하이머 병인 것인 약학 조성물.
10. 제8항에 있어서, 투여량이 0.01 내지 5 mg/kg 체중의 범위인 것인 약학 조성물.
11. 제10항에 있어서, 투여량이 1 mg/kg 체중인 것인 약학 조성물.

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