EA005005B1

EA005005B1 - ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД β1α-ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА, ЕГО МУТАНТНЫЕ ФОРМЫ И ПРОИЗВОДНЫЕ И СОДЕРЖАЩАЯ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ

Info

Publication number: EA005005B1
Application number: EA200100447A
Authority: EA
Inventors: Эдриан Витти; Лаура Ранкель; Маргот Брикельмэйер; Паула Хочман
Original assignee: Байоджен, Инк.
Priority date: 1998-10-16
Filing date: 1999-10-15
Publication date: 2004-10-28
Also published as: CZ20011330A3; DK1121382T3; HK1042098B; EE200100223A; IS5887A; CN100480266C; MXPA01003790A; DE69931507T2; HK1042098A1; KR100767649B1; EP1121382B1; AU766190B2; JP2010268810A; US20090286958A1; NO20011861D0; EE05111B1; ES2265693T3; IL142350A; US7527946B2; HUP0200414A2

Abstract

Раскрыт полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 45-60, причем каждый полипептид также содержит шарнирный, СН2- и СН3-домены иммуноглобулина, его производное и содержащая его фармацевтическая композиция.

Description

Предпосылки изобретения

Применение полипептидов и белков для системного лечения конкретных заболеваний в настоящее время широко используется в медицинской практике. Роль, которую эти вещества играют в терапии, так важна, что многочисленные усилия исследователей направлены на их синтез в больших количествах с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Многие из этих полипептидов являются эндогенными молекулами, биологическое действие которых осуществляется очень эффективно и специфично.

Основной фактор, ограничивающий применимость этих белковых веществ для намеченного применения, состоит в том, что при парентеральном введении они выводятся из организма в течение короткого времени. Это может происходить в результате протеазного метаболизма или при клиренсе с вовлечением обычных механизмов удаления белков, таких как фильтрация в почках. Проблемы, связанные с этими способами введения белков, хорошо известны в фармацевтической промышленности, и при попытках решить их используются различные стратегии.

Интерфероны представляют собой семейство пептидов, на котором были сфокусированы многочисленные клинические исследования и усилия, предпринятые для усовершенствования способов их введения и биологического усвоения. Наличие интерферонов было определено при различных клинических болезненных состояниях. Применимость β-интерферона человека, одного из членов этого семейства, лучше всего установлена для лечения рассеянного склероза. Для лечения этого заболевания в Европе и США недавно были лицензированы две формы рекомбинантного β-интерферона. Одна форма представляет собой β-1 α-интерферон (торговые марка и название ΑνΟΝΕΧ®, шГд. Вюдсп. 1пс., СатЬпбдс. ΜΑ), далее в данном документе упоминается как β-ΐα-интерферон, или ΙΕΝ-β-1α, или ΙΕΝ-β-1α, или β-1αинтерферон, используемые взаимозаменяемо. Другая форма представляет собой β-1βинтерферон (торговые марка и название ВЕΤΑ8ΕΚΟΝ®, Вег1ех., РюНтопб СА), далее в данном документе упоминается как β-1βинтерферон. β-1 α-Интерферон продуцируется в клетках млекопитающих с использованием нативной последовательности гена человека и гликозилируется, тогда как β-1 β-интерферон продуцируется бактериями Е. сой с использованием модифицированной последовательности гена человека, которая содержит генетически введенную замену цистеина на серии в аминокислотном положении 17, и не гликозилируется.

Ранее некоторые из авторов данного изобретения непосредственно сравнили относительную активность ίη νίΐτο β-1 α-интерферона и β-1β-интерферона в функциональных исследо ваниях и показали, что удельная активность β1 α-интерферон приблизительно в 10 раз выше, чем удельная активность β-1 β-интерферон (Випке1 е1 а1., 1998, Рбатт. Век. 15: 641-649). В результате исследований, призванных идентифицировать структурную основу этих различий в активности, авторы идентифицировали гликозилирование как единственное из известных структурных отличий между продуктами, которое влияет на удельную активность. Эффект углевода в значительной степени выражается через его стабилизирующее влияние на структуру. Стабилизирующий эффект углевода наблюдали в экспериментах по термической денатурации и 8ЕС анализе. Отсутствие гликозилирования также коррелирует с усилением агрегации и повышенной чувствительностью к термической денатурации. Ферментативное удаление углевода из β-1 α-интерферона с помощью ΡΝΟазы Е вызывает интенсивное осаждение дегликозилированного продукта.

Эти исследования показывают, что, несмотря на сохранение одинаковой последовательности β-1 α-интерферона и β-1β-интерферона, они различны биохимически, и, таким образом, многое из того, что известно о β-1βинтерфероне, не может быть применено к β-1αинтерферону и наоборот.

Сущность изобретения

Авторы данного изобретения использовали преимущества гликозилированного β-интерферона по сравнению с его негликозилированными формами. В частности, авторы разработали композицию β-1 α-интерферона с повышенной активностью по сравнению с β-1β-интерфероном, и которая также имеет полезные свойства гибридных белков, как правило, без существенной утраты активности по сравнению с формами β-1 α-интерферона, которые не являются гибридными белками. Так, если модификации проводят таким образом, чтобы продукты (гибридные белки β-1 α-интерферона) сохраняли всю или большую часть биологической активности, в результате могут быть получены следующие свойства: изменение фармакокинетики и фармакодинамики, что приводит к увеличению периода полужизни и изменению распределения в тканях (например, способность оставаться в сосудистом русле в течение более длительного периода времени). Такая готовая препаративная форма является существенным достижением в фармацевтической и медицинской областях и может внести значительный вклад в лечение различных заболеваний, в которых применяется интерферон, таких как рассеянный склероз, фиброз и другие воспалительные или аутоиммунные заболевания, злокачественные опухоли, гепатит и другие вирусные заболевания, а также заболевания, характеризующиеся неоваскуляризацией. В частности, способность сохраняться в течение длительного времени в сосудистом русле позволяет использовать β-1 αинтерферон для подавления ангиогенеза и возможно для проникновения через гематоэнцефалический барьер.

В частности, данное изобретение относится к выделенному полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность Χ-Υ-Ζ, где X представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотной последовательности β-интерферона, или ее фрагмент; Υ представляет собой необязательный линкерный фрагмент; и Ζ представляет собой полипептид, включающий, по меньшей мере, фрагмент полипептида, отличного от β-интерферона. Необязательный фрагмент Υ и необходимый фрагмент Ζ могут быть связаны либо с Ν-концом, либо с С-концом β-интерферона (X). Предпочтительно X представляет собой человеческий β-1αинтерферон. В предпочтительных воплощениях Ζ представляет собой, по меньшей мере, фрагмент константной области иммуноглобулина, и может быть получен из иммуноглобулина, принадлежащего к классу, выбранному из 1дМ, 1дС. 1§ϋ, 1дА и 1дЕ. Если таким классом является 1д6, то его выбирают из 1§61, 1§62, 1дС3 и 1дС4. Константная область человеческих 1дМ и 1дЕ содержит 4 константных участка (СН1, (шарнир), СН2, СН3 и СН4), тогда как константная область человеческих 1дС, 1дА и Ι§Ό содержит 3 константных участка (СН1, (шарнир), СН2 и СН3). В наиболее предпочтительных гибридных белках данного изобретения константная область содержит, по меньшей мере, шарнирный домен и домены СН2 и СН3. В других воплощениях фрагмент Ζ представляет собой, по меньшей мере, фрагмент полипептида, который содержит иммуноглобулинподобные домены. Примеры таких других полипептидов включают СЭЕ СЭ2, СЭ4 и члены I и II классов антигенов главного комплекса гистосовместимости.

В другом воплощении данного изобретения предоставляется гибридный белок, имеющий аминоконцевую область, состоящую из аминокислотной последовательности β-интерферона или ее фрагмента, и имеющий карбоксиконцевую область, включающую, по меньшей мере, фрагмент белка, отличного от бетаинтерферона. Карбоксиконцевая область предпочтительно представляет собой, по меньшей мере, фрагмент константной области иммуноглобулина, полученный из иммуноглобулина, принадлежащего к классу, выбранному из 1дМ, 1д6, 1§р, 1дА и 1дЕ. В наиболее предпочтительных гибридных белках константная область содержит, по меньшей мере, шарнирный домен и домены СН2 и СН3.

В другом воплощении данного изобретения предоставляется гибридный белок, в котором фрагмент β-интерферона (например, X в приведенной выше формуле) подвергается мутации с получением мутеинов, обладающих селективно повышенной антивирусной и/или антипролиферативной активностью или другими свойствами, улучшенными по сравнению с немутированными формами β-1 α-интерферона.

В дальнейшем аспекте данного изобретения предоставляется гибридный белок на основе β-1 α-интерферона, включающий β-1α-интерферон и добавочный полипептид, с которым в природе он не связан, в существенно очищенном виде, причем гибридный белок обладает антивирусной активностью, приблизительно равной антивирусной активности β-1αинтерферон, не содержащего добавочный полипептид.

В следующем аспекте данного изобретения предоставляется фармацевтическая композиция, включающая терапевтически эффективное количество гибридного белка на основе β-1αинтерферона.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - последовательность кДНК и расшифрованная аминокислотная последовательность гибрида гистидиновый маркер - β-интерферон (упоминаемого также Ы§ ΙΡΝ-β или Н18₆-маркер).

Приведены последовательность полноразмерной ДНК и белковая последовательность Ιιίδ ΙΡΝ-β-1α. В отщепленной под действием УСАМ-1 сигнальной последовательности остается 3 аминоконцевых остатка (8етС1уС1у) выше гистидинового маркера (Н15₆, положения 4-9). Последовательность энтерокиназного линкера (АкрАкрАкрАкрЬук) отделена от гистидинового маркера спейсером (положения 10-12, 8ет8ет61у). Белковая последовательность природного ШМ^-Ш занимает положения (Ме!18А5П183).

Фиг. 2 - кДНК и расшифрованная аминокислотная последовательность гибридного белка β-1α-интерферон/Ρс.

Приведены последовательность полноразмерной ДНК и белковая последовательность человеческого IΡN-β-1α/мышиный Ре. Белковые последовательности человеческого ΙΡΝ-β-1α перекрывают аминокислотные последовательности 1-166 (ДНК последовательности 1-498). Энтерокиназная линкерная последовательность перекрывает аминокислотные остатки 167-171 (ДНК последовательности 499-513). Белковая последовательность тяжелой цепи мышиного 1д62а перекрывает остатки 172-399 (ДНК последовательности 514-537).

Фиг. 3 - связывание аланинзамещенных мутантных форм β-интерферона с димерным гибридным белком, включающим внеклеточный домен цепи рецептора интерферона типа I,

ШНАВ2/Ре.

Связывающее сродство аланинзамещенных мутантных форм !ΡΝ (А1-Е) к рецепторной цепи ΙΕΝΑΚ2 определяют как описано в примере 1 (подраздел Ό). Гистограмма представляет их связывающее сродство в этом анализе по сравнению с диким типом Ηίδ-ΙΕΝ-β (% от д.т.). Значения % от д.т. рассчитывали как отношение (сродство дикого типа Ιιίδ-ΙΡΝ-β(/(сродство мутантного ΙΓΝ-β)χ100. Показаны % от д.т. (х) для серийных анализов (п = 3) и средний % от д.т. (х) для конкретного эксперимента. Мутантные формы А2, АВ1, АВ2 и Е не связывают ΙΕΝΑΚ2Τε при концентрациях, превышающих в 500 раз количество Ηίδ-ΙΕΝ-β, соответствующее ЕС50 (*).

Фиг. 4 - связывание аланинзамещенных мутантных форм β-интерферона с рецепторными комплексами клеточной поверхности для интерферона типа Ι (комплекс ΙΕΝΑΚ1/2), экспрессированными на клетках лимфомы Дауди-Беркитта.

Рецептор-связывающие свойства аланинзамещенных мутантных форм (А1-Е) определяли с помощью анализа связывания рецептора клеточной поверхности с использованием ЕАС8 (клеточный сортер с возбуждением флуоресценции), как описано в примере 1 (подраздел Ό). Гистограмма представляет их рецепторсвязывающее сродство в этом анализе по сравнению с диким типом Ηίδ-ΙΕΝ-β (% от д.т.). Значения % от д.т. для каждой мутантной формы рассчитывали как отношение (сродство д.т. ΙιίδIΕN-β)/(сродство мутантного ΙΕΝ-β)χ100. Показаны значения % от д.т. (о) для серийных анализов под гистограммой и средние значения % от д.т. (х) для конкретного эксперимента.

Фиг. 5 - антивирусная активность аланинзамещенных мутантных форм β-интерферона.

Антивирусную активность аланинзамещенных мутантных форм (А1-Е) определяли на человеческих клетках А549, зараженных вирусом ЕМС, как описано в примере 1 (подраздел Е). Гистограмма представляет их активность в этом анализе по сравнению с диким типом Ιιίδ-ΙΕΝ-β (% от д.т.). Значения % от д.т. рассчитывали как отношение обратной концентрации мутантного ΙΕΝ-β (50% сре)/ концентрации д.т. Ηίδ-ΙΕΝ-β (50% сре)х100. Показаны значения % от д.т. (о) для множественных анализов и средние значения для экспериментального набора данных (х).

Фиг. 6 - антипролиферативная активность аланинзамещенных мутантных форм βинтерферона.

Антипролиферативную активность аланинзамещенных мутантных форм (А1-Е) определяли на клетках лимфомы Дауди-Беркитта, как описано в примере 1 (подраздел Е). Гистограмма представляет их активность в этом анализе по сравнению с диким типом Ιιίδ-ΙΕΝ-β (% от д.т.). Значения % от д.т. рассчитывали как отношение концентрации д.т. Ιιίδ-ΙΕΝ-β (50% ингибирования роста)/концентрации мутантного

ΙΕΝ-β (50% ингибирования роста)х100. Показаны значения % от д.т. (о) для множественных анализов и средние значения для экспериментального набора данных (х).

Фиг. 7 - относительная антивирусная и антипролиферативная активность аланинзамещенных мутантных форм β-интерферона.

Сравнивали относительную активность аланинзамещенных мутантных форм (А1-Е) в антивирусном (ось X) и антипролиферативном (ось Υ) анализах. Для проведения этого сравнения использовали средние значения процента от активности дикого типа Ιιίδ-ΙΕΝ-β (% от д.т. (х)), приведенные на фиг. 5 и 6. Мутантные формы с пропорциональным отношением падение/рост активности попадают на вертикальную линию, или в близлежащую к этой линии область. Мутантные формы с непропорциональным отношением падение/рост антивирусной или антипролиферативной активности попадают в существенно отдаленную от диагональной линии область (ΌΕ1. Ό, С1). Значение определяли из анализа стандартных отклонений, присущих используемым средним значениям % от д. т.

Фиг. 8 - антивирусная активность гибридного белка β-1α-интерферон/Iд.

Активность β-1а-интерферон (использующегося в виде ΑνΟΝΕΧ®) или гибридного белка [Па-интерферон/мышиный Ι§2α в концентрациях, указанных на оси X, оценивали в антивирусных анализах с использованием клеток карциномы легких человека (А549), зараженных вирусом ЭМК (энцефаломиокардита). После двух дней инкубации с вирусом жизнеспособные клетки окрашивали МТТ, плашки считывали при 450 нм и поглощение, которое отражало жизнеспособность клеток, указывали на оси Υ. Стандартные отклонения показаны как величины ошибки. Концентрация β-1α-интерферона (использующегося в виде ΑνΟΝΕΧ® Ьи1к ш1сгшсб1а1с), которая предлагается (50% от максимального ΟΌ450) и, следовательно, 50% вирусной гибели (50% цитопатический эффект), составляла приблизительно 0,4 пМ, а 50% цитопатический эффект для гибридного β-1ηинтерферона соответствовал приблизительно 0,15 пМ.

Фиг. 9 - измерения антивирусной активности β-интерферона в плазме мышей, обработанным гибридным белком β-1α-интерферон/Εс или β-1α-интерфероном.

Мышам внутривенно вводили или 50000 ед. β-1α-интерферона (использующегося в виде ΑνΟΝΕΧ® Ьи1к ш1сгтсб1а1с), или 50000 ед. гибридного белка β-1α-интерферон/Εс. Кровь от этих мышей получали из ретро-орбитального синуса через различные промежутки времени после введения интерферона, как указано на оси X. Для каждой временной точки кровь брали по меньшей мере у 3 мышей, плазму получали и замораживали до того времени, когда актив

Ί ность β-интерферона оценивали в антивирусных анализах с использованием клеток карциномы легкого человека (А549), зараженных вирусом энцефаломиокардита. Жизнеспособные клетки окрашивали раствором МТТ, плашки считывали при 450 нм для определения поглощения, которое свидетельствует о жизнеспособности клеток и активности β-интерферон. Стандартные кривые получали для каждой плашки с использованием β-1 α-интерферона в виде ΑνΟΝΕΧ® и использовали для количественного определения активности β-интерферона в каждом образце. Приведены данные для индивидуальных животных.

Фиг. 10 - последовательность полноразмерной ДНК и белковая последовательность открытых рамок считывания непосредственного гибрида человеческого ΙΕΝ-β и человеческого 1дО1Рс (ΖΕ5107).

Фиг. 11 - последовательность полноразмерной ДНК и белковая последовательность открытой рамки считывания гибридного белка, состоящего из человеческого ΙΤΝ-β/линкера 048/человеческого 1дО1Рс (ΖΤ6206).

Подробное описание изобретения

Все ссылки, цитируемые в подробном описании, включены в данный документ в качестве ссылок, если не оговорено иначе. В данном документе используются следующие термины.

I. Определения.

Интерферон - интерферон (также упоминается как ΙΡΝ) представляет собой небольшой, видо-специфичный одноцепочечный полипептид, продуцирующийся клетками млекопитающих в ответ на воздействие ряда индукторов, таких как вирусы, полипептиды, митогены и т. п. Наиболее предпочтительным интерфероном, использующимся в данном изобретении, является гликозилированный человеческий βинтерферон, который гликозилирован по 80 остатку (Αδη 8) и который предпочтительно получают посредством технологий рекомбинантных ДНК. Этот предпочтительный гликозилированный β-интерферон называют β-ΐα-интерферон (или ΙΡΝ-β-1α, или ΙΡΝ-β-1α, или β-1αинтерферон, или β-1α-интерферон, или β1а-интерферон-, используемые взаимозаменяемо). Подразумевается, что термин β-1αинтерферон также охватывает все мутантные формы (см. пример 1), при условии, что мутантные формы также являются гликозилированными по остатку Αδη 80.

Способы получения белков, включая интерфероны, с использованием рекомбинантных ДНК, являются известными. См., например, патенты США 4399216, 5149636, 5179017 (Ахе1 е1 а1.) и 4470461 (КаиГтап).

Предпочтительные полинуклеотиды, которые могут использоваться в способах настоящего изобретения, получают из генных последовательностей β-интерферона дикого типа различ ных позвоночных животных, предпочтительно млекопитающих, с помощью методов, хорошо известных рядовым специалистам в данной области, таких как методы, описанные в следующих патентах США: патент США 5641656 (выданный 24 июня 1997 г.: ΌΝΑ епсобшд а\зап 1уре I шЮгГегоп ргоргсЛеш апб такие а\зап 1уре I 1п1ет£етоп), патент США 5605688 (25 февраля 1997 г.: тесотЬшап! бод апб йогае 1уре I 1п(егГегοιΐδ): патент США 5231176 (27 июля 1993 г.: ΌΝΑ то1еси1е епсобшд а йитап 1еикосу1е ί п(егГегоп): патент США 5071761 (10 декабря 1991 г.: ΌΝΑ δе^иеηсе собшд Гог δΐώ^ίμκΐ'^δ оГ йитап 1утрйоЬкМо1б йИегГегош йу1РХ-а1рйа-2 апб ЬуШЫ-а1рйа-3): патент США 4970161 (13 ноября 1990 г.: ΌΝΑ δе^иеηсе собшд Гог йитап 1п1егГегоп-датта): патент США 4738931 (19 апреля 1988 г.: ΌΝΑ соШашшд а йитап йиегГегоп Ье!а депе): патент США 4695543 (22 сентября 1987 г.: йитап а1рйа-й11ег[сгоп Ох-1 депе) и патент США 4456748 (26 июня 1984 г.: ΌΝΑ епсобшд δΐώ^ίμκΐ'^δ оГ б1ГГегеп(. па(ига11у осситпд 1еикосу1е йИегГегснъ).

В соответствии с данным изобретением могут быть использованы мутантные формы β1а-интерферона. Мутации проводят с помощью традиционных методов направленного мутагенеза, известных рядовым специалистам в данной области. Кроме того, данное изобретение предоставляет функционально эквивалентные полинуклеотиды β-1α-интерферона, которые кодируют функционально эквивалентные полипептидные последовательности β^α^Μ^ферона.

Первый полинуклеотид, кодирующий β1 α-интерферон, является функционально эквивалентным по отношению ко второму полинуклеотиду, кодирующему β-1 α-интерферон, если он удовлетворяет по меньшей мере одному из следующих условий:

(a) функциональным эквивалентом является первый полинуклеотид, который гибридизуется со вторым полинуклеотидом в стандартных условиях гибридизации, и/или является вырожденным по отношению к первой полинуклеотидной последовательности. Наиболее предпочтительно он кодирует мутантную форму интерферона, обладающую терапевтической активностью β-1 α-интерферона:

(b) функциональным эквивалентом является первый полинуклеотид, который программирует экспрессию аминокислотной последовательности, которую кодирует второй нуклеотид.

Таким образом, термин интерферон включает, не ограничиваясь ими, перечисленные выше агенты, а также их функциональные эквиваленты. В данном документе термин функциональный эквивалент, следовательно, относится к белку β-1 α-интерферон, или к полинуклеотиду, кодирующему белок β^α^^^ферон, который обладает таким же или улуч шенным полезным действием на млекопитающего-реципиента, как и интерферон, функциональным эквивалентом которого он считается. Как известно рядовому специалисту в данной области, функционально эквивалентный белок может продуцироваться посредством рекомбинантных методов, например, посредством экспрессии функционально эквивалентной ДНК. Соответственно настоящее изобретение охватывает белки β-1 α-интерферон, которые кодируются встречающимися в природе ДНК, а также синтетическими ДНК, которые кодируют тот же белок, что и встречающиеся в природе ДНК. Вследствие вырожденности кодирующих нуклеотидных последовательностей для кодирования β-1 α-интерферона могут использоваться другие полинуклеотиды. Они включают фрагменты вышеупомянутых последовательностей, или вышеупомянутые последовательности целиком, которые изменены в результате замещения различных кодонов, кодирующих одни и те же аминокислотные остатки в пределах последовательности, что приводит, таким образом, к образованию молчащей замены. Измененные таким образом последовательности рассматриваются в качестве эквивалентов этих последовательностей. Например, Р11С (Р) кодируют два кодона, ТТС или ТТТ, Туг (Υ) кодируют ТАС или ТАТ и ΗΪ8 (Н) кодируют САС или САТ. С другой стороны, Тгр (XV) кодирует единственный кодон, ТСС. Соответственно, понятно, что для данной последовательности ДНК, кодирующей конкретный интерферон, существует много вырожденных последовательностей ДНК, которые кодируют его. Вырожденные последовательности ДНК рассматриваются в объеме данного изобретения.

Гибрид - относится к колинеарным, ковалентно связанным через индивидуальные пептидные каркасы, двум или более белкам или их фрагментам, наиболее предпочтительно продуцируемым посредством генной экспрессии полинуклеотидной молекулы, кодирующей эти белки. Предпочтительно, если белки или их фрагменты происходят из разных источников. Таким образом, предпочтительные гибридные белки включают белок β-1 α-интерферон, или его фрагмент, ковалентно связанный со вторым компонентом, который не является интерфероном. Конкретно, гибрид интерферон-в/1д представляет собой белок, включающий молекулу β-интерферона данного изобретения (например, β-1 α-интерферона) или ее фрагмент, Νконец или С-конец, которой связан с Ν-концом иммуноглобулиновой цепи, где часть Νконцевой области иммуноглобулина заменена на β-интерферон. Разновидностью гибридного белка β-интерферон/Iд является гибрид βинтерферон/Ге, который представляет собой белок, включающий молекулу β-интерферона данного изобретения (например, β-1α интерферона), связанную по меньшей мере с частью константного домена иммуноглобулина. Предпочтительный Рс-гибрид включает молекулу β-интерферона данного изобретения, связанную с фрагментом антитела, содержащим Сконцевой домен тяжелой цепи иммуноглобулина.

Кроме того, термин гибридный белок обозначает белок интерферон-β, химически связанный через моно- или гетерофункциональную молекулу со вторым компонентом, который не является белком β-интерферон и который получают бе ηονο из очищенного белка, как описано ниже.

В данном документе термин рекомбинантный означает, что белок получают из рекомбинантной экспрессирующей системы млекопитающего. Белок, экспрессирующийся в большинстве бактериальных культур, например, в Е. сой, не содержит гликана, поэтому эти экспрессирующие системы не являются предпочтительными. Белок, экспрессирующийся в дрожжах, может содержать олиго-сахаридные структуры, которые отличаются от олигосахаридных структур белка, экспрессированного в клетках млекопитающего.

Термин биологически активный, использующийся в данном описании в качестве характеристики β-1α-интерферона, означает, что конкретная молекула обладает достаточной степенью гомологии аминокислотной последовательности по сравнению с молекулами воплощений настоящего изобретения, раскрытых в данном документе, для того, чтобы быть способной к антивирусной активности, которую измеряют в антивирусном анализе ίη νίίτο такого типа, как показано в примере 1, как описано ниже.

Термин терапевтическая композиция, использующийся в данном документе, определяется как включающий белки данного изобретения и другие физиологически совместимые ингредиенты. Терапевтическая композиция может включать такие наполнители, как вода, минеральные вещества и носители, такие как белок.

Аминокислота - мономерная единица пептида, полипептида или белка. Существует двадцать аминокислот, обнаруженных в природных пептидах, полипептидах и белках, все они являются Ь-изомерами. Этот термин также включает аналоги этих аминокислот и Όизомеры аминокислот белков и их аналогов.

Модифицированная аминокислота представляет собой природную или синтетическую аминокислоту, в которой присутствующую в норме боковую цепь или концевую группу (или фрагмент сахара в случае β-1 α-интерферона) модифицируют с помощью химической реакции. Такие модификации включают, например, γ-карбоксилирование, β-карбоксилирование, конъюгирование с ПЭГ, сульфирование, суль фонирование, фосфорилирование, амидирование, этерифицирование, Ν-ацетилирование, карбобензилирование, тозилирование, а также другие модификации, известные в данной области. Модифицированный полипептид представляет собой полипептид, содержащий одну или несколько модифицированных аминокислот и/или один или несколько модифицированных сахаров, если пептид является гликозилированным.

Белок - это любой полимер, состоящий, по существу, из любых из 20 аминокислот. Хотя термин полипептид часто используется для обозначения относительно больших полипептидов, а термин пептид часто используется для обозначения маленьких полипептидов, области применения этих терминов в данной области перекрываются и варьируют. Термин белок, как используется в данном документе, относится к пептидам, белкам и полипептидам, если не оговорено иначе.

Функциональным эквивалентом аминокислотного остатка является аминокислота, обладающая физико-химическими свойствами, сходными с физико-химическими свойствами аминокислотного остатка, который заменяют на функциональный эквивалент.

Мутантная форма - любое изменение в генетическом материале организма, в частности, любое изменение (например, делеция, замещение, добавление или изменение) в полинуклеотидной последовательности дикого типа, или любое изменение в белке дикого типа. Термин мутеин является взаимозаменяемым с термином мутантная форма.

Дикий тип - встречающаяся в природе полинуклеотидная последовательность экзона белка, или ее фрагмент, или белковая последовательность, или ее фрагмент, соответственно, как она обычно существует ίη νίνο.

Стандартные условия гибридизации - солевые и температурные условия, по существу, эквивалентные от 0,5 х 88С (раствор хлорида и цитрата натрия) до 5 х 88С и 65°С как для гибридизации, так и для промывания. Следовательно, в данном документе термин стандартные условия гибридизации является рабочим определением и охватывает разные условия гибридизации. Более строгие условия могут, например, включать гибридизацию с использованием буфера для скрининга бляшек (0,2% поливинилпирролидон, 0,2% фиколл 400; 0,2% бычий сывороточный альбумин, 50 мМ Тп5-НС1 (рН 7,5); 1М №С1; 0,1% пирофосфат натрия; 1% 8Ό8); 10% декстрансульфата и 100 мкг/мл денатурированной, обработанной ультразвуком, ДНК спермы лосося при 65°С в течение 12-20 ч, и промывание смесью 75 мМ №С1/7,5 мМ цитрат натрия (0,5 х 88С)/1% 8Ό8 при 65°С. Менее строгие условия могут, например, включать гибридизацию с использованием буфера для скрининга бляшек 10% декстрансульфата и 110 мкг/мл денатурированной, обработанной ультразвуком, ДНК спермы лосося при 55°С в течение 12-20 ч, и промывание смесью 300 мМ №С1/30 мМ цитрат натрия (2,0 х 88С)/1% 8Ό8 при 55°С. См. также СиггеШ Рго!осо1§ ίη Μο1еси1аг Βίοίοβν. ίοΐιη \УПеу & 8οηδ. 1пс. №\ν Уогк, Зес^то 6.3.1-6.3.6, (1989).

Последовательность, контролирующая экспрессию - это последовательность полинуклеотидов, которая контролирует и регулирует экспрессию генов, будучи оперативно связана с этими генами.

Оперативно связанный - полинуклеотидная последовательность (ДНК, РНК), оперативно связана с последовательностью, управляющей экспрессией, если управляющая экспрессией последовательность контролирует и регулирует транскрипцию и трансляцию этой полинуклеотидной последовательности. Термин оперативно связанный включает наличие соответствующего стартового сигнала (например, АТС) в начале полинуклеотидной последовательности, которая должна экспрессироваться, и сохранение правильной рамки считывания для обеспечения экспрессии полинуклеотидной последовательности под контролем последовательности, контролирующей экспрессию, и продукции целевого полипептида, кодируемого этой полинуклеотидной последовательностью.

Экспрессирующий вектор - полинуклеотид, такой как плазмидная или фаговая ДНК (среди других обычных примеров), который позволяет экспрессироваться по меньшей мере одному гену, если экспрессирующий вектор введен в клетку-хозяина. Вектор может быть способным или неспособным к репликации в клетке.

Выделенный (этот термин является взаимозаменяемым с термином существенно чистый) - при применении к нуклеиновой кислоте, например, полинуклеотидным последовательностям, которые кодируют полипептиды, обозначает полинуклеотидную последовательность РНК или ДНК, фрагмент геномного полинуклеотида, кДНК, или синтетический полинуклеотид, который в результате особенностей его происхождения или манипуляций, проведенных с ним, (ί) не связан с целым полинуклеотидом, с которым он связан в природе (например, присутствует в клетке-хозяине в виде экспрессионного вектора или его фрагмента); или (ίί) связан с нуклеиновой кислотой или другим химическим фрагментом, отличающимся от того, с которым он связан в природе; или (ίίί) не встречается в природе. Термин выделенный также обозначает полинуклеотидную последовательность, которую (ί) получают в результате амплификации ίη νίίτο посредством, например, полимеразной цепной реакции (РСК); (ίί) синтезируют химически; (ίίί) получают рекомбинантным методом путем клонирования; или (ίν) очищают, например, путем расщепления и разделения в геле.

Таким образом, существенно чистой нуклеиновой кислотой является нуклеиновая кислота, которая не соседствует непосредственно с одной или обеими кодирующими последовательностями, с которыми она обычно соседствует в природном геноме организма, из которого получают нуклеиновую кислоту. Существенно чистая ДНК также включает рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительные последовательности.

Выделенный (этот термин используется взаимозаменяемо с термином существенно чистый) - при применении к полипептидам обозначает полипептид или его фрагмент, который, в результате особенностей его происхождения или манипуляций, проведенных с ним (ί) присутствует в клетке-хозяине как продукт экспрессии фрагмента экспрессионного вектора; или (ίί) связан с белком или другим химическим фрагментом, отличным от того, с которым он связан в природе; или (ίίί) не встречается в природе. Термин выделенный также обозначает белок, который (ί) синтезируют химически; или (ίί) экспрессию которого осуществляют в клетке-хозяине и очищают его от связанных с ним белков. Этот термин обычно обозначает полипептид, который был отделен от других белков и нуклеиновых кислот, с которыми он встречается в природе. Предпочтительно этот полипептид также отделен от таких веществ, как антитела или гелеобразные матрицы (полиакриламид), которые используются для его очистки.

Гетерологичный промотер - в данном документе обозначает промотер, который в природных условиях не связан с геном или очищенной нуклеиновой кислотой.

Гомологичный - в данном документе является синонимом термину идентичный и относится к подобию последовательностей двух полипептидов, молекул, или двух нуклеиновых кислот. Если положение в обоих из двух сравниваемых последовательностей занято одной и той же основной или аминокислотной мономерной субъединицей (например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином, или положение в каждом из двух полипептидов занято лизином), то соответствующие молекулы являются гомологичными по этому положению. Процент гомологии двух последовательностей определяют как число парных или гомологичных положений, общих для двух последовательностей, деленное на число сравниваемых положений, х100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях являются равносильными или гомологичными, то две последовательности являются гомологичными на 60%. Например, последовательности ДНК СТСЛСТ СЛ66ТТ обладают 50% гомологией (3 из 6 общих положений являются равносиль ными). Обычно сравнение проводят при выравнивании двух последовательностей, с получением максимальной гомологии. Такое совмещение может быть проведено с помощью, например, метода №еб1етап е! а1., 1. Μοί. Βΐοΐ. 48: 443-453 (1970) с соответствующим обеспечением такими компьютерными программами, как Лйдп ргодгат (ΩΝΑδΙαΓ. 1пс.). Гомологичные последовательности имеют идентичные или подобные аминокислотные остатки, где подобные остатки представляют собой консервативные замещения на соответствующие аминокислотные остатки в выровненной последовательности отнесения, или разрешенные точковые мутации этих аминокислотных остатков. В этом отношении консервативными заменами остатков в последовательности отнесения являются замещения на такие остатки, которые физически или функционально подобны соответствующим остаткам отнесения, например, которые имеют сходный размер, форму, электрический заряд, химические свойства, включая способность образовывать ковалентные или водородные связи, или т. п. Особенно предпочтительными консервативными заменами являются замещения, удовлетворяющие критерию, определенному для допустимой точковой мутации в ЭауйоГГ е! а1., 5: А11а§ οί Рто!еш Зесщепсе апб 31гис!иге, 5: 8ирр1. 3, сйар!ет 22: 354-352, №11. Вютеб. Кек. Еоипбабоп, АакЫпд!оп, Ό. С. (1978).

Термины полинуклеотидная последовательность и нуклеотидная последовательность в данном документе также использующиеся взаимозаменяемо.

Термины неоваскуляризация и ангиогенез в их самом широком смысле обозначают образование новых кровеносных сосудов. В частности, термин ангиогенез также относится к образованию новых кровеносных сосудов в области опухоли.

ΙΕΝΑΚ2, ΙΕΝΑΚ1, 'ΊΕΝΑΡ4/2 относится к белкам, которые, как известно, составляют клеточный поверхностный рецептор интерферона типа I. Внеклеточный фрагмент (эктодомен) цепи ΙΕΝΑΚ2 может один связывать интерферон α или β.

При осуществлении настоящего изобретения применяются, если не оговорено иначе, традиционные методы клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК, белковой химии и иммунологии, которые находятся в пределах квалификации специалистов данного уровня техники. Такие методы описаны в литературе. См., например, Мо1еси1аг С1ошпд: Α БаЬогаЮгу Мапиа1, 2^пб ебйюп (ЗатЬтоок, Етйксй апб Машабк, ебк.), Со1б Зрппд НагЬог ЬаЬога1оту Ргекк, 1989; ΌΝΑ С1ошпд, Уо1итек I апб II (Ό.Ν. 61оует, еб), 1985; О11допис1ео!1бе Зуп1йек1к, (М.

1. Сай, еб.), 1984; патент США № 4683195 (МиШк е! а1.,); ШсШс Αο6 НуЬпб1/а1юп (Β.Ό. Натек апб 3.1. Шддшк, ебк.), 1984; Ттапкспрйоп апй Тгапк1айоп (Β.Ό. Натек апй 8.1. Шддшк, ейк.), 1984; Си1!иге о£ Лшта1 Се11к (ΚΙ. ГгекЬпеу, ей). А1ап В. Ыкк, 1пс., 1987; 11птоЫН/ей Се11к апй Епхутек. 1ВЬ Ргекк. 1986; А Ргасйса1 Сшйе 1о Мо1еси1аг С1ошпд (Β. РегЬа1), 1984; МеШойк ш Еп7уто1оду, Уо1итек 154 апй 155 (\Уи е! а1., ейк). Асайетк Ргекк, №\ν Уогк; Сепе ТгапкГег УесЮгк £ог МаттаНап Се11к (ЕН. Мй1ег апй М. Р. Са1ок, ейк.), 1987, Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу; 1ттипос11ет1са1 МеШойк ш Се11 апй Мо1еси1аг Вю1оду (Мауег апй \Уа1кег ейк). Асайетк Ргекк, Ьопйоп, 1987; НапйЬоок о£ Ехрептеп! 1ттипо1оду, Уо1итек Ι-ΐν (Э.М. \Уей апй С.С. В1аск\ге1к ейк.), 1986; Машри1а1шд 111е Мойке ЕтЬгуо, Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, 1986.

II. Получение и экспрессия гибридных белков.

Настоящее изобретение относится к системе получения гибридных белков на основе β1 α-интерферона. В частности настоящее изобретение относится к этим белкам, а также к рекомбинантным молекулам ДНК, использующимся для их получения.

Получение полипептидов данного изобретения может осуществляться с помощью ряда методов, известных в данной области. Например, полноразмерный в-1а-интерферон или укороченные формы [Ыа-интерферона могут быть получены с помощью известных методов с использованием рекомбинантной кДНК (см. ниже).

Ген, который кодирует целевой полипептид в-1а-интерферон, может быть сконструирован на основе аминокислотной последовательности целевого полипептида. Затем для синтеза этого гена могут быть применены стандартные методы. Например, аминокислотная последовательность может использоваться для конструирования обратно-транслируемого гена. Олигомер ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность, способную кодировать β-1αинтерферон, может быть получен в одну стадию. Альтернативно, можно синтезировать несколько олигонуклеотидов меньшего размера, кодирующих фрагменты целевого β-1αинтерферона, и затем сшить их вместе. Предпочтительно последовательность ДНК, кодирующую фрагмент в-1а-интерферона, получают в виде нескольких отдельных олигонуклеотидов, которые затем сшивают вместе (см. пример 2). Индивидуальные олигонуклеотиды обычно содержат 5'- или З'-липкие концы для обеспечения комплементарной сборки.

После сборки предпочтительные гены характеризуются последовательностями, которые распознаются рестрикционными эндонуклеазами (включая уникальные сайты рестрикции для непосредственной вставки в клонирующий или экспрессирующий вектор), предпочтительными кодонами, взятыми в соответст вии с экспрессионной системой-хозяином (предпочтительно клеткой млекопитающего), и последовательностью, которая при транскрипции дает стабильную, эффективно транслирующуюся РНК. Правильность сборки может быть подтверждена путем секвенирования нуклеиновой кислоты, рестрикционного картирования и экспрессии биологически активного полипептида в подходящем хозяине.

кДНК β-интерферона млекопитающих может быть выделена с использованием последовательности ДНК человеческого β-интерферона в качестве зонда для скрининга конкретной библиотеки кДНК млекопитающих путем перекрестно-видовой гибридизации. β-интерферон млекопитающих включает, например, βинтерферон приматов, человеческий, мышиный, собачий, кошачий, бычий, лошадиный и свиной β-интерферон. β-интерферон млекопитающих может быть получен путем перекрестновидовой гибридизации с использованием одноцепочечной кДНК, полученной из последовательности ДНК человеческого β-интерферона в качестве гибридизационного зонда для выделения кДНК β-интерферона из библиотек кДНК млекопитающих. К методам, которые могут использоваться для выделения и клонирования генных последовательностей интерферона, относятся методы, выявленные в патентах США, приведенных выше. Особое значение имеют, однако, положения патента США 47З89З1 (19 апреля 1988 г.), описывающего ДНК, содержащую ген человеческого β-интерферона.

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным молекулам ДНК, включающим вышеупомянутые последовательности ДНК. Рекомбинантные молекулы ДНК данного изобретения способны управлять экспрессией полипептидов данного изобретения в организмах-хозяинах, трансформированных с помощью этих молекул. Для осуществления такой экспрессии последовательность ДНК, кодирующая гибридный полипептид данного изобретения, должна быть оперативно связана с последовательностью, управляющей экспрессией. Для обеспечения адекватной транскрипции рекомбинантных конструкций данного изобретения предпочтительно в рекомбинантный вектор можно включить последовательность промотора/энхансера, при условии, что промоторная/управляющая экспрессией последовательность способна управлять транскрипцией нуклеотидной последовательности, кодирующей гликозилированный β-интерферон. Промоторы, которые могут быть использованы для управления экспрессией гибридного белка на основе иммуноглобулина включают, не ограничиваясь ими, участок раннего промотора 8У40 (Вепок! апй СйашЬоп, 1981, №1Шге 290:304-310), промотор, содержащийся в З' длинном концевом повторе вируса саркомы Рауса (Тататок, е! а1.,

1980, Се11 22:787-797), промотор тимидинкиназы вируса герпеса (ЭДадпег е! а1., 1981, Ргос №111. Асаб. 8с1. и.8.А. 78:144-1445), регуляторные последовательности гена металлотионина (Вппк!ег е! а1., 1982, №1Шге 296:39-42); векторы для осуществления экспрессии в растениях, включающие промоторный участок нопалинсинтетазы (Неггега-Ек!ге11а е! а1., №1Шге 303:209-213) или РНК промотор вируса мозаики цветной капусты 358 (Сагбпег, е! а1., 1981, №с1. АОбк Век. 9:2871), и промотор фотосинтетического фермента рибулозобифосфаткарбоксилазы (НеггегаЕк!ге11а е! а1., 1984, №1Шге 310:115-120); промоторные элементы из дрожжей или других грибков, такие как промотор Са1 4, промотор АЭС (алкогольдегидрогеназы), промотор РСК (фосфоглицеринкиназы), промотор щелочной фосфатазы и следующие контролирующие транскрипцию области животного происхождения, которые проявляют тканевую специфичность и применяются у трансгенных животных: участок, контролирующий ген эластазы I, который активен в клетках поджелудочной железы (8^ίί! е! а1., 1984, Се11 38:639-646; ОгпП/ е! а1., 1986, Со1б 8рг1пд НагЬог 8утр. Онап! Вю1. 50:399-409; МасЭопа16. 1987, Нера!о1оду 7:425-515); энхансеры или промоторы гена инсулина, которые активны в β-клетках поджелудочной железы (НаиаЬап, 1985, №1Шге 315:115-122); энхансеры или промоторы гена иммуноглобулина, которые активны в лимфоидных клетках (СгокксЬеб1 е! а1., 1984, Се11 38:647-658; Абатек е! а1., 1985, №1Шге 318:533-538; А1ехапбег е! а1., 1987, Мо1. Се11. Вю1. 7:1436-1444); участки раннего промотора и энхансера цитомегаловируса (ВокЬаг! е! а1., 1985, Се11 41:521-530); контролирующая область вируса опухоли мышиной молочной железы, который является активным в семенниках, молочной железе, лимфоидных и тучных клетках (Ьебег е! а1., 1986, Се11 45:485-495); участок, управляющий геном альбумина, который является активным в печени (Ршкей е! а1., 1987, Сепек апб Эеуе1. 1:268-276); участок, управляющий геном α-фетопротеина, который является активным в печени (Кгшпк-шГ е! а1., 1985, Мо1. Се11. Вю1. 5:1639-1648; Наттег е! а1., 1987, 8с1епсе 235:53-58); участок, управляющий геном α-1-антитрипсина, который является активным в печени (Ке1кеу е! а1., 1987, Сепек апб Эеуе1. 1:161-171); участок, управляющий геном βглобина, который является активным в миелоидных клетках (Могдат е! а1., 1985, №1Шге 315:338-340; КоШак е! а1., 1986, Се1 46:89-94); участок, управляющий геном основного белка миелина, который является активным в олигодендроцитарных клетках мозга (ВеабЬеаб е! а1., 1987, Се11 48:703-712); участок, управляющий геном легкой цепи-2 миозина, который является активным в скелетных мышцах (8аш, 1985, №1!иге 314:283-286); участок, управляющий геном релизинг-фактора гонадотропин, который явля ется активным в гипоталамусе (Макоп е! а1., 1986, 8с1епсе 234:1372-1378). Прокариотические экспрессионные системы, такие как ЬАС, или промотор бета-лактамазы (УШа-КатагоГГ, е! а1., 1978, Ргос. Асаб. 8сь И.8.А. 75:3727-3731), не являются в настоящее время предпочтительными, поскольку экспрессируемый β-интерферон не является гликозилированным. Тем не менее, прокариотические экспрессионные системы, которые позволяют протекать гликозилированию β-интерферона либо в прокариотических, либо в эукариотических организмаххозяевах, входят в объем данного изобретения.

Экспрессионные векторы, которые могут быть использованы, включают, не ограничиваясь ими, следующие векторы или их производные: вирусы человека или животных, такие как вирус оспы коров, векторы на основе аденовируса или ретровируса; вирусы насекомых, такие как бакуловирус; дрожжевые векторы; бактериофаговые векторы (например, лямбда) и векторы из плазмидной и космидной ДНК, здесь перечислены только некоторые. Конкретно, пригодные экспрессионные векторы для предпочтительных эукариотических хозяев включают векторы, содержащие последовательности, управляющие экспрессией, из 8У40, бычьего папилломавируса, цитомегаловируса. Кроме того, в каждом конкретном экспрессионном векторе для вставки этих последовательностей ДНК могут быть выбраны различные сайты. Эти сайты обычно обозначают по названию рестрикционной эндонуклеазы, которая разрезает их.

Они хорошо известны специалистам в данной области. Понятно, что для данного экспрессионного вектора, использующегося в данном изобретении, присутствие сайта рестрикционной эндонуклеазы для вставки выбранного фрагмента ДНК не является обязательным. Вместо этого, вектор может быть соединен с фрагментом с помощью альтернативных средств.

Экспрессирующий вектор, и сайт, выбранный для вставки выбранного фрагмента ДНК, и оперативная связь с последовательностью, управляющей экспрессией, определяется с помощью ряда факторов, таких как число сайтов, чувствительных к конкретному рестрикционному ферменту, размер полипептида, насколько легко происходит протеолитическое расщепление полипептида и т.п. Выбор вектора и сайта вставки для данной ДНК определяют по балансу этих факторов.

Рекомбинантные конструкции данного изобретения могут быть введены в клеткихозяева, которые способны экспрессировать гибридный белок, с помощью любого метода, известного в данной области, включая трансформацию (например, с помощью методик с использованием ОЕАЕ-декстрана или фосфата кальция), трансфекцию, микроинъекцию, ин19 фекцию, бомбардировка клетки (се11 дип) и электропорацию. Можно использовать любой тип клеток-хозяев при условии, что последовательности рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гибридный белок, могут адекватно транскрибироваться в мРНК в данном типе клеток, и в данном типе клеток может происходить гликозилирование белка. Кроме того, рекомбинантные конструкции нуклеиновых кислот данного изобретения могут использоваться для создания трансгенных животных, отличных от человека, способных продуцировать гибридный белок на основе иммуноглобулина. В предпочтительных воплощениях данного изобретения клеткой-хозяином является клетка млекопитающего, такая как клетка СО8 или СНО.

Успешное введение таких полинуклеотидных конструкций в данный экспрессирующий вектор может быть установлено с помощью трех общих подходов (а) ДНК-ДНК гибридизации, (Ь) присутствие или отсутствие маркерных генных функций и (с) экспрессия вставленных последовательностей. В первом подходе присутствие гена β-1 α-интерферона, введенного в экспрессирующий вектор, может быть установлено с помощью ДНК-ДНК гибридизации, с использованием зондов, включающих последовательности, которые являются гомологичными по отношению к введенному гену гибридного белка. Во втором подходе система рекомбинантный вектор/хозяин может быть идентифицирована и выбрана на основе присутствия или отсутствия некоторых функций маркерных генов (например, тимидинкиназной активности, устойчивости к антибиотикам, таким как 0418, изменения фенотипа, блокировка образования телец бакуловирусов и др.), что вызвано введением чужеродных генов в вектор. Например, если полинуклеотид вставлен так, что он прерывает последовательность маркерного гена данного вектора, рекомбинанты, содержащие данную вставку, могут быть идентифицированы по отсутствию функции маркерного гена. В третьем подходе рекомбинантные экспрессионные векторы могут быть идентифицированы путем анализа продукта чужеродного гена, который экспрессируется посредством рекомбинантного вектора. Такие анализы могут основываться, например, на физических или химических свойствах генного продукта в биоаналитических системах.

Понятно, что не все комбинации хозяин/экспрессирующий вектор будут функционировать с равной эффективностью в экспрессирующих последовательностях ДНК, которые кодируют полипептиды данного изобретения. Однако специалисты в данной области после тщательного анализа основных положений, изложенных в данном документе, могут сделать конкретный выбор комбинации хозяин экспрессирующий вектор, не выходя за рамки данного изобретения.

В предпочтительном воплощении данного изобретения рассматриваются гибридные белки и последовательности ДНК, кодирующие их. Данные гибридные белки имеют аминоконцевой участок, характеризующийся аминокислотной последовательностью β-ΐα-интерферона, и карбоксиконцевой участок, включающий домен белка, отличного от β-ΐα-интерферона. Предпочтительной общей формулой для такого белка является белок, имеющий первичную аминокислотную последовательность Χ-ΥΖ, где X представляет полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотной последовательности человеческого β-интерферона, или ее фрагмент; Υ представляет необязательный линкерный фрагмент; и Ζ представляет полипептид, включающий, по меньшей мере, фрагмент полипептида, отличного от человеческого β-интерферона. В одном воплощении фрагмент Ζ может быть частью полипептида, который содержит иммуноглобулин-подобные домены. Примеры таких полипептидов включают СЭР СЭ2. СЭ4 и члены I и II классов антигенов главного комплекса гистосовместимости. Примеры таких полипептидов приведены в патенте США 5565335 (Сароп е! а1.).

Фрагмент Ζ может включать, например, множество гистидиновых остатков или предпочтительно Рс область иммуноглобулина, Рс определяется в данном документе как фрагмент антитела, содержащий С-концевой домен тяжелых цепей иммуноглобулина.

В большинстве предпочтительных гибридных белков полипептид β-1 α-интерферон соединен через его С-конец по меньшей мере с частью Рс области иммуноглобулина. β-1αинтерферон образует аминоконцевой фрагмент, а Рс область образует карбоксиконцевой фрагмент. В этих гибридных белках Рс область предпочтительно ограничена константным доменом шарнирного участка и доменами СН2 и СН3. Рс область в этих гибридных белках также может быть ограничена фрагментом шарнирного участка, причем данный фрагмент способен образовывать межмолекулярные дисульфидные мостики, и доменами СН2 и СН3, или их функциональными эквивалентами. Эти константные области могут быть получены из любого млекопитающего, использующегося в качестве источника (предпочтительно человека), и из любого соответствующего класса и/или изотипа, включая 1дА, 1дО, 1дМ, 1дЕ и 1дО1, 1дС2, 1дО3 и 1§С4.

Рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют гибриды на основе

1д, могут быть получены с помощью любого метода, известного в данной области (МашаЩ е!

а1., 1982, Мо1еси1аг С1ошпд; А ЬаЬотаФгу Мап21 иа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу, Со1б 8рппд НагЬог, Ν.Υ.), или получены из доступных библиотек клонов. Методы получения генов, которые кодируют тяжелую или легкую цепь константных областей иммуноглобулинов, приведены, например, в КоЬткои, К. е! а1., заявка РСТ, публикация № XVО 87-02671. Последовательность кДНК, кодирующая молекулу или фрагмент интерферона, может быть непосредственно соединена с кДНК, кодирующей тяжелую цепь константных областей 1д или может быть соединена с ней через линкерную последовательность. В следующих воплощениях данного изобретения может быть создана рекомбинантная векторная система, содержащая последовательности, кодирующие β-интерферон, в корректной рамке считывания с последовательностью, кодирующей синтетический шарнирный участок. Кроме того, может быть желательным включение в качестве части рекомбинантной векторной системы нуклеиновых кислот, соответствующих 3'-фланкирующей области гена иммуноглобулина, включая сайты расщепления РНК/полиаденилирования и последовательности, находящиеся ниже по ходу транскрипции. Кроме того, может быть желательно конструирование сигнальной последовательности выше последовательностей, кодирующих гибридный белок на основе иммуноглобулина, для облегчения секреции гибридной молекулы из клетки, трансформированной рекомбинантным вектором.

Настоящее изобретение предоставляет димерные гибридные молекулы, а также мономерные или мультимерные молекулы, включающие гибридные белки. Такие мультимеры могут быть образованы путем использования таких Ре областей, или их фрагментов, или молекул 1д, которые обычно являются мультивалентными, таких как пентамеры 1дМ, или димеры 1дЛ. Понятно, что 1 цепь полипептида может быть нужна для образования и стабилизации пентамеров 1дМ и димеров 1дЛ. Альтернативно мультимеры гибридных белков на основе β-1 α-интерферона могут быть образованы с использованием белка, обладающего сродством к Рс области молекул 1д, таких как белок А. Например, множество гибридных белков β-ΐα-интерферон/иммуноглобулин может быть связано с белком А, сшитым с агарозными гранулами.

Данные поливалентные формы являются пригодными, так как они обладают множеством участков, связывающих рецептор β-интерферона. Например, бивалентный растворимый βΐα-интерферон может состоять из двух последовательно соединенных повторов аминокислот от 1 до 166 в последовательности 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2 (или кодируемых нуклеиновыми кислотами под номерами от 1 до 498 в последовательности 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 1) (фрагмент X в общей формуле), разделенных линкерным участком (фрагмент

Υ), повторы связаны, по меньшей мере, с фрагментом константного домена иммуноглобулина (фрагмент Ζ). Также могут быть сконструированы альтернативные поливалентные формы, например, путем химического связывания гибридов [Ша-интерферон/Ц с любой химически приемлемой молекулой носителя, полимером, выбранным из группы, состоящей из фиколла, полиэтиленгликоля или декстрана, с помощью традиционных методов сочетания. Альтернативно, β-1α-интерферон может быть химически связан с биотином, затем конъюгат биотининтерферон-β-Рс связывается с авидином, что приводит к образованию тетравалентных молекул авидин/биотин/β-интерферон. Гибриды β1а-интерферон/1д могут также ковалентно связываться с динитрофенолом (ДНФ (ΌΝΡ)) или тринитрофенолом (ТНФ (ΤΝΡ)), полученный конъюгат осаждают анти-ДНФ- или анти-ТНФ1дМ, с образованием декамерных конъюгатов с валентностью, равной 10 для участков, связывающих рецептор β-интерферона.

Белки, фрагменты и гибридные белки на основе β-1α-интерферона данного изобретения могут быть выделены и очищены в соответствии с традиционными условиями, такими как экстракция, осаждение, хроматография, аффинная хроматография, электрофорез или т.п. Например, белки и фрагменты на основе интерферона могут быть очищены путем пропускания их раствора через колонку с иммобилизованным рецептором интерферона (см. патент США № 4725669). Связанную интерфероновую молекулу можно затем элюировать путем обработки хаотропной солью или путем элюирования водным раствором уксусной кислоты. Иммуноглобулиновые гибридные белки могут быть очищены путем пропускания раствора, содержащего гибридный белок через колонку с иммобилизованным белком А или белком С, которые селективно связывают Рс фрагмент гибридного белка. См., например, Ке® К.1., е! а1., 1. 1ттипо1. 132:3098-3102 (1984); заявку РСТ, публикация № VО 87/00329. Затем химерное антитело можно элюировать путем обработки хаотропной солью или путем элюирования водным раствором уксусной кислоты.

Альтернативно белки на основе интерферона и гибридные молекулы с иммуноглобулином могут быть очищены на колонках с антителами против интерферона или на колонках с антителами против иммуноглобулина, с получением существенно чистого белка. Под термином существенно чистый подразумевается, что белок является свободным от примесей, которые в природе связаны с ним. Степень чистоты может быть подтверждена наличием одной полосой в электрофорезе.

Примером подходящего гибридного белка β-1α-интерферон/Iд данного изобретения является 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2, которая секретируется в клеточную культуральную среду эукариотическими клетками, содержащими экспрессионную плазмиду рСМС2 61 (см. пример 2). Данный белок состоит из зрелого человеческого β-1αинтерферона, связанного с фрагментом шарнирного участка и константными доменами СН2 и СН3 мышиного 1д. Данный белок содержит достаточный фрагмент мышиного иммуноглобулина, чтобы распознаваться белком, связывающим Ес, белком А.

Другие гибридные белки данного изобретения, включающие человеческий β-1α-интерферон, показаны (а) в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 3 и 4 для последовательности кДНК и расшифрованной аминокислотной последовательности, в соответствии с Ык-меченным гибридным белком на основе β-1α-интерферона (также показано на фиг. 1); и (Ь) в 8 ЕС ΙΌ ΝΟ: 1 для кДНК, кодирующей гибридный белок β-1α-интерферон/Iд с последовательностью 8 ЕС ΙΌ ΝΟ: 2 (также показано на фиг. 2).

Предпочтительные белки на основе β-1αинтерферона данного изобретения включают новый участок сочленения с последовательностью ДНК 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 5 и аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 6. 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 5 представляет 11 триплетных кодонов на каждой стороне участка сочленения между ДНК человеческого β-интерферона и ДНК, кодирующей константную область человеческого иммуноглобулина (см. пример 5: 8 ЕС ΙΌ ΝΟ: 41 и 42). Конкретно, в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 5, ДНК, кодирующая человеческий β-1а-интерферон заканчивается на нуклеотидном триплете 568-570 (ААС), а ДНК, кодирующая константную область человеческого Ι§01, начинается с триплета (САС), начинающегося с нуклеотида номер 574 последовательности 8 ЕС ΙΌ ΝΟ: 41. Соответствующая расшифрованная аминокислотная последовательность участка сочленения представлена в 8 ЕС ΙΌ ΝΟ: 6 и основана на 8 ЕС ΙΌ ΝΟ: 42. Другая уникальная последовательность участка сочленения построена так, чтобы она включала линкерную последовательность в конечной конструкции ДНК (см. пример 5: 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 43 и 44). Последовательность ДНК и аминокислотная последовательность данного участка сочленения представлены в 8 ЕС ΙΌ ΝΟ: 7 и 8 соответственно, которые демонстрируют 11 триплетных кодонов на каждой стороне участка сочленения непосредственно между концом последовательности β-1 α-интерферона (нуклеотид номер 570 в 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 43) и линкерной последовательностью (нуклеотиды 571-585 в 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 43; СССС8 в 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 8).

Последовательности ДНК участка сочленения могут использоваться в виде зондов ДНК и могут представлять собой минимальную ДНК, требующуюся для гибридизации в стандартных условиях с любой последовательностью ДНК, кодирующей какой-либо гибридный белок β-1α интерферонаЛд. Тем не менее, при условии, что целый зонд гибридизуется с обоими сторонами участка сочленения и обе стороны участка сочленения β-интерферона/константной области участвуют в гибридизации, могут существовать последовательности меньшего размера. Более того, рядовым специалистам в данной области понятно, что последовательности ДНК большего размера, чем 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 5 или 7, тоже являются подходящими для гибридизации. Рядовой специалист в данной области может определить, способен ли конкретный зонд, такой как 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 5 или 7, к гибридизации на обоих сторонах участка сочленения, путем мечения 5'-конца либо одноцепочечного смыслового олигонуклеотида, либо одноцепочечного антисмыслового олигонуклеотида, с использованием подходящим образом меченного фосфора АТФ с помощью полинуклеотидкиназы. Последовательность данного изобретения должна гибридизоваться с обоими олигонуклеотидными зондами, и таким образом происходит ее мечение этими зондами. Кроме того, понятно, что охватывает полностью вырожденные последовательности, кодирующие участок сочленения 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 5 или 7.

ΙΙΙ. Другие варианты гибридных белков на основе интерферона.

Производные белков данного изобретения также включают различные структурные формы первичного белка, которые сохраняют биологическую активность. Благодаря присутствию способных к ионизации аминогрупп и карбоксильных групп, например, гибридный белок на основе β-интерферона может находиться в виде кислой или основной соли, или в нейтральном виде. Индивидуальные аминокислотные остатки могут быть модифицированы посредством окисления или восстановления. Кроме того, первичную аминокислотную структуру (включая Ν- и/или С-концевые участки), или гликан β-1 α-интерферона, можно модифицировать путем образования ковалентных или агрегационных конъюгатов с другими химическими компонентами, такими как гликозильные группы, полиалкиленгликолевые полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ (РЕС): см. рассматриваемые одновременно с настоящей заявкой и регистрируемые в обычном порядке заявки с серийными номерами 60/104491 и 60/720237), липиды, фосфатные, ацетильные группы и т.п., или путем создания мутантных форм аминокислотной последовательности.

Другие производные гибрида β-интерферонЛд включают ковалентные или агрегационные конъюгаты β-интерферона или его фрагментов с другими белками или полипептидами, такие как полученные путем синтеза в рекомбинантной культуре как дополнительные Ν-концы или С-концы. Например, конъюгированным пептидом может быть сигнальная (или лидер ная) полипептидная последовательность в Νконцевой области белка, которая одновременно с трансляцией или после трансляции направляет перенос белка из области его синтеза к области его функционирования снаружи или внутри по отношению к клеточной мембране или стенке (например, лидерная последовательность дрожжевого α-фактора). Белки-рецепторы β-интерферона могут включать пептиды, добавленные для облегчения очистки или идентификации βинтерферона (например, гибриды гистидин/β1 α-интерферон). Аминокислотная последовательность β-интерферона может быть также связана с пептидом Акр-Тут-Бук-Акр-Акр-АкрАкр-Бук (ΌΎΚΌΌΌΌΚ) (Норр е! а1., Вю/Тесйио1оду 6:1204, 1988). Последняя последовательность является высоко антигенной и предоставляет эпитоп, обратимо связывающийся со специфическим моноклональным антителом, создавая возможность для быстрого анализа и легкой очистки экспрессируемого рекомбинантного белка. Данная последовательность также специфично расщепляется под действием энтерокиназы бычьей слизистой оболочки по остатку, следующему сразу за парой Акр-Бук.

Другие аналоги включают гибридный белок интерферон-в-Рс, или его биологически активные фрагменты, где последовательности βинтерферона отличаются от последовательностей, показанных в 8ЕЭ ΙΌ ΝΟ: 2, 4, 6 или 8, по одному или нескольким консервативным аминокислотным замещениям, или по удалениям или вставкам, которые не приводят к утрате биологической активности выделенного белка. Консервативные замещения обычно включают замещение одной аминокислоты на другую, имеющую сходные характеристики, такие как замещения внутри следующих групп: валин, аланин и глицин; лейцин и изолейцин; аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; аспарагин и глутамин; серин и треонин; лизин и аргинин; и фенилаланин и тирозин. Неполярные гидрофобные аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Другие консервативные замещения могут быть хорошо известны рядовым специалистам. Например, для аминокислоты аланина консервативное замещение может быть проведено с использованием любой аминокислоты, выбранной из Ό-аланина, глицина, β-аланина, Б-цистеина и Ό-цистеина. Для лизина замещение может быть проведено с использованием любой аминокислоты, выбранной из Ό-лизина, аргинина, Ό-аргинина, гомо аргинина, метионина, Ό-метионина, орнитина или Ό-орнитина. В основном замещениями, которые предположительно вызывают изменения функциональных свойств выделенных полипептидов, являются такие, в которых (ί) полярный остаток, например, серина или треонина, замещают на гидрофобный остаток, например, лейцина, изолейцина, фенилаланина или аланина; (ίί) остаток цистеина замещают на любой другой остаток; (ίίί) остаток, имеющий электроположительную боковую цепь, например, аргинина или гистидина, замещают на остаток, имеющий электроотрицательную боковую цепь, например, глутаминовой кислоты или аспарагиновой кислоты; или (ίν) остаток, имеющий объемную боковую цепь, например, фенилаланина, замещают на остаток, не имеющий такой боковой цепи, например, глицина. В данное изобретение включены выделенные молекулы, которые представляют собой аллельные варианты, природные мутанты, индуцированные мутанты, белки, кодируемые ДНК, которая гибридизуется в очень или не очень строгих условиях с нуклеиновой кислотой, которая кодирует такой полипептид, как 8ЕЭ ΙΌ ΝΟ: 2, 4, 6 или 8.

Заявители разработали мутантные формы β-ΐα-интерферона, которые являются дополнительными вариантами фрагмента β-1αинтерферона данного изобретения. Эти фрагменты β-ΐα-интерферона могут быть особенно полезными поскольку они проявляют новые свойства, не обнаруженные у β-ΐα-интерферона дикого типа (см. пример 1). Короче говоря, заявители предприняли мутационный анализ человеческого β-ΐα-интерферона с целью картирования остатков, необходимых для осуществления активности и рецепторного связывания. Наличие 3-Ό кристаллической структуры человеческого β-ΐα-интерферона (см. Кагрикак е! а1., 1997, Ргос. Νίώ. Асаб. 8с1. 94:11813-11818) позволило заявителям идентифицировать для аланиновых (или сериновых) замещений, остатки, находящиеся в контакте с растворителем, доступные для взаимодействия с рецептором βинтерферона, и сохранить аминокислоты, включенные в образование межмолекулярных связей. Панель из пятнадцати аланиновых последовательных мутаций была создана, чтобы заменить от двух до восьми остатков вдоль различных областей каждой из спиралей (А, В, С, Ό, Е) и петель (АВ1, АВ2, АВ3, ΟΌ1, СЭ2. ΌΕ1, ΌΕ2) β-1α-интерферона. См. пример 1.

Для аффинной очистки мутантных форм, экспрессирующихся в клетках млекопитающих (8ЕЭ ΙΌ ΝΟ: 2: фиг. 1), был включен аминоконцевой гистидиновый маркер (Ык маркер). Функциональные результаты образования данных мутантных форм оценивали в антивирусном и антипролиферативном анализах. Для анализа данных мутантных форм на связывание с клеточным поверхностным рецептором β-интер ферона (рецептор клеточной поверхности ΙΡΝΑΚ1/2) был разработан нерадиоактивный анализ связывания. Кроме того, анализ на основе ЕБ18А с применением гибридного белка эктодомен ΙΡΝΑΚ/Рс для связывания интерферона, использовали для картирования поверхностных взаимодействий между β-1 α-интерфероном и ΙΡΝΑΚ2 (см. пример 1). Эти мутационные анализы показали, что Ν- и С-концевые положения фрагмента молекулы β-интерферона не являются важными для осуществления рецепторного связывания или биологической функции.

Заявители идентифицировали три типа эффектов, получаемых в результате направленного мутагенеза. В некоторых условиях эти эффекты могут быть полезными для разработки лекарственного препарата на основе интерферона. К данным трем типам эффектов относятся следующие: (а) мутантные формы с более высокой антивирусной активностью, чем у 1нкдикого типа β-ΐα-интерферона (например, мутантная форма С1); (Ь) мутантные формы, которые проявляют активность как в антивирусном, так и в антипролиферативном анализе, но для которых антипролиферативная активность является непропорционально низкой по отношению к антивирусной активности, по сравнению с Ыкдиким типом β-ΐα-интерферона (например, мутантные формы С1, Б и БЕ1); и (с) функциональные антагонисты (например, А1, В2, СБ2 и БЕ1), которые демонстрируют антивирусную и антипролиферативную активность, которые являются непропорционально низкими по отношению к связыванию рецептора, по сравнению с Ык-диким типом β-1 α-интерферона.

Кроме того, связывание фрагмента β-1αинтерферона (X) со вторым, отличным от β-1αинтерферона, фрагментом Ζ (например, Рс области иммуноглобулина) может осуществляться с помощью химической реакции, в результате которой две молекулы связываются друг с другом, при условии, что иммуноглобулин и β-1αинтерферон сохраняют их соответствующие активности. Данная химическая связь может включать многочисленные химические механизмы, такие как ковалентное связывание, аффинное связывание, интеркаляция, координационное связывание и комплексообразование. Типичные связывающие агенты (например, линкеры Υ в общей формуле), использующиеся для образования ковалентной связи между фрагментами β-1α-интерферона и иммуноглобулина, могут включать органические соединения, такие как тиоэфиры, карбодиимиды, сукцинимидные сложные эфиры, диизоцианаты, такие как толуол-2,6-диизоцианат, глютеральдегиды, диазобензолы и гексаметилендиамины, такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин, бифункциональные производные сложных эфиров имидов, такие как диметиладипимидат, и бисактивные соединения фтора, такие как 1,5дифтор-2,4-динитробензол. Данный список не является исчерпывающим для различных классов химических связывающих агентов, известных в данной области. Многие из этих соединений являются коммерчески доступными, например, Ν-сукцинимидил-З -(2-пиридилдитио) пропионат (8РБР), гидрохлорид 1-этил-3-(3диметиламинопропил)карбодиимида (ЕБС); 4сукцинимидилоксикарбонил-а-метил-а-(2пиридилдитио)толуол (8ΜΡΤ: Р1егсе С1ет. Со., Са!. # 215586).

IV. Область применения данного изобретения.

Гибридные белки данного изобретения могут применяться в терапевтических композициях, когда требуется терапия с использованием βинтерферона. Данные молекулы имеют обычные преимущества, связанные с гибридными белками, особенно, 1д гибридными белками; а именно, измененные фармакокинетические и фармакодинамические характеристики, приводящие к увеличению периода полужизни и времени пребывания в сосудистом русле. Более того, особенно предпочтительные гликозилированные белки β-1α-интерферон, хотя по структуре подобны β-1β-интерферону, являются во много раз биологически более активными, чем не гликозилированный β-1β-интерферон. См. К.иике1 е! а1., 1998, Рйагт. Кек. 15:641-649.

Было обнаружено, что продукты настоящего изобретения являются полезными для поддержания периода полужизни терапевтического β-1 α-интерферона, и, например, могут быть получены для терапевтического введения путем растворения в воде или приемлемой жидкой среде. Введение осуществляют парентеральным, аэрозольным или пероральным способом. Тонкие коллоидные суспензии могут быть получены для парентерального введения с целью достижения эффекта депо, или для перорального введения, тогда как аэрозольные композиции могут быть по характеру жидкими или в виде сухого порошка. В сухом, лиофилизированном состоянии, или в составе раствора, гибридные белки настоящего изобретения на основе β-1 α-интерферона должны иметь хорошую стабильность при хранении.

Белки настоящего изобретения, предназначенные для терапевтического применения, могут применяться для профилактики или лечения любого болезненного состояния или заболевания, при котором β-1α-интерферон, как составная часть, является эффективным. Кроме того, гибридные белки настоящего изобретения могут применяться для диагноза компонентов, болезненных состояний или заболеваний в биологических системах или образцах, а также для диагностических целей в нефизиологических системах.

В области терапевтического применения настоящее изобретение рассматривает способ лечения животного, страдающего от такого болезненного состояния (состояний) или заболевания (заболеваний), или в скрытой форме склонного к таким состояниям или заболеваниям, и нуждающегося в таком лечении, включающий введение такому животному эффективного количества гибридного белка настоящего изобретения, который является терапевтически эффективным для упомянутого болезненного состояния или заболевания. Индивидуумы, подлежащие лечению с помощью гибридных белков настоящего изобретения, включают представителей млекопитающих и наиболее предпочтительно человека. В зависимости от конкретного состояния или заболевания, подлежащего лечению, животным могут быть введены гибридные белки данного изобретения на основе β-ΐα-интерферона в любой подходящей терапевтически эффективной и безопасной дозировке, которая может быть легко определена в пределах уровня техники без лишних экспериментов. Из-за существования видовых барьеров для интерферонов типа I, может быть необходимо получать гибридные белки на основе интерферона, как описано в данном документе, с использованием интерферона из соответствующих видов.

Антипролиферативная активность β-ΐαинтерферона хорошо известна. В частности, некоторые из гибридных белков на основе β-ΐαинтерферона, описанные в данном документе, являются применимыми для лечения опухолей, в т. ч. злокачественных, таких как остеогенная саркома, лимфома, острый лимфоцитарный лейкоз, карцинома молочной железы, меланома и карцинома носоглотки, а также аутоиммунные состояния, такие как фиброз, волчанка и рассеянный склероз. Кроме того, предполагается, что антивирусная активность, проявляемая гибридными белками, в особенности некоторыми из мутеинов β-ΐα-интерферона, описанных в данном документе, может использоваться для лечения вирусных заболеваний, таких как инфекция ЕСМ, грипп и другие инфекции дыхательного тракта, бешенство и гепатит. Также ожидается, что иммуномодуляторная активность β-ΐαинтерферона, проявляемая белками, описанными в данном документе, может использоваться для лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний, таких как фиброз, рассеянный склероз. Способность интерферонов ингибировать образование новых кровеносных сосудов (ангиогенез или неоваскуляризация) позволяет использовать белки данного изобретения для лечения ангиогенных заболеваний, таких как диабетическая ретинопатия, ретинопатия недоношенных, дегенерация желтого пятна, отторжение трансплантата роговицы неоваскулярная глаукома, ретролентальная фиброплазия, по краснение радужки и синдром Ослера-Веббера (051сг-\УсЬЬсг). Более того, с некоторого времени известна антиэндотелиальная активность интерферона, и возможным механизмом действия интерферона может быть подавление активности эндотелиальных клеток путем ингибирования продукции или эффективности ангиогенных факторов, продуцируемых опухолевыми клетками. Некоторые васкулярные опухоли, такие как гемангиомы, являются особенно чувствительными к лечению интерфероном. Лечение α-интерфероном является единственным описанным в документах способом лечением этого заболевания. Предполагается, что лечение гибридными белками данного изобретения на основе β-ΐα-интерферона приводит к существенным фармацевтическим улучшениям в отношении фармакокинетики и фармакодинамики, так как полагают, что конъюгат остается в сосудистой сети в течение более длинного периода времени, чем неконъюгированные интерфероны, что таким образом приводит к более результативной и эффективной терапии в случае применения в качестве антиангиогенного агента. См. пример 9.

Гибриды данного изобретения полимер-βΐα-интерферон могут быть введены сами по себе, а также в виде фармацевтически приемлемых сложных эфиров, солей и других физиологически функциональных производных данных гибридов. В таких фармацевтических и лекарственных композициях β-ΐα-интерферон предпочтительно используется вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и необязательно с любыми другими терапевтическими ингредиентами. Носитель должен быть фармацевтически приемлемым, то есть быть совместимым с другими ингредиентами композиции и не быть чрезмерно опасным для получающего его. β-ΐα-интерферон предоставляется в количестве, эффективном для достижения желательного фармакологического эффекта, как описано выше, и в количестве, необходимом для достижения желательной ежедневной дозы.

Композиции включают подходящие для парентерального, а также для непарентерального введения, а конкретные способы введения включают пероральное, ректальное, щечное, наружное, назальное, глазное, подкожное, внутримышечное, внутривенное, чрескожное, интратекальное, внутрисуставное, внутриартериальное, субарахноидальное, бронхиальное, лимфатическое, вагинальное и внутриматочное введение. Предпочтительными являются композиции, подходящие для перорального, назального и парентерального введения.

Если β-ΐα-интерферон применяется в составе композиции, включающей жидкий раствор, то композиция может быть введена преимущественно перорально или парентерально.

Если β-1 α-интерферон применяется в составе композиции, представляющей собой жидкую суспензию, или в виде порошка в композиции с биосовместимым носителем, то данная композиция может быть введена преимущественно перорально, ректально или бронхиально.

Если β-1 α-интерферон применяется непосредственно в виде порошкообразного твердого вещества, то β-1 α-интерферон может быть введен преимущественно перорально. Альтернативно, он может быть введен назально или бронхиально, посредством распыления порошка в газообразном носителе, с образованием газовой дисперсии порошка, которая вдыхается пациентом из дыхательного устройства, включающего подходящее распыляющее устройство.

Удобно, когда композиции, включающие белки настоящего изобретения, находятся в виде дозированных лекарственных форм и могут быть получены с помощью любого из методов, хорошо известных в области фармацевтики. Такие методы обычно включают стадию внесения активного ингредиента (ингредиентов) в сочетании с носителем, который составляет один или несколько вспомогательных ингредиентов. Обычно композиции приготавливают путем внесения одинакового (одинаковых) и хорошо знакомого (знакомых) активного ингредиента (ингредиентов) в сочетании с жидким носителем, тонко измельченным твердым носителем, или с обоими, и затем, при необходимости, формование продукта в дозированные формы желаемой композиции.

Композиции настоящего изобретения, подходящие для перорального введения, могут находиться в виде дискретных единиц, таких как капсулы, облатки, таблетки или лепешки, каждая из которых содержит ранее определенное количество активного ингредиента в виде порошка или гранул; или в виде суспензии в водном растворе, или в неводной жидкости, такой как сироп, эликсир, эмульсия, или в виде дозы жидкого лекарства.

Таблетка может быть изготовлена путем прессования или формования, необязательно с одним или несколькими добавочными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть получены путем прессования в подходящем устройстве, с активным ингредиентом, находящимся в сыпучем виде, таком как порошок или гранулы, который необязательно смешивают со связующим агентом, дезинтегрирующим агентом, смазочным агентом, инертным разбавителем, поверхностно-активным веществом или разряжающим агентом. Формованные таблетки, включающие смесь порошкообразных полимерных конъюгатов с подходящим носителем, могут быть изготовлены путем формования в подходящем устройстве.

Сироп может быть получен путем добавления активного ингредиента к концентриро ванному водному раствору сахара, например, сахарозы, к которому также может быть добавлен любой добавочный ингредиент. Такие добавочные ингредиенты могут включать ароматизаторы, подходящие консерванты, агенты, замедляющие кристаллизацию сахара, и агенты, увеличивающие растворимость любого другого ингредиента, такого как многоатомный спирт, например, глицерин или сорбит.

Композиции, подходящие для парентерального введения, соответственно включают стерильный водный препарат активного конъюгата, который предпочтительно является изотоническим с кровью реципиента (например, физиологический солевой раствор). Такие композиции могут включать суспендирующие агенты и загустители, или другие системы микровключений, которые создают для направления соединений к компонентам крови, или одного или нескольких органов. Композиции могут находиться в единичной дозированной или множественной дозированной форме.

Назальные композиции в виде спреев включают очищенные водные растворы активного конъюгата с консервантами и изотоническими агентами. Такие композиции преимущественно доводят до рН и изотонического состояния, совместимых с назальными слизистыми оболочками.

Композиции для ректального введения могут присутствовать в виде свечей с подходящим носителем, таким как масло какао, гидрированные жиры или гидрированная жирная карбоновая кислота.

Глазные композиции, такие как глазные капли, получают с помощью методов, подобных методам получения назального спрея, за исключением того, что рН и изотонические факторы предпочтительно доводят до соответствующих для глаз.

Наружные композиции включают конъюгаты данного изобретения, растворенные или суспендированные в одной или нескольких средах, таких как минеральное масло, смесь жидких углеводородов (нефть), многоатомные спирты, или другие основы, использующиеся для наружных фармацевтических композиций.

В добавление к вышеупомянутым ингредиентам, композиции данного изобретения могут дополнительно включать один или несколько добавочных ингредиентов, выбранных из разбавителей, буферов, ароматизирующих агентов, дезинтегрирующих агентов, поверхностноактивных веществ, загустителей, смазывающих агентов, консервантов (включая антиоксиданты) и т. п.

Соответственно настоящее изобретение рассматривает предоставление подходящих гибридных белков для ίη νίίτο стабилизации βΐα-интерферона в растворе в качестве предпочтительного иллюстративного примера не тера33 певтического применения. Гибридные белки могут использоваться, например, для повышения устойчивости к ферментативному разрушению β-1α-интерферона, и с их помощью обеспечивается увеличение срока годности, стабильность при комнатной температуре и устойчивость к исследовательским реагентам и наборам.

Следующие примеры предоставлены для иллюстрации настоящего изобретения и не должны истолковываться как ограничивающие его. В частности, понятно, что эксперименты на животных ίη νίνο, описанные в данном документе, могут варьировать, так что возможны другие модификации и вариации основной методологии. Например, в примере 7, рядовой специалист в данной области может использовать другой анализ с использованием неоптерина или может изменить число и вид используемых приматов. Данные модификации и вариации примеров следует рассматривать как соответствующие духу и области действия данного изобретения.

Пример 1. Исследования структура/ активность человеческого β-1α-интерферона с использованием мутаций в виде аланин/сериновых замещений. Анализ сайтов рецепторного связывания и функциональных доменов.

А. Обзор.

Пространственный мутационный анализ человеческого β-1а-интерферона (ΙΡΝ-β-1α) был предпринят с целью картирования остатков, требующихся для осуществления активности и рецепторного связывания. Наличие 3-Ό кристаллической структуры человеческого β-1αинтерферона (см. Кагрикак е! а1., 1997, Ргос. Ναΐΐ. Асаб. 8сг 94:11813-11818) позволило заявителям идентифицировать для аланиновых (или сериновых) замещений, остатки, находящиеся в контакт с растворителем, доступные для взаимодействия с рецептором β-интерферона, и сохранить аминокислоты, включенные в образование межмолекулярных связей. Панель из пятнадцати аланиновых последовательных мутаций была создана, чтобы заменить от 2 до 8 остатков вдоль различных областей каждой из спиралей (А, В, С, Ό, Е) и петель (АВ1, АВ2, АВ3, СО1, СЭ2. ΌΕ1, ΌΕ2) β-1а-интерферона. Для аффинной очистки включили аминоконцевой маркер, состоящий из 6 гистидиновых остатков, а также участок энтерокиназной линкерной последовательности для удаления аминоконцевого удлинения. Полученные интерфероны равнозначно обозначают как 1нкмеченный интерферон (ΙΡΝ)-β или Ηίκ₆-βинтерферон и т.п.

Экспрессионные плазмиды с различными мутантными формами меченного ΙΡΝ-β конструировали с использованием генной конструкции ΙΡΝ-β дикого типа в качестве матрицы для мутагенеза. Стратегия мутагенеза включает вначале введение уникальных сайтов расщепления рестрикционными ферментами на всем протяжении гена Ык-меченного ΙΡΝ-β дикого типа, затем замену различных последовательностей ДНК между выбранными сайтами рестрикции на синтетические олигонуклеотидные дуплексы, которые кодируют мутации с аланиновыми (или сериновыми) замещениями. Наконец, мутантные гены ΙΡΝ субклонировали в плазмиде, которая направляет экспрессию в клетках млекопитающих, в клеточной линии 293 почек человека.

Функциональные результаты этих мутаций оценивали в антивирусном и антипролиферативном тестах. Нерадиоактивный анализ связывания ΙΡΝ разработали для анализа данных мутантных форм на связывание с поверхностным рецептором (комплекс ΙΡΝΑΚ1/2) клеток человеческой лимфомы Дауди-Беркитта. Кроме того, разработали анализ для картирования поверхностей взаимодействия между мутантными формами Ык-ΙΡΝ-β и ΙΡΝΑΚ2, в котором использовали гибридный белок ШЫАК2/Рс, включающий внеклеточный домен ΙΡΝΑΚ2, рецепторного белка ΙΡΝ, соединенный с шарнирным участком, СН2 и СН3 доменами человеческого Ι§01.

1. Создание гена β-интерферона как матрицы для мутагенеза.

Стратегия заявителей, направленная на получение аланин- (или серин)замещенных мутантных форм ΙΡΝ-β состояла в создании вначале модифицированного гена ΙΡΝ-β, который кодировал белок дикого типа, но который нес уникальные сайты расщепления рестрикционными ферментами, рассеянные на всем протяжении гена. Уникальные сайты использовали для замены последовательностей дикого типа на синтетические олигонуклеотидные дуплексы, которые кодируют мутантные кодоны. Для получения экспрессионной кассеты ΙΡΝ-β-1α подходящей для создания мутантных генов, кДНК ΙΡΝ-β (СепВапк каталожный номер #Е00029) амплифицировали с помощью ПЦР (РСК). Начальное клонирование гена ΙΡΝ-β в плазмиде рМ!В 107, полученной из рΑСΥС184, (см. Κο^, е! а1., 1988, №с1ею Ас1бк Кек. 16(1) 355) было необходимо для проведения сайтнаправленного мутагенеза данного гена в плазмиде, утратившей специфические сайты рестрикции, которые образуются в процессе мутагенеза.

ПЦР праймеры, использующиеся для субклонирования кодирующей последовательности гена человеческого ΙΡΝ-β, также позволили заявителям ввести линкерную последовательность энтерокиназы выше по ходу транскрипции и в рамке считывания с геном ΙΡΝ-β 5' ПЦР праймер 5'-ТТСТССССАСАССАТСАТСАСААСАТСАССТАСААСТТССТТССАТТССТАСААА35

ОААОС-3' (8ЕО Ш ΝΟ: 9: ВЕТ-021) и 3' ПЦР праймер 5'-0СС6СТС6А6ТТАТСА6ТТТС60 А6ОТААССТОТААОТС-3' (8 НО II) ΝΟ: 10: ВЕТ-022) и фланкирующими сайтами ферментативной рестрикции (ВзрЕI и Х1ю I), использующимися для клонирования в сайтах плазмиды рМ1В107. Полученную ДНК обозначают ПЦР фрагмент А.

Эффективную сигнальную последовательность из сигнальной последовательности адгезионной молекулы-1 клеток кровеносных сосудов человека (УСАМ-1) и 6 гистидиновых остатков в качестве маркера ввели в конечную конструкцию из второго фрагмента ДНК, созданную из рЭ8\У247 (фрагмент В). Плазмиду рЭ8\У247 получали из рСЕР4 Цпуйгодеп, Саг1зЬаб, СА), из которой удален ген ЕВNА-1, и которая несет сигнальную последовательность УСАМ-1 (УСАМзз), находящуюся в рамке считывания с 6 гистидиновыми остатками в качестве маркера и присоединенную выше их по ходу транскрипции. ПЦР праймеры, которые использовали для создания кассетного фрагмента УСАМзз-1/гистидиновый маркер, представляли собой КГО-369 (5' ПЦР праймер 5'-АОСТТС С06666ССАТСАТСАТСАТСАТСАТА0СТ3': 8 НО ГО ΝΟ: 11) и КШ-421 (3¹ ПЦР праймер 5'-СС66А6СТАТ6АТ6АТ6АТ6АТ6АТ0 ОСССССООА-3': 8ЕО Ю ΝΟ: 12), включающие фланкирующие сайты расщепления рестрикционными ферментами (ΝοΙ I апб ВзрЕЦ которые позволяют вырезать фрагмент В ДНК.

Для создания плазмидного вектора, несущего сигнальную последовательность УСАМ-1, 1118-маркер и ген β-интерферона, заявители провели 3-фрагментное лигирование, используя очищенные в геле фрагменты ДНК из плазмидного вектора рМГВ107 (полученные в результате расщепления ΝοΙ I и X1юI). ПЦР фрагмент А (полученный в результате расщепления В8рЕI и X1юI) и фрагмент В (полученный в результате расщепления Νο6 и ВзрЕЦ Лигированную плазмиду использовали для трансформации клеток Е. со11, или 6А221, или X^1-В1ие, и устойчивые к ампициллину колонии собирали и тестировали на наличие вставок путем анализа рестрикционной карты. Проводили препаративное получение ДНК и последовательность вставки подтверждали путем секвенирования ДНК. Полученную конструкцию назвали рСМО260.

2. Создание аланинзамещенных мутантных форм человеческого β-интерферона в рСМО260.

Плазмиду рСМО260 использовали в качестве матрицы для множественных раундов мутагенеза (И.8.Е. набор для направленного мутагенеза (Воейппдет-Маппйет)), в результате которого были введены уникальные сайты рестрикционного расщепления в положения вдоль последовательности, кодирующей белок ΓΡΝ-β, но полученная в результате последовательность белка не была изменена. Мутантные плазмиды использовали для трансформации штаммов Е. со11 бА221 или X^1-В1ие. и рекомбинантные колонии отбирали по устойчивости к хлорамфениколу. Хлорамфениколустойчивые колонии затем тестировали на присутствие требуемого уникального сайта ферментативной рестрикции с помощью анализа рестрикционного картирования ДНК. Были подтверждены структуры полученной плазмиды ШЫ-β, рСМО275.8, содержащей полный набор уникальных сайтов рестрикционного ферментативного расщепления, и последовательности ДНК данного гена. Последовательность полноразмерной ДНК модифицированного, йз-меченного гена β-интерферона, вместе с последовательностью, кодирующей белок дикого типа, приведены на фиг. 1.

Полный набор аланинзамещенных мутаций приведен в табл. 1. Названия мутантов определяют структурные области (спирали и петли), в которые введены данные мутации. Полная панель аланиновых (сериновых) замещений дает в результате 65 мутаций на 165 аминокислот человеческого ШЫ-β.

Панель мутантных форм создана из рСМО275.8 путем замещения сегментов ДНК, находящихся между уникальными свитами рестрикции, на синтетические олигонуклеотидные дуплексы, которые несут информацию генетического кодирования, как изображено в табл. 2 (см. ниже). Для создания различных аланинзамещенных мутантных форм плазмид, вектор рСМО275.8 (полученный в результате расщепления соответствующим рестрикционным ферментом, как определено в списке, приведенном ниже для каждой структурной области ΓΡΝ-β), очищенный в геле, и олигонуклеотидные дуплексы (кодирующие последовательности цепей, как показано в табл. 2) сшивали вместе. Лигированные смеси использовали для трансформации штамма Е. со11 1А221 и рекомбинантные колонии выбирали по устойчивости к ампициллину. Устойчивые к ампициллину колонии тестировали на присутствие вставок мутаций путем скрининга соответствующих сайтов ферментативной рестрикции. Для двух мутантных форм (А2 и ί.Ό2), стратегия клонирования заключается в использовании двух дуплексов синтетических нуклеотидов (как показано в табл. 2), которые несут комплементарные липкие концы, что позволяет лигировать один с другим и с каркасом вектора ΣΡΝ-β при трехстадийном лигировании. Следующий список иллюстрирует сайты, которые использовали для клонирования мутантных олигонуклеотидов из табл. 2. Схема клонирования (подраздел В) показывает позиции данных уникальных сайтов гена βинтерферона.

Спираль А от ВзрЕI до Мий или от ВдШ до Рзб

Петля АВ от Мий до Рзб или от Мий до

ВзаШ

Спираль В от ΒκρΗΙ до В§а1 или от В§аН1 до В§а1

Спираль С от В§а1 до ХЬа1

Петля СО от ХЬа1 до ΒκρΗΙ или от ХЬа1 до

ЭгаШ

А1

А2

ЗЕО 10

N0:13

ВЕТ-053

N0:14

Таблица 2

СССОАОАСОАТОАТСАСААСАТОССТГАССССССТСТТСОАССССТАСААО

СТТСТАОСААТТГТСАСТОТСАСААСС ТССТС Т06С

САТСТА0СААТССТ0ССТСТССТССССТССТСССТСССТТ0ААТСС0А06С

ТТСААТАСТ

Спираль Ό от ΒκρΗΙ до ЭгаШ

Петля ΌΕ от ΒκρΗΙ до ΡνυΙ

Спираль Е от ΡνυΙ до ΒδίΕΙΙ

Таблица 1

Положения аланинзамещенных мутаций ΙΕΝ-β

ВЕТ-039

5ЕС Ю

N0:15

ОССТСААООАСАСОАТаААСТТТОАСАТСССТОАОСАСАТТААССАССТОСА

АВ1

ВЕТ-041

5Е0 10

ААТТСААТССОАОООСТОСАОСТТОСОСТССАСАСАССАТОААС'ГГТСАСАТ

N0:16 вет-оэо

СССТСАССАСАТТААССАССТССА

АВ2

АВЗ

В1

В2

ЗЕО 10

N0:17

ВЕТ-082

5Е0 Ю

N0: 18

ВЕТ-084

5Е0 Ю

N0: 19

ВЕТ-086

5Е0 Ю

N0: 20

ВЕТ-110

5Е<3 10

N0: 21

ААТТОААТОССАСССТТСААТАСТОССТСААССАСАССССТССАТТТССТАТ

СССТОСАОАСАТТААОСАССТССА

ААТТСААТОбСАСССТГСААТАСТСССТСААООАСАССАТОААСТТТСАСА

ТСССТОАСОАОАТТОСТОСАССТаСАССТТТСССТССАССТаА

СССССССТТСАССАТСТАТаАСАТССТСССТААСАТСССТАССАТТТТСАСА сааоаттсатстассастссстооаа

СОССССАТТОАССАТСТАТСАСАТОСТССАСААСАТСТТТССТАТТТТСОСТ

ОСАССТТСАТСТАССАСТСССТССАА

Линия, обозначающая ΙΕΝ-β, показывает последовательность человеческого ΙΕΝ-β дикого типа. Аланиновые или сериновые замены остатков ΙΕΝ-β показаны для каждой мутантной формы, и черточки, расположенные ниже соответствующих областей, обозначают последовательности дикого типа. Структуры спиралей и петель обозначены сплошными линиями ниже

ВЕТ-112

С1

С2 сю1

5Е<2 10

N0:22

ВЕТ-114

5Е0 ΙΟ

N0:23

ВЕТ-092

5Е0 10

ССААТССТТСААТТСТТССТССАСТССТОАССААТСТСТАТСАТСАОАТАЛА

ССАТСТСААСАСАСТТСТАС

ОСААТСАСАССАТТСТТСАСААССТССТОССТААТОТСССТСАТСАСАТАСС

АСАТСТОССТССАСТТСТАО

СТАССТССААААСТСССТССАеСТСАТТТСАССАСОССААААСТ мутантных форм. Петля ΌΕ охватывает промежуток между спиралями Ό и Е. Две дополнительные аланинзамещенные мутантные фомы (Н93А, Н97А и Н121А) получали и анализировали в антивирусных анализах для того, чтобы

N0:24

ВЕТ-094

002

ВЕТ-096

СТАОААбАААААСТСвАОАААСААССАССТАССОСТСОААААОСААТСАОСС

СОСТССАССТОААААСА

ТАТТАТСССА06АТТСТССАТТАССГСАА0СССАА00АСТАСТСАСАСТСТ оценить влияние мутации соответствующих гистидинов, которые образуют хелатные комплексы с цинком в корковом структурном димере. Обе вышеуказанные мутантные формы полϋΐ

ВЕТ-108

САТСАССАСТСТССАССТСААААСАТАТТАТСССССААТТССТССАТАССТ

0ССАЗССАА00А0ТАСТСАСАСТСТ ностью сохраняют активность дикого типа в

0Е1 антивирусных анализах, что позволяет предположить, что цинк-опосредованное образование

ЗЕО Ю

N0:28

САТОАОСАОТСТОСАССТОАЛААСАТАТТАТбОСАССАТТСТОСАТТАССТ

ОААССССССТЧХГАТАСТСАСАСТСТСССТааАССАТ димера не является существенным для проявления активности ΙΕΝ-β.

0Е2

5Ε0 10

N0:29

ВЕТ-118

Е1

ЗЕО ΙΟ

N0: 30

ВЕТ-104

САТОАСЗСА6ТСТОСАССТОААААОАТАТГАТСОСАОСАТТСТССАТТАССТО

ААСССАДАСаАСТАСССТаСАТСТОССТССАССАТ

ССТСАСАССТСАААТССТАССАААСТТГССАТТСАТТССААСАСТТАСАС

В. Конструирование экспрессионных плазмид ΕΒΝΑ 293.

Гены мутантных форм и дикого типа ΙΕΝβ, соединенные с сигнальной последовательностью УСАМ-1, йб-маркером и энтерокиназной линкерной последовательностью, очищали в геле в виде фрагментов величиной в 761 пару оснований, полученных в результате действия рестрикционных ферментов ΝοΐΙ и ΒатΗI. Очищенные гены субклонировали в расщепленном под действием ΝοΐΙ и ΒатΗI плазмидном векторе ρΌ8ν247, который получали из рСЕР4 (ΙηνίΐΓο^βη, СагНЬаб, СΑ). Плазмида ρΌδν247 представляет собой экспрессирующий вектор для временной экспрессии белка в клетках почек человека ΕΒΝΑ 293 (ΙηνίΐΓο^βη, СагкЬаб, СΑ). Она содержит ранний промотор гена цитомегаловируса и регуляторные элементы ΕΒν, которые необходимы для обеспечения высокого уровня экспрессии в данной системе, а также отборочные маркеры для Е. со11 (устойчивость к ампициллину) и клеток ΕΒΝΑ 293 (устойчивость к гидромицину). Цитированные плазмиды использовали для трансформирования ΙΑ221 или ХЬ1-В1ие клеток Е. сой, и ампициллинустойчивые колонии собирали и тестировали на наличие вставок с помощью рестрикционного картирования. Получали препаративное количество ДНК и последовательность вставок подтверждали путем секвенирования ДНК. Положительные клоны, обнаруживающие наличие желательных мутировавших последовательностей, использовали для трансфекции клеток почек человека ΕΒΝΑ 2 93.

Полное клонирование и стратегия экспрессии представлены на фиг. 12.

С. Экспрессия и количественное определение аланинзамещенных форм ΙΕΝ-β-1α.

Человеческие клетки ΕΒΝΑ 293 (Ιηνίΐτοдеп, СагкЬаб, СΑ, СЫИе^е^ Т. (1989) I. νίτοί. 63: 3016-3025) хранили в виде субконфлюентных культур в модифицированной по способу Дальбекко среде Игла с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамина и 250 нг/мл генетицина (ЫГе Тесйηο1οд^е8, ОаййегкЬигд, ΜΌ). Экспрессионные плазмиды ρΌ8\ν247 для обеспечения временной экспрессии трансфицировали в клетки ΕΒΝΑ 293, с помощью метода с использованием липофектамина (Όί^ο/ΒΚΕ ШЕе Тесйηο1οд^е8). Кондиционированную среду собирали через 3-4 дня после трансфекции, обломки клеток удаляют путем центрифугирования и концентрацию Ιιίδ-ΙΕΝ-β определяют с помощью ΕΌΙδΑ.

Анализ ΕΌΙδΑ проводили с использованием поликлональных кроличьих антител (Ι§Ο, очищенные на белке А, образование антител вызывали против очищенного человеческого ΙΕΝ-β-1α) для покрытия 96-луночных планшетов ΕΌΙδΑ, и биотинилированную форму таких же поликлональных кроличьих Ι§Ο использовали в качестве второго реагента для обеспечения возможности определения интерферона с помощью стрептавидин-связанной пероксидазы хрена (НКР: Искюи IттиηοΚе8еа^сЫ, V. Огоуе, ΡΑ). Серии разведении β-1α-инτерферона (в виде ΑνΟΝΕΧ®, получали от Вюдещ Шс.) использовали для получения стандартных концентрационных кривых. Кондиционированную среду от трансфицированных клеток ΕΒΝΑ, содержащую Ηίδ-ΙΕΝ-β, разбавляли до получения образцов с концентрациями, варьирующими от 10 до 0,3 нг/мл в тесте ΕΌΙδΑ. Для подтверждения концентраций ΙΕΝ-β в среде, определенных с помощью ΕΌΙδΑ, проводили вестерн-блоттинг. Востановленные супернатанты культуры и стандарты ΙΕΝ-β-1α подвергали анализу методом δΌδ-ΡΑΟΕ на гелях с градиентом полиакриламида 10-20% (Nονеx, 8аη ^^едο, СΑ) и помещали на мембраны ΡΌΥΕ. Иммуноактивные полосы определяли с помощью кроличьей поликлональной антисыворотки против ΙΕΝ-β-1α (#447, Вюдещ Шс., вторая антисыворотка, которая была получена против ΙΕΝ-β-1α), с последующей обработкой НКР-связанными антикроличьими ΙβΟ осла (ΕκΚδοη IттиηοΚе5еа^с11. V. Огоуе, ΡΑ).

Ό. Анализ мутантных форм β-интерферона на связывание с рецептором.

Рецепторсвязывающие свойства мутантных форм β-интерферона, описанных в разделе С, оценивали с помощью двух различных анализов связывания. В одном анализе измеряли связывание мутантных форм β-интерферона с гибридным белком, ΙΕΝΑΚ2/Εφ включающим внеклеточный домен цепи человеческого рецептора ΙΕΝΑΚ2, соединенного с частью константной области человеческого Ι§Ο. ΙΕΝΑΚ2^ экспрессировали в клетках яичников китайского хомяка (СНО) и очищали с помощью аффинной хроматографии на сефарозе с иммобилизованным белком А в соответствии с инструкциями производителя (Р1егсе СЫет. ΚοскΓο^ά. ΙΌ, № по каталогу #20334). Связывание мутантных форм бета-интерферона с ΙΕΝΑΚ2^ измеряли с помощью анализа формата ΕΌΙδΑ. Планшеты для ΕΌΙδΑ получали путем покрытия плоскодонных 96-луночных планшетов 50 мкл/лунку мышиных моноклональных антител против человеческого Ι§Ο1 (0ΌΟ5-ΑΑ9, ВОден, Шс.) в течение ночи при 4°С, при концентрации 10 мкг/мл в буфере для покрытия (50 мМ NаНСΟз, 0,2 мМ МдС12, 0,2 мМ СаС12, рН 9,6). Планшеты дважды промывали ΡΒδ, содержащим 0,05% Т^ееп-20, и блокировали 0,5% обезжиренным сухим молоком в ΡΒδ в течение 1 ч при комнатной температуре. После двух дополнительных промывок к каждой лунке добавляли 50 мкл 1 мкг/мл ΙΕΝΑΚ2^ в 0,5% молоке в ΡΒδ, содержащем 0,05% Т^ееп-20, и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего планшеты промывали еще два раза. Связывание мутантных форм β-интерферона с ΙΕΝΑΚ2^ измеряли путем добавления 50 мкл/лунку мутантных форм β-интерферона в кондиционированной среде, серийно разведенных в модифицированной по Дальбекко среде Игла (ΌΜΕΜ), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой, и инкубировали 2 ч при 4°С. Разведения мутантных форм β-интерферона обычно варьировали приблизительно от 1 мкМ до 10 пМ. После промывания концентрацию β-интерферона, связанного с планшетом, определяли путем добавления 50 мкл/лунку смеси, состоящей из разбавленных 1:1000 кроличьих поликлональных антител против интерферона (#447, Вюдеп, 1пс.) и меченных пероксидазой хрена (НИР) антикроличьих 1д6 осла Цасккоп 1ттипоКе8еагск), и инкубации в течение 15 мин при 4°С. После двух промывок добавляли субстрат НИР и планшет инкубировали при 4°С, после чего считывали поглощение при 450 нм на аппарате для прочтения планшет ЕЬ18А. Строили график зависимости поглощения от концентрации мутантной формы βинтерферона, и сродство связывания мутантной формы β-интерферона с ШЫАК2-Рс определяли путем приведения данных к простому гиперболическому уравнению связывания. Результаты этих анализов приведены на фиг. 3, в которой связывающее сродство для каждого мутанта, определенное в экспериментах с тройными повторами, выражали в виде процента от величины, измеренной для Н^8₆-β-1α-интерферона дикого типа.

Во втором анализе использовали измерение сродства, с которым мутантные формы βинтерферона связываются с клетками Дауди, экспрессирующими обе рецепторные цепи, 1РΝΛΚ.1 и ΙΡΝΛΚ.2, которые вместе составляют рецептор β-интерферона. В этом анализе, который проводят с использованием РАС8, использовали блокирование моноклональных антител, направленных против внеклеточного домена IРNАΚ1, ЕА12 (Вюдеп, 1пс.), для того, чтобы различить незанятый (свободный) рецептор от рецептора, с которым связан β-интерферон. Клетки Дауди (20 мкл с концентрацией 2,5х10⁷клеток/мл) помещали в 96-луночные планшеты ЕЫ8А с У-образным дном и инкубировали в течение 1 ч при 4°С с различными концентрациями мутантных форм β-интерферона (20 мкл в РАС8-буфере; 5% РВ8, 0,1% Ν;ιΝ₃ в РВ8). Желательные серийные разведения мутантных форм β-интерферона варьировали от 0,5 мкМ до 0,5 пМ. К каждой лунке добавляли 100 нг биотинилированных мышиных моноклональных антител ЕА12 (10 мкл) против IРNАΚ1, и планшеты инкубировали еще 2 мин при комнатной температуре, после чего их дважды промывали РАС8-буфером (4°С). Затем клетки инкубировали 30 мин при 4°С с 50 мкл/лунку разбавленного 1:200 И-фикоэритрин-конъюгированного стрептавидина (1аск§оп 1ттипоКе8еагск, \Уе81 Сгоуе, РА), промывали дважды РАС8-буфером, ресуспендировали в 300 мкл РАС8-буфера, содержащего 0,5% параформальдегида, и переносили в полистироловые пробирки 12x75 мм (Ра1соп 2052). Затем образцы анализировали с помощью проточной цитометрии на РАС8саи (Вес!оп Пюкт8оп). Строили график зависимости среднего значения интенсивности канальной флюоресценции (МРС1) от концентрации мутантной формы β-интерферона: связывающее сродство определяли как концентрацию му тантной формы β-интерферона, соответствующую 50% ингибированию окрашивания антител. Каждую мутантную форму тестировали много раз. На фиг. 4 показано связывающее сродство к рецептору для каждой мутантной формы β-интерферона, определенное с помощью этого метода, выраженное как процент от сродства, измеренного для №8^-^^^^ферона дикого типа в каждом эксперименте.

Е. Анализ функции мутантных форм βинтерферона.

Мутантные формы β-интерферона также тестировали на функциональную активность, используя ш νίΐΐΌ анализы на антивирусную активность и способность β-интерферона ингибировать пролиферацию клеток. Минимум три антивирусных анализа, каждый с тройными повторами точек данных, проводили для каждой мутантной формы. Н^8₆-β-1α-интерферон дикого типа был включен в каждый эксперимент в качестве образца отнесения. Антивирусный анализ проводили путем обработки клеток карциномы легкого человека А549 (АТСС СС1 185) в течение ночи 2-кратными серийными разведениями мутантной формы β-интерферона в концентрациях, охватывающих интервал от полной защиты против вируса до отсутствия защиты от гибели клеток в результате действия вируса. На следующий день клетки заражали в течение двух дней вирусом энцефаломиокардита (ВЭМК (ЕСМУ)) при разбавлении, которое приводит к полной гибели клеток в отсутствие интерферона. Содержимое планшетов затем окрашивали метаболическим красителем МТТ (2,3-бис[2метокси-4-нитро-5-сульфофенил]-2Н-тетразолин-5-карбоксианалид) (М-5655, 81дта, δΐ.

Ьош8, МО). Получали базовый раствор МТТ с концентрацией 5 мг/мл в РВ8, подвергали стерильной фильтрации и 50 мкл этого раствора разбавляли в клеточных культуральных средах (100 мкл на лунку). После инкубации при комнатной температуре в течение 30-60 мин, раствор МТТ/среда отбрасывали, клетки промывали 100 мкл РВ8, и наконец метаболизированный краситель солюбилизировали в 100 мкл 1,2н. растворе соляной кислоты в 90% изопропаноле. Количество живых клеток (как видно по присутствию красителя) определяли по поглощению при 450 нм. Данные анализировали путем нанесения на график величины поглощения против концентрации мутантной формы βинтерферона, и активность каждой мутантной формы определяли как концентрацию, при которой наступала гибель 50% клеток. На фиг. 5 показана активность каждой мутантной формы, выраженная в виде процента от активности, измеренной в каждом эксперименте для 1118меченного β-1α-интерферона дикого типа.

Мутантные формы β-интерферона также оценивали на активность в антипролиферативном анализе. Клетки человеческой лимфомы

Дауди-Беркитта (АТСС # ССЬ 213) высевали в концентрации 2х10⁵ клеток/мл в КРМ[ 1620, дополненной 10% определенной фетальной телячьей сывороткой (Нус1опе, Ьодап И!ай) и 2 мМ Ь-глутамином. Каждая лунка также содержит заданную концентрацию мутантной формы β-интерферона в конечном общем объеме 100 мкл среды на лунку; использующиеся концентрации β-интерферона были выбраны так, чтобы охватывать интервал от максимального ингибирования пролиферации клеток Дауди до отсутствия ингибирования (т.е. полная пролиферация). Повторы экспериментальных точек использовали для каждой концентрации тестируемой мутантной формы β-интерферона, и во всех экспериментах был включен параллельный набор необработанных клеток. Клетки инкубировали в течение двух дней при 37°С в инкубаторах с 5% СО2, после чего к каждой лунке добавляли 1 мкКи на лунку меченного тритием тимидина ((метил-³Н) тимидин, Αιι-κιέΙ!;·!!!! ТКК758) в 50 мкл среды, и инкубировали в течение еще 4 ч. Клетки собирали, используя харвестер планшет ЬКВ, и включение меченного тритием тимидина измеряли, используя планшет-ридер ЬКВ β. Получали средние значения повторов экспериментальных данных и определяли стандартные отклонения. Данные наносили на график как среднее количество импульсов в минуту против концентрации мутантной формы бетаинтерферона, и активность каждого мутанта определяли как концентрацию, требующуюся для получения 50% ингибирования максимального наблюдающегося роста. Для каждой мутантной формы проводили многочисленные анализы.

На фиг. 6 показаны результаты, выраженные в виде процента от активности, обнаруженной для Ык-меченного β-1α-интерферона дикого типа в каждом эксперименте.

Р. Свойства мутантных форм β-интерферона.

Было обнаружено, что активность гистидин-меченного β-1α-интерферона дикого типа в антивирусном и антипролиферативном анализах была в каждом приблизительно в 3 раза ниже, чем соответствующая активность, обнаруженная для немеченого β-1α-интерферона дикого типа. Из-за того что все мутантные формы βинтерферона А1-Е содержат идентичную Ыкмеченную последовательность в их Ν-концевых областях, влияние мутаций на свойства молекулы определяли путем сравнения активностей данных мутантных форм в антивирусном, антипролиферативном анализах и анализе связывания с активностью, наблюдаемой для Ыкмеченного β-1α-интерферона дикого типа. Исходя из этого, заявители допускали, что вариации активностей мутантных форм А1-Е, сравниваемые с Ык-меченным β-1α-интерфероном дикого типа, качественно и количественно при близительно соответствуют эффектам, которые те же мутации будут оказывать в отсутствие Νконцевого Ык-маркера. Эквивалентное допущение для меченных или гибридных конструкций других растворимых цитокинов обычно считается верным практикующими специалистами, использующими мутагенез с последовательными аланиновыми замещениями, особенно если 1п уйго функциональная активность меченной или гибридной конструкции близка к активности цитокина дикого типа, как в случае, описанном в данном документе. См., например, Реагсе К.Н. 1г, е! а1., 1. Вю1. Сйет. 272:20595-20602 (1997) и Ыпек РТ., е! а1., 1. Вю1. СНет. 213:11667-11674 (1998).

Данные, приведенные на фиг. 3-6, позволяют предположить наличие трех типов эффектов, которые вызваны направленным мутагенезом. Эти эффекты в некоторых условиях могут быть благоприятными для разработки лекарственного препарата на основе интерферона. К данным трем типам эффектов относятся следующие: (а) мутантные формы с более высокой антивирусной активностью, чем активность β1а-интерферона дикого типа (например, мутантная форма С1); (Ь) мутантные формы, которые проявляют активность как в антивирусном, так и в антипролиферативном анализе, но для которых антипролиферативная активность является непропорционально низкой по отношению к антивирусной активности, по сравнению с диким типом β-1α-интерферона (например, мутантные формы С1, Ό и ΌΕ1); и (с) функциональные антагонисты (например, Α1, В2, СЭ2 и ΌΕ1), которые демонстрируют антивирусную и антипролиферативную активность, которые являются непропорционально низкими по отношению к связыванию рецептора, по сравнению с диким типом β-1α-интерферона. Можно видеть, что некоторые мутантные формы относятся более чем к одному классу. Обзор этих классов приведен ниже. Хотя заявители характеризуют данные классы мутантных форм относительно перечисленных примеров, должно быть понятно, что другие мутации в данных областях могут приводить к подобным или даже увеличенным влияниям на активность:

(а) Мутантная форма С1 обладает антивирусной активностью, которая приблизительно в 6 раз выше, чем активность Ык-меченного β-1αинтерферона дикого типа. Ожидается, что эта и другие мутантные формы данного типа будут полезными для уменьшения количества βинтерферона, которое должно быть введено для достижения заданного уровня антивирусного эффекта. Полагают, что уменьшение количества вводимого белка приведет к уменьшению иммуногенности данного белка и может также уменьшить побочные эффекты, касающиеся токсичности, не основанной на механизме действия белка. Ожидается, что мутации в данном классе являются благоприятными в ситуациях, когда терапевтическое улучшение, наступившее в результате введения β-интерферона, является следствием его антивирусного действия, и когда антипролиферативная активность сопровождается токсичностью или нежелательными побочными эффектами.

(Ь) Относительные активности (% от дикого типа) аланинзамещенных мутантных форм в антивирусном и антипролиферативном анализах сравнивают на фиг. 7. Согласованно измененные активности (т.е. антивирусная и антипролиферативная активности, которые отличаются на один и тот же коэффициент от активностей Ык-меченного β-ΐα-интерферона дикого типа) обнаруживали в большинстве мутантных форм (которые лежат на диагональной линии). Однако некоторые мутантные формы более сильные изменения в активности в одном анализе относительно другого, по сравнению с Ык-меченным β-ΐα-интерфероном дикого типа, как видно по смещению от диагонали. Три такие мутантные формы показаны в таблице, приведенной ниже. Мутантная форма С1 обнаруживает антивирусную активность, которая в ~6 раз выше, чем активность Ык-меченного β-ΐα-интерферона дикого типа, но ее активность в антипролиферативном анализе является подобной активности дикого типа. Таким образом мутантная форма С1 обладает антивирусной активностью, превышающей в 5,2 раза ее антипролиферативную активность, по сравнению с Ык-меченным β-ΐαинтерфероном дикого типа. Подобным образом, мутантная форма Ό проявляет 65% активности дикого типа в антивирусном анализе, но только 20% активности дикого типа в антипролиферативном анализе, и таким образом обладает антивирусной активностью, которая в 3,4 превышает ее антипролиферативную активность по сравнению с диким типом. Мутантная форма ΌΕ1 проявляет 26% активности дикого типа в антивирусном анализе, но только 8,5% в антипролиферативном анализе, и таким образом обладает антивирусной активностью, которая в 3,0 раза превышает ее антипролиферативную активность по сравнению с Ык-меченным β-ΐαинтерфероном дикого типа. При введении в концентрации, достаточной для достижения желаемого уровня антивирусной активности, эти мутантные белки будут обнаруживать суще ственно более низкие уровни антипролиферативной активности, чем белок дикого типа. Ожидается, что мутации в этом классе, так же как и в классе (а), являются благоприятными в ситуациях, когда терапевтическое улучшение, наступившее в результате введения βинтерферона, является следствием его антивирусного действия и когда антипролиферативная активность сопровождается токсичностью или нежелательными побочными эффектами.

Мутантная форма	Антивирусная активность (АВ) (% от дикого типа)	Антипролиферативная активность (АП) (% от дикого типа)	АВ/АП
С1	571	109	5,2
ϋ	65	19	3,4
ΏΕ1	26	8,5	3,0

(с) Мутантные формы с антивирусной и антипролиферативной активностями, которые являются низкими относительно рецепторного связывания, по сравнению с Ык-меченным β-ΐαинтерфероном дикого типа (см. таблицу, приведенную ниже). Мутантная форма А1 проявляет антивирусную и антипролиферативную активности, которые являются в 2,0 раза и в ΐ,8 раза выше, чем активности, наблюдающиеся для Ыкмеченного β-ΐα-интерферона дикого типа, но связывает родственный рецептор на клетках Дауди со сродством, которое в 29 раз превышает сродство дикого типа. Связывание данной мутантной формы с рецептором ΙΕΝ-β, таким образом, увеличено приблизительно в ΐ5 раз по сравнению с антивирусной и антипролиферативной активностями данного белка. Подобным образом, мутантные формы В2, СЭ2 и ΌΕ1 показывают увеличение связывания по отношению к антивирусной активности в 4,6, 4,6 и ΐ8 раз соответственно, и по отношению к антипролиферативной активности в 3,5, ΐ5 и 54 раза. Ожидается, что эти белки будут полезными в качестве функциональных антагонистов активности эндогенного ΙΕΝ-β и возможно других эндогенных интерферонов типа I, так как они обладают способностью связывать и занимать рецептору и, кроме того, генерируют только небольшую часть функционального ответа в клетках-мишенях, который можно наблюдать в случае ΙΕΝ-β дикого типа.

Мутантная форма	Антивирусная активность(АВ) (% от д.т.)	Антипролиферативная активность (АП) (% от д.т.)	Клеточная связывающая активность (% от д.т.)	Связывание/АВ	Связывание/АП
А1	200	180	2900	15	16
В2	7,1	9,2	33	4,6	3,5
СО2	150	46	690	4,6	15
ΌΕ1	26	8,5	460	18	54

С. Зависимость мутеина от трехмерной структуры интерферона.

В то время как опубликованные кристаллические структуры негликозилированной формы мышиного β-интерферона (Т. 8епйа, 8. 8а1Ю11 апй Υ. Мйкш. Яейпей Сгук!а1 81гис1иге о£ ЯесотЬшап! Мигше Ιπ^ΓίοϊΌΠ-β а! 2.15 А Яеко1ийоп. 1. Мо1. Вю1. 253: 187-207 (1995)) и человеческого альфа-2Ь-интерферона (Я. Яаййакпкйпап, Ь.Е \Уа11ег. А. Нгиха, Р. Яеюйей, Р.Р Тгойа, Т.Ь. ЫадаЬйикйап апй М.Я. ^айег. 2шс Мей1а1ей Оппег οί Нитап Iп1егГегоп-а2Ь Яеνеа1ей Ьу Х-гау Сгук1а11одгарйу. 81гисй1ге. 4: 1453-1463 (1996)) предоставили модели полипептидного каркаса человеческого β-интерферона, заявители недавно установили структуру гликозилированной формы β-1а-интерферона (М. Кагрикак, М. Ыойе. С.В. Веп1оп, V. Ме1ег, ν.Ν. ЫрксотЬ, апй

8.Е Сое1х. Тйе СгуКа1 8йис1иге о£ Нитап 1п1егГегоп-β а! 2.2 А геко1ийоп. Ргос. №11. Асай. 8сЕ И8А 94:11813-11818 (1997)).

Результаты наших мутационных анализов могут быть суммированы относительно 30структуры β-1α-интерферона (не представлено в данном документе). Некоторые мутации остатков приводят к уменьшению активности (от 2 до >5-кратное уменьшение). Мутировавшие участки соответствуют замещениям, приведенным в табл. 1 и 2.

Мутации, которые являются наиболее значительными по влиянию на функционирование, приводят к значительному уменьшению как активности, так и связывания рецептора клеточной поверхности. Мутации в данной области (спираль А2, петля АВ&АВ2 и спираль Е) соответствуют мутациям в связывающем участке IΕNАЯ2, так как ни одна из этих мутантных форм не связывала IΕNАЯ/Εс в анализе, проводимом заявителями.

Хотя мутации, которые являются важными для связывания IΕNАЯ2, также влияют на клеточное связывание. На связывающие свойства клеточной поверхности также влияют остатки в других участках молекулы (спираль В1, спираль С2). Как можно видеть на 3-Ό моделях (не показано), изображающих эффекты аланинзамещенных мутантных форм, что Ν-концевые, Сконцевые участки и участки гликозилированной спирали С молекулы ΙΕΝ-β-1α не принадлежат участку, связывающему рецептор. Мутации в этих участках не уменьшают биологической активности или уменьшают связывание рецептора клеточной поверхности.

Пример 2. Конструирование плазмид для экспрессии гибридного белка на основе β-1αинтерферона (ΙΕΝ-β/Ес).

Для создания экспрессионной плазмиды, кодирующей последовательность ДНК человеческого ΙΕΝ-β, соединенного с молекулой тяжелой цепи Ес фрагмента мышиного 1§С2а, применяли метод ПЦР. Плазмидный вектор ρΌ8ν247 (см. пример 1) получали из рСЕР4 йтйгодеп, Саг1кЬай, СА), из которого был удален ген ЕΒNА-I. Данную плазмиду использовали для конструирования экспрессионного вектора, пригодного для временной экспрессии белка в клетках почек человека ЕΒNА 293 (1п^йгодеп, Саг1кЬай, СА., 8йеп. Е. 8., ей а1. 1995, Сепе 156, 235-239). Он был сконструирован так, чтобы включать сигнальную последовательность адгезионной молекулы-1 клеток кровеносных сосудов человека (УСАМ-1), находящуюся в рамке считывания и выше по ходу транскрипции последовательности β-интерферона, и энтерокиназную линкерную последовательность в области сочленения β-интерферона и 1д последовательностей.

Экспрессионную кассету гибридного белка собирали из нескольких фрагментов ДНК. Для получения фрагмента ДНК, кодирующего ген человеческого ΙΕΝ-β, субклон кДНК человеческого ΙΕΝ-β (СепВапк каталожный номер #Е00029) использовали в качестве матрицы для ПЦР, которую проводили с использованием праймеров 5'-ССТССТСТСАСАТСАССТАСА АСТТССТТССАТТССТАСАААСААСС (8 ЕС) ΙΌ ΝΟ: 31: ВЕТ-025) и 5'-ССССТССАСТСС АССТТСТСАТСАТССТССТТТСССАССТА АССТСТААС (8 ЕС) ΙΌ ΝΟ: 32: ВЕТ-026), которая также включала сайт расщепления рестрикционным ферментом (ΒκηΙ) выше первого кодона ΙΕΝ-β. 3' праймер (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 32: ВЕТ026) для ПЦР гена ΙΕΝ-β исключал терминирующий кодон ΙΕΝ-β и включал как рамку считывания энтерокиназной линкерной последовательности (ΌΌΌΌΚ), так и концевой сайт ферментативной рестрикции (ХйоЦ, использующийся для субклонирования в экспрессионном векторе. Сайт ВкаЕ введенный выше последовательности, кодирующей ΙΕΝ-β, позволил заявителям лигировать сигнальную последовательность УСАМ-1 в рамку считывания гена, кодирующего последовательность ΙΕΝ-β, и выше его по ходу транскрипции. Сигнальную последовательность УСАМ-1 также получали с помощью ПЦР, используя пары праймеров 5'-САА ССТТССТАСССССССССС-3' (8ЕС) ΙΌ ΝΌ: 33: ВЕТ-023) и 5'-ССТССТСТСАСАТСССТТС АСААССТСС-3' (8 ЕС) ΙΌ ΝΟ: 34: ВЕТ-024), которые содержали 5' сайт расщепления рестрикционным ферментом (№Й, для лигирования в рЭ8\У247 №Й-клонирующий сайт) и 3' сайт расщепления рестрикционным ферментом (ВкаЕ для лигирования в ΙΕΝ-β-Ы 5' ПЦР фрагмент). В качестве матрицы для ПЦР использовали кДНК (СепВапк каталожный номер Х53051) адгезионной молекулы-1 клеток кровеносных сосудов человека (УСАМ-1).

Для создания гибридного гена ΙΕΝ-β-1α^ проводили следующие процедуры. Фрагмент мышиного Ι§62η удаляли из рЕАС293 путем очистки в геле фрагмента ДНК, который пред49 ставляет собой продукт расщепления 8α1Ι + ВатНЕ Плазмида рЕАС293 представляет собой В1иекспр1 ΙΙ8Κ+ (81га1адепе, Ьабо11а СА, номер по каталогу #212205) субклон шарнирного участка, доменов СН2 и СН3 мышиного ^С2а (СепВапк каталожный номер ν00798). Пары праймеров для ПЦР 5'-АССТ8МАВСТССАС 8АСТС№-3' (8 ЕС) ΙΌ ΝΟ: 35), где 8 = С или С, М = А или С, В = А или С, = А или Т, и 5'СТСАССТСАТТТАСССССАСТСССССАСАА ССТСТТ-3' (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 36) создают фланкирующие сайты 8аП и ΝοΐΙ в 5' и 3' концах кассеты, соответственно. Кассета Ес домена мышиного ЦС2а отличалась от последовательности СепВапк на одно основание (кодон ν369), создающее молчащую мутацию. Следовательно, с помощью кассеты ЦС2а Ес экспрессировали Ес белок дикого типа.

Фрагмент ДНК, содержащий сигнальную последовательность VСΑΜ-1, соединенную с геном человеческого ΙΓΝ-β с С-концевой энтерокиназной линкерной последовательностью, вырезали из рСМС258 путем расщепления по ΝοΐΙ и ВатШ и очищали в геле. Сайт 8ι1Ι кбе присутствовал в первоначальной плазмиде рЭ8\У247 и помещался непосредственно ниже и в рамке считывания гена, кодирующего последовательность ΙΤΝ-β. Плазмидный вектор рЭ8\У247 получали в виде очищенного в геле фрагмента ΝοΐΙ + ВатШ (см. пример 1). Для сборки конечного экспрессионного вектора, кодирующего гибрид IЕN-β-1α/IдС2а. проводили 3-стадийное лигирование, используя вышеупомянутые фрагменты. Данную экспрессионную плазмиду обозначили рСМС261, она содержит сигнальную последовательность VСΑΜ1 в соединении с геном зрелого человеческого ΙΗΝ-β, энтерокиназную линкерную последовательность и Ес домен мышиного ЦС2а. Последовательность полноразмерной ДНК (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1) и белковая последовательность (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2) гибридного белка приведены на фиг. 2.

Пример 3. Получение гибридного белка на основе β-1 α-интерферона в клетках млекопитающих.

Экспрессирующий вектор рСМС261 рекомбинантного ΒΝ-β/Ес для временной экспрессии трансфицировали в клетки почек человека ΕΒNΑ 293 для осуществления экспрессии гибридного белка данного изобретения на основе ΙΤΝ-β-1α. Данную рекомбинантную экспрессионную плазмиду трансфицировали с использованием липофектамина (номер по каталогу #18324-020, ЫГе Тес1юпо1од1ек) в клетки почек человека ΕΒNΑ 283 в соответствии с инструкцией производителя (ЫГе ТесЬпо1од1ек, СайбеткЬитд, ΜΌ, На\\'1еу-№1коп, Р., Сюсатопе, V., СеЬеуеНи, С. 1еккее. 1., Ее1дпег, Р. Ь. (1993) Еосик 15.73) с использованием 1-3 мкг плазмидной ДНК для культуральной плашки диаметром 100 мм с клетками ΕΒNΑ 293. На следующий день после липофектаминовой трансфекции клеток среду заменяют на среду для культивирования (модифицированная по Дальбекко среда Игла, 10% фетальная бычья сыворотка, 4 мМ глутамин, 250 мкг гентецина/мл (ЫГе Тес1по1од1ек, СайбеткЬитд, ΜΌ). Кондиционированную среду собирали через 3-4 дня и концентрацию ΙΡΝ-β-Ια-Ес определяли как описано ниже.

Получение гибридного белка ΙΡΝ-β/Ес в других экспрессионных системах, клетках млекопитающих или прокариотических клетках, может быть проведено путем переноса участка, кодирующего гибридный белок, в экспрессионные векторы, соответствующие этим экспрессионным системам. Альтернативные экспрессионные системы включают клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомяка (СНО) (Вагкоит, ΐ. (1995, Мебюбк т Мо1. Вю1. 48, с11ар1ег 18, 225-237), мышиные клетки Ν8-0 (Вокктап, С. е! а1. 1996, Рго1ет Ехргеккюп апб Риг. 7, 335-342) и клетки почек зеленой мартышки ί.Ό87 (ЕЫпдет, В. е! а1. 1996, Ргос. №16. Асаб. 8с1. И8А, 93:23, 13102-13107). Другими эукариотическими экспрессионными системами, которые могут применяться, могут быть дрожжи РюЫа ракЮпк (Е1бт, Р. Е. е! а1. 1997, ΐ. йттип. Мебюбк, 201, 67-75) и 8асс1аготусек сеге^зЛае (НоптЦ/, А. Н., 1988, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А, 85, 8678-8682).

Количественное определение уровней экспрессии белка IЕN-β-1α-Ес в культуральных супернатантах из трансфицированных клеток ΕΒNΑ 293 проводили с помощью ЕЫ8А, с использованием очищенной на белке А ЦС фракции кроличьих поликлональных антител против IЕN-β-1α (антигеном был очищенный ΙΡΝ-β-1α, Вюдеп, Ыс.) для покрытия 96-луночных планшетов. С помощью антител определяли содержание ΙΤΝ-β-1α в стандартных растворах и культуральных супернатантах в интервале концентраций интерферона от 10 до 0,3 нг/мл. Биотинилированные кроличьи поликлональные антитела против ΙΤΝ-β-1α (такие же антитела, как описанные выше) и связанную со стрептовидином пероксидазу хрена использовали для детекции связанных интерферонов. Для подтверждения данных, полученных с помощью ЕЫ8А, проводили вестерн-блоттинг, в котором восстановленные культуральные супернатанты и стандартные растворы ΙΤΝ-β-1α прогоняли на гелях с 5-20% Тпк-глицина (Nονеx, 8ап 01едо, СА), переносили на мембраны Р'УПЕ (Атеткбат ЫГе 8с1епсе, Ыс., С1е\^ге1апб. ΟΗ) и проводили определение с использованием другой кроличьей поликлональной сыворотки (полученной против ΙΗΝ-β-1α), с последующим применением связанных с пероксидазой хрена антител осла против кроличьих ЦС Цасккоп ИптипоВекеагсН, \Уек1 Соте, РА).

Пример 4. Антивирусная активность гибридного белка IЕN-β-1α/мышиный IдС2а.

Клетки карциномы легкого человека (А549) предварительно обрабатывали 24 ч с помощью ΙΡΝ-β-1α или ΙΡΝ-β-мышиный 1дО2а (61, 41, 27, 18, 12, 8,2, 5,5, 3,7, 2,5, 1,6 пг/мл) перед внесением вируса энцефаломиокардита (ВЭМК). После двух дней инкубации с вирусом живые клетки окрашивали раствором ХТТ:РМ8 (2,3-бис(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2Нтетразолий-5-карбоксанилида внутренняя соль: метасульфат феназина, при 333 мкг/мл и 2 нг/мл соответственно, в физиологическом растворе с фосфатным буфером) и определяли путем спектроскопии при 450 нм. Анализ проводили, используя данные с тройными повторами для каждой концентрации ΙΡΝ.

На фиг. 8 стандартные отклонения показаны как величины ошибки. 50% цитопатический эффект для ΙΡΝ-β-1α приблизительно составлял 0,4 пМ. Обнаружено, что 50% цитопатический эффект ΙΡΝ-β-мышиного 1дО2а составлял 0,15 пМ.

Пример 5. Конструирование и получение гибридного белка человеческий β-1α-интерферон/человеческий Ιβ01 Рс.

А. Конструирование гибридного белка человеческий β-1 α-интерферон/человеческий

Ι§01 Рс.

Для создания экспрессионной плазмиды, кодирующей последовательность ДНК человеческого ΙΡΝ-β, соединенного с молекулой тяжелой цепи Рс фрагмента (шарнирный участок, домены СН2 и СН3) человеческого ^01, применяли метод ПЦР.

Конструкция ΕΒΝΑ. Плазмидный вектор рСН269 получали из рСЕР4 Цпуйтодеп, СаткЬаб, СА), из которого был удален ген ΕΒΝΑ-1. Плазмиду использовали для конструирования экспрессионного вектора, использующегося для временной экспрессии белка в клетках почек человека ΕΒΝΑ 293 Цпуйтодеп, СаткЬаб, СА: 8йеп Ε.8., е! а1. 1995, Оепе 156, 235-239).

Экспрессионную кассету гибридного белка собирали из трех фрагментов ДНК: №П/8аП фрагмента, кодирующего сигнальную последовательность VСΑМ-1 в рамке считывания и соединенный с последовательностью, кодирующей человеческий ΙΡΝ-β, ЗаИ/ЫоИ фрагмента, кодирующего шарнирный участок, СН2 и СН3 домены человеческого ^0Ι, и №6 фрагмента ΕΒΝΑ экспрессионного вектора рСН269.

Два разных фрагмента №П/8а1! кодирующих зрелую сигнальную последовательность VСΑМ-1 в рамке считывания и соединенных с геном человеческого ΙΡΝ-β получали с помощью метода ПЦР. В качестве матрицы для ПЦР использовали плазмиду рСМО258 (см. пример 2, приведенный выше), которая кодирует зрелую сигнальную последовательность VСΑМ-1 в рамке считывания, соединенную с геном человеческого ΙΡΝ-β, который находится в рамке считывания и соединен с энтерокиназной линкерной последовательностью. Использовали два набора праймеров для ПЦР. Один набор праймеров (5'-А6СТТ6СТА6С66СС ОСООССТСАСТООСТТСА-3' (8ΕΕ) ΙΌ ΝΟ: 37), и 5'-АТАСОСОТСОАСОТТТСООАООТААСАТОТААОТСТО-3': (8ΕΕ) ΙΌ ΝΟ: 38)) вводит аминокислотную замену О на С в положении 162. Данный фрагмент называется человеческий ΙΡΝ-β-Ο62.

Второй набор праймеров (5'-АОСТТО СТАОСООССОСООССТСАСТООСТТСА-3' (8ΕΕ) ΙΌ ΝΟ: 39) и 5'-ТАСАСОТСОАСО СТОССАССАССОССОТТТСООАООТААСАТ ОТААОТСТО-3' (8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: 40)) также вводит аминокислотную замену О162 на С162 и изменяет энтерокиназную линкерную последовательность (ΌΌΌΌΚ) на линкерную последовательность ОООО8 в рамке считывания и соединяет 3' с геном человеческого ΙΡΝ-β. Этот фрагмент назвали человеческий ΙΕΝ-β-ί.Ί62/048. Оба набора праймеров содержат 5' №П сайт для обеспечения возможности лигирования в рСН269 и 3' 8а 1Ι сайт расщепления для обеспечения возможности лигирования с фрагментом 8а11/№П человеческого ^61.

Фрагмент человеческого ^01, который кодирует шарнирный участок, СН2 и СН3 домены человеческого Ι§01, получали путем расщепления под действием рестрикционных ферментов (8аП/№П) плазмиды рЕАО409, полученной из плазмиды 8ΑΒ144 (описанной в патенте США 5547853). Фрагмент вырезали и очищали в геле.

Плазмиду рСН269 экспрессионного вектора ΕΒΝΑ расщепляли с помощью №6 и очищали в геле.

Две гибридные конструкции человеческий ΙΡΝ-β-человеческий Ιβ01 Рс получали путем трехстадийного лигирования. Одна конструкция, названная ΖΕ6206, содержит линкер 048: другая конструкция, названная ΖΕ5107, представляет собой прямое соединение. Последовательность полноразмерной ДНК и белковая последовательность открытых рамок считывания (см. фиг. 10) гибридного белка с прямым соединением приведены в 8Ε0 ΙΌ ΝΟ: 41 и 8Ε0 ΙΌ ΝΟ: 42 соответственно. Последовательность полноразмерной ДНК и белковая последовательность открытых рамок считывания (см. фиг. 11) гибридного белка с линкерной последовательностью приведены в 8Ε0 ΙΌ ΝΟ: 43 и 8Ε0 ΙΌ ΝΟ: 44 соответственно.

Конструкция СНО. Получали стабильную экспрессионную конструкцию СНО гибридного белка человеческий ΙΡΝ-β-человеческий ^01 Рс, которая включала ген человеческого ΙΡΝ-β, непосредственно связанный с геном человеческого Ιβ01 Рс. Фрагмент человеческий ΙΡΝ-βчеловеческий ^01 Рс вырезали из плазмиды ΖΕ5107 с помощью ИоИ и очищали в геле: его лигировали в №б сайт рЕАС347 (экспрессирующий вектор, содержащий тандем раннего промотора 8У40 и основного позднего промотора аденовируса [полученный из плазмиды рАЭ2[], уникальный сайт клонирования №!1, сопровождаемый сайтом поздней терминации транскрипции 8У40 и сигналами полиА [полученными из плазмиды рСМУ[]. рЕАС347 содержит плазмидную основу, полученную из риС19 и р8У2бЫг-полученный б11Гг для селекции МТХ и амплификации в трансфицированных клетках СНО).

В. Получение гибридного белка человеческий β-1α-интерферон/человеческий 1дС1 Рс в клетках млекопитающих.

Трансфекция гибридных конструкций ΙΡΝβ в клетки ΕΒΝΑ293 для обеспечения временной экспрессии.

Экспрессионные векторы рекомбинантного белка ΙΡΝ-β/человеческий 1дС 1 Рс, описанные выше, временно трансфицируют в клетки почек человека ΕΒΝΑ293 для осуществления экспрессии гибридного белка данного изобретения на основе ΙΡΝ-β-1α. Эти рекомбинантные экспрессионные плазмиды трансфицируют с использованием липофектамина (номер по каталогу #18324-020, Ь1Ге Тес11по1още5) в клетки почек человека ΕΒΝΑ 293 в соответствии с инструкцией, описанной выше в примере 3.

Стабильная трансфекция гибридной конструкции человеческий IРN-β-1α/человеческий ЦС1 Рс (не содержащей линкера) в клетки бйГгСНО.

Описанный выше экспрессирующий вектор рекомбинантного ΙΕΝ-β/человеческий ЦС1 Рс (не содержащего линкера), содержащий бйГг стабильно трансфицировали в клетки бйГг- СНО для осуществления экспрессии гибридного белка данного изобретения на основе ΙΕΝ-β-1α. Данную рекомбинантную экспрессионную плазмиду трансфицировали методом электропорации и отбор положительных клонов проводили в соответствии со следующим описанием.

Плазмидную ДНК (20 мкг), расщепленную с помощью Β§ΙΙΙ. осаждали, ресуспендировали в 800 мкл буфера НЕРЕ8 и добавляли к 10х10⁷СНО клеток/мл. После электропорации клетки культивировали в полной среде ΌΜΕΜ в течение 2 дней. Клетки разделяли на 20-40 чашек диаметром 10 см с полной средой ΌΜΕΜ/ диализованной 10% РВ8 и культивируют в течение 5 дней перед помещением в селекционную среду с увеличивающимися концентрациями (50-200 нг/мл) МТХ в ΌΜΕΜ в течение двух недель. К концу двух недель единичные колонии отбирали и размножали. Супернатанты, полученные от 22 клонов СНО, тестировали в антивирусном анализе.

Активность.

Антивирусную активность гибридных белков определяли в СРЕ анализах, как описано в примере 4. Как определено с использованием в данном анализе стандарта β-1α-интерферона со специфической активность 60 МИ/мг, активность полученного в результате временной экспрессии (ΕΒΝΑ) гибридного белка человеческий β-1α-интерферон/человеческий IцС1 Рс, содержащего линкер, составляла 900 ед./мл и активность гибридного белка, не содержащего линкер, составляла 440 ед./мл. Активность экспрессированного в СНО гибридного белка человеческий β-1α-интерферон/человеческий ЦС1 Рс составляла 50 ед./мл.

Пример 6. Измерение антивирусной активности β-1α-интерферона в плазме мыши, обработанной β-1α-интерфероном и гибридным белком β-1а-интерферон /мышиный ЦС2а.

Мышам (С57/В16) вводили в.в. через хвостовую вену 50000 ед. β-интерферона-1α (одной дозой) или 5000 ед. гибридного белка β-1αинтерферон-мышиный ЦС2а. В качестве контроля вводили равный объем фосфатного буфера.

Образцы крови брали из ретроорбитального синуса в разные моменты времени (сразу, через 0,25, 1, 4, 24 и 48 ч) после инъекции β-интерферона. Для каждой временной точки брали по меньшей мере 3 мыши. Целую кровь собирали в пробирки, содержащие коагулянт, клетки удаляли, полученную плазму замораживали и хранили до анализа. Образцы плазмы разбавляли 1:10 не содержащей сыворотку средой для анализа и пропускали через 0,2 мкм шприцевой фильтр.

Разбавленные образцы затем титровали в обозначенных лунках 96-луночного культурального планшета, содержащего клетки А549. Стандарт β-1α-интерферона (10, 6,7, 4,4, 2,9, 1,3, 0,9 и 0,6 ед./мл, ΑνΟΝΕΧ) и 4 образца тестировали на каждом планшете. Клетки предварительно обрабатывали образцами в течение 24 ч перед заражением вирусом ЭМК. После двух дней инкубации с вирусом живые клетки окрашивали раствором МТТ (5 мг/мл в фосфатном буфере) в течение 1 ч, промывали фосфатным буфером и солюбилизровали в 1,2н. растворе НС1 в изопропаноле. Лунки прочитывали при 450 нм. Для каждого планшета получали стандартные кривые и использовали их для определения величины активности β-1α-интерферона в каждом образце. На фиг. 9 приведен график зависимости активности в образцах, полученных от разных мышей, от времени.

Более медленное исчезновение гибридного белка на основе β-1α-интерферона из системы циркуляции, как функция времени, показывает, что период полужизни образца гибридного белка гораздо больше, чем период полужизни немодифицированного контроля β-1α-интерферона. Вторым обнаружением данного исследования, имеющим большое значение, является то, что очень небольшое количество гибридного белка утрачивается в процессе фазы распределения, что подтверждается сходными высокими уровнями активности, соответствующими временным точкам 15 и 60 мин. Эти данные показывают, что в отличие от контроля β-1αинтерферона, распределение гибридного белка на основе β-1α-интерферона в значительной степени ограничено сосудистой сетью.

Пример 7. Сравнительные фармакокинетические и фармакодинамические характеристики у приматов.

Сравнительные исследования проводили с гибридным белком на основе β-1α-интерферона и нативным β-1α-интерфероном (не представленным в виде лекарственной формы АУОИЕХ® β-1α-интерферона в 100 мМ фосфате натрия, 200 мМ №С1, рН 7,2) для определения их относительной стабильности и активности у приматов. В этих исследованиях фармакокинетические и фармакодинамические характеристики гибридного белка на основе β-1αинтерферона у приматов сравнивали с характеристиками нативного β-1α-интерферона, корректные заключения могут быть распространены на людей.

Животные и методы

План исследования.

Для сравнительной оценки фармакокинетических и фармакодинамических характеристик гибридного белка на основе β-1αинтерферона и негибридного белка β-1αинтерферона проводили исследования с использованием параллельных групп, повторяющихся доз.

Для данного исследования использовали здоровых приматов (предпочтительно макак резусов). Перед получением дозы всех животных дважды проверяли на наличие симптомов заболеваний с помощью ЬаЬ Ашта1 Уе!еттату в течение 14 дней перед введением тестируемого препарата; одна проверка должна проходить в пределах 24 ч перед первым введением тестируемого препарата. Тестируемый препарат давали только здоровым животным. Проверки включают общее физическое обследование и анализ крови перед введением дозы на базовую клиническую патологию и базовый уровень антител к β-1 α-интерферону. В пределах 24 ч перед введением тестируемого препарата всех животных взвешивали и измеряли у них температуру тела.

Двенадцать индивидуумов регистрировали и распределяли по группам из трех индивидуумов для получения 1 МИ/кг β-1 α-интерферона, либо гибридного, либо негибридного, но иным образом идентичного β-1α-интерферону. Введение осуществляли либо подкожным (ПК), либо внутривенным (ВВ) способом. Шесть самцов получали тестируемый препарат ВВ способом (3/обработку), а другие 6 самцов получали тестируемый препарат ПК способом (3/обработку). Все животные должны быть наивными по отношению к обработке βинтерфероном. Каждое животное получало дозу дважды; дозы разделяли на четыре недели. Объем дозы составлял 1,0 мл/кг.

Кровь подвергали фармакокинетическому тестированию через 0, 0,083, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72 и 96 ч после каждой инъекции. Образцы крови для определений индуцированного интерфероном маркера биологического ответа, сывороточного неоптерина, брали через 0, 24, 48, 72, 96, 168, 336, 504 ч после введения исследуемого препарата.

Проверки в течение периода исследования включают клинические наблюдения, проводимые через 30 мин и 1 ч после введения дозы для обнаружения симптомов токсичности. Проводили ежедневные всесторонние наблюдения и регистрировали общий вид, симптомы токсичности, дискомфорт и изменения в поведении. Вес и температуру тела регистрировали с регулярными интервалами через 21 день после введения дозы.

Аналитические методы.

Количественное определение уровней βинтерферона в сыворотке проводили с помощью анализа цитопатического эффекта (СРЕ). В анализе СРЕ измеряли уровни интерферонопосредованной антивирусной активности. Уровень антивирусной активности в образце отражает число молекул активного интерферона, содержащихся в данном образце в момент взятия крови. Этот подход является стандартным методом определения фармакокинетических характеристик β-интерферона. Анализ СРЕ, использующийся в настоящем исследовании, определяет способность β-интерферона защищать клетки карциномы легкого человека (А549, #СС1-185, АТСС, ^с^Ше, ΜΌ) от цитотоксичности, обусловленной вирусом энцефаломиокардита (ЭМК). Преинкубация клеток в течение периода от 15 до 20 ч с образцами сыворотки способствует индукции и синтезу интерферон-индуцируемых белков, которые затем обеспечивают антивирусный эффект. Затем добавляют вирус и инкубируют в течение еще 30 ч, после чего определяют цитотоксичность с использованием кристаллического фиолетового красителя. Внутренний стандарт, β-интерферон, а также внутренний стандарт, [Мд-интерферон. тестировали одновременно с образцами на каждом аналитическом планшете. Этот стандарт калибровали против стандарта отнесения, природного интерферона фибробластов человека (νΗΟ Второй международный стандарт интерферона, человеческие фибробласты, СЬ-23-90253). Каждый аналитический планшет также включает лунки контроля клеточного роста, не содержащие ни β-интерферона какого-либо вида, ни ЭМК, и лунки контроля вируса, содержащие клетки и ЭМК, но не β-интерферона. Для определения влияния, если оно имеет место, образцов на клеточный рост также готовили контрольные планшеты, содержащие стандарты и образцы. Эти планшеты окрашивали, не добавляя вирус.

Образцы и стандарты тестировали в повторах на каждом из двух параллельных аналитических планшетах, получая для образца четыре значения данных. Приводили среднее геометрическое значение концентраций в четырех повторах. Предел определения в этом анализе составлял 10 единиц (ед.)/мл.

Сывороточные концентрации неоптерина определяли в единицах клинической фармакологии с использованием коммерчески доступных анализов.

Фармакокинетические и статистические методы.

Для приведения данных к фармакокинетическим моделям использовали программное обеспечение ВкЬгрТМ (МюгоМаШ, 1пс., 8а1! Баке СПу, ИТ). Для каждой группы строили график зависимости среднего геометрического значения концентраций от времени. Так как результаты анализа выражали в разведениях, средние геометрические значения считали более подходящими, чем средние арифметические. Уровни сывороточного интерферона доводили до базовых значений и к не детектируемым сывороточным концентрациям относили концентрации ниже 5 ед./мл, что представляет собой половину нижнего предела детекции.

В случае данных для ВВ инфузии, модель ВВ инфузии из двух отделений приводили к детектируемым сывороточным концентрациям для каждого индивидуума, и ПК данные приводили к инъекционной модели из двух отделений.

Рассчитывали следующие фармакокинетические параметры:

(ί) наблюдаемое максимальное значение концентрации, С_тах (ед./мл);

(ίί) область под кривой от 0 до 48 ч, ОПК (АИС), с использованием трапецеидальной линейки;

(ΐϊϊ) полупериод выведения; и из данных ВВ инфузии (если ВВ применяется):

(ίν) полупериод распределения (ч);

(ν) разрешение (скорость вливания) (мл/ч);

(νί) кажущийся объем распределения, Уб (Ъ).

Для расчета полупериодов выведения после ПК и ВВ введения использовали программное обеспечение ЭДт№п1т (Уегкюп 1.0, 8с1епБПс СопкиШпд 1пс., Арех, ΝΟ).

Для неоптерина представляли зависимость средних арифметических значений от времени для каждой группы. Рассчитывали Е_тах, значение, максимально отличающееся от базовой линии. С_тах, ОПК и Е_тах подвергали одностадийному анализу отклонений для сравнения дозировочных групп. Стах и ОПК перед анали зом переводили в логарифмический вид; приводили средние геометрические значения.

Пример 8. Антиангиогенные эффекты гибридного белка на основе β-1 α-интерферона.

Определение способности гибридного белка на основе β-1α-интерферона ингибировать пролиферацию эндотелиальных клеток ш νίίΐΌ.

Эндотелиальные клетки вены человека (Се11 8ук!етк, номер по каталогу 2УО-Р75) и эндотелиальные клетки микрососудов кожи человека (Се11 8ук!етк, номер по каталогу 2М1С25) выращивали в культуре с С8-С средовым набором (Се11 8ук!етк, Са!. # 4Ζ0-500). За 24 до эксперимента клетки трипсинизировали, ресуспендировали в аналитической среде, 90% М199 и 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), и доводили до желаемой клеточной плотности. Затем клетки помещали на покрытые желатином 24- или 96-луночные планшеты в количестве 12500 клеток/лунку или 2000 клеток/лунку соответственно.

После инкубации в течение ночи, аналитическую среду заменяли свежей средой, содержащей 20 нг/мл человеческого рекомбинантного основного фактора роста фибробластов (Вес!оп Оюкшкоп, номер по каталогу 40060), и различные концентрации гибридного или негибридного β-1α-интерферона или положительного контроля (в качестве положительного контроля можно использовать эндостатин, а также антитело против ЬБСБ). Конечный объем доводят до 0,5 мл в 24-луночном планшете или до 0,2 мл в 96-луночном планшете.

Через 72 ч клетки трипсинизируют для счета Сои1!ег, замораживают для СуОиап! флюоресцентного считывания, или метят [³Н]тимидином.

В данном анализе ш νίίΐΌ анализировали влияние молекул человеческого β-интерферона данного изобретения на пролиферацию эндотелиальных клеток, которое может быть показателем агиогенных эффектов ш νί\Ό. См. О'КеШу, М.8., Т. ВоеЬт, Υ. 8Ыпд, Ν. Бика1, С. Уакюк, ЭД. Ьапе, Е. Б1упп, 1. ВпкЬеаб, В. О1кеп апб 1. Ео1ктап. (1997). ЕпбоДаНп: Ап Епбодепоик 1пЫЬ1!ог оГ Апдюдепык апб Титог Сго\\111. Се11 88, 277285.

Пример 9. 1п УАо модель для анализа антиангиогенных и реваскуламатозных эффектов гибридного белка β-1α/Iд-интерферона.

Был разработан ряд моделей для анализа антиангиогенных и неоваскуламатозных эффектов описанных в данном документе молекул. Некоторые из этих моделей были описаны в патентах США 5733876 (31 марта 1998: МеШоб оГ шЫЬФпд апдюдепеык) и 5135919 (4 августа 1992: Мебюб апб а рЬагтасеийса1 сотрокЮоп Гог !1е тЫЬПюп оГ апдюдепекЦ). Другие исследования включают анализ с использованием безоболочечной хориоаллантоисной мембраны (САМ) 8. Тау1ог апб 1. Ео1ктап; №!иге, 297, 307 (1982) и В. Сгиш, 8. 8хаЬо апй 1. Ео1ктап; 8с1епсе. 230. 1375 (1985); модель антиангиогенеза метода мышиного дорсального воздушного мешочка Ео1ктап, 1. е! а1.; 1. Ехр. Мей.,133. 275 (1971) и анализ с использованием микрокармана комедона крысы СтЬгопе, М.А. 1г. е! а1., 1. №11. Сапсег 1пк!. 52, 413 (1974), в котором васкуляризацию комедона индуцируют у взрослых самцов крыс штамма 8ргадие-0а^1еу (СБаг1ек ВВег, 1арап) путем имплантации 500 нг основного ЕСЕ (бычий, В & Ό 8ук!етк, 1пс.) импрегнированного в ЭВА (сополимер этилена и винилацетата) шарики в каждой роговице.

Другие методы тестирования гибридных белков β/18-интерферон на антиангиогенные эффекты в животных моделях включают (но не ограничиваются ими) описания скрининга новых потенциальных антираковых агентов, как описано в Сапсег Сйешоίйе^ару Веройк, Рак 3, Уо1. 3, Νθ.2, 8ер!етЬег 1972 и 111е киррктеп! 1п У1уо Сапсег Мойе1к, 1976-1982, МН РиЬ1ка!юп №. 84-2635, ЕеЬгиагу 1984. Из-за наличия видовых барьеров для интерферонов типа I, для определения антиангиогенной активности гибридных белков на основе β-интерферона на моделях-грызунах, получали гибридные препараты β-интерферон грызуновЛд. Примеры таких методов скрининга приводятся в описании к тесту для антиангиогенных эффектов мышиных гибридных белков β/Iд-интерферон на имплантированной подкожно карциноме легких Льюиса.

Источник опухолевой линии.

Возник спонтанно в 1951 в виде карциномы легких у мыши С57ВБ/6.

Краткое описание аналитических процедур.

Опухолевый фрагмент имплантировали подкожно в подмышечную область мыши Β6Ό2Ε1. Тестируемый агент (т.е. гибридный белок данного изобретения) вводили в различных дозах, подкожно (ПК) или интраперитонеально (ИП) через много дней после имплантации опухоли. Измеряемым параметром являлось среднее время выживания. Результаты выражали в виде процента от контрольного времени выживания.

Животные:

Воспроизведение: мыши С57ВБ/6.

Тестирование: мыши В6Э2Б1.

Вес: Вес мыши должен варьировать в пределах 3 г от минимального веса, составляющего 18 г для самцов и 17 г для самок.

Пол: В одном эксперименте использовали тестируемых и контрольных животных одного пола.

Источник: В одном эксперименте всех животных, если возможно, брали из одного источника.

Размер эксперимента: Десять животных на тестируемую группу.

Пересадка опухоли: Воспроизведение:

Фрагмент: Получали фрагмент величиной

2-4 мм от п. к. донора опухоли.

Время: 13-15 день.

Место: Имплантировали фрагмент п.к. в подмышечную область с пункцией в паховую область.

Тестирование:

Фрагмент: Получали фрагмент величиной 2-4 мм от п. к. донора опухоли.

Время: 13-15 день.

Место: Имплантировали фрагмент п. к. в подмышечную область с пункцией в паховую область.

Режим тестирования:

День 0: Имплантация опухоли. Выращивание бактериальных культур. Тестирование соединения положительного контроля в каждом нечетном эксперименте. Подготовка материалов. Ежедневная запись гибели животных.

День 1: Проверка культур. Отбрасывание эксперимента в случае загрязнения. Перемешивание животных. Обработка в соответствии с инструкцией (на 1 день и на следующие дни).

День 2: Повторная проверка культур. Отбрасывание эксперимента в случае загрязнения.

День 5: Сравнение дня 2 и дня начального определения токсичности тестируемого агента.

День 14: Контрольный день ранней гибели.

День 48: Контрольный по-!аке день.

День 60: Окончание и оценка эксперимента. Грубое обследование легких на наличие опухоли.

Контроль качества.

Использовали соединение положительного контроля (N80 26271 (цитоксан в дозе 100 мг/кг/инъекцию)) в каждом нечетном эксперименте, режим для которого состоял в интраперитонеальном введении только на 1 день. Более низкий предел тест/контроль для положительного контроля составлял 140%. Допустимое среднее время выживания необработанного контроля составляло 19-35,6 дней.

Оценка.

Измеряемым параметром являлось среднее время выживания. Вычисляли вес тела животных на 1 день и 5 день, вычисляли отношение тест/контроль для всех тестируемых групп. Вычисляли средний вес тела животных на промежуточный день и день окончательной оценки. Отношение тест/контроль вычисляли для всех тестируемых групп с выживаемостью на 5 день >65%. Величина отношения тест/контроль <86% определяет токсичность. При оценке токсичности можно также использовать разность изменения избыточного веса тела (тест минус контроль).

Критерий активности.

Начальное отношение тест/контроль большее чем или равное 140%, считается необходимым для демонстрации умеренной активности. Воспроизводимое отношение тест/ контроль большее чем или равное 150%, считается соответствующим высокой активности.

Список последовательностей <110> ΒΙΟ6ΕΝ, -КС.

<120> ГИБРИДНЫЕ БЕЛКИ НА ОСНОВЕ БЕТА-ИНТЕРФЕРОНА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ <130> 00689-513-112/2403-124369/233 <140> 200100447 <141> 1999-10-15 <150> РСТ/и599/2420С <151> 1999-10-15 <150> 60/120,237 <151> 1999-02-16 <150> 60/104,491 <151> 1998-10-16 <160> 61 <170> РасепсТп Уег. 2.0 <210> 1 <211> 1190 <212> ДНК <213> мышь

Азр

СНу Зег 355

РНе

РНе Ьеи Туг Бег 360

Ьуз

Ьеи ТНг

Уа1 Азр Ьуз 365

Бег

Агд

Тгр

СНп

С1п

СПу

Азп

νβΐ

РНе

Бег

Суз

Бег

Уа1

МеС

Ηίδ

С1и

А1а

Ьеи

370

375

380

Н1з

Азп

Ηίδ

Туг

ТНг

С1п

Ьуз

Бег

Ьеи

Бег

Ьеи

Бег

Рго

С1у

Ьуз

385

390

395

<400: сссдддддсс аасССдсССд ссдаасддда аССаадсадс садаасаСсС дССдадаасс дааааасСдд адасассасд ассасадСса сСссдааас аСсаСсаСса даСсссСаса ддсссдааса СдсадсадСС ССдсСаСССС СссьддсСаа адааадаада ддаддасссс дадсддааас аадаадсадс сСдссСсаад ссадааддад садасаадаС сдСсСассаС ссьсассадд дсасСассСд сссааддаас

Сссддадасд аасссссадс дасаддаСда дасдссдсас СсаСсСадса садаСааасс ддааааесса ааддссаадд ссссаессса аСдаСдасаа дссадаадсс асСССдасаС сдассассса сСддсСддаа аСсСдаадас сдадсадбсс адсасадСса ССаасадасс даСдадсСас сссдсддсаа сссСдаддад сдадасдссс СдадасСаСС адСссСддаа дсассСдааа ссдСдсссдд Сасаддссас

120

180

240

300

360

420

480

540

549 <210:

<211:

<212:

<213:

183 белок мышь <400> 1

аСдассСаса	асССдсССдд	аССссСасаа	адаадсадса	аССССсадСд	СсадаадсСс	60
сСдСддсааС	СдааСдддад	дсССдааСас	СдссСсаадд	асаддаСдаа	ссссдаеасс	120
ссСдаддада	ссаадсадсС	дсадсадССс	садааддадд	асдссдсаСС	дассаСсСаС	180
дадаСдсСсс	адаасаСсСС	сдесассссс	адасаадаСС	сасссадсас	СддсСддааС	240
дадасСаССд	ССдадаассС	ссСддсСааС	дСсСассаСс	адаСааасса	СсСдаадаса	300
дСссСддаад	аааааседда	дааадаадас	сссассаддд	даааасссас	дадсадСссд	360
сассидаааа	даСаССаСдд	даддаССсСд	саССассСда	аддссаадда	дСасадСсас	420
СдСдосСдда	ссаСадСсад	адСддаааСс	ссааддаасС	СССасССсас	СаасадасСС	480
асаддССасс	Сссдааасда	сдаСдаСдас	ааддесдаса	ааасСсасас	аСдсссассд	540
Сдсссадсас	сСдаасСссС	ддддддассд	СсадСсССсс	Ссссессссс	аааасссаад	600
дасасссСса	СдаСсСсссд	дассссСдад	дСсасаСдсд	СддСддСдда	одсдадссас	660
даадассссд	аддсеаадсс	саасСддСас	дсддасддсд	СддаддСдса	СааСдссаад	720
асааадссдс	дддаддадса	дСасаасадс	асдСассдСд	СддСсадсд!	ссСсассдСс	780
сСдсассадд	ассддссдаа	Сддсааддад	СасаадСдса	аддСсСссаа	сааадсссСс	840
ссадссссса	Ссдадаааас	сасссссааа	дссааадддс	адссссдада	ассасаддСд	900
Сасассссдс	ссссассссд	ддаСдадссд	ассаадаасс	аддСсадссС	дассСдссСд	960
дСсаааддсС	СссаСсссад	сдасаСсдсс	дсддадсддд	ададсааСдд	дсадссддад	1020
аасаасСаса	адассасдсс	СсссдСдССд	дассссдасд	дссссссссс	ссссСасадс	1080
аадсСсассд	Сддасаадад	саддеддсад	саддддаасд	СсССсСсаСд	сСссдСдаСд	1140
сасдаддсСс	Сдсасаасса	сСасасдсад	аададссСсС	сссСдСсСсс	едддааа	1197

СНу

С1у

ΗΪ5

Н1з

Ηίδ

Н1;

ΗΪ:

Зег

Бе:

С1у

Азр

МеС

3<

Туг

Ьеи

С1у

РНе

Агд

5»

Зег

РНе

С1п

Суз

С1п

Ьуз

Ьеи

Ье(

Тгр енп

Ьеи

Азп

С1у

Агд

011

Туг

Су;

Ьеи

Ьуз

Азр

Агд

Азп

РНе

Азр

Не

Рго

С1и

Не

Ьуз

Ьв1

РНе

С1и

Азр

А1а

АНа

ТНг

Не

Туг

С1и

Мес

Ьеи

С1п

Азп

Не

РЬе

А1а

111

РНе

Агд

С11

Азр

Зе;

Зег

ТН:

СНу

Тгр

Аз)

011

ТНг

Не

100

Уа1

Ьеи

105

А1;

Уа1

Ту:

ΗΪ3

110

С1) <210 2 <211> 399 <212> белок <213> мышь <400> 2

Мес Зег Туг Азп Ьеи Ьеи С1у РЬе Ьеи С1п Агд Зег Зег Азп РНе С1г.

10 15

Ньз

Ьеи

115

Ьуз

ТНг

Уа1

Ьеи

С1и

120

С11

Ьу;

Ьеи

С1и

Ьуз

140

Ьуз

125

С1и

Азр

РНе

Суз Схп Ьуз Ьеи Ьеи Тгр С1п Ьеи Азп С1у Агд Ьеи С1и Туг Суз Ьеи

20

. . 25

30

Ьуз

Азр

Агд

МеС

Аэп

РНе

Азр

Не

Рго

С1и

Не

Ьуз

С1п

Ьеи

С1л

35

40

45

С1п

РНе

С1п

Ьуз

С1и

Азр

А1а

Ьеи

ТНг

Не

Туг

С1и

Мес

Ьеи

С1п

50

55

60

Азп

Не

РНе

А1а

Не

РНе

Агд

С1п

Азр

Бег

ТНг

61у

Тгр

Азп

65

70

75

80

С1и

ТНг

Не

УаЬ

С1и

Азп

Ьеи

А1а

Азп

Уа1

Туг

ΗΪ5

С1п

Не

Азп

85

90

95

Н13

Ьеи

Ьуз

ТНг

\7а1

Ьеи

С1и

Ьуз

Ьеи

С1и

Ьуз

С1и

Азр

РНе

ТНг

100

105

НО

Агд

С1у

Ьуз

Ьеи

Мес

Бег

Ьеи

Н15

Ьеи

Ьуз

Агд

Туг

СНу

Агд

115

120

125

Не

Ьеи

ΗΪ5

Туг

Ьеи

Ьуз

А1а

Ьуз

С1и

Туг

Бег

ΗΪ3

Суз

А1а

Тгр

ТНг

130

135

140

Не

νβΐ

Агд

Уа1

С1и

Не

Ьеи

Агд

Азп

РНе

Туг

РНе

Не

Азп

Агд

Ьеи

145

150

155

160

ТНг

<Э1у

Туг

Ьеи

Агд

Азп

Азр

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

ТНг

Ηί з

165

170

175

ТНг

Суз

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

С1и

Ьеи

СНу

С1у

Рго

Бег

νβΐ

180

185

190

РНе

Ьеи

РНе

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТНг

Ьеи

Мес

Не

Зег

Агд

ТНг

195

200

205

Рго

СНи

νβΐ

ТНг

Суз

Уа1

Азр

Уа1

Бег

ΗΪ3

С1и

Азр

Рго

С1и

210

215

220

Уа1

Ьуз

РНе

Азп

Тгр

Туг

УаН

Азр

С1у

νβΐ

С1и

Уа1

ΗΪ3

Азп

АНа

Ьуз

225

230

235

240

ТНг

Ьуз

Рго

Агд

С1и

С1п

Туг

Азп

Бег

ТНг

Туг

Агд

УаН

Уа1

Бег

245

250

255

Уа1

Ьеи

ТНг

УаН

Ьеи

НИз

С1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

СНу

Ьуз

С1и

Туг

Ьуз

260

265

270

Суз

Ьуз

Уа1

Бег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

АНа

Рго

11е

С1и

Ьуз

ТНг

Не

275

280

285

Бег

Ьуз

АНа

Ьуз

С1у

С1п

Рго

Агд

С1и

Рго

С1п

Уа1

Туг

ТНг

Ьеи

Рго

290

295

300

Рго

Бег

Агд

Азр

С1и

Ьеи

ТНг

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Бег

Ьеи

ТНг

Суз

Ьеи

305

310

315

320

Уа1

Ьуз

С1у

РНе

Туг

Рго

Бег

Азр

Не

АНа

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Бег

Азп

325

330

335

СНу

С1п

Рго

С1и

Азп

Туг

Ьуз

ТНг

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Бег

340

345

350

С1у

ТНг

С1у

Ьеи

Ηίδ

Ьеи

Агд

Ту1

Ту;

Ьу;

МеС

Зег

135

Агд

130

А1а

АНа

ТНг

СНу

АНа

ТНг

СНу

С1у

А1а

С1у

СНу

Суз

ТНг

1

5

10

15

Тпг

СНу

АНа

ТНг

АНа

Суз

ТНг

СНу

Суз

ТНг

Суз

АНа

А1а

С1у

20

25

30

СНу

А1а

Суз

А1а

СНу

С1у

АНа

ТНг

СНу

АНа

А1а

Суз

ТНг

СНу

адсЕЕдсЕад сддссдсддс .сЕсасЕддсЕ

Еса

С1у Ьу;

<210>

<211>

<212>

<213>

ДНК зари <400>

ЕасасдЕсда сдсСдссасс

-ддаддЕаас аЕдЕаадЕсЕ :21 О>

:2Н>

:212>

:213>

1257 ДНК <400: аЕдссЕддда дс11с1саад ЕдЕсадаадс аасЕЕЕдаса ЕЕдассаЕсЕ асЕддсЕдда саЕсЕдаада аЕдадсадЕс дадЕасадЕс аЕЕаасадас ссадсассЕд асссЕсаЕда дасссЕдадд аадссдсддд сассаддасЕ дсссссаЕсд асссЕдсссс аааддсЕЕсЕ аасЕасаада сЕсассдЕдд даддсЕсЕдс адаЕддЕсдЕ ссаидадсЕа ЕссгдЕддса ЕсссЕчадда аЕдадаЕдсЕ аЕдадасЕаЕ садЕссЕдда ЕдсассЕдаа асЕдЕдссЕд ЕЕасаЕдЕЕа аасЕссЕддд ЕсЕсссддас ЕсаадЕЕсаа аддадсадса ддсЕдааЕдд адаааассаЕ саЕсссддда аЕсссадсда ссасдссЕсс асаададсад даЕссЕЕдда саасЕЕдсЕС аЕЕдааЕддд даЕЕаадсад ссадаасаЕс ЕдЕЕдадаас адааааасЕд аадаЕаЕЕаЕ дассаЕадЕс ссЕссдааас дддассдЕса сссЕдаддЕс сЕддЕасдЕд саасадсасд сааддадЕас сЕссааадсс ЕдадсЕдасс саЕсдссдЕд сдЕдЕЕддас дЕддсадсад сасдсадаад дссЕсаааЕа ддаЕЕссЕас аддсЕЕдааЕ сЕдсадсадЕ ЕЕЕдсЕаЕЕЕ СЕссЕддсЕа дадааадаад дддаддаЕЕс ададЕддааа дЕсдасаааа дЕсЕЕссЕсЕ асаЕдсдЕдд дасддсдЕдд ЕассдЕдЕдд аадЕдсаадд ааадддсадс аадаассадд дадЕдддада ЕссдасддсЕ дддаасдЕсЕ адссЕсЕссс

ЕасЕЕЕддаЕ ааадаадсад асЕдссЕсаа Ессадаадда Есадасаада ЭЕдЕсЕаЕса аЕЕЕсассад ЕдсаЕЕассЕ ЕссЕааддаа сЕсасасаЕд Ессссссааа ЕддЕддасдЕ аддЕдсаЕаа ЕсадсдЕссЕ ЕсЕссаасаа сссдадаасс ЕсадссЕдас дсааЕдддса ССЕЕСЕЕССЕ ЕсЕсаЕдсЕс ЕдЕсЕсссдд ддасаддаЕд ддасдссдса ЕЕсаЕсЕадс дддаааасЕс дааддссаад СЕЕЕЕасЕЕС сссассдЕдо асссааддас дадссасдаа Едссаадаса асаддЕдЕас сЕдссЕддЕс дссддадаас сЕасадсаад сдЕдаЕдсаЕ дааагда

120

180

240

ЗОС

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1257 <400 43 аЕдссЕддда дсЕЕсЕсаад ЕдЕсадаадс аасЕЕЕдаса ЕЕдассаЕсЕ асЕддсЕдда саЕсЕдаада аЕдадсадЕс дадЕасадЕс аЕЕаасадас асаЕдсссас ссаааассса дасдЕдадсс дЕссЕсассд аасааасссс даассасадд сЕдассЕдсс дддсадссдд

ЕдсЕсссЕда сссдддаааЕ адаЕддЕсдЕ ссаЕдадсЕа ЕссЕдЕддса ЕсссЕдадда аЕдадаЕдсЕ аЕдадасЕаЕ садЕссЕдда ЕдсассЕдаа асЕдЕдссЕд ЕЕасаЕдЕЕа сдЕдсссадс асдасасссЕ асдаадассс адасааадсс ЕссЕдсасса Есссадсссс ЕсЕасасссЕ ЕсдЕсааадд асаасаасЕа дсаадсЕсас ЕдсаЕдаддс да даЕссЕЕдда саасЕЕдсЕЕ аЕЕдааЕддд даЕЕаадсад ссадаасаЕс ЕдЕЕдадаас адааааасЕд аадаЕаЕЕаЕ дассаЕадЕс ссЕссдааас ассЕдаасЕс саЕдаЕсЕсс ЕдаддЕсаад дсдддаддад ддасЕддсЕд саЕсдадааа дсссссаЕсс сЕЕсЕаЕссс саадассасд сдЕддасаад ЕсЕдсасаас дссЕсаааЕа ддаЕЕссЕас аддсЕЕдааЕ сЕдсадсадЕ ЕЕЕдсЕаЕЕЕ сЕссЕддсЕа дадааадаад дддаддаЕЕс ададЕддааа ддсддЕддЕд сЕддддддас сддассссЕд ЕЕсаасЕддЕ садЕасааса ааЕддсаадд ассаЕсЕсса сдддаЕдадс адсдасаЕсд ссЕсссдЕдЕ адсаддЕддс сасЕасасдс

ЕасЕЕЕддаЕ ааадаадсад асЕдссЕсаа Ессадаадда Есадасаада аЕдЕсЕаЕса аЕЕЕсассад ЕдсаЕЕассЕ ЕссЕааддаа дсадсдЕсда сдЕсадЕсЕЕ аддЕсасаЕд асдЕддасдд дсасдЕассд адЕасаадЕд аадссааадд Едассаадаа ссдЕддадЕд ЕддасЕссда адсаддддаа адаададссЕ сааЕЕЕЕсад ддасаддаЕд ддасдссдса ЕЕсаЕсЕадс ЕсадаЕааас дддаааасЕс дааддссаад СЕЕЕЕасЕЕС саааасЕсас ссЕсЕЕсссс сдЕддЕддЕд сдЕддаддЕд ЕдЕддЕсадс сааддЕсЕсс дсадссссда ссаддЕсадс ддададсааЕ сддсЕссЕЕс сдЕсЕЕсЕса СЕСССЕдЕСЕ

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1272 <210> <211> <212>

<213>

418 белок

Ното зарЕепз :210:

:211:

:2 12:

:213:

<400:

МеЕ 1 :400>

Р:

МеЕ :о С1у

Ъу:

МеЕ

Уа1

II·

С1у

А1<

Зег

Азп

11е

Тгр

11<

МеС

РЬе

А1а

А1.

3· а:

МеЕ

Зе:

Туз

Ье:

Ьеи

С1у

РН.

Зег

Зе:

Азп

РЬе

Су;

С1п

Ьу;

Ье:

Тгр ΰΐη

С1у

Агд

Ту:

Суз

Ьу;

Азр

Агд

МеЕ

Азп

РЬе

Азр

Не

Рго

С1и

II·

Ьу;

С-1п

РН·

Ьу;

<311

Азр

А1.

А1а ео

Азр

423 белок

Ното зархепз )> 44

Рго (

С1у

Ьу;

МеЕ

Уа1

II·

С1у

А1а

3·

Азп

и.

Тгр

Мег

РНе

А1а

А1.

Зег

А1,

МеЕ

Зег

Туг

Азп

С1у

РЬе

Агд

Зег

Зе:

РЬе

С1п

Ьуз

Ьеи

Тгр

С1у

Агд

Туз

Суз

Ьуз Азр

МеЕ

А31

РЬе

Азр

Не

II·

РЬе

Ьу;

Азр

А1.

А1а

ТЬ:

II.

Ту:

С1и

МеЕ

РЬе

А1а

II·

РЬе

Агд

5·

Зег100

ТЬ.

С1у

Тгр

Азп

С1и

105

ТЬ:

II·

Уа1

РЬе

С1п

ТНг

Не

Ту;

МеЕ

РНе

А1а

II·

11е

Агд

Н13

Ьеи

Ьуз

Агд

Туг

С1у

Агд

Не

Ьеи

Η13

Туг

Ьеи

Ьуз

А1а

Ьуз

145

150

155

160

С1и

Туг

Зег

ΗΪ3

Суз

А1а

Тгр

ТЬг

Не

Уа1

Агд

Уа1

С1и

Не

Ьеи

Агд

165

170

175

Азы

РЬе

Туг

РЬе

Не

Азл

Агд

Ьеи

ТЬг

Суз

Туг

Ьеи

Агд

Азп

Уа1

Азр

180

185

190

Ьуз

ТЬг

ΗΪ5

ТЬг

Суз

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

С1и

Ьеи

С1у

Азр

Рго

С1и

Уа1

Ьуз

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

С1у

Уа1

С1и

Уа1

Н15

245

250

255

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

С1и

С1п

Туг

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

260

265

270

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

ΗΪ3

С1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз

Ьуз	ТЬг	Не	Зег	Ьуз	А1а	Ьуз	С1у	61п	Рго	Агд
305					310					315
ТЬг	Ьеи	Рго	Рго	Зег	Агд	Азр	(Ни	Ьеи	ТЬг	Ьуз
				325					330
ТЬг	Суз	Ьеи	Уа1	Ьуз	С1у	РЬе	Туг	Рго	Зег	Азр
			340					345
С1и	Зег	Азп	С1у	С1п	Рго	С1и	Азп	Азп	Туг	Ьуз

А1<

Уа1

21:

Не ’Ь:

Уа1

Ту:

Аз:

Ьуз

Ηί:

115

120

125

Ьуз

Ьеи

С1и

Ьуз

С1и

Азр

РЬе

ТЬг

Агд

С1у

Ьуз

Ьеи

МеЕ

Зег

Ьеи

130

135

140

ΗΪ3

Ьеи

Ьуз

Агд

Туг

С1у

Агд

Не

Ьеи

ΗΪ8

Туг

Ьеи

Ьуз

А1а

Ьуз

145

150

155

160

С1и

Туг

Зег

ΗΪ3

Суз

А1а

Тгр

ТЬг

Не

Уа1

Агд

Уа1

С1и

Не

Ьеи

Агд

165

170

175

Азп

РЬе

Туг

РЬе

Пе

Азп

Агд

Ьеи

ТЬг

Суз

Туг

Ьеи

Агд

Азп

О1у

С1у

Рго

А1а

Рго

Не

С1и

Ьуз

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

С1у

<31п

Рго

Агд

305

310

315

320

С-1и

Рго

С1п

Уа 1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Зег

Агд

Азр

Б1и

Ьеи

ТЬг

Ьуз

325

330

335

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Б1у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

340

345

350

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

Азп

С1у

61п

Рго

С1и

Азп

Туг

Ьуз

<210> 45 <211> 166 <212> белок <213> человек <210>

<211>

<212>

<213>

166 белок человек <400> 45

Мел 1

АЬа

Туг

АЬа

АЬа 5

Ьеи С1у АЬа Ьеи

СЬп 10

А1а Зег

Зег

Азп

Рке 15

СЬп

Суз

СЬп

Ьуз

Ьеи

Тгр

СЬп

Ьеи

Азп

СЬу

Агд

Ьеи

СЬи

Туг

Суз

Ьеи

20

25

30

Ьуз

Азр

Агд

Мео

АЗП

РЬе

Азр

Не

Рго

СХи

СЬи

Не

Ьуз

СЬп

Ьеи

СЬп

35

40

45

СЬп

РЬе

СЬп

Ьуз

СЬи

Азр

АЬа

А1а

Ьеи

ТНг

ЬЬе

Туг

СЬи

Неб

Ьеи

С-1п

50

55

60

Азп

11е

РЬе

А1а

Не

РЬе

Агд

СХп

Азр

Зег

Ткг

СЬу

Тгр

Азп

65

70

75

80

СЬи

ТГг

Не

УаЬ

СЬи

Азп

Ьеи

АЬа

Азг.

УаЬ

Туг

Н15

СЬп

11е

Азп

85

90

95

Н13

Ьеи

Ьуз

ТНг

УаЬ

Ьеи

СЬи

Ьуз

Ьеи

СЬи

Ьуз

СЬи

Азр

РЬе

Ткг

100 105 110 <400>

Агд СЬу АЬа Ьеи МеЛ Зег Зег Ьеи Нхз Ьеи Ьуз Агд Туг Туг СЬу Агд 115 120 125

Не

Ьеи

НЬ$

Туг

Ьеи

Ьуз

АЬа

Ьуз

СЬи Туг

Зег

ΗΪ5

Суз

АЬа Тгр

130

135

140

11е

УаЬ

Агд

УаЬ

СЬи

Пе

Ьеи

Агд

Азп Рке

Туг

Агд

Не

Азп Агд

145

150

155

Ткг

С1у

Туг

Ьеи

Агд

Азп

165 <210> 46 <211> 166 <212> белок <213> человек

Агд

СЬу

АЬа

Ьеи

МеЛ

Зег

Ьеи

НЬз

Ьеи

Ьуз

Агд

Туг

СЬу

115

120

125

Не

Ьеи

НЬз

Туг

Ьеи

Ьуз

АЬа

Ьуз

С1и

Туг

Зег

НЬз

Суз

АЬа

Тгр

130

135

140

11е

УаЬ

Агд

УаЬ

СЬи

Не

Ьеи

Агд

Азп

Рке

Туг

Агд

Не

Азп

Агд

145

150

155

Ткг

СЬу

Туг

Ьеи

Агд

Азп

165

<400> 46

Мел

Зег

Туг

Азп

Ьеи

СЬу

Рке

Ьеи

СЬп

Агд

Зег

Азп

АЬа

1

5

10

15

Суз

А1а

АЬа

Ьеи

АЬа

Ьеи

Азп

С1у

Агд

Ьеи

СЬи

Туг

Суз

Ьеи

20

25

30

Ьуз

Азр

Агд

МеЛ

Азп

Рке

Азр

Не

Рго

СЬи

Не

Ьуз

СЬп

Ьеи

СЬп

35

40

45

С1п

Рке

СЬп

Ьуз

СЬи

Азр

АЬа

А1а

Ьеи

Ткг

Не

Туг

СЬи

Меб

Ьеи

СЬп

50

55

60

Азп

Не

Рке

А1а

Не

РЬе

Агд

СЬп

Азр

Зег

Ткг

СЬу

Тгр

Азп

65

70

75

80

СЬи

Ткг

Пе

УаЬ

СЬи

Азп

Ьеи

АЬа

Азп

УаЬ

Туг

НЬЗ

СЬп

Не

Азп

85

90

95

Н15

Ьеи

Ьуз

Ткг

УаЬ

Ьеи

СЬи

Ьуз

Ьеи

СЬи

Ьуз

СЬи

Азр

Рке

Ткг

100 105 110

Агд С1у АЬа Ьеи МеЛ Зег Зег Ьеи НЬз Ьеи Ьуз Агд Туг Туг СЬу Агд

115 120 125

Не

Ьеи

НЬз

Туг

Ьеи

Ьуз

АЬа

Ьуз СЬи

Туг

Зег

НЬз

Суз

АЬа

Тгр

Ткг

130

135

140

Не

УаЬ

Агд

УаЬ

СЬи

Не

Ьеи

Агд Азп

Рке

Туг

Агд ·

Не

Азп

Агд

Ьеи

145

150

155

160

Ткг

СЬу

Туг

Ьеи

Агд

Азп

165 <210> 47 <211> 166 <212> белок

Агд С1у

АЬа Ьеи 115

МеЛ Зег

Зег

Ьеи Нхз Ьеи Ьуз Агд Туг

Туг

СЬу

120

125

Не

Ьеи

Н15

Туг

Ьеи

Ьуз

АЬа

Ьуз

СЬи

Туг

Зег

НЬз

Суз

АЬа

Тгр

130

135

140

Не

УаЬ

Агд

УаЬ

СЬи

Не

Ьеи

Агд

Азп

Рке

Туг

Агд

Не

Азп

Агд

145

150

155

Тпг

СЬу

Туг

Ьеи

Агд

Азп

165

<213> человек <400 47

МеЛ

Зег

Туг

Азп

Ьеи

СЬу

Рке

Ьеи

СЬп

Агд

Зег

Азп

РЬе

СЬп

1

5

10

15

Суз

СЬп

Ьуз

Ьеи

Тгр

СЬп

Ьеи

Азп

СЬу

Агд

АЬа

Суз

АЬа

20

25

30

А1а

Азр

Агд

Мел

Азп

Рке

Азр

Не

Рго

СЬи

Не

Ьуз

СЬп

Ьеи

СЬп

35

40

45

СЬп

Рке

СЬп

Ьуз

СЬи

Азр

АЬа

А1а

Ьеи

Ткг

Не

Туг

СЬи

Мел

Ьеи

СЬп

50

55

60

Азп

Не

Рке

АЬа

Не

Рке

Агд

СЬп

Азр

Зег

Ткг

СЬу

Тгр

Азп

65

70

75

80

СЬи

Ткг

Не

УаЬ

СЬи

Азп

Ьеи

АЬа

Азп

УаЬ

Туг

НЬз

СЬп

Не

Азп

85

90

95

НЬз

Ьеи

Ьуз

Ткг

УаЬ

Ьеи

СЬи

Ьуз

Ьеи

СЬи

Ьуз

СЬи

Азр

Рке

Ткг

100

105

но

Агд

СЬу

АЬа

Ьеи

МеЛ

Зег

Ьеи

НЬз

Ьеи

Ьуз

Агд

Туг

СЬу

Агд

115

120

125

Не

Ьеи

НЬз

Туг

Ьеи

Ьуз

АЬа

Ьуз

СЬи

Туг

Зег

НЬз

Суз

АЬа

Тгр

Ткг

130

135

140

Не

УаЬ

Агд

УаЬ

СЬи

Не

Ьеи

Агд

Азп

Рке

Туг

Агд

Не

Азп

Агд

Ьеи

145

150

155

160

Ткг

СЬу

Туг

Ьеи

Агд

Азп

165

<210> 48 <211> 166 <212> белок <213> человек

Ьеи	Н15	Ьеи	Ьуз	Агд	Туг	Туг	СЬу	Агд
120					125
Ьуз	СЬи	Туг	Зег	Н13	Суз	АЬа	Тгр	Ткг
				140
Агд	Азп	Рке	Туг	Агд	11е	Азп	Агд	Ьеи

<400> 48

Мел 1

Зег Туг

АЗП

Ьеи 5

Ьеи

СЬу Рке Ьеи

СЬп Агд Зег Зег 10

Азп

Рке 15

СЬп

Суз

СЬп

Ьуз

Ьеи

Тгр

СЬп

Ьеи

Азп

СЬу

Агд

Ьеи

СЬи

Туг

Суз

Ьеи

20

25

30

Ьуз

Азр

Агд

АЬа

РЬе

АЬа

11е

Рго

АЬа

СЬи

11е

Ьуз

СЬп

Ьеи

СЬп

35

40

45

СЬп

Рке

СЬп

Ьуз

СЬи

Азр

АЬа

Ьеи

Ткг

Не

Туг

СЬи

МеЛ

Ьеи

СЬп

50

55

60

Азп

Не

РЬе

АЬа

Не

Рке

Агд

СЬп

Азр

Зег

Ткг

СЬу

Тгр

Азп

65

70

75

80

СЬи

Ткг

ЬЬе

УаЬ

СЬи

Азп

Ьеи

АЬа

Азп

УаЬ

Туг

НЬз

С1п

Не

Азп

85

90

95

НЬз

Ьеи

Ьуз

Ткг

УаЬ

Ьеи

СЬи

Ьуз

Ьеи

СЬи

Ьуз

СЬи

Азр

РЬе

Ткг

100

105

110

Агд

СЬу

А1а

Ьеи

МеЛ

Зег

Ьеи

НЬз

Ьеи

Ьуз

Агд

Туг

СЬу

Агд

115

120

125

Не

Ьеи

ньз

Туг

Ьеи

Ьуз

АЬа

Ьуз

СЬи

Туг

Зег

Н1з

Суз

АЬа

Тгр

Ткг

130

135

140

Пе

УаЬ

Агд

УаЬ

СЬи

Не

Ьеи

Агд

Азп

Рке

Туг

Агд

Не

Азп

Агд

Ьеи

145

150

155

160

Ткг

СЬу

Туг

Ьеи

Агд

Азп

165

Агд

СЬу

АЬа

Ьеи

Мел

Зег

Ьеи

НЬз

Ьеи

Ьуз

Агд

Туг

СЬу

115

120

125

ЬЬе

Ьеи

Нхз

Туг

Ьеи

Ьуз

АЬа

Ьуз

СЬи

Туг

Зег

Ηίδ

Суз

АЬа

Тгр

130

135

140

Пе

УаЬ

Агд

УаЬ

СЬи

1Ье

Ьеи

Агд

Азп

Рке

Туг

Агд

Не

Азп

Агд

145

150

155

Ткг

СЬу

Туг

Ьеи

Агд

Азп

165

Агд

СЬу

А1а

Ьеи

МеС

Зег

Ьеи

НЬз

Ьеи

Ьуз

Агд

Туг

СЬу

115

120

125

Не

Ьеи

Н13

Туг

Ьеи

Ьуз

АЬа

Ьуз

СЬи

Туг

Зег

НЬз

Суз

АЬа

Тгр

130

135

140

11е

УаЬ

Агд

Уа1

СЬи

Не

Ьеи

Агд

Азп

РЬе

Туг

Агд

Не

Азп

Агд

145

150

155

ТЬг

СЬу

Туг

Ьеи

Агд

Азп

165

НЬз

Ьеи

Ьуз

ТЬг

УаЬ

Ьеи

АЬа

А1а

Ьуз

Ьеи

АЬа

А1а

АЬа

Азр

РЬе

ТЬг

100

105

110

Агд

СЬу

АЬа

Ьеи

МеС

Зег

Ьеи

Н13

Ьеи

Ьуз

Агд

Туг

СЬу

Агд

115

120

125

Не

Ьеи

НЬз

Туг

Ьеи

Ьуз

А1а

Ьуз

СЬи

Туг

Зег

НЬз

Суз

А1а

Тгр

ТЬг

130

135

140

Не

УаЬ

Агд

Уа1

С1и

Не

Ьеи

Агд

Азп

РЬе

Туг

Агд

Не

Азп

Агд

Ьеи

АЬа

СЬу

АЬа

МеС

Зег

АЬа

Ьеи

НЬз

Ьеи

Ьуз

Агд

Туг

СЬу

115

120

125

1Ье

Ьеи

НЬз

Туг

Ьеи

Ьуз

АЬа

Ьуз

СЬи

Туг

Зег

НЬз

Суз

А1а

Тгр

130

135

140

Не

УаЬ

Агд

УаЬ

СЬи

ЬЬе

Ьеи

Агд

Азп

РЬе

Туг

Агд

Не

Азп

Агд

145

15 0

155

ТЬг

СЬу

Туг

Ьеи

Агд

Азп

165

Агд СЬу

АЬа Ьеи 115

Мес Зег

Зег

Ьеи НЬз Ьеи Ьуз Агд Туг

Туг

СЬу

120

125

Не

АЬа

Туг

Ьеи

А1а

АЬа

Ьуз

СЬи

Туг

Зег

НЬз

Суз

АЬа

Тгр

ЬЗО

135

140

Не

УаЬ

Агд

УаЬ

СЬи

Не

Ьеи

Агд

Азп

РЬе

Туг

Агд

Не

Азп

Агд

145

150

155

ТЬг

СЬу

Туг

Ьеи

Агд

Азп

165

Туг	Н13	С1п	Не 95	Азп
Ьуз	СЬи	Азр 110	РЬе	ТЬг
Агд	Туг 125	Туг	С1у	Агд
НЬз 140	Суз	АЬа	Тгр	ТЬг
Агд	Не	Азп	Агд	Ьеи

Агд

СЬу

А1а

Ьеи

Мес

Зег

Ьеи

НЬз

Ьеи

Ьуз

Агд

Туг

СЬу

115

120

12 5

Не

Ьеи

НЬз

Туг

Ьеи

Ьуз

А1а

Ьуз

СЬи

Туг

А1а

АЬа

Суз

АЬа

Тгр

130

135

14 0

Не

Уа1

Агд

Уа1

СЬи

Не

Ьеи

Агд

Азп

РЬе

Туг

Агд

ЬЬе

Азп

Агд

145

150

155

ТЬг

СЬу

Туг

Ьеи

Агд

Азп

165

Азп

Не

РЬе

АЬа

ЬЬе

РЬе

Агд

СЬп

Азр

Зег

ТЬг

СЬу

Тгр

65

70

75

СЬи

ТЬг

ЬЬе

УаЬ

СЬи

Азп

Ьеи

А1а

Азп

УаЬ

Туг

НЬз

СЬп

Не

85

90

95

НЬз

Ьеи

Ьуз

ТЬг

УаЬ

Ьеи

СЬи

Ьуз

Ьеи

СЬи

Ьуз

СЬи

Азр

РЬе

ЬОО

105

ььо

Агд

СЬу

АЬа

Ьеи

Мер

Зег

Ьеи

НЬз

Ьеи

Ьуз

Агд

Туг

СЬу

1Ь5

120

125

ЬЬе

Ьеи

НЬз

Туг

Ьеи

Ьуз

АЬа

Ьуз

СЬи

Туг

Зег

НЬз

Суз

АЬа

Тгр

130

135

14 0

ЬЬе

УаЬ

Агд

УаЬ

СЬи

ЬЬе

Ьеи

Агд

Азп

РЬе

Туг

Агд

Не

Азп

Агд

145

150

155

ТЬг

СЬу

Туг

Ьеи

Агд

Азп

165

<21С> 61 <211> 8 <212> (5елок <213> человек <400>61

Азр Туг Ьуз Азр Азр Азр Азр Ьуз ] 5

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 45-60, причем каждый полипептид также содержит шарнирный, СН2- и СН3-домены иммуноглобулина.
2. Полипептид по п.1, в котором иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин человека.
3. Полипептид по п.1, в котором иммуноглобулин представляет собой ЦС.
4. Полипептид по п.3, в котором ЦС представляет собой ДСБ ΐ тс«бсббсс *τατατα тспашс тссвбМАСб атсаюлсаа «лтсмстк

1У5ег61у61уН ΙιΗΙιΗΚΗΙ аНиниЗег ЗегИуАррА врАарЛарЬу аМеаЗегТуг

61 ААСТТбСПб САТТССТАСЛ АЛ6АА6СЛ6С ЛЛТТГГСЛСТ СТСЛ6АМСТ ССТ6Т66САА

21 ►А5п1еи1еиС 1уРЬе1еиб1 пАгд5ег5ег Л5ПРЬе61пС у8б1п1у81е и!_еиТгр61п

121 ТТбААТЕССА 66СТТ6ААТА СТ6ССГСАА6 САСАССАТ б А АСТТТбАСАТ СССТбАббАС

41НеиА5Пб1уА гдЬеиС1иТу гСухЬеиЬу! А$рАг^4е(А 5пРЬеА$р11 еРго61и61и

181 АТТААбСАСС ТССАбСАСТТ ССАбААббАб САССССССАТ ТбАССАТСТА ТСАСАТССТС

61 ► 11 е1у5б! п1_ еи61п61пРЬ е61п1у5б!и ЛарА1аА1а1. еиТЪгПеТу г61уМе11_еи

241 СА САА САТ СТ ТТ6СТАТПТ САСАСААСАТ ТСАТСТДССА СТббСТббАА ТСАСАСТАТТ

81>61яА$п11еР ИеА1а11 еРЬ еАгдС1пАзр 5ег5ег5егТ Кг 61 уТг рАз п61 и ТЬг 11 е

Э01 СТТ6А6ААСС ТССТМПАА ТСТПАТСАТ САСАТАААСС АТСТ6АА6АС АбТССТбСАА

101>-Уа161цА5п1 еи1еиА1аАз г»Уа1ТугН1$ 61 ηΙ I βΑδηΗ 15Ьеи1у$ТЬ гУй!1еи61и

361 САААААСТСС АСАААСААСА ТПСАССАСС 6СААААСТСА ТСАССАСТСТ ССАССТСААА

121 >61 и!.у$1.еи6 1и1.у$61иА$ рРНеТЬгАгд 61у1у$1еиМ еС5ег5ег1.е иЖ51еи1_у5

421 АбАТАТТАТС СбАСбАТТСТ ССАПАССТб ААббССААбб АбТАСАбТСА СТСТСССТСС

141 ►АгдТугТусб 1уАгд!1е1е иЖзТугЬеи ЬузА!аЬузб 1 иТугбегН! $Су$А1 аТгр

481 АССАТАбТСА 6А6Т66АААТ ССТААббААС ТТТТАСТТСА ТТААСАбАСТ ТАСАССТТАС

161 ►ТЬг 11еУаIА г дУа161 и11 еЬеиАгдАзп РЬеТугРНе! 1еА8пАгд1.е иТЪг61уТуг

541 СТССбАААС

181ИеиАгдА5п

Фиг. 1

ФИГ. 2А-1

ФИГ. 2А-2

Фиг. 2А
5. Полипептид по п.4, содержащий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 42 или 44.
6. Полипептид по п.1 в гликозилированной форме.
7. Применение полипептида по п.1 для приготовления лекарственного препарата для лечения воспалительных, аутоиммунных, ангиогенных, опухолевых или вирусных заболеваний.
8. Производное полипептида по п.1, содержащее полиалкилгликолевый полимер.
9. Производное по п.8, в котором полиалкилгликолевый полимер связан по Ν-концу с аминокислотной последовательностью полипептида.
10. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество полипептида по п.1.