DE69933561T2

DE69933561T2 - Rekombinante herstellung von cellulase aus actinomycetes

Info

Publication number: DE69933561T2
Application number: DE69933561T
Authority: DE
Inventors: E. Brian JONES; A. Wilhelmus VAN DER KLEIJ; Piet Van Solingen; Walter Weyler
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1998-06-24
Filing date: 1999-05-28
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2019-05-29
Also published as: WO2000009707A1; DK1088080T3; DE69933561D1; AU752901B2; JP2004500010A; AU4409499A; EP1408108A2; CA2330245C; JP4392778B2; EP1088080A1; EP1088080B1; EP1408108A3; CA2330245A1; EP1408108B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Cellulasen sind Enzyme, welche β-D-glucosidische Bindungen in Cellulosen hydrolysieren. Cellulolytische Enzyme sind traditionell in drei Hauptklassen eingeteilt worden: Endoglucanasen, Exoglucanasen oder Zellobiohydrolasen und β-Glucosidasen (Knowles, J. et al., TIBTECH 5, 255–261 (1987)). Cellulasen werden bekanntermaßen von einer großen Anzahl von Bakterien, Hefen und Pilzen hergestellt.
Hauptrangig unter den Anwendungen, welche für die Verwendung von cellulolytischen Enzymen entwickelt worden sind, sind diejenigen, welche das Abbauen von (Holz)Cellulose-Zellstoff zu Zuckern für (Bio)Ethanol-Herstellung beinhalten, Textilbehandlungen wie "Stonewashing" und "Biopolishing" und Reinigungsmittel-Zusammensetzungen. Somit sind Cellulasen bekanntermaßen auch nützlich in Reinigungsmittel-Zusammensetzungen zur Entfernung von Schmutz, d. h. zur Säuberung. Zum Beispiel veranschaulichen die G.B.-Anmeldungen Nr. 2 075 028, 2 095 275, 2 094 826 eine verbesserte Reinigungsleistung mit Waschmitteln, wenn diese Cellulase beinhalten. Darüber hinaus veranschaulicht die G.B.-Anmeldung Nr. 1 358 599 die Verwendung von Cellulase in Waschmitteln zur Verringerung des Rauhigkeitsgefühls baumwollhaltiger Textilien.
Ein anderes nützliches Merkmal von Cellulasen in der Behandlung von Textilien ist ohre Fähigkeit, gebrauchte Textilien zu rekonditionieren, indem deren Farben kräftiger gemacht werden. Zum Beispiel führt das wiederholte Waschen von baumwollhaltigen Textilien zu einem gräulichen Belag auf dem Kleidungsstück. Dieser kommt angenommenermaßen aufgrund zerstörter und ungeordneter Fibrillen zu Stande, welche manchmal als "Pills" bzw. Noppen bezeichnet werden, was durch mechanische Einwirkung verursacht wird. Dieser gräuliche Belag ist besonders auf gefärbten Textilien bemerkbar. Als eine Folge ist das Vermögen von Cellulase, die in Unordnung geratene Oberseitenschicht der Faser zu entfernen und somit das Gesamtaussehen der Textilie zu verbessern, als nützlich befunden worden.
Weil Reinigungsmittel, die eine Hauptanwendung von Cellulase sind, im Allgemeinen unter alkalischen Bedingungen arbeiten, besteht ein starker Bedarf nach Cellulasen, welche eine hohe Aktivität bei pH 7–10 aufweisen. Gut charakterisierte pilzliche Cellulasen, wie diejenigen aus Humicola insolens und Trichoderma reesei, zeigen eine adäquate Leistung bei neutralem bis niedrig alkalischem pH-Wert. Eine Anzahl von Enzymen, welche Cellulaseaktivität bei hohem alkalischen pH-Wert aufzeigen, sind aus Bacillus und anderen Prokaryoten isoliert worden, siehe z. B. die PCT-Veröffentlichungen Nr. WO 96/34092 und WO 96/34108. Somit sind sowohl pilzliche als auch bakterielle Cellulasen gründlich untersucht worden. Allerdings hat eine dritte Gruppe von Cellulasen, diejenigen, welche aus Actinomycetes isoliert werden, lediglich geringe Aufmerksamkeit erfahren. Wilson et al., Critical Reviews in Beiotechnology, 12: 45–63 (1992), haben Cellulasen untersucht, welche hergestellt werden von Thermomonospora fusca, Thermonomospora curvata und Microbispora bispora, und haben gezeigt, dass viele von diesen Cellulasen breite pH-Profile und eine gute Temperaturstabilität aufzeigen. In ähnlicher Weise haben Nakai et al., Agric. Biol. Chem., 51: 3061–3065 (1987), und Nakai et al., Gene, 65: 229–238 (1988), die alkalitolerante Cellulase casA aus dem Streptomyces-Stamm KSM-9 nachgewiesen. Diese Cellulase besitzt ein alkalisches pH-Optimum und eine ausgezeichnete Temperaturstabilität.
Trotz der Kenntnis auf dem Fachgebiet in Bezug auf viele Cellulasezusammensetzungen mit wünschenswerten Eigenschaften, einschließlich einiger Beispiele aus Actinomycetes, besteht ein fortgesetzter Bedarf nach neuen Cellulasen mit einem variierenden Spektrum an Merkmalen, welche nützlich sind beispielsweise als Textilbehandlungen, Komponenten von Reinigungsmittelzusammensetzungen, Zellstoff- und Papierbehandlungen, Tierfutterzusätze, Verarbeitungshilfen für das Backen und Biomassen-Umwandler. Die Anmelder der vorliegenden Erfindung haben Cellulasen gefunden, welche ein derartige reiche Ausstattung an Merkmalen besitzen und welche nützlich in solchen bekannten Anwendungen von Cellulasen sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem ersten Aspekt sieht die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor vor, umfassend ein DNA-Molekül, welches eine Cellulase codiert, die eine DNA-Sequenz umfasst, wie dargestellt in SEQ ID Nr.: 2 oder eine DNA-Sequenz, welche wenigstens 76 % Sequenzidentität zu der DNA-Sequenz, wie dargestellt in SEQ ID Nr.: 2, aufweist, wobei das DNA-Molekül funktionsfähig an einen Glukoseisomerase-Promotor von Actinoplanes missouriensis verknüpft ist.
In einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung Wirtszellen vor, wie definiert in den Ansprüchen. Falls die Wirtszelle eine Streptomyces spp oder ein Bacillus spp ist, handelt es sich vorzugsweise um Streptomyces lividans, Bacillus lichenifomis oder Bacillus subtilis.
In einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Cellulase vor, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
Wachsenlassen einer transformierten Wirtszelle, wie definiert in den Ansprüchen, unter Bedingungen, die für die Expression der Cellulase codierenden DNA geeignet sind; und
Auffangen der resultierenden wässrigen Mischung, welche die Cellulase umfasst.
In diesem Verfahren wird vorzugsweise die Cellulase aus der wässrigen Mischung weiter aufgereinigt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz einer ungefähr 36 kD großen Cellulase gemäß der Erfindung, wobei die Leader-Sequenz im Fettdruck gezeigt wird. Die codierten Buchstaben werden gemäß der IUPAC-IUB-Biochemie-Nomenklatur-Kommission aufgeführt (wie beschrieben in dem GenBank PatentIn-Benutzerhandbuch, PC-DOS/MS-DOS-Version, November 1990) (SEQ ID Nr.: 1).
Die 2 zeigt die DNA-Sequenz, codierend eine ungefähr 36 kD große Cellulase gemäß der Erfindung (SEQ ID Nr.: 2).
Die 3 zeigt das pH/Aktivitäts-Profil einer ungefähr 36 kD großen Cellulase gemäß der Erfindung bei 40°C und 60°C.
Die 4 zeigt den pHPLT-Vektor.
Die 5 zeigt den pHP11AG8-Vektor.
Die 6 zeigt die 16s-RNA-Sequenz des Actinomycete, aus welchem die Cellulase der Erfindung erhalten werden kann (SEQ ID Nr.: 3).
Die 7 zeigt die Konstruktion von pIJ488-101.
Die 8 zeigt die Konstruktion von pWGxGIT.
Die 9 zeigt die Konstruktion von pTZ18Rsti.
Die 10 zeigt die Konstruktion von pWGxsGIT.
Die 11 zeigt die Konstruktion von pIJ488sti.
Die 12 zeigt die Konstruktion von pSEGCi.
Die 13 zeigt die Konstruktion von pSEGCT.
Die 14 zeigt die Konstruktion von pSEGCT11AG8.
Die 15 gibt die DNA-Sequenz der vollständigen Expressionskassette an, welche aus dem GI-Promotor, der celA-Signalsequenz, Cellulase 11AG8 und dem GI-Terminator besteht (SEQ ID Nr.: 4). Ebenfalls darin angegeben wird die codierende Aminosäuresequenz von 11AG8 (SEQ ID Nr.: 5).
Die 16 zeigt die Konstruktion von pSEACT11AG8.
Die 17 zeigt die Konstruktion von pSACT11AG8.
Die 18 vergleicht das Leistungsverhalten der Volllängen- und der trunkierten bzw. verkürzten Cellulase dieser Erfindung. 18a zeigt an, dass in Wisk^® die Entpillungs-Leistung der Volllängenform äquivalent zu derjenigen der trunkierten Cellulase ist. Die 18b zeigt, dass bei der trunkierten Cellulase die Peak-Belastungswerte geringfügig niedriger sind und der TSL bzw. Zugfestigkeitsverlust größer ist. 18c zeigt an, dass, bei einer gleichen Entpillungsrate, die trunkierte Cellulase einen größeren TSL aufweist als die Volllängen-Cellulase.
Die 19 vergleicht die Leistung der Volllängenform und der trunkierten Cellulase dieser Erfindung. 19a zeigt an, dass in Gessy Lever #1 die Entpillungsleistung der trunkierten Cellulase besser war als jene der Volllängen-Cellulase. 19b zeigt an, dass die Peak-Belastungswerte für das trunkierte Enzym größer waren als für die Volllängen-Cellulase.
Die 20 vergleicht die Leistung der Volllängenform und der trunkierten Cellulase dieser Erfindung in Gegenwart eines Bleichmittels. 20a zeigt an, dass in Gegenwart von Perboratmonohydrat und eines Bleichaktivators das Entpillungsvermögen des trunkierten Enzyms am wenigsten absank. 20b zeigt an, dass die Peak-Belastungswerte für die trunkierte Cellulase in Gegenwart eines Bleichmittels anstiegen.
Die 21 vergleicht die Leistung der Volllängenform und der trunkierten Cellulase dieser Erfindung in Gegenwart von Protease. 21a zeigt an, dass Protease keinen Effekt auf die Entpillungsleistung des trunkierten Enzyms aufwies. 21b zeigt, dass Protease keinen Effekt auf die Peak-Belastungswerte für die trunkierte Cellulase hatte.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Definitionen
Es sei denn, es wird hierin anderweitig definiert, besitzen alle technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke, welche hierin verwendet werden, die gleiche Bedeutung, wie es üblicherweise vom Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, welchem diese Erfindung angehört, verstanden wird. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2. Auflage, John Wiley and Sons, New York (1994), und Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991), liefern dem Fachmann ein allgemeines Wörterbuch für viele der in dieser Erfindung verwendeten Ausdrücke. Obwohl beliebige Verfahren und Materialien, welche ähnlich oder gleichwertig zu den hierin beschriebenen sind, in der Ausübung oder dem Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben. Numerische Bereiche schließlich die Zahlen, welche den Bereich begrenzen, ein. Es sei denn, es wird anderweitig angegeben, werden Nukleinsäuren von links nach rechts in 5'- nach 3'-Orientierung angegeben; bzw. Aminosäuresequenzen werden von links nach rechts in der Richtung von Amino- zu Carboxy-Orientierung geschrieben. Die hierin vorgesehenen Überschriften sind keine Einschränkungen der verschiedenen Aspekte oder Ausführungsformen der Erfindung, welche zur Bezugnahme in Form der Beschreibung als Ganzheit herangezogen werden soll. Folglich werden die unmittelbar nachfolgend definierten Begriffe vollständiger unter Bezugnahme auf die Beschreibung als Ganzes definiert.
Der Begriff "Aminosäure" schließt die Bezugnahme auf eine Aminosäure ein, welche in ein Protein, Polypeptid oder Peptid (zusammengefasst "Polypeptid") eingebaut ist. Die Aminosäure kann eine natürlich vorkommende Aminosäure sein oder kann, es sei denn, es wird anderweitig eingegrenzt, bekannte Analoge von natürlichen Aminosäuren einschließen, welche in einer ähnlichen Weise wie natürlich vorkommende Aminosäuren funktionieren.
Mit "Derivat" wird beabsichtigt, ein Peptid oder Protein anzugeben, welches aus einem nativen Protein abgeleitet wird durch Addition einer oder mehrere Aminosäuren entweder an einem oder beiden von dem C- und N-terminalen Ende des nativen Proteins, Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren an einer oder einer Anzahl von verschiedenen Stelle(n) in der nativen Aminosäuresequenz, Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren an einem oder beiden Enden des nativen Proteins oder an einer oder mehreren Stellen in der Aminosäuresequenz, oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen in der nativen Aminosäuresequenz. Die Herstellung eines Enzymderivats wird vorzugsweise durch Modifizieren einer DNA-Sequenz, welche das native Protein codiert, Transformation dieser DNA-Sequenz in einen geeigneten Wirt und Expression der modifizierten DNA-Sequenz zur Bildung des abgewandelten Enzyms erreicht. Alternative Methoden zum Herstellen von Derivaten sind im Fachgebiet allgemein bekannt und schließen z. B. proteolytische Spaltung von nativen Proteinen oder ihren Derivaten ein. Die Derivate der Cellulasen dieser Erfindung schließen Peptide ein, welche veränderte Aminosäuresequenzen im Vergleich zu einer Vorläuferenzym-Aminosäuresequenz (z. B. einem Wildtyp- oder Naturzustand-Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung) umfassen, welche eine charakteristische enzymatische Natur des Vorläuferenzyms beibehalten, aber welche in irgendeinem spezifischen Aspekt veränderte Eigenschaften aufweisen. Zum Beispiel kann eine veränderte Cellulase ein erhöhtes pH-Optimum oder eine erhöhte Temperaturbeständigkeit aufweisen, aber wird ihre charakteristische cellulolytische Aktivität beibehalten.
"Konservative Substitutionen" einer bestimmten Aminosäuresequenz bezieht sich auf Aminosäuresubstitutionen von jenen Aminosäuren, welche für die funktionelle Aktivität nicht kritisch sind, oder Substitution von Aminosäuren durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (z. B. sauer, basisch, positiv oder negativ geladen, polar oder nicht-polar etc.), so dass die Substitutionen selbst von kritischen Aminosäuren die Aktivität nicht wesentlich verändern. Tabellen für konservative Substitutionen, welche funktionell ähnliche Aminosäuren angeben, sind im Fachbereich allgemein bekannt.
Der Begriff "identisch" im Zusammenhang mit zwei Polypeptid- oder Nukleinsäuresequenzen bezieht sich auf die Reste in den zwei Sequenzen, welche gleich sind, bei Alignierung hinsichtlich maximaler Übereinstimmung, wie gemessen unter Anwendung eines der folgenden "Sequenzvergleichsalgorithmen". Eine optimale Alignierung von Sequenzen zum Vergleich kann z. B. durch den lokalen Homologie-Algorithmus von Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); durch den Homologie-Alignierungs-Algorithmus von Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970); durch das Ähnlichkeitssuche-Verfahren von Pearson & Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988); durch die computerisierten Implementationen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA in dem Wisconsin Genetics-Software-Paket, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch visuelle Überprüfung durchgeführt werden.
Ein Beispiel für einen Algorithmus, der zum Bestimmen von Sequenzähnlichkeit geeignet ist, ist der BLAST-Algorithmus, der in Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990), beschrieben wird. Software zum Durchführen von BLAST-Analysen ist über das National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) öffentlich erhältlich. Dieser Algorithmus beinhaltet zuerst das Identifizieren von hochbewerteten Sequenzpaaren (HSPs) durch Identifizieren von kurzen Wörtern der Länge W in der Suchsequenz, welche entweder einem positiv bewerteten Schwellenwert T entsprechen oder diesen erfüllen, wenn sie mit einem Wort derselben Länge in einer Datenbanksequenz aligniert werden. Diese anfänglichen Nachbarschafts-Worttreffer fungieren als Ausgangspunkte für das Auffinden von längeren HSPs zu finden, welche diese enthalten. Die Worttreffer werden in beiden Richtungen entlang jeder der zwei verglichenen Sequenzen so weit verlängert, wie die kumulative Alignierungs-Bewertung erhöht werden kann. Die Verlängerung der Worttreffer wird angehalten, wenn: die kumulative Alignierungs-Bewertung um die Größe X von einem maximal erzielten Wert abfällt; die kumulative Bewertung gleich Null oder niedriger wird; oder das Ende von einer der beiden Sequenzen erreicht ist. Die BLAST-Algorithmus-Parameter W, T und X bestimmen die Empfindlichkeit und Geschwindigkeit der Alignierung. Das BLAST-Programm verwendet als Standards eine Wortlänge (W) von 11, die BLOSUM62-Bewertungsmatrix (siehe Henikoff & Henikoff Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)), Alignierungen (B) von 50, eine Erwartung (E) von 10, M'5, N'-4 und einen Vergleich beider Stränge.
Der BLAST-Algorithmus führt dann eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch (siehe z. B. Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873–5787 (1993)). Ein Maß der Ähnlichkeit, welches von dem BLAST-Algorithmus vorgesehen wird, ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), welche eine Anzeige der Wahrscheinlichkeit liefert, mit welcher eine Übereinstimmung zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen zufällig auftreten würde. Zum Beispiel wird eine Nukleinsäure als ähnlich zu einer Cellulase-Nukleinsäure dieser Erfindung betrachtet, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit in einem Vergleich der Test-Nukleinsäure zu einer Cellulase-Nukleinsäure geringer als etwa 0,1, weiter bevorzugt geringer als etwa 0,01 und am stärksten bevorzugt geringer als etwa 0,001 ist. Falls die Test-Nukleinsäure ein Cellulase-Polypeptid codiert, wird sie als ähnlich zu einer spezifizierten Cellulase-Nukleinsäure betrachtet, wenn der Vergleich zu einer kleinsten Summenwahrscheinlichkeit von weniger als etwa 0,5 und weiter bevorzugt weniger als etwa 0,2 führt.
Ein anderer Hinweis, dass zwei Polypeptide im wesentlichen identisch sind, besteht darin, dass das erste Polypeptid immunologisch kreuzreaktiv mit dem zweiten Polypeptid ist. Typischerweise sind Polypeptide, die sich durch konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden, immunologisch kreuzreaktiv. Somit ist zum Beispiel ein Polypeptid im wesentlichen identisch zu einem zweiten Polypeptid, falls die zwei Peptide sich nur durch eine konservative Substitution unterscheiden.
Wie hierin verwendet, werden "Polypeptid", "Peptid" und "Protein" austauschbar verwendet und schließen den Bezug auf ein Polymer von Aminosäureresten ein. Die Ausdrücke beziehen sich auf Aminosäurepolymere, in welchen ein oder mehrere Aminosäurereste ein künstliches chemisches Analog einer entsprechenden natürlich vorkommenden Aminosäure ist/sind, sowie auf natürlich vorkommende Aminosäurepolymere. Die Ausdrücke beziehen sich ebenfalls auf Polymere, welche konservative Aminosäuresubstitutionen enthalten, so dass das Protein funktionell bleibt.
Wie hierin verwendet, schließt "rekombinant" den Bezug auf ein Polypeptid ein, welches unter Verwendung von Wirtszellen hergestellt wird, welche in ihrem nativen Zustand keine endogene Kopie der DNA aufweisen, die in der Lage ist, das Polypeptid zu exprimieren. Die Zellen produzieren das rekombinante Polypeptid, da sie genetisch durch die Einführung der geeigneten isolierten Nukleinsäuresequenz verändert wurden. Der Ausdruck schließt ebenfalls den Bezug auf eine Wirtszelle oder Nukleinsäure oder einen Vektor ein, welche durch die Einführung einer heterologen Nukleinsäure oder die Veränderung einer nativen Nukleinsäure zu einer Form verändert worden ist, welche für die Zelle nicht nativ ist, oder dass die Zelle von einer Zelle abgeleitet wird, die so modifiziert wurde. Somit exprimieren rekombinante Wirtszellen zum Beispiel Gene, welche nicht innerhalb der nativen (nicht-rekombinanten) Form der Zelle gefunden werden, exprimieren Mutanten von Genen, welche innerhalb der nativen Form gefunden werden, oder exprimieren native Gene, welche ansonsten abnormal exprimiert, unter-exprimiert oder überhaupt nicht exprimiert werden.
"Wirtszelle" bezeichnet eine Zeile, welche die Fähigkeit aufweist, als ein Wirt und Expressionsvehikel für einen rekombinanten DNA-Vektor gemäß der Erfindung zu wirken. In einer bevorzugten Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung bedeutet "Wirtszelle" die Zellen von Bacillus. Der Fachmann wird jedoch erkennen, dass jedwede geeignete Wirtszelle, z. B. bakterielle, pilzliche, eukaryotische und Pflanzenzelle, verwendet werden kann.
"DNA-Konstrukt" oder "DNA-Vektor" bedeutet eine Nukleotidsequenz, welche ein oder mehrere DNA-Fragmente umfasst, codierend jede der obenstehend beschriebenen neuen Cellulasen oder Cellulasederivate. Eingeschlossen in "DNA-Vektoren" sind "Expressionsvektoren". Typische Expressionsvektoren enthalten Transkriptions- und Translationsterminatoren, Transkriptions- und Translations-Initiationssequenzen und Promotoren, welche nützlich zur Regulierung der Expression der jeweiligen Nukleinsäure sind. Die Vektoren umfassen gegebenenfalls generische Expressionskassetten, enthaltend mindestens eine unabhängige "Terminatorsequenz, Sequenzen, welche die Replikation der Kassette in Prokaryoten, Eukaryoten oder beiden gestatten (z. B. Shuttle-Vektoren), und Selektionsmarker für sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Systeme. Vektoren sind geeignet für Replikation und Integration in Prokaryoten, Eukaryoten oder beiden. Siehe Giliman und Smith, Gene 8: 81–97 (1979); Roberts et al., Nature 328: 731–734 (1987); Berger und Kimmel, GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, METHODS IN ENZYMOLOGY, BAND 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA ("Berger"); Scheider, B. et al., Protein Expr. Purif 6435: 10 (1995); Sambrook et al. MOLECULAR CLONING – A LABORATORY MANUAL (2. AUFLAGE) BAND 1–3, Cold Springs Harbor Publishing (1989) ("Sambrook"); und CURRENT PROTOKOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols, ein Gemeinsschaftsunternehmen zwischen Greene Publishing Associates, Inc., und John Wiley & Sons, Inc., (1997 Ergänzungsband) ("Ausubel").
Klonierung und Expression von Volllängen-Cellulase
In einer Ausführungsform dieser Erfindung werden die Cellulasen dieser Erfindung aus natürlichen Quellen erhalten, z. B. werden nicht rekombinant hergestellt. Es ist möglich, die Cellulasen durch Screening von Proben aus Soda-Seen zu erhalten, um den geeigneten Cellulase-erzeugenden Organismus zu isolieren. Dieser Organismus kann dann gemäß im Fachgebiet anerkannten Methoden zum Heranziehen von Bakterien, wie Actinomycetes, wachsen gelassen werden.
Anstatt den korrekten Cellulase-erzeugenden Stamm zu isolieren, ist es allerdings effizienter, gentechnische Verfahrensweisen einzusetzen. Somit ist es möglich, eine geeignete Wirtszelle mit der hierin vorgesehenen DNA zu transformieren, und den resultierenden rekombinanten Mikroorganismus unter für Wirtszellwachstum und Cellulaseexpression geeigneten Bedingungen zu kultivieren.
Als ein erster Schritt kann chromosomale DNA aus dem Donor-Actinomycete-Stamm erhalten werden, zum Beispiel durch das Verfahren von Saito und Miura (Saito & Miura, Biochim. Biophys. Acta., 72: 619 (1963)) oder durch ein ähnliches Verfahren. Restriktionsenzymspaltung der so erhaltenen chromosomalen DNA sieht DNA-Fragmente vor, welche das alkalische Cellulase-Gen enthalten. Für diesen Zweck kann jedwedes Restriktionsenzym verwendet werden, vorausgesetzt, es spaltet nicht eine gewünschte Region des Gens, zum Beispiel die codierende Region eines Gens oder eine codierende Region und einen Promotor eines Gens. Als Alternative kann ein Restriktionsenzym verwendet werden, welches das Gen spaltet, wobei allerdings eine verringerte Enzymkonzentration oder Inkubationszeit eingesetzt wird, um nur einen partiellen Verdau zuzulassen. Eine bevorzugte Restriktionsendonuklease ist Sau3A. Aus der resultierenden Verdaumischung können geeignete Fragmente von etwa 4–10 kb isoliert, in einen DNA-Vektor inseriert und angewandt werden, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren.
Gene, welche die Cellulasen der vorliegenden Erfindung codieren, können unter Verwendung von z. B. λ-Phage-(Expressions)-Vektoren und E.coli-Wirtszellen kloniert werden. (Alternativ dazu kann eine PCR-Klonierung unter Verwendung von Consensus-Primern, welche auf konservierten Domänen entworfen werden, eingesetzt werden.) Nach einem ersten Klonierungsschritt in E. coli kann ein Cellulasegen gemäß der vorliegenden Erfindung in einen stärker bevorzugten industriellen Expressionswirt, wie Bacillus- oder Streptomyces-Spezies, überführt werden. Am stärksten wird Streptomyces bevorzugt. Die Hochspiegel-Expression und -Sekretion, welche in diesen Wirtsorganismen erhältlich ist, gestattet eine Akkumulation der Cellulase in dem Fermentationsmedium, aus welchem sie anschließend zurückgewonnen werden kann.
Die Cellulase kann aus dem Fermentationsmedium durch herkömmliche Vorgehensweisen zurückgewonnen werden, einschließlich Abtrennen der Zellen aus dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, oder, falls notwendig, Aufbrechen der Zellen und Entfernen des Überstandes von den zellulären Fragmenten und Trümmern. Nach der Klärung werden typischerweise die proteinartigen Komponenten des Überstandes oder Filtrats mittels eines Salzes, z. B. Ammoniumsulfat, gefällt. Die gefällten Proteine werden dann solubilisiert und durch eine Vielzahl von chromatographischen Vorgehensweisen, z. B. Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder ein anderes ähnliches im Fachgebiet anerkanntes Vorgehen, gereinigt. Für die Herstellung einer Cellulase gemäß der Erfindung, wird es bevorzugt, die Wirtszellen unter alkalischen Bedingungen unter Verwendung von Medien, welche eine Energiequelle auf Cellulose-Basis enthalten, zu kultivieren.
Es wird bevorzugt, dass die Reinigung der Cellulasen dieser Erfindung durch die funktionelle Aktivität überwacht wird. Ein bevorzugter funktioneller Assay überwacht die Kinetik der Hydrolyse von NPC (Nitrophenylcellobiosid) durch Cellulase. Das Vorgehen ist wie folgend:
In doppelt oder dreifach angesetzten Vertiefungen einer 96-Vertiefungs-Mikrotiterplatte werden 20 μl Probe oder Standard zugesetzt. Die Standards können zuvor erhaltene und gutcharakterisierte Cellulaseproben oder kommerziell gelieferte Cellulasen sein. Es werden 100 μl Assaylösung zugegeben. Die Assaylösung besteht in 1 Teil konzentrierter Stammlösung und 5 Teilen Phosphatpuffer. Die konzentrierte Stammlösung besteht aus 25 mg/ml NPC (Sigma N4764) in 100 mM Natriumphosphat, pH 8,0. Der gleiche Phospatpuffer kann verwendet werden, um die Assaylösung zu verdünnen. Sobald das NPC-Substrat zu den Proben oder Standards zugesetzt worden ist, wird die Platte in eine bei 30 °C vorgewärmte Mikrotiter-Plattenlesevorrichtung eingeschoben. Ablesungen bei 1410 nm sollten in 1-minütigen Intervallen während 6 Minuten erfasst werden.
Aus den Standards kann eine Standardkurve erzeugt werden. Die y-Achse der Kurve ist das Vmax und die X-Achse ist die Konzentration der Cellulase in dem Standard. Wenn das Vmax der Proben außerhalb der Standardkurve liegt, welche durch die Standards aufgestellt wurde, sollten die Proben verdünnt und der Assay wiederholt werden.
In einer Ausführungsform dieser Erfindung umfasst die Expressionswirtszelle eine Bacillus spp., weiter bevorzugt Bacillus licheniformis oder Bacillus subtilis. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Wirtsexpressionszellen jedoch einen Streptomyces spp., weiter bevorzugt Streptomyces lividens. Ein bevorzugtes allgemeines Transformations- und Expressionsprotokoll für hinsichtlich Protease deletierte Bacillus-Stämme wird in Ferrari et al., U.S.-Patent Nr. 5 264 366 angegeben. Transformation und Expression in Streptomyces können in Hopwood et al., GENETIC MANIPULATION OF STREPTOMYCES: A LABORATORY MANUAL, Innis (1985), nachgeschlagen werden.
Es ist festgestellt worden, dass eine Transformation der DNA-Sequenzen dieser Erfindung in Bacillus in Hinsicht auf die resultierende Expression ineffektiv war. Bei Streptomyces ist der bevorzugte Promotor der Glucoseisomerase(GI)-Promotor von Actinoplanes missouriensis.
Zusätzlich zu einer Volllängen-Cellulase und der dafür codierenden DNA umfasst diese Erfindung ebenfalls trunkierte Cellulasen und Derivate von Cellulasen und die dafür codierende DNA. Typischerweise umfassen Cellulasen zwei aktive Domänen: eine katalytisch aktive Domäne und eine Cellulosebindungsdomäne. Die trunkierten Cellulasen dieser Erfindung umfassen den katalytisch aktiven Bereich einer Volllängen-Cellulase dieser Erfindung.
In einer Ausführungsform wird die trunkierte Cellulase durch die Spaltung einer Volllängen-Cellulase erzeugt. Die Volllängen-Cellulase kann entweder aus ihrem natürlichen Wirt, z. B. Actinomyctes, oder aus einer rekombinanten Wirtszelle isoliert werden. Ohne dass gewünscht wird, durch Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass während des Fermentationsverfahrens von rekombinanten Wirtszellen eine Protease die Cellulasen dieser Erfindung trunkiert. Es wird insbesondere angenommen, dass eine Endoprotease, welche nach Prolinresten spaltet, die Cellulasen trunkiert. Daher wird es in Betracht gezogen, dass, im Fall von nicht-rekombinanten Cellulasen oder rekombinanten Cellulasen, welche während des Fermentationsverfahrens nicht trunkiert werden, eine solche Protease zu den Volllängen-Cellulasen dieser Erfindung zugesetzt werden kann, um die trunkierten Formen herzustellen.
Nach der Spaltung kann es notwendig sein, die trunkierte Cellulase dieser Erfindung von der nun abgetrennten Cellulasebindungsdomäne zu trennen. Diese Trennung kann auf der Grundlage der Größe, z. B. durch präparative Elektrophorese, Gelfiltration oder Größenausschlusschromatographie und Ultrafiltration erfolgen. Andere mögliche Verfahren werden dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein und können Ionenaustauschchromatographie, Hydrophobe-Wechselwirkungs-Chromatographie und Affinitätschromatographie, Sedimentations-Äquilibrierung etc. einschließen.
Alternativ dazu kann eine trunkierte Cellulase rekombinant hergestellt werden. In diesem Aspekt wird eine DNA-Sequenz hergestellt, welche nur die codierende Region für den katalytisch aktiven Bereich einer Volllängen-Cellulase umfasst. In bevorzugten Ausführungsformen wird die DNA, welche die 230 oder 233 Aminosäuren der katalytisch aktiven Domäne codiert, hergestellt. Die DNA-Sequenz kann entweder durch synthetische Mittel oder durch Restriktionsenzymverdau einer codierenden Volllängensequenz hergestellt werden. Wenn ein Restriktionsenzym verwendet wird, kann es, abhängig von dem Enzym, notwendig sein, jedwede hervorstehenden Einzelstränge von DNA glattendig zu machen. Ein solches Glätten der Enden kann durch Auffüllen des anderen, nicht hervorstehenden Strangs oder durch Beschneiden des hervorstehenden Strangs ausgeführt werden. Techniken für beide dieser Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt. Der Fachmann wird auch wissen, dass ein Stop-Codon hinzugefügt werden sollte, nachdem die gewünschte codierende Region geendet hat. Techniken zum Hinzufügen von Codons an das 3'-Ende einer codierenden Region sind gut bekannt und können beispielsweise in Ausubel oder Sambrook gefunden werden.
Die Synthese von DNA-Sequenzen ist im Fachgebiet gut bekannt und kann zum Beispiel gefunden werden in Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22(20): 1859–1862 (1981), z. B. unter Verwendung eines automatischen Synthesizers, z. B. wie beschrieben in Needham-VanDevanter, et al., Nucl Acids Res. 12: 6159–6168 (1984). DNA-Sequenzen können auch maßgeschneidert angefertigt werden und bestellt werden von einer Vielzahl von kommerziellen Quellen, die dem Fachmann bekannt sind, zum Beispiel Promega (Madison, WI). Eine Reinigung von DNA-Sequenzen, falls nötig, wird typischerweise entweder durch native Acrylamidgelelektrophorese oder durch Anionenaustausch-HPLC, wie beschrieben in Pearson & Regnier, J. Chrom. 255: 137–149 (1983), durchgeführt. Die Sequenz der synthetischen Oligonukleotide kann unter Anwendung des chemischen Abbauverfahrens von Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology 65: 499–560 (1980), bestätigt werden.
In einem alternativen Verfahren kann es bevorzugt werden, die codierende Region des Volllängen-Cellulasegens intakt zu halten, aber ein Stop-Codon am gewünschten Trunkierungspunkt einzuführen. Es gibt viele Wege zum Erzeugen von Veränderungen in einer gegebenen Nukleinsäuresequenz, um z. B. ein Stop-Codon zu inserieren, welches ein Polypeptid trunkieren kann. Derartige gut bekannte Verfahren schließen ortsgerichtete Mutagenese, PCR-Amplifikation unter Verwendung von degenerierten Oligonukleotiden, Exposition von Zellen, enthaltend die Nukleinsäure, an mutagene Mittel oder Strahlung, chemische Synthese eines gewünschten Oligonukleotids (z. B. in Verbindung mit Ligation und/oder Klonierung zur Erzeugung großer Nukleinsäuren) und andere allgemein bekannte Techniken ein, siehe Giliman & Smith, Gene 8: 81–97 (1979); Robert et al., Nature 328: 731–734 (1987); Sambrook; und Ausubel.
Zusätzlich zu trunkierten Cellulasen beinhaltet diese Erfindung andere Derivate von Volllängen- und trunkierten Cellulasen. Solche Derivate umfassen z. B. Aminosäuresubstitutionen, Substitution von nicht-natürlichen Aminosäuren, Substitution oder Addition von D-Aminosäuren und Konjugation an eine andere Einheit. Mit der Ausnahme von Aminosäuresubstitutionen, welche in einer ähnlichen Weise zu jener, die oben für die Insertion eines Stop-Codons beschrieben wurde, bewerkstelligt werden können, sollte die Substitution von nicht-natürlichen Aminosäuren und eine Konjugation an andere Einheiten chemisch durchgeführt werden. Techniken zur chemischen Modifikation von Proteinen sind im Fachgebiet gut bekannt und können beispielsweise gefunden werden in CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES, AND PROTEINS, B. Weinstein (Hrsg.), Marcel Dekker, New York, S. 267 (1983).
Identifikation der Cellulasen dieser Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfasst einen Expressionsvektor und Wirtszellen, umfassend eine DNA gemäß 2 (SEQ ID Nr.: 2), ein Fragment oder ein Derivat davon mit mehr als 76 % Sequenzidentität, vorzugsweise mehr als 80 % Sequenzidentität und am stärksten bevorzugt mehr als 90 % Sequenzidentität dazu, wie es in den Patentansprüchen definiert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Hybridisierung eingesetzt, um zu analysieren, ob ein gegebenes DNA-Fragment oder Gen einer hierin beschriebenen Cellulase-DNA-Sequenz entspricht und somit innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegt. Der Hybridisierungsassay ist im Wesentlichen wie folgend beschaffen: Genomische DNA aus einer jeweiligen Zielquelle wird durch Verdau mit einem passenden Restriktionsenzym, z. B. EcoR I, Hind III, Bam HI, Cla I, Kpn I, Mlu I, Spe I, Bgl II, Nco I, Xba I, Xho I und Xma I (geliefert von New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, und Boehringer Mannheim) gemäß den Anweisungen des Herstellers fragmentiert. Die Proben werden dann durch ein Agarose-Gel (zum Beispiel 0,8 % Agarose) so elektrophoretisiert, dass eine Trennung von DNA-Fragmenten nach der Größe sichtbar gemacht werden kann. Das Gel kann kurz in destilliertem H₂O gespült und anschließend in einer geeigneten Lösung (wie zum Beispiel 0,25 M HCl) unter vorsichtigem Schütteln depuriniert werden, gefolgt von 30 Minuten langer Denaturierung (in zum Beispiel 0,4 M NaOH) bei sanftem Schütteln. Ein Renaturierungsschritt kann eingeschlossen werden, in welchem das Gel während 30 Minuten bei sanftem Schütteln in 1,5 M NaCl, 1 M Tris, pH 7,0, eingebracht wird. Die DNA sollte dann auf eine geeignete positiv geladene Membran überführt werden, beispielsweise die Maximum Strength Nytran Plus-Membran (Schleicher & Schuell, Keene, N.H.), wobei eine Transferlösung verwendet wird (wie zum Beispiel 6 × SSC (900 mM NaCl, 90 mM Trinatriumcitrat)). Sobald der Transfer vollständig ist, im Allgemeinen nach etwa 2 Stunden, wird die Membran gespült in z. B. 2× SSC (2× SSC = 300 mM NaCl, 30 mM Trinatriumcitrat) und bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Die Membran sollte dann (etwa 2 Stunden lang oder mehr) in einer geeigneten Vorhybridisierungslösung (wie zum Beispiel eine wässrige Lösung, enthaltend pro 100 ml: 20–50 ml Formamid, 25 ml 20× SSPE (1× SSPE = 0,18 M NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM NaH₂PO₄, pH 7,7), 2,5 ml 20 % SDS und 1 ml 10 mg/ml gescherter Heringssperma-DNA) prähybridisiert werden. Wie dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sein wird, kann die Menge an Formamid in der Vorhybridisierungslösung in Abhängigkeit von der Natur der erhaltenen Reaktion gemäß Routineverfahren variiert werden. Somit kann eine niedrigere Menge an Formamid zu einer vollständigeren Hybridisierung im Hinblick auf die Identifizierung von hybridisierenden Molekülen führen, als das gleiche Vorgehen unter Ver wendung einer größeren Menge an Formamid. Andererseits kann eine starke Hybridisierungsbande unter Verwendung von mehr Formamid leichter visuell identifiziert werden.
Eine DNA-Sonde mit einer Länge im Allgemeinen zwischen 100 und 1000 Basen, entnommen aus der Sequenz in 2, sollte durch Elektrophorese in einem Agarosegel isoliert werden, das Fragment aus dem Gel herausgeschnitten werden und aus der ausgeschnittenen Agarose gewonnen werden; für ein ausführlicheres Vorgehen siehe Sambrook. Dieses gereinigte Fragment von DNA wird dann markiert (zum Beispiel unter Verwendung des Megaprime-Markierungssystems gemäß den Anweisungen des Herstellers) zum Einbauen von P³² in die DNA. Die markierte Sonde wird durch Erhitzen auf 95°C während 5 Minuten denaturiert und unverzüglich zu der Membran und Vorhybridisierungslösung zugesetzt. Die Hybridisierungsreaktion sollte während einer angemessenen Zeit und unter passenden Bedingungen, zum Beispiel 18 Stunden lang bei 37°C unter vorsichtigem Schütteln oder Schwenken vor sich gehen. Die Membran wird gespült (zum Beispiel in 2× SSC/0,3% SDS) und dann in einer geeigneten Waschlösung bei vorsichtigem Bewegen gewaschen. Die gewünschte Stringenz wird eine Reflexion der Bedingungen sein, unter welchen die Membran (Filter) gewaschen wird.
Spezifisch wird die Stringenz einer gegebenen Reaktion (d. h. der Grad an Homologie, der für eine erfolgreiche Hybridisierung notwendig ist) von den Waschbedingungen abhängen, welchen der Filter nach der Hybridisierung unterzogen wird. "Niedrig-Stringenz"-Bedingungen, wie hierin definiert, werden das Waschen eines Filters mit einer Lösung von 0,2× SSC/0,1% SDS bei 20°C während 15 Minuten umfassen. "Hoch-Stringenz"-Bedingungen umfassen einen weiteren Waschschritt, umfassend das zweimalige Waschen des Filters mit einer Lösung von 0,2× SSC/0,1% SDS bei 37°C während 30 Minuten.
Nach dem Waschen wird die Membran getrocknet, und die gebundene Sonde wird detektiert. Falls ³²P oder ein anderes Radioisotop als das Markierungsmittel verwendet wird, kann die gebundene Sonde durch Autoradiographie detektiert werden. Andere Techniken für die Sichtbarmachung von anderen Sonden sind dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. Die Detektion einer gebundenen Sonde zeigt an, dass eine Nukleinsäuresequenz die gewünschte Homologie und daher Identität zu SEQ ID Nr.: 2 aufweist und innerhalb dieser Erfindung eingeschlossen ist.
Die Cellulaseproteine und Derivate dieser Erfindung können entweder physikochemisch oder funktionell, und vorzugsweise auf beide Arten, charakterisiert werden. Eine physikochemische Charakterisierung zieht einen Vorteil aus gut bekannten Techniken, wie SDS- Elektrophorese, Gelfiltration, Aminosäurezusammensetzung, Massenspektroskopie und Sedimentierung, um das Molekulargewicht eines Proteins zu bestimmen, isoelektrischer Fokussierung, um den pI eines Proteins zu bestimmen, Aminosäuresequenzierung, um die Aminosäuresequenz eines Proteins zu bestimmen, Kristallographie-Untersuchungen, um die Tertiärstruktur eines Proteins zu bestimmen, und Antikörperbindung, um antigene Epitope, welche in einem Protein vorhanden sind, zu ermitteln.
Funktionelle Charakteristika werden durch dem Fachmann auf dem Gebiet der Cellulase allgemein bekannte Techniken bestimmt und schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Hydrolyse von kristalliner Carboxymethylcellulose (CMC) ein. Diese bevorzugte Technik für eine funktionelle Charakterisierung wird in größerer Ausführlichkeit im nachstehenden Beispiel 5 beschrieben.
Unter Anwendung einiger der obenstehend aufgezählten Techniken wurde festgestellt, dass die Volllängen-Cellulasen dieser Erfindung ein Molekulargewicht von ungefähr 30 bis 40 kD, vorzugsweise 34 bis etwa 38 kD, am stärksten bevorzugt 36 kD aufweisen, wie gemessen auf SDS-PAGE. Es wurde festgestellt, dass die Volllängen-Cellulasen einen berechneten isoelektrischen Punkt von etwa 4 bis etwa 5, vorzugsweise 4,5, und ein pH-Optimum gegenüber CMC von etwa 5 bis etwa 10, abhängig von der Temperatur, aufweisen. Das pH-Optimum beträgt festgestelltermaßen 8 bei 40°C und 7 bei 60°C. Die trunkierten Cellulasen dieser Erfindung weisen festgestelltermaßen ein Molekulargewicht von zwischen 20 und 30 kD, vorzugsweise zwischen etwa 23 und 26 kD und am stärksten bevorzugt zwischen 24 und 25 kD auf.
Anwendungen der Cellulasen dieser Erfindung
Die Behandlung von Textilien gemäß der vorliegenden Erfindung zieht eine Textilien-Verarbeitung oder -Reinigung mit einer Zusammensetzung, welche eine Cellulase der Erfindung umfasst, in Betracht. Eine solche Behandlung schließt, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Stonewashing, Modifizieren der Textur, Gefühlseigenschaft und/oder Erscheinung von cellulosehaltigen Textilien oder sonstige Techniken, welche während der Herstellung oder Säuberung/Rekonditionierung von cellulosehaltigen Textilien angewandt werden, ein. Darüber hinaus betrifft die Behandlung innerhalb des Kontexts dieser Erfindung die Entfernung "unreifer" oder "toter" Baumwolle aus cellulosehaltigen Textilien oder Fasern. Unreife Baumwolle ist signifikant amorpher als reife Baumwolle, und zum Beispiel Ursache von ungleichmäßiger Einfärbung. Die in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogene Zusammensetzung schließt ferner eine Cellulase-Komponente zur Verwendung beim Waschen einer verschmutzten gefertigten cellulosehaltigen Textilie ein. Zum Beispiel kann eine Cellulase dieser Erfindung in einer Reinigungsmittelzusammensetzung zum Wäschewaschen verwendet werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung brauchbare Waschmittelzusammensetzungen schließen Spezialformulierungen, wie Vorwäsche-, Voreinweichungs- oder Farbwiederherstellungszusammensetzungen für den Hausgebrauch ein. Solche Behandlungszusammensetzungen, wie hierin beschrieben, können in der Form eines Konzentrats, welches eine Verdünnung erfordert, oder in der Form einer verdünnten Lösung oder einer Form, welche direkt auf die Cellulose enthaltende Textilie aufgebracht werden kam, vorliegen. Allgemeine Behandlungstechniken für die Cellulase-Behandlung von Textilien werden zum Beispiel in der EP-Veröffentlichung Nr. 220 016 und den GB-Anmeldungen Nr. 1 368 599 und 2 095 275 beschrieben.
Die Behandlung eines cellulosehaltigen Materials gemäß der vorliegenden Erfindung beabsichtigt ferner die Behandlung von Tierfutter, Zellstoff und/oder Papier, Lebensmitteln und Getreide bzw. Körnern für die im Fachgebiet bekannten Zwecke. Beispielsweise ist bekannt, dass Cellulase den Wert von Tierfutter erhöht, den Feuchtigkeitsgehalt bzw. die Entwässerbarkeit von Holzzellstoff erhöht, Lebensmittelprodukte verbessert und die Fasern in Getreide während des Körner-Nassmahlverfahrens oder -Trockenmahlverfahrens reduziert.
Eine Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Herstellen einer wässrigen Lösung, welche eine wirksame Menge an einer Cellulase oder einer Kombination von Cellulasen zusammen mit anderen optionalen Bestandteilen enthält, einschließlich zum Beispiel einem Puffer, einem Tensid und/oder einem Scheuermittel. Eine wirksame Menge von einer Cellulase-Enzymzusammensetzung ist eine für ihren beabsichtigten Zweck ausreichende Konzentration an Cellulase-Enzym. Somit ist zum Beispiel eine "wirksame Menge" an Cellulase in einer Stonewashing-Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung diejenige Menge, welche den gewünschten Effekt vorsehen wird, z. B. zur Hervorrufung eines gebrauchten und ausgebleichten Aussehens an den Nähten und auf Gewebebahnen. In ähnlicher Weise ist eine "wirksame Menge" an Cellulase in einer Zusammensetzung, welche zur Verbesserung des Gefühlseindrucks und/oder Aussehens einer Cellulose enthaltenden Textilie beabsichtigt wird, diejenige Menge, welche messbare Verbesserung im Gefühlseindruck, z. B. eine Verbesserung der Glattheit des Gewebes, oder Aussehen, z. B. Entfernung von Pills und Fibrillen, welche dazu neigen, die Klarheit des Aussehens eines Kleidungsstücks zu verringern, hervorruft. Die eingesetzte Menge an Cellulase ist ebenfalls abhängig von der verwendeten Gerätschaft, den verwendeten Verfahrensparametern (der Temperatur der Cellulasebehandlungslösung, der Expositionszeit an die Cellulaselösung und dergleichen) und der Cellulase-Aktivität (z. B. wird eine jeweilige Lösung eine geringere Konzentration an Cellulase erfordern, falls eine aktivere Cellulase-Zusammensetzung verwendet wird, verglichen zu einer weniger aktiven Cellulase-Zusammensetzung). Die exakte Konzentration an Cellulase in der wässrigen Behandlungslösung, zu welcher das zu behandelnde Textil zugegeben wird, kann vom Fachmann basierend auf den oben genannten Faktoren sowie dem gewünschten Ergebnis ohne Weiteres bestimmt werden. In Stonewashing-Verfahren ist es im Allgemeinen bevorzugt worden, dass die Cellulase in der wässrigen Behandlungslösung in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 5000 ppm und am stärksten bevorzugt etwa 10 bis 200 ppm Gesamtprotein vorhanden ist. In Zusammensetzungen zur Verbesserung des Gefühlseindrucks und/oder Aussehens einer Cellulose enthaltenden Textilie ist es im Allgemeinen bevorzugt worden, dass die Cellulase in der wässrigen Behandlungslösung bei einer Konzentration von etwa 0,1 bis 2000 ppm und am stärksten bevorzugt etwa 0,5 bis 200 ppm Gesamtprotein vorhanden ist.
In einer bevorzugten Behandlungs-Ausführungsform wird ein Puffer in der Behandlungslösung verwendet, so dass die Konzentration an Puffer ausreichend ist, um den pH-Wert der Lösung innerhalb des Bereichs zu halten, worin die verwendete Cellulase Aktivität aufzeigt. Der pH, bei dem die Cellulase Aktivität aufzeigt hängt seinerseits von der Natur der verwendeten Cellulase ab. Die exakte Konzentration an verwendetem Puffer wird von mehreren Faktoren abhängen, die der Fachmann ohne Weiteres berücksichtigen kann. Zum Beispiel werden, in einer bevorzugten Ausführungsform, der Puffer wie auch die Pufferkonzentration so ausgewählt, dass der pH-Wert der letztendlichen Cellulase-Lösung innerhalb des pH-Bereichs gehalten wird, der für eine optimale Cellulase-Aktivität erfordert wird. Die Feststellung des optimalen pH-Bereichs der Cellulasen der Erfindung kann gemäß gut bekannten Techniken ermittelt werden. Geeignete Puffer bei einem pH innerhalb des Aktivitätsbereichs der Cellulase sind dem Fachmann auf dem Gebiet ebenfalls gut bekannt.
Zusätzlich zu Cellulase und einem Puffer kann die Behandlungszusammensetzung gegebenenfalls ein Tensid enthalten. Geeignete Tenside schließen jedwedes Tensid ein, das mit der verwendeten Cellulase und der Textilie kompatibel ist, einschließlich beispielsweise anionischen, nicht-ionischen und ampholytischen Tensiden. Geeignete anionische Tenside schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, lineare oder verzweigte Alkylbenzolsulfonate; Alkyl- oder Alkenylethersulfate mit linearen oder verzweigten Alkylgruppen oder Alkenylgruppen; Alkyl- oder Alkenylsulfate; Olefinsulfonate; Alkansulfonate und dergleichen ein. Geeignete Gegenionen für anionische Tenside schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Alkalimetallionen wie Natrium und Kalium; Erdalkalimetallionen wie Calcium und Magnesium; Ammoniumion; und Alkanolamine mit 1 bis 3 Alkanolgruppen der Kohlenstoffanzahl 2 oder 3 ein. Ampholytische Tenside schließen z. B. quaternäre Ammo niumsalzsulfonate und ampholytische Tenside vom Betain-Typ ein. Derartige ampholytische Tenside besitzen sowohl positiv als auch negativ geladene Gruppen im gleichen Molekül. Nichtionische Tenside umfassen im Allgemeinen Polyoxyalkylenether, sowie höhere Fettsäure-Alkanolamide oder Alkylenoxid-Addukt davon und Fettsäureglycerinmonoester. Mischungen von Tensiden können in den Weisen, welche dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, ebenfalls verwendet werden.
Eine konzentrierte Cellulasezusammensetzung kann zur Verwendung in den hierin beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Solche Konzentrate enthalten konzentrierte Mengen der oben beschriebenen Cellulasezusammensetzung, Puffer und Tensid, vorzugsweise in einer wässrigen Lösung. Wenn es so formuliert wird, kann das Cellulasekonzentrat leicht mit Wasser verdünnt werden, so dass die Cellulasepräparationen, welche die erforderliche Konzentration an jedem Bestandteil aufweisen, rasch und akkurat hergestellt werden. Wenn wässrige Konzentrate formuliert werden, können diese Konzentrate verdünnt werden, so dass man zu der erforderlichen Konzentration der Komponenten in der Cellulase-Lösung, wie oben angegeben, gelangt. Wie ohne Weiteres offensichtlich ist, werden derartige Cellulase-Konzentrate eine einfache Formulierung der Cellulase-Lösungen gestatten, als auch einen durchführbaren Transport der Zusammensetzung zu der Örtlichkeit, an der sie verwendet werden wird, zulassen. Das Behandlungskonzentrat kann in einer beliebigen, im Fachgebiet anerkannten, Form vorliegen, beispielsweise Flüssigkeit, Emulsion, Gel oder Paste. Derartige Formen sind dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt.
Wenn ein festes Cellulase-Konzentrat eingesetzt wird, kann die Cellulase-Zusammensetzung ein Granulat, ein Pulver, ein Agglomerat oder eine feste Scheibe sein. Die Granulate können so formuliert werden, dass sie Materialien zur Verringerung der Auflösungsgeschwindigkeit der Granulate in das Waschmedium enthalten. Derartige Materialien und Granulate werden im U.S.-Patent Nr. 5 254 283 offenbart, das hierin durch den Bezug darauf in seiner Gesamtheit einbezogen ist.
Andere Materialien können ebenfalls mit der Cellulase-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet oder darin eingebracht werden, wie gewünscht, einschließlich Steinen, Bimsstein, Füllstoffen, Lösungsmitteln, Enzymaktivatoren und Anti-Wiederablagerungs-Mitteln, abhängig von der letztendlichen Verwendung der Zusammensetzung.
Als Beispiel werden Stonewashing-Verfahren ausführlich beschrieben werden, wobei jedoch die beschriebenen Parameter vom Fachmann für andere Anwendungen, d. h. Verbesserung des Gefühlserlebnisses und/oder Aussehens einer Textilie, ohne Weiteres modifiziert werden.
Die cellulosehaltige Textilie wird mit der Cellulase-haltigen Stonewashing-Zusammensetzung, welche eine wirksame Menge der Cellulase enthält, durch Vermengen der Behandlungszusammensetzung mit der Stonewashing-Zusammensetzung, und somit indem das Cellulase-Enzym in Nähe zu dem Textil gebracht wird, kontaktiert. Anschließend wird die wässrige Lösung, welche die Cellulase und die Textilie enthält, bewegt. Wenn die Behandlungszusammensetzung eine wässrige Lösung ist, kann die Textilie direkt in der Lösung eingeweicht werden. In ähnlicher Weise wird, wo die Stonewashing-Zusammensetzung ein Konzentrat ist, das Konzentrat in ein Wasserbad mit der cellulosehaltigen Textilie hinein verdünnt. Wenn die Stonewashing-Zusammensetzung in einer festen Form, zum Beispiel einem Vorwasch-Gel oder einer festen Stückform, vorliegt, kann die Stonewashing-Zusammensetzung durch direktes Anwenden der Zusammensetzung auf die Textilie oder die Waschflotte kontaktiert werden.
Die cellulosehaltige Textilie wird mit der Stonewashing-Lösung unter Bedingungen inkubiert, die wirksam sind, um zu gestatten, dass die enzymatische Wirkung der cellulosehaltigen Textilie ein "stonewashed"-Aussehen verleiht. Zum Beispiel können, während des Stonewashing, der pH, das Flottenverhältnis, die Temperatur und die Reaktionszeit eingestellt werden, um die Bedingungen zu optimieren, unter welchen die Stonewashing-Zusammensetzung wirkt. "Effektive Bedingungen" bezieht sich notwendigerweise auf den pH, das Flottenverhältnis und die Temperatur, welche dem Cellulase-Enzym gestatten, effizient mit cellulosehaltigen Textilien zu reagieren, in diesem Falle den "stonewashed" Effekt hervorzurufen. Es liegt es innerhalb des Kenntnisstands des Fachmanns auf dem Gebiet, Bedingungen zur Anwendung der Stonewashing-Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung zu maximieren.
Die Flottenverhältnisse während des Stonewashing, d. h. das Verhältnis des Gewichts an Stonewashing-Zusammensetzungs-Lösung (d. h. der Waschflotte) zu dem Gewicht der Textilien, welche hierin angewandt werden, sind im Allgemeinen eine Menge, die ausreicht, um den gewünschten Stonewashing-Effekt in der Denim- bzw. Jeans-Textilie zu erzielen und sind von dem eingesetzten Verfahren abhängig. Vorzugsweise belaufen sich die Flottenverhältnisse auf etwa 4:1 bis etwa 50:1; weiter bevorzugt etwa 5:1 bis etwa 20:1, und am stärksten bevorzugt etwa 10:1 bis etwa 15:1.
Die Reaktionstemperaturen während des Stonewashings mit den vorliegenden Stonewashing-Zusammensetzungen werden von zwei miteinander konkurrierenden Faktoren beherrscht. Zum Ersten entsprechen höhere Temperaturen im Allgemeinen einer verstärkten Reaktionskinetik, d. h. schnelleren Reaktionen, was verringerte Reaktionszeiten im Vergleich zu den Reaktionszeiten gestattet, welche bei niedrigeren Temperaturen erforderlich sind. Folglich betragen die Reaktionstemperaturen im Allgemeinen wenigstens etwa 10 °C und darüber. Zum Zweiten ist Cellulase ein Protein, welches jenseits einer gegebenen Reaktionstemperatur Aktivität verliert, wobei die Temperatur von der Natur der verwendeten Cellulase abhängt. Wenn somit die Reaktionstemperatur zu hoch steigen gelassen wird, wird die cellulolytische Aktivität als Ergebnis der Denaturierung der Cellulase verloren. Obgleich Standardtemperaturen für die Cellulase-Verwendung im Fachgebiet im Allgemeinen im Bereich von 35°C bis 65°C liegen, wobei von diesen Bedingungen auch erwartet werden würde, für die Cellulase der Erfindung geeignet zu sein, sollten die optimalen Temperaturbedingungen gemäß gut bekannter Techniken in Bezug auf die verwendete spezifische Cellulase ermittelt werden.
Reaktionszeiten sind abhängig von den spezifischen Bedingungen, unter denen das Stonewashing stattfindet. Zum Beispiel werden pH, Temperatur und Konzentration von Cellulase alle die optimale Reaktionszeit beeinflussen. Im Allgemeinen belaufen sich Reaktionszeiten auf etwa 5 Minuten bis etwa 5 Stunden und vorzugsweise etwa 10 Minuten bis etwa 3 Stunden und weiter bevorzugt etwa 20 Minuten bis etwa 1 Stunde.
Gemäß noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Cellulase der Erfindung in einer Waschmittelzusammensetzung verwendet werden. Die Waschmittelzusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung werden als Vorwasch-Zusammensetzungen, Voreinweichungs-Zusammensetzungen oder zur Reinigung während des regulären Wasch- oder Spülzyklus verwendet. Vorzugsweise umfasst die Reinigungsmittelzusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine wirksame Menge an Cellulase, ein Tensid und schließt gegebenenfalls andere Bestandteile, welche nachstehend beschrieben werden, ein.
Eine wirksame Menge an Cellulase, welche in den Waschmittelzusammensetzungen dieser Erfindung verwendet wird, ist eine Menge, die ausreicht, um die wünschenswerten Effekte zu vermitteln, welche bekanntermaßen durch Cellulase gegenüber cellulosehaltigen Textilien hervorgerufen werden, beispielsweise Entpillung, Weichmachen, Anti-Pilling, Oberflächenfaserentfernung, Anti-Vergrauung und Reinigung. Vorzugsweise wird die Cellulase in der Waschmittelzusammensetzung in einer Konzentration von etwa 10 ppm bis etwa 20000 ppm Waschmittel eingesetzt.
Die Konzentration an Cellulase-Enzym, welche in der Waschmittelzusammensetzung verwendet wird, wird vorzugsweise so gewählt, dass nach Verdünnen in ein Waschmedium hinein, die Konzentration an Cellulase-Enzym in einem Bereich von etwa 0,01 bis etwa 1000 ppm, vorzugsweise etwa 0,02 ppm bis etwa 500 ppm und am stärksten bevorzugt etwa 0,5 ppm bis etwa 250 ppm Gesamtprotein liegt. Die in der Waschmittelzusammensetzung verwendete Menge an Cellulase-Enzym wird von dem Ausmaß abhängen, zu welchem das Waschmittel nach Zugeben von Wasser verdünnt wird, so dass eine Waschlösung gebildet wird.
Die Waschmittelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in jedweder im Fachgebiet anerkannten Form vorliegen, zum Beispiel als eine Flüssigkeit, in Granulaten, in Emulsionen, in Gelen oder in Pasten. Derartige Formen sind dem Fachmann gut bekannt. Wenn eine feste Waschmittelzusammensetzung verwendet wird, wird die Cellulase vorzugsweise als Granulat formuliert. Vorzugsweise können die Granulate so formuliert werden, dass sie zusätzlich ein Cellulase-schützendes Mittel enthalten. Das Granulat kann so formuliert werden, dass es Materialien enthält, welche die Auflösungsrate des Granulats in das Waschmedium hinein reduziert. Solche Materialien und Granulate sind im U.S.-Patent Nr. 5 254 283 offenbart, das hierin durch den Bezug darauf in seiner Gesamtheit einbezogen wird.
Die Waschmittelzusammensetzungen dieser Erfindung verwenden ein oberflächenaktives Mittel, d. h. Tensid, einschließlich anionischer, nicht-ionischer und ampholytischer Tenside, welche für ihre Verwendung in Waschmittelzusammensetzungen gut bekannt sind.
Geeignete anionische Tenside zur Verwendung in der Waschmittelmittelzusammensetzung dieser Erfindung schließen lineare oder verzweigte Alkylbenzolsulfonate; Alkyl- oder Alkenylethersulfate mit linearen oder verzweigten Alkylgruppen oder Alkenylgruppen; Alkyl- oder Alkenylsulfate; Olefinsulfonate und Alkansulfonate ein. Geeignete Gegenionen für anionische Tenside schließen Alkalimetallionen, wie Natrium und Kalium; Erdalkalimetallionen, wie Calcium und Magnesium; Ammoniumion; und Alkanolamine mit 1 bis 3 Alkanolgruppen mit einer Kohlenstoffanzahl von 2 oder 3 ein. Ampholytische Tenside schließen quaternäre Ammoniumsalzsulfonate und ampholytische Tenside vom Betain-Typ ein. Bei derartigen ampholytische Tenside liegen sowohl die positiv als auch negativ geladenen Gruppen im gleichen Molekül vor. Nichtionische Tenside umfassen im Allgemeinen Polyoxyalkylenether, sowie höhere Fettsäurealkanolamide oder Alkylenoxidaddukt davon, Fettsäureglycerinmonoester und dergleichen. Geeignete Tenside zur Verwendung in dieser Erfindung werden offenbart in der Britischen Patentanmeldung Nr. 2 094 826 A, deren Beschreibung hierin als Bezugsstelle einbezogen wird. Mischungen solcher Tenside können ebenfalls verwendet werden. Das Tensid oder eine Mischung von Tensiden wird im Allgemeinen in den Waschmittelzusammensetzungen dieser Erfindung in einer Menge von etwa 1 Gewichtsprozent bis etwa 95 Gewichtsprozent der gesamten Waschmittelzusammensetzung, und vorzugsweise von etwa 5 Gewichtsprozent bis etwa 45 Gewichtsprozent der gesamten Waschmittelzusammensetzung verwendet. Zusätzlich zu der Cellulasezusammensetzung und den Tensid(en), können die Waschmittelzusammensetzungen dieser Erfindung gegebenenfalls eine oder mehrere der folgenden Komponenten enthalten:
Hydrolasen außer Cellulase
Geeignete Hydrolasen schließen Carboxylatesterhydrolase, Thioester-Hydrolase, Phosphatmonoester-Hydrolase und Phosphatdiester-Hydrolase, welche auf die Esterbindung einwirken; Glycosid-Hydrolase, welche auf Glycosylverbindungen einwirkt; ein Enzym, welches N-Glycosylverbindungen hydrolysiert; Thioether-Hydrolase, welche auf die Etherbindung wirkt; und eine a-Amino-Acyl-Peptid-Hydrolase, Peptidyl-Aminosäure-Hydrolase, Acyl-Aminosäure-Hydrolase, Dipeptid-Hydrolase und Peptidyl-Peptid-Hydrolase, welche auf die Peptidbindung einwirken, ein. Bevorzugt unter ihnen sind Carboxylatester-Hydrolase, Glycosidhydrolase und Peptidyl-Peptid-Hydrolase. Geeignete Hydrolasen schließen ein: (1) Proteasen, welche der Peptidyl-Peptid-Hydrolase angehören, wie Pepsin, Pepsin B, Rennin, Trypsin, Chymotroypsin A, Chymotrypsin B, Elastase, Enterokinase, Cathepsin C, Papain, Chymopapain, Ficin, Thrombin, Fibrinolysin, Renin, Subtilisin, Aspergillopeptidase A, Collagenase, Clostridiopeptidase B, Kallikrein, Gastrisin, Cathepsin D., Bromelin, Keratinase, Chymotrypsin C, Pepsin C, Aspergillopeptidase B, Urokinase, Carboxypeptidase A und B und Aminopeptidase; (2) Glycosid-Hydrolasen (Cellulase, welche ein Hauptbestandteil ist, ist aus dieser Gruppe ausgenommen), α-Amylase, β-Amylase, Glucoamylase, Invertase, Lysozym, Pectinase, Chitinase und Dextranase. Unter ihnen sind α-Amylase und β-Amylase bevorzugt. Sie funktionieren in sauren bis neutralen Systemen, aber eine solche, welche aus Bakterien erhalten wird, zeigt eine hohe Aktivität in einem alkalischen System; (3) Carboxylatester-Hydrolase, einschließlich Carboxylesterase, Lipase, Pektinesterase und Chlorophyllase. Speziell wirksam unter ihnen ist Lipase.
Die von Cellulase verschiedene Hydrolase wird in die Waschmittelzusammensetzung in solcher Menge eingebracht, es wie gemäß der Absicht erforderlich ist. Sie sollte vorzugsweise in einer Menge von 0,001 bis 5 Gewichtsprozent und weiter bevorzugt 0,02 bis 3 Gewichtsprozent, bezüglich des gereinigten Proteins, eingebracht werden. Dieses Enzym sollte in der Form von Granulaten, hergestellt aus Rohenzym, allein oder in Kombination mit anderen Komponenten, in der Waschmittelzusammensetzung verwendet werden. Granulate des Rohenzyms werden in einer derartigen Menge verwendet, dass sich das gereinigte Enzym auf 0,001 bis 50 Gewichtsprozent in den Granulaten beläuft. Die Granulate werden in einer Menge von 0,002 bis 20 und vorzugsweise von 0,1 bis 10 Gewichtsprozent verwendet. Wie bei Cellulasen, können diese Granulate so formuliert werden, dass sie ein enzymschützendes Mittel und ein auflösungsverzögerndes Material enthalten.
Kationische Tenside und langkettige Fettsäuresalze
Derartige kationische Tenside und langkettige Fettsäuresalze schließen gesättigte oder ungesättigte Fettsäuresalze, Alkyl- oder Alkenylether-Carbonsäuresalze, α-Sulfo-Fettsäuresalze oder -ester, Tenside vom Aminosäuretyp, Phosphatester-Tenside, quaternäre Ammoniumsalze, einschließlich jenen mit 3 bis 4 Alkylsubstituenten und bis zu 1 phenylsubstituierten Alkylsubstituenten, ein. Geeignete kationische Tenside und langkettige Fettsäuresalze sind in der britischen Patentanmeldung Nr. 2 094 826 A beschrieben, deren Beschreibung hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist. Die Zusammensetzung kann etwa 1 bis etwa 20 Gewichtsprozent an solchen kationischen Tensiden und langkettigen Fettsäuresalzen enthalten.
Builder
A. Zweiwertige Sequestriermittel.
Die Zusammensetzung kam etwa 0 bis etwa 50 Gewichtsprozent an einer oder mehreren Builderkomponenten enthalten, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkalimetallsalzen und Alkanolaminsalzen der folgenden Verbindungen: Phosphate, Phosphonate, Phosphonocarboxylate, Salze von Aminosäuren, Aminopolyacetate, hochmolekulare Elektrolyte, nicht-dissoziierende Polymere, Salze von Dicarbonsäuren und Aluminiumsilicat-Salze. Geeignete zweiwertige Sequestriermittel sind in der britischen Patentanmeldung Nr. 2 094 826 A beschrieben, deren Beschreibung hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist.
B. Alkalis oder anorganische Elektrolyte
Die Zusammensetzung kann etwa 1 bis etwa 50 Gewichtsprozent, vorzugsweise etwa 5 bis etwa 30 Gewichtsprozent, basierend auf der Zusammensetzung, an einem oder mehreren Alkalimetallsalzen der folgenden Verbindungen als die Alkalis oder anorganischen Elektrolyte enthalten: Silicate, Carbonate und Sulfate sowie organische Alkalis, wie Triethanolamin, Diethanolamin, Monoethanolamin und Triisopropanolamin.
Anti-Wiederablagerungsmittel
Die Zusammensetzung kann etwa 0,1 bis etwa 5 Gewichtsprozent einer oder mehrerer der folgenden Verbindungen als Anti-Wiederablagerungsmittel enthalten: Polyethylenglykol, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose.
Unter ihnen sieht eine Kombination von Carboxymethylcellulose und/oder Polyethylenglykol mit der Cellulase-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine besonders nützliche schmutzentfernende Zusammensetzung vor.
Bleichmittel
Die Verwendung der Cellulase der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem Bleichmittel, wie Kaliummonopersulfat, Natriumpercarbonat, Natriumperborat, Natriumsulfat/Wasserstoffperoxid-Addukt und Natriumchlorid/Wasserstoffperoxid-Addukt oder/und einem lichtempfindlichen Bleichungs-Farbstoff, wie Zink- oder Aluminiumsalz von sulfoniertem Phthalocyanin, verbessert die Reinigungseffekte weiter. In ähnlicher Weise können Bleichmittel und Bleichkatalysatoren, wie beschrieben im EP 684 304 , verwendet werden.
Bläuungsmittel und fluoreszierende Farbstoffe
Verschiedene Bläuungsmittel und fluoreszierende Farbstoffe können in die Zusammensetzung eingebunden werden, falls notwendig. Geeignete Bläuungsmittel und fluoreszierende Farbstoffe sind in der britischen Patentanmeldung Nr. 2 094 826 A offenbart, deren Beschreibung hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist.
Klumpenbildungs-Inhibitoren
Die folgenden Verklumpungsinhibitoren können in das pulverförmige Reinigungsmittel eingebunden werden: p-Toluolsulfonsäuresalze, Xylensulfonsäuresalze, Essigsäuresalze, Sulfobernsteinsäuresalze, Talk, fein pulverisiertes Siliziumdioxid, amorphe Siliziumdioxide, Ton, Calciumsilicat (wie Micro-Cell von Johns Manville Co.), Calciumcarbonat und Magnesiumoxid.
Antioxidationsmittel
Die Antioxidationsmittel schließen zum Beispiel tert-Butyl-Hydroxytoluol, 4,4'-Butyliden-bis(6-tert-butyl-3-methylphenol), 2,2'-Butylidenbis(6-tert-butyl-4-methylphenol), monostyroli siertes Cresol, distyrolisiertes Cresol, monostyrolisiertes Phenol, distyrolisiertes Phenol und 1,1-Bis(4-hydroxyphenyl)cyclohexan ein.
Solubilisatoren
Die Solubilisatoren schließen zum Beispiel niedere Alkohole, wie Ethanol, Benzolsulfonatsalze, Niederalkylbenzolsulfonatsalze, wie p-Toluolsulfonatsalze, Glykole wie Propylenglykol, Acetylbenzolsulfonatsalze, Acetamide, Pyridindicarbonsäureamide, Benzoat-Salze und Harnstoff ein.
Die Waschmittelzusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann in einem breiten pH-Bereich von saurem bis alkalischem pH eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Waschmittelzusammensetzung der vorliegenden Erfindung in schwach sauren, neutralen oder alkalischen Reinigungsmittel-Waschmedien verwendet werden, welche einen pH-Wert von über 5 bis zu nicht mehr als etwa 12 aufweisen.
Neben den oben genannten Bestandteilen, können Duftstoffe, Puffer, Konservierungsstoffe, Farbstoffe und dergleichen, falls gewünscht, mit den Waschmittelzusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden. Solche Komponenten werden herkömmlicherweise in bislang im Fachgebiet verwendeten Mengen eingesetzt.
Wenn eine Waschmittelbasis, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, in der Form eines Pulvers vorliegt, kann es ein solches sein, welches durch jedwede bekannten Herstellungsverfahren hergestellt wird, einschließlich eines Sprühtrocknungsverfahrens und eines Granulierungsverfahrens. Die Waschmittelbasis, welche insbesondere durch das Sprühtrocknungsverfahren, Agglomerationsverfahren, Trockenmischverfahren oder Nicht-Turm-Routen-Verfahren erhalten wird, wird bevorzugt. Die durch das Sprühtrocknungsverfahren erhaltene Waschmittelbasis ist nicht in Hinsicht auf die Herstellungsbedingungen eingeschränkt. Die durch das Sprühtrocknungsverfahren erhaltene Waschmittelbasis besteht in Hohlgranulaten, welche durch Sprühen einer wässrigen Schlämmung von wärmebeständigen Bestandteilen, wie oberflächenaktiven Mitteln und Buildern, in einen heißen Raum erhalten werden. Nach dem Sprühtrocknen können Duftstoffe, Enzyme, Bleichmittel und anorganische alkalische Builder zugesetzt werden. Bei einer hochdichten, granulären Waschmittelbasis, wie sie durch das Sprühtrocknungs-Granulations- oder Agglomerationsverfahren erhalten wird, können verschiedene Bestandteile auch nach der Herstellung der Basis zugesetzt werden.
Wenn die Waschmittelbasis eine Flüssigkeit ist, kann sie entweder eine homogene Lösung oder eine nicht-homogene Dispersion sein. Zum Abwenden der Zersetzung von Carboxymethylcellulose durch die Cellulase in dem Waschmittel, wird es erwünscht, dass Carboxymethylcellulose, vor der Einbringung in die Zusammensetzung, granuliert oder beschichtet wird.
Die Waschmittelzusammensetzungen dieser Erfindung können mit Cellulose enthaltendem Gewebe, zum Beispiel verschmutzten Textilien, in Industrie- und Haushalt-Anwendungen bei Temperaturen, Reaktionszeiten und Flottenverhältnissen, welche herkömmlich in diesen Umgebungen verwendet werden, inkubiert werden.
Waschmittel gemäß der vorliegenden Erfindung können darüber hinaus als eine Vorwäsche in der geeigneten Lösung bei einem intermediären pH-Wert formuliert werden, worin eine ausreichende Aktivität vorliegt, um erwünschte Verbesserungen beim Weichmachen, Entpillen, Pilling-Verhinderung, Oberflächenfaser-Entfernen oder Reinigen vorzusehen. Wenn die Waschmittelzusammensetzung eine Zusammensetzung zum Voreinweichen (z. B. Vorwaschen oder Vorbehandeln) ist, entweder als eine Flüssigkeits-, Spray-, Gel- oder Pasten-Zusammensetzung, wird das Cellulase-Enzym im Allgemeinen bei etwa 0,0001 bis etwa 1 Gewichtsprozent, basierend auf dem Gesamtgewicht der Voreinweich- oder Vorbehandlungs-Zusammensetzung, verwendet. In solchen Zusammensetzungen kann gegebenenfalls ein Tensid verwendet werden, und bei Verwendung ist es im Allgemeinen bei einer Konzentration von etwa 0,005 bis etwa 20 Gewichtsprozent, basierend auf dem Gesamtgewicht der Voreinweichung, vorhanden. Der Rest der Zusammensetzung umfasst herkömmliche Komponenten, welche in der Voreinweichung verwendet werden, d. h. Verdünnungsmittel, Puffer, weitere Enzyme (Proteasen) und dergleichen bei ihren herkömmlichen Konzentrationen.
Es wird in Erwägung gezogen, dass Zusammensetzungen, welche die hierin beschriebenen Cellulase-Enzyme umfassen, in der Haushaltsanwendung als eine Stand-Alone-Zusammensetzung verwendet werden können, die zum Wiederherstellen von Farbe bei ausgeblichenen Textilien geeignet ist (siehe zum Beispiel U.S.-Patent Nr. 4 738 682, das hierin durch den Bezug darauf in seiner Gesamtheit einbezogen wird), sowie in einem Fleckenentferner und zum Entpillen und Anti-Pilling (Pilling-Verhinderung) verwendet werden können.
Die Verwendung der Cellulase gemäß der Erfindung kann bei Futterzusatzstoffen und bei der Verarbeitung von Zellstoff und Papier besonders effektiv sein. Diese zusätzlichen industriellen Anwendungen werden zum Beispiel in der PCT-Veröffentlichung Nr. 95/16360 bzw. dem finnischen erteilten Patent Nr. 87372 beschrieben.
Um die vorliegende Erfindung und ihre Vorteile weiter zu veranschaulichen, werden die nachfolgenden spezifischen Beispiele angegeben, wobei es sich versteht, dass sie dargestellt werden, um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen, und keineswegs so ausgelegt werden sollten, dass sie deren Umfang einschränken.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Isolierung von Cellulase-erzeugenden Mikroorganismen aus alkalischen Boden- und Wasserproben
Alkalische Schlammproben wurden in 5 ml 4 % (w/v) NaCl, 1 % (w/v) Na₂CO₃ suspendiert und heftig geschüttelt. Serielle Verdünnungen in der gleichen Lösung wurden auf Bodenextrakt-Agar, pH 10, welcher Rifampicin 50 μg/ml enthielt, ausplattiert.
Bodenextrakt-Agar wurde wie folgend hergestellt: 1 kg Gartenerde wurde 1 Liter entmineralisiertem Wasser suspendiert. Die Suspension wurde 20 Minuten lang bei 120 °C autoklaviert. Die Suspension wurde über einen Glasfaserfilter (Whatman, GF/A) filtriert, und die Feststoffe wurden zweimal mit demineralisiertem Wasser (1 × 200 ml, 1 × 100 ml) gewaschen. Das Filtrat wird mit Wasser auf 1 Liter gebracht. Ein gleiches Volumen an sterilisiertem Filtrat wurde mit einer sterilen Lösung von 8 % (w/v) NaCl, 2 % (w/v) Na₂CO₃ mit 2 % (w/v) Agar-Zusatz zur Verfestigung gemischt.
Die Platten wurden bei 30°C mehrere Wochen lang in einer geschlossenen Schachtel, zur Vermeidung von Verdampfung, inkubiert. Die Platten wurden periodisch unter dem Stereomikroskop untersucht, und Mikrokolonien wurden auf alkalischen Agar überführt, welcher 0,3 % (w/v) Carboxymethylcellulose (CMC) enthielt. Duplikat-Kulturen wurden verwendet, um Cellulaseaktivität zu detektieren. Die Duplikatplatten wurden mit 0,1 % (w/v) Congo-Rot während 15 Minuten überschwemmt und 30 Minuten lang mit 1 M NaCl entfärbt. Die Stämme, welche eine Klärungszone um die Kolonien herum aufzeigten, wurden als potenzielle Cellulase-herstellende Mikroorganismen ausgewählt.
Stämme, welche Klärungszonen aufzeigten, wurden in 25 ml fermentiert, wie beschrieben in der PCT-Veröffentlichung Nr. Wo 96/34108, wonach CMC zugegeben wurde.
Unter Anwendung des obenstehend beschriebenen Verfahrens wurde der Stamm, welcher eine Cellulase gemäß der Erfindung herstellte, isoliert und weiter als filamentöses Bakterium charakterisiert. Basierend auf dem Aussehen und einer partiellen 16s-rRNA-Gensequenz-Analyse (Beispiel 4) wurde der Mikroorganismus als eine Spezies von Streptomyces klassifiziert.
Eine morphologische Untersuchung des Cellulase-herstellenden Stammes wurde vorgenommen. Bei Aufzucht auf Bodenextrakt-Agar bei pH 10 entwickelte die anfänglich kleine runde glitzernde transparente Kolonie nach einigen Tagen ein weißes bis grau-weißes Luftmycel. Auf alkalischem Agar bildete der Stamm eine trockene, ledrige, cremefarbene opake Kolonie, welche bei Reife ein Luftmycel hervorbrachte. Unter dem Mikroskop zeigte der Stamm ein umfangreich verzweigtes Pseudomycel, welches zu unregelmäßigen Stäbchen, isolierten Sporen und Sporen in Ketten zerbrach.
BEISPIEL 2
Isolierung von DNA, Transformation und Expression von Cellulase
Ein alkaliphiler Actinomyceten-Stamm, welcher gemäß Beispiel 1 isoliert wurde, wurde als ein Donorstamm für die Expressionsklonierung in E. coli ausgewählt. Chromosomale DNA wurde gemäß des Verfahrens, welches von Saito & Miura, Biochim. Biophys. Acta., 72: 619–629 (1963), beschrieben wurde, isoliert.
Die isolierte chromosomale DNA wurde mit dem Restriktionsenzym Sau3A unter Anwendung von seriell verdünnten Enzymlösungen während einer Stunde bei 37°C unter Verwendung von React-Puffern (Gibco BRL Life Technologies, Gaithersburg, Md., USA) unter vom Hersteller empfohlenen Bedingungen partiell verdaut. Die verdaute DNA wurde durch Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und geeignete Fraktionen (2–6 kb) wurden aus dem Gel unter Verwendung des QIAquick-Gel-Extraktions-Kits gemäß des Protokolls, welches vom Hersteller beschrieben wird (QIAGEN Inc., Chatsworth, CA, USA), isoliert.
Genomische Genbibliotheken der alkalitoleranten Actinomyceten-Stämme wurden in einem pUC19-abgeleiteten Plasmid (Yanisch-Perron, C., et al., Gene 33: 103 (1985)) konstruiert. Rekombinante Klone wurden durch Agardifusion gescreent, wie beschrieben von Wood, et al., Meth. Enzym., 160: 59–74 (1988). Stämme, welche Klärungszonen um die Kolonien herum zeigten, wurden isoliert. Plasmid-DNA der Cellulase-herstellenden Rekombinante wurde unter Verwendung eines QIAprep-Plasmid-Kits gemäß des Protokolls, welches vom Hersteller (QIAGEN Inc.) beschrieben wird, isoliert. Die Nukleotidsequenz eines 3,5 kb großen Fragmentes wurde von beiden Enden aus bestimmt, bis eine Sequenz, welche eine Ähnlichkeit zu bekannten konservierten Cellulasesequenzen trug, mittels einer FASTA-Suche gegenüber den öffentlichen Datenbanken identifiziert wurde. Nach der Bestimmung der konservierten Sequenzen wurde der Rest des Gens sequenziert.
Das isolierte Gen enthielt 1173 Basenpaare, codierend ein Vorläuferprotein mit 371 Aminosäuren, einschließlich einer Signalsequenz von 27 Aminosäuren. Das reife Protein umfasste 344 Aminosäuren für ein abgeleitetes Molekulargewicht von 35766 und wies einen berechneten pI von 5,9 auf. Die Nukleotidsequenz des Gens (SEQ ID Nr.: 2), codierend für die Cellulase, und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 1) der reifen Cellulase sind in den 1 und 2 veranschaulicht.
Das DNA-Fragment des Cellulasegens, welches für das Strukturgen codiert, hergestellt wie obenstehend beschrieben, wurde in den Vektor pHPLT kloniert (siehe 4). Dieser Vektor enthielt bereits den Promotor und die Signalsequenz des thermostabilen Amylase-Gens von Bacillus licheniformis, und von ihm wurde festgestellt, eine hohe Expression in Bacillus zu ergeben (siehe 5). Eine Transformation von kompetenten Bacillus-Wirtszellen wurde durchgeführt, wobei resultierende rekombinante Cellulase-produzierende Bacillus-Klone isoliert und unter geeigneten Bedingungen für die Herstellung der klonierten Cellulase wachsen gelassen wurden.
Das Gen, welches die Aminosäuresequenz der 36 kD großen Cellulase codiert, wurde durch Vergleich mit den zugänglichen Sequenzdaten in verschiedenen Bibliotheken (GenBank, Swiss-Prot, EMBL und PIR) analysiert, was durchgeführt wurde, um die nahen phylogenetischen Nachbarn zu ermitteln. Das höchste Ausmaß an gefundener Homologie bestand zu Endoglucanase I aus Aspergillus aculeatus, Exocellobiohydrolase aus Cellulomonas fimi und Endoglucanase C aus Clostridium cellulovorans. Es wurde gezeigt, dass die ungefähr 36 kD große Cellulase zu 35,1 % identisch hinsichtlich der Sequenz zu Endoglucanase I aus Aspergillus aculeatus in einer 242 Reste großen Überlappung ist, zu 48,2 % identisch hinsichtlich der Sequenz zu Exocellbiohydrolase aus Cellulomonas fimi in einer 112 Reste langen Überlappung ist, und zu 44,7 % identisch zu Endoglucanase C aus Clostridium cellulovorans in einer 114 Aminosäuren großen Überlappung ist, wobei das TFASTA-Programm eingesetzt wurde, wie beschrieben von Pearson & Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci., 85: 2444–2448 (1988). Das TFASTA-Daten-Suchprogramm ist kommerziell erhältlich im Sequenz-Analyse-Software-Paket, Version 6.0 (Genetic Computer Group, Univ. Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wisconsin 53705). Ein Vergleich der DNA-Sequenzen, welche die 36 kD große Cellulase codieren, mit DNA-Sequenzen in den öffentlichen Datenbanken zeigt, dass die näheste Homologie zu dem eglS aus Streptomyces rochei codierenden Gen (75,8 % Identität in einer 823 Basenpaare großen Überlappung), sowie zu dem Gen, das celB aus Streptomyces lividans codiert (74,9 % Identität in einer 765 Basenpaare großen Überlappung), bestand.
BEISPIEL 3
Reinigung von Cellulase
Die Cellulase-produzierenden Bacillus licheniformis-Klone aus Beispiel 2 wurden in einem Komplexmedium, umfassend Trypton-Soja-Nährmedium (Oxoid CM129) 3 %, 20 μg/ml Neomycin, wachsen gelassen. Die Reinigung der rekombinanten Cellulase kann wie folgend bewerkstelligt werden: Fermentations-Nährmedium wird aus der Kulturflüssigkeit durch Zentrifugation (8000 U/min) abgetrennt. Die Cellulase im Überstand wird mit Aminoniumsulfat (65 % Sättigung) gefällt. Das Präzipitat wird in 25 mM Phosphatpuffer, pH 7, + 5 mM EDTA, aufgelöst, bis eine Leitfähigkeit von 7 mS/cm erreicht wurde. Diese Lösung wird auf eine Q-Sepharose FF-Anionenaustauschsäule (Durchmesser 5 cm, Länge 10 cm) aufgetragen, wonach die Säule mit 25 mM Phosphatpuffer, pH 7, + 5 mM EDTA, gewaschen wird bis zu einer Absorption von 0,2 AU. Ein Gradient von 0 bis 0,5 M NaCl in 25 mM Phosphat, pH 7, wird in 80 Minuten auf die Säule aufgetragen, gefolgt von einem Gradienten von 0,5 bis 1 M NaCl in 10 Minuten. Eine Elution kann im ersten Gradienten ausgeführt werden. Nach der Elution wird die Säule (Aufwärtsstrom) mit 1 M NaOH gereinigt und erneut mit 25 mM Phosphat pH 7 + 5 mM EDTA äquilibriert.
BEISPIEL 4
Charakterisierung von 16S-rDNA aus Cellulase-produzierendem Actinomycete
Die Nukleotidsequenz der ersten 400 bp der 16S-rDNA-Sequenz des Cellulase-produzierenden Organismus, der in Beispiel 1 isoliert wurde, wurde erhalten und ist in 6 angegeben (SEQ ID Nr.: 3). Diese Sequenz wurde mit dem FASTA-Sequenzanalyse-Softwarepaket analysiert, um einen Vergleich mit den Sequenzen in öffentlichen Datenbanken vorzusehen. Die Analyseergebnisse veranschaulichten, dass der nächste Nachbar Streptomyces thermoveolaceous ist, welcher eine 16S-rDNA-Identität von 95,5 % in einer Überlappung von 465 Basenpaaren aufwies. Der Prozentsatz der Identität der partiellen 16S-rDNA-Fraktion der Stämme ist ein starker Hinweis darauf, dass der Stamm eine unbekannte Spezies von Actinomycetes darstellt. Basierend auf einer Analyse der erhaltenen 16S-rRNA-Sequenz (in Kombination mit dem Aussehen, Beispiel 1), wurde der Mikroorganismus als eine Spezies von Streptomyces klassifiziert.
BEISPIEL 5
Eigenschaften der Cellulase gemäß der Erfindung
Um das pH/Temperatur-Profil der ungefähr 36 kD großen Cellulase dieser Erfindung zu bestimmen, wurde die Aktivität der Cellulase gegenüber CMC bei verschiedenen pH- und Temperaturwerten gemessen. Der Assay war ein kolorimetrisches Verfahren für die Bestimmung von (gesamter) Cellulase-Aktivität unter Verwendung von Carboxymethylcellulose (CMC) als Substrat. Die Detektion von Cellulase beruhte auf der Freisetzung von reduzierenden Zuckern aus Cellulose durch Cellulase. Die freien Zucker reagieren mit "PAHBAH" bei hohem pH und Temperatur. Dieses Reaktionsprodukt wurde mit einem Spektrophotometer gemessen. Die Aktivität wurde unter Verwendung einer Eichkurve von Glucose bestimmt.
Chemikalien:

– CMC, niedrige Viskosität (Sigma C-5678, Charge # 23HO244)
– p-Hydroxybenzoesäurehydrazid ("PAHBAH", Sigma H-9882)
– D-Glucosemonohydrat (Boom 8342)
– NaH₂PO₄·1 aq. (Merck 6346)
– H₃PO₄ (85%; Merck 573)
– Zitronensäure·1 aq. (Merck 244)
– 4 N NaOH
– 0,5 N HCl

Inkubationspuffer A (0,01 M Phosphat):
1,38 g NaH₂PO₄·1 aq. wurde in 800 ml demineralisiertem Wasser gelöst. Der pH wurde mit 4 N NaOH auf 7 eingestellt, und die Mischung wurde mit demineralisiertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. Schließlich wurde der pH überprüft und eingestellt, falls notwendig. Dieser Puffer wurde zum Lösen und Verdünnen der Enzymproben verwendet.
Inkubationspuffer B (0,1 M Citrat + 0,1 M Phosphat):
23,06 g H₃PO₄ wurden in demineralisiertem Wasser zu einem Endvolumen von 200 ml (= 1 M) gelöst. 42 g Zitronensäure wurden in demineralisiertem Wasser zu einem Endvolumen von 200 ml (= 1 M) gelöst. 20 ml Zitronensäurelösung wurde zu 20 ml Phosphorsäure zugesetzt, und dann mit demineralisiertem Wasser auf 150 ml gebracht. Der pH (für einen Bereich von 4 bis 10) wurde mit 4 N NaOH eingestellt, und das Endvolumen wurde mit demineralisiertem Wasser auf 200 ml eingestellt. Dieser Puffer wurde zum Verdünnen der Substratpräparation verwendet.
Inkubationspuffer C (0,05 M Citrat + 0,05 M Phosphat):
Inkubationspuffer B wurde 1:1 mit demineralisiertem Wasser verdünnt. Der pH-Wert wurde überprüft und korrigiert, falls notwendig. Diese Lösung wurde für die Glucose-Eichkurve verwendet.
Substrat-Herstellung (1 %):
Unter starkem Rühren wurde 1 g CMC langsam zu 100 ml demineralisiertern Wasser zugegeben. Das heftige Rühren wurde wenigstens eine Stunde lang fortgesetzt, gefolgt von einer Behandlung mit einem Ultraturrax während 30 Sekunden.
Enzymlösung:
Die Enzymprobe wurde gelöst und in Inkubationspuffer A zu einer Aktivität von etwa 0,05 U/ml verdünnt (50 % auf der Glucose-Eichkurve).
Farbreagenz (5 %):
5 g PAHBAH wurden in 80 ml 0,5 N HCl gelöst, wonach die Lösung mit 0,5 N HCl auf 100 ml gebracht wurde. Vor der Anwendung wurde ein Teil der PAHBAH-Lösung mit vier Teilen 0,5 N NaOH verdünnt.
Eichkurve:

Stammlösung #1: 1000 mg Glucose wurden in 100 ml demineralisiertem Wasser gelöst (10 mg/ml).
Stammlösung #2: 0,5 ml Stammlösung #1 wurde mit 9,5 ml Inkubationspuffer C des betreffenden pH gelöst (0,5 mg/ml).

Es wurde das folgende Titrationsschema verwendet:
Assay-Verfahren:

(1) Teströhrchen von den Glucosestandards, Kontrollen, Proben und Leerproben wurden mit 0,5 ml Substrat (1 %) und 0,5 ml Inkubationspuffer B vom gewünschten pH gefüllt und in ein Wasserbad bei der gewünschten Temperatur eingebracht;
(2) die Lösungen wurden 10 Minuten lang inkubiert;
(3) in 15 Sekunden-Intervallen wurden 100 μl Glucose-Standard, Kontrolle oder Probe bei jedem pH zu den Röhrchen mit Substrat gegeben;
(4) die Lösungen wurden 3 Sekunden lang verwirbelt und zurück in das Wasserbad gebracht;
(5) jede Probe wurde 30 Minuten lang inkubiert;
(6) die Enzymreaktion wurde durch Zugeben von 3 ml des PAHBAH-Reagenz gestoppt;
(7) die resultierenden Lösungen wurden 3 Sekunden lang verwirbelt, und in ein Gestell außerhalb des Wasserbads gestellt;
(8) als alle der Reaktionen gestoppt worden waren, wurden 100 μl Probe zu den Leerprobenröhrchen zugesetzt und 3 Sekunden lang verwirbelt;
(9) die Proben wurden während 15 Minuten in ein kochendes Wasserbad gebracht;
(10) die resultierenden Proben wurden in kaltem Leitungswasser 5 bis 10 Minuten lang gekühlt und dann erneut 3 Sekunden lang verwirbelt;
(11) die Absorption der Mischung wurde bei 410 nm mit Wasser als Referenz gemessen.

Die Ergebnisse sind in der 3 gezeigt. Wie gezeigt in 3 wurde beobachtet, dass sich das pH-Optimum der 36 kD großen Cellulase bei 40°C auf etwa 8 und bei 60°C auf 7 beläuft.
BEISPIEL 6
Cellulaseherstellung in Streptomyces lividans
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines Plasmids, das eine Nukleinsäure, welche eine Cellulase dieser Erfindung codiert, umfasst und zum Transformieren von Streptomyces lividans verwendet wird. Der letztliche Plasmidvektor wird als pSEGCT bezeichnet.
Die Konstruktion von pSEGCT verwendete zwei andere Plasmide, pIJ486, beschrieben in Ward et al., Mol. Gen. Genet. 203: 468–478 (1986), und pIJ488. Bei dem Plasmid pIJ488 handelt es sich um pUC18 (Yanisch-Perron et al., Gene 33: 103–119 (1985)), welches in seiner KpnI-Stelle ein 1,5 kb großes ermE-Fragment aus Saccharopolyspora erythrea, das Erythromycin-Resistenz codiert, enthält. Die Nukleotidsequenz dieses Fragments ist bestimmt worden (Uchiyama & Weisblum, Gene 38: 103–110 (1985), und Bibb et al., Gene 38: 215–226 (1985)).
Beide Plasmide wurden ursprünglich aus dem natürlichen Streptomyces-Plasmid pIJ101 (D. A. Hopwood et al., J. Gen. Microbiol. 129: 2257–2260 (1983)) abgeleitet. pIJ101 enthält das tsr-Gen, welches Resistenz gegenüber Thiostrepton codiert, aus Streptomyces azureus. Allerdings sind nur noch der Replikationsursprung und das Replikase-Gen von pIJ101 in den Plasmiden pIJ486 und pIJ488 vorhanden.
Das Plasmid pIJ488-101 wurde durch Ligieren des großen PstI-Fragments von pI1486, enthaltend den pIJ101-Replikationsursprung und das Thiostrepton-Resistenzgen, mit PstI-verdautem pIJ488 konstruiert, wodurch das Plasmid pIJ488-101 erhalten wurde (siehe 7).
Um einen geeigneten Promotor einzuführen, wurde ein Plasmid aus dem obenstehend beschriebenen Plasmid pIJ488-101 konstruiert. Das Glucoseisomerase-Gen von Actinoplanes missouriensis wurde in das Plasmid pIJ488 eingeführt. Dieses Gen, GI, sowie das Gen, codierend ein proteingentechnisch manipuliertes Derivat, das als GIT bekannt ist, sind beschrieben worden (Europäische Patentanmeldung 351029) und dienen als eine Quelle für eine geeignete Promotorsequenz, welche in Streptomyces funktional ist.
Kurz gesagt, wurde das Plasmid pIJ488-101 mit EcoRI und SphI verdaut, und das große Fragment wurde isoliert und an das GIT-Gen auf einem EcoRI-SphI-Fragment ligiert. Das resultierende Plasmid pWGE.GIT war festgestelltermaßen strukturell instabil. Diese Instabilität wurde dem ermE-Gen zugeschrieben. Deshalb wurde das ermE-Gen aus dem Konstrukt durch Deletion des XbaI-Fragmentes entfernt, was zu dem Plasmid pWGx.GIT führte (siehe 8).
Das Plasmid pWGx.GIT zeigte festgestelltermaßen noch eine geringe Segregations-Instabilität. Es war über eine Studie berichtet worden, welche die Replikation des natürlichen Streptomyces-Plasmids pIJ101 beschreibt, von welchem alle diese Plasmide abgeleitet worden waren (Z. Deng et al., Mol. Gen. Genet. 214: 286–294 (1988)). In dieser Untersuchung wurde es gezeigt, dass pIJ101 unter Verwendung des "rollender Kreis"-Mechanismus repliziert. Plasmide, welche unter Verwendung dieses Mechanismus replizieren, synthetisieren zuerst ein einzelsträngiges intermediäres Molekül unter Verwendung des bekannten Replikationsursprungs, welcher als der Plus-Ursprung bezeichnet wird. Eine effiziente Umwandlung in ein aktives doppelsträngiges Molekül erfordert einen zweiten Replikationsursprung, welcher als der Minus-Ursprung bezeichnet wird. Während der Konstruktion der meisten Derivate von pIJ101 war dieser Minus-Ursprung entfernt worden.
Der Minus-Ursprung, der ebenfalls als "sti" bezeichnet wird, wurde aus dem Plasmid pIJ211, welches ein Derivat von pIJ101 ist, als ein KpnI-FspI-Fragment isoliert und in den generellen Klonierungsvektor pTZ18R (Pharmacia, Analects 13, Nr. 4) ligiert. Der Vektor wurde mit BamHI verdaut und glattendig gemacht und mit KpnI verdaut. Dies führte zum Plasmid pTZ18Rsti (siehe 9).
Das Plasmid pWGxGIT wurde mit KpnI und XbaI verdaut. Das große Fragment wurde isoliert und an das sti-enthaltende Fragment ligiert, welches aus einem KpnI- und XbaI-Fragment von pTZ18Rsti isoliert worden war. Auf diese Weise wurde das Plasmid pWGxsGIT gebildet (siehe 10).
Ein Shuttle-Plasmid wurde durch Vereinigen der Plasmide pIJ488-101 und des Plasmids pWGxsGIT konstruiert. Das Fragment, welches die Streptomyces-Replikationsfunktionen (Plus-Ursprung, sti und rep-Gen) aus pWGxsGIT enthält, wurde nach Verdau mit XbaI und SphI isoliert. Das Fragment, welches die E.coli-Replikationsfunktion enthält, wurde aus pIJ488-101 nach Verdau mit XbaI, SphI und NcoI isoliert. Nach Ligation dieser zwei Fragmente wurde das Plasmid pIJ488sti gebildet (siehe 11).
Um die Expression der Cellulase anzutreiben, wurde der GI-Promotor zusammen mit der Signalsequenz von S. lividans-Cellulase, CelA (D. Kluepfel et al., Nature Biotechnol. 14: 756–759 (1996)), verwendet. Eine Fusion zwischen dem GI-Promotor und der CelA-Signalsequenz wurde durch Fusions-PCR-Techniken als ein XbaI-EcoRI-Fragment konstruiert. Auf demselben Fragment wurde eine NheI-Stelle für Klonierungszwecke eingeführt. Das Fragment wurde in das Plasmid pIJ488sti ligiert, welches mit XbaI und EcoRI verdaut worden war, was zum Plasmid pIJSEGiCe führt (siehe 12).
Um den Expressionsvektor zu vervollständigen, wurde eine Terminatorsequenz von Cellulase inseriert. Der Stamm Streptomyces 11AG3 ist zu dem in Beispiel 1 isolierten Streptomyces-Stamm (11AG8) nah verwandt, wenn nicht identisch. Beide Stämme wurden aus derselben Probe isoliert, und die sequenzierte 16S-rDNA der zwei Stämme wurde als identisch befunden. Das 11AG3-Cellulasegen wurde als ein NheI-EcoRI-PCR-Fragment isoliert. Auf demselben Fragment wurden eine BamHI- und eine HpaI-Stelle eingeführt, um eine Klonierung zu erleichtern. Das Plasmid pIJSEGiCel wurde mit NheI und EcoRI verdaut, und das PCR-Terminator-Fragment wurde in das verdaute Plasmid ligiert, um den Vektor pIJSEGCi zu erzeugen. Als Nächstes wurde die Cellulase 11AG3 codierende Region durch Deletion des internen BamHI-Fragements aus dem Plasmid pIJSEGCi entfernt, was zum Vektor pSEGCT führte (siehe 13).
Das Cellulase 11AG8-Gen wurde aus Streptomyces lividans TK23 unter Verwendung von PCR als ein NheI-BamHI-Fragment isoliert. Der Vektor pSEGCT wurde mit NheI und BamHI verdaut, und das PCR-Fragment wurde in den verdauten Vektor ligiert, was zum Plasmid pSEGCT11AG8 führte (siehe 14). Die DNA-Nukleotidsequenz der vollständigen Expressionskassette, bestehend aus GI-Promotor, celA-Signalsequenz, Cellulase 11AG8 und Gl-Terminator, ist in der 15 abgebildet, ebenso wie die Aminosäuresequenz des Produktes (SEQ ID Nr.: 4 und 5).
Der Wirt Streptomyces lividans TK23 wurde mit dem Plasmidvektor pSEGCT11AG8 unter Anwenden des Protoplasten-Verfahrens transformiert, welches in Hopwood et al., GENETIC MANIPULATION OF STREPTOMYCES: A LABORATORY MANUAL, The John Innen Foundation, Norwich, Großbritannien (1985), beschrieben wird.
Die transformierte Kultur wurde expandiert, um zwei Fermentationskulturen bereitzustellen. An verschiedenen Zeitpunkten wurden Proben der Fermentationsnährlösungen für eine Analyse entnommen. Zum Zwecke dieses Experimentes wurden die Proben hinsichtlich CMC-Aktivität und hinsichtlich Molekulargewicht (SDS-PAGE) geassayt. Am Ende des Fermentationsansatzes wurden signifikante Mengen (5–15 %) an Volllängen-Cellulase durch SDS-PAGE beobachtet.
In einem der Fermentationsansätze akkumulierte sich Volllängen-Cellulase rasch bis etwa 110,3 Stunden. Von da ab bis 205,5 Stunden akkumulierte sich wenig mehr Volllängen-Cellulase, und der Großteil der Volllängen-Cellulase wurde zu einer trunkierten Form prozessiert. Im anderen Fermentationsansatz war die Volllängen-Cellulase die dominante Cellulase, welche im Fermenter vorhanden war, bis etwa 66,2 Stunden. Danach akkumulierten sich trunkierte Formen von Cellulase. Somit ist es wahrscheinlich, dass in beiden dieser Ansätze die Wirtszellen Volllängen-Cellulase herstellten, welche dann im Fermentermedium unter Bildung der trunkierten Formen von Cellulase gespalten wurde.
BEISPIEL 7
Expression von trunkierter Actinomyceten-Cellulase
Wie in Beispiel 6 festgestellt wurde, erscheint die 35 kD große Cellulase der Erfindung bei Expression in einem Streptomyces lividans-Expressionssystem im extrazellulären Raum anfänglich als "Volllängen"-Enzym (von N- zum C-Terminus: katalytischer Kern, Linker-Region und Cellulosebindungsdomäne (CBD), bestehend aus insgesamt 340 Aminosäure resten mit einem Molekulargewicht von etwa 35 kD, und beinhaltend 3 Disulfidbindungs-Brücken). Nachdem die Fermentation während einer signifikanten Zeitdauer, d. h. etwa 66 Stunden, vorangeschritten ist, wird die Cellulase dadurch modifiziert, dass ihre Cellulose-Bindungsdomäne abgeschnitten wird. Das resultierende "Kern"-Molekül behält Cellulaseaktivität bei und besitzt ein Molekulargewicht von etwa 25 kD. Eine anfängliche Spaltungsstelle des Volllängenenzyms, falls eine vorhanden ist, ist nicht bestimmt worden, aber die exakte Aminosäuresequenz (mw bzw. MG) des Kerns wurde entweder unter Verwendung von gereinigten Protein oder UF-konzentrierter zellfreier Nährlösung bestimmt. Aus der Aminosäuresequenz wurde ein durchschnittliches Molekulargewicht für das trunkierte Protein berechnet.
Die Sequenzidentität des trunkierten Kerns wurde wie folgend bestimmt: Ein Aliquot von 0,2 mg gelöstem Enzym wurde mit gekühltem Wasser (mindestens 2 Volumina des Probenaliquots) auf 0,45 ml verdünnt, dann mit 0,05 ml 1 N HCl gemischt und 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die Lösung wurde während 2 Minuten bei 13000 × g zentrifugiert, der Überstand gewonnen und mit 0,065 ml 50 % (w/v) Trichloressigsäure 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. Das präzipitierte Protein wurde durch Zentrifugation gewonnen, das Pellet wurde einmal mit 1 ml gekühltem 90 % (v/v) Aceton gewaschen und dann in 0,025 ml 8 M Harnstoff in 0,5 M Ammoniumbicarbonat gelöst. Nachdem das Pellet aufgelöst worden war, wurden 2,5 μl 0,2 M Dithiothreitol zugegeben, und die Lösung wurde 15 Minuten lang bei 50°C inkubiert. Danach wurden 2,5 μl 0,44 M Jodacetamid in 0,1 M Ammoniumbicarbonat zugesetzt, und die Lösung wurde 15 Minuten lang im Dunklen bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Lösung wurde mit 0,1 ml 0,1 % (w/v) n-Octyl-β-D-glycosid verdünnt, und das Protein wurde mit 6 μg Trypsin während 60 Minuten bei 37°C verdaut. Die resultierenden Peptide wurden durch RP-HPLC bzw. Umkehrphasen-HPLC auf einer C₁₈-Säule getrennt, und das Elutionsprofil wurde sowohl durch UV-Absorption als auch Massenspektrometrie verfolgt. Die Zuordnung der Peptide zu der gegebenen Sequenz wurde durch partielle Sequenzierung von 11 unter 13 Peaks unterstützt.
Obwohl die Massenbestimmung bereits die Information, dass der "Kern" aus zwei Molekülen bestand, und ihre jeweilige Sequenz bereitstellte, wurde die C-terminale tryptische Peptidmischung mit Endoproteinase AspN verdaut und erneut durch LC/MS bzw. Flüssigchromatographie/Massenspektrometrie analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass das "Kern"-Protein in einem Verhältnis von ungefähr 1:2 aus zwei Molekülen bestand, eines mit einem Molekulargewicht von 24469,0 Dalton (umfassend 230 Aminosäurereste, 2 Disulfidbindungsbrücken) und eines mit einem Molekulargewicht von 24724,3 Dalton (umfassend 233 Aminosäurereste, 2 Disulfidbindungsbrücken). Dieser Befund wird von direkten Massen messungen mit einem PE-Bioscience ESI-TOF-Massenspektrometer, Modell Mariner (Foster City, CA) unterstützt, welche Molekulargewichte der gereinigten Varianten-Kernproteine von 24467,0 bzw. 24727,6 anzeigten.
BEISPIEL 8
Expression von Cellulase vermittels eines alternativen Promotors
Der GI-Promotor führte bekanntermaßen zu einer sehr hohen Expression. Aufgrund von z. B. Promotorinstabilität ist es möglich, dass eine hohe Expression von Cellulasen nicht erwünscht ist. Daher wurde ein alternativer Promotor in die Cellulase-Expressionsvektoren dieser Erfindung kloniert. Der verwendete Promotor war der schwächere aph-Promotor des Aminoglycosid-3'-Phosphotransferase-Gens aus Streptomyces fradiae. Dieser Promotor wurde aus dem Plasmid pIJ61 isoliert, welches ein Derivat des natürlichen Streptomyces-Plasmids SLP1 ist. Die vollständige Nukleotidsequenz des aph-Gens ist bekannt gewesen, und die Promotorregion ist charakterisiert worden.
Eine Fusions-PCR-Technik wurde angewandt, um ein SpeI-NheI-Fragment zu erhalten, welches den aph-Promotor, welcher an die celA-Signalsequenz fusioniert war, enthielt. Der GI-Promotor im Plasmid pSEGCT11AG8 wurde dann gegen den aph-Promotor ausgetauscht durch Verdauen dieses Plasmids mit SpeI und NheI, Isolieren des großen Fragmentes und Ligieren des PCR-Fragmentes in selbiges. Dies führte zum Plasmid pSEACT11AG8 (siehe 16). Dieses Plasmid ist äquivalent zum Plasmid pSEGCT11AG8 (siehe 14) und kann so angesehen werden, dass es durch Insertion der Cellulase aus S. lividens 11AG8 in einen Vektor pSEACT konstruiert wird, welcher identisch zum Vektor pSEGCT ist, mit Ausnahme des verwendeten Promotors zur Steuerung der Expression des Cellulasegens.
Um alle E. coli-Sequenzen aus dem Plasmid pSEACT11AG8 zu entfernen, wurde das Plasmid mit SphI verdaut und erneut ligiert. Dies bildete das Plasmid pSACT11AG8 (siehe 17). Dieses Konstrukt wurde in eine Bacillis-Wirtszelle transfiziert. Obwohl hohe Spiegel an exprimierter Cellulase in Plattenkulturen beobachtet wurden, war die Produktion von Cellulase durch die Bacillis-Wirtszellen in einer Fermenter-Umgebung sehr gering. Es ist jedoch möglich, dass mit einer besseren Steuerung über die Promotorinduktion die Produktion von Cellulase unter der Steuerung des aph-Promotors verbessert wird.
BEISPIEL 9
Vergleich von Volllängen-Cellulase und trunkierten Cellulasen
Ein Vergleich der "Entpillungs"-Leistung von Volllängen- und trunkierter Cellulase wurde vorgenommen.

Ein, drei Zyklen umfassender, "Detergent-Cellulase-Terg-O-Tometer"-Test (DCTT) wurde angewandt, um die Dosisantworten von Volllängen-Form (15,4 mg/ml) und der trunkierten Form (ungefähr 14 mg/ml) bei 20°C und 40°C in den Flüssigdetergenzien Wisk^® und Gessy Lever #1 auszuwerten. Die Experimente wurden sowohl unter Verwendung von vorgepillten Baumwollstrickstoff-Flicken als auch gewebten Baumwollstoff-Flicken durchgeführt. Die Bedingungen des Tests waren die Folgenden:

Temperatur:	40 °C
Zykluszeit:	2,5 Stunden
Anzahl von Zyklen:	3
Bewegungsgeschwindigkeit:	125
Wasserhärte:	150 ppm
Enzymdosis:	0, 45, 90, 135, 180, 225 NPC-Einheiten/Liter (225 NPC-Einheiten = 30 mg Volllängenprotein)
pH, Flotte:	8,55

Der pH-Wert wurde vor Zugeben der Enzyme und danach alle 30 Minuten während des Tests geprüft.
Bei der Durchführung des 3-Zyklus-Tests wurden die Stoffflicken aus dem "Terg"-Gefäß am Ende jedes Zyklus entnommen, in der Waschmaschine gespült, dann zurück in das Terg-Gefäß gebracht, welches frisches Enzym und Detergenz enthielt. Am Ende des 3. Zyklus-Spülens wurden die Stoffflicken in einem Wäschetrockner getrocknet.
Datenanalyse
Entpillung: Die 18a zeigt die Entpillungs-Dosis-Antwort von Volllängen gegenüber trunkierter Form in Wisk^® bei 40°C. Die Rohdaten wurden an die Michaelis-Menten-Gleichung angepasst und auf der Grafik aufgetragen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass es keinen signifikanten Unterschied in der Entpillungsleistung von Volllängen- gegenüber trunkierter Form in Wisk^® bei 40°C gibt.
Peak-Belastung: 18b zeigt die Dosis-Antwort von Volllängenform gegenüber trunkierter Form in Wisk^® bei 40°C. Die Peak-Belastung ist umgekehrt proportional zum Festigkeitsverlust, d. h. je höher die Peak-Belastung, umso geringer der TSL. Die Peak-Belastungswerte sind bei der trunkierten Form geringfügig größer als bei der Volllängenform. Obwohl die Peak-Belastungswerte bei der trunkierten Form geringfügig niedriger und der TSL größer als bei der Volllängenform sind, weisen die zwei Enzyme daher eine gleiche Entpillungsleistung auf.
Wenn jedoch Entpillung und % TSL verglichen werden, werden einige Unterschiede zwischen der Volllängen- und der trunkierten Cellulase beobachtet. Die 18c zeigt die % TSL geg. Entpillung für Volllängenform gegenüber trunkierter Form in Wisk^® bei 40°C. Es konnte eine Trendlinie sowohl für Volllängenform als auch trunkierte Form gezogen werden, welche zeigt, dass mit Zunahme der Entpillung der TSL zunimmt. Dies zeigt, dass bei einer Entpillungs-Bewertung von 4 die trunkierte Form einen größeren TSL aufweist als die Volllängenform.
Zusätzlich zu Wisk^®-Flüssigwaschmittel wurde die Entpillungsleistung in dem Flüssigwaschmittel Gessy Lever #1 bestimmt. Unter den gleichen Bedingungen (außer einer Zunahme im pH-Wert der Wäsche auf 10,57) wurden die Dosisantworten von Volllängenform zu trunkierter Form bei 20°C und 40°C in Gessy Lever #1 verglichen. Der pH-Wert wurde vor der Enzymzugabe und alle 30 Minuten überprüft.
Datenanalyse
Entpillung: Die 19a zeigt die Dosisantwort von Volllängenform gegenüber trunkierter Form in Gessy Lever #1 @ 20°C. Die Rohdaten wurden an die Michaelis-Menten-Gleichung angepasst und auf der Grafik aufgetragen. Wie auf der Grafik ersehen werden kann, war die Entpillungs-Leistung der trunkierten Form besser als bei der Volllängenform in Gessy Lever #1. Zusammengefasst brauchte man zum Erzielen einer Entpillungs-Bewertung von zwei 1,6-mal soviel Volllängenform im Vergleich zur trunkierten Form.
Peak-Belastung: Die 19b zeigt die Peak-Belastungswerte und den TSL von Volllängenform gegenüber trunkierter Form in Gessy Lever #1 @ 20°C. Wie erwartet, waren die Peak-Belastungswerte für die trunkierte Form größer als für die Volllängenform. Die Streuung in den Volllängen-Daten und der niedrige Korrelationskoeffizient legten nahe, dass das Enzym eine geringe Wirkung auf das Textil besaß und deshalb keinen TSL verursachte. Der TSL war in Gessy Lever #1 viel niedriger als in Wisk^®, was höchstwahrscheinlich auf Unterschieden im pH-Wert beruhte.

Um die Entpillungs-Leistung in Gegenwart von Bleichmitteln zu bestimmen, wurden dieselben Experimente in Gegenwart eines Bleichsystems ausgeführt. Die Bedingungen des Tests waren die folgenden:

Temperatur:	40°C
Zykluszeit:	2,5 Stunden
Anzahl von Zyklen:	3
Bewegungsgeschwindigkeit:	125 U/min.
Wasserhärte:	70 ppm als CaCO₃ (2:1 Ca:Mg)
Detergenz-Matrix:	0,51 Gramm LAS/0,35 Gramm STPP/0,68 Gramm Na₂SO₄
Bleichsystem:	0,50 Gramm Perboratmonohydrat (PBS)/0,10 Gramm TAED (Bleichaktivator)
pH:	10
Enzymdosen:	225 NPC/l Volllängenform bei 115,6 NPC/ml (dosiert bei 30 mg/l) 225 NPC/l trunkierte Form bei 149,2 NPC/ml (dosiert bei gleichem Wirkstoffgehalt zur Volllängenform) 34 NPC/l "Super L" EGIII @ 23 NPC/ml (dosiert bei 30 mg/l)

Der pH-Wert wurde vor und nach der Enzymdosierung eingestellt, dann alle 30 Minuten überprüft und nach Bedarf eingestellt.
Datenanalyse
Entpillung: Die 20a zeigt die Entpillungsleistung von Volllängenform, trunkierter Form und EGIII in einer alkalischen Detergenzmatrix ± einem Sauerstoffbleichmittelsystem. Wie auf der Grafik ersehen werden kann, verringerte sich, bei der Zugabe von PBS/TAED, die Entpillung bei allen drei Enzymen. Die Volllängenform und EGIII wurden in der Gegenwart des Bleichungssystems am stärksten betroffen. Die trunkierte Form wies die beste Entpillungsleistung auf, sogar in Gegenwart eines Sauerstoffbleichmittelsystems, mit einer Entpillungs-Bewertung von 3,5. Diese Daten legen nahe, dass die trunkierte Form stabiler als die Volllängenform und EGIII in Gegenwart des Bleichmittelsystems ist.
Peak-Belastung: Die 20b zeigt Peak-Belastungswerte von Volllängenform, trunkierter Form und von EGIII in einer alkalischen Detergenzmatrix ± einem Sauerstoffbleichmittelsystem. Wie ersehen werden kann, waren die Peak-Belastungswerte für Volllängenform und EGIII in Gegenwart eines Bleichmittelsystems gleich, wohingegen die Peak-Belastungswerte für die trunkierte Form stiegen. Es wurde festgestellt, dass der TSL umgekehrt proportional zur Peak-Belastung ist. Die Peak-Belastungswerte für die trunkierte Form stiegen in Gegenwart des Bleichmittelsystems, weshalb der TSL abnahm.

Zusätzlich zu Bleichmittel können Wäschewaschmittel Proteasen enthalten. Daher wurden die obenstehend beschriebenen Experimente bei Vorhandensein von Purafect 4000L^® (Genencor, International) durchgeführt. Die Bedingungen des Tests waren die folgenden:

Temperatur:	40°C
Zykluszeit:	2,5 Stunden
Anzahl von Zyklen:	3
Bewegungsgeschwindigkeit:	125 U/min.
Wasserhärte:	70 ppm als CaCO₃ (2:1 Ca:Mg)
Detergenz-Matrix:	0,51 Gramm LAS/0,35 Gramm STPP/0,68 Gramm Na₂SO₄
Protease:	1 mg/l Purafect 4000L^®
pH:	10
Enzymdosen:	225 NPC/l Volllängenform bei 115,6 NPC/ml (dosiert bei 30 mg/l) 225 NPC/l trunkierte Form bei 149,2 NPC/ml (dosiert bei gleichem Wirkstoffgehalt zur Volllängenform) 34 NPC/l "Super L"-EGIII bei 23 NPC/ml (dosiert bei 30 mg/l)

Datenanalyse
Entpillung: Die 21a zeigt die Entpillungsleistung von Volllängenform, trunkierter Form und EGIII in einer alkalischen Detergenzmatrix ± Purafect 4000L^®-Protease. Die Kontrolle ohne Cellulase ± Purafect 4000L^® wies keine Entpillungsleistung auf. Die Entpillungsleistung von Volllängenform stieg in Gegenwart von Purafect 4000L^®, wohingegen die Leistung der trunkierten Form unverändert war. Dies legte nahe, dass die trunkierte Form proteolytisch stabiler als das Volllängenenzym ist. Die Leistung der Volllängenform + Purafect 4000L^® erhöhte sich auf das gleiche Leistungsniveau wie bei der trunkierten Form. Diese Beobachtung stimmt mit früheren Beobachtungen überein, dass die trunkierte Form unter alkalischen Bedingungen eine bessere Leistung zeigt als die Volllängenform. Das Leistungsverhalten von EGIII bleibt von der Gegenwart von Purafect 4000L^®-Protease unbeeinflusst.
Peak-Belastung: Die 21b zeigt die Peak-Belastungswerte von Volllängenform, trunkierter Form und EGIII in einer alkalischen Detergenzmatrix ± Purafect 4000L^®-Protease. Die Zugabe von Purafect 4000L zur Null-Kontrolle besaß keinen Effekt auf die Peak-Belastungswerte. Die Peak-Belastungswerte für die Volllängenform sanken in Gegenwart von Purafect 4000L^®, was bedeutet, dass der TSL in Gegenwart von Protease zunahm. Weil der TSL umgekehrt proportional zur Peak-Belastung ist, nahm, mit Zunahme der Entpillung von Volllängenform bei Zugabe von Purafect 4000L^®, der TSL ebenfalls zu. Wiederum hatte Protease einen geringen oder gar keinen Effekt auf die trunkierte Form. Die Peak-Belastungswerte für EGIII blieben in Gegenwart von Purafect 4000L unbeeinflusst.

Claims

Expressionsvektor, der ein DNA-Molekül umfasst, das eine Cellulase codiert, welche eine DNA-Sequenz umfasst, wie dargestellt in SEQ ID Nr.: 2, oder eine DNA-Sequenz, welche mindestens 76 % Sequenzidentität zu der wie in SEQ ID Nr.: 2 dargestellten DNA-Sequenz aufweist, wobei das DNA-Molekül operativ an einen Glucoseisomerase-Promotor von Actinoplanes missouriensis verknüpft ist.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 1, der ferner eine Signalsequenz von Streptomyces lividans-Cellulase celA umfasst.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, der ferner eine Terminatorsequenz umfasst.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 3, wobei die Terminatorsequenz eine Glucoseisomerase-Terminatorsequenz ist.
Expressionsvektor gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Expressionsvektor pSEGCT ist, wie repräsentiert durch die Restriktionskarte, wie dargestellt in 13.
Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 transformiert ist, wobei die Wirtszelle eine Streptomyces spp oder eine Bacillus spp ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 6, wobei die Wirtszelle Streptomyces lividans, Bacillus licheniformis oder Bacillus subtilis ist.
Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, umfassend ein DNA-Molekül, das eine Cellulase codiert, welche eine DNA-Sequenz umfasst, wie dargestellt in SEQ ID Nr.: 2, oder eine DNA-Sequenz, welche mindestens 76 % Sequenzidentität zu der wie in SEQ ID Nr.: 2 dargestellten DNA-Sequenz aufweist, wobei das DNA-Molekül operativ an den aph-Promotor des Streptomyces fradiae-Aminoglycosid-3'-phosphotransferase-Gens verknüpft ist und wobei die Wirtszelle eine Bacillus spp ist.
Wirtszelle von Anspruch 8, wobei der Expressionsvektor ferner eine Signalsequenz von Streptomyces lividans-Cellulase celA umfasst.
Wirtszelle von Anspruch 8 oder Anspruch 9, wobei der Expressionsvektor ferner eine Terminatorsequenz umfasst.
Wirtszelle von Anspruch 10, wobei die Terminatorsequenz eine Glucoseisomerase-Terminatorsequenz ist.
Wirtszelle von mindestens einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei der Expressionsvektor pSEGCT ist, wie repräsentiert durch die Restriktionskarte, wie dargestellt in 13.
Wirtszelle gemäß mindestens einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei die Wirtszelle Bacillus licheniformis oder Bacillus subtilis ist.
Verfahren zur Herstellung einer Cellulase, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Heranziehen einer transformierten Wirtszelle gemäß mindestens einem der Ansprüche 6 bis 13 unter Bedingungen, die zur Expression der DNA, welche die Cellulase codiert, geeignet sind; und Sammeln der resultierenden wässrigen Mischung, welche die Cellulase umfasst.
Verfahren von Anspruch 14, wobei die Cellulase während des Fermentationsverfahrens trunkiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 14 oder Anspruch 15, wobei die Cellulase aus der wässrigen Mischung weiter gereinigt wird.