DE60126639T2

DE60126639T2 - Mutierte trichoderma reesei egiii cellulasen, dafür kodierende dna und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE60126639T2
Application number: DE60126639T
Authority: DE
Inventors: Anthony G. Day; Peter Gualfetti; Colin Mitchinson; Andrew Shaw
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2000-08-04
Filing date: 2001-07-31
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2021-08-01
Also published as: EP1328645B1; CA2417860C; DK1328645T3; DE60126639D1; WO2002012466A2; CA2417860A1; EP1328645A2; JP5005153B2; US6579841B1; AU2001279111A1; HK1056893A1; ATE353967T1; JP2004505630A; WO2002012466A3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Cellulasen sind Enzyme, welche zur Hydrolyse der β-D-glucosidischen Bindungen in Cellulosen in der Lage sind. Cellulolytische Enzyme sind traditionell in drei Hauptklassen eingeteilt worden: Endoglucanasen, Exoglucanasen oder Cellobiohydrolasen und β-Glucosidasen (Knowles, J., et al., (1987), TIBTECH 5, 255–261); und werden bekanntermaßen von einer großen Anzahl von Bakterien, Hefen und Pilzen hergestellt.
Obwohl Cellulasen verwendet werden, um Holz-Zellstoff und Tierfutter abzubauen, werden Cellulasen hauptsächlich in der Behandlung von Textilien, d.h. in Waschmittel-Zusammensetzungen zum Unterstützen der Entfernung von Schmutz oder gräulichen Ablagerungen (siehe z.B. G.B.-Anmeldungen Nr. 2 075 028, 2 095 275 und 2 094 826), oder in der Behandlung von Textilien vor dem Verkauf zur Verbesserung des Gefühlseindrucks und des Aussehens des Textils verwendet. So veranschaulicht die G.B.-Anmeldung Nr. 1 358 599 die Verwendung von Cellulase in Waschmitteln zur Verringerung der Rauhigkeit baumwollhaltiger Textilien.
Cellulasen wurden auch in der Behandlung von Textilien eingesetzt, um gebrauchte Textilien zu rekonditionieren, indem deren Farben kräftiger gemacht werden (siehe z.B. The Shizuoka Prefectural Hammamatsu Textile Industrial Research Institute Report, Band 24, S. 54–61 (1986)). Zum Beispiel führt das wiederholte Waschen von baumwollhaltigen Textilien zu einem gräulichen Belag auf dem Kleidungsstück, welcher angenommenermaßen aufgrund zerstörter und ungeordneter Fibrillen zu Stande kommt, welche manchmal als "Pills" bezeichnet werden, was durch mechanische Einwirkung verursacht wird. Dieser gräuliche Belag ist besonders auf gefärbten Textilien bemerkbar. Als eine Folge ist das Vermögen von Cellulase, die in Unordnung geratene Oberseitenschicht der Faser zu entfernen und somit das Gesamtaussehen der Textilie zu verbessern, von Nutzen gewesen.
Wegen ihrer Effektivität in vielen industriellen Verfahren bestand auf dem Fachgebiet ein Trend, nach spezifischen Cellulasezusammensetzungen oder Komponenten zu suchen, welche besonders effektive Leistungsprofile in Bezug auf eine oder mehrere spezifische Anwendungen besitzen. Als mögliche Quellen von Cellulasen konzentrierten sich die Fachleute auf Pilze und Bakterien. Zum Beispiel erfuhr Cellulase, welche von bestimmten Pilzen, wie Trichoderma spp. (insbesondere Trichoderma reesei) hergestellt wurde, viel Aufmerksamkeit, weil ein komplettes Cellulasesystem, welches zum Abbauen kristalliner Formen von Cellulose in der Lage ist, leicht in großen Mengen mittels Fermentationsvorgehensweisen hergestellt wird. Dieser spezifische Cellulasekomplex ist umfassend analysiert worden, um die Natur seiner spezifischen Komponenten und das Vermögen dieser Komponenten, Leistung in industriellen Verfahren aufzuzeigen, zu bestimmen (siehe Wood et al., "Methods in Enzymology", 160, 25, Seiten 234 ff. (1988)). Das U.S.-Patent Nr. 5 475 101 (Ward et al.) offenbart die Reinigung und molekulare Klonierung eines besonders nützlichen Enzyms, das Endoglucanase III (EGIII) genannt wird, welches aus Trichoderma reesei abgeleitet wird.
Die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94/14953 offenbart Endoglucanasen, welche von einer Nukleinsäure codiert werden, welche eine beliebige einer Reihe von DNA-Sequenzen, welche jeweils 20 Nukleotide aufweisen, umfasst.
Ooi et al., Curr. Genet. 18: 217–222 (1990), offenbaren die cDNA-Sequenz, codierend für Endoglucanase F1-CMC, hergestellt von Aspergillus aculeatus, welche die Aminosäurefolgen NNLWG, ELMIW und GTEPFT enthält. Sakamoto et al., Curr. Genet. 27: 435–439 (1995), offenbart die cDNA-Sequenz, codierend die Endoglucanase CMCase-1 aus Aspergillus kawachii IFO 4308, welche die Aminosäurefolgen ELMIW und GTEPFT enthält. Ward et al. offenbart die Sequenz von EGIII, welche die Aminosäurefolgen NNLWG, ELMIW und GTEPFT aufweist. Zusätzlich dazu werden zwei Cellulase-Sequenzen, eine aus Erwinia carotovara und Rhodothermus marinus in Saarilahti et al., Gene 90: 9–14 (1990), und Hreggvidsson et al., Appl. Environ. Microb. 62: 3047–3049 (1996), offenbart, welche die Aminosäurefolge ELMIW enthalten.
Trotz der Kenntnis im Fachgebiet in Bezug auf viele Cellulasezusammensetzungen mit Anwendungen in manchen oder allen der oben genannten Gebiete besteht ein fortgesetzter Bedarf nach neuen Cellulasezusammensetzungen, welche eine verbesserte Stabilität unter Bedingungen aufweisen, die in Anwendungen herrschen, für welche Cellulasen brauchbar sind, z.B. Haushalts- und Wäschereinigungsmittel und Textilbehandlungs-Zusammensetzungen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine variante EGIII- oder EGIII-ähnliche Cellulase wird bereitgestellt, wobei die Variante eine Substitution mit einem Valinrest an einer Position, entsprechend dem Rest A35 in EGIII von Trichoderma reesei umfasst, wobei die Variante nicht Emericella desertorum-EGIII-ähnliche Cellulase ist. In einem Aspekt dieser Ausführungsform leitet sich die Cellulase aus einem Pilz, Bakterien oder einem Actinomyceten ab. In einem stärker bevorzugten Aspekt leitet sich die Cellulase aus einem Pilz ab. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist der Pilz ein filamentöser Pilz. Es ist bevorzugt, dass der filamentöse Pilz zu den Euascomyceten, insbesondere Aspergillus spp., Gliocladium spp., Fusarium spp., Acremonium spp., Myceliophthora spp., Verticillium spp., Myrothecium spp. oder Penicillium spp., gehört. Ebenfalls vorgesehen ist eine variante EGIII-ähnliche Cellulase, wobei die Variante folgendes umfasst:

a) eine Substitution mit einem Tyrosinrest an einer Position, entsprechend dem Rest W7 in EGIII von Trichoderma reesei und/oder eine Substitution mit einem Glutaminsäurerest an einer Position, entsprechend dem Rest T145 in EGIII von Trichoderma reesei, wobei die Variante nicht EGIII-ähnliche Cellulase von Hypocrea schweinitzii, Aspergillus aculeatus, Apergillus kawachii (1), Aspergillus kawachii (2), Aspergillus oryzae, Humicola grisea, Humicola insolens, Fusarium equiseti, Gliocladium roseum (1), Gliocladium roseum (3), Gliocladium roseum (4), Memnoniella echinata, Actinomycete 11AG8, Streptomyces lividans CelB oder Rhodothermus marinus ist; und/oder
b) eine Substitution oder Deletion an einer Position, entsprechend dem Rest Y147 in EGIII von Trichoderma reesei, wobei die Variante nicht EGIII-ähnliche Cellulase von Aspergillus aculeatus, Apergillus kawachii (1), Aspergillus kawachii (2), Aspergillus oryzae, Humicola grisea, Humicola insolens, Chaetomium brasilliense, Fusarium equiseti, Gliocladium roseum (1), Gliocladium roseum (2), Gliocladium roseum (3), Gliocladium roseum (4), Actinomycete 11AG8, Streptomyces lividans CelB, Rhodothermus marinus oder Erwinia carotovara ist,

In einem Aspekt dieser Ausführungsformen ist die Cellulase eine Endoglucanase.
In einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine DNA, welche eine EGIII-Variante codiert, vorgesehen. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die DNA in einem Vektor vor. In einer weiteren Ausführungsform wird der Vektor zum Transformieren einer Wirtszelle verwendet. In einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung wird ein Verfahren zur Herstel lung einer EGIII-Varianten-Cellulase bereit gestellt. Das Verfahren umfasst die Schritte des Kultivierens der Wirtszelle gemäß Anspruch 11 in einem geeigneten Kulturmedium unter geeigneten Bedingungen zur Herstellung der Cellulase und des Erhaltens der hergestellten Cellulase.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird eine Reinigungsmittelzusammensetzung, umfassend ein Tensid und eine variante Cellulase der Erfindung, vorgesehen. In einem bevorzugten Aspekt dieser Erfindung ist das Reinigungsmittel ein Wäschewaschmittel oder ein Geschirrspülmittel. In einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung wird die variante EGIII- oder EGIII-ähnliche Cellulase in der Behandlung einer Cellulose enthaltenden Textilie verwendet, insbesondere beim 'Stonewashing' von Indigo-gefärbtem Denim. Alternativ dazu kann die Cellulase der Erfindung als ein Futterzusatzstoff, in der Behandlung von Holz-Zellstoff und bei der Reduktion von Biomasse zu Glukose verwendet werden.
Die Erfindung sieht weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer Enzymvariante aus EGIII- oder EGIII-ähnlicher Cellulase vor, umfassend das Substituieren mit einem Valinrest an einer Aminosäureposition in der EGIII- oder EGIII-ähnlichen Cellulase, entsprechend A35 in Trichoderma reesei-EGIII, durch:

a) Modifizieren einer DNA-Sequenz, welche die EGIII- oder EGIII-ähnliche Cellulase codiert;
b) Transformation dieser DNA-Sequenz in einen geeigneten Wirt; und
c) Expression der modifizierten DNA-Sequenz zur Bildung des Varianten-Enzyms.

Ebenfalls vorgesehen ist ein Verfahren zur Herstellung einer Enzymvariante aus EGIII-ähnlicher Cellulase, umfassend das Substituieren mit einem Tyrosinrest an einer Aminosäureposition in der EGIII-ähnlichen Cellulase, entsprechend W7 in EGIII von Trichoderma reesei, und/oder Substituieren mit einem Glutaminsäurerest an einer Aminosäureposition in der EGIII-ähnlichen Cellulase, entsprechend T145 in EGIII von Trichoderma reesei, und/oder Substituieren oder Deletieren einer Aminosäure an der Position in der EGIII-ähnlichen Cellulase, entsprechend Y147 in EGIII von Trichoderma reesei, durch:

a) Modifizieren einer DNA-Sequenz, welche die EGIII-ähnliche Cellulase codiert;
b) Transformation dieser DNA-Sequenz in einen geeigneten Wirt; und
c) Expression der modifizierten DNA-Sequenz zur Bildung des Varianten-Enzyms;

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 veranschaulicht die Aminosäuresequenz von reifem EGIII-Protein aus Trichoderma reesei, wobei die gemäß der vorliegenden Erfindung beschriebenen Reste gezeigt sind.
Die 2 veranschaulicht die DNA-Sequenz von EGIII aus Trichoderma reesei ohne Introns.
Die 3 veranschaulicht eine Alignierung der Volllängensequenz von 20 EGIII-ähnlichen Cellulasen in Parallel-Übereinanderstellung mit EGIII, wobei äquivalente Reste auf der Basis einer Primärsequenz-Modellierung angezeigt werden, einschließlich derjenigen, abgeleitet aus Trichoderma reesei, Hypocrea schweinitzii, Aspergillus aculeatus, Apergillus kawachii (1), Aspergillus kawachii (2), Aspergillus oryzae, Humicola grisea, Humicola insolens, Chaetomium brasilliense, Fusarium equiseti, Fusarium javanicum (1), Fusarium javanicum (2), Gliocladium roseum (1), Gliocladium roseum (2), Gliocladium roseum (3), Gliocladium roseum (4), Memnoniella echinata, Emericella desertorum, Actinomycete 11AG8, Streptomyces lividans CelB, Rhodothermus marinus und Erwinia carotovara.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Anmelder haben neue Mitglieder einer Familie von Cellulasen isoliert, welche Homologie zu EGIII aus Trichoderma reesei aufweisen. Die Analyse dieser Cellulasen hat zu einem differenziellen Leistungsverhalten unter den Cellulasen geführt, trotz der signifikanten Homologie. Insbesondere wurde festgestellt, dass die EGIII-ähnlichen Cellulasen aus Humicola insolens, Humicola grisea, Memnonella echinata, Fusarium javanicum und Emericella desertorum eine höherwertige Leistung unter Bedingungen einer Wärmebelastung aufweisen. Durch Alignieren der Aminosäuresequenzen in diesen EGIII-ähnlichen Cellulasen mit derjenigen von EGIII ist es möglich, Rest-Unterschiede zwischen den thermisch stabileren Cellulasen und EGIII zu identifizieren, wodurch Reste identifiziert werden, welche wichtig für die verbesserte thermische Stabilität von EGIII-ähnlichen Cellulasen sind. Folglich ist es, durch Optimieren der identifizierten Reste in EGIII sowie in den EGIII-ähnlichen Cellulasen, möglich, die Wärmestabilität sowohl der EGIII- als auch der EGIII-ähnlichen Cellulasen weiter zu verbessern.
Das verbesserte Protein gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst eine Aminosäuresequenz, welche aus der Aminosäuresequenz eines Vorläuferproteins abgeleitet ist. Das Vorläuferprotein kann ein natürlich vorkommendes Protein oder ein rekombinantes Protein sein. Die Aminosäuresequenz des verbesserten Proteins wird aus der Aminosäuresequenz des Vorläuferprote ins durch die Substitution, Deletion oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren der Vorläufer-Aminosäuresequenz abgeleitet. Eine solche Modifikation erfolgt generell eher an der Vorläufer-DNA-Sequenz, welche die Aminosäuresequenz der Vorläuferproteine codiert, anstatt als Manipulation des Vorläuferproteins an sich. Geeignete Verfahren für eine derartige Manipulation der Vorläufer-DNA-Sequenz schließen Verfahren ein, welche hierin und in den, in Gemeinbesitz befindlichen, U.S.-Patenten Nr. 4 760 025 und 5 185 258 offenbart werden, welche hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind.
Sequenz-Alignierungen können unter Verwendung von verschiedenen EGIII-ähnlichen Cellulasen aufgestellt werden, und können geringfügig von einer Alignierung zu einer anderen abweichen, abhängig von der Anzahl an Sequenzen und dem Grad der Homologie. Geeignete Experimente zum Bestimmen passender Modifikationen sind für den Durchschnittsfachmann im Zusammenhang mit der vorliegenden Beschreibung eine Routineangelegenheit.
Innerhalb der Beschreibung werden bestimmte Begriffe offenbart, welche nachstehend definiert sind, um die Beschaffenheit der beanspruchten Erfindung zu verdeutlichen.
"Cellulase" ist eine gut klassifizierte Kategorie von Enzymen im Fachgebiet und schließt Enzyme ein, fähig zum Hydrolysieren von Cellulosepolymeren zu kürzeren Cellooligosaccharid-Oligomeren, Cellobiose und/oder Glukose. Übliche Beispiele für Cellulase-Enzyme schließen Exo-Cellobiohydrolasen und Endoglucanasen ein und sind aus vielen Spezies von cellulolytischen Organismen erhältlich, insbesondere einschließlich Pilzen und Bakterien.
"EGIII"-Cellulase bezieht sich auf die Endoglucanase-Komponente, welche beschrieben wird in Ward et al., U.S.-Patent Nr. 5 475 101, und "Proceedings on the Second TRICEL Symposium on Trichoderma Reesei Cellulases And Other Hydrolases", Hrsg.: Suominen & Reinikainen, Espoo Finnland (1993), S. 153–158 (Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research, Bd. 8). Wie darin offenbart, wird EGIII aus Trichoderma reesei abgeleitet und ist durch ein pH-Optimum von etwa 5,8, einen isoelektrischen Punkt (pI) von etwa 7,4 und ein Molekulargewicht von etwa 25 kD gekennzeichnet. Das üblicherweise als EGII bezeichnete Enzym aus Trichoderma reesei ist früher in der Literatur von manchen Autoren mittels der Nomenklatur EGIII bezeichnet worden, aber dieses Enzym unterscheidet sich wesentlich von dem Enzym, welches hierin hinsichtlich Molekulargewicht, pI und pH-Optimum als EGIII definiert wird.
"EGIII-ähnliches Enzym", "EGIII-ähnliches Protein" oder "EGIII-ähnliche Cellulase" gemäß der vorliegenden Erfindung bedeuten Enzyme, welche mit EGIII verwandt sind, dadurch, dass sie gewisse Aminosäurefolgen mit EGIII gemeinsam haben. Wie hierin verwendet, wird mit EGIII-ähnliche Cellulase ebenfalls beabsichtigt, EGIII aus Trichoderma reesei einzuschließen. Somit umfasst eine EGIII-ähnliche Cellulase ein Enzym mit cellulolytischer Aktivität, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die darin eine Aminosäurefolge umfasst, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem oder mehreren von:

1) Asn-Asn-(Leu/Phe/Lys/Ile)-Trp-Gly
2) Glu-(Leu/Phe/Ile)-Met-Ile-Trp
3) Gly-Thr-Glu-Pro-Phe-Thr;
4) (Ser/Tyr/Cys/Trp/Thr/Asn/Lys/Arg)-(Val/Pro)-(Lys/Ala)-(Ser/Ala)-(Tyr/Phe); und
5) Lys-Asn-Phe-Phe-Asn-Tyr.

In einer Ausführungsform weist das Enzym der Erfindung ferner signifikante strukturelle und/oder Sequenz-Homologie zu EGIII auf. Somit besitzt, in einem Aspekt dieser Ausführungsform der Erfindung, das Enzym wenigstens 30%, vorzugsweise wenigstens 40% und am stärksten bevorzugt wenigstens 60% Aminosäureidentität zu EGIII. Es sollte jedoch erkannt werden, dass Homologie allein oft nicht ein geeignetes Maß dafür ist, ob ein bestimmtes Enzym, das durch die hierin beschriebenen Verfahren identifiziert wird, ein EGIII-ähnliches Enzym darstellt. Eine ähnliche enzymatische Funktion mit oder ohne verringerte Homologie kann eine EGIII-ähnliche Cellulase identifizieren. Folglich sollte, obgleich homologe Enzyme eigentlich durch die hierin beschriebenen und beispielhaft angegebenen Verfahren detektiert werden, der Grad an Homologie nicht als den Umfang der Erfindung einschränkend angesehen werden.
Es wird davon ausgegangen, dass EGIII-ähnliche Cellulasen der Erfindung in vielen Organismen gefunden werden können, welche Cellulase herstellen. Allerdings schließen wahrscheinliche Quellen von EGIII-ähnlicher Cellulase diejenigen ein, welche sich ableiten aus einem Bakterium oder Pilz, und genauer gesagt aus einem Actinomyceten, einem Bacillus oder einem filamentösen Pilz. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Cellulase aus der filamentösen Pilz-Familie Metazoa, vorzugsweise Euascomycetes, abgeleitet. Innerhalb der Metazoa schließen phylogenetische Pilz-Klassifikationen, welche EGIII-ähnliche Cellulasen herstellen, die mitosporischen Pyrenomyceten (einschließlich Acremonium), Sordariales (einschließlich Thielavia), Hypocreales (einschließlich Nectriaceae, wie Fusarium, Necitia, Verticillium, Myrothecium und Gliocladium; und Hypocrea) und Eurotiales (einschließlich mitosporischen Trichocomaceae, wie Aspergillus und Penicillium) ein.
Der Euascomycet gehört vorzugsweise den Diaporthales, Halosphaeriales, Microascales, Ophiostomatales, Phyllachorales, Sordariales oder Xylariales an. Ebenfalls bevorzugt gehört der Euascomycet den Hypocreales an, umfassend Clavicipitaceae, Melanosporaceae, Nectria ceae, Niessliaceae oder mitosporische Hypocreales. Weiter bevorzugt gehört der Euascomycet den Hypocreaceae an, wobei die Hypocreaceae nicht Trichoderma umfassen. Am stärksten bevorzugt handelt es sich bei dem Euascomyceten um Gliocladium spp., Fusarium spp., Acremonium spp., Myceliophtora spp., Verticillium spp., Myrothecium spp., Penicillum spp., Chaetomium spp., Emercella spp., und Phanerochaete spp. Spezifische Organismen, welche in Betracht gezogen werden als EGIII-ähnliche Cellulasen aufweisend, schließen Chaetomium thermophilum var. therm., Chaetomium atrobrunneum, Chaetomium brasiliense, Chaetomium globosum, Chaetomium vitellium, Paecilomyces lilacinus, Chaetomium thermophilum vr. dissitum, Humicola insolens, Humicola brevis, Memnoniella echinata, Fusarium equiseti, Fusarium oxysporum, Fusarium stilboides, Myceliophthora thermophila, Fusarium javanicum, Humicola grisea vr. thermoidea, Stibella thermophila, Melanocarpus albomyces, Arthrobotrys superba, Myceliophthora hinunilea, Chaetomium pachypodiodes, Myrothecium verrucaria, Penicillium crysogenum, Malbranchea sulfurea, Lunulospora curvula, Emericella desertorum, Acremonium strictum, Cylindrocarpon heteronema und Ulocladium chartarum ein. Innerhalb der Actinomyceten scheint Streptomyces EGIII-ähnliche Cellulasen zu besitzen.
EGIII-ähnliche Cellulasen gemäß der Erfindung können gemäß der folgenden Verfahren erhalten werden. Degenerierte DNA-Primer werden konstruiert, welche eine Aminosäuresequenz codieren, gewählt aus der Gruppe, die aus einem oder mehreren von:

Die degenerierten Primer können als Hybridisierungssonden gegen eine genomische Bibliothek verwendet werden, die aus einem Zielorganismus erhalten wird, um zu analysieren, ob ein gegebenes Fragment zu einer ähnlichen Sequenz in dem Zielorganismus korreliert ist. Ein nützlicher Hybridisierungs-Assay ist wie folgend beschaffen: Genomische DNA aus einer jeweiligen Zielquelle wird durch Verdau mit einem Restriktionsenzym(en), z.B. EcoRI, HindIII, BamHI, ClaI, KpnI, MluI, SpeI, BglII, NcoI, XbaI, XhoI und XmaI (geliefert von New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, und Boehringer Mannheim) gemäß den Anweisungen der Hersteller fragmentiert. Die Proben werden dann durch ein Agarose-Gel (wie zum Beispiel 0,7% Agarose) so elektrophoretisiert, dass eine Trennung von DNA-Fragmenten der Größe nach sichtbar gemacht werden kann. Das Gel kann kurz in destilliertem H₂O gespült und anschließend in einer geeigneten Lösung (wie beispielsweise 0,25 M HCl) unter vorsichtigem Schütteln depuriniert werden, gefolgt von 30 Minuten langer Denaturierung (in zum Beispiel 0,4 M NaOH). Ein Renaturierungsschritt kann eingeschlossen werden, in welchem das Gel bei sanftem Schütteln in 1,5 M NaCl, 1 M Tris, pH 7,0, während 30 Minuten eingebracht wird. Die DNA wird dann auf eine geeignete, positiv geladene Membran überführt, zum Beispiel die Maximum Strength Nytran Plus-Membran (Schleicher & Schuell, Keene, N.H.), wobei eine Transferlösung verwendet wird (wie zum Beispiel 6 × SSC (900 mM NaCl, 90 mM Trinatriumcitrat)). Nachdem der Transfer vollständig ist, im Allgemeinen nach etwa 2 Stunden oder mehr, wird die Membran gespült (zum Beispiel in 2 × SSC [2 × SSC = 300 mM NaCl, 30 mM Trinatriumcitrat]) und bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Die Membran wird dann (etwa 2 Stunden lang oder mehr) in einer geeigneten Vorhybridisierungslösung (wie zum Beispiel eine wässrige Lösung, enthaltend pro 100 ml: 30–50 ml Formamid, 25 ml 20 × SSPE (1 × SSPE = 0,18 M NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM NaH₂PO₄, pH 7,7), 2,5 ml 20% SDS und 1 ml von 10 mg/ml gescherter Heringssperma-DNA) prähybridisiert.
Eine DNA-Sonde, entsprechend den obenstehenden Primer-Sequenzen, wird durch Elektrophorese in einem Agarose-Gel isoliert, das Fragment aus dem Gel ausgeschnitten und aus der ausgeschnittenen Agarose gewonnen. Dieses gereinigte DNA-Fragment wird dann markiert (zum Beispiel unter Verwendung des Megaprime-Markierungssystems gemäß den Anweisungen des Herstellers zum Einbauen von P³² in die DNA (Amersham International PLC, Buckinghamshire, England)). Die markierte Sonde wird durch Erhitzen auf 95°C während 5 Minuten denaturiert und unverzüglich zu der oben genannten Vorhybridisierungslösung, welche die Membran enthält, zugesetzt. Die Hybridisierungsreaktion sollte während einer angemessenen Zeit und unter passenden Bedingungen, zum Beispiel 18 Stunden lang bei 37°C unter vorsichtigem Schütteln vor sich gehen. Die Membran wird gespült (zum Beispiel in 2 × SSC/0,3% SDS) und dann mit einer geeigneten Waschlösung und bei vorsichtigem Bewegen gewaschen. Die gewünschte Stringenz wird eine Reflexion der Bedingungen sein, unter welchen die Membran (Filter) gewaschen wird.
Spezifisch wird die Stringenz einer gegebenen Reaktion (d.h. der Grad an Homologie, der für eine erfolgreiche Hybridisierung notwendig ist) in großem Maße von den Waschbedingungen abhängen, an welche der Filter aus dem Southern-Blot nach der Hybridisierung unterzogen wird. "Niedrig-Stringenz"-Bedingungen, wie hierin definiert, werden das Waschen eines Filters aus einem Southern-Blot mit einer Lösung von 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 20°C während 15 Minuten umfassen. Standard-Stringenz-Bedingungen umfassen einen weiteren Waschschritt, umfassend das Waschen des Filters aus dem Southern-Blot für ein zweites Mal mit einer Lösung von 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 37°C während 30 Minuten.
In einer bevorzugten Ausführungsform gemäß dieses Aspekts der Erfindung werden degenerierte Primer hergestellt, entsprechend einem oder mehreren der obenstehenden Peptide. Die Primer werden mit einer genomischen DNA aus einem Zielorganismus (d.h. dem Organismus, in welchem die EGIII-ähnliche Cellulase gesucht wird) unter Bedingungen kombiniert, die zum Einleiten einer standardmäßigen PCR-Reaktion geeignet sind. In dieser Ausführungsform ist es vorteilhaft, degenerierte Primer zu wählen, entsprechend den Peptiden (a) und/oder (d), sowie Primer, entsprechend zu (c) und/oder (e), und DNA mit diesen Primern zu amplifizieren. Nachdem die PCR-Reaktion durchgeführt worden ist, wird die resultierende DNA auf einem Polyacrylamidgel laufen gelassen, und Banden, welche hinsichtlich der Größe dem EGIII-Fragment entsprechen, umfassend die Peptide (a) und/oder (d) zusätzlich zu (c) und/oder (e), d.h. diejenigen im Bereich von 400–1000 Basenpaaren, werden ausgewählt. Diese Fragmente werden vereinigt und unter Verwendung von Primern, entsprechend den Peptiden (a) und/oder (d), sowie Primern, entsprechend Peptid (b), oder in alternativer Weise unter Verwendung von Primern entsprechend Peptid (c) und/oder (e), sowie Primern entsprechend dem Peptid (b), erneut amplifiziert. Starke Banden der erwarteten Größe (im Falle von EGIII-ähnlichen Cellulasen werden die Banden ungefähr 250–500 Basenpaaren entsprechen) werden herausgeschnitten und sequenziert. Die isolierten Sequenzen werden dann verwendet, um Primer zu entwerfen, und diese Primer werden mittels z.B. "rascher Amplifikation von genomischen DNA-Enden" (RAGE) verwendet, um das Volllängen-Gen zu erhalten, siehe z.B. Mizobuchi et al., BioTechniques, 15: 215–216 (1993).
Die DNA, welche mit den obenstehend umrissenen DNA-Primern hybridisiert, und somit – identifiziert durch dieses Verfahren – ein entsprechendes EGIII codierendes Gen, können mittels Routineverfahren isoliert und verwendet werden, um die entsprechende EGIII-ähnliche Cellulase gemäß Routinetechniken zu exprimieren. Nach Erhalten des klonierten Gens werden Routineverfahren zum Einfügen der DNA in einen Vektor, welcher dann in eine geeignete Wirtszelle transformiert werden kann, angewandt. Das Kultivieren der transformierten Wirts zelle unter geeigneten Bedingungen führt dann zur Produktion der EGIII-ähnlichen Cellulase, welche erhalten, gereinigt und präpariert werden kann, wie es für eine jeweilige Anwendung notwendig ist.
Die EGIII-ähnlichen Cellulasen der Erfindung sind vorzugsweise isoliert oder gereinigt. Im Kontext der vorliegenden Erfindung bedeutet Reinigung oder Isolierung im Allgemeinen, dass die EGIII-ähnliche Cellulase von ihrem natürlichen Zustand vermittels der Trennung der EGI-II-ähnlichen Cellulase von einigen oder allen der natürlich vorkommenden Substituenten, mit denen sie in der Natur assoziiert ist, z.B. dem Herkunftsorganismus oder anderen Cellulasen oder Enzymen, welche von dem Herkunftsorganismus zusammen mit der EGIII-Zelle exprimiert werden, verändert wird. In ähnlicher Weise können die EGIII-ähnlichen Cellulasen der Erfindung mit anderen Komponenten vereinigt werden, welche nicht natürlicherweise in dem natürlichen Zustand vorhanden sind. Die Isolierung oder Reinigung kann durch im Fachgebiet anerkannte Trennungstechniken bewerkstelligt werden, wie Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, hydrophobe Abtrennung, Dialyse, Proteasebehandlung, Ammoniumsulfat-Präzipitation oder andere Protein-Salzfällungs-Techniken, Zentrifugation, Größenausschluss-Chromatographie, Filtration, Mikrofiltration, Gel-Elektrophorese oder Trennung auf einem Gradienten zur Entfernung von gesamten Zellen, Zelltrümmern, Verunreinigungen, fremden Proteinen oder in der Endzusammensetzung unerwünschten Enzymen.
Ein Rest in einer EGIII-ähnlichen Cellulase, welcher "entsprechend" oder "äquivalent" zu einem Rest ist, der in EGIII vorhanden ist, bedeutet einen Rest, welcher in einer äquivalenten Position zu derjenigen in EGIII existiert, wie angezeigt durch Primärsequenzhomologie, Tertiärstruktur-Homologie (wie gezeigt, z.B. durch Kristallstruktur oder Computermodellierung) oder funktionelle Äquivalenz. Eine variante EGIII-ähnliche Cellulase besitzt eine Aminosäuresequenz, welche von der Aminosäuresequenz einer EGIII-ähnlichen Vorläufer-Cellulase abgeleitet ist. Die Vorläufer-Cellulasen schließen natürlich vorkommende Cellulasen und rekombinante Cellulasen (wie hierin definiert) ein. Die Aminosäuresequenz der EGIII-ähnlichen Cellulase-Variante wird aus der Aminosäuresequenz der EGIII-ähnlichen Vorläufer-Cellulase durch die Substitution, Deletion oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren der Vorläufer-Aminosäuresequenz abgeleitet. Eine solche Modifikation erfolgt eher an der Vorläufer-DNA-Sequenz, welche die Aminosäuresequenz der Vorläufer-Cellulase codiert, anstatt als Manipulation des Vorläufer-Cellulase-Enzyms selbst. Geeignete Verfahren für eine derartige Manipulation der Vorläufer-DNA-Sequenz schließen Verfahren ein, welche hierin und in den in Gemeinbesitz befindlichen U.S.-Patenten 4 760 025 und 5 185 258 offenbart werden. Spezifische Reste, entsprechend den Positionen, welche für die Instabilität in Gegenwart von Tensid verantwortlich sind, werden hierin für eine Substitution oder Deletion identifiziert. Die Aminosäure-Positionsnummer (z.B. +35) bezieht sich auf die Nummer, welche der reifen Trichoderma reesei-EGIII-Sequenz zugewiesen wird, die in der 1 präsentiert ist. Die Erfindung richtet sich auf die Mutation von EGIII-ähnlichen Cellulasen, welche Aminosäurereste an Positionen enthalten, welche äquivalent zu dem jeweilig identifizierten Rest in Trichoderma reesei-EGIII sind. Ein Rest (Aminosäure) einer Vorläufer-Cellulase ist äquivalent zu einem Rest von Trichoderma reesei-EGIII, wenn er entweder homolog (d.h. hinsichtlich Position in entweder Primär- oder Tertiärstruktur entsprechend) oder funktionell analog zu einem spezifischen Rest oder Teil dieses Restes in Trichoderma reesei-EGIII ist (d.h. dieselbe oder eine ähnliche funktionelle Fähigkeit, zu kombinieren, reagieren oder chemisch oder strukturell zu interagieren, aufweist). Wie hierin verwendet, wird mit der Nummerierung beabsichtigt, jener der reifen EGIII-Aminosäuresequenz zu entsprechen, wie sie in der 1 veranschaulicht ist.
Homologe Proteine können auch durch Verwendung eines "Sequenzvergleichsalgorithmus" bestimmt werden. Eine optimale Alignierung von Sequenzen zum Vergleich kann z.B. durch den lokalen Homologie-Algorithmus von Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); durch den Homologie-Alignierungs-Algorithmus von Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970); durch das Ähnlichkeitssuche-Verfahren von Pearson & Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988); durch die computerisierten Implementationen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA in dem Wisconsin Genetics-Software-Paket, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch visuelle Überprüfung durchgeführt werden.
Ein Beispiel für einen Algorithmus, der zum Bestimmen von Sequenzähnlichkeit geeignet ist, ist der BLAST-Algorithmus, der in Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403–410 (1990), beschrieben wird. Software zum Durchführen von BLAST-Analysen ist über das National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) öffentlich erhältlich. Dieser Algorithmus beinhaltet zuerst das Identifizieren von hochbewerteten Sequenzpaaren (HSPs) durch Identifizieren von kurzen Wörtern der Länge W in der Suchsequenz, welche entweder einem positiv bewerteten Schwellenwert T entsprechen oder diesem genügen, wenn sie mit einem Wort derselben Länge in einer Datenbanksequenz aligniert werden. Diese anfänglichen Nachbarschafts-Worttreffer fungieren als Ausgangspunkte für das Auffinden von längeren HSPs, welche diese enthalten. Die Worttreffer werden in beiden Richtungen entlang jeder der zwei verglichenen Sequenzen so weit verlängert, wie die kumulative Alignierungs-Bewertung erhöht werden kann. Die Verlängerung der Worttreffer wird angehalten, wenn: die kumulative Alignierungs-Bewertung um die Größe X von einem maximal erzielten Wert abfällt; die kumulative Bewertung gleich Null oder niedriger wird; oder das Ende von einer der beiden Sequenzen erreicht ist. Die BLAST-Algorithmus-Parameter W, T und X bestimmen die Empfindlichkeit und Geschwindigkeit der Alignierung. Das BLAST-Programm verwendet als Standards eine Wortlänge (W) von 11, die BLOSUM62-Bewertungsmatrix (siehe Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)), Alignierungen (B) von 50, eine Erwartung (E) von 10, M'5, N'-4 und einen Vergleich beider Stränge.
Der BLAST-Algorithmus führt dann eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch (siehe z.B. Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873–5787 (1993)). Ein Maß der Ähnlichkeit, welches von dem BLAST-Algorithmus vorgesehen wird, ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), welche eine Anzeige der Wahrscheinlichkeit liefert, mit welcher eine Übereinstimmung zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen zufällig auftreten würde. Zum Beispiel wird eine Aminosäuresequenz als ähnlich zu einer Protease betrachtet, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit in einem Vergleich der Test-Aminosäuresequenz zu einer Protease-Aminosäuresequenz geringer als etwa 0,1, weiter bevorzugt geringer als etwa 0,01 und am stärksten bevorzugt geringer als etwa 0,001 ist.
"Äquivalente Reste" können auch definiert werden durch Bestimmen von Homologie auf der Ebene der Tertiärstruktur für eine Vorläufer-Protease, deren Tertiärstruktur durch Röntgen-Kristallographie bestimmt worden ist. Äquivalente Reste werden definiert als solche, für welche die Atomkoordinaten von zwei oder mehr der Hauptkettenatome eines jeweiligen Aminosäurerestes einer Cellulase und T. reesei-EGIII (N auf N, CA auf CA, C auf C und O auf O) innerhalb von 0,13 nm und vorzugsweise 0,1 nm nach der Fluchtung bzw. deckenden Ausrichtung liegen. Die Fluchtung wird erzielt, nachdem das beste Modell orientiert und positioniert worden ist, um die maximale Überlappung von Atomkoordinaten von Nicht-Wasserstoff-Proteinatomen der fraglichen Cellulase zu der T. reesei-EGIII zu ergeben. Das beste Modell ist das kristallographische Modell, das den niedrigsten R-Faktor für experimentelle Beugungsdaten bei der höchsten verfügbaren Auflösung ergibt.
Äquivalente Reste, welche funktionell analog zu einem spezifischen Rest von T.reesei-EGIII sind, werden als diejenigen Aminosäuren einer Cellulase definiert, welche eine solche Konformation einnehmen können, dass sie Proteinstruktur, Substrat-Bindung oder Katalyse entweder abändern, modifizieren oder dazu beitragen, und zwar in einer Weise, die von einem spezifischen Rest von T.reesei-EGIII definiert wird und diesem zugeschrieben wird. Ferner sind sie diejenigen Reste der Cellulase (für welche eine Tertiärstruktur durch Röntgen-Kristallographie erhalten worden ist), welche eine analoge Position zu dem Ausmaß besetzen, dass, obwohl die Hauptkettenatome des gegebenen Restes den Äquivalenzkriterien auf der Basis des Besetzens einer homologen Position nicht genügen mögen, die Atomkoordinaten von mindestens zwei der Seitenkettenatome des Restes innerhalb von 0,13 nm der entsprechenden Seitenkettenatome von T.reesei-EGIII liegen. Die Kristallstruktur von T.reesei-EGIII wird vorgestellt in "The Protein Society, Vierzehntes Symposium San Diego, CA. 5.–9. August 2000", dessen Offenbarung durch den Bezug darauf in ihrer Gesamtheit einbezogen wird. Die Koordinaten von CelB von Streptomyces lividans, einem homologen Vertreter der Familie12-Glycosylhydrolasen sind in Sulzenbacher, et al., Biochemistry 36: 6032 (1997), und in Sulzenbacher, et al., Biochemistry 38: 4826 (1999), angegeben.
"Variante" bedeutet ein Protein, welches aus einem Vorläuferprotein (z.B. dem nativen Protein) durch Addition einer oder mehrere Aminosäuren entweder an einem oder beiden von dem C- und N-terminalen Ende, Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren an einer oder einer Anzahl von verschiedenen Stelle(n) in der Aminosäuresequenz, Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren an einem oder beiden Enden des Proteins oder an einer oder mehreren Stellen in der Aminosäuresequenz, oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen in der Aminosäuresequenz abgeleitet wird. Die Herstellung einer Enzymvariante wird vorzugsweise durch Modifizieren einer DNA-Sequenz, welche für das native Protein codiert, Transformation dieser DNA-Sequenz in einen geeigneten Wirt und Expression der modifizierten DNA-Sequenz zur Bildung des abgewandelten Enzyms erreicht. Das veränderte EGIII-ähnliche Enzym der Erfindung schließt Peptide ein, umfassend veränderte Aminosäuresequenzen im Vergleich zu einer Vorläuferenzym-Aminosäuresequenz, wobei das veränderte EGIII-ähnliche Enzym die charakteristische cellulolytische Natur des Vorläuferenzyms beibehält, aber in irgendeinem spezifischen Aspekt abgeänderte Eigenschaften aufweisen kann. Zum Beispiel kann ein verändertes EGIII-ähnliches Enzym ein erhöhtes pH-Optimum oder erhöhte Temperatur- oder Oxidationsstabilität aufweisen, aber wird seine charakteristische cellulolytische Aktivität beibehalten. Es wird in Betracht gezogen, dass die Varianten gemäß der vorliegenden Erfindung aus einem DNA-Fragment, das ein EGIII-ähnliches Cellulase-Varianten-Enzym codiert, worin die funktionelle Aktivität des exprimierten Cellulase-Derivates beibehalten wird, abgeleitet werden können. Zum Beispiel kann ein DNA-Fragment, welches eine Cellulase codiert, ferner eine DNA-Sequenz oder einen Abschnitt davon einschließen, codierend ein Gelenk oder einen Linker, angeheftet an die Cellulase-DNA-Sequenz entweder am 5'- oder 3'-Ende, wobei die funktionelle Aktivität der codierten Cellulasedomäne beibehalten wird.
"Cellulose enthaltende Textilie" bedeutet jedwede genähten oder nicht-genähten Textilien, Garne oder Fasern, hergestellt aus Baumwolle oder Nicht-Baumwolle enthaltender Cellulose oder Baumwolle oder Nicht-Baumwolle enthaltenden Cellulosegemischen, einschließlich na türlichen Cellulosestoffen und vom Menschen hergestellte Cellulosestoffen (wie Jute, Flachs, Ramie, Rayon und Lyocell). Eingeschlossen unter dem Überbegriff "vom Menschen hergestellte cellulosehaltige Textilien" sind regenerierte Textilien, welche im Fachgebiet gut bekannt sind, wie Rayon. Andere vom Menschen hergestellte cellulosehaltige Textilien schließen chemisch modifizierte Cellulosefasern (z.B. Cellulose, derivatisiert mittels Acetat) und Lösungsmittel-gesponnene Cellulosefasern (z.B. Lyocell) ein. Spezifisch eingeschlossen innerhalb der Definition von cellulosehaltiger Textilie ist jedweder Garn oder Faser, welche(r) aus solchen Materialien hergestellt wird. Cellulosehaltige Materialien werden häufig in Mischungen mit Materialien eingebunden, wie synthetischen Fasern und natürlichen nicht-celluloseartigen Fasern, wie Wolle und Seide.
"Baumwollhaltige Textilie" bedeutet genähte oder ungenähte Textilien, Garne oder Fasern, die aus reiner Baumwolle oder Baumwollmischungen hergestellt sind, einschließlich Baumwoll-Webtextilien, Baumwoll-Strickwaren, Baumwoll-Denims, Baumwoll-Garnen, Roh-Baumwolle und dergleichen. Wenn Baumwollmischungen verwendet werden, beläuft sich die Menge an Baumwolle in der Textilie vorzugsweise auf wenigstens etwa 35 Gewichtsprozent Baumwolle. Bei Verwendung als Mischungen können die in der Textilie verwendeten Begleitmaterialien eine oder mehrere Nicht-Baumwoll-Fasern einschließen, einschließlich celluloseartigen oder synthetischen Fasern, wie Polyamidfasern (zum Beispiel Nylon 6 und Nylon 66), Acrylfasern (zum Beispiel Polyacrylnitrilfasern) und Polyesterfasern (zum Beispiel Polyethylenterephthalat), Polyvinylalkoholfasern (zum Beispiel Vinylon), Polyvinylchloridfasern, Polyvinylidenchloridfasern, Polyurethanfasern, Polyharnstoff-Fasern und Aramid-Fasern.
"Stonewashing-Zusammensetzung" bedeutet eine Formulierung zur Verwendung beim Stonewashing von cellulosehaltigen Textilien. Stonewashing-Zusammensetzungen werden verwendet, um Cellulose enthaltende Textilien vor der Präsentation zum Verkauf an den Verbraucher, d.h. während des Herstellungsverfahrens, zu modifizieren. Im Gegensatz dazu sind Waschmittelzusammensetzungen für die Reinigung von verschmutzter Kleidung beabsichtigt.
"Stonewashing" bedeutet die Behandlung von Cellulose enthaltenden Textilien mit einer Cellulase-Lösung unter Bewegungs- und Abrollungsbedingungen, d.h. in einer Rotationstrommel-Waschmaschine, um dem Denim ein "stonewashed"-Aussehen zu verleihen. Die Cellulaselösung gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung von Steinen in derartigen im Fach anerkannten Verfahren entweder vollständig oder teilweise funktionell ersetzen. Verfahren zum Verleihen eines "stonewashed"-Aussehens an Denim sind im U.S.-Patent Nr. 4 832 864 beschrieben. Im Allgemeinen sind Stonewashing-Techniken auf Indigo- gefärbten Baumwoll-Denim angewandt worden.
"Waschmittelzusammensetzung" bezeichnet eine Mischung, welche zur Verwendung in einem Waschmedium für das Wäschewaschen von verschmutzten cellulosehaltigen Textilien beabsichtigt ist. Im Kontext der vorliegenden Erfindung können derartige Zusammensetzungen, zusätzlich zu Cellulasen und Tensiden, zusätzliche hydrolytische Enzyme, Builder, Bleichmittel, Bleichaktivatoren, Bläuungsmittel und fluoreszierende Farbstoffe, Verklumpungsinhibitoren, Maskierungsmittel, Cellulase-Aktivatoren, Antioxidationsmittel und Solubilisierungsmittel einschließen. Derartige Zusammensetzungen werden im Allgemeinen zum Reinigen von verschmutzten Kleidern verwendet und werden nicht während des Herstellungsverfahrens eingesetzt, im Gegensatz zu Stonewashing-Zusammensetzungen. Waschmittelzusammensetzungen, welche Cellulase umfassen, werden zum Beispiel im U.S.-Patent Nr. 5 290 474 und der EP-Veröffentlichung Nr. 271 004 beschrieben, welche hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind.
"Expressionsvektor" bedeutet ein DNA-Konstrukt, umfassend eine DNA-Sequenz, welche funktionsfähig an eine geeignete Kontrollsequenz verknüpft ist, fähig zur Bewirkung der Expression der DNA in einem geeigneten Wirt. Derartige Kontrollsequenzen können einen Promotor zur Bewirkung von Transkription, eine optionale Operatorsequenz zur Regulierung der Transkription, eine Sequenz, codierend geeignete Ribosomen-Bindungsstellen auf der mRNA, und Sequenzen, welche die Termination von Transkription und Translation regulieren, einschließen. Verschiedene Zelltypen werden bevorzugt mit verschiedenen Expressionsvektoren verwendet. Ein bevorzugter Promotor für in Bacillus subtilis verwendete Vektoren ist der AprE-Promotor; ein bevorzugter in E. coli verwendeter Promotor ist der Lac-Promotor, ein bevorzugter in Saccharomyces cerevisiae verwendeter Promotor ist PGK1, ein bevorzugter in Aspergillus niger verwendeter Promotor ist glaA, und ein bevorzugter Promotor für Trichoderma reesei ist cbhI. Der Vektor kann ein Plasmid, ein Phagenpartikel oder einfach ein potentielles genomisches Insert sein. Sobald er in einen geeigneten Wirt transformiert wurde, kann der Vektor replizieren und unabhängig vom Wirtsgenom wirken oder kann, unter geeigneten Bedingungen, in das Genom selbst integrieren. In der vorliegenden Beschreibung werden Plasmid und Vektor manchmal austauschbar verwendet. Jedoch wird beabsichtigt, dass die Erfindung andere Formen von Expressionsvektoren einschließt, welche äquivalente Funktionen vollführen und welche im Fachgebiet bekannt sind oder werden. Somit kann eine große Vielfalt von Wirts/Expressionsvektorkombinationen bei der Exprimierung der DNA-Sequenzen dieser Erfindung verwendet werden. Nützliche Expressionsvektoren können zum Beispiel aus Segmenten von chromosomalen, nicht-chromosomalen und synthetischen DNA-Sequenzen bestehen, wie verschiedene bekannte Derivate von SV40 und bekannte bakterielle Plasmide, z.B. Plasmide aus E. coli, einschließlich colE1, pCR1, pBR322, pMb9, pUC19 und ihren Derivaten, Plasmide mit breiterem Wirtsspektrum, z.B. RP4, Phagen-DNAs, z.B. die zahlreichen Derivate von Phage λ, z.B. NM989, und andere DNA-Phagen, z.B. M13 und filamentöse einzelsträngige DNA-Phagen, Hefeplasmide, wie das 2μ-Plasmid oder Derivate davon, in eukaryotischen Zellen brauchbare Vektoren, wie Vektoren, welche in Tierzellen nützlich sind, und Vektoren, welche aus Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNAs abgeleitet sind, wie Plasmide, welche modifiziert worden sind, um Phagen-DNA- oder andere Expressions-Kontrollsequenzen zu verwenden. Expressionstechniken unter Verwendung der Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung sind im Fachgebiet bekannt und werden allgemein zum Beispiel in Sambrook beschrieben. Häufig werden derartige Expressionsvektoren, welche die DNA-Sequenzen der Erfindung einschließen, in einen einzelligen Wirt durch direkte Insertion in das Genom einer jeweiligen Spezies mittels eines Integrationsereignisses transformiert (siehe z.B. Bennett & Lasure, MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press, San Diego, S. 70–76 (1991), und den darin zitierten Artikeln, welche die zielgerichtete genomische Insertion in Pilz-Wirte beschreiben, was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist).
"Wirtsstamm" oder "Wirtszelle" bedeutet einen geeigneten Wirt für einen Expressionsvektor, welcher DNA gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst. In der vorliegenden Erfindung brauchbare Wirtszellen sind im Allgemeinen prokaryotische oder eukaryotische Wirte, einschließlich eines beliebigen transformierbaren Mikroorganismus, in welchem eine Expression erzielt werden kann. Bevorzugte Wirtsstämme schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Trichoderma reesei, Saccharomyces cerevisiae oder Aspergillus niger ein. Ein am stärksten bevorzugter Wirt ist A. niger. Wirtszellen werden mit Vektoren transformiert oder transfiziert, welche unter Anwendung von rekombinanten DNA-Techniken konstruiert worden sind. Solche transformierten Wirtszellen sind sowohl in der Lage, die Vektoren, welche die varianten EGIII-ähnlichen Enzyme codieren, zu replizieren als auch das gewünschte Peptidprodukt zu exprimieren.
"Signalsequenz" bedeutet eine Sequenz von Aminosäuren, die an den N-terminalen Teil eines Proteins gebunden ist, welche die Sekretion der reifen Form des Proteins aus der Zelle heraus erleichtert. Diese Definition einer Signalsequenz ist eine funktionelle. Der reifen Form des extrazellulären Proteins fehlt die Signalsequenz, welche während des Sekretionsvorgangs abgespalten wird.
"DNA-Vektor" bedeutet eine Nukleotidsequenz, welche ein oder mehrere DNA-Fragmente oder DNA-Variantenfragmente, codierend eine EGIII-ähnliche Cellulase oder obenstehend beschriebene Varianten, umfasst, welche nach der Transformation in eine geeignete Wirtszelle, verwendet werden kann, um die Expression der varianten EGIII-ähnlichen Cellulase zu verursachen.
"Funktionell verknüpft an" bedeutet, dass eine regulatorische Region, wie ein Promotor, Terminator, Sekretionssignal oder eine Enhancerregion, an einem Strukturgen angebracht ist und die Expression dieses Gens reguliert.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Expression, Reinigung und/oder Isolierung und Verwendung von varianten EGIII-ähnlichen Cellulasen. Diese Enzyme werden vorzugsweise durch rekombinante Verfahren unter Verwendung des Gens hergestellt, welches gemäß der obenstehend beschriebenen Verfahren identifiziert und isoliert worden ist. Allerdings können Enzyme zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung durch andere im Fachgebiet anerkannte Methoden erhalten werden, wie der Aufreinigung aus natürlichen Isolaten.
Der Mikroorganismus, der zum Zwecke des Exprimierens einer EGIII-ähnlichen Cellulase gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert werden soll, kann in vorteilhafter Weise einen Stamm umfassen, welcher aus Trichoderma reesei sp. abgeleitet ist. Daher umfasst eine bevorzugte Art zur Herstellung von EGIII-ähnlichen Cellulasen gemäß der vorliegenden Erfindung das Transformieren einer Trichoderma sp.-Wirtszelle mit einem DNA-Konstrukt, umfassend mindestens ein Fragment von DNA, codierend einen Teil oder die Gesamtheit der EGIII-ähnlichen Cellulase, nachgewiesen, wie obenstehend beschrieben. Das DNA-Konstrukt wird im Allgemeinen funktionsfähig an einen Promotor verknüpft sein. Die transformierte Wirtszelle wird dann unter solchen Bedingungen herangezogen, dass das gewünschte Protein exprimiert wird. Anschließend wird das gewünschte Proteinprodukt bis zur wesentlichen Homogenität gereinigt.
Allerdings ist, in einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform, das beste Expressionsvehikel für eine gegebene DNA, welche eine variante EGIII-ähnliche Cellulase codiert, Aspergillus niger. Siehe WO 98/31821, deren Offenbarung in ihrer Gesamtheit durch den Bezug darauf einbezogen ist, für eine Beschreibung der Transformation von A. niger.
In einer Ausführungsform umfasst der Stamm T. reesei (reesei), welcher ein brauchbarer Stamm zum Erhalten von überexprimiertem Protein ist. Zum Beispiel ist bekannt, dass RL-P37, beschrieben von Sheir-Neiss et al., Appl. Microbiol. Biotechnology, 20: 46–53, erhöhte Mengen an Cellulase-Enzymen sezerniert. Funktionelle Äquivalente von RL-P37 schließen den Trichoderma reesei-Stamm RUT-C30 (ATCC Nr. 56765) und Stamm QM9414 (ATCC Nr. 26921) ein. Es wird in Betracht gezogen, dass diese Stämme ebenfalls bei der Überexprimierung von EGIII-ähnlichen Cellulasen nützlich sind.
Wo es gewünscht wird, die EGIII-ähnliche Cellulase in Abwesenheit von potentiell schädlicher nativer cellulolytischer Aktivität zu erhalten, ist es nützlich, einen Trichoderma-Wirtszellenstamm zu erhalten, bei welchem ein oder mehrere Cellulase-Gene vor der Einbringung eines DNA-Konstrukts oder Plasmids, enthaltend das für die EGIII-ähnliche Cellulase codierende DNA-Fragment, deletiert worden sind. Solche Stämme können durch das Verfahren hergestellt werden, offenbart in U.S.-Patent Nr. 5 246 853 und WO 92/06209, welche hierin als Bezugsstelle einbezogen werden. Durch Exprimieren einer EGIII-ähnlichen Cellulase in einem Wirtsmikroorganismus, dem ein oder mehrere Cellulase-Gene fehlen, werden die Identifizierungs- und anschließenden Aufreinigungs-Verfahrensweisen vereinfacht. Jedwedes Gen aus Trichoderma sp., welches kloniert worden ist, kann deletiert werden, beispielsweise die Gene cbh1, cbh2, egl1 und egl3 sowie diejenigen, welche EGIII- und/oder EGV-Protein codieren (siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5 475 101 bzw. WO 94/28117).
Eine Gendeletion kann durch Inserieren einer Form des gewünschten Gens, welches deletiert oder disruptiert werden soll, in ein Plasmid durch im Fachgebiet bekannte Verfahren bewerkstelligt werden. Das Deletionsplasmid wird dann an (einer) geeigneten Restriktionsenzymstelle(n), intern bezüglich der gewünschten Gen-codierenden Region, geschnitten, und die Gen-codierende Sequenz oder ein Teil davon wird mit einem selektierbaren Marker ersetzt. Flankierende DNA-Sequenzen aus dem Lokus des Gens, welches deletiert oder disruptiert werden soll, vorzugsweise zwischen etwa 0,5 bis 2,0 kb, bleiben auf jeder Seite des selektierbaren Markergens zurück. Ein passendes Deletionsplasmid wird im Allgemeinen darin vorkommende einmalige Restriktionsenzymstellen aufweisen, um zu gestatten, dass das Fragment, welches das deletierte Gen, einschließlich flankierender DNA-Sequenzen, und das selektierbare Markergen enthält, als ein einzelnes lineares Stück entfernt werden kann.
Ein selektierbarer Marker muss so gewählt werden, dass er eine Detektion des transformierten Mikroorganismus ermöglicht. Jedwedes selektierbare Markergen, welches in dem selektierten Mikroorganismus exprimiert wird, wird geeignet sein. Zum Beispiel wird bei Trichoderma sp. der selektierbare Marker so gewählt, dass die Gegenwart des selektierbaren Markers in den Transformanten die Eigenschaften des Pilzes nicht signifikant beeinflussen wird. Ein derartiger selektierbarer Marker kann ein Gen sein, welches ein assaybares Produkt codiert. Zum Beispiel kann eine funktionelle Kopie eines Trichoderma sp.-Gens verwendet werden, welches, wenn es in dem Wirtsstamm fehlt, dazu führt, dass der Wirtsstamm einen auxotrophen Phänotyp aufzeigt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein pyr4^–-Derivatstamm von Trichoderma sp. mit einem funktionellen pyr4-Gen transformiert, welches somit einen selektierbaren Marker für die Transformation bereitstellt. Ein pyr4^–-Derivatstamm kann erhalten werden durch Selektion von Trichoderma sp.-Stämmen, welche gegen Fluororotsäure (FOA) resistent sind. Das pyr4-Gen codiert Orotidin-5'-Monophosphat-Decarboxylase, ein Enzym, das für die Biosynthese von Uridin erforderlich ist. Stämme mit einem intakten pyr4-Gen wachsen in einem Medium, welchem Uridin fehlt, sind aber empfindlich gegenüber Fluororotsäure. Es ist möglich, pyr4^–-Derivatstämme zu selektieren, welchen ein funktionelles Orotidin-Monophosphat-Decarboxylase-Enzym fehlt und welche Uridin für das Wachstum benötigen, indem hinsichtlich FOA-Resistenz selektiert wird. Unter Anwendung der FOA-Selektionstechnik ist es ebenfalls möglich, Uridin-erfordernde Stämme zu erhalten, denen eine funktionelle Orotat-Pyrophosphoribosyl-Transferase fehlt. Es ist möglich, diese Zellen mit einer funktionellen Kopie des Gens zu transformieren, welches dieses Enzym codiert (Berges & Barreau, Curr. Genet. 9: 359–365 (1991)). Die Selektion von Derivatstämmen wird leicht unter Anwendung der FOA-Resistenztechnik, auf welche obenstehend Bezug genommen wurde, durchgeführt, und daher wird das pyr4-Gen als ein selektierbarer Marker bevorzugt verwendet.
Um pyr4^–-Trichoderma sp. so zu transformieren, dass ihm die Fähigkeit, ein oder mehrere Cellulase-Gene zu exprimieren, fehlt, wird dann ein einzelnes DNA-Fragment, umfassend ein disruptiertes oder deletiertes Cellulase-Gen, aus dem Deletionsplasmid isoliert und verwendet, um einen passenden pyr^–-Trichoderma-Wirt zu transformieren. Transformanten werden dann identifiziert und auf der Grundlage ihres Vermögens, das pyr4-Genprodukt zu exprimieren und somit die Uridin-Auxotrophie des Wirtsstamms zu komplementieren, selektiert. Dann wird eine Southern-Blot-Analyse an den resultierenden Transformanten ausgeführt, um ein Doppel-Crossover-Integrationsereignis zu identifizieren und zu bestätigen, welches einen Teil oder die Gesamtheit der codierenden Region der genomischen Kopie des Gens, welches deletiert werden soll, mit den selektierbaren pyr4-Markern ersetzt.
Obwohl die obenstehend beschriebenen, spezifischen Plasmidvektoren die Herstellung von pyr^–-Transformanten betreffen, ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese Vektoren eingeschränkt. Verschiedene Gene können in dem Trichoderma sp.-Stamm unter Anwendung der oben genannten Techniken deletiert und ersetzt werden. Darüber hinaus können beliebige verfügbare selektierbare Marker verwendet werden, wie obenstehend erörtert. Tatsächlich kann jedwedes Trichoderma sp.-Gen, welches kloniert und somit identifiziert worden ist, unter Anwendung der obenstehend beschriebenen Strategie aus dem Genom deletiert werden.
Wie oben angegeben, sind die verwendeten Wirtsstämme Derivate von Trichoderma sp., denen das Gen oder die Gene, entsprechend dem gewählten selektierbaren Marker, fehlt/fehlen, oder die eine nicht-funktionelle Form davon aufweisen. Wenn zum Beispiel der selektierbare Marker pyr4 gewählt wird, dann wird ein spezifischer pyr4^–-Derivatstamm als ein Empfänger in dem Transformationsverfahren verwendet. In ähnlicher Weise können selektierbare Marker, umfassend Trichoderma sp.-Gene, äquivalent zu den Aspergillus nidulans-Genen amdS, argB, trpC, niaD, verwendet werden. Der entsprechende Empfängerstamm muss deshalb ein Derivatstamm, wie argB^–, trpC^– bzw. niaD^– sein.
Die EGIII-ähnliche Cellulase codierende DNA wird dann zur Einbringung in einen geeigneten Mikroorganismus hergestellt. Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst eine EGIII-ähnliche Cellulase codierende DNA, die DNA, welche notwendig ist, um ein Protein zu codieren, welches funktionelle cellulolytische Aktivität aufweist. Das DNA-Fragment oder DNA-Variantenfragment, codierend die EGIII-ähnliche Cellulase oder ein Derivat, kann funktionsfähig an eine Pilz-Promotor-Sequenz verknüpft werden, zum Beispiel den Promotor des cbh1- oder egl1-Gens.
Es wird ebenfalls in Erwägung gezogen, dass mehr als eine Kopie von DNA, codierend eine EGIII-ähnliche Cellulase, in den Stamm hinein rekombiniert werden kann, um eine Überexpression zu erleichtern. Die DNA, codierend die EGIII-ähnliche Cellulase, kann durch die Konstruktion eines Expressionsvektors hergestellt werden, welcher die DNA trägt, die die Cellulase codiert. Der Expressionsvektor, welcher das inserierte DNA-Fragment trägt, das die EGIII-ähnliche Cellulase codiert, kann ein beliebiger Vektor sein, welcher zur autonomen Replizierung in einem gegebenen Wirtsorganismus oder zur Integration in die DNA des Wirtes in der Lage ist, typischerweise ein Plasmid. In bevorzugten Ausführungsformen werden zwei Typen von Expressionsvektoren zum Erhalten einer Expression von Genen in Erwägung gezogen. Der erste enthält DNA-Sequenzen, in welchen der Promotor, die codierende Genregion und die Terminatorsequenz sämtlich aus dem zu exprimierenden Gen stammen. Eine Gentrunkierung kann erhalten werden, wo dies gewünscht wird, durch Deletieren von unerwünschten DNA-Sequenzen (welche z.B. unerwünschte Domänen codieren), wobei die zu exprimierende Domäne unter der Steuerung ihrer eigenen Transkriptions- und Translations-Regulierungssequenzen übrig gelassen wird. Ein selektierbarer Marker ist ebenfalls auf dem Vektor vorhanden, wodurch die Selektion hinsichtlich Einbringung von mehreren Kopien der neuen Gensequenzen in den Wirt gestattet wird.
Der zweite Typ von Expressionsvektor ist im Voraus zusammengebaut und enthält Sequenzen, welche für eine Transkription bei hohem Spiegel erforderlich sind, und einen selektierbaren Marker. Es wird in Betracht gezogen, dass die codierende Region für ein Gen oder einen Teil daraus in diesen Allzweck-Expressionsvektor inseriert werden kann, so dass sie unter der Transkriptionssteuerung der Promotor- und Terminatorsequenzen der Expressionskassette steht. Zum Beispiel ist pTEX ein derartiger Allzweck-Expressionsvektor. Gene, oder ein Teil davon, können stromabwärts des starken cbh1-Promotors inseriert werden.
In dem Vektor sollte die DNA-Sequenz, welche die EGIII-ähnliche Cellulase der vorliegenden Erfindung codiert, an transkriptionelle und translationelle Sequenzen, d.h. eine geeignete Promotorsequenz und Signalsequenz, im Leseraster zu dem Strukturgen, funktionsfähig verknüpft sein. Der Promotor kann eine beliebige DNA-Sequenz sein, welche eine transkriptionelle Aktivität in der Wirtszelle aufzeigt und kann aus Genen abgeleitet sein, welche Proteine codieren, die hinsichtlich der Wirtszelle entweder homolog oder heterolog sind. Das Signalpeptid sorgt für eine extrazelluläre Produktion der EGIII-ähnlichen Cellulase oder von Derivaten davon. Die für die Signalsequenz codierende DNA ist vorzugsweise diejenige, welche natürlicherweise mit dem zu exprimierenden Gen assoziiert ist, gleichwohl wird die Signalsequenz aus einer beliebigen geeigneten Quelle, zum Beispiel einer Exo-Cellobiohydrolase oder Endoglucanase aus Trichoderma, in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.
Die zum Ligieren der DNA-Sequenzen, welche die EGIII-ähnliche Cellulase der vorliegenden Erfindung codieren, mit dem Promotor und zur Insertion in geeignete Vektoren angewandten Vorgehensweisen sind im Fachgebiet gut bekannt.
Der/Das obenstehend beschriebene DNA-Vektor oder -Konstrukt kann gemäß bekannter Techniken in die Wirtszelle eingebracht werden, wie Transformation, Transfektion, Mikroinjektion, Mikroporation, Biolistik-Beschuss und dergleichen.
In der bevorzugten Transformationstechnik muss berücksichtigt werden, dass die Permeabilität der Zellwand in Trichoderma sp. für DNA sehr gering ist. Folglich ist die Aufnahme der/des gewünschten DNA-Sequenz, Gens oder Gen-Fragments bestenfalls minimal. Es gibt eine Reihe von Verfahren, um die Permeabilität der Trichoderma sp.-Zellwand in dem Derivatstamm (d.h. ohne ein funktionelles Gen, entsprechend dem verwendeten selektierbaren Marker) vor dem Transformationsverfahren zu erhöhen.
Das bevorzugte Verfahren in der vorliegenden Erfindung zur Vorbereitung von Trichoderma sp. für eine Transformation beinhaltet die Herstellung von Protoplasten aus Pilz-Myzel. Das Myzel kann von ausgekeimten vegetativen Sporen erhalten werden. Das Myzel wird mit einem Enzym behandelt, welches die Zellwand verdaut, was zu Protoplasten führt. Die Protoplasten werden dann durch die Gegenwart eines osmotischen Stabilisators in dem Suspendiermedium geschützt. Diese Stabilisatoren schließen Sorbitol, Mannitol, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat und dergleichen ein. Üblicherweise variiert die Konzentration dieser Stabilisatoren zwischen 0,8 M und 1,2 M. Es wird bevorzugt, eine Lösung von etwa 1,2 M Sorbitol in dem Suspensionsmedium zu verwenden.
Die Aufnahme der DNA in den Wirt-Trichoderma-sp.-Stamm ist abhängig von der Calciumi onenkonzentration. Im Allgemeinen werden zwischen etwa 10 mM CaCl₂ und 50 mM CaCl₂ in einer Aufnahmelösung verwendet. Neben der Notwendigkeit für das Calciumion in der Aufnahmelösung sind andere Dinge, welche allgemein eingeschlossen werden, ein Puffersystem wie TE-Puffer (10 mM Tris, pH 7,4; 1 mM EDTA) oder 10 mM MOPS-Puffer, pH 6,0 (Morpholinpropansulfonsäure) und Polyethylenglykol (PEG). Es wird angenommen, dass das Polyethylenglykol wirkt, um die Zellmembranen zu verschmelzen, wodurch gestattet wird, dass der Inhalt des Mediums in das Zytoplasma des Trichoderma sp.-Stammes zugeführt und die Plasmid-DNA zum Zellkern transferiert wird. Diese Fusion hinterlässt häufig mehrere Kopien der Plasmid-DNA, welche schwach in das Wirtschromosom integriert sind.
Üblicherweise wird in der Transformation eine Suspension verwendet, welche die Trichoderma sp.-Protoplasten oder -Zellen, welche einer Permeabilitätsbehandlung unterzogen worden sind, bei einer Dichte von 10⁸ bis 10⁹/ml, vorzugsweise 2 × 10⁸/ml enthält. Ein Volumen von 100 Mikrolitern dieser Protoplasten oder Zellen in einer geeigneten Lösung (z.B. 1,2 M Sorbitol; 50 mM CaCl₂) wird mit der gewünschten DNA vermischt. Im Allgemeinen wird der Aufnahmelösung eine hohe Konzentration an PEG zugesetzt. 0,1 bis 1 Volumen 25%iges PEG 4000 kann zu der Protoplastensuspension zugesetzt werden. Es ist jedoch zu bevorzugen, der Protoplastensuspension etwa 0,25 Volumina hinzuzusetzen. Additive, wie Dimethylsulfoxid, Heparin, Spermidin, Kaliumchlorid und dergleichen können der Aufnahmelösung ebenfalls zugesetzt werden und bei der Transformation helfen.
Im Allgemeinen wird die Mischung dann bei ungefähr 0°C während einer Dauer zwischen 10 bis 30 Minuten inkubiert. Zusätzliches PEG wird dann der Mischung zugegeben, um die Aufnahme der gewünschten Gen- oder DNA-Sequenz weiter zu steigern. Das 25%ige PEG 4000 werden im Allgemeinen in Volumina des 5- bis 15-Fachen des Volumens der Transformationsmischung zugesetzt; gleichwohl können größere und kleinere Volumina geeignet sein. Das 25%ige PEG 4000 wird vorzugsweise in etwa dem 10-fachen Volumen der Transformationsmischung zugegeben. Nachdem das PEG zugegeben wurde, wird die Transformationsmischung dann bei Raumtemperatur vor Zugabe einer Sorbitol- und CaCl₂-Lösung inkubiert. Die Protoplastensuspension wird dann fernerhin zu geschmolzenen Aliquots eines Wachstumsmediums zugegeben. Dieses Wachstumsmedium gestattet nur das Wachstum von Transformanten. In der vorliegenden Erfindung kann jedwedes Wachstumsmedium verwendet werden, welches zum Wachsenlassen der gewünschten Transformanten geeignet ist. Wenn jedoch Pyr⁺-Transformanten selektiert werden, wird es bevorzugt, ein Wachstumsmedium zu verwenden, welches kein Uridin enthält. Die anschließenden Kolonien werden auf ein Wachstumsmedium, welches frei von Uridin ist, überführt und darauf gereinigt.
An dieser Stufe können stabile Transformanten von unstabilen Transformanten durch ihre raschere Wachstumsgeschwindigkeit und die Bildung von zirkulären Kolonien mit einer eher glatten als gezackten Umrandung auf Festkulturmedium ohne Uridin unterschieden werden. Weiterhin kann in einigen Fällen ein weiterer Test der Stabilität vorgenommen werden durch Heranzüchten der Transformanten auf festem nicht-selektivem Medium (d.h. mit Uridin), Ernten von Sporen aus diesem Kulturmedium und Bestimmung des Prozentsatzes dieser Sporen, welche anschließend auf selektivem Medium ohne Uridin auskeimen und wachsen werden.
In einer besonderen Ausführungsform des obenstehenden Verfahrens werden die EGIII-ähnlichen Cellulasen oder Derivate davon in aktiver Form aus der Wirtszelle nach Wachstum in Flüssigmedien gewonnen, und zwar jeweilig als Ergebnis der geeigneten posttranslationalen Prozessierung der neuen EGIII-ähnlichen Cellulase oder Derivaten davon.
Die exprimierte EGIII-ähnliche Cellulase kann aus dem Medium durch herkömmliche Techniken gewonnen werden, einschließlich Trennungen der Zellen aus dem Medium durch Zentrifugation, Filtration, und Fällung der Proteine im Überstand oder Filtrat mit einem Salz, zum Beispiel Ammoniumsulfat. Darüber hinaus können Chromatographie-Verfahrensweisen, wie Ionenaustauschchromatographie oder Affinitätschromatographie angewandt werden. Antikörper (polyklonal oder monoklonal) können gegen die natürliche gereinigte EGIII-ähnliche Cellulase erzeugt werden, oder synthetische Peptide können aus Bereichen des EGIII-ähnlichen Cellulase-Moleküls hergestellt und zum Erzeugen von polyklonalen Antikörpern verwendet werden.
Obwohl es bevorzugt wird, dass Substitutionen von Resten aus thermisch stabileren EGIII-Cellulasen in EGIII-Cellulase zu stabilerer EGIII führen, ist dies nicht das einzige nützliche Ergebnis. Dem Fachmann auf dem Gebiet wird es offensichtlich sein, dass Substitutionen, welche zu weniger stabilen EGIII-Cellulasen führen, ebenfalls nützlich sind, z.B. in Zusammensetzungen, die zur Behandlung empfindlicher Textilien verwendet werden, und in anderen Anwendungen, worin das längere Bestehen von aktiver EGIII nicht erwünscht ist. Darüber hinaus wird es der Fachmann auf dem Gebiet leicht einschätzen, dass umgekehrte Substitutionen nützlich sind. Zum Beispiel können Reste aus weniger thermostabiler EGIII in stabilere EGIII-ähnliche Cellulasen substituiert werden, um weniger (oder mehr) stabile EGIII-Homologe herzustellen. Wiederum können weniger stabile Homologe verwendet werden, wenn das längere Vorhandensein von aktiver Cellulase nicht erforderlich ist.
Die Behandlung von Textilien gemäß der vorliegenden Erfindung zieht eine Textilien-Verarbeitung oder -Säuberung mit einer Zusammensetzung, welche eine Cellulase umfasst, in Betracht. Eine solche Behandlung schließt, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Stone washing, Modifizieren der Textur, Gefühlseigenschaft und/oder des Aussehens von cellulosehaltigen Textilien oder sonstige Techniken, welche während der Herstellung oder Säuberung/Rekonditionierung von cellulosehaltigen Textilien angewandt werden, ein. Darüber hinaus betrifft die Behandlung innerhalb des Kontexts dieser Erfindung die Entfernung "unreifer" oder "toter" Baumwolle aus cellulosehaltigen Textilien oder Fasern. Unreife Baumwolle ist signifikant amorpher als reife Baumwolle und führt zu einer Textilie von geringerer Qualität, wenn sie vorhanden ist, beispielsweise aufgrund einer ungleichmäßigen Einfärbung. Die in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogene Zusammensetzung schließt ferner eine Cellulase-Komponente zur Verwendung beim Waschen einer verschmutzten industriegefertigten cellulosehaltigen Textilie ein. Zum Beispiel kann die Cellulase in einer Reinigungsmittelzusammensetzung zum Wäschewaschen verwendet werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung brauchbare Waschmittelzusammensetzungen schließen Spezialformulierungen, wie Vorwäsche-, Voreinweichungs- oder Heimanwender-Farbwiederherstellungs-Zusammensetzungen ein. Solche Behandlungszusammensetzungen, wie hierin beschrieben, können in der Form eines Konzentrats, welches eine Verdünnung erfordert, oder in der Form einer verdünnten Lösung oder einer Form, welche direkt auf das Cellulose enthaltende Textil aufgebracht werden kann, vorliegen. Allgemeine Behandlungstechniken für die Cellulase-Behandlung von Textilien werden beispielsweise in der EP-Veröffentlichung Nr. 220 016 und den GB-Anmeldungen Nr. 1 368 599 und 2 095 275 beschrieben.
Die Behandlung eines cellulosehaltigen Materials gemäß der vorliegenden Erfindung zieht ferner die Behandlung von Tierfutter, Zellstoff und/oder Papier, Lebensmitteln und Getreide für die im Fachgebiet bekannten Zwecke in Betracht. Beispielsweise ist bekannt, dass Cellulase den Wert von Tierfutter erhöht, den Feuchtigkeitsgehalt von Holzzellstoff erhöht, Lebensmittelprodukte verbessert und die Fasern in Getreide während des Körner-Nassmahlverfahrens oder -Trockenmahlverfahrens reduziert.
Eine Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Herstellen einer wässrigen Lösung, welche eine wirksame Menge an Cellulase zusammen mit anderen optionalen Bestandteilen enthält, einschließlich zum Beispiel einem Puffer, einem Tensid und/oder einem Scheuermittel. Eine wirksame Menge an Cellulase-Enzymzusammensetzung ist eine für ihren beabsichtigten Zweck ausreichende Konzentration an Cellulase-Enzym. Somit ist zum Beispiel eine "wirksame Menge" an Cellulase in einer Stonewashing-Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung diejenige Menge, welche den gewünschten Effekt vorsehen wird, z.B. zur Hervorrufung eines gebrauchten und ausgebleichten Aussehens an den Nähten und auf Gewebebahnen. In ähnlicher Weise ist eine "wirksame Menge" an Cellulase in einer Zusammensetzung, welche zur Verbesserung des Anfühlens und/oder Aussehens einer Cellulose enthaltenden Textilie beabsichtigt wird, diejenige Menge, welche messbare Verbesserungen im Gefühlseindruck, z.B. eine Verbesserung der Glattheit des Gewebes, oder im Aussehen, z.B. Entfernung von Pills und Fibrillen, welche dazu neigen, die Klarheit des Aussehens eines Kleidungsstücks zu verringern, hervorrufen wird. Die eingesetzte Menge an Cellulase ist ebenfalls abhängig von der verwendeten Gerätschaft, den verwendeten Verfahrensparametern (der Temperatur der Cellulasebehandlungslösung, der Expositionszeit an die Cellulaselösung und dergleichen) und der Cellulase-Aktivität (z.B. wird eine jeweilige Lösung eine geringere Konzentration an Cellulase erfordern, falls eine aktivere Cellulase-Zusammensetzung verwendet wird, verglichen zu einer weniger aktiven Cellulase-Zusammensetzung). Die exakte Konzentration an Cellulase in der wässrigen Behandlungslösung, zu welcher das zu behandelnde Textil zugegeben wird, kann vom Fachmann basierend auf den oben genannten Faktoren sowie dem gewünschten Ergebnis ohne Weiteres bestimmt werden. In Stonewashing-Verfahren ist es im Allgemeinen bevorzugt worden, dass die Cellulase in der wässrigen Behandlungslösung in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 5000 ppm und am stärksten bevorzugt etwa 10 bis 200 ppm Gesamtprotein vorhanden ist. In Zusammensetzungen zur Verbesserung des Gefühlseindrucks und/oder Aussehens von einer Cellulose enthaltenden Textilie ist es im Allgemeinen bevorzugt worden, dass die Cellulase in der wässrigen Behandlungslösung bei einer Konzentration von etwa 0,1 bis 2000 ppm und am stärksten bevorzugt etwa 0,5 bis 200 ppm Gesamtprotein vorhanden ist.
In einer bevorzugten Behandlungs-Ausführungsform wird ein Puffer in der Behandlungszusammensetzung verwendet, so dass die Konzentration an Puffer ausreichend ist, um den pH-Wert der Lösung innerhalb des Bereichs zu halten, worin die verwendete Cellulase Aktivität aufzeigt, welcher seinerseits von der Natur der verwendeten Cellulase abhängt. Die exakte Konzentration an verwendetem Puffer wird von mehreren Faktoren abhängen, die der Fachmann ohne Weiteres berücksichtigen kann. Zum Beispiel werden, in einer bevorzugten Ausführungsform, der Puffer wie auch die Pufferkonzentration so ausgewählt, dass der pH-Wert der letztendlichen Cellulase-Lösung innerhalb des pH-Bereichs gehalten wird, der für eine optimale Cellulase-Aktivität erfordert wird. Die Bestimmung des optimalen pH-Bereichs der Cellulasen der Erfindung kann gemäß gut bekannten Techniken ermittelt werden. Geeignete Puffer bei dem pH innerhalb des Aktivitätsbereichs der Cellulase sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt.
Zusätzlich zu Cellulase und einem Puffer kann die Behandlungszusammensetzung gegebenenfalls ein Tensid enthalten. Geeignete Tenside schließen jedwedes Tensid ein, das mit der Cellulase und der Textilie kompatibel ist, einschließlich beispielsweise anionischen, nicht-ionischen und ampholytischen Tensiden. Geeignete anionische Tenside zur Verwendung hierin schließen lineare oder verzweigte Alkylbenzolsulfonate; Alkyl- oder Alkenylethersulfate mit linearen oder verzweigten Alkylgruppen oder Alkenylgruppen; Alkyl- oder Alkenylsulfa te; Olefinsulfonate; Alkansulfonate und dergleichen ein. Geeignete Gegenionen für anionische Tenside schließen Alkalimetallionen wie Natrium und Kalium; Erdalkalimetallionen wie Calcium und Magnesium; Ammoniumion; und Alkanolamine mit 1 bis 3 Alkanolgruppen der Kohlenstoffanzahl 2 oder 3 ein. Ampholytische Tenside schließen quaternäre Ammoniumsalzsulfonate und ampholytische Tenside vom Betain-Typ ein. Derartige ampholytische Tenside besitzen sowohl positiv als auch negativ geladene Gruppen im gleichen Molekül. Nichtionische Tenside umfassen im Allgemeinen Polyoxyalkylenether, sowie höhere Fettsäure-Alkanolamide oder Alkylenoxid-Adukt davon und Fettsäureglycerinmonoester. Mischungen von Tensiden können in den Arten, welche dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, ebenfalls verwendet werden.
Eine konzentrierte Cellulasezusammensetzung kann zur Verwendung in den hierin beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Solche Konzentrate enthalten konzentrierte Mengen der oben beschriebenen Cellulasezusammensetzung, Puffer und Tensid, vorzugsweise in einer wässrigen Lösung. Wenn es so formuliert wird, kann das Cellulasekonzentrat leicht mit Wasser verdünnt werden, so dass die Cellulasepräparationen, welche die erforderliche Konzentration an jedem Bestandteil aufweisen, rasch und akkurat hergestellt werden. Wenn wässrige Konzentrate formuliert werden, können diese Konzentrate verdünnt werden, so dass man zu der erforderlichen Konzentration der Komponenten in der Cellulase-Lösung, wie oben angegeben, gelangt. Wie ohne Weiteres offensichtlich ist, werden derartige Cellulase-Konzentrate eine einfache Formulierung der Cellulase-Lösungen gestatten, als auch einen durchführbaren Transport der Zusammensetzung zu der Örtlichkeit, wo sie verwendet werden wird, zulassen. Das Behandlungskonzentrat kann in einer beliebigen, im Fachgebiet anerkannten, Form vorliegen, zum Beispiel Flüssigkeit, Emulsion, Gel oder Paste. Derartige Formen sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt.
Wenn ein festes Cellulase-Konzentrat verwendet wird, kann die Cellulase-Zusammensetzung ein Granulat, ein Pulver, ein Agglomerat oder eine feste Scheibe sein. Die Granulate können so formuliert werden, dass sie Materialien zur Verringerung der Auflösungsgeschwindigkeit der Granulate in das Waschmedium enthalten. Derartige Materialien und Granulate werden im U.S.-Patent Nr. 5 254 283 offenbart, das hierin durch den Bezug darauf in seiner Gesamtheit einbezogen ist.
Andere Materialien können ebenfalls mit der Cellulase-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet oder darin eingebracht werden, wie gewünscht, einschließlich Steinen, Bimsstein, Füllstoffen, Lösungsmitteln, Enzymaktivatoren und Anti-Wiederablagerungs-Mitteln, abhängig von der letztendlichen Verwendung der Zusammensetzung.
Als Beispiel werden Stonewashing-Verfahren ausführlich beschrieben werden, wobei jedoch die beschriebenen Parameter vom Fachmann für andere Anwendungen, z.B. Verbesserung des Gefühlserlebnisses und/oder Aussehens einer Textilie, ohne Weiteres modifiziert werden. Die Cellulose enthaltende Textilie wird mit der Cellulase-haltigen Stonewashing-Zusammensetzung, welche eine wirksame Menge der Cellulase enthält, durch Vermengen der Behandlungszusammensetzung mit der Stonewashing-Zusammensetzung, und somit indem das Cellulase-Enzym in die Nähe zu dem Textil gebracht wird, kontaktiert. Anschließend wird die wässrige Lösung, welche die Cellulase und die Textilie enthält, bewegt. Wenn die Behandlungszusammensetzung eine wässrige Lösung ist, kann die Textilie direkt in der Lösung eingeweicht werden. In ähnlicher Weise wird, wo die Stonewashing-Zusammensetzung ein Konzentrat ist, das Konzentrat in ein Wasserbad, das die cellulosehaltige Textilie enthält, hinein verdünnt. Wenn die Stonewashing-Zusammensetzung in einer festen Form, zum Beispiel einem Vorwasch-Gel oder einer festen Barrenform, vorliegt, kann die Stonewashing-Zusammensetzung durch direktes Aufbringen der Zusammensetzung auf die Textilie oder die Waschflotte kontaktiert werden.
Die cellulosehaltige Textilie wird mit der Stonewashing-Lösung unter Bedingungen inkubiert, die wirksam sind, um zu gestatten, dass die enzymatische Wirkung der cellulosehaltigen Textilie ein "stonewashed"-Aussehen verleiht. Zum Beispiel können, während des Stonewashing, der pH, das Flottenverhältnis, die Temperatur und die Reaktionszeit eingestellt werden, um die Bedingungen zu optimieren, unter welchen die Stonewashing-Zusammensetzung wirkt. "Effektive Bedingungen" bezieht sich notwendigerweise auf den pH, das Flottenverhältnis und die Temperatur, welche dem Cellulase-Enzym gestatten, effizient mit cellulosehaltigen Textilien zu reagieren, in diesem Falle den "stonewashed" Effekt hervorzurufen. Gleichwohl sind solche Bedingungen ohne Weiteres vom Fachmann auf dem Gebiet feststellbar. Die für die Stonewashing-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung wirksamen Reaktionsbedingungen sind im Wesentlichen ähnlich zu gut bekannten Verfahren, welche mit entsprechenden Cellulasezusammensetzungen des Stands der Technik angewandt werden. Folglich liegt es innerhalb des Kenntnisstands des Fachmanns auf dem Gebiet, Bedingungen zur Anwendung der Stonewashing-Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung zu maximieren.
Die Flottenverhältnisse während des Stonewashings, d.h. das Verhältnis des Gewichts an Stonewashing-Zusammensetzungs-Lösung (d.h. der Waschflotte) zu dem Gewicht der Textilien, welches hierin angewandt wird, ist im Allgemeinen ein Betrag, der ausreicht, um den gewünschten Stonewashing-Effekt in dem Denim-Textil zu erzielen und ist von dem angewandten Verfahren abhängig. Vorzugsweise belaufen sich die Flottenverhältnisse auf etwa 4:1 bis etwa 50:1; weiter bevorzugt etwa 5:1 bis etwa 20:1, und am stärksten bevorzugt etwa 10:1 bis etwa 15:1.
Die Reaktionstemperaturen während des Stonewashings mit den vorliegenden Stonewashing-Zusammensetzungen werden von zwei miteinander konkurrierenden Faktoren beherrscht. Zum Ersten entsprechen höhere Temperaturen im Allgemeinen einer verstärkten Reaktionskinetik, d.h. schnelleren Reaktionen, was verringerte Reaktionszeiten im Vergleich zu den Reaktionszeiten gestattet, welche bei niedrigeren Temperaturen erforderlich sind. Folglich betragen die Reaktionstemperaturen im Allgemeinen wenigstens etwa 10°C und darüber. Zum Zweiten ist Cellulase ein Protein, welches jenseits einer gegebenen Reaktionstemperatur Aktivität verliert, wobei diese Temperatur von der Natur der verwendeten Cellulase abhängt. Wenn somit die Reaktionstemperatur zu hoch steigen gelassen wird, wird die cellulolytische Aktivität als Ergebnis der Denaturierung der Cellulase verloren. Obgleich Standardtemperaturen für die Cellulase-Verwendung im Fachgebiet im Allgemeinen im Bereich von 35°C bis 65°C liegen, wobei von diesen Bedingungen auch erwartet werden würde, für die Cellulase der Erfindung geeignet zu sein, sollten die optimalen Temperaturbedingungen gemäß allgemein bekannter Techniken in Bezug auf die verwendete spezifische Cellulase ermittelt werden.
Reaktionszeiten sind abhängig von den spezifischen Bedingungen, unter denen das Stonewashing stattfindet. Zum Beispiel werden pH, Temperatur und Konzentration von Cellulase alle die optimale Reaktionszeit beeinflussen. Im Allgemeinen belaufen sich die Reaktionszeiten auf etwa 5 Minuten bis etwa 5 Stunden und vorzugsweise etwa 10 Minuten bis etwa 3 Stunden und weiter bevorzugt etwa 20 Minuten bis etwa 1 Stunde.
Gemäß noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Cellulase der Erfindung in einer Waschmittel- bzw. Reinigungsmittelzusammensetzung verwendet werden. Die Waschmittelzusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung werden als Vorwasch-Zusammensetzungen, Voreinweichungs-Zusammensetzungen oder zur Reinigung während des regulären Wasch- oder Spülzyklus verwendet. Vorzugsweise umfasst die Waschmittelzusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine wirksame Menge an Cellulase, ein Tensid und schließt gegebenenfalls andere Bestandteile, welche nachstehend beschrieben werden, ein.
Eine wirksame Menge an Cellulase, welche in den Waschmittelzusammensetzungen dieser Erfindung verwendet wird, ist eine Menge, die ausreicht, um die wünschenswerten Effekte zu vermitteln, welche bekanntermaßen durch Cellulase gegenüber cellulosehaltigen Textilien hervorgerufen werden, beispielsweise Ent-Pillen, Weichmachen, Anti-Pilling, Oberflächenfaserentfernung, Anti-Vergrauung und Säuberung. Vorzugsweise wird die Cellulase in der Waschmittelzusammensetzung in einer Konzentration von etwa 10 ppm bis etwa 20000 ppm Waschmittel eingesetzt.
Die Konzentration an Cellulase-Enzym, welche in der Waschmittelzusammensetzung verwendet wird, wird vorzugsweise so gewählt, dass nach Verdünnen in ein Waschmedium hinein, die Konzentration an Cellulase-Enzym in einem Bereich von etwa 0,01 bis etwa 1000 ppm, vorzugsweise etwa 0,02 ppm bis etwa 500 ppm und am stärksten bevorzugt etwa 0,5 ppm bis etwa 250 ppm Gesamtprotein liegt. Die in der Waschmittelzusammensetzung verwendete Menge an Cellulase-Enzym wird von dem Ausmaß abhängen, zu welchem das Waschmittel beim Zugeben von Wasser zur Bildung einer Waschlösung verdünnt wird.
Die Waschmittelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in jedweder im Fachgebiet anerkannten Form vorliegen, zum Beispiel als eine Flüssigkeit, in Granulaten, in Emulsionen, in Gelen oder in Pasten. Derartige Formen sind dem Fachmann allgemein bekannt. Wenn eine feste Waschmittelzusammensetzung verwendet wird, wird die Cellulase vorzugsweise als Granulat formuliert. Vorzugsweise können die Granulate so formuliert werden, dass sie zusätzlich ein Cellulase schützendes Mittel enthalten. Das Granulat kann so formuliert werden, dass es Materialien enthält, um die Auflösungsrate des Granulates in das Waschmedium hinein zu reduzieren. Solche Materialien und Granulate sind im U.S.-Patent Nr. 5 254 283 offenbart, das hierin durch den Bezug darauf in seiner Gesamtheit einbezogen ist.
Die Waschmittelzusammensetzungen dieser Erfindung verwenden ein oberflächenaktives Mittel, z.B. ein Tensid, einschließlich anionischer, nicht-ionischer und ampholytischer Tenside, welche für ihre Verwendung in Reinigungsmittelzusammensetzungen allgemein bekannt sind. Zusätzlich zu der Cellulase-Zusammensetzung und den Tensid(en) können die Waschmittelzusammensetzungen dieser Erfindung gegebenenfalls eine oder mehrere der folgenden Komponenten enthalten:
Hydrolasen außer Cellulase
Geeignete Hydrolasen schließen Carboxylatesterhydrolase, Thioester-Hydrolase, Phosphatmonoester-Hydrolase und Phosphatdiester-Hydrolase, welche auf die Esterbindung einwirken; Glycosid-Hydrolase, welche auf Glycosylverbindungen einwirkt; ein Enzym, welches N-Glycosylverbindungen hydrolysiert; Thioether-Hydrolase, welche auf die Etherbindung wirkt; und eine a-Amino-Acyl-Peptid-Hydrolase, Peptidyl-Aminosäure-Hydrolase, Acyl-Aminosäure-Hydrolase, Dipeptid-Hydrolase und Peptidyl-Peptid-Hydrolase, welche auf die Peptidbindung einwirken, ein. Bevorzugt unter ihnen sind Carboxylatester-Hydrolase, Glycosid hydrolase und Peptidyl-Peptid-Hydrolase. Geeignete Hydrolasen schließen ein: (1) Proteasen, welche der Peptidyl-Peptid-Hydrolase angehören, wie Pepsin, Pepsin B, Rennin, Trypsin, Chymotroypsin A, Chymotrypsin B, Elastase, Enterokinase, Cathepsin C, Papain, Chymopapain, Ficin, Thrombin, Fibrinolysin, Renin, Subtilisin, Aspergillopeptidase A, Collagenase, Clostridiopeptidase B, Kallikrein, Gastrisin, Cathepsin D., Bromelin, Keratinase, Chymotrypsin C, Pepsin C, Aspergillopeptidase B, Urokinase, Carboxypeptidase A und B und Aminopeptidase; (2) Glycosid-Hydrolasen (Cellulase, welche ein Hauptbestandteil ist, ist aus dieser Gruppe ausgenommen), α-Amylase, β-Amylase, Glucoamylase, Invertase, Lysozym, Pectinase, Chitinase und Dextranase. Unter ihnen sind α-Amylase und β-Amylase bevorzugt. Sie funktionieren in sauren bis neutralen Systemen, aber eine solche, welche aus Bakterien erhalten wird, zeigt eine hohe Aktivität in einem alkalischen System; (3) Carboxylatester-Hydrolase, einschließlich Carboxylesterase, Lipase, Pektinesterase und Chlorophyllase. Speziell wirksam unter ihnen ist Lipase.
Die von Cellulase verschiedene Hydrolase wird in die Waschmittelzusammensetzung in solcher Menge eingebracht, wie es gemäß der Absicht erforderlich ist. Sie sollte vorzugsweise in einer Menge von 0,001 bis 5 Gewichtsprozent und weiter bevorzugt 0,02 bis 3 Gewichtsprozent, bezüglich des gereinigten Proteins, eingebracht werden. Dieses Enzym sollte in der Form von Granulaten, hergestellt aus Rohenzym, allein oder in Kombination mit anderen Komponenten in der Waschmittelzusammensetzung verwendet werden. Granulate des Rohenzyms werden in einer derartigen Menge verwendet, dass sich das gereinigte Enzym auf 0,001 bis 50 Gewichtsprozent in den Granulaten beläuft. Die Granulate werden in einer Menge von 0,002 bis 20 und vorzugsweise von 0,1 bis 10 Gewichtsprozent verwendet. Wie bei Cellulasen, können diese Granulate so formuliert werden, dass sie ein enzymschützendes Mittel und ein auflösungsverzögerndes Material enthalten.
Builder
A. Zweiwertige Sequestrierungsmittel.
Die Zusammensetzung kann etwa 0 bis etwa 50 Gewichtsprozent an einer oder mehreren Builderkomponenten enthalten, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkalimetallsalzen und Alkanolaminsalzen der folgenden Verbindungen: Phosphate, Phosphonate, Phosphonocarboxylate, Salze von Aminosäuren, Aminopolyacetate, hochmolekulare Elektrolyte, nicht-dissoziierende Polymere, Salze von Dicarbonsäuren und Aluminiumsilicat-Salze. Geeignete zweiwertige Maskierungsmittel sind in der britischen Patentanmeldung Nr. 2 094 826 A beschrieben, deren Offenbarung hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist.
B. Alkalis oder anorganische Elektrolyte
Die Zusammensetzung kann etwa 1 bis etwa 50 Gewichtsprozent, vorzugsweise etwa 5 bis etwa 30 Gewichtsprozent, basierend auf der Zusammensetzung, an einem oder mehreren Alkalimetallsalzen der folgenden Verbindungen als die Alkalis oder anorganischen Elektrolyte enthalten: Silicate, Carbonate und Sulfate sowie organische Alkalis, wie Triethanolamin, Diethanolamin, Monoethanolamin und Triisopropanolamin.
Anti-Wiederablagerungsmittel
Die Zusammensetzung kann etwa 0,1 bis etwa 5 Gewichtsprozent einer oder mehrerer der folgenden Verbindungen als Anti-Wiederablagerungsmittel enthalten: Polyethylenglykol, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose.
Unter ihnen sieht eine Kombination von Carboxymethylcellulose und/oder Polyethylenglykol mit der Cellulase-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine besonders nützliche schmutzentfernende Zusammensetzung vor.
Bleichmittel
Die Verwendung der Cellulase der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem Bleichmittel, wie Kaliummonopersulfat, Natriumpercarbonat, Natriumperborat, Natriumsulfat/Wasserstoffperoxid-Addukt und Natriumchlorid/Wasserstoffperoxid-Addukt oder/und einem lichtempfindlichen Bleichungs-Farbstoff, wie Zink- oder Aluminiumsalz von sulfoniertem Phthalocyanin, verbessert die Reinigungswirkungen weiter. In ähnlicher Weise können Bleichmittel und Bleichkatalysatoren, wie beschrieben im EP 684 304 , verwendet werden.
Bläuungsmittel und fluoreszierende Farbstoffe
Verschiedene Bläuungsmittel und fluoreszierende Farbstoffe können in die Zusammensetzung eingebunden werden, falls notwendig. Geeignete Bläuungsmittel und fluoreszierende Farbstoffe sind in der britischen Patentanmeldung Nr. 2 094 826 A offenbart, deren Offenbarung hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist.
Klumpenbildungs-Inhibitoren
Die folgenden Verklumpungsinhibitoren können in das pulverförmige Reinigungsmittel eingebunden werden: p-Toluolsulfonsäuresalze, Xylensulfonsäuresalze, Essigsäuresalze, Sulfo bernsteinsäuresalze, Talk, fein pulverisiertes Siliziumdioxid, amorphe Siliziumdioxide, Ton, Calciumsilicat (wie Micro-Cell von Johns Manville Co.), Calciumcarbonat und Magnesiumoxid.
Maskierungsmittel für Faktoren, welche die Cellulase-Aktivität inhibieren
Die Cellulase-Zusammensetzung dieser Erfindung wird in manchen Fällen in Gegenwart von Kupfer, Zink, Chrom, Quecksilber, Blei, Mangan oder Silberionen oder ihren Verbindungen deaktiviert. Verschiedene Metall-Chelatierungsmittel und Metall-präzipitierende Mittel sind gegen diese Inhibitoren wirksam. Sie schließen beispielsweise zweiwertige Metallion-Sequestriermittel, wie im obenstehenden Punkt unter Bezug auf wahlfreie Additive aufgelistet, sowie Magnesiumsilicat und Magnesiumsulfat ein.
Cellobiose, Glucose und Gluconolacton wirken manchmal als Inhibitoren. Es wird bevorzugt, das gemeinsame Vorhandensein dieser Saccharide mit der Cellulase soweit als möglich zu vermeiden. In dem Fall, dass ein gemeinsames Vorhandensein unvermeidlich ist, ist es notwendig, den direkten Kontakt der Saccharide mit der Cellulase zu vermeiden, beispielsweise indem man diese beschichtet.
Langketten-Fettsäure-Salze und kationische Tenside wirken als die Inhibitoren in einigen Fällen. Allerdings ist das gemeinsame Vorhandensein dieser Substanzen mit der Cellulase zulässig, wenn der direkte Kontakt von ihnen durch irgendwelche Mittel, wie Tablettieren oder Beschichten, verhindert wird.
Die oben erwähnten Maskierungsmittel und Verfahren können, falls notwendig, in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Cellulase-Aktivatoren
Die Aktivatoren können abhängig von der spezifischen Cellulase variieren. In Gegenwart von Proteinen, Kobalt und seinen Salzen, Magnesium und seinen Salzen und Calcium und seinen Salzen, Kalium und seinen Salzen, Natrium und seinen Salzen oder Monosacchariden, wie Mannose und Xylose, werden viele Cellulasen aktiviert, und ihre Reinigungsleistungen werden beträchtlich verbessert.
Antioxidationsmittel
Die Antioxidationsmittel schließen zum Beispiel tert-Butyl-hydroxytoluol, 4,4'-Butyliden bis(6-tert-butyl-3-methylphenol), 2,2'-Butylidenbis(6-tert-butyl-4-methylphenol), monostyrolisiertes Cresol, distyrolisiertes Cresol, monostyrolisiertes Phenol, distyrolisiertes Phenol und 1,1-Bis(4-hydroxyphenyl)cyclohexan ein.
Solubilisatoren
Die Solubilisatoren schließen zum Beispiel niedere Alkohole, wie Ethanol, Benzolsulfonatsalze, Niederalkylbenzolsulfonatsalze, wie p-Toluolsulfonatsalze, Glykole wie Propylenglykol, Acetylbenzolsulfonatsalze, Acetamide, Pyridindicarbonsäureamide, Benzoat-Salze und Harnstoff ein.
Die Waschmittelzusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann in einem breiten pH-Bereich von saurem bis alkalischem pH eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Waschmittelzusammensetzung der vorliegenden Erfindung in schwach sauren, neutralen oder alkalischen Waschmittel-Waschmedien verwendet werden, welche einen pH-Wert von über 5 bis zu nicht mehr als etwa 12 aufweisen.
Neben den oben genannten Bestandteilen, können Duftstoffe, Puffer, Konservierungsstoffe, Farbstoffe und dergleichen, falls gewünscht, mit den Waschmittelzusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden. Solche Komponenten werden in herkömmlicher Weise in bisherig im Fachgebiet verwendeten Mengen eingesetzt.
Wenn eine Waschmittelbasis, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, in der Form eines Pulvers vorliegt, kann es ein solches sein, welches durch jedwede bekannten Herstellungsverfahren hergestellt wird, einschließlich eines Sprühtrocknungsverfahrens und eines Granulierungsverfahrens. Die Waschmittelbasis, welche insbesondere durch das Sprühtrocknungsverfahren, Agglomerationsverfahren, Trockenmischungsverfahren oder Nicht-Turm-Routen-Verfahren erhalten wird, ist bevorzugt. Die durch das Sprühtrocknungsverfahren erhaltene Waschmittelbasis ist nicht in Hinsicht auf die Herstellungsbedingungen eingeschränkt. Die durch das Sprühtrocknungsverfahren erhaltene Waschmittelbasis besteht in Hohlgranulaten, welche durch Sprühen einer wässrigen Schlämmung von wärmebeständigen Bestandteilen, wie oberflächenaktiven Mitteln und Buildern, in einen heißen Raum erhalten werden. Nach dem Sprühtrocknen können Duftstoffe, Enzyme, Bleichmittel und anorganische alkalische Builder zugesetzt werden. Bei einer hochdichten, granulären Waschmittelbasis, wie sie durch das Sprühtrocknungs-Granulations- oder Agglomerationsverfahren erhalten wird, können verschiedene Bestandteile auch nach der Herstellung der Basis zugesetzt werden.
Wenn die Waschmittelbasis eine Flüssigkeit ist, kann sie entweder eine homogene Lösung oder eine inhomogene Dispersion sein. Zum Abwenden der Zersetzung von Carboxymethylcellulose durch die Cellulase in dem Waschmittel, ist es wünschenswert, dass Carboxymethylcellulose, vor der Einbringung in die Zusammensetzung, granuliert oder beschichtet wird.
Die Waschmittelzusammensetzungen dieser Erfindung können mit Cellulose enthaltendem Gewebe, zum Beispiel verschmutzten Textilien, in Industrie- und Haushalt-Anwendungen bei Temperaturen, Reaktionszeiten und Flottenverhältnissen, welche herkömmlich in diesen Umgebungen verwendet werden, inkubiert werden. Die Inkubationsbedingungen, d.h. die Bedingungen, welche zum Behandeln von Cellulose enthaltenden Textilien mit Waschmittelzusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung wirksam sind, werden vom Fachmann auf dem Gebiet ohne Weiteres feststellbar sein. Folglich werden die passenden Bedingungen, die zur Behandlung mit den vorliegenden Waschmitteln effektiv sind, denjenigen unter Verwendung ähnlicher Waschmittelzusammensetzungen, welche bekannte Cellulasen einschließen, entsprechen.
Waschmittel gemäß der vorliegenden Erfindung können darüber hinaus als eine Vorwäsche in der geeigneten Lösung bei einem intermediären pH-Wert formuliert werden, worin eine ausreichende Aktivität vorliegt, um die gewünschten Verbesserungen hinsichtlich Weichmachen, Entpillen, Pilling-Verhinderung, Oberflächenfaser-Entfernung oder Säubern vorzusehen. Wenn die Waschmittelzusammensetzung eine Zusammensetzung zum Voreinweichen (z.B. Vorwaschen oder Vorbehandeln) ist, entweder als Flüssigkeits-, Spray-, Gel- oder Pasten-Zusammensetzung, wird das Cellulase-Enzym im Allgemeinen bei etwa 0,0001 bis etwa 1 Gewichtsprozent, basierend auf dem Gesamtgewicht der Voreinweich- oder Vorbehandlungs-Zusammensetzung, verwendet. In solchen Zusammensetzungen kann gegebenenfalls ein Tensid verwendet werden, und bei Verwendung ist es im Allgemeinen bei einer Konzentration von etwa 0,005 bis etwa 20 Gewichtsprozent, basierend auf dem Gesamtgewicht der Voreinweichung, vorhanden. Der Rest der Zusammensetzung umfasst herkömmliche Komponenten, welche in der Voreinweichung verwendet werden, d.h. Verdünnungsmittel, Puffer, andere Enzyme (Proteasen) und dergleichen bei ihren herkömmlichen Konzentrationen.
Es wird in Erwägung gezogen, dass Zusammensetzungen, welche die hierin beschriebenen Cellulase-Enzyme umfassen, in der Haushaltsanwendung als eine Stand-Alone-Zusammensetzung, die zum Wiederherstellen von Farbe bei ausgeblichenen Textilien geeignet ist (siehe zum Beispiel U.S.-Patent Nr. 4 738 682, das hierin durch den Bezug darauf in seiner Gesamtheit einbezogen ist) verwendet werden können und auch in einem Fleckenentferner und zum Entpillen und Anti-Pilling (Pilling-Verhinderung) verwendet werden können.
Die Verwendung der Cellulase gemäß der Erfindung kann bei Futterzusatzstoffen und bei der Verarbeitung von Zellstoff und Papier besonders effektiv sein. Diese zusätzlichen industriellen Anwendungen werden zum Beispiel in der PCT-Veröffentlichung Nr. 95/16360 bzw. dem finnischen erteilten Patent Nr. 87372 beschrieben.
Um die vorliegende Erfindung und ihre Vorteile weiter zu veranschaulichen, werden die nachfolgenden spezifischen Beispiele angegeben, wobei es sich versteht, dass sie dargeboten werden, um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen, und keineswegs so ausgelegt werden sollten, dass sie deren Umfang einschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1: Herstellung von genomischer DNA, welche EGIII-ähnliche Cellulasen codiert
Genomische DNA wurde aus mehreren verschiedenen Mikroorganismen zum Zwecke der Durchführung einer PCR-Reaktion präpariert, um zu bestimmen, ob EGIII-ähnliche Cellulasen durch die DNA eines jeweiligen Organismus codiert werden.
Genomische DNA wurde aus Acremonium brachypenium, Hinterlegungs-Nr. CBS 886.73; Chaetomium brasillience, Hinterlegungs-Nr. CBS 140.50; Chaetomium vitellium, Hinterlegungs-Nr. CBS 250.85; Emericella desertorum, Hinterlegungs-Nr. CBS 653.73; Fusarium equiseti, Hinterlegungs-Nr. CBS 185.34; Gliocladium roseum, Hinterlegungs-Nr. CBS 443.65; Humicola grisea var. thermoidia, Hinterlegungs-Nr. CBS 225.63; Myceliopthora thermophila, Hinterlegungs-Nr. ATCC 48102–48104; Penicillium notatum, Hinterlegungs-Nr. ATCC 9178, 9179; und Phanerochaete chrysosporium, Hinterlegungs-Nr. ATCC 28326 erhalten und gemäß Standardverfahren isoliert.
PCR wurde auf einer standardmäßigen PCR-Maschine, wie dem PCT-150 MicroCycler von MJ Research Inc. unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:

1) 1 Minute bei 98°C während 1 Zyklus;
2) 1 Minute bei 94°C, 90 Sekunden bei 40°C, 1 Minute bei 72°C
3) Wiederhole Schritt 2 während 30 Zyklen
4) 7 Minuten bei 72°C während 1 Zyklus, und
5) Erniedrigen der Temperatur auf 15°C für die Aufbewahrung und weitere Analyse.

Die folgenden DNA-Primer wurden zur Verwendung in der Amplifikation von EGIII-ähnlichen Genen aus den Bibliotheken, die aus den verschiedenen Mikroorganismen hergestellt wurden, konstruiert. Alle Symbole, welche hierin für Protein- und DNA-Sequenzen verwendet werden, entsprechen den Codes der IUPAC-IUB-"Biochemische Nomenklatur-Kommission". BOX1: Primer, codierend für (N/Q)NLWG

Vorwärtsprimer	FRG001: AAY AAY YTN TGG GG
Vorwärtsprimer	FRG002: CAR AAY YTN TGG GG

BOX1': Primer, codierend für NNN(F/L/Y/I/L/N/K)WG

Vorwärtsprimer FRG010: AAY AAY AAY HWI TGG GG

BOX2: Primer, codierend für ELMIW

Vorwärts-Primer	FRG003: GAR YTN ATG ATH TGG
Rückwärts-Primer	FRG004: CCA DAT CAT NAR YTC

BOX2': Primer, codierend für YELMIW

Vorwärts-Primer	FRG011: TAY GAR YTI ATG ATH TGG
Rückwärts-Primer	FRG012: CCA DAT CAT IAR YTC RTA

BOX3: Primer, codierend für GTE(P/C)FT

Rückwärts-Primer	FRG005: GTR AAN GGY TCR GTR CC
Rückwärts-Primer	FRG006: GTR AAN GGY TCR GTY CC
Rückwärts-Primer	FRG007: GTR AAN GGY TCY GTR CC
Rückwärts-Primer	FRG008: GTR AAN GGY TCY GTY CC
Rückwärts-Primer	FRG009: GTR AAR CAY TCN GTN CC

Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 10 μl 10 × Reaktionspuffer (10 × Reaktionspuffer, umfassend 100 mM Tris HCl, pH 8–8,5; 250 mM KCl; 50 mM (NH₄)₂SO₄; 20 mM MgSO₄); 0,2 mM jeweils von dATP, dTTP, dGTP, dCTP (Endkonzentration), 1 μl 100 ng/μl genomische DNA, 1 μl PWO-Polymerase (Boehringer Mannheim, Kat.-# 1644-947) bei 1 Unit pro μl, 500 mM Primer (Endkonzentration) und Wasser zu 100 μl. Die Lösung wurde mit Mineralöl überschichtet.
Die PCR-Strategie war wie folgend: Vorwärtsprimer für BOX1 und BOX1' wurden mit Rückwärtsprimern aus BOX3 in einer Mischung mit der gewünschten genomischen DNA- Probe vereinigt und auf einem Gel laufen gelassen, um Fragmente im 400–1000-Basenpaarbereich zu erhalten. Die so erhaltenen Fragmente wurden vereinigt, und der Pool wurde in zwei ungefähr gleiche Portionen aufgeteilt. Der erste Pool wurde mit den Vorwärtsprimern aus BOX1 und BOX1' zusammen mit dem Rückwärtsprimer aus BOX2 kombiniert. Der zweite Pool wurde mit dem Vorwärtsprimer aus BOX2 zusammen mit den Rückwärtsprimern aus BOX3 kombiniert. Fragmente mit der ungefähren Größe, relativ zu einer EGIII-ähnlichen Cellulase, unter Berücksichtigung der Lokalisierung der Primer innerhalb des Gens, in diesem Fall entsprechend denjenigen zwischen 250–500 Basenpaaren, wurden isoliert und sequenziert.
Aus den sequenzierten Fragmenten war es möglich, die RAGE-Technik (rasche Amplifikation genomischer Enden) anzuwenden, um die Sequenz des Volllängen-Gens schnell zu erhalten. Volllängen-Gene wurden erhalten und sind mit mehreren zusätzlichen EGIII-ähnlichen Cellulase-Sequenzen in der 3 angegeben. Wie in der 3 gezeigt, enthalten Volllängen-Gene, welche aus Hypocrea schweinitzii, Aspergillus aculeatus, Apergillus kawachii (1), Aspergillus kawachii (2), Aspergillus oryzae, Humicola grisea, Humicola insolens, Chaetomium brasilliense, Fusarium equiseti, Fusarium javanicum (1), Fusarium javanicum (2), Gliocladium roseum (1), Gliocladium roseum (2), Gliocladium roseum (3), Gliocladium roseum (4), Memnoniella echinata, Actinomycete 11AG8, Streptomyces lividans CelB, Rhodothermus marinus, Emericella desertoru und Erwinia carotovara isoliert wurden, alle eine signifikante Homologie zu EGIII aus Trichoderma reesei.
Beispiel 2: Temperaturstabilitäts-Test an EGIII und EGIII-ähnlichen Cellulasen
EGIII und EGIII-Homologe, abgeleitet aus Humicola grisei, Humicola insolens, Emercella desertoru, Fusarium javanicum und Memnonella echinata, wurden getestet, um ihre Stabilität unter Temperaturbelastung zu bestimmten.
Die Stabilität wurde durch Verfolgen der Rate des Aktivitätsverlusts nach Inkubation bei einer festgelegten hohen Temperatur geassayt: Lösungen von EGIII- und EGIII-ähnlichen Cellulasen bei zwischen 0,1 mg/ml und 0,5 mg/ml in 50 mM Citrat/Phosphat-Puffer bei pH 8,0 wurden in einem Wasserbad bei 48°C inkubiert. Zu den gemessenen Zeiten bzw. Meßzeitpunkten wurden 100 μl große Aliquots entnommen und rasch gekühlt (oder eingefroren). Die verbleibende Aktivität in diesen Aliquots wurde geassayt, wie nachstehend ausführlich angegeben. Eine Kurve der irreversiblen Wärmeinaktivierung wurde durch Auftragen der verbleibenden Aktivität gegen die Zeit aufgestellt, und die Daten wurden an einen einfach-exponentiellen Zerfall angepasst. Die Halbwertszeit dieses exponentiellen Zerfalls wurde als ein Maß der Wärmestabilität bestimmt.
Der Aktivitäts-Assay wurde wie folgend durchgeführt: In eine Vertiefung einer 96-Vertiefungs-Mikrotiterplatte wurden 10 μl Enzymprobe zu 120 μl Substrat (4,2 mg/ml o-Nitrophenyl-Cellobiosid) in 50 mM Kaliumphosphat, pH 6,7, zugesetzt. Die Platte wurde dann 10 Minuten lang bei 40°C inkubiert, und die Reaktionen wurden mit 70 μl 0,2 M Glycin gelöscht. Die Absorption bei 410 nm (aufgrund des nach enzymatischer Spaltung des Substrats freigesetzten o-Nitrophenols) wurde dann in einem Mikrotiterplatten-Lesegerät gemessen. Diese Endpunkt-410 nm-Ablesung war proportional zu der Cellulaseaktivität in der Enzymprobe.
Die Ergebnisse des Stabilitäts-Testens waren wie in der Tabelle 1 gezeigt: Tabelle 1

* "Stabil" bedeutet weniger als 20% Aktivitätsverlust in 200 Minuten.

Wie durch die obenstehenden Ergebnisse ersichtlich, hatten die EGIII-ähnlichen Cellulasen eine signifikant verbesserte Stabilität, obwohl sie relativ homolog zu EGIII aus T. reesei waren. Folglich ist es offensichtlich, dass die Reste, welche in den stabileren Homologen unterschiedlich sind, kritisch für die verbesserte Stabilität der EGIII-ähnlichen Cellulasen sind, und als solches wird eine weitere Verbesserung der EGIII-ähnlichen Cellulasen und von EGIII selbst durch Modifizieren dieser Reste zu zusätzlichen Verbesserungen in der Stabilität von EGIII und der EGIII-ähnlichen Enzyme führen.
Beispiel 3: Stabilität von EGIII mit Resten aus thermisch stabilen EGIII-ähnlichen Cellulasen
Die folgenden Primer wurden verwendet, um Cystein-Substitutionen in EGIII aus T. reesei und in der EGIII-ähnlichen Cellulase aus H. grisea zu erzeugen. Die PCR wurde gemäß allgemein bekannten Techniken durchgeführt.
Tabelle 2: PCR-Primer
Kurz gesagt, wurde DNA, welche T.reesei-EGIII codiert, aus einem cDNA-Klon (Ward et al., Proc. of the Tricel Symposium on "Trichoderma Reesei cellulases and other hydrolases", Espoo Finnland 1993, Hrsg.: Suominen, P. ans Reinikanen, T., Foundation for Biotechnical and Industrial Research, 8, S. 153–158: und U.S.-Patent Nr. 5 475 101) unter Verwendung von PCR-Primern amplifiziert, welche eine BglII-Restriktionsendonuklease-Stelle am 5'-Ende des egl3-Gens (unmittelbar stromaufwärts des ersten ATG-Codons) und eine XbaI-Stelle am 3'-Ende (unmittelbar stromabwärts des "Stop"-Codons) einführten. Das amplifizierte Fragment wurde dann mit BglII und XbaI verdaut und in pUC19, der mit BglII und XbaI verdaut worden war, ligiert.
Varianten wurden in diesem Plasmid unter Verwendung der QuikChange^TM-Mutagenesemethoden (Stratagene) hergestellt. Die Variantengene wurden dann in den Aspergillus-Expressionsvektor pGAPT-pyrG subkloniert. Dieser ist eine Variante von PGPT-pyrG (Berka und Barnett, Biotech. Adv. 7: 127 (1989)), in welchem nicht-essentielle DNA herausgeschnitten wurde. Vektoren, welche die Variantengene tragen, wurden dann in A. niger var. awamori transformiert, und die resultierenden Stämme wurden in Schüttelkolben-Kulturen wachsen gelassen (WO 98/31821).
EGIII-Varianten wurden dann aus zellfreien Überständen dieser Kulturen durch Säulenchro matogaphie gereinigt. Kurz gesagt, wurde ungefähr 1 ml Pharmacia Butyl-Sepharose (Fast Flow)-Harz pro 10 mg EGIII in eine Einweg-Tropfsäule mit 0,5 M Ammoniumsulfat geladen. Die Säule wurde dann mit 0,05 M Bis-Tris-Propan und 0,05 M Ammoniumacetat bei pH 8 äquilibriert.
Die EGIII-ähnliche Cellulase enthaltenden Überstände wurden über Nacht mit 0,18 mg/ml Endoglucanase H bei 37°C behandelt. Ammoniumsulfat wurde zu den behandelten Überständen zu einer Endkonzentration von ungefähr 0,5 M zugesetzt. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand auf die Säule geladen. Die Säule wurde dann mit 3 Volumen Äquilibrierungspuffer gewaschen und dann mit 2 × 1 Volumen an 0,05 M Bis-Tris-Propan und 0,05 M Ammoniumacetat, pH 8, eluiert. Jedes Volumen des Durchflusses wurde als eine separate Fraktion aufgefangen, wobei die EGIII-ähnliche Cellulase in der zweiten Fraktion erschien.
Gleichgewicht s-CD-Experimente wurden durchgeführt auf einem Aviv 62DS oder 62ADS-Spektrophotometer, ausgestattet mit einem 5-Positions thermoelektrischen Zellen-Halter, der von Aviv erworben wurde. Die Pufferbedingungen waren 50 mM Bis-Tris-Propan und 50 mM Ammoniumacetat, eingestellt auf pH 8,0 mit Essigsäure. Die End-Proteinkonzentration für jedes Experiment lag im Bereich von 5–30 mM. Daten wurden in einer Zelle mit 0,1 cm Weglänge erfasst.
Spektren wurden von 265 bis ~210 nm erfasst. Thermische Denaturierungen wurden bei 217 nm von 30 bis 90°C durchgeführt, wobei die Daten alle zwei Grad erfasst wurden. Die Äquilibrierungszeit bei jeder Temperatur betrug 0,1 Minuten, und Daten wurden während 4 Sekunden pro Probe erfasst.
Der Rest der pH 8,0-Probe wurde in 5 × 400 μl-Aliquots unterteilt. Zwei Proben wurden mit Essigsäure auf pH 5 und 7 eingestellt, und die zwei anderen wurden mit Natriumhydroxid auf pH 9 und 10 eingestellt. Thermische Denaturierungen aller fünf Proben wurden gleichzeitig durchgeführt, wie oben beschrieben. Die Schmelzpunkte wurden gemäß Verfahren von Luo et al., Biochemistry 34: 10669, und Gloss et al., Biochemistry 36: 5612 bestimmt.
Tabelle 3: Themische Stabilität von varianten EGIII-ähnlichen Cellulasen
Wie ersehen werden kann, hatte die Rekrutierung der bevorzugten Reste aus EGIII-Homologen in EGIII eine Vielzahl von Wirkungen. In einem Fall erhöhte das Andern des Alanins an der Position 35 zu einem Valin signifikant die thermische Stabilität des Enzyms. In einem anderen Fall verringerte das Ändern des Glycins an Position 31 zu einem Glutamin die thermische Stabilität des Enzyms.
Beispiel 4: Spezifische Aktivität von EGIII-ähnlichen Cellulasen
Um hinsichtlich die spezifische Aktivität zu prüfen, wurde ein NPC-Hydolyse-Assay verwendet. In einer Mikrotiterplatte wurden 100 μl 50 mM Natriumacetat, pH 5,5, und 20 μl 25 mg/ml o-NPC (o-Nitrophenyl-o-D-Cellobiosid (Sigma N 4764)) in Assaypuffer zugesetzt. Die Platte wurde 10 Minuten lang bei 40°C inkubiert.
Nach der Äquilibrierung wurden 10 μl EGIII-ähnliche Cellulase zugesetzt, und die Platte wurde bei 40°C weitere 10 Minuten inkubiert. Um die Hydrolyse abzulöschen und die Reaktion zu stoppen, wurden 70 μl 0,2 M Glycin, pH 10,0, zugesetzt. Die Platte wurde dann in einem Mikrotiterplatten-Lesegerät abgelesen. Als eine Richtlinie lieferten 10 μl einer 0,1 mg/ml Lösung von T.reesei-EGIII eine OD von etwa 0,3.
Die Konzentration von EGIII-ähnliche Cellulase wurde bestimmt durch Absorption bei 280 nm, wobei der Extinktionskoeffizient 78711 M^–1 cm^–1 oder 3,352 g/l^–1 betrug, wie experimen tell bestimmt wurde durch das Verfahren von Edelhoch, wie beschrieben in Pace et al., Pro. Sci. 4: 2411 (1995).
Tabelle 4: Spezifische Aktivität von EGIII-ähnlichen Cellulasen
Wie aus der Tabelle 4 ersehen werden kann, neigen Mutationen, welche die aus EGIII abgeleiteten EGIII-ähnlichen Cellulasen stabilisieren, dazu, Aktivität beizubehalten. Die Änderung an Position 31 zu Glutamin, welche die thermische Stabilität signifikant verringerte, verminderte auch die Aktivität in signifikanter Weise.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Variante EGIII- oder EGIII-ähnliche Cellulase, wobei die Variante eine Substitution mit einem Valinrest an einer Position, entsprechend dem Rest A35 in EGIII von aus Trichoderma reesei umfasst, wobei die Variante nicht Emericella desertorum-EGIII-ähnliche Cellulase ist.
Cellulase gemäß Anspruch 1, wobei die Cellulase aus einem Pilz, Bakterien oder einem Actinomyceten abgeleitet ist.
Cellulase gemäß Anspruch 2, wobei die Cellulase aus einem Pilz abgeleitet ist.
Cellulase gemäß Anspruch 3, wobei der Pilz ein filamentöser Pilz ist.
Cellulase gemäß Anspruch 4, wobei der filamentöse Pilz den Euascomyceten angehört.
Cellulase gemäß Anspruch 5, wobei es sich bei dem Euascomyceten um Aspergillus spp., Gliocladium spp., Fusarium spp., Acremonium spp., Myceliophthora spp., Verticillium spp., Myrothecium spp. oder Penicillium spp. handelt.
Variante EGIII-ähnliche Cellulase, wobei die Variante folgendes umfasst: a) eine Substitution mit einem Tyrosinrest an einer Position, entsprechend dem Rest W7 in EGIII von Trichoderma reesei und/oder eine Substitution mit einem Glutaminsäurerest an einer Position, entsprechend dem Rest T145 in EGIII von Trichoderma reesei, wobei die Variante nicht EGIII-ähnliche Cellulase von Hypocrea schweinitzii, Aspergillus aculeatus, Apergillus kawachii (1), Aspergillus kawachii (2), Aspergillus oryzae, Humicola grisea, Humicola insolens, Fusarium equiseti, Gliocladium roseum (1), Gliocladium roseum (3), Gliocladium roseum (4), Memnoniella echinata, Actinomycete 11AG8, Streptomyces lividans CelB oder Rhodothermus marinus ist; und/oder b) eine Substitution oder Deletion an einer Position, entsprechend dem Rest Y147 in EGIII von Trichoderma reesei, wobei die Variante nicht EGIII-ähnliche Cellulase von Aspergillus aculeatus, Apergillus kawachii (1), Aspergillus kawachii (2), Aspergillus oryzae, Humicola grisea, Humicola insolens, Chaetomium brasilliense, Fusarium equiseti, Gliocladium roseum (1), Gliocladium roseum (2), Gliocladium roseum (3), Gliocladium roseum (4), Actinomycete 11AG8, Streptomyces lividans CelB, Rhodothermus marinus oder Erwinia carotovara ist, und wobei die EGIII-ähnliche Cellulase aus einem Bakterium oder Pilz abgeleitet ist, wobei der Pilz Trichoderma nicht umfasst.
Cellulase gemäß Anspruch 7, wobei die EGIII-ähnliche Cellulase aus einem Euascomyceten abgeleitet ist, der den Hypocreaceae angehört.
Cellulase gemäß Anspruch 7 oder 8, wobei es sich bei der Substitution an einer Y147 entsprechenden Position um Y147W handelt.
Cellulase gemäß mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Cellulase eine Endoglucanase ist.
DNA, welche die Cellulase gemäß mindestens einem der vorangehenden Ansprüche codiert.
Vektor, welcher die DNA von Anspruch 11 umfasst.
Wirtszelle, welche mit dem Vektor von Anspruch 12 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung einer Cellulase, welches die folgenden Schritte umfasst: a) Kultivieren der Wirtszelle gemäß Anspruch 13 in einem geeigneten Kulturmedium unter geeigneten Bedingungen zur Herstellung der Cellulase; b) Erhalten der hergestellten Cellulase.
Reinigungsmittelzusammensetzung, umfassend ein Tensid und eine Cellulase, wobei die Cellulase eine variante Cellulase gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 umfasst.
Reinigungsmittel gemäß Anspruch 15, wobei das Reinigungsmittel ein Wäschewaschmittel ist.
Reinigungsmittel gemäß Anspruch 15, wobei das Reinigungsmittel ein Geschirrspülmittel ist.
Verwendung der varianten EGIII- oder EGIII-ähnlichen Cellulase gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 in der Behandlung einer Cellulose enthaltenden Textilie.
Verwendung der EGIII- oder EGIII-ähnlichen Cellulase gemäß Anspruch 18 beim 'Stonewashing' oder Indigo-gefärbten Denim.
Verwendung der EGIII- oder EGIII-ähnlichen Cellulase gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 als Futterzusatzstoff.
Verwendung der EGIII- oder EGIII-ähnlichen Cellulase gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 in der Behandlung von Holz-Zellstoff.
Verwendung der EGIII- oder EGIII-ähnlichen Cellulase gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 bei der Reduktion von Biomasse zu Glukose.
Verfahren zur Herstellung einer Enzymvariante aus EGIII- oder EGIII-ähnlicher Cellulase, umfassend das Substituieren mit einem Valinrest an einer Aminosäureposition in der EGIII- oder EGIII-ähnlichen Cellulase, entsprechend A35 in EGIII von Trichoderma reesei, durch: a) Modifizieren einer DNA-Sequenz, welche die EGIII- oder EGIII-ähnliche Cellulase codiert; b) Transformation dieser DNA-Sequenz in einen geeigneten Wirt; und c) Expression der modifizierten DNA-Sequenz zur Bildung des Varianten-Enzyms.
Verfahren zur Herstellung einer Enzymvariante aus EGIII-ähnlicher Cellulase, umfassend das Substituieren mit einem Tyrosinrest an einer Aminosäureposition in der EGIII-ähnlichen Cellulase, entsprechend W7 in EGIII von Trichoderma reesei, und/oder Substituieren mit einem Glutaminsäurerest an einer Aminosäureposition in der EGIII-ähnlichen Cellulase, entsprechend T145 in EGIII von Trichoderma reesei, und/oder Substituieren oder Deletieren einer Aminosäure an der Position in der EGIII-ähnlichen Cellulase, entsprechend Y147 in EGIII von Trichoderma reesei, durch: a) Modifizieren einer DNA-Sequenz, welche die EGIII-ähnliche Cellulase codiert; b) Transformation dieser DNA-Sequenz in einen geeigneten Wirt; und c) Expression der modifizierten DNA-Sequenz zur Bildung des Varianten-Enzyms; wobei die EGIII-ähnliche Cellulase aus einem Bakterium oder Pilz abgeleitet ist, wobei der Pilz Trichoderma nicht umfasst.