DE69931661T2

DE69931661T2 - Varianten der cellulase, die egiii änhelt, und zusammensetzungen, die diese enthalten

Info

Publication number: DE69931661T2
Application number: DE69931661T
Authority: DE
Inventors: Colin Half Moon Bay MITCHINSON; J. Dan Walnut Creek WENDT
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1998-12-18
Filing date: 1999-11-12
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2019-11-13
Also published as: EP1141336A2; WO2000037614A2; JP2002533071A; ES2267310T3; WO2000037614A3; DK1141336T3; AU2148100A; EP1141336B1; CA2355604A1; US6268328B1; ATE328090T1; JP2011087582A; DE69931661D1

Description

1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf neue Mutanten-Cellulase-Zusammensetzungen, welche verbesserte Stabilität aufweisen. Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung mutante Cellulase-Enzyme aus Pilzen und Bakterien, welche hinsichtlich der Sequenz verwandt zu von Trichoderma reesei hergestellter EGIII sind, aber welche bestimmte Mutationen aufweisen, die ihre Beständigkeit gegenüber Wärmebelastung modifizieren.
2. Stand der Technik
Cellulasen sind Enzyme, welche zur Hydrolyse der β-D-glucosidischen Bindungen in Zellulosen in der Lage sind. Zellulolytische Enzyme sind traditionell in drei Hauptklassen eingeteilt worden: Endoglucanasen, Exoglucanasen oder Zellobiohydrolasen und β-Glucosidasen (Knowles, J. et al., (1987), TIBTECH 5, 255-261); und werden bekanntermaßen von einer großen Anzahl von Bakterien, Hefen und Pilzen hergestellt.
Hauptrangig unter den Anwendungen, welche für die Verwendung von zellulolytischen Enzymen entwickelt worden sind, sind diejenigen, welche das Abbauen von (Holz)Zellulose-Zellstoff zu Zuckern für (Bio)Ethanol-Herstellung, Textilbehandlungen wie "Stonewashing" und "Biopolishing" und in Reinigungsmittel-Zusammensetzungen beinhalten. Somit sind Cellulasen bekanntermaßen nützlich in der Behandlung von mechanischem Zellstoff (siehe z. B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/16687). Darüber hinaus sind Cellulasen bekanntermaßen nützlich als ein Lebensmitteladditiv (siehe z. B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 91/04673) und beim Körner-Nassmahlen.
Allerdings werden Cellulasen, von besonderer Bedeutung, in der Behandlung von Textilien, d. h. in Waschmittel-Zusammensetzungen zum Unterstützen der Entfernung von Schmutz oder graulichen Ablagerungen (siehe z. B. G.B.-Anmeldungen Nr. 2 075 028, 2 095 275, 2 094 828, welche eine verbesserte Reinigungsleistung veranschaulichen, wenn Waschmittel Cellulase beinhalten), oder in der Behandlung von Textilien vor dem Verkauf zur Verbesserung des Gefühlseindrucks und des Aussehens des Textils verwendet. So veranschaulicht die G.B.-Anmeldung Nr. 1 358 599 die Verwendung von Cellulase in Waschmitteln zur Verringerung der Rauhigkeit baumwollhaltiger Textilien, und Cellulasen werden in der Behandlung von Textilien eingesetzt, um gebrauchte Textilien zu rekonditionieren, indem deren Farben kräftiger gemacht werden (siehe z. B. The Shizuoka Prefectural Hammamatsu Textile Industrial Research Institute Report, Band 24, S. 54-61 (1986)). Zum Beispiel führt das wiederholte Waschen von baumwollhaltigen Textilien zu einem gräulichen Überzug auf dem Kleidungsstück, welcher angenommenermaßen aufgrund zerstörter und ungeordneter Fibrillen zu Stande kommt, welche manchmal als "Pills" bezeichnet werden, was durch mechanische Einwirkung verursacht wird. Dieser gräuliche Belag ist besonders auf gefärbten Textilien bemerkbar. Als eine Folge ist das Vermögen von Cellulase, die in Unordnung geratene Oberseitenschicht der Faser zu entfernen und somit das Gesamtaussehen der Textilie zu verbessern, von Nutzen gewesen.
Somit ist von Cellulasen gezeigt worden, in vielen industriellen Verfahren effektiv zu sein. Folglich bestand auf dem Fachgebiet ein Trend, nach spezifischen Cellulasezusammensetzungen oder Komponenten zu suchen, welche besonders effektive Leistungsprofile in Bezug auf eine oder mehrere spezifische Anwendungen besitzen. Im Hinblick hierauf sind in Pilzen und Bakterien hergestellte (exprimierte) Cellulasen ein Gegenstand der Aufmerksamkeit gewesen. Beispielsweise erfuhr Cellulase, welche von bestimmten Pilzen, wie Trichoderma spp. (insbesondere Trichoderma longibrachiatum) hergestellt wurde, viel Aufmerksamkeit, weil ein komplettes Cellulasesystem, welches zum Abbauen kristalliner Formen von Zellulose in der Lage ist, leicht in großen Mengen mittels Fermentationsvorgehensweisen hergestellt wird. Dieser spezifische Cellulasekomplex ist umfassend analysiert worden, um die Natur seiner spezifischen Komponenten und das Vermögen dieser Komponenten, Leistung in industriellen Verfahren aufzuzeigen, zu bestimmen. Beispielsweise offenbaren Wood et al., "Methods in Enzymology", 160, 25, Seiten 234 ff. (1988), dass vollständige Pilz-Cellulasesysteme mehrere unterschiedliche Enzymklassifikationen umfassen, einschließlich denjenigen, identifiziert als Exo-Cellobiohydrolasen (EC 3.2.1.91) ("CBH"), Endoglucanasen (EC 3.2.1.4) ("EG") und β-Glucosidasen (EC 3.2.1.21) ("BG"). Die PilzCellulaseklassifikationen CBH, EG und BG können weiter ausgedehnt werden, um mehrere Komponenten innerhalb jeder Klassifikation einzuschließen. Das U.S.-Patent Nr. 5 475 101 (Ward et al.) und die PCT-Anmeldung WO 94/21801 offenbaren die Reinigung und molekulare Klonierung eines besonders nützlichen Enzyms, das EGIII genannt wird, welches aus Trichoderma longibrachiatum abgeleitet wird.
Die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94/14953 offenbart Endoglukanasen, welche von einer Nukleinsäure codiert werden, welche eine beliebige einer Reihe von DNA-Sequenzen, welche jeweils 20 Nukleotide aufweisen, umfasst.
Ooi et al., Curr. Genet., Bd. 18, S. 217-222 (1990), offenbaren die cDNA-Sequenz, codierend für Endoglucanase F1-CMC, hergestellt von Aspergillus aculeatus, welche die Aminosäurefolgen NNLWG, ELMIW und GTEPFT enthält. Sakamoto et al., Curr. Genet., Band 27, S. 435-439 (1995), offenbart die cDNA-Sequenz, codierend die Endoglukanase CMCase-1 aus Aspergillus kawachii IFO 4308, welche die Aminosäurefolgen ELMIW und GTEPFT enthält. Ward et al. offenbart die Sequenz von EGIII, welche die Aminosäurefolgen NNLWG, ELMIW und GTEPFT aufweist. Zusätzlich dazu werden zwei Cellulase-Sequenzen, eine aus Erwinia carotovara und Rhodothermus marinus in Saarilahti et al., Gene, Band 90, S. 9-14 (1990), und Hreggvidsson et al., Appl. Environ. Microb., Band 62, Nr. 8, S. 3047-3049 (1996), offenbart, welche die Aminosäurefolge ELMIW enthalten.
Trotz der Kenntnis im Fachgebiet in Bezug auf viele Cellulasezusammensetzungen mit Anwendungen in manchen oder allen der oben stehenden Bereiche besteht ein fortgesetzter Bedarf für neue Cellulasezusammensetzungen, welche eine verbesserte Stabilität unter Bedingungen aufweisen, die in Anwendungen herrschen, für welche Cellulasen brauchbar sind, d. h. Haushaltsreinigungsmittel, "Stonewashing"-Zusammensetzungen oder Wäschewaschmittel.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein Ziel der Erfindung, neue variante bzw. veränderte EGIII- oder EGIII-ähnliche Cellulase-Zusammensetzungen vorzusehen, welche eine veränderte Wärmestabilität aufweisen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine veränderte EGIII- oder EGIII-ähnliche Cellulase bzw. EGIII- oder EGIII-ähnliche Cellulase-Variante bereitgestellt, worin eine oder mehrere Aminosäuren modifiziert oder deletiert sind, um eine modifizierte Wärmestabilität im Vergleich zum Wildtyp-Enzym zu vermitteln. Die Aminosäuren, welche modifiziert werden sollen, entsprechen hinsichtlich der Position den Resten G31, N164 oder N174 in reifer EGIII aus Trichoderma reseei. Vorzugsweise entsprechen die modifizierten Aminosäuren G31Q, N164D oder N174D.
Das Wildtyp-Enzym ist eine Pilz-, Bakterien- oder Actinomyceten-Cellulase, welche wenigstens 60 % Aminosäureidentität zu EGIII aus Trichoderma reseei aufweist. Vorzugs weise wird das Enzym aus einer Pilz- oder Bakterien-Quelle, am stärksten bevorzugt aus einem filamentösen Pilz, abgeleitet.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine DNA, welche die veränderte EGIII- oder EGIII-ähnliche Cellulase gemäß der Erfindung codiert, vorgesehen. Ebenfalls werden Expressionsvektoren, welche diese DNA umfassen, Wirtszellen, welche mit derartigen Expressionsvektoren transformiert sind, sowie veränderte EGIII- oder EGIII-ähnliche Cellulasen, welche von derartigen Wirtszellen hergestellt werden, vorgesehen.
Wie ausführlicher unten stehend gezeigt wird, sind die hierin identifizierten Substitutionen wichtig für die Stabilität von EGIII- und EGIII-ähnlichen Enzymen, insbesondere unter thermischer Belastung. Folglich liegt es innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, das EGIII- oder EGIII-ähnliche Enzym bei der Textilbehandlung, z. B. in Wäschewaschmittel- oder "Stonewashing"-Zusammensetzungen, bei der Reduktion von Biomasse, bei der Herstellung von Futter-Additiven oder der Behandlung von Futter, bei der Behandlung von Holzzellstoff für die Herstellung von Papier oder Produkten auf Zellstoffbasis und bei der Behandlung von Stärke während des Korn-Nassmahlens oder -Trockenmahlens, zur Erleichterung der Herstellung von Glukose, Maissirup mit hohem Fructosegehalt und/oder Alkohol, zu verwenden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 veranschaulicht die Aminosäuresequenz von reifem EGIII-Protein aus Trichoderma longibrachiatum, wobei die gemäß der vorliegenden Erfindung beschriebenen Reste gezeigt sind.
Die 2 veranschaulicht die DNA-Sequenz von EGIII aus Trichoderma longibrachiatum ohne Introns.
Die 3 veranschaulicht eine Alignierung der Volllängensequenz von 20 EGIII-ähnlichen Cellulasen in Parallel-Übereinanderstellung mit EGIII, wobei äquivalente Reste auf der Basis einer Primärsequenz-Modellierung angezeigt werden, einschließlich derjenigen, abgeleitet aus Trichoderma reesei, Hypocrea schweinitzii, Aspergillus aculeatus, Apergillus kawachii (1), Aspergillus kawachii (2), Aspergillus oryzae, Humicola grisea, Humicola insolens, Chaetomium brasilliense, Fusarium equiseti, Fusarium javanicum (1), Fusarium javanicum (2), Gliocladium roseum (1), Gliocladium roseum (2), Gliocladium roseum (3), Gliocladium roseum (4), Memnoniella echinata, Emericella desertorum, Actinomycete 11AG8, Streptomyces lividans CelB, Rhodothermus marinus und Erwinia carotovara.
Die 4 veranschaulicht eine Alignierung der Volllängen-Sequenz von 7 EGIII-ähnlichen Cellulasen in Alignierung mit EGIII, wobei äquivalente Reste basierend auf einer Primärsequenz-Modellierung gezeigt werden, einschließlich denjenigen, abgeleitet aus Humicola insolens, Humicola grisea, Trichoderma reesei, Hypocrea schweinitzii, Memnonella echinada, Fusarium javanicum und Emericella desertorum.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Anmelder haben neue Mitglieder einer Familie von Cellulasen isoliert, welche Homologie zu EGIII aus Trichoderma reesei aufweisen. Die Analyse dieser Cellulasen hat zu einem differenziellen Leistungsverhalten unter den Cellulasen geführt, trotz der signifikanten Homologie. Insbesondere wurde festgestellt, dass die EGIII-ähnlichen Cellulasen aus Humicola insolens, Humicola grisea, Memnonella echinada, Fusarium javanicum und Emericella desertorum eine höherwertige Leistung unter Bedingungen einer Wärmebelastung aufweisen. Durch Vergleichen der Reste in diesen EGIII-ähnlichen Cellulasen von höherer Leistung mit denjenigen von EGIII ist es möglich, Rest-Unterschiede zwischen den stabileren Cellulasen und EGIII zu identifizieren, wodurch ebenfalls Reste identifiziert werden, welche wichtig für die verbesserte thermische Stabilität der stabileren EGIII-ähnlichen Cellulasen sind. Folglich sollte es, durch Optimieren der Reste in den EGIII-ähnlichen Cellulasen, welche von EGIII abweichen, möglich sein, die Wärmestabilität der EGIII-ähnlichen Cellulasen weiter zu verbessern. In ähnlicher Weise ist es, durch Vergleichen der Reste in diesen verhältnismäßig stabileren EGIII-ähnlichen Cellulasen mit denjenigen von EGIII oder weniger stabilen Homologen möglich, Rest-Unterschiede zwischen den stabileren Cellulasen und EGIII oder weniger stabilen EGIII-ähnlichen Cellulasen zu identifizieren, wodurch ebenfalls Reste identifiziert werden, welche für die verbesserte Wärmestabilität der stabileren EGIII-ähnlichen Cellulasen wichtig sind. Folglich wird es, durch Verändern dieser Reste in EGIII oder anderen weniger stabilen EGIII-ähnlichen Cellulasen möglich sein, die Wärmestabilität von EGIII weiter zu verbessern. Sequenz-Alignierungen können unter Verwendung von verschiedenen EGIII-ähnlichen Cellulasen aufgestellt werden, und können geringfügig von einer Alignierung zu einer anderen abweichen, abhängig von der Anzahl von Sequenzen und dem Grad der Homologie. Geeignete Experimente zum Bestimmen passender Modifikationen sind für den Durchschnittsfachmann im Zusammenhang mit der vorliegenden Beschreibung eine Routineangelegenheit.
In einigen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung eine veränderte EGIII- oder EGIII-ähnliche Cellulase bereit, welche weniger Wärmestabilität als die Wildtyp-EGIII oder EG-ähnlichen Cellulasen, die hierin vorgesehen werden, aufweist.
In anderen Ausführungsformen kann der zu modifizierende Rest zu einem Rest verändert werden, welcher dem Enzym zusätzliche Wärmestabilität verleiht. Das verbesserte Protein gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst eine Aminosäuresequenz, welche aus der Aminosäuresequenz eines Vorläuferproteins abgeleitet ist. Das Vorläuferprotein kann ein natürlich vorkommendes Protein oder ein rekombinantes Protein sein. Die Aminosäuresequenz des verbesserten Proteins wird aus der Aminosäuresequenz des Vorläuferproteins durch die Substitution, Deletion oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren der Vorläufer-Aminosäuresequenz abgeleitet. Eine solche Modifikation erfolgt generell eher an der Vorläufer-DNA-Sequenz, welche die Aminosäuresequenz der Vorläuferproteine codiert, anstatt als Manipulation des Vorläuferproteins an sich. Geeignete Verfahren für eine derartige Manipulation der Vorläufer-DNA-Sequenz schließen Verfahren ein, welche hierin und in den, der Allgemeinheit übereigneten, U.S.-Patenten Nr. 4 760 025 und 5 185 258 offenbart werden.
Innerhalb der Beschreibung werden bestimmte Begriffe offenbart, welche nachstehend definiert sind, um die Beschaffenheit der beanspruchten Erfindung zu verdeutlichen.
"Cellulase" ist eine gut klassifizierte Kategorie von Enzymen im Fachgebiet und schließt Enzyme ein, fähig zum Hydrolysieren von Zellulosepolymeren zu kürzeren Cellooligosaccharid-Oligomeren, Cellobiose und/oder Glukose. Übliche Beispiele für Cellulase-Enzyme schließen Exo-Cellobiohydrolasen und Endoglukanasen ein und sind aus vielen Spezies von zellulolytischen Organismen erhältlich, insbesondere einschließlich Pilzen und Bakterien.
"EGIII"-Cellulase bezieht sich auf die Endoglukanase-Komponente, welche beschrieben wird in Ward et al., U.S.-Patent Nr. 5 475 101, und Proceedings on the Second TRICEL Symposium on Trichoderma Reesei Cellulases And Other Hydrolyses, Hrsg.: Suominen & Reinikainen, Espoo Finnland (1993), S. 153-158 (Fondation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research, Band 8). Wie hierin offenbart, wird EGIII aus Trichoderma reesei (longibrachiatum) abgeleitet und ist durch ein pH-Optimum von etwa 5,8, einen isoelektrischen Punkt (pi) von etwa 7,4 und ein Molekulargewicht von etwa 25 kD gekennzeichnet. Das üblicherweise als EGII bezeichnete Enzym aus Trichoderma reesei ist früher in der Literatur von manchen Autoren mittels der Nomenklatur EGIII bezeichnet worden, aber dieses Enzym unterscheidet sich wesentlich von dem Enzym, welches hierin hinsichtlich Molekulargewicht, pI und pH-Optimum als EGIII definiert wird.
"EGIII-ähnliches Enzym", "EGIII-ähnliches Protein" oder "EGIII-ähnliche Cellulase" gemäß der vorliegenden Erfindung bedeuten Enzyme, welche mit EGIII verwandt sind, dadurch, dass sie gewisse Aminosäurefolgen mit EGIII gemeinsam haben. Wie hierin verwendet, wird mit EGIII-ähnliche Cellulase ebenfalls beabsichtigt, EGIII aus Trichoderma reesei einzuschließen. Somit umfasst eine EGIII-ähnliche Cellulase ein Enzym mit zellulolytischer Aktivität, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die darin einen Aminosäureabschnitt umfasst, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem oder mehreren von:

(a) Asn-Asn-(Leu/Phe/Lys/Ile)-Trp-Gly
(b) Glu-(Leu/Phe/Ile)-Met-Ile-Trp
(c) Gly-Thr-Glu-Pro-Phe-Thr;
(d) (Ser/Tyr/Cys/Trp/Thr/Asn/Lys/Arg)-(Val/Pro)-(Lys/Ala)-(Ser/Ala)-(Tyr/Phe); und
(e) Lys-Asn-Phe-Phe-Asn-Tyr.

Das Enzym der Erfindung besitzt fernerhin wenigstens 60 % Aminosäureidentität zu reifer EGIII aus Trichoderma reesei.
Wildtyp-EGIII-ähnliche Cellulasen werden aus Bakterien-, Pilz- oder Actinumyceten-Quellen, und genauer gesagt aus einem Actinomycet, einem Bazillus oder einem filamentösen Pilz, abgeleitet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Cellulase aus der filamentösen Pilz-Familie Metazoa, vorzugsweise Euascomycetes, abgeleitet. Innerhalb der Metazoa schließen phylogenetische Pilz-Klassifikationen, welche EGIII-ähnliche Cellulasen herstellen, die mitosporischen Pyrenomyceten (einschließlich Acremonium), Sordariales (einschließlich Thielavia), Hypocreales (einschließlich Nectriaceae, wie Fusarium, Necitia, Verticillium, Myrothecium und Gliocladium; und Hypocrea) und Eurotiales (einschließlich mitosporischen Trichocomaceae wie Aspergillus und Penicillium) ein.
Der Euascomycet gehört vorzugsweise den Diaporthales, Halosphaeriales, Microascales, Ophiostomatales, Phyllachorales, Sordariales oder Xylariales an. Ebenfalls bevorzugt gehört der Euascomycet den Hypocreales an, umfassend Clavicipitaceae, Melanosporaceae, Nectriaceae, Niessliaceae oder mitosporische Hypocreales. Weiter bevorzugt gehört der Euascomycet den Hypocreaceae an, wobei die besagten Hypocreaceae nicht Trichoderma umfassen. Am stärksten bevorzugt handelt es sich bei dem Euascomyceten um Gliocladium spp., Fusarium spp., Acremonium spp., Myceliophtora spp., Verticillium spp., Myrothecium spp., Penicillum spp., Chaetomium spp., Emercella spp., und Phanerochaete spp. Spezifische Organismen, welche in Betracht gezogen werden als EGIII-ähnliche Cellulasen aufweisend, schließen Chaetomium thermophilum var. therm., Chaetomium atrobrunneum, Chaetomium brasiliense, Chaetomium globosum, Chaetomium vitellium, Paecilomyces lilacinus, Chaetomium thermophilum vr. dissitum, Humicola insolens, Humicola brevis, Memnoniella echinata, Fusarium equiseti, Fusarium oxysporum, Fusarium stilboides, Myceliophthora thermophila, Fusarium javanicum, Humicola grisea vr. thermoidea, Stibella thermophila, Melanocarpus albomyces, Arthrobotrys superba, Myceliophthora hinunilea, Chaetomium pachypodiodes, Myrothecium verrucaria, Penicillium crysogenum, Malbranchea sulfurea, Lunulospora curvula, Emericella desertorum, Acremonium strictum, Cylindrocarpon heteronema und Ulocladium chartarum ein. Innerhalb der Actinomyceten scheint Streptomyces EGIII-ähnliche Cellulasen aufzuweisen.
EGIII-ähnliche Cellulasen gemäß der Erfindung können gemäß der folgenden Verfahren erhalten werden. DNA-Primer werden konstruiert, welche eine Aminosäuresequenz codieren, gewählt aus der Gruppe, die aus einem oder mehreren von:

In einer bevorzugten Ausführungsform gemäß dieses Aspekts der Erfindung werden degenerierte Primer hergestellt, entsprechend einem oder mehreren der oben stehenden Peptide. Die Peptide werden mit einer genomischen DNA aus einem Zielorganismus (d. h. dem Organismus, in welchem die EGIII-ähnliche Cellulase gesucht wird) unter Bedingungen kombiniert, die zum Einleiten einer standardmäßigen PCR-Reaktion geeignet sind. In dieser Ausführungsform ist es vorteilhaft, degenerierte Primer zu wählen, entsprechend den Peptiden (a) und/oder (d), sowie Primer, entsprechend zu (c) und/oder (e), und eine PCR mit diesen Peptiden durchzuführen. Nachdem die PCR-Reaktion durchgeführt worden ist, wird die resultierende DNA auf einem Polyacrylamidgel laufen gelassen, und Banden, welche hinsichtlich der Größe dem EGIII-Fragment entsprechen, umfassend die Peptide (a) und/oder (d) zusätzlich zu (c) und/oder (e), d. h. diejenigen im Bereich von 400-1000 Basenpaaren, werden ausgewählt. Diese Fragmente werden vereinigt und unter Verwendung von Primern, entsprechend den Peptiden (a) und/oder (d), sowie Primern, entsprechend Peptid (b), oder alternativerweise unter Verwendung von Primern entsprechend Peptid (c) und/oder (e), sowie Primern entsprechend Peptid (b), erneut amplifiziert. Starke Banden der erwarteten Größe (im Falle von EGIII-ähnlichen Cellulasen werden die Banden einem Basenpaarbereich von ungefähr 250-500 entsprechen) werden herausgeschnitten und sequenziert. Die Sequenz wird dann verwendet, um exakt passende Primer zu entwerfen, und diese Primer werden mit der Technik verwendet, welche als "rasche Amplifikation von genomischen DNA-Enden" bezeichnet wird, um das Volllängen-Gen zu erhalten, siehe z. B. Mizobuchi et al., BioTechniques, Band 15, Nr. 2, S. 215-216 (1993).
Es ist allerdings ebenfalls möglich, die degenerierten DNA's als Hybridisierungssonden gegen eine genomische Bibliothek zu verwenden, die aus einem Zielorganismus erhalten wird, um zu analysieren, ob ein gegebenes Fragment zu einer ähnlichen Sequenz in dem Zielorganismus korreliert ist. Ein nützlicher Hybridisierungs-Assay ist wie folgend beschaffen: Genomische DNA aus einer jeweiligen Zielquelle wird durch Verdau mit einem Restriktionsenzym(en), z. B. EcoR I, Hind III, Bam HI, Cla I, Kpn I, Mlu I, Spe I, Bgl II, Nco I, Xba I, Xho I und Xma I (geliefert von New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, und Boehringer Mannheim) gemäß den Anweisungen der Hersteller fragmentiert. Die Proben werden dann durch ein Agarose-Gel (wie zum Beispiel 0,7 % Agarose) so elektrophoretisiert, dass eine Trennung von DNA-Fragmenten der Größe nach sichtbar gemacht werden kann. Das Gel kann kurz in destilliertem H₂O gespült und anschließend in einer geeigneten Lösung (wie beispielsweise 0,25 M HCl) unter vorsichtigem Schütteln depuriniert werden, gefolgt von 30 Minuten langer Denaturierung (in zum Beispiel 0,4 M NaOH). Ein Renaturierungsschritt kann eingeschlossen werden, in welchem das Gel bei sanftem Schütteln in 1,5 M NaCl, 1 M Tris, pH 7,0, während 30 Minuten eingebracht wird. Die DNA sollte dann auf eine geeignete, positiv geladene Membran überführt werden, beispielsweise die Maximum Strength Nytran Plus-Membran (Schleicher & Schuell, Keene, N.H.), wobei eine Transferlösung verwendet wird (wie zum Beispiel 6 X SSC (900 mM NaCl, 90 mM Trinatriumcitrat)). Nachdem der Transfer vollständig ist, im Allgemeinen nach etwa 2 Stunden oder mehr, wird die Membran gespült und bei Raumtemperatur luftgetrocknet nach Verwenden einer Spüllösung (wie zum Beispiel 2X SSC [2X SSC = 300 mM NaCl, 30 mM Trinatriumcitrat]). Die Membran sollte dann (etwa 2 Stunden lang oder mehr) in einer geeigneten Vorhybridisierungslösung (wie zum Beispiel eine wässrige Lösung, enthaltend pro 100 ml: 30-50 ml Formamid, 25 ml 20X SSPE (1X SSPE = 0,18 M NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM NaH₂PO₄, pH 7,7), 2,5 ml 20 % SDS, 1 ml von 10 mg/ml gescherter Heringssperma-DNA) prähybridisiert werden.
Eine DNA-Sonde, entsprechend den oben stehenden Peptid-Sequenzen, sollte durch Elektrophorese in einem Agarose-Gel isoliert werden, das Fragment aus dem Gel ausgeschnitten und aus der ausgeschnittenen Agarose zurückgewonnen werden. Dieses gereinigte DNA-Fragment wird dann markiert (zum Beispiel unter Verwendung des Megaprime-Markierungssystems gemäß den Anweisungen des Herstellers zum Einbauen von P³² in die DNA (Amersham International plc, Buckinghamshire, England)). Die markierte Sonde wird durch Erhitzen auf 95°C während 5 Minuten denaturiert und unverzüglich zu der oben genannten Vorhybridisierungslösung, welche die Membran enthält, zugesetzt. Die Hybridisierungsreaktion sollte während einer angemessenen Zeit und unter passenden Bedingungen, zum Beispiel 18 Stunden lang bei 37 °C unter vorsichtigem Schütteln vor sich gehen. Die Membran wird gespült (zum Beispiel in 2X SSC/0,3 % SDS) und dann mit einer geeigneten Waschlösung und bei vorsichtigem Bewegen gewaschen. Die gewünschte Stringenz wird eine Reflexion der Bedingungen sein, unter welchen die Membran (Filter) gewaschen wird.
Spezifisch wird die Stringenz einer gegebenen Reaktion (d. h. der Grad an Homologie, der für eine erfolgreiche Hybridisierung notwendig ist) in großem Maße von den Waschbedingungen abhängen, an welche der Filter aus dem Southern-Blot nach der Hybridisierung unterzogen wird. "Niedrig-Stringenz"-Bedingungen, wie hierin definiert, werden das Waschen eines Filters aus einem Southern-Blot mit einer Lösung von 0,2X SSC/0,1 % SDS bei 20°C während 15 Minuten umfassen. Standard-Stringenz-Bedingungen umfassen einen weiteren Waschschritt, umfassend das Waschen des Filters aus dem Southern-Blot für ein zweites Mal mit einer Lösung von 0,2X SSC/0,1 % SDS bei 37°C während 30 Minuten.
Die DNA, welche mit den oben stehend umrissenen DNA-Primern hybridisiert, und somit – identifiziert durch dieses Verfahren – ein entsprechendes EGIII-codierendes Gen, kann mittels Routineverfahren isoliert und verwendet werden, um die entsprechende EGIII-ähnliche Cellulase gemäß Routinetechniken zu exprimieren. Ein bevorzugtes Klonierungsvorgehen umfasst die rasche Amplifikation von genomischen DNA-Enden, welche z. B. in Mizobuchi et al., BioTechniques, Band 15, Nr. 2, S. 215-216 (1993) beschrieben wird. Nach Erhalten des klonierten Gens werden Routineverfahren zum Einführen der DNA in einen Vektor, welcher dann in eine geeignete Wirtszelle transformiert werden kann, angewandt. Das Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen führt dann zur Produktion der EGIII-ähnlichen Cellulase, welche erhalten, gereinigt und präpariert werden kann, wie es für eine jeweilige Anwendung notwendig ist.
Die EGIII-ähnlichen Cellulasen der Erfindung werden vorzugsweise isoliert oder gereinigt. Im Kontext der vorliegenden Erfindung bedeutet Reinigung oder Isolierung im Allgemeinen, dass die EGIII-ähnliche Cellulase von ihrem natürlichen Zustand vermittels der Trennung der EGIII-ähnlichen Cellulase von einigen oder allen der natürlich vorkommenden Substituenten, mit denen sie in der Natur assoziiert ist, z. B. dem Herkunftsorganismus oder anderen Cellulasen oder Enzymen, welche von dem Herkunftsorganismus im Zusammenhang mit der EGIII-Zelle exprimiert werden, verändert wird. In ähnlicher Weise können die EGIII-ähnlichen Cellulasen der Erfindung mit anderen Komponenten vereinigt werden, welche nicht natürlicherweise in dem natürlichen Zustand vorhanden sind. Die Isolierung oder Reinigung kann durch im Fachgebiet anerkannte Trennungstechniken bewerkstelligt werden, wie Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, hydrophobe Abtrennung, Dialyse, Proteasebehandlung, Ammoniumsulfat-Präzipitation oder andere Protein-Salzfällungs-Techniken, Zentrifugation, Größenausschluss-Chromatographie, Filtration, Mikrofiltration, Gel-Elektrophorese oder Trennung auf einem Gradienten zur Entfernung von gesamten Zellen, Zelltrümmern, Verunreinigungen, fremden Proteinen oder in der Endzusammensetzung unerwünschten Enzymen.
Ein Rest in einer EGIII-ähnlichen Cellulase, welcher "entspricht" oder "äquivalent ist" zu einem Rest, der in EGIII vorhanden ist, bedeutet einen Rest, welcher in einer äquivalenten Position zu derjenigen in EGIII existiert, wie angezeigt durch Primärsequenzhomologie, Tertiärstruktur-Homologie (wie gezeigt, d. h. durch Kristallstruktur oder Computermodellierung) oder funktionelle Äquivalenz. Eine veränderte EGIII-ähnliche Cellulase besitzt eine Aminosäuresequenz, welche von der Aminosäuresequenz einer EGIII-ähnlichen Vorläufer-Cellulase abgeleitet ist. Die Vorläufer-Cellulasen schließen natürlich vorkommende Cellulasen und rekombinante Cellulasen (wie hierin definiert) ein. Die Aminosäuresequenz der EGIII-ähnlichen Cellulase-Variante wird aus der Aminosäuresequenz der EGIII-ähnlichen VorläuferCellulase durch die Substitution oder Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren der Vorläufer-Aminosäuresequenz abgeleitet. Eine solche Modifikation erfolgt eher an der Vorläufer-DNA-Sequenz, welche die Aminosäuresequenz der Vorläufer-Cellulase codiert, anstatt als Manipulation des Vorläufer-Cellulase-Enzyms selbst. Geeignete Verfahren für eine derartige Manipulation der Vorläufer-DNA-Sequenz schließen Verfahren ein, welche hierin und in den in im gemeinsamen Besitzt befindlichen U.S.-Patenten 4 760 025 und 5 185 258 offenbart werden. Spezifische Reste, entsprechend den Positionen, welche für die Instabilität in Gegenwart von Tensid verantwortlich sind, werden hierin für eine Substitution oder Deletion identifiziert. Die Aminosäure-Positionsnummer (d. h. +11) bezieht sich auf die Nummer, welche der reifen Trichoderma reesei-EGIII-Sequenz zugewiesen wird, die in der
1 präsentiert ist. Die Erfindung richtet sich auf die Mutation von EGIII-ähnlichen Cellulasen, welche Aminosäurereste an Positionen enthalten, welche äquivalent zu dem jeweilig identifizierten Rest in reifer EGIII von Trichoderma reesei sind. Ein Rest (Aminosäure) einer Vorläufer-Cellulase ist äquivalent zu einem Rest von Trichoderma reesei-EGIII, wenn er entweder homolog (d. h. hinsichtlich Position in entweder Primär- oder Tertiärstruktur entsprechend) oder funktionell analog zu einem spezifischen Rest oder Teil dieses Restes in Trichoderma reesei-EGIII ist (d. h. dieselbe oder eine ähnliche funktionelle Fähigkeit, zu kombinieren, reagieren oder chemisch oder strukturell zu interagieren, aufweist). Wie hierin verwendet, wird mit der Nummerierung beabsichtigt, jener der reifen EGIII-Aminosäuresequenz zu entsprechen, wie sie in der 1 veranschaulicht ist.
"Zellulose-enthaltende Textilie" bedeutet jedwede vernähten oder nicht-genähten Textilien, Garne oder Fasern, hergestellt aus Baumwolle- oder Nicht-Baumwolle-enthaltender Zellulose oder Baumwolle- oder Nicht-Baumwolle-enthaltenden Zellulosegemischen, einschließlich natürlichen Zellulosestoffen und vom Menschen hergestellte Zellulosestoffen (wie Jute, Flache, Ramie, Rayon und Lyocell). Eingeschlossen unter dem Überbegriff "vom Menschen hergestellte zellulosehaltige Textilien" sind regenerierte Textilien, welche im Fachgebiet als Rayon gut bekannt sind. Andere vom Menschen hergestellte zellulosehaltige Textilien schließen chemisch modifizierte Zellulosefasern (z. B. Zellulose, derivatisiert mittels Acetat) und Lösungsmittel-gesponnene Zellulosefasern (z. B. Lyocell) ein. Spezifisch eingeschlossen innerhalb der Definition von zellulosehaltiger Textilie ist jedweder Garn oder Faser, welcher) aus solchen Materialien hergestellt wird. Zellulosehaltige Materialien werden häufig in Mischungen mit Materialien eingebunden, wie synthetischen Fasern und natürlichen nicht-zelluloseartigen Fasern, wie Wolle und Seide.
"Baumwollhaltige Textilie" bedeutet genähte oder ungenähte Textilien, Garne oder Fasern, die aus reiner Baumwolle oder Baumwollmischungen hergestellt sind, einschließlich Baumwoll-Webtextilien, Baumwoll-Strickwaren, Baumwoll-Jeansstoffen, Baumwoll-Garnen, Roh-Baumwolle und dergleichen. Wenn Baumwoll-Mischungen verwendet werden, beläuft sich die Menge an Baumwolle in der Textilie vorzugsweise auf wenigstens etwa 35 Gewichtsprozent Baumwolle. Bei Verwendung als Mischungen können die in der Textilie verwendeten Begleitmaterialien eine oder mehrere Nicht-Baumwoll-Fasern einschließen, einschließlich zelluloseartigen oder synthetischen Fasern, wie Polyamidfasern (zum Beispiel Nylon 6 und Nylon 66), Acrylfasern (zum Beispiel Polyacrylnitrilfasern) und Polyesterfasern (zum Beispiel Polyethylenterephthalat), Polyvinylalkoholfasern (zum Beispiel Vinylon), Polyvinylchloridfasern, Polyvinylidenchloridfasern, Polyurethanfasern, Polyharnstoff-Fasern und Aramid-Fasern.
"Stonewashing-Zusammensetzung" bedeutet eine Formulierung zur Verwendung beim Stonewashing von zellulosehaltigen Textilien. Stonewashing-Zusammensetzungen werden verwendet, um zellulosehaltige Textilien vor der Präsentation zum Verbraucherverkauf, d. h. des Herstellungsverfahrenes, zu modifizieren. Im Gegensatz dazu sind Waschmittel-Zusammensetzungen für die Reinigung von verschmutzter Kleidung beabsichtigt.
"Stonewashing" bedeutet die Behandlung von zellulosehaltigen Textilien mit einer Cellulase-Lösung unter Bewegungs- und Abrollungsbedingungen, d. h. in einer Waschmaschine mit Rotationstrommel, um dem Jeansstoff ein "stonewashed"-Aussehen zu verleihen. Die Cellulaselösung gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung von Steinen in derartigen im Fach anerkannten Verfahren entweder vollständig oder teilweise funktionell ersetzen. Verfahren zum Verleihen eines "stonewashed"-Aussehens an Jeansstoff sind im U.S.-Patent Nr. 4 832 864 beschrieben. Im Allgemeinen sind Stonewashing-Techniken auf Indigogefärbten Baumwoll-Jeansstoff angewandt worden.
"Waschmittel-Zusammensetzung" bezeichnet eine Mischung, welche zur Verwendung in einem Waschmedium für das Wäschewaschen von verschmutzten zellulosehaltigen Textilien beabsichtigt ist. Im Kontext der vorliegenden Erfindung können derartige Zusammensetzungen, zusätzlich zu Cellulasen und Tensiden, zusätzliche hydrolytische Enzyme, Builder, Bleichmittel, Bleichaktivatoren, Bläuungsmittel und fluoreszierende Farbstoffe, Verklumpungsinhibitoren, Maskierungsmittel, Cellulase-Aktivatoren, Antioxidationsmittel und Solubilisierungsmittel einschließen. Derartige Zusammensetzungen werden im Allgemeinen zum Reinigen von verschmutzten Kleidern verwendet und werden nicht während des Herstellungsverfahrens eingesetzt, im Gegensatz zu Stonewashing-Zusammensetzungen. Waschmittelzusammensetzungen, welche Cellulase umfassen, werden beispielsweise in Clarkson et al., U.S.-Patent Nr. 5 290 474, und EP-Veröffentlichung Nr. 271 004 beschrieben.
"Variante" bedeutet ein Protein, welches aus einem Vorläuferprotein (z. B. dem nativen Protein) durch Addition einer oder mehrere Aminosäuren entweder an einem oder beiden von dem C- und N-terminalen Ende, Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren an einer oder einer Anzahl von verschiedenen Stelle(n) in der Aminosäuresequenz, Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren an einem oder beiden Enden des Proteins oder an einer oder mehreren Stellen in der Aminosäuresequenz, oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen in der Aminosäuresequenz abgeleitet wird. Die Herstellung einer Enzymvariante wird vorzugsweise durch Modifizieren einer DNA-Sequenz, welche für das native Protein codiert, Transformation dieser DNA-Sequenz in einen geeigneten Wirt und Expression der modifizierten DNA-Sequenz zur Bildung des abgewandelten Enzyms erreicht. Das veränderte EGIII-ähnliche Enzym der Erfindung schließt Peptide ein, umfassend veränderte Aminosäuresequenzen im Vergleich zu einer Vorläuferenzym-Aminosäuresequenz, wobei das veränderte EGIII-ähnliche Enzym die charakteristische zellulolytische Natur des Vorläuferenzyms beibehält, aber in irgendeinem spezifischen Aspekt abgeänderte Eigenschaften aufweisen kann. Zum Beispiel kann ein verändertes EGIII-ähnliches Enzym ein erhöhtes pH-Optimum oder erhöhte Temperatur- oder Oxidationsstabilität aufweisen, aber wird seine charakteristische zellulolytische Aktivität beibehalten. Es wird in Betracht gezogen, dass die Varianten gemäß der vorliegenden Erfindung aus einem DNA-Fragment, codierend ein EGIII-ähnliches Cellulase-Varianten-Enzym, worin die funktionelle Aktivität des exprimierten Cellulase-Derivates beibehalten wird, abgeleitet werden können. Zum Beispiel kann ein DNA-Fragment, welches eine Cellulase codiert, ferner eine DNA-Sequenz oder einen Abschnitt davon einschließen, codierend ein Gelenk oder einen Linker, angeheftet an die Cellulase-DNA-Sequenz entweder am 5'- oder 3'-Ende, wobei die funktionelle Aktivität der codierten Cellulasedomäne beibehalten wird.
"Expressionsvektor" bedeutet ein DNA-Konstrukt, umfassend eine DNA-Sequenz, welche funktionsfähig an eine geeignete Kontrollsequenz verknüpft ist, fähig zur Bewirkung der Expression der DNA in einem geeigneten Wirt. Derartige Kontrollsequenzen können einen Promotor zur Bewirkung von Transkription, eine optionale Operatorsequenz zur Regulierung der Transkription, eine Sequenz, codierend geeignete Ribosomen-Bindungsstellen auf der mRNA, und Sequenzen, welche die Termination von Transkription und Translation regulieren, einschließen. Verschiedene Zelltypen werden bevorzugt mit verschiedenen Expressionsvektoren verwendet. Ein bevorzugter Promotor für in Bacillus subtilis verwendete Vektoren ist der AprE-Promotor; ein bevorzugter in E. coli verwendeter Promotor ist der Lac-Promotor, ein bevorzugter in Saccharomyces cerevisiae verwendeter Promotor ist PGK1, ein bevorzugter in Aspergillus niger verwendeter Promotor ist glaA, und ein bevorzugter Promotor für Trichoderma reesei ist cbhI. Der Vektor kann ein Plasmid, ein Phagenpartikel oder einfach ein potentielles genomisches Insert sein. Sobald er in einen geeigneten Wirt transformiert wurde, kann der Vektor replizieren und unabhängig vom Wirtsgenom wirken oder kann, unter geeigneten Bedingungen, in das Genom selbst integrieren. In der vorliegenden Beschreibung werden Plasmid und Vektor manchmal austauschbar verwendet. Jedoch wird beabsichtigt, dass die Erfindung andere Formen von Expressionsvektoren einschließt, welche äquivalente Funktionen vollführen und welche im Fachgebiet bekannt sind oder werden. Somit kann eine große Vielfalt von Wirts/Expressionsvektorkombinationen bei der Exprimierung der DNA-Sequenzen dieser Erfindung verwendet werden. Nützliche Expressionsvektoren können zum Beispiel aus Segmenten von chromosomalen, nicht- chromosomalen und synthetischen DNA-Sequenzen bestehen, wie verschiedene bekannte Derivate von SV40 und bekannte bakterielle Plasmide, z. B. Plasmide aus E. coli, einschließlich col E1, pCR1, pBR322, pMb9, pUC 19 und ihren Derivaten, Plasmide mit breiterem Wirtsspektrum, z. B. RP4, Phagen-DNAs, z. B. die zahlreichen Derivate von Phage λ, z. B. NM989, und andere DNA-Phagen, z. B. M13 und filamentöse einzelsträngige DNA-Phagen, Hefeplasmide, wie das 2μ-Plasmid oder Derivate davon, in eukaryotischen Zellen brauchbare Vektoren, wie Vektoren, welche in Tierzellen nützlich sind, und Vektoren, welche aus Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNAs abgeleitet sind, wie Plasmide, welche modifiziert worden sind, um Phagen-DNA- oder andere Expressions-Kontrollsequenzen zu verwenden. Expressionstechniken unter Verwendung der Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung sind im Fachgebiet bekannt und werden allgemein zum Beispiel in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Press (1989) beschrieben. Häufig werden derartige Expressionsvektoren, welche die DNA-Sequenzen der Erfindung einschließen, in einen einzelligen Wirt durch direkte Insertion in das Genom einer jeweiligen Spezies mittels eines Integrationsereignisses transformiert (siehe z. B. Bennett & Lasure, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, San Diego, S. 70-76 (1991), und den darin zitierten Artikeln, welche die zielgerichtete genomische Insertion in Pilz-Wirte beschreiben).
"Wirtsstamm" oder "Wirtszelle" bedeutet einen geeigneten Wirt für einen Expressionsvektor, welcher DNA gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst. In der vorliegenden Erfindung brauchbare Wirtszellen sind im Allgemeinen prokaryotische oder eukaryotische Wirte, einschließlich eines beliebigen transformierbaren Mikroorganismus, in welchem eine Expression erzielt werden kann. Spezifisch, kann es sich bei den Wirtsstämmen um Bacillus subtilis, Escherichia coli, Trichoderma reesei, Saccharomyces cerevisiae oder Aspergillus niger handeln. Wirtszellen werden mit Vektoren transformiert oder transfiziert, welche unter Anwendung von rekombinanten DNA-Techniken konstruiert worden sind. Solche transformierten Wirtszellen sind in der Lage, sowohl die Vektoren, codierend die veränderten EGIII-ähnlichen Enzyme, zu replizieren oder das gewünschte Peptidprodukt zu exprimieren. In einer bevorzugten Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung bedeutet "Wirtszelle" sowohl die Zellen als auch Protoplasten, welche aus den Zellen von Trichoderma sp. erzeugt wurden.
"Signalsequenz" bedeutet eine Sequenz von Aminosäuren, die an den N-terminalen Teil eines Proteins gebunden ist, welche die Sekretion der reifen Form des Proteins aus der Zelle heraus erleichtert. Diese Definition einer Signalsequenz ist eine funktionelle. Der reifen Form des extrazellulären Proteins fehlt die Signalsequenz, welche während des Sekretionsvorgangs abgespalten wird.
"DNA-Vektor" bedeutet eine Nukleotidsequenz, welche eine oder mehrere DNA-Fragmente oder DNA-Variantenfragmente, codierend eine EGIII-ähnliche Cellulase oder oben stehend beschriebene Varianten, umfasst, welche nach der Transformation in eine geeignete Wirtszelle, verwendet werden kann, um die Expression der veränderten EGIII-ähnlichen Cellulase zu verursachen.
"Funktionell verknüpft an" bedeutet, dass eine regulatorische Region, wie ein Promotor, Terminator, Sekretionssignal oder eine Enhancerregion, an ein Strukturgen verknüpft ist und die Expression dieses Gens reguliert.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Expression, Reinigung und/oder Isolierung und Verwendung von veränderten EGIII-ähnlichen Cellulasen. Diese Enzyme werden vorzugsweise durch rekombinante Verfahren unter Verwendung des Gens hergestellt, welches gemäß des oben stehend beschriebenen Verfahrens identifiziert und isoliert worden ist. Allerdings können Enzyme zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung durch andere im Fachgebiet anerkannte Methoden erhalten werden, wie der Aufreinigung aus natürlichen Isolaten.
Die Erfinder gehen davon aus, dass die Mikroorganismen, welche zum Zwecke des Exprimierens einer EGIII-ähnlichen Cellulase gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert werden sollen, in vorteilhafter Weise einen Stamm umfassen, welcher aus Trichoderma sp. abgeleitet ist. Daher umfasst eine bevorzugte Art zur Herstellung von EGIII-ähnlichen Cellulasen gemäß der vorliegenden Erfindung das Transformieren einer Trichoderma sp.-Wirtszelle mit einem DNA-Konstrukt, umfassend mindestens ein Fragment von DNA, codierend einen Teil oder die Gesamtheit der EGIII-ähnlichen Cellulase, nachgewiesen, wie oben stehend beschrieben. Das DNA-Konstrukt wird im Allgemeinen funktionsfähig an einen Promotor verknüpft sein. Die transformierte Wirtszelle wird dann unter solchen Bedingungen herangezogen, dass das gewünschte Protein exprimiert wird. Anschließend wird das gewünschte Proteinprodukt im wesentlichen bis zur Homogenität gereinigt.
Gleichwohl kann es tatsächlich der Fall sein, dass das beste Expressionsvehikel für eine gegebene DNA, welche eine veränderte EGIII-ähnliche Cellulase codiert, abweichen kann. So kann es sein, dass es am vorteilhaftesten ist, ein Protein in einem Transformationswirt zu exprimieren, welcher phylogenetische Ähnlichkeit zu dem Herkunftsorganismus für die veränderte EGIII-ähnliche Cellulase trägt. Folglich wird die vorliegende Erfindung eines Trichoderma spp.-Expressionssystems lediglich aus veranschaulichenden Gründen und als eine Option und zum Exprimieren der veränderten EGIII-ähnlichen Cellulase der Erfindung angegeben. Der Fachmann auf dem Gebiet kann jedoch geneigt sein, die DNA, welche eine veränderte EGIII-ähnliche Cellulase codiert, in einer anderen Wirtszelle zu exprimieren, falls dies angemessen ist, und es sollte sich verstehen, dass die Quelle der veränderten EGIII-ähnlichen Cellulase bei der Bestimmung des optimalen Expressionswirts in Erwägung gezogen werden sollte. Darüber hinaus wird der Fachmann auf dem Gebiet in der Lage sein, das beste Expressionssystem für ein jeweiliges Gen mittels Routinetechniken unter Verwendung der im Fachgebiet verfügbaren Werkzeuge auszuwählen.
In einer Ausführungsform umfasst der Stamm T. reesei (longibrachiatum), welcher ein brauchbarer Stamm zum Erhalten von überexprimiertem Protein ist. Zum Beispiel ist bekannt, dass RL-P37, beschrieben von Sheir-Neiss et al. in Appl. Microbiol. Biotechnology, 20 (1984), 5. 46-53, erhöhte Mengen an Cellulase-Enzymen sezerniert. Funktionelle Äquivalente von RL-P37 schließen den Trichoderma reesei(longibrachiatum)-Stamm RUT-C30 (ATCC Nr. 56765) und Stamm QM9414 (ATCC Nr. 26921) ein. Es wird in Betracht gezogen, dass diese Stämme ebenfalls bei der Überexprimierung von EGIII-ähnlichen Cellulasen nützlich sind.
Wo es gewünscht wird, die EGIII-ähnliche Cellulase in Abwesenheit von potentiell schädlicher nativer zellulolytischer Aktivität zu erhalten, ist es nützlich, einen Trichoderma-Wirtszellenstamm zu erhalten, bei welchem ein oder mehrere Cellulase-Gene vor der Einbringung eines DNA-Konstrukts oder Plasmids, enthaltend das für die EGIII-ähnliche Cellulase codierende DNA-Fragment, deletiert worden sind. Solche Stämme können durch das Verfahren hergestellt werden, offenbart in U.S.-Patent Nr. 5 246 853 und WO 92/06209, wobei diese Offenbarungen hierin als Bezugsstelle einbezogen werden. Durch Exprimieren einer EGIII-ähnlichen Cellulase in einem Wirtsmikroorganismus, dem ein oder mehrere Cellulase-Gene fehlen, werden die Identifizierungs- und anschließenden Aufreinigungs-Verfahrensweisen vereinfacht. Jedwedes Gen aus Trichoderma sp., welches kloniert worden ist, kann deletiert werden, beispielsweise die Gene cbh1, cbh2, egl1 und egl3 sowie diejenigen, codierend EGIII- und/oder EGV-Protein (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5 475 101 bzw. WO 94/28117).
Eine Gen-Deletion kann durch Inserieren einer Form des gewünschten Gens, welches deletiert oder disruptiert werden soll, in ein Plasmid durch im Fachgebiet bekannte Verfahren bewerkstelligt werden. Das Deletionsplasmid wird dann an (einer) geeigneten Restriktions enzymstelle(n), intern bezüglich der gewünschten Gen-codierenden Region, geschnitten, und die Gen-codierende Sequenz oder ein Teil davon wird mit einem selektierbaren Marker ersetzt. Flankierende DNA-Sequenzen aus dem Lokus des Gens, welches deletiert oder disruptiert werden soll, vorzugsweise zwischen etwa 0,5 bis 2,0 kb, bleiben auf jeder Seite des selektierbaren Markergens zurück. Ein passendes Deletionsplasmid wird im Allgemeinen darin vorkommende einmalige Restriktionsenzymstellen aufweisen, um zu gestatten, dass das Fragment, welches das deletierte Gen, einschließlich flankierender DNA-Sequenzen, und das selektierbare Markergen enthält, als ein einzelnes lineares Stück entfernt werden kann.
Ein selektierbarer Marker muss so gewählt werden, dass er eine Detektion des transformierten Pilzes ermöglicht. Jedwedes selektierbare Markergen, welches in dem selektierten Mikroorganismus exprimiert wird, wird geeignet sein. Zum Beispiel wird bei Trichoderma sp. der selektierbare Marker so gewählt, dass die Gegenwart des selektierbaren Markers in den Transformanten ihre Eigenschaften nicht signifikant verändern wird. Ein derartiger selektierbarer Marker kann ein Gen sein, welches ein assaybares Produkt codiert. Zum Beispiel kann eine funktionelle Kopie eines Trichoderma sp.-Gens verwendet werden, welches dazu führt, wenn es in dem Wirtsstamm fehlt, dass der Wirtsstamm einen auxotrophen Phänotyp aufzeigt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein pyr4^–-Derivatstamm von Trichoderma sp. mit einem funktionellen pyr4-Gen transformiert, welches somit einen selektierbaren Marker für die Transformation bereitstellt. Ein pyr4^–-Derivatstamm kann erhalten werden durch Selektion von Trichoderma sp.-Stämmen, welche gegen Fluororotsäure (FOA) resistent sind. Das pyr4-Gen codiert Orotidin-5'-Monophosphat-Decarboxylase, ein Enzym, welches für die Biosynthese von Uridin erforderlich ist. Stämme mit einem intakten pyr4-Gen wachsen in einem Medium, welchem Uridin fehlt, sind aber empfindlich gegenüber Fluororotsäure. Es ist möglich, pyr4^–-Derivatstämme zu selektieren, denen ein funktionelles Orotidin-Monophosphat-Decarboxylase-Enzym fehlt und die Uridin für das Wachstum benötigen, indem hinsichtlich FOA-Resistenz selektiert wird. Unter Anwendung der FOA-Selektionstechnik ist es ebenfalls möglich, Uridin-erfordernde Stämme zu erhalten, denen eine funktionelle Orotat-Pyrophospharibosyl-Transferase fehlt, Es ist möglich, diese Zellen mit einer funktionellen Kopie des Gens zu transformieren, welches dieses Enzym codiert (Berges und Barreau, Curr. Genet., 19, 1991, S. 359-365). Die Selektion von Derivatstämmen wird leicht unter Anwendung der FOA-Resistenztechnik, auf welche oben stehend Bezug genommen wurde, durchgeführt, und daher wird das pyr4-Gen als ein selektierbarer Marker bevorzugt verwendet.
Um pyr4^–-Trichoderma sp. so zu transformieren, dass ihm die Fähigkeit, ein oder mehrere Cellulase-Gene zu exprimieren, fehlt, wird dann ein einzelnes DNA-Fragment, umfassend ein disruptiertes oder deletiertes Cellulase-Gen, aus dem Deletionsplasmid isoliert und verwendet, um einen passenden pyr^–-Trichoderma-Wirt zu transformieren. Transformanten werden dann identifiziert und auf der Grundlage ihres Vermögens, das pyr4-Genprodukt zu exprimieren und somit die Uridin-Auxotrophie des Wirtsstamms zu komplementieren, selektiert. Dann wird eine Southern-Blot-Analyse an den resultierenden Transformanten ausgeführt, um ein Doppel-Crossover-Integrationsereignis zu identifizieren und zu bestätigen, welches einen Teil oder die Gesamtheit der codierenden Region der genomischen Kopie des Gens, welches deletiert werden soll, mit den selektierbaren pyr4-Markern ersetzt.
Obwohl die oben stehend beschriebenen, spezifischen Plasmidvektoren die Herstellung von pyr^–-Transformanten betreffen, ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese Vektoren eingeschränkt. Verschiedene Gene können in dem Trichoderma sp.-Stamm unter Anwendung der oben stehenden Techniken deletiert und ersetzt werden. Darüber hinaus können beliebige verfügbare selektierbare Marker verwendet werden, wie oben stehend erörtert. Tatsächlich kann jedwedes Trichoderma sp.-Gen, welches kloniert und somit identifiziert worden ist, unter Anwendung der oben stehend beschriebenen Strategie aus dem Genom deletiert werden.
Wie oben stehend angegeben, sind die verwendeten Wirtsstämme Derivate von Trichoderma sp., denen das Gen oder die Gene, entsprechend dem gewählten selektierbaren Marker, fehlt/fehlen, oder die eine nicht-funktionelle Form davon aufweisen. Wenn zum Beispiel der selektierbare Marker pyr4 gewählt wird, dann wird ein spezifischer pyr4^–-Derivatstamm als ein Empfänger in dem Transformationsverfahren verwendet. In ähnlicher Weise können selektierbare Marker, umfassend Trichoderma sp.-Gene, äquivalent zu den Aspergillus nidulans-Genen amdS, argB, trpC, niaD, verwendet werden. Der entsprechende Empfängerstamm muss deshalb ein Derivatstamm, wie argB^–, trpC^– bzw. niaD^– sein.
Die EGIII-ähnliche Cellulase codierende DNA wird dann zur Einbringung in einen geeigneten Mikroorganismus hergestellt. Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst DNA, codierend eine EGIII-ähnliche Cellulase, die Gesamtheit der DNA, welche notwendig ist, um ein Protein zu codieren, welches funktionelle zellulolytische Aktivität aufweist. Das DNA-Fragment oder DNA-Variantenfragment, codierend die EGIII-ähnliche Cellulase oder ein Derivat, kann funktionsfähig an eine Pilz-Promotor-Sequenz verknüpft werden, zum Beispiel den Promotor des cbh1- oder egl1-Gens.
Es wird ebenfalls in Erwägung gezogen, dass mehr als eine Kopie von DNA, codierend eine EGIII-ähnliche Cellulase, in den Stamm einrekombiniert werden kann, um eine Überexpression zu erleichtern. Die DNA, codierend die EGIII-ähnliche Cellulase, kann durch die Konstruktion eines Expressionsvektors hergestellt werden, welcher die DNA trägt, die die Cellulase codiert. Der Expressionsvektor, welcher das inserierte DNA-Fragment, codierend die EGIII-ähnliche Cellulase trägt, kann ein beliebiger Vektor sein, welcher zur autonomen Replizierung in einem gegebenen Wirtsorganismus oder zur Integration in die DNA des Wirtes in der Lage ist, typischerweise ein Plasmid. In bevorzugten Ausführungsformen werden zwei Typen von Expressionsvektoren zum Erhalten einer Expression von Genen in Erwägung gezogen. Der erste enthält DNA-Sequenzen, in welchen der Promotor, die codierende Genregion und die Terminatorsequenz sämtlich aus dem zu exprimierenden Gen stammen. Eine Gentrunkierung kann erhalten werden, wo dies gewünscht wird, durch Hinweg-Deletieren von unerwünschten DNA-Sequenzen (z. B. codierend unerwünschte Domänen), wobei die zu exprimierende Domäne unter der Steuerung ihrer eigenen Transkriptions- und Translations-Regulierungssequenzen belassen wird. Ein selektierbarer Marker ist auf dem Vektor ebenfalls vorhanden, wodurch die Selektion hinsichtlich Einbringung von mehreren Kopien der neuen Gensequenzen in den Wirt gestattet wird.
Der zweite Typ von Expressionsvektor ist im Voraus zusammengebaut und enthält Sequenzen, welche für eine Transkription bei hohem Spiegel erforderlich sind, und einen selektierbaren Marker. Es wird in Betracht gezogen, dass die codierende Region für ein Gen oder einen Teil daraus in diesen Allzweck-Expressionsvektor inseriert werden kann, so dass sie unter der Transkriptionssteuerung der Promotor- und Terminatorsequenzen der Expressionskassette steht. Zum Beispiel ist pTEX ein derartiger Allzweck-Expressionsvektor. Gene, oder ein Teil daraus, können stromabwärts des starken cbh1-Promotors inseriert werden.
In dem Vektor sollte die DNA-Sequenz, welche die EGIII-ähnliche Cellulase der vorliegenden Erfindung codiert, an transkriptionelle und translationelle Sequenzen, d. h. eine geeignete Promotorsequenz und Signalsequenz, im Leseraster zu dem Strukturgen, funktionsfähig verknüpft sein. Der Promotor kann eine beliebige DNA-Sequenz sein, welche eine transkriptionelle Aktivität in der Wirtszelle aufzeigt und kann aus Genen abgeleitet sein, welche Proteine codieren, die hinsichtlich der Wirtszelle entweder homolog oder heterolog sind. Das Signalpeptid sorgt für eine extrazelluläre Produktion der EGIII-ähnlichen Cellulase oder von Derivaten davon. Die für die Signalsequenz codierende DNA ist vorzugsweise diejenige, welche natürlicherweise mit dem zu exprimierenden Gen assoziiert ist, gleichwohl wird eine Signalsequenz aus einer beliebigen geeigneten Quelle, zum Beispiel einer Exo- Cellobiohydrolase oder Endoglucanase aus Trichoderma, in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.
Die zum Ligieren der DNA-Sequenzen, welche die EGIII-ähnliche Cellulase der vorliegenden Erfindung codieren, mit dem Promotor und zur Insertion in geeignete Vektoren angewandten Vorgehensweisen sind im Fachgebiet gut bekannt.
Der/Das oben stehend beschriebene DNA-Vektor oder -Konstrukt kann gemäß bekannter Techniken in die Wirtszelle eingebracht werden, wie Transformation, Transfektion, Mikroinjektion, Mikroporation, Biolistik-Beschuss und dergleichen.
In der bevorzugten Transformationstechnik muss berücksichtigt werden, dass die Permeabilität der Zellwand in Trichoderma sp. für DNA sehr gering ist. Folglich ist die Aufnahme der/des gewünschten DNA-Sequenz, Gens oder Gen-Fragments bestenfalls minimal. Es gibt eine Reihe von Verfahren, um die Permeabilität der Trichoderma sp.-Zellwand in dem Derivatstamm (d. h. ohne ein funktionelles Gen, entsprechend dem verwendeten selektierbaren Marker) vor dem Transformationsverfahren zu erhöhen.
Das bevorzugte Verfahren in der vorliegenden Erfindung zur Vorbereitung von Trichoderma sp. für eine Transformation beinhaltet die Herstellung von Protoplasten aus Pilz-Myzel. Das Myzel kann von ausgekeimten vegetativen Sporen erhalten werden. Das Myzel wird mit einem Enzym behandelt, welches die Zellwand verdaut, was zu Protoplasten führt. Die Protoplasten werden dann durch die Gegenwart eines osmotischen Stabilisators in dem Suspendiermedium geschützt. Diese Stabilisatoren schließen Sorbitol, Manitol, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat und dergleichen ein. Üblicherweise variiert die Konzentration dieser Stabilisatoren zwischen 0,8 M bis 1,2 M. Es wird bevorzugt, eine Lösung von etwa 1,2 M Sorbitol in dem Suspensionsmedium zu verwenden.
Die Aufnahme der DNA in den Wirt-Trichoderma-sp.-Stamm ist abhängig von der Calciumionenkonzentration. Im Allgemeinen werden zwischen etwa 10 mM CaCl₂ und 50 mM CaCl₂ in einer Aufnahmelösung verwendet. Neben der Notwendigkeit für das Calciumion in der Aufnahmelösung sind andere Dinge, welche allgemein eingeschlossen werden, ein Puffersystem wie TE-Puffer (10 mM Tris, pH 7,4; 1 mM EDTA) oder 10 mM MOPS-pH 6,0-Puffer (Morpholinpropansulfonsäure) und Polyethylenglykol (PEG). Es wird angenommen, dass das Polyethylenglykol wirkt, um die Zellmembranen zu verschmelzen, wodurch gestattet wird, dass der Inhalt des Mediums in das Zytoplasma des Trichoderma sp.-Stammes zugeführt und die Plasmid-DNA zu dem Zellkern transferiert wird. Diese Fusion hinterlässt häufig mehrere Kopien der Plasmid-DNA, welche schwach in das Wirtschromosom integriert sind.
Üblicherweise wird in der Transformation eine Suspension verwendet, welche die Trichoderma sp.-Protoplasten oder -Zellen, welche einer Permeabilitätsbehandlung unterzogen worden sind, bei einer Dichte von 10⁸ bis 10⁹/ml, vorzugsweise 2 × 10⁸/ml enthält. Ein Volumen von 100 Mikrolitern dieser Protoplasten oder Zellen in einer geeigneten Lösung (z. B. 1,2 M Sorbitol; 50 mM CaCl₂) wird mit der gewünschten DNA vermischt. Im Allgemeinen wird der Aufnahmelösung eine hohe Konzentration an PEG zugesetzt. 0,1 bis 1 Volumen 25% PEG 4000 kann zu der Protoplastensuspension zugesetzt werden. Es ist jedoch zu bevorzugen, der Protoplastensuspension etwa 0,25 Volumina hinzuzusetzen. Additive, wie Dimethylsulfoxid, Heparin, Spermidin, Kaliumchlorid und dergleichen können der Aufnahmelösung ebenfalls zugesetzt werden und bei der Transformation helfen.
Im Allgemeinen wird die Mischung dann bei ungefähr 0 °C während einer Dauer zwischen 10 bis 30 Minuten inkubiert. Zusätzliches PEG wird dann der Mischung zugegeben, um die Aufnahme der gewünschten Gen- oder DNA-Sequenz weiter zu steigern. Die 25 % PEG 4000 werden im Allgemeinen in Volumina des 5- bis 15-Fachen des Volumens der Transformationsmischung zugesetzt; gleichwohl können größere und kleinere Volumina geeignet sein. Die 25 % PEG 4000 werden vorzugsweise in etwa dem 10-fachen Volumen der Transformationsmischung zugegeben. Nachdem das PEG zugegeben wurde, wird die Transformationsmischung dann bei Raumtemperatur vor Zugabe einer Sorbitol- und CaCl₂-Lösung inkubiert. Die Protoplastensuspension wird dann fernerhin zu geschmolzenen Aliquots eines Wachstumsmediums zugegeben. Dieses Wachstumsmedium gestattet nur das Wachstum von Transformanten. Es kann jedwedes Wachstumsmedium in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, welches zum Wachsenlassen der gewünschten Transformanten geeignet ist. Wenn jedoch Pyr⁺-Transformanten selektiert werden, wird es bevorzugt, ein Wachstumsmedium zu verwenden, welches kein Uridin enthält. Die anschließenden Kolonien werden auf ein Wachstumsmedium, welches frei von Uridin ist, überführt und darauf gereinigt.
An dieser Stufe können stabile Transformanten von unstabilen Transformanten durch ihre raschere Wachstumsgeschwindigkeit und die Bildung von zirkulären Kolonien mit einer eher glatten als gezackten Umrandung auf Festkulturmedium ohne Uridin unterschieden werden. Weiterhin kann in einigen Fällen ein weiterer Test der Stabilität vorgenommen werden durch Heranzüchten der Transformanten auf festem nicht-selektivem Medium (d. h. mit Uridin), Ernten von Sporen aus diesem Kulturmedium und Bestimmung des Prozentsatzes dieser Sporen, welche anschließend auf selektivem Medium ohne Uridin auskeimen und wachsen werden.
In einer besonderen Ausführungsform des oben stehenden Verfahrens werden die EGIII-ähnlichen Cellulasen oder Derivate davon in aktiver Form aus der Wirtszelle nach Wachstum in Flüssigmedien gewonnen, und zwar entweder als Ergebnis der geeigneten postranslationalen Prozessierung der neuen EGIII-ähnlichen Cellulase oder Derivate davon.
Die exprimierte EGIII-ähnliche Cellulase kann aus dem Medium durch herkömmliche Techniken gewonnen werden, einschließlich Trennungen der Zellen aus dem Medium durch Zentrifugation, Filtration, und Fällung der Proteine im Überstand oder Filtrat mit einem Salz, zum Beispiel Ammoniumsulfat. Darüber hinaus können Chromatographie-Verfahrensweisen, wie Ionenaustauschchromatographie oder Affinitätschromatographie angewandt werden. Antikörper (polyklonal oder monoklonal) können gegen die natürliche gereinigte EGIII-ähnliche Cellulase erzeugt werden, oder synthetische Peptide können aus Bereichen des EGIII-ähnlichen Cellulase-Moleküls hergestellt und zum Erzeugen von polyklonalen Antikörpern verwendet werden.
Die Behandlung von Textilien gemäß der vorliegenden Erfindung zieht eine Textilien-Verarbeitung oder -Säuberung mit einer Zusammensetzung, welche eine Cellulase umfasst, in Betracht. Eine solche Behandlung schließt, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Stonewashing, Modifizieren der Textur, Gefühlseigenschaft und/oder Erscheinung von zellulosehaltigen Textilien oder sonstige Techniken, welche während der Herstellung oder Säuberung/Rekonditionierung von zellulosehaltigen Textilien angewandt werden, ein. Darüber hinaus betrifft die Behandlung innerhalb des Kontexts dieser Erfindung die Entfernung "unreifer" oder "toter" Baumwolle aus zellulosehaltigen Textilien oder Fasern. Unreife Baumwolle ist signifikant amorpher als reife Baumwolle und führt zu einer Textilie von geringerer Qualität, wenn sie vorhanden ist, beispielsweise aufgrund einer ungleichmäßigen Einfärbung. Die in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogene Zusammensetzung schließt ferner eine Cellulase-Komponente zur Verwendung beim Waschen einer verschmutzten hergestellten zellulosehaltigen Textilie ein. Zum Beispiel kann die Cellulase in einer Reinigungsmittelzusammensetzung zum Wäschewaschen verwendet werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung brauchbare Waschmittelzusammensetzungen schließen Spezialformulierungen, wie Vorwäsche-, Voreinweichungs- oder Heimanwender-Farbwiederherstellungs-Zusammensetzungen ein. Solche Behandlungszusammensetzungen, wie hierin beschrieben, können in der Form eines Konzentrats, welches eine Verdünnung erfordert, oder in der Form einer verdünnten Lösung oder einer Form, welche direkt auf die Zellulose enthaltenden Textilie aufgebracht werden kann, vorliegen. Allgemeine Behandlungstechniken für die Cellulase-Behandlung von Textilien werden beispielsweise beschrieben in der EP-Veröffentlichung Nr. 220 016 und den GB-Anmeldungen Nr. 1 368 599 und 2 095 275.
Die Behandlung eines zellulosehaltigen Materials gemäß der vorliegenden Erfindung beabsichtigt ferner die Behandlung von Tierfutter, Zellstoff und/oder Papier, Lebensmitteln und Körnern für die im Fachgebiet bekannten Zwecke. Beispielsweise ist bekannt, dass Cellulase den Wert von Tierfutter erhöht, den Feuchtigkeitsgehalt von Holzzellstoff erhöht, Lebensmittelprodukte verbessert und die Fasern in Getreide während des Körner-Nassmahlverfahrens oder -Trockenmahlverfahrens reduziert.
Eine Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Herstellen einer wässrigen Lösung, welche eine wirksame Menge an Cellulase zusammen mit anderen optionalen Bestandteilen enthält, einschließlich zum Beispiel einem Puffer, einem Tensid und/oder einem Scheuermittel. Eine wirksame Menge an Cellulase-Enzymzusammensetzung ist eine für ihren beabsichtigten Zweck ausreichende Konzentration an Cellulase-Enzym. Somit ist zum Beispiel eine "wirksame Menge" an Cellulase in einer Stonewashing-Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung diejenige Menge, welche den gewünschten Effekt vorsehen wird, z. B. zur Hervorrufung eines gebrauchten und ausgebleichten Aussehens an den Nähten und auf Gewebebahnen. In ähnlicher Weise ist eine "wirksame Menge" an Cellulase in einer Zusammensetzung, welche zur Verbesserung des Anfühlens und/oder Aussehens einer Zellulose enthaltenden Textilie beabsichtigt wird, diejenige Menge, welche messbare Verbesserung im Gefühlseindruck, z. B. eine Verbesserung der Glattheit des Gewebes, oder Aussehen, z. B. Entfernung von Pills und Fibrillen, welche dazu neigen, die Klarheit des Aussehens eines Kleidungsstücks zu verringern, hervorrufen wird. Die eingesetzte Menge an Cellulase ist ebenfalls abhängig von der verwendeten Gerätschaft, den verwendeten Verfahrensparametern (der Temperatur der Cellulasebehandlungslösung, der Expositionszeit an die Cellulaselösung und dergleichen) und der Cellulase-Aktivität (z. B. wird eine jeweilige Lösung eine geringere Konzentration an Cellulase erfordern, falls eine aktivere Cellulase-Zusammensetzung verwendet wird, verglichen zu einer weniger aktiven Cellulase-Zusammensetzung). Die exakte Konzentration an Cellulase in der wässrigen Behandlungslösung, zu welcher das zu behandelnde Textil zugegeben wird, kann vom Fachmann basierend auf den oben genannten Faktoren sowie dem gewünschten Ergebnis ohne Weiteres bestimmt werden. In Stonewashing-Verfahren ist es im Allgemeinen bevorzugt worden, dass die Cellulase in der wässrigen Behandlungslösung in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 5000 ppm und am stärksten bevorzugt etwa 10 bis 200 ppm Gesamtprotein vorhanden ist. In Zusammensetzungen zur Verbesserung des Gefühlseindrucks und/oder Aussehens von einer Zellulose enthaltenden Textilie ist es im Allgemeinen bevorzugt worden, dass die Cellulase in der wässrigen Behandlungslösung bei einer Konzentration von etwa 0,1 bis 2000 ppm und am stärksten bevorzugt etwa 0,5 bis 200 ppm Gesamtprotein vorhanden ist.
In einer bevorzugten Behandlungs-Ausführungsform wird ein Puffer in der Behandlungslösung verwendet, so dass die Konzentration an Puffer ausreichend ist, um den pH-Wert der Lösung innerhalb des Bereichs zu halten, worin die verwendete Cellulase Aktivität aufzeigt, welcher seinerseits von der Natur der verwendeten Cellulase abhängt. Die exakte Konzentration an verwendetem Puffer wird von mehreren Faktoren abhängen, die der Fachmann ohne Weiteres berücksichtigen kann. Zum Beispiel werden, in einer bevorzugten Ausführungsform, der Puffer wie auch die Pufferkonzentration so ausgewählt, dass der pH-Wert der letztendlichen Cellulase-Lösung innerhalb des pH-Bereichs gehalten wird, der für eine optimale Cellulase-Aktivität erfordert wird. Die Bestimmung des optimalen pH-Bereichs der Cellulasen der Erfindung kann gemäß gut bekannten Techniken ermittelt werden. Geeignete Puffer bei dem pH innerhalb des Aktivitätsbereichs der Cellulase sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt.
Zusätzlich zu Cellulase und einem Puffer kann die Behandlungszusammensetzung gegebenenfalls ein Tensid enthalten. Geeignete Tenside schließen jedwedes Tensid ein, das mit der Cellulase und der Textilie kompatibel ist, einschließlich beispielsweise anionischen, nicht-ionischen und ampholytischen Tensiden. Geeignete anionische Tenside zur Verwendung hierin schließen lineare oder verzweigte Alkylbenzolsulfonate; Alkyl- oder Alkenylethersulfate mit linearen oder verzweigten Alkylgruppen oder Alkenylgruppen; Alkyl- oder Alkenylsulfate; Olefinsulfonate; Alkansulfonate und dergleichen ein. Geeignete Gegenionen für anionische Tenside schließen Alkalimetallionen wie Natrium und Kalium; Erdalkalimetallionen wie Calcium und Magnesium; Ammoniumion; und Alkanolamine mit 1 bis 3 Alkanolgruppen der Kohlenstoffanzahl 2 oder 3 ein. Ampholytische Tenside schließen quaternäre Ammoniumsalzsulfonate und ampholytische Tenside vom Betain-Typ ein. Derartige ampholytische Tenside besitzen sowohl positiv als auch negativ geladene Gruppen im gleichen Molekül. Nichtionische Tenside umfassen im Allgemeinen Polyoxyalkylenether, sowie höhere Fettsäure-Alkanolamide oder Alkylenoxid-Adukt davon und Fettsäureglycerinmonoester. Mischungen von Tensiden können in den Weisen, welche dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, ebenfalls verwendet werden.
Eine konzentrierte Cellulasezusammensetzung kann zur Verwendung in den hierin beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Solche Konzentrate enthalten konzentrierte Mengen der oben beschriebenen Cellulasezusammensetzung, Puffer und Tensid, vorzugsweise in einer wässrigen Lösung. Wenn es so formuliert wird, kann das Cellulasekonzentrat leicht mit Wasser verdünnt werden, so dass die Cellulasepräparationen, welche die erforderliche Konzentration an jedem Bestandteil aufweisen, rasch und akkurat hergestellt werden. Wenn wässrige Konzentrate formuliert werden, können diese Konzentrate verdünnt werden, so dass man zu der erforderlichen Konzentration der Komponenten in der Cellulase-Lösung, wie oben angegeben, gelangt. Wie ohne Weiteres offensichtlich ist, werden derartige Cellulase-Konzentrate eine einfache Formulierung der Cellulase-Lösungen gestatten, als auch einen durchführbaren Transport der Zusammensetzung zu der Örtlichkeit, wo sie verwendet werden wird, zulassen. Das Behandlungskonzentrat kann in einer beliebigen, im Fachgebiet anerkannten, Form vorliegen, beispielsweise Flüssigkeit, Emulsion, Gel oder Paste. Derartige Formen sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt.
Wenn ein festes Cellulase-Konzentrat eingesetzt wird, kann die Cellulase-Zusammensetzung ein Granulat, ein Pulver, ein Agglomerat oder eine feste Scheibe sein. Die Granulate können so formuliert werden, dass sie Materialien zur Verringerung der Auflösungsgeschwindigkeit der Granulate in das Waschmedium enthalten. Derartige Materialien und Granulate werden im U.S.-Patent Nr. 5 254 283 offenbart.
Andere Materialien können ebenfalls mit der Cellulase-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet oder darin eingebracht werden, wie gewünscht, einschließlich Steinen, Bimsstein, Füllstoffen, Lösungsmitteln, Enzymaktivatoren und Anti-Wiederablagerungs-Mitteln, abhängig von der letztendlichen Verwendung der Zusammensetzung.
Als Beispiel werden Stonewashing-Verfahren ausführlich beschrieben werden, wobei jedoch die beschriebenen Parameter vom Fachmann für andere Anwendungen, d. h. Verbesserung des Gefühlserlebnisses und/oder Aussehens einer Textilie ohen Weiteres modifiziert werden. Die zellulosehaltige Textilie wird mit der Cellulase-haltigen Stonewashing-Zusammensetzung, welche eine wirksame Menge der Cellulase enthält, durch Vermengen der Behandlungszusammensetzung mit der Stonewashing-Zusammensetzung, und somit indem das Cellulase-Enzym in die Nähe zu dem Textil gebracht wird, kontaktiert. Anschließend wird die wässrige Lösung, welche die Cellulase und die Textilie enthält, bewegt. Wenn die Behandlungszusammensetzung eine wässrige Lösung ist, kann die Textilie direkt in der Lösung eingeweicht werden. In ähnlicher Weise wird, wo die Stonewashing-Zusammensetzung ein Konzentrat ist, das Konzentrat in ein Wasserbad mit der zellulosehaltigen Textilie hinein verdünnt. Wenn die Stonewashing-Zusammensetzung in einer festen Form, zum Beispiel einem Vorwasch-Gel oder einer festen Barrenform, vorliegt, kann die Stonewashing- Zusammensetzung durch direktes Aufbringen der Zusammensetzung auf die Textilie oder die Waschflotte kontaktiert werden.
Die zellulosehaltige Textilie wird mit der Stonewashing-Lösung unter Bedingungen inkubiert, die wirksam sind, um zu gestatten, dass die enzymatische Wirkung der zellulosehaltigen Textilie ein "stonewashed"-Aussehen verleiht. Zum Beispiel können, während des Stonewashing, der pH, das Flottenverhältnis, die Temperatur und die Reaktionszeit eingestellt werden, um die Bedingungen zu optimieren, unter welchen die Stonewashing-Zusammensetzung wirkt. "Effektive Bedingungen" bezieht sich notwendigerweise auf den pH, das Flottenverhältnis und die Temperatur, welche dem Cellulase-Enzym gestatten, effizient mit zellulosehaltigen Textilien zu reagieren, in diesem Falle den "stonewashed" Effekt hervorzurufen. Gleichwohl sind solche Bedingungen ohne Weiteres vom Fachmann auf dem Gebiet feststellbar. Die für die Stonewashing-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung wirksamen Reaktionsbedingungen sind im Wesentlichen ähnlich zu gut bekannten Verfahren, welche mit entsprechenden Cellulasezusammensetzungen des Stands der Technik angewandt werden. Folglich liegt es innerhalb des Kenntnisstands des Fachmanns auf dem Gebiet, Bedingungen zur Anwendung der Stonewashing-Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung zu maximieren.
Die Flottenverhältnisse während des Stonewashings, d. h. das Verhältnis des Gewichts an Stonewashing-Zusammensetzungs-Lösung (d. h. der Waschflotte) zu dem Gewicht der Textilien, welche hierin angewandt werden, sind im Allgemeinen eine Menge, die ausreicht, um den gewünschten Stonewashing-Effekt in dem Jeans-Textil zu erzielen und sind von dem eingesetzten Verfahren abhängig. Vorzugsweise belaufen sich die Flottenverhältnisse auf etwa 4:1 bis etwa 50:1; weiter bevorzugt etwa 5:1 bis etwa 20:1, und am stärksten bevorzugt etwa 10:1 bis etwa 15:1.
Die Reaktionstemperaturen während des Stonewashings mit den vorliegenden Stonewashing-Zusammensetzungen werden von zwei miteinander konkurrierenden Faktoren beherrscht. Zum Ersten entsprechen höhere Temperaturen im Allgemeinen einer verstärkten Reaktionskinetik, d. h. schnelleren Reaktionen, was verringerte Reaktionszeiten im Vergleich zu den Reaktionszeiten gestattet, welche bei niedrigeren Temperaturen erforderlich sind. Folglich betragen die Reaktionstemperaturen im Allgemeinen wenigstens etwa 10 °C und darüber. Zum Zweiten ist Cellulase ein Protein, welches jenseits einer gegebenen Reaktionstemperatur Aktivität verliert, wobei diese Temperatur von der Natur der verwendeten Cellulase abhängt. Wenn somit die Reaktionstemperatur zu hoch steigen gelassen wird, wird die zellulolytische Aktivität als Ergebnis der Denaturierung der Cellulase verloren. Obgleich Standard temperaturen für die Cellulase-Verwendung im Fachgebiet im Allgemeinen im Bereich von 35 °C bis 65 °C liegen, wobei von diesen Bedingungen auch erwartet werden würde, für die Cellulase der Erfindung geeignet zu sein, sollten die optimalen Temperaturbedingungen gemäß gut bekannter Techniken in Bezug auf die verwendete spezifische Cellulase ermittelt werden.
Reaktionszeiten sind abhängig von den spezifischen Bedingungen, unter denen das Stonewashing stattfindet. Zum Beispiel werden pH, Temperatur und Konzentration von Cellulase alle die optimale Reaktionszeit beeinflussen. Im Allgemeinen belaufen sich die Reaktionszeiten auf etwa 5 Minuten bis etwa 5 Stunden und vorzugsweise etwa 10 Minuten bis etwa 3 Stunden und weiter bevorzugt etwa 20 Minuten bis etwa 1 Stunde.
Gemäß noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Cellulase der Erfindung in einer Reinigungsmittel-Zusammensetzung verwendet werden. Die Reinigungsmittel- bzw. Waschmittel-Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung werden als Vorwasch-Zusammensetzungen, Voreinweichungs-Zusammensetzungen oder zur Reinigung während des regulären Wasch- oder Spülzyklus verwendet. Vorzugsweise umfasst die Reinigungsmittelzusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine wirksame Menge an Cellulase, ein Tensid und schließt gegebenenfalls andere Bestandteile, welche nachstehend beschrieben werden, ein.
Eine wirksame Menge an Cellulase, welche in den Waschmittelzusammensetzungen dieser Erfindung verwendet wird, ist eine Menge, ausreichend, um die wünschenswerten Effekte zu vermitteln, welche bekanntermaßen durch Cellulase gegenüber zellulosehaltigen Textilien hervorgerufen werden, beispielsweise Ent-Pillen, Weichmachen, Anti-Pilling, Oberflächenfaserentfernung, Anti-Vergrauung und Säuberung. Vorzugsweise wird die Cellulase in der Waschmittelzusammensetzung in einer Konzentration von etwa 10 ppm bis etwa 20000 ppm Waschmittel eingesetzt.
Die Konzentration an Cellulase-Enzym, welche in der Waschmittelzusammensetzung verwendet wird, wird vorzugsweise so gewählt, dass nach Verdünnen in ein Waschmedium hinein, die Konzentration an Cellulase-Enzym in einem Bereich von etwa 0,01 bis etwa 1000 ppm, vorzugsweise etwa 0,02 ppm bis etwa 500 ppm und am stärksten bevorzugt etwa 0,5 ppm bis etwa 250 ppm Gesamtprotein liegt. Die in der Waschmittelzusammensetzung verwendete Menge an Cellulase-Enzym wird von dem Ausmaß abhängen, zu welchem das Waschmittel nach Zugeben von Wasser verdünnt wird, so dass eine Waschlösung gebildet wird.
Die Waschmittelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in jedweder im Fachgebiet anerkannten Form vorliegen, zum Beispiel als eine Flüssigkeit, in Granulaten, in Emulsionen, in Gelen oder in Pasten. Derartige Formen sind dem Fachmann gut bekannt. Wenn eine feste Waschmittel-Zusammensetzung verwendet wird, wird die Cellulase vorzugsweise als Granulat formuliert. Vorzugsweise können die Granulate so formuliert werden, dass sie zusätzlich ein Cellulase-schützendes Mittel enthalten. Das Granulat kann so formuliert werden, dass es Materialien enthält, welche die Auflösungsrate des Granulates in das Waschmedium hinein reduziert. Solche Materialien und Granulate sind im U.S.-Patent Nr. 5 254 283 offenbart.
Die Waschmittelzusammensetzungen dieser Erfindung verwenden ein oberflächenaktives Mittel, d. h. Tensid, einschließlich anionischer, nicht-ionischer und ampholytischer Tenside, welche für ihre Verwendung in Reinigungsmittelzusammensetzungen gut bekannt sind. Zusätzlich zu der Cellulase-Zusammensetzung und den Tensid(en) können die Reinigungsmittel-Zusammensetzungen dieser Erfindung gegebenenfalls eine oder mehrere der folgenden Komponenten enthalten:
Hydrolasen außer Cellulase
Geeignete Hydrolasen schließen Carboxylatesterhydrolase, Thioester-Hydrolase, Phosphatmonoester-Hydrolase und Phosphatdiester-Hydrolase, welche auf die Esterbindung einwirken; Glycosid-Hydrolase, welche auf Glycosylverbindungen einwirkt; ein Enzym, welches N-Glycosylverbindungen hydrolysiert; Thioether-Hydrolase, welche auf die Etherbindung wirkt; und eine a-Amino-Acyl-Peptid-Hydrolase, Peptidyl-Aminosäure-Hydrolase, Acyl-Aminosäure-Hydrolase, Dipeptid-Hydrolase und Peptidyl-Peptid-Hydrolase, welche auf die Peptidbindung einwirken, ein. Bevorzugt unter ihnen sind Carboxylatester-Hydrolase, Glycosidhydrolase und Peptidyl-Peptid-Hydrolase. Geeignete Hydrolasen schließen ein: (1) Proteasen, welche der Peptidyl-Peptid-Hydrolase angehören, wie Pepsin, Pepsin B, Rennin, Trypsin, Chymotroypsin A, Chymotrypsin B, Elastase, Enterokinase, Cathepsin C, Papain, Chymopapain, Ficin, Thrombin, Fibrinolysin, Renin, Subtilisin, Aspergillopeptidase A, Collagenase, Clostridiopeptidase B, Kallikrein, Gastrisin, Cathepsin D., Bromelin, Keratinase, Chymotrypsin C, Pepsin C, Aspergillopeptidase B, Urokinase, Carboxypeptidase A und B und Aminopeptidase; (2) Glycosid-Hydrolasen (Cellulase, welche ein Hauptbestandteil ist, ist aus dieser Gruppe ausgenommen), α-Amylase, β-Amylase, Glucoamylase, Invertase, Lysozym, Pectinase, Chitinase und Dextranase. Unter ihnen sind α-Amylase und β-Amylase bevorzugt. Sie funktionieren in sauren bis neutralen Systemen, aber eine solche, welche aus Bakterien erhalten wird, zeigt eine hohe Aktivität in einem alkalischen System; (3) Carboxylatester-Hydrolase, einschließlich Carboxylesterase, Lipase, Pektinesterase und Chlorophyllase. Speziell wirksam unter ihnen ist Lipase.
Die von Cellulase verschiedene Hydrolase wird in die Reinigungsmittel-Zusammensetzung in solcher Menge eingebracht, es wie gemäß der Absicht erforderlich ist. Sie sollte vorzugsweise in einer Menge von 0,001 bis 5 Gewichtsprozent und weiter bevorzugt 0,02 bis 3 Gewichtsprozent, bezüglich des gereinigten Proteins, eingebracht werden. Dieses Enzym sollte in der Form von Granulaten, hergestellt aus Rohenzym, allein oder in Kombination mit anderen Komponenten in der Reinigungsmittel-Zusammensetzung verwendet werden. Granulate des Rohenzyms werden in einer derartigen Menge verwendet, dass sich das gereinigte Enzym auf 0,001 bis 50 Gewichtsprozent in den Granulaten beläuft. Die Granulate werden in einer Menge von 0,002 bis 20 und vorzugsweise von 0,1 bis 10 Gewichtsprozent verwendet. Wie bei Cellulasen, können diese Granulate so formuliert werden, dass sie ein enzymschützendes Mittel und ein auflösungsverzögerndes Material enthalten.
Builder
A. Zweiwertige Sequestrierungsmittel.
Die Zusammensetzung kann etwa 0 bis etwa 50 Gewichtsprozent an einer oder mehreren Builderkomponenten enthalten, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkalimetallsalzen und Alkanolaminsalzen der folgenden Verbindungen: Phosphate, Phosphonate, Phosphonocarboxylate, Salze von Aminosäuren, Aminopolyacetate, hochmolekulare Elektrolyte, nicht-dissoziierende Polymere, Salze von Dicarbonsäuren und Aluminiumsilicat-Salze. Geeignete zweiwertige Maskierungsmittel sind in der britischen Patentanmeldung Nr. 2 094 826 A beschrieben.
B. Alkalis oder anorganische Elektrolyte
Die Zusammensetzung kann etwa 1 bis etwa 50 Gewichtsprozent, vorzugsweise etwa 5 bis etwa 30 Gewichtsprozent, basierend auf der Zusammensetzung, an einem oder mehreren Alkalimetallsalzen der folgenden Verbindungen als die Alkalis oder anorganischen Elektrolyte enthalten: Silicate, Carbonate und Sulfate sowie organische Alkalis, wie Triethanolamin, Diethanolamin, Monoethanolamin und Triisopropanolamin.
Anti-Wiederablagerungsmittel
Die Zusammensetzung kann etwa 0,1 bis etwa 5 Gewichtsprozent einer oder mehrerer der folgenden Verbindungen als Anti-Wiederablagerungsmittel enthalten: Polyethylenglykol, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose.
Unter ihnen sieht eine Kombination von Carboxymethylcellulose und/oder Polyethylenglykol mit der Cellulase-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine besonders nützliche schmutzentfernende Zusammensetzung vor.
Bleichmittel
Die Verwendung der Cellulase der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem Bleichmittel, wie Kaliummonopersulfat, Natriumpercarbonat, Natriumperborat, Natriumsulfat/Wasserstoffperoxid-Addukt und Natriumchlorid/Wasserstoffperoxid-Addukt oder/und einem lichtempfindlichen Bleichungs-Farbstoff, wie Zink- oder Aluminiumsalz von sulfoniertem Phthalocyanin, verbessert die Reinigungswirkungen weiter. In ähnlicher Weise können Bleichmittel und Bleichkatalysatoren, wie beschrieben im EP 684 304 , verwendet werden.
Bläuungsmittel und fluoreszierende Farbstoffe
Verschiedene Bläuungsmittel und fluoreszierende Farbstoffe können in die Zusammensetzung eingebunden werden, falls notwendig. Geeignete Bläuungsmittel und fluoreszierende Farbstoffe sind in der britischen Patentanmeldung Nr. 2 094 826 A offenbart.
Klumnenbildungs-Inhibitoren
Die folgenden Verklumpungsinhibitoren können in das pulverförmige Reinigungsmittel eingebunden werden: p-Toluolsulfonsäuresalze, Xylensulfonsäuresalze, Essigsäuresalze, Sulfobernsteinsäuresalze, Talk, fein pulverisiertes Siliziumdioxid, amorphe Siliziumdioxide, Ton, Calciumsilicat (wie Micro-Cell von Johns Manville Co.), Calciumcarbonat und Magnesiumoxid.
Maskierungsmittel für Faktoren, welche die Cellulase-Aktivität inhibieren Die Cellulase-Zusammensetzung dieser Erfindung wird in manchen Fällen in Gegenwart von Kupfer, Zink, Chrom, Quecksilber, Blei, Mangan oder Silberionen oder ihren Verbindungen deaktiviert. Verschiedene Metall-Chelatierungsmittel und Metall-präzipitierende Mittel sind gegen diese Inhibitoren wirksam. Sie schließen beispielsweise zweiwertige Metallion-Sequestriermittel, wie im oben stehenden Punkt unter Bezug auf wahlfreie Additive aufgelistet, sowie Magnesiumsilicat und Magnesiumsulfat ein.
Cellobiose, Glucose und Gluconolacton wirken manchmal als Inhibitoren. Es wird bevorzugt, die Co-Gegenwart dieser Saccharide mit der Cellulase zu vermeiden, soweit möglich. In dem Fall, dass eine gemeinsame Gegenwart unvermeidlich ist, ist es notwendig, den direkten Kontakt der Saccharide mit der Cellulase zu vermeiden, beispielsweise indem man diese beschichtet.
Langketten-Fettsäure-Salze und kationische Tenside wirken als die Inhibitoren in einigen Fällen. Allerdings ist die gemeinsame Gegenwart dieser Substanzen mit der Cellulase zulässig, wenn der direkte Kontakt von ihnen durch irgendwelche Mittel, wie Tablettieren oder Beschichten, verhindert wird.
Die oben stehend erwähnten Maskierungsmittel und Verfahren können, falls notwendig, in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Cellulase-Aktivatoren
Die Aktivatoren können abhängig von der spezifischen Cellulase variieren. In Gegenwart von Proteinen, Kobalt und seinen Salzen, Magnesium und seinen Salzen und Calcium und seinen Salzen, Kalium und seinen Salzen, Natrium und seinen Salzen oder Monosacchariden, wie Mannose und Xylose, werden viele Cellulasen aktiviert, und ihre Reinigungsleistung wird beträchtlich verbessert.
Antioxidationsmittel
Die Antioxidationsmittel schließen zum Beispiel tert-Butyl-Hydroxytoluol, 4,4'-Butylidenbis(6-tert-butyl-3-methylphenol), 2,2'-Butylidenbis(6-tert-butyl-4-methylphenol), monostyrolisiertes Cresol, distyrolisiertes Cresol, monostyrolisiertes Phenol, distyrolisiertes Phenol und 1,1-Bis(4-hydroxyphenyl)cyclohexan ein.
Solubilisatoren
Die Solubilisatoren schließen zum Beispiel niedere Alkohole, wie Ethanol, Benzolsulfonatsalze, Niederalkylbenzolsulfonatsalze, wie p-Toluolsulfonatsalze, Glykole wie Propylenglykol, Acetylbenzolsulfonatsalze, Acetamide, Pyridindicarbonsäureamide, Benzoat-Salze und Harnstoff ein.
Die Reinigungsmittel-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann in einem breiten pH-Bereich von saurem bis alkalischem pH eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Reinigungsmittel-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in schwach sauren, neutralen oder alkalischen Reinigungsmittel-Waschmedien verwendet werden, welche einen pH-Wert von über 5 bis zu nicht mehr als etwa 12 aufweisen.
Neben den oben genannten Bestandteilen, können Duftstoffe, Puffer, Konservierungsstoffe, Farbstoffe und dergleichen, falls gewünscht, mit den Reinigungsmittel-Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden. Solche Komponenten werden herkömmlicherweise in bislang im Fachgebiet verwendeten Mengen eingesetzt.
Wenn eine Reinigungsmittelbasis, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, in der Form eines Pulvers vorliegt, kann es ein solches sein, welches durch jedwede bekannten Herstellungsverfahren hergestellt wird, einschließlich eines Sprühtrocknungsverfahrens und eines Granulierungsverfahrens. Die Reinigungsmittelbasis, welche insbesondere durch das Sprühtrocknungsverfahren, Agglomerationsverfahren, Trockenmischverfahren oder Nicht-Turm-Routen-Verfahren erhalten wird, ist bevorzugt. Die durch das Sprühtrocknungsverfahren erhaltene Reinigungsmittelbasis ist nicht in Hinsicht auf die Herstellungsbedingungen eingeschränkt. Die durch das Sprühtrocknungsverfahren erhaltene Reinigungsmittelbasis besteht in Hohlgranulaten, welche durch Sprühen einer wässrigen Schlämmung von wärmebeständigen Bestandteilen, wie oberflächenaktiven Mitteln und Buildern, in einen heißen Raum erhalten werden. Nach dem Sprühtrocknen können Duftstoffe, Enzyme, Bleichmittel und anorganische alkalische Builder zugesetzt werden. Bei einer hochdichten, granulären Reinigungsmittelbasis, wie sie durch das Sprühtrocknungs-Granulations- oder Agglomerationsverfahren erhalten wird, können verschiedene Bestandteile auch nach der Herstellung der Basis zugesetzt werden.
Wenn die Reinigungsmittelbasis eine Flüssigkeit ist, kann sie entweder eine homogene Lösung oder eine inhomogene Dispersion sein. Zum Abwenden der Zersetzung von Carboxy methylcellulose durch die Cellulase in dem Reinigungsmittel, wird es erwünscht, dass Carboxymethylcellulose, vor der Einbringung in die Zusammensetzung, granuliert oder beschichtet wird.
Die Reinigungsmittel-Zusammensetzungen dieser Erfindung können mit Zellulose enthaltendem Gewebe, zum Beispiel verschmutzten Textilien, in Industrie- und Haushalt-Anwendungen bei Temperaturen, Reaktionszeiten und Flottenverhältnissen, welche herkömmlich in diesen Umgebungen verwendet werden, inkubiert werden. Die Inkubationsbedingungen, d. h. die Bedingungen, welche zum Behandeln von zellulosehaltigen Textilien mit Reinigungsmittel-Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung wirksam sind, werden vom Fachmann auf dem Gebiet ohne Weiteres feststellbar sein. Folglich werden die entsprechenden Bedingungen, die zur Behandlung mit den vorliegenden Reinigungsmitteln effektiv sind, denjenigen unter Verwendung ähnlicher Reinigungsmittel-Zusammensetzungen, welche bekannte Cellulasen einschließen, entsprechen.
Reinigungsmittel gemäß der vorliegenden Erfindung können darüber hinaus als eine Vorwäsche in der geeigneten Lösung bei einem intermediären pH-Wert formuliert werden, worin eine ausreichende Aktivität vorliegt, um die gewünschten Verbesserungen beim Weichmachen, Entpillen, Pilling-Verhinderung, Oberflächenfaser-Entfernen oder Säubern vorzusehen. Wenn die Reinigungsmittelzusammensetzung eine Zusammensetzung zum Voreinweichen (z. B. Vorwaschen oder Vorbehandeln) ist, entweder als Flüssigkeits-, Spray-, Gel- oder Pasten-Zusammensetzung, wird das Cellulase-Enzym im Allgemeinen bei etwa 0,0001 bis etwa 1 Gewichtsprozent, basierend auf dem Gesamtgewicht der Voreinweich- oder Vorbehandlungs-Zusammensetzung, verwendet. In solchen Zusammensetzungen kann gegebenenfalls ein Tensid verwendet werden, und bei Verwendung ist es im Allgemeinen bei einer Konzentration von etwa 0,005 bis etwa 20 Gewichtsprozent, basierend auf dem Gesamtgewicht der Voreinweichung, vorhanden. Der Rest der Zusammensetzung umfasst herkömmliche Komponenten, welche in der Voreinweichung verwendet werden, d. h. Verdünnungsmittel, Puffer, weitere Enzyme (Proteasen) und dergleichen bei ihren herkömmlichen Konzentrationen.
Es wird in Erwägung gezogen, dass Zusammensetzungen, welche die hierin beschriebenen Cellulase-Enzyme umfassen, in der Haushaltsanwendung als eine Stand-Alone-Zusammensetzung verwendet werden können, die zum Wiederherstellen von Farbe bei ausgeblichenen Textilien geeignet ist (siehe zum Beispiel U.S.-Patent Nr. 4 738 682), sowie in einem Fleckenentferner und zum Entpillen und Anti-Pilling (Pilling-Verhinderung) verwendet werden können.
Die Verwendung der Cellulase gemäß der Erfindung kann bei Futterzusatzstoffen und bei der Verarbeitung von Zellstoff und Papier besonders effektiv sein. Diese zusätzlichen industriellen Anwendungen werden zum Beispiel in der PCT-Veröffentlichung Nr. 95/16360 bzw. dem finnischen erteilten Patent Nr. 87372 beschrieben.
Um die vorliegende Erfindung und ihre Vorteile weiter zu veranschaulichen, werden die nachfolgenden spezifischen Beispiele angegeben, wobei es sich versteht, dass sie dargeboten werden, um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen, und keineswegs so ausgelegt werden sollten, dass sie deren Umfang einschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1
Herstellung von genomischer DNA, welche EGIII-ähnliche Cellulasen codiert Genomische DNA wurde aus mehreren verschiedenen Mikroorganismen zum Zwecke der Durchführung einer PCR-Reaktion präpariert, um zu bestimmen, ob EGIII-ähnliche Cellulasen durch die DNA für einen jeweiligen Organismus codiert werden.
Genomische DNA wird aus Acremonium brachypenium, Hinterlegungs-Nr. CBS 886.73; Chaetomium brasillience, Hinterlegungs-Nr. CBS 140.50; Chaetomium vitellium, Hinterlegungs-Nr. CBS 250.85; Emericella desertorum, Hinterlegungs-Nr. CBS 653.73; Fusarium equiseti, Hinterlegungs-Nr. CBS 185.34; Gliocladium roseum, Hinterlegungs-Nr. CBS 443.65; Humicola grisea var. thermoidia, Hinterlegungs-Nr. CBS 225.63; Myceliopthora thermophila, Hinterlegungs-Nr. ATCC 48102-48104; Penicillium notatum, Hinterlegungs-Nr. ATCC 9178, 9179; und Phanerochaete chrysosporium, Hinterlegungs-Nr. ATCC 28326 erhalten und gemäß Standardverfahren isoliert.
PCR wurde auf einer standardmäßigen PCR-Maschine, wie dem PCT-150 MicroCycler von MJ Research Inc. wie den folgenden Bedingungen durchgeführt:

1) 1 Minute bei 98°C während 1 Zyklus;
2) 1 Minute bei 94°C, 90 Sekunden bei 40°C, 1 Minute bei 72°C
3) Wiederhole Schritt 2 während 30 Zyklen
4) 7 Minuten bei 72°C während 1 Zyklus
5) Erniedrigen der Temperatur auf 15°C für die Aufbewahrung und weitere Analyse.

Die folgenden DNA-Primer wurden zur Verwendung in der Amplifikation von EGIII-ähnlichen Genen aus den Bibliotheken, die aus den verschiedenen Mikroorganismen hergestellt wurden, konstruiert. Alle Symbole, welche hierin für Protein- und DNA-Sequenzen verwendet werden, entsprechen den IUPAC-IUB-"Biochemische Nomenklatur-Kommission"-Codes.

BOX 1: Primer, codierend für (N/Q)NLWG Vorwärtsprimer: FRG001: AAY AAY YTN TGG GG Vorwärtsprimer: FRG002: CAR AAY YTN TGG GG

BOX1': Primer, codierend für NNN(F/L/Y/I/L/N/K)WG Vorwärtsprimer: FRG010: AAY AAY AAY HWI TGG GG

BOX 2: Primer, codierend für ELMIW Vorwärts-Primer: FRG003: GAR YTN ATG ATH TGG Rückwärts-Primer: FRG004: CCA DAT CAT NAR YTC

BOX2': Primer, codierend für YELMIW Vorwärts-Primer: FRG011: TAY GAR YTI ATG ATH TGG Rückwärts-Primer: FRG012: CCA DAT CAT IAR YTC RTA

BOX3: Primer, codierend für GTE(P/C)FT Rückwärts-Primer: FRG005: GTR AAN GGY TCR GTR CC Rückwärts-Primer: FRG006: GTR AAN GGY TCR GTY CC Rückwärts-Primer: FRG007: GTR AAN GGY TCY GTR CC Rückwärts-Primer: FRG008: GTR AAN GGY TCY GTY CC Rückwärts-Primer: FRG009: GTR AAR CAY TCN GTN CC

PCR-Bedingungen für PWO-Polymerase (Boehringer Mannheim, Cat # 1644-947) umfassen eine 100-Mikroliter-Lösung, hergestellt aus 10 Mikrolitern 10 x Reaktionspuffer (10 x Reaktionspuffer umfassend 100 mM Tris HCl, pH 8-8,5; 250 mM KCl; 50 mM (NH₄)₂SO₄; 20 mM MgSO₄); 0,2 mM jeweils von dATP, dTTP, dGTP, dCTP (Endkonzentration), 1 Mikroliter 100 Nanogramm/Mikroliter genomische DNA, 1 Mikroliter PWO bei 1 Unit pro Mikroliter, 500 mM Primer (Endkonzentration) und Wasser zu 100 Mikrolitern. Die Lösung wird mit Mineralöl überschichtet.
Die PCR-Strategie war wie folgend: Vorwärtsprimer für BOX1 und BOX1' wurden mit Rückwärtsprimern aus BOX3 in einer Mischung mit der gewünschten genomischen DNA-Probe vereinigt und auf einem Gel laufen gelassen, um Fragmente im 400-1000-Basenpaarbereich zu erhalten. Die erhaltenen Fragmente wurden dann vereinigt, und der Pool wurde in zwei ungefähr gleiche Portionen aufgeteilt. Der erste Pool wurde mit den Vorwärtsprimern aus BOX1 und BOX1' zusammen mit dem Rückwärtsprimer aus BOX2 kombiniert. Der zweite Pool wurde mit dem Vorwärtsprimer aus BOX2 zusammen mit den Rückwärtsprimern aus BOX3 kombiniert. Fragmente mit der ungefähren Größe, relativ zu einer EGIII-ähnlichen Cellulase, unter Berücksichtigung der Lokalisierung der Primer innerhalb des Gens, in diesem Fall entsprechend denjenigen zwischen 250-500 Basenpaaren, wurden isoliert und sequenziert.
Aus den sequenzierten Fragmenten war es möglich, die RAGE-Technik (rasche Amplifikation genomischer Enden) anzuwenden, um die Sequenz des Volllängen-Gens schnell zu erhalten. Volllängen-Gene wurden erhalten und sind mit mehreren zusätzlichen EGIII-ähnlichen Cellulase-Sequenzen in der 3 angegeben. Wie in der 3 gezeigt, enthalten Volllängen-Gene, welche aus Hypocrea schweinitzii, Aspergillus aculeatus, Apergillus kawachii (1), Aspergillus kawachii (2), Aspergillus oryzae, Humicola grisea, Humicola insolens, Chaetomium brasilliense, Fusarium equiseti, Fusarium javanicum (1), Fusarium javanicum (2), Gliocladium roseum (1), Gliocladium roseum (2), Gliocladium roseum (3), Gliocladium roseum (4), Memnoniella echinata, Emericella desertorum, Actinomycete 11AG8, Streptomyces lividans CelB, Rhodothermus marinus, Emericella desertorum und Erwinia carotovara isoliert wurden, alle eine signifikante Homologie zu EGIII aus Trichoderma reesei.
Beispiel 2
Temperaturstabilitäts-Test an EGIII und EGIII-ähnlichen Cellulasen
EGIII und EGIII-Homologe, abgeleitet aus Humicola grise, Humicola insolens, Emercella desertorum, Fusarium javanicum und Memnonella echinata, wurden getestet, um ihre Stabilität unter Temperaturbelastung zu bestimmten.
Die Stabilität wurde durch Verfolgen der Rate des Aktivitätsverlusts nach Inkubation bei einer festgelegten hohen Temperatur geassayt: Lösungen von EGIII- und EGIII-ähnlichen Cellulasen bei zwischen 0,1 mg/ml und 0,5 mg/ml in 50 mM Citrat/Phosphat-Puffer bei pH 8,0 wurden in einem Wasserbad bei 48°C inkubiert. An den Meßzeitpunkten wurden 100 μl große Aliquots entnommen und rasch gekühlt (oder eingefroren). Die verbleibende Aktivität in diesen Aliquots wurde geassayt, wie nachstehend ausführlich angegeben. Eine Kurve der irreversiblen Wärmeinaktivierung wurde durch Auftragen der verbleibenden Aktivität gegen die Zeit aufgestellt, und die Daten wurden an einen einfach-exponentiellen Zerfall angepasst. Die Halbwertszeit dieses exponentiellen Zerfalls wurde als ein Maß der Wärmestabilität festgestellt.
Aktivitäts-Assay: In eine Vertiefung einer 96-Vertiefungs-Mikrotiter-Platte wurden 10 μl Enzymprobe zu 120 μl Substrat (4,2 mg/ml o-Nitrophenyl-Cellobiosid) in 50 mM Kaliumphosphat, pH 6,7 zugesetzt. Die Platte wurde dann 10 Minuten lang bei 40°C inkubiert, und die Reaktionen wurden mit 70 μl 0,2 M Glycin gelöscht. Die Absorption bei 410 nm (aufgrund des nach enzymatischer Spaltung des Substrats freigesetzten o-Nitrophenols) wurde dann in einem Mikrotiter-Platten-Lesegerät gemessen. Diese Endpunkt-410 nm-Ablesung war proportional zur Cellulaseaktivität in der Enzymprobe.
Die Ergebnisse des Stabilitäts-Testens waren wie folgend:
"Stabil" bedeutet weniger als 20 % Aktivitätsverlust in 200 Minuten.
Wie durch die oben stehenden Ergebnisse ersichtlich, hatten die EGIII-Homologe signifikant verbesserte Stabilität, obwohl sie eine nahe Homologie zu EGIII aus T.reesei aufwiesen. Folglich ist es offensichtlich, dass diese Unterschiede in den Resten kritisch für die verbesserte Stabilität der EGIII-Homologe sind, und als solches wird eine weitere Verbesserung der EGIII-ähnlichen Cellulasen durch Modifizieren dieser Reste zu zusätzlichen zunehmenden Verbesserungen der Stabilität der EGIII-ähnlichen Enzyme führen.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

EGIII- oder EGIII-ähnliche Cellulase-Variante, wobei die Variante eine Substitution oder Deletion, verglichen mit dem entsprechenden Wildtypenzym, an einer Position umfasst, welche den Resten G31, N164 oder N174 in reifer EGIII aus Trichoderma reesei entspricht, wobei das Wildtypenzym eine Pilz-, Bakterien- oder Actinomyceten-Cellulase ist, welche mindestens 60 % Aminosäureidentität zu EGIII aus Trichoderma reesei aufweist, wodurch die Cellulase-Variante eine modifizierte Wärmestabilität im Vergleich zum Wildtypenzym besitzt.
EGIII- oder EGIII-ähnliche Cellulase-Variante gemäß Anspruch 1, wobei die Substitution G31 Q, N164D oder N174D in reifer EGIII aus Trichoderma reesei entspricht.
Cellulase gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Cellulase aus einem filamentösen Pilz stammt.
Cellulase gemäß Anspruch 3, wobei der filamentöse Pilz den Euascomyceten angehört.
Cellulase gemäß Anspruch 4, wobei es sich bei dem Euascomyceten um Aspergillus spp., Gliocladium spp., Fusarium spp., Acremonium spp., Myceliophthora spp., Verticillium spp., Myrothecium spp. oder Penicillium spp. handelt.
DNA, welche die Cellulase gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 codiert.
Vektor, welcher die DNA von Anspruch 6 umfasst.
Wirtszelle, welche mit einem Vektor von Anspruch 7 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung einer Cellulase, umfassend die folgenden Schritte: (a) Kultivieren der Wirtszelle gemäß Anspruch 8 in einem geeigneten Kulturmedium unter geeigneten Bedingungen zur Herstellung von Cellulase; (b) Erhalten der hergestellten Cellulase; und gegebenenfalls (c) Reinigen der Cellulase zur Bereitstellung eines gereinigten Cellulase-Produkts.
Reinigungsmittelzusammensetzung, umfassend ein Tensid und eine Cellulase gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2.
Reinigungsmittel gemäß Anspruch 10, wobei das Reinigungsmittel ein Wäschewaschmittel ist.
Reinigungsmittel gemäß Anspruch 10, wobei das Reinigungsmittel ein Geschirrspülmittel ist.
Verwendung der EGIII- oder EGIII-ähnlichen Cellulase-Variante gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 in der Behandlung einer Cellulose-enthaltenden Textilie.
Verwendung der EGIII- oder EGIII-ähnlichen Cellulase gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 als Futterzusatzstoff.
Verwendung der EGIII- oder EGIII-ähnlichen Cellulase gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 in der Behandlung von Holz-Zellstoff.
Verwendung der EGIII- oder EGIII-ähnlichen Cellulase gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 bei der Reduktion von Biomasse zu Glukose.
Verwendung der EGIII- oder EGIII-ähnlichen Cellulase gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 beim 'Stonewashing' oder Indigo-Färben von Denim.