DE69927174T2

DE69927174T2 - VERFAHREN ZUM SYNTHETISIEREN VON cDNA

Info

Publication number: DE69927174T2
Application number: DE69927174T
Authority: DE
Inventors: Junko Yamamoto; Kazue Miyake; Hiroyuki Mukai; Fumitsugu Hino; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1998-11-27
Filing date: 1999-11-25
Publication date: 2006-06-08
Anticipated expiration: 2019-11-26
Also published as: DE69927174D1; EP1132470A4; EP1132470A1; CN1333827A; AU1408900A; US6485917B1; KR100506124B1; ATE304051T1; US20050153326A1; KR20020002358A; US20030077762A1; WO2000032763A1; EP1132470B1; US6949634B2; CN1276082C; JP3910015B2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Synthese einer cDNA und einen Kit, der für das Verfahren verwendet wird, das/der auf dem Gebiet der genetischen Manipulation verwendbar ist.
Hintergrund der Erfindung
Die Analyse von mRNA-Molekülen, die von verschiedenen Genen stammen, ist von sehr großer Bedeutung, um biologische Phänomene aufzuklären. Die Entdeckung einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase, die sogenannte reverse Transkriptase in einem Retrovirus hat eine reverse Transkriptionsreaktion ermöglicht, bei der eine cDNA unter Verwendung von RNA als Template synthetisiert wird. Als Folge haben die Verfahren zur Analyse von mRNA-Molekülen einen schnellen Fortschritt verzeichnet. Dann haben sich die Verfahren zur Analyse von mRNA-Molekülen unter Verwendung einer reversen Transkriptase nicht mehr wegzudenkende experimentelle Methoden zur Untersuchung von Genen entwickelt. Weiter wurden diese Verfahren, die in Klonierungstechniken und PCR-Techniken eingesetzt wurden, unabdingbare Techniken, die nicht nur zur Untersuchung von Genen, sondern auch in einer breiten Vielfalt von Gebieten, einschließlich der Biologie, Medizin und Landwirtschaft eingesetzt wurden. Ein reverses Transkriptionsverfahren, das aus einem getrennten Erststrang- und Zweitstrangsyntheseschritt besteht, wurde beispielsweise von Clontech angeboten (Seiten 30 und 179, Clontech-Katalog 96/97). Verfahren mit Enzymen, die sowohl eine 3'-5'-Exonuklease- als auch reverse Transkriptionsaktivität enthalten, sind in den US-Patenten 5,624,833 (Spalte 12, Zeile 66 ff.) und 5,618,703 (Spalte 15, Zeile 20 ff.) beschrieben.
Jedoch wiesen die konventionellen reverse Transkriptionsverfahren viele Probleme auf, wie z.B. eine Unterbrechung der cDNA-Synthesereaktion, die Unfähigkeit eine lange cDNA zu synthetisieren, geringe Genauigkeit und Zerstörung der Template- RNA im Verlauf der Reaktion aufgrund der für die Reaktion benötigten langen Dauer.
Es wird angenommen, dass die Unterbrechung der cDNA-Synthesereaktion auf die Sekundärstruktur zurückzuführen ist, die durch die RNA als Template gebildet wird. Die optimale Reaktionstemperatur für eine reverse Transkriptase von einem Retrovirus ist niedrig. RNAs bilden während der Reaktion bei der Temperatur komplizierte Sekundärstrukturen. Daher wird die cDNA-Synthesereaktion an den Stellen von solchen Sekundärstrukturen unterbrochen. Es wurde ein Verfahren, bei dem eine Hitze-resistente reverse Transkriptase verwendet wird, vorgeschlagen, um das oben genannte Problem zu lösen. Jedoch ist die Reaktivität dieses Verfahrens nicht zufriedenstellend. Zusätzlich war nicht bekannt, dass reverse Transkriptasen eine Korrekturleseaktivität während einer reversen Transkriptionsreaktion ausüben und es war auch kein Verfahren zur Synthese einer cDNA mit hoher Genauigkeit bekannt.
Wie oben beschrieben war es schwierig, eine cDNA mit hoher Effizienz und mit hoher Genauigkeit entsprechend den konventionellen Verfahren zu synthetisieren. Daher ist ein effizienteres Verfahren zur Synthese einer cDNA wünschenswert.
Aufgabe der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wurde angesichts des oben beschriebenen Stands der Technik entworfen. Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Probleme zu lösen, die mit dem Stand der Technik verbunden sind und ein Verfahren zur Synthese einer cDNA mit einer hohen Reaktionseffizienz und Genauigkeit zur Verfügung zu stellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird wie folgt beschrieben. Der erste Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese einer cDNA, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die Durchführung einer reversen Transkriptionsreaktion in der Gegenwart eines Enzyms mit einer reversen Transkriptionsaktivität und einem anderen Enzym mit einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität umfasst.
Der zweite Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Amplifikation einer cDNA, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die Durchführung einer Gen-Amplifikationsreaktion umfasst, bei der eine cDNA als Template verwendet wird, die gemäß dem Verfahren nach dem ersten Aspekt synthetisiert wurde.
Der dritte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Kit zur cDNA-Synthese, der ein Enzym mit einer reversen Transkriptionsaktivität und ein anderes Enzym mit einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität enthält.
Der vierte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Kit zur Amplifikation einer cDNA durch Durchführung einer Gen-Amplifikationsreaktion unter Verwendung einer cDNA als Template, die gemäß dem Verfahren des ersten Aspekts synthetisiert wurde, der ein Enzym mit einer reversen Transkriptionsaktivität und ein anderes Enzym mit einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität sowie ein Reagenz für die Gen-Amplifikationsreaktion enthält.
Die Erfinder haben festgestellt, dass die Effizienz der cDNA-Synthese und die Genauigkeit durch Durchführung einer reversen Transkriptionsreaktion in der Gegenwart eines Enzyms mit einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität in einer cDNA-Synthesereaktion erhöht werden kann. Dies hat die Grundlage für die vorliegende Erfindung geschaffen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Eines der Hauptmerkmale des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Synthese einer cDNA ist es, dass eine cDNA unter Verwendung einer RNA als Template in einem reversen Transkriptionsreaktionssystem synthetisiert wird, das ein Enzym mit einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität enthält.
Beispiele von Proben, die RNAs enthalten, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Proben von Organismen wie einer Zelle, einem Gewebe und Blut sowie Proben, die einen Organismus enthalten können, wie Nahrungsmittel, Erde und Abwasser. Die Probe kann eine Präparation sein, die eine Nukleinsäure enthält, die durch Verarbeitung der oben genannten Probe gemäß einem bekannten Verfahren gewonnen wurde. Beispiele von Präparationen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen ein Zellzertrümmerungsprodukt und eine Probe, die durch Fraktio nierung des Produkts, der Gesamt-RNA in der Probe erhalten wurde oder einer Probe, bei der spezifische RNA-Moleküle wie mRNAs angereichert sind.
Die RNAs, bei denen das erfindungsgemäße Verfahren angewendet werden kann, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf RNA-Moleküle wie RNA, mRNA, tRNA und rRNA in einer Probe, sowie spezifische RNA-Moleküle (z.B. RNA-Moleküle, die jeweils ein gemeinsames Basensequenzmotiv besitzen, Transkripte, die unter Verwendung einer RNA-Polymerase erhalten wurden und RNA-Moleküle, die durch ein Subtraktionsverfahren konzentriert wurden). Es können beliebige RNAs, für die ein Primer zur Verwendung in einer reversen Transkriptionsreaktion hergestellt werden kann, verwendet werden.
Die zur Synthese einer cDNA aus einer RNA als Template verwendeten Primer sind nicht auf einen spezifischen beschränkt, solange es sich um ein Oligonukleotid handelt, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die komplementär ist zu der Template-RNA und die sich an die Template-RNA unter den verwendeten Reaktionsbedingungen anlagern kann. Der Primer kann ein Oligonukleotid sein, wie ein Oligo(dT) oder ein Oligonukleotid mit einer Zufallssequenz (ein Zufallsprimer).
Angesichts der spezifischen Anlagerung beträgt die Länge des Primers vorzugsweise 6 Nukleotide oder mehr, bevorzugter 10 Nukleotide oder mehr. Bezüglich der Oligonukleotidsynthese beträgt die Länge vorzugsweise 100 Nukleotide oder weniger, bevorzugter 30 Nukleotide oder weniger. Das Oligonukleotid kann beispielsweise unter Verwendung des DNA-Synthetisierers Typ 394 von Applied Biosystems Inc. (ABI) gemäß einem Phosphoramidit-Verfahren synthetisiert werden. Alternativ kann ein beliebiges Verfahren einschließlich einem Phosphattriester-Verfahren, einem H-Phosphonat-Verfahren und einem Thiophosphonat-Verfahren verwendet werden, um das Oligonukleotid zu synthetisieren. Das Oligonukleotid kann von einer biologischen Probe stammen. Zum Beispiel kann es von einer DNA isoliert oder präpariert werden, die von einer natürlichen Probe präpariert wurde, die mit einer Restriktionsendonuklease verdaut wurde. Für die Synthese einer cDNA von einer Template-RNA beträgt die Konzentration des Primers in dem reversen Transkriptionsreaktionsgemisch vorzugsweise 0,1 μM oder mehr, bevorzugter 0,5 μM oder mehr. Für die Inhibition der Reaktion beträgt die Konzentration vorzugsweise 10 μM oder weniger, bevorzugter 5 μM oder weniger.
Beliebige Enzyme mit reversen Transkriptionsaktivitäten können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, so lange sie die Aktivitäten zur Synthese von cDNAs unter Verwendung von RNAs als Template besitzen. Jedoch sind Enzyme mit reversen Transkriptionsaktivitäten bei einer hohen Temperatur (d.h. Hitzeresistenten reversen Transkriptasen) für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Beispiele von solchen Enzymen, die verwendet werden können, umfassen eine DNA-Polymerase von einem Bakterium des Genus Thermus (z.B. Tth-DNA-Polymerase) und eine DNA-Polymerase von einem thermophilen Bakterium des Genus Bacillus. Das Vorliegen eines Manganions in einem Reaktionsgemisch ist für die Durchführung der reversen Transkriptionsaktivität der Tth-DNA-Polymerase unabdingbar. Das Manganion ist dafür bekannt, die Genauigkeit einer PCR zu verringern. Daher ist es erforderlich, dass Manganion zu entfernen, wenn ein reverses Transkriptionsreaktionsgemisch, bei dem Tth-DNA-Polymerase verwendet wird, für eine PCR verwendet wird. DNA-Polymerasen von thermophilen Bakterien des Genus Bacillus benötigen keinen Zusatz eines Manganions für die Ausübung deren reversen Transkriptionsaktivität und dessen Entfernung nach einer PCR. Diesbezüglich sind DNA-Polymerasen von thermophilen Bakterien des Genus Bacillus in der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Eine DNA-Polymerase von dem Bacillus caldotenax (hier als Bca-DNA-Polymerase bezeichnet) und eine DNA-Polymerase von dem Bacillus stearothermophilus (hier als Bst-DNA-Polymerase bezeichnet) sind bevorzugt. Diese Enzyme benötigen kein Manganion für die Reaktion. Weiter können sie verwendet werden, um eine cDNA zu synthetisieren, während die Bildung einer Sekundärstruktur der Template-RNA unter hohen Temperaturbedingungen unterdrückt wird.
Bacillus caldotenax ist ein thermophiles Bakterium mit einer optimalen Wachstumstemperatur von ungefähr 70°C. Die Bca-DNA-Polymerase von diesem Bakterium ist dafür bekannt, dass sie eine DNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität, eine RNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität (eine reverse Transkriptionsaktivität), eine 5'-3'-Exonukleaseaktivität und eine 3'-5'-Exonukleaseaktivität besitzt.
Bei diesem Enzym kann es sich entweder um ein Enzym handeln, das von dessen ursprünglichen Quelle aufgereinigt wurde oder es kann sich um ein rekombinantes Protein handeln, das unter Verwendung von genetischen Manipulationstechniken hergestellt wurde. Das Enzym kann durch Modifikation verändert werden, z.B. durch Substitution, Deletion, Addition oder Insertion, indem genetische Manipulationstechniken oder andere Mittel verwendet werden. Beispiele von solchen modi fizierten Enzymen umfassen BcaBEST-DNA-Polymerase (Takara Shuzo), bei der es sich um eine Bca-DNA-Polymerase handelt, bei der deren 5'-3'-Exonukleaseaktivität fehlt und Bst-DNA-Polymerase, Large fragment (New England Biolabs), welches eine Bst-DNA-Polymerase ist, bei der dessen 5'-3'-Exonukleaseaktivität fehlt. Die oben genannten Enzyme, denen deren 5'-3'-Exonukleaseaktivitäten fehlen, können vorzugsweise in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die Menge des Enzyms mit einer reversen Transkriptionsaktivität, die verwendet werden muss, ist nicht auf eine bestimmte beschränkt. Das Enzym kann beispielsweise in einer Menge verwendet werden, die in einer konventionellen reversen Transkriptionsreaktion verwendet wird. Die Menge des Enzyms mit einer reversen Transkriptionsaktivität kann im Vergleich zu der für ein konventionelles Verfahren erhöht werden, um die cDNA-Synthesereaktion effizienter durchzuführen und die Reaktionszeit zu verkürzen. Zum Beispiel kann die Menge des Enzyms in dem Reaktionsgemisch 0,5 U oder mehr betragen, wenn BcaBEST-DNA-Polymerase zur Durchführung einer reversen Transkriptionsreaktion in einem Reaktionsvolumen von 20 μl verwendet wird. Angesichts der cDNA-Syntheseeffizienz werden vorzugsweise 22 U oder mehr, bevorzugter 42 U oder mehr verwendet. Die Aktivität einer DNA-Polymerase wie hier beschrieben basiert auf der Angabe für ein kommerziell erhältliches Enzym. Eine Aktivität zum Einbau von 10 nmol Gesamtnukleotiden in einem Säure-unlöslichen Präzipitat in 30 Minuten unter Reaktionsbedingungen, die für die DNA-Polymerase geeignet sind, wird als 1 U definiert. Es wird DNA als Template und eine Reaktionstemperatur, die für jede DNA-Polymerase geeignet ist, verwendet. Zum Beispiel wird im Falle von BcaBEST-DNA-Polymerase eine Aktivität zum Einbau von 10 nmol Gesamtnukleotiden in ein Säure-unlösliches Präzipitat in 30 Minuten bei 60°C unter Verwendung von Polydesoxy (ATP-TTP) als Template/Primer als 1 U definiert.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Synthese einer cDNA ist dadurch charakterisiert, dass es die Durchführung einer reversen Transkriptionsreaktion in der Gegenwart eines Enzyms mit einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität umfasst. Das Enzym mit einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist nicht auf ein spezifisches beschränkt, solange es die entsprechende Aktivität besitzt. Zum Beispiel kann eine DNA-Polymerase mit einer 3'-5'-Exonuklease verwendet werden. Beispiele von solchen Enzymen umfassen DNA-Polymerasen des α-Typs, wie eine DNA-Polymerase von einem Bakterium des Genus Pyrococcus (Pfu DNA-Polymerase (Stratagene), Pyrobest DNA-Polymerase (Takara Shuzo), Deep Vent DNA-Polymerase (New England Biolabs), KOD-DNA-Polymerase (Toyobo), Pwo DNA-Polymerase (Boehringer), etc. und eine DNA-Polymerase von einem Bakterium des Genus Thermococcus (Vent DNA Polymerase (New England Biolabs), etc.) und pol I-Typ DNA-Polymerasen, wie eine DNA-Polymerase von Escherichia coli (Polymerase I, Klenow Fragment, etc.) und eine DNA-Polymerase von einem Bakteriophagen (T4-DNA-Polymerase, etc.). Vorzugsweise wird eine DNA-Polymerase des α-Typs, die eine starke 3'-5'-Exonukleaseaktivität aufweist, verwendet. Die DNA-Polymerase des pol I-Typs oder die DNA-Polymerase des α-Typs bezieht sich auf eine Reihe von Enzymen, die auf der Basis der Aminosäuresequenzhomologie klassifiziert werden. Die Merkmale der Aminosäuresequenzen sind in Nucleic Acids Research, 15: 4045–4657 (1991) beschrieben.
Für den Zweck der vorliegenden Erfindung wird ein Enzym, das auf einen 3'-Terminus einer DNA wirkt, die mit einer RNA hybridisiert ist, verwendet. Weiter ist ein Enzym, das eine 3'-5'-Exonukleaseaktivität bei einer hohen Temperatur ausübt, bevorzugt. In dieser Hinsicht ist eine DNA-Polymerase des α-Typs, die von einem hyperthermophilen Archaebakterium stammt, bevorzugt. Die DNA-Polymerase des α-Typs, die von einem hyperthermophilen Archaebakterium stammt, ist z.B. eine DNA-Polymerase aus einem Bakterium des Genus Pyrococcus.
Es kann eine cDNA amplifiziert werden, indem eine Nukleinsäureamplifikationsreaktion durchgeführt wird, bei der die cDNA, die gemäß dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, als Template verwendet wird. Obwohl es nicht beabsichtigt ist, die vorliegende Erfindung zu beschränken, wird beispielsweise eine Polymerasenkettenreaktion (PCR) als Nukleinsäureamplifikationsreaktion verwendet. Das für die PCR verwendete Enzym ist nicht auf ein spezifisches beschränkt. Es kann eine DNA-Polymerase, die üblicherweise für eine PCR verwendet wird, verwendet werden. Die cDNA, die gemäß dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, wird von der Template-RNA mit hoher Genauigkeit synthetisiert. Es ist erwünscht, die PCR mit hoher Genauigkeit durchzuführen, um die Sequenz der RNA so genau wie möglich zu reproduzieren. Daher wird vorzugsweise eine DNA-Polymerase mit hoher Genauigkeit, wie einer DNA-Polymerase des α-Typs von einem thermophilen Archaebakterium, für die erfindungsgemäße cDNA-Amplifikation verwendet. Wenn eine Hitze-resistente DNA-Polymerase mit einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität (z.B. einer DNA-Polymerase des α-Typs von einem thermophilen Archaebakterium) in dem cDNA-Syntheseschritt verwendet wird, kann dasselbe Enzym auch in dem PCR- Schritt verwendet werden. Die Genauigkeit einer cDNA-Synthese-/Amplifikationsreaktion kann gemäß einer Modifikation des Verfahrens von J. Cline et al. (J. Cline et al., Nucleic Acids Research, 24: 3546–3551 (1996)) bestimmt werden.
Das Enzym kann entweder ein von dessen ursprünglichen Quelle aufgereinigtes Enzym oder ein rekombinantes Protein sein, das unter Verwendung von genetischen Manipulationstechniken hergestellt wurde. Das Enzym kann durch eine Modifikation, wie z.B. durch eine Substitution, Deletion, Addition oder Insertion, durch genetische Manipulationstechniken oder andere Mittel verändert sein. Eine DNA-Polymerase mit einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität übt eine Korrekturleseaktivität aus, die bei der Eliminierung einer Base, die fälschlicherweise in einer synthetisierten cDNA eingebaut wurde, wirksam ist, selbst wenn eine RNA als Template eingesetzt wurde. Daher kann sie zur Synthese einer cDNA mit hoher Genauigkeit verwendet werden. Angesichts der cDNA-Syntheseeffizienz beträgt die zu verwendende Menge des Enzyms (ausgedrückt als Polymeraseaktivität) in einem Reaktionsvolumen von 20 μl vorzugsweise 1 U oder weniger, bevorzugter 0,5 U oder weniger. Angesichts der Korrekturleseaktivität beträgt die Menge vorzugsweise 0,01 U oder mehr, bevorzugter 0,02 U oder mehr.
Indem das erfindungsgemäße Verfahren verwendet wird, kann die Menge der synthetisierten cDNA erhöht werden, es kann eine längere cDNA synthetisiert werden und es kann eine cDNA mit einer höheren Genauigkeit wie vergleichsweise mit den konventionellen reverse Transkriptionsverfahren synthetisiert werden. Weiter ist es durch Kombination des erfindungsgemäßen Verfahrens mit verwandten Techniken, wie Klonierungstechniken und PCR-Techniken möglich, eine cDNA-Bibliothek zu herzustellen oder eine RT-PCR effizienter durchzuführen als vergleichsweise mit konventionellen Verfahren, was dadurch eine genauere Analyse einer mRNA ermöglicht, bei der die Analyse durch ein konventionelles Verfahren aufgrund des niedrigen Expressionsspiegels schwierig wäre.
Der Kit zur Synthese der erfindungsgemäßen cDNA ist ein Kit, der in dem oben beschriebenen Verfahren zur Synthese einer cDNA verwendet wird. Es handelt sich um einen Kit zur Synthese einer cDNA mit hoher Genauigkeit und mit hoher Effizienz. Der Kit ist beispielsweise einer, der das Enzym mit einer reversen Transkriptionsaktivität und das Enzym mit einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität, wie oben beschrieben, enthält. Der Kit kann einen Reaktionspuffer enthalten, der für die cDNA-Synthesereaktion verwendet wird, indem das oben beschriebene Enzym, Nukleotide und andere Reagenzien verwendet werden. Die cDNA kann effizient mit hoher Genauigkeit und auf einfache Weise durch Verwendung eines solchen Kits synthetisiert werden.
Der Kit zur Amplifikation einer erfindungsgemäßen cDNA ist ein Kit, der in dem oben beschriebenen Verfahren zur Amplifikation einer cDNA verwendet wird. Es handelt sich um einen Kit zur Amplifikation einer cDNA mit hoher Genauigkeit und mit hoher Effizienz. Der Kit ist beispielsweise einer, der das Enzym mit einer reversen Transkriptionsaktivität und das Enzym mit einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität, wie oben beschrieben, sowie ein Reagenz zur Durchführung einer Gen-Amplifikationsreaktion enthält. Wenn eine PCR als eine Gen-Amplifikationsreaktion verwendet wird, in der eine cDNA als Template verwendet wurde, umfassen Reagenzien, die für die Amplifikationsreaktion verwendet werden, eine Hitze-resistente DNA-Polymerase, einen Reaktionspuffer, Nukleotide und andere Reagenzien. cDNA kann mit hoher Genauigkeit und auf leichte Weise unter Verwendung eines solchen Kits effizient amplifiziert werden. Wenn eine Hitze-resistente DNA-Polymerase mit einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität (z.B. eine DNA-Polymerase des α-Typs von einem thermophilen Archaebakterium) in dem cDNA-Syntheseschritt verwendet wird, kann das Enzym auch in dem PCR-Schritt als eine DNA-Polymerase für die oben beschriebene Amplifikationsreaktion verwendet werden.
Beispiele
Die folgenden Beispiele veranschaulichen weiter die vorliegende Erfindung im Detail, sollen jedoch nicht deren Umfang beschränken.
In den Beispielen unten sind die Aktivitäten der jeweiligen Enzyme entsprechend den Angaben in den den Enzymen beiliegenden Anweisungen ausgedrückt.
Beispiel 1: Präparation von RNA
Soweit nicht anders angegeben, wurde die in den Beispielen unten verwendete RNA von humanen kultivierten U-937-Zellen (ATCC CRL-1593) unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (Life Technologies) gemäß den dem Reagenz beiliegenden Anweisungen präpariert. Die Konzentration wurde dann auf 0,66 μg/μl angepasst. Die Reinheit der RNA betrug OD₂₆₀/OD₂₈₀ = 1,7.
Beispiel 2: Wirkung einer Kombination von BcaBEST-DNA-Polymerase und Pyrobest-DNA-Polymerase
Die Wirkung des Zusatzes eines Enzyms mit einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität während der cDNA-Synthese wurde untersucht, indem eine von Bacillus caldotenax stammende DNA-Polymerase als reverse Transkriptase, bei der deren 5'-3'-Exonukleaseaktivität fehlt (BcaBEST-DNA-Polymerase, Takara Shuzo), und eine von Pyrococcus sp. stammende DNA-Polymerase (Pyrobest-DNA-Polymerase, Takara Shuzo) als 3'-5'-Exonuklease verwendet wurde.
Die cDNA-Synthesereaktionen wurden unter Verwendung eines BcaBEST-RNA-PCR-Kits durchgeführt (Ver. 1.1) (Takara Shuzo). Die Reaktionsgemische, die jeweils das Enzym(e) wie unten beschrieben und einen Oligo-dT-Primer in einem Volumen von 20 μl enthielten, wurden gemäß dem dem Kit beiliegenden Handbuch präpariert. Die Reaktionsgemische wurden in einem PCR-Thermocycler PERSONAL (Takara Shuzo) für die reversen Transkriptionsreaktionen bei 60°C für 1, 2, 3 oder 4 Minuten gegeben. Nach der Reaktion für die vorbestimmte Zeit wurden sie auf 98°C für 5 Minuten erhitzt.
Enzym 1: BcaBEST-DNA-Polymerase 22 U/Reaktionssystem
Enzym 2: BcaBEST-DNA-Polymerase 42 U/Reaktionssystem
Enzym 3: BcaBEST-DNA-Polymerase 22 U + Pyrobest-DNA-Polymerase 0,017 U/Reaktionssystem
Enzym 4: BcaBEST-DNA-Polymerase 42 U + Pyrobest-DNA-Polymerase 0,033 U/Reaktionssystem
PCRs zur Amplifikation einer Region von 4,4 kb innerhalb der mRNA für den Transferrin-Rezeptor wurden unter Verwendung von Pyrobest-DNA-Polymerase und jeweils 20 μl der reversen Transkriptionsreaktionsgemische durchgeführt. Die PCRs wurden gemäß dem der Pyrobest-DNA-Polymerase beiliegenden Handbuch wie folgt durchgeführt. Reaktionsgemische, die jeweils 20 μl von einem der oben genannten ersten Transkriptionsreaktionsgemische, Primer 1 zur Amplifikation des Transferrin-Rezeptors (SEQ ID NO: 1) und Primer 2 zur Amplifikation des Transferrin-Rezeptors (SEQ ID NO: 2) enthielten, wurden in einem Volumen von 100 μl hergestellt. Die Reaktionsgemische wurden in einem PCR-Thermocycler PERSONAL gegeben und PCRs unterzogen (30 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 65°C für 30 Sekunden und 72°C für 5 Minuten).
Nach den PCRs wurden jeweils 8 μl der entstehenden Reaktionsgemische einer Elektrophorese auf einem 1%-Agarose-Gel unter Verwendung von Agarose L03 (Takara Shuzo) unterzogen. Die Mengen der PCR-Produkte wurden unter Verwendung eines Fluoreszenz-Image-Analysegerätes FMBIO II Multi-View (Takara Shuzo) ausgewertet, um die Intensität der Fluoreszenz, die von dem Agarose-Gel nach der Elektrophorese ausgesendet wird, numerisch auszudrücken und die Ethidiumbromid-Färbung wurde gemessen. Die Ergebnisse von allen umgewandelten Proben definieren die Fluoreszenzintensität von dem RT-PCR-Amplifikationsprodukt, die für die Kombination des Enzyms 1 gemessen wurde, sowie die reverse Transkriptionsreaktionszeit von 3 Minuten als 1,00 und sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

n.d.:: nicht detektierbar.

Wenn 22 U oder 42 U BcaBEST-DNA-Polymerase verwendet wurde, wurde die Effizienz der cDNA-Synthese durch den Zusatz von Pyrobest-DNA-Polymerase erhöht, die eine 3'-5'-Exonukleaseaktivität besitzt (Tabelle 1, Enzym 3 oder 4). Der Anstieg bei der Effizienz war insbesondere bemerkenswert, wenn 42 U BcaBEST-DNA-Polymerase verwendet wurden (Tabelle 1, Enzym 4).
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Effizienz der cDNA-Synthese durch den Zusatz eines Enzyms mit einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität während einer reversen Transkriptionsreaktion erhöht ist und dass die Verwendung einer großen Menge eines Enzyms mit einer reversen Transkriptionsaktivität die Effizienz weiter erhöht.
Als ein Kontrollexperiment wurde cDNA unter Verwendung von Titan RT-PCR-Kit von Boehringer synthetisiert. Dieser Kit enthält AMV-RTase als ein Enzym mit einer reversen Transkriptionsaktivität und Pwo-DNA-Polymerase von Pyrococcus woesii als ein Enzym mit einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität.
Es wurde eine cDNA-Synthesereaktion bei 50°C für 30 Minuten gemäß dem dem Kit beiliegenden Handbuch durchgeführt. Nach einem Erhitzen bei 94°C für 2 Minuten gemäß dem Handbuch wurde eine PCR zur Amplifikation einer Region von 4,4 kb innerhalb der mRNA für den Transferrin-Rezeptor unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase/Pwo-DNA-Polymerase gemäß dem dem Kit beiliegenden Handbuch wie folgt durchgeführt: 10 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 68°C für 4 Minuten; 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 68°C für 4 Minuten und 5 Sekunden (der 11. Zyklus); 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 68°C für 4 Minuten und 10 Sekunden (der 12. Zyklus); 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 68°C für 4 Minuten und 15 Sekunden (der 13. Zyklus); bis zum 25. Zyklus während die Dauer des Verlängerungsschrittes um 5 Sekunden pro Zyklus verlängert wurde.
Das RT-PCR-Produkt wurde einer Elektrophorese auf einem 1%-Agarose-Gel unterzogen. Das 4,4 kb-Amplifikationsprodukt von Interesse wurde nicht nachgewiesen, obwohl die reverse Transkriptionsreaktion für 30 Minuten durchgeführt wurde.
Beispiel 3: Wirkung einer Kombination von BcaBEST-DNA-Polymerase und Deep Vent-DNA-Polymerase
Es wurde die Wirkung bei Verwendung von Deep Vent-DNA-Polymerase aus Pyrococcus sp. GB-D (New England Biolabs) als ein Enzym mit einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität untersucht.
Die Experimente wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, unter Verwendung des folgenden Enzyms(e) durchgeführt.
Enzym 1: BcaBEST-DNA-Polymerase 42 U/Reaktionssystem
Enzym 2: BcaBEST-DNA-Polymerase 42 U + Deep Vent-DNA-Polymerase 0,033 U/Reaktionssystem
Enzym 3: BcaBEST-DNA-Polymerase 42 U + Deep Vent-DNA-Polymerase 0,067 U/Reaktionssystem
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt (Definition des Ergebnisses, das für die Kombination des Enzyms 1 und der Dauer der reversen Transkriptionsreaktion für 2 Minuten als 1,00 erhalten wurde). Tabelle 2

n.d.: nicht detektierbar.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Wirksamkeit einer cDNA-Synthese bei Verwendung von Deep Vent-DNA-Polymerase als ein Enzym mit einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität anstelle von Pyrobest-DNA-Polymerase erhöht ist.
Beispiel 4: Wirkung einer Kombination von Bst-DNA-Polymerase, Large fragment und Pyrobest-DNA-Polymerase
Es wurde die Wirkung bei Verwendung einer DNA-Polymerase, die von Bacillus stearothermophilus stammt, der dessen 5'-3'-Exonukleaseaktivität fehlt (Bst DNA-Polymerase, Large fragment, New England Biolabs), als ein Enzym mit einer reversen Transkriptionsaktivität untersucht.
Es wurden reverse Transkriptionsreaktionen wie in Beispiel 2 beschrieben unter Verwendung des/der folgenden Enzyms(e) durchgeführt, außer dass die reverse Transkriptionsreaktion für 10 Minuten durchgeführt wurde.
Enzym 1: Bst-DNA-Polymerase, Large fragment 8 U/Reaktionssystem
Enzym 2: Bst-DNA-Polymerase, Large fragment 8 U + Pyrobest-DNA-Polymerase 0,01 U/Reaktionssystem
Enzym 3: Bst-DNA-Polymerase, Large fragment 8 U + Pyrobest-DNA-Polymerase 0,005 U/Reaktionssystem
Enzym 4: Bst-DNA-Polymerase, Large fragment 8 U + Pyrobest-DNA-Polymerase 0,0033 U/Reaktionssystem
PCRs zur Amplifikation einer Region von 2,4 kb innerhalb der mRNA für den Transferrin-Rezeptor wurden durchgeführt. Die PCRs wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt, außer dass Primer 2 zur Amplifikation des Transferrin-Rezeptors (SEQ ID NO: 2) und Primer 3 zur Amplifikation des Transferrin-Rezeptors (SEQ ID NO: 3) als Primer unter den folgenden Reaktionsbedingungen verwendet wurden: 30 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 65°C für 30 Sekunden und 72°C für 3 Minuten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt (das Ergebnis, das für das Enzym 1 erhalten wurde, wird als 1,00 definiert).
Tabelle 3
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Effizienz der cDNA-Synthese durch den Zusatz eines Enzyms mit einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität erhöht ist, wenn Bst-DNA-Polymerase, Large fragment für eine reverse Transkriptionsreaktion als ein Enzym mit einer reversen Transkriptionsaktivität anstelle von BcaBEST-DNA-Polymerase verwendet wird.
Beispiel 5: Wirkung von 3'-5'-Exonukleaseaktivität auf die Genauigkeit während der cDNA-Synthese
Die Wirkung einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität auf die Genauigkeit während der cDNA-Synthese wurde unter Verwendung von BcaBEST-DNA-Polymerase als ein Enzym mit einer reversen Transkriptionsaktivität und Pyrobest-DNA-Polymerase als ein Enzym mit einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität gemäß einer Modifikation des Verfahrens nach J. Cline et al. (J. Cline et al., Nucleic Acids Research, 24: 3546–3551 (1996)) untersucht.
lacIOZα-RNA, die unter Verwendung von SP6-RNA-Polymerase (Takara Shuzo) wie folgt synthetisiert wurde, wurde als Template-RNA zur cDNA-Synthese verwendet.
lacIOZα ist ein Teil des E. coli-Lactoseoperons und enthält die Repressorregion (I), die Operatorregion (O) und die lacZα-Faktorregion (Z).
Ein amplifiziertes Fragment der lacIOZα-Region wurde durch PCR erhalten, indem genomische E. coli-DNA als Template sowie lacIOZα-F-Primer (SEQ ID NO: 4) und lacIOZα-R-Primer (SEQ ID NO: 5) verwendet wurden. Das entstehende amplifizierte Fragment (ungefähr 1,9 kb) wurde in pSCREEN-T^TM-Vektor (Novagene), einem Plas mid mit einem SP6-Promotor, durch TA-Klonierung kloniert, um ein Plasmid zu erhalten, bei dem die lacIOZα-Region stromabwärts des SP6-Promotors verbunden war. Es wurde eine RNA von der SP6-Promotorregion unter Verwendung einer linearen DNA synthetisiert, die erhalten wurde, indem das Plasmid mit einem Restriktionsenzym XhoI (Takara Shuzo) als Template mit einem kompetitiven RNA-Transkriptionskit (Takara Shuzo) und einer SP6-RNA-Polymerase wie folgt verdaut wurde.
Das Reaktionsgemisch, das 200 ng der linearen lacIOZα-pSCREEN-T-DNA in einem Volumen von 50 μl enthält, wurde gemäß dem dem kompetitiven RNA-Transkriptionskit beiliegenden Handbuch präpariert. Das Reaktionsgemisch wurde bei 37°C für 2 Stunden inkubiert, um eine RNA zu synthetisieren. Nach der Reaktion wurden 10 U DNaseI (Takara Shuzo) dazu zugegeben. Das Gemisch wurde bei 37°C für eine Stunde stehen gelassen, um die DNA abzubauen. Das Gemisch wurde dann einer Phenol/Chloroformbehandlung, gefolgt von einer Ethanolpräzipitation, unterzogen, um die synthetisierte RNA aufzureinigen. Die so erhaltene lacIOZα-RNA mit 1991 Basen, welche den SP6-Promotor, die Repressorregion (I), die Operatorregion (O) und die lacZα-Region (Z) enthält, wurde als Template verwendet, um die folgenden Experimente durchzuführen.
Reaktionsgemische, die jeweils 450 ng der lacIOZα-RNA, 20 pmol des lacIOZα-R-Primers und die unten beschriebenen Enzym(e) in einem Volumen von 20 μl enthielten, wurden gemäß dem dem BcaBEST-RNA-PCR-Kit beiliegenden Handbuch präpariert. Die Reaktionsgemische wurden in einen PCR-Thermocycler PERSONAL (Takara Shuzo) gegeben und bei 65°C für eine Minute und dann bei 30°C für eine Minute inkubiert. Die Temperatur wurde in 15 Minuten von 30°C auf 65°C erhöht. Die Gemische wurden dann bei 65°C für 15 Minuten für reverse Transkriptionsreaktionen inkubiert und schließlich auf 98°C für 5 Minuten erhitzt.
Enzym 1: BcaBEST-DNA-Polymerase 42 U/Reaktionssystem
Enzym 2: BcaBEST-DNA-Polymerase 42 U + Pyrobest-DNA-Polymerase 0,033 U/Reaktionssystem
PCRs zur Amplifikation einer 1,9-kb-Region von lacIOZα wurden unter Verwendung von Pyrobest-DNA-Polymerase und jeweils 2,5 μl der reversen Transkriptionsreaktionsgemische durchgeführt. Die PCRs wurden entsprechend dem der Pyrobest-DNA-Polymerase beiliegenden Handbuch wie folgt durchgeführt. Die Reaktionsge mische, die jeweils 2,5 μl von einem der oben genannten reversen Transkriptionsreaktionsgemische, lacIOZα-F-Primer und lacIOZα-R-Primer in einem Volumen von 100 μl enthielten, wurden präpariert. Die Reaktionsgemische wurden in einen PCR-Thermocycler PERSONAL gegeben und PCRs unterzogen (28 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 68°C für 2 Minuten).
Nach den PCRs werden die entstehenden Reaktionsgemische einer Phenol/Chloroformbehandlung unterzogen, gefolgt von einer Ethanolpräzipitation, um die Amplifikationsprodukte aufzureinigen. Nachdem die Amplifikationsprodukte mit einem Restriktionsenzym EcoRI (Takara Shuzo) behandelt wurden, wurden die ganzen Gemische einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterzogen. Die Banden der EcoRI-behandelten Fragmente wurden nach der Elektrophorese ausgeschnitten und die EcoRIbehandelten Fragmente wurden unter Verwendung von EasyTrap (Takara Shuzo) isoliert. Jedes der so erhaltenen EcoRI-behandelten Fragmente wurde mit λgt10-EcoRI-Arms (Takara Shuzo) ligiert, indem der Ligationskit ver.2 (Takara Shuzo) verwendet wurde. Jedes der Ligationsgemische wurde dann einem in vitro-Packaging unter Verwendung von Gigapack III Gold Packaging Extrakt (Stratagene) unterzogen.
100 μl von jeder der seriellen Verdünnungen der so erhaltenen Packaging-Gemische wurden zu 100 μl einer Kultur von E. coli DH5α (lacZΔM15) (OD600 = 1) zugegeben. Die Gemische wurden bei 37°C für 15 Minuten stehen gelassen. Die ganzen Gemische wurden zu 0,7% LB Soft-Agar zugegeben, der X-gal (1 mg/ml) und IPTG (1,5 mM) (IPTG (+)) enthielt oder 0,7% LB-Soft-Agar, der X-gal aber nicht IPTG (IPTG (–)) enthielt, zugegeben, gemischt und auf LB-Platten überschichtet. Die Platten wurden bei 37°C über Nacht inkubiert. Die Anzahl der gebildeten Plaques wurden gezählt.
Wenn keine Mutation in lacI innerhalb der lacIOZ-Region vorhanden ist, wird β-Galactosidase nicht in Abwesenheit von IPTG aufgrund der Wirkung des Repressors, der durch lacI kodiert wird, exprimiert, was zur Bildung von weißen Plaques führt. β-Galactosidase wird in der Anwesenheit von IPTG exprimiert, was zur Bildung von blauen Plaques führt. Andererseits wird β-Galactosidase selbst in der Abwesenheit von IPTG aufgrund der Inaktivierung des Repressors, der durch lacI kodiert wird, exprimiert, wenn eine Mutation in lacI innerhalb der lacIOZ-Region eingeführt wird. Als Ergebnis werden blaue Plaques auf den IPTG (+)- und IPTG (–)-Platten gebildet.
Demgemäß entsprechen blaue Plaques, die auf einer IPTG (–)-Platte gebildet wurden, mutierten Klonen. Die Mutationshäufigkeit (mf) kann durch Dividieren der Anzahl der blauen Plaques, die auf einer IPTG (–)-Platte gebildet wurden, durch die Anzahl von blauen Plaques, die auf einer IPTG (+)-Platte gebildet wurden, bestimmt werden, wie dies anhand der folgenden Gleichung dargestellt ist.

mf:: Mutationshäufigkeit

Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4
Wenn die reverse Transkriptionsreaktion in der Gegenwart von BcaBEST-DNA-Polymerase alleine durchgeführt wurde, betrug die Mutationshäufigkeit (mf) 0,229. Andererseits, wenn die reverse Transkriptionsreaktion in der Gegenwart von BcaBEST-DNA-Polymerase und Pyrobest-DNA-Polymerase durchgeführt wurde, betrug die Mutationshäufigkeit (mf) 0,133, was darauf hinweist, dass die Genauigkeit um das ungefähr 2-fache höher war als in der Abwesenheit von Pyrobest-DNA-Polymerase.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Gegenwart eines Enzyms mit einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität während einer reversen Transkriptionsreaktion nicht nur die Effizienz der cDNA-Synthese erhöht, sondern auch die Genauigkeit.
Industrielle Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, das verwendet werden kann, um eine cDNA mit hoher Effizienz der Reaktion und hoher Genauigkeit zu synthetisieren. Durch Kombination des Verfahrens mit verwandten Techniken, wie Klonierungstechniken und PCR-Techniken, ist es möglich, eine cDNA-Bibliothek herzustellen oder eine RT-PCR effizienter und genauer durchzuführen als vergleichsweise mit konventionellen Verfahren, was zu einer Verbesserung bei den mRNA-Analyseverfahren führt.
Freier Text des Sequenzprotokolls:
SEQ ID NO: 1: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als Primer 1 zur Amplifikation von Transferrin-Rezeptor-mRNA.
SEQ ID NO: 2: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als Primer 2 zur Amplifikation von Transferrin-Rezeptor-mRNA.
SEQ ID NO: 3: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als Primer 3 zur Amplifikation von Transferrin-Rezeptor-mRNA.
SEQ ID NO: 4: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als lacIOZα-F zur Amplifikation der lacIOZα-Region von E. coli.
SEQ ID NO: 5: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als lacIOZα-R zur Amplifikation der lacIOZα-Region von E. coli.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Synthese einer cDNA, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die Durchführung einer reversen Transkriptionsreaktion mit dem Gemisch eines Enzyms mit reverser Transkriptionsaktivität von einem thermophilen Bakterium des Genus Bacillus und eines anderen Enzyms mit 3'-5' Exonukleaseaktivität umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Enzym mit reverser Transkriptionsaktivität eine DNA-Polymerase aus Bacillus Caldotenax oder eine DNA-Polymerase aus Bacillus Stearothermophilus ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Enzym mit 3'-5' Exonukleaseaktivität eine DNA-Polymerase ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Enzym mit 3'-5' Exonukleaseaktivität eine α-Typ DNA-Polymerase aus einem thermophilen Archaebakterium ist.
Ein Verfahren zur Amplifikation einer cDNA, gekennzeichnet dadurch, dass das Verfahren die Durchführung einer Gen-Amplifikationsreaktion mit einer cDNA als Matrize umfasst, wobei die cDNA gemäß dem durch Ansprüche 1 bis 4 definierten Verfahren synthetisiert wurde.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Gen-Amplifikationsreaktion eine PCR ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei eine DNA-Polymerase für die PCR das gleiche Enzym wie das Enzym mit 3'-5' Exonukleaseaktivität ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die DNA-Polymerase für die PCR eine α-Typ DNA-Polymerase aus einem Archaebakterium ist.
Ein Kit für die cDNA-Synthese, enthaltend ein Gemisch aus einem Enzym mit reverser Transkriptionsaktivität von einem thermophilen Bakterium des Genus Bacillus und einem anderen Enzym mit 3'-5' Exonukleaseaktivität.
Kit gemäß Anspruch 9, wobei das Enzym mit reverser Transkriptionsaktivität eine DNA-Polymerase aus Bacillus Caldotenax oder eine DNA-Polymerase aus Bacillus Stearothermophilus ist.
Kit gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei das Enzym mit 3'-5' Exonukleaseaktivität eine DNA-Polymerase ist.
Kit gemäß Anspruch 11, wobei das Enzym mit 3'-5' Exonukleaseaktivität eine α-Typ DNA-Polymerase aus einem Archaebakterium ist.
Kit zur Amplifikation einer cDNA mittels Durchführung einer Gen-Amplifikationsreaktion unter Verwendung einer cDNA als Matrize, die gemäß dem Verfahren synthetisiert wurde, das durch Ansprüche 1 bis 4 definiert ist, wobei der Kit ein Gemisch aus einem Enzym mit reverser Transkriptionsaktivität von einem thermophilen Bakterium des Genus Bacillus und einem anderen Enzym mit 3'-5' Exonukleaseaktivität als auch eine gegen Hitze resistente DNA-Polymerase für die Gen-Amplifikationsreaktion enthält.
Kit gemäß Anspruch 13, wobei die Gen-Amplifikationsreaktion eine PCR ist.
Kit gemäß Anspruch 14, wobei der Kit für die PCR als Reagenz für die Gen-Amplifikationsreaktion eine DNA-Polymerase enthält.
Kit gemäß Anspruch 15, wobei die PCR mit einer DNA-Polymerase mit 3'-5' Exonukleaseaktivität durchgeführt wird, und wobei das Enzym mit 3'-5' Exonukleaseaktivität das gleiche Enzym wie die DNA-Polymerase für die PCR ist.
Kit gemäß Anspruch 16, wobei die DNA-Polymerase mit 3'-5' Exonukleaseaktivität eine α-Typ DNA-Polymerase eines Archaebakteriums ist.