DE69801749T2 - Eine methode zum klonieren von mrna und darstellung von differentiell exprimierten transcripten (dodet) - Google Patents

Description

Hintergrund der Erfindung
• Der menschliche Körper besteht hauptsächlich aus spezialisierten Zellen, die verschiedene physiologische Funktionen erfüllen und in Organen und Geweben organisiert sind. Alle menschliche Zellen enthalten DNA, welche in einer Reihe von Untereinheiten, die als Gene bekannt sind, angeordnet ist. Es wird geschätzt, daß es etwa 100.000 Gene im menschlichen Genom gibt. Gene sind die Pläne für Proteine. Proteine können eine große Vielzahl von biologischen Funktionen erfüllen, zum Beispiel als Botenstoffe, Katalysatoren und Sensoren. Solche Verbindungen sind für die Steuerung der meisten physiologischen und biochemischen Funktionen beim Menschen und allen anderen lebenden Organismen verantwortlich. In den letzten Jahrzehnten wurde zunehmend erkannt, daß viele wichtige Krankheiten eine genetische Grundlage haben. Es ist nun hinreichend bewiesen, daß Gene eine wichtige Rolle bei Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, psychiatrischen Störungen, Fettleibigkeit und Stoffwechselerkrankungen spielen. Basierend auf der Annahme, daß die Nucleotidsequenzen eines bestimmten Gens und dessen vorausgesagtes Proteinprodukt zum Verständnis seiner Funktion in gesunden und funktionsgestörten Zellen oder Geweben führt, werden erhebliche Mittel auf die Genomforschung konzentriert. Es wird erwartet, daß dieses Verständnis wiederum zu therapeutischen und diagnostischen Ansätzen führt, die sich auf molekulare Ziele konzentrieren, die mit dem Gen und dem Protein, das es exprimiert, in Zusammenhang stehen. Der erste Schritt auf dem Weg zur Entwicklung solcher Anwendungen ist, die Gene zu identifizieren, die spezifisch mit den verschiedenen Arten von Erkrankungen verbunden sind. Die Anwendung dieses Wissens kann neue und wertvolle Marker hervorbringen, die Regionen identifizieren, welche wichtige Krankheiten hervorrufen, und diagnostische und therapeutische Vorteile bereitstellen können.
• Angesichts der hohen Komplexität des menschlichen Genoms werden viele Ansätze verwendet, um den Zusammenhang zwischen der primären Genstruktur und der Funktion aufzuklären. Ein öffentlich hinreichend bekannt gemachter Ansatz wird vom Human Genome Mapping Project umfaßt, bei dem die Sequenz aller einzelnen Gene im gesamten menschlichen Genom mühsam bestimmt wird. Gegenwärtig jedoch können nur wenige Informationen direkt über die Funktion der identifizierten Gene und noch weniger über die zeitlichen und räumlichen Expressionsmuster des sich entwickelnden oder ausgewachsenen Organismus gewonnen werden. Andere Ansätze, wie die ungerichtete cDNA-Sequenzierung, schließen die Sequenzbestimmung aller Gene eines Organismus ein, die in einem bestimmten Gewebe oder Entwicklungsstadium exprimiert werden. Wie eine Reihe anderer Strategien ist dies zeitaufwendig und für zahlreiche Probleme anfällig.
• Obwohl die Flut von Daten von großmaßstäblich angelegten Sequenzierungsprogrammen für die wissenschaftliche Gemeinschaft von außerordentlichem Vorteil ist, ist eines der Hauptprobleme, denen man durch solche "Schrotschuß"-Ansätze gegenübersteht, das Fehlen von spezifischen Informationen, die ohne erhebliche Mehrarbeit über die Biologie eines jeden der einzelnen Gene gewonnen werden können.
• Mehrere andere Ansätze wurden von Molekularbiologen verwendet, um spezifischere Informationen über den genetischen Hintergrund bestimmter biologischer Prozesse zu erhalten. Solche Ansätze stützen sich auf ein gemeinsames Konzept. Ein Gen oder eine Untergruppe von Genen wird angeschaltet, wodurch der gesunde, pathologische oder Entwicklungsstatus eines Organs oder eines Zelltyps eingeleitet wird.
• In einer großen Zahl von Versuchssystemen wurde die Isolierung von Genen auf der Grundlage ihrer unterschiedlichen Expression erfolgreich angewendet. Die differenzielle Durchmusterung und substraktive Hybridisierung von cDNA-Banken wurde hinreichend etabliert, vgl. Zimmerman et al. (1980) und Davies et al. (1979). Die differenzielle Durchmusterung von Banken ist in der Praxis für Gene, die in hohem Grade exprimiert werden, gut geeignet, aber mRNAs, welche in geringer Häufigkeit vorkommen, sind schwer zu isolieren. Die substraktive Hybridisierung stellt eine empfindlichere Durchmusterung bereit, erfordert aber große RNA- Mengen. Vor kurzem wurden RNA-Fingerabdruck-Methoden (oft als differenzielle Display- oder DD/RT-PCR bezeichnet) zu diesen Hilfsmitteln hinzugefügt, wodurch attraktive neue Merkmale für das Isolieren von Genen bereitgestellt werden. RNA-Fingerabdruck-Methoden basieren auf der PCR und erfordern daher keine große RNA-Mengen für Experimente. Außerdem erlauben RNA- Fingerabdruck-Methoden, daß eine große Zahl von RNA-Pools gleichzeitig auf spezifische mRNAs durchmustert werden können. Die Untersuchung eines großen Bereichs von pathogenen Entwicklungsstadien und ihrer Kontrollen wäre möglich. Bis heute haben sich zwei Methoden des RNA-Fingerabdrucks zur Isolierung von Genen als nützlich erwiesen. Im Jahr 1992 veröffentlichten Liang et al. ein Protokoll (US-Patent 5,262,311), bald danach wurde ein Protokoll von Welsh et al. (1992) vorgestellt. Beide Methoden beginnen mit der cDNA-Synthese aus RNA unter Verwendung von mindestens einem Zufallsprimer für die Initiation der Synthese des ersten und des zweiten Strangs.
• Welsh et al. (1992) entwickelten ein Protokoll, bei dem das gleiche 20 Mer-Zufallsoligo für die Synthese des ersten und des zweiten Strangs verwendet wird. Unter Verwendung von Zufallsprimern wird nur eine Untergruppe der mRNAs in cDNA transkribiert. Die cDNA-Pools werden dann für eine Standard-PCR mit den gleichen Primern verwendet. Eines der dNTPs in dem PCR-Gemisch enthält einen radioaktiven Marker (³&sup5;S oder ³²P) zum Sichtbarmachen der PCR- Fragmente mit einer PAGE. Die Methoden von Liang und Welsh stützen sich auf mindestens einen kleinen Zufallsprimer zur Selektion spezifischer cDNAs. Als Folge sind die Temperaturen für die Anlagerung niedrig (-40ºC), und alle amplifizierten cDNA-Fragmente gehen aus einem bestimmten Grad der Fehlpaarung des Primers hervor. Später entwickelten mehrere Gruppen Verfeinerungen und Optimierungen, was zu einer Überflulle von Artikeln führte, welche die Nützlichkeit dieser Methode beschreiben (Bauer und Warthoe et al., 1993; Warthoe et al., 1995; Liang und Warthoe et al., 1995; Rohde und Warthoe et al., 1996).
Ziel der Erfindung
• Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, neue Methoden und Mittel zur Untersuchung der Expressionsmuster in Zellen, insbesondere in eukaryontischen Zellen, bereitzustellen. Die Ergebnisse solcher Untersuchungen können bei der Arzneistoffentwicklung, beim Gennachweis, der Diagnose von - Krankheiten etc. verwendet werden, und daher sind solche verbesserten Methoden besonders wünschenswert.
Zusammenfassung der Erfindung
• Im weitesten Sinne betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer unterteilten Bibliothek von amplifizierten cDNA-Fragmenten der codierenden Region von mRNA, die in einer Probe enthalten ist, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
• (a) Durchführen einer reversen Transkription mit der aus einer Probe gewonnenen mRNA unter Verwendung mindestens eines cDNA-Primers, wobei cDNA-Fragmente des ersten Strangs erhalten werden,
• (b) Synthetisieren der cDNA des zweiten Strangs, die komplementär zu den cDNA-Fragmenten des ersten Strangs ist, unter Verwendung der DNA-Fragmente des ersten Strangs als Matrizen, wobei doppelsträngige cDNA-Fragmente erhalten werden,
• (c) Verdauen der doppelsträngigen cDNA-Fragmente mit mindestens einer Restriktionsendonuclease, wobei gespaltene cDNA-Fragmente erhalten werden,
• (d) Ligieren von mindestens zwei Adapterfragmenten mit den gespaltenen cDNA-Fragmenten, welche in Schritt (c) erhalten wurden, so daß ligierte cDNA-Fragmente erhalten werden, und
• (e) Verwenden der ligierten cDNA-Fragmente, welche in Schritt (d) erhalten wurden, für ein molekulares Amplifikationsverfahren, um amplifizierte cDNA-Fragmente zu erhalten, unter Verwendung für ein Adapterfragment, welches in Schritt (d) verwendet wurde, eines Satzes von Amplifikationsprimern mit der allgemeinen Formel
• 5'-Com-Nn1-3' II
• wobei Com die komplementäre Sequenz zu mindestens dem 5'-Ende des einen Adapterfragments ist, welches mit dem 3'-Ende der gespaltenen cDNA-Fragmente ligiert ist, N entweder A, G, T oder C entspricht und n1 eine ganze Zahl ≥ 0 ist, und wobei mindestens ein Satz von Primern die allgemeinen Formel II aufweist, worin n1 > 0 ist, wobei mindestens ein Satz in der Lage ist, die Amplifikation jeder Nucleotidsequenz, die mit ihrem 3'-Ende an das Adapterfragment ligiert ist, das in seinem 5'-Ende komplementär zu Com ist, einzuleiten.
• Der allgemeine Vorteil der Erfindung im Vergleich zum Stand der Technik ist, daß die so erhaltene Bibliothek von cDNA-Fragmenten Nucleinsäuresequenzen von allen Teilen der cDNA, welche in Schritt (a) hergestellt wird, enthält. Verfahren gemäß dem Stand der Technik, welche sich u. a. auf Poly-dT-cDNA-Primer stützen, weisen die Tendenz auf, daß nur Fragmente erhalten werden, die von den langen nichttranslatierten Regionen der mRNA stammen. Außerdem führt das erfindungsgemäße Verfahren durch die Feinabstimmung der Bedingungen in jedem Schritt zu einer sehr spezifischen Reproduktion der Sequenzinformation, welche in der mRNA vorliegt, auch in mRNA, die nur in verhältnismäßig geringen Mengen vorhanden ist. Außerdem ist es durch die Wahl der optimalen Zusammensetzung der Endonuclease(n) möglich, cDNA-Fragmente zu erhalten, die von einem sehr hohen Prozentsatz der Gesamtzahl der transkribierten Gene in relevanten Zellen gewonnen werden.
• Das vorliegende Verfahren erlaubt das zielgerichtete Sichtbarmachen bekannter Gene unter Verwendung von Primerkombinationen, die Sequenzen des Gens von Interesse entsprechen. Dies ist insofern vorteilhaft, als alle Schritte des Verfahrens und das biologische System in einfacher Weise überprüft werden können. Auch können sehr spezifische Expressionsanalysen mit verwandten Genen, welche eine sehr große Homologie aufweisen, durchgeführt werden, die unter Anwendung der Hybridisierungstechnik nicht durchgeführt werden konnten.
• Kurz zusammengefaßt, schließen weitere Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens die Isolierung von Banden von Interesse aus einem Gel, deren Clonierung und Sequenzierung ein. Die Sequenzinformation erlaubt die Reamplifikation einzelner Banden unter Verwendung von Primern mit den geeigneten Verlängerungen von 3-4 Nucleotiden. Beim Auftrennen auf einem Gel zeigen diese Reaktionen eine Bande oder nur wenige Banden pro Bahn, wobei eine eindeutige Bestimmung der Identität der Bande erhalten wird.
• Da die vorliegende Technik endmarkierte Primer zum Sichtbarmachen verwendet, kann die Technik sowohl bei Standardverfahren, welche Radioaktivität einschließen, als auch mit fluoreszenzmarkierten Primern angewendet werden, ohne daß eine weitere Optimierung erforderlich ist.
• Die Erfindung betrifft auch Verfahren zum Nachweis von Unterschieden zwischen der (den) Expressionsrate(n) in Zellen, welche unter verschiedenen Bedingungen gehalten wurden, und Verfahren zur Diagnose von Krankheiten.
• Nachstehend wird eine kurze Erläuterung der in der vorliegenden Anmeldung verwendeten Begriffe angegeben:
• "Eine unterteilte Bibliothek von amplifizierten cDNA-Fragmenten" bezieht sich im vorliegenden Zusammenhang auf eine Bibliothek von amplifizierten cDNA-Fragmenten, die in eine Reihe von verschiedenen Pools aufgeteilt werden, wobei jeder Pool durch die Sequenzen an den Enden der amplifizierten Fragmente definiert ist. Zum Beispiel kann ein Pool amplifizierte Fragmente enthalten, die alle dadurch gekennzeichnet sind, daß sie die Sequenz 5'-Com-AGC in einem der Stränge enthalten, während ein anderer Pool amplifizierte Fragmente enthält, welche die Sequenz 5'-Com-AAT in einem der Stränge enthalten. Für eine Erläuterung der Bedeutung von "Com" vgl. nachstehend.
• "Eine normalisierte Bibliothek" ist eine Bibliothek, in welcher im wesentlichen jede mRNA gleich vertreten ist, d. h. etwa die gleiche Kopienzahl jeder mRNA ist vorhanden.
• "Reverse Transkription" hat die auf dem Fachgebiet übliche Bedeutung, d. h. die Synthese von DNA unter Verwendung von RNA als Matrize, ausgeführt durch ein Enzym mit einer reversen Transkriptaseaktivität.
• "Adapterfragment" soll sich auf eine Nucleinsäuresequenz beziehen, welche eine bekannte Sequenz enthält, die als Matrize für einen Primer in einem folgenden molekularen Amplifikationsverfahren, wie eine PCR, verwendet werden kann. Das Adapterfragment ist ferner dadurch gekennzeichnet, daß es am Ende eines cDNA-Fragments, das vorher mit einer Restriktionsendonuclease in Schritt (c) gespalten wurde, eingeführt werden kann. In den meisten Fällen erzeugt die Restriktionsendonuclease Fragmente mit "klebrigen Enden", an die sich das Adapterfragment leicht lagern kann, und danach wird das Adapterfragment mit der cDNA durch die Wirkung einer DNA-Ligase ligiert.
Ausführliche Offenbarung der Erfindung
• Nachstehend wird die Auswirkung eines jeden der Schritte ausführlich besprochen, vgl. Fig. 1 und 7.
Schritt a)
• Das Ziel in Schritt (a) ist, ein Gemisch aus cDNA-Fragmenten des ersten Strangs herzustellen, das hinsichtlich seiner Zusammensetzung optimiert ist, um die folgenden Schritte auszuführen. Dafür gelten eine Reihe von Überlegungen:
• Zuallererst, um das "Hintergrundrauschen" zu vermindern, wird bevorzugt, daß die Anlagerung des cDNA-Primers an die RNA in Schritt (a) unter Bedingungen hoher Stringenz durchgeführt wird, wobei gewährleistet wird, daß ein Minimum an Fehlpaarungen in die cDNA im Verhältnis zu der mRNA eingeführt wird, d. h. bei einer Temperatur oberhalb von 50ºC. Zweitens ist es wünschenswert, Kopien von Sequenzen zu erhalten, die von allen Teilen der mRNA stammen, um Informationen zu erhalten, welche den translatierten Teil der mRNA betreffen. Verfahren gemäß dem Stand der Technik zur reversen Transkription von eukaryontischem Material verwendeten oft Poly-dT als cDNA-Primer. Diese Strategie weist jedoch den Nachteil auf, daß sich das am wirksamsten reverse transkribierte Material in dem nichttranslatierten Teil der Gene von Interesse befindet. Daher stammen die einzigen Teile der mRNA, die z. B. nach einem PCR-Verfahren "sichtbar" werden, sehr oft von nichttranslatierten Regionen der RNA. Der Grund hierfür sind zwei Effekte. Zuallererst hat der Poly-dT-Ansatz zur Folge, daß sich der Startpunkt der reversen Transkription sehr weit von z. B. dem Startcodon befindet, das mit dem fraglichen Operon in Beziehung steht. Zweitens kann die mRNA Strukturen einschließen (z. B. "Haarnadel"-Strukturen aufgrund von Basenpaarungen innerhalb der Kette), welche die reverse Transkription blockieren, und durch die fortgesetzte Initiation der reversen Transkription an einem Ende des Gens blockieren solche Strukturen statistisch die reverse Transkription einer Reihe von translatierten Regionen.
• Erfindungsgemäß wird bevorzugt, sicherzustellen, daß in Schritt (a) cDNAs hergestellt werden, die Vertreter des ganzen Gens, einschließlich der translatierten Regionen sind.
• In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Reaktionsgemisch mit der Probe einen cDNA-Primer, wobei der cDNA-Primer ausreichend komplementär zu der Ziel-RNA ist, die in der Probe vorhanden ist, um damit zu hybridisieren und die Synthese eines einzelsträngigen cDNA- Moleküls zu veranlassen, das komplementär zu der Ziel-RNA ist, und das Reaktionsgemisch umfaßt einen geeigneten Puffer, der alle vier Desoxyribonucleosidtriphosphate und ein divalentes Kation, gewählt aus der Gruppe aus Mg²&spplus; und Mn²&spplus;, in einer Konzentration zwischen 0,1 und 5 mM umfaßt.
• Das Ziel des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, eine Unterteilung der hergestellten cDNA zu erhalten. Wenn die mRNA von einem eukaryontischen System stammt, kann mindestens ein cDNA-Primer einen Oligo- oder Poly-dT-Schwanz in dem 5'-Ende einschließen, wobei der Primer die allgemeine Formel 5'-dTn2-Vn3-Nn4-3' aufweist, worin dT eine Desoxythymidinylgruppe bedeutet, V entweder A, G oder C entspricht, N entweder A, G, C oder T entspricht, n2 eine ganze Zahl ≥ 1 ist, n3 0 oder 1 ist, falls n3 den Wert 0 hat, n4 dann 0 ist, und falls n3 den Wert 1 hat, n4 dann eine ganze Zahl ≥ 0 ist. Es ist erkennbar, daß, wenn n3 und n4 beide Null sind, der Primer dann ein üblicher Poly- oder Oligo-dT-cDNA-Primer ist. Wenn n3 jedoch 1 ist, dann stellt der Primer eigentlich eine Primerzusammensetzung dar, welche in der Lage ist, die reverse Transkription jeder mRNA mit einem Poly-A-Schwanz einzuleiten. Falls die ursprüngliche RNA- Probe unterteilt wird und mit jedem Unterpool eine reverse Transkription durchgeführt wird, welche einen der möglichen Primer mit der vorstehenden Formel, worin n3 den Wert 1 hat, verwendet, dann ist das Ergebnis eine Reihe von einzelsträngigen cDNA-Pools, die sich jeweils in dem 5'-Ende voneinander unterscheiden.
• Zum Beispiel, wenn n3 den Wert 1 hat, werden 3 · 4n4 Gruppen von cDNA-Primern verwendet, wobei jede Gruppe von jeder der anderen Gruppen im Hinblick auf die Struktur -Vn3- Nn4- verschieden ist. In einer solchen Ausführungsform wird der mRNA-Pool geeigneterweise in 3 x 4n4 Aliquots unterteilt, welche jeweils getrennt dem Schritt (a) unter Verwendung von einer der 3 x 4n4 Gruppen von cDNA-Primern unterworfen werden, wobei eine Unterteilung der cDNA des ersten Strangs in 3 · 4n4 verschiedene Pools erhalten wird. Normalerweise weist n4 den Wert 0 oder lauf, was zur Bereitstellung von 3 bzw. 12 Pools führt.
• Wenn das Ausgangsmaterial nicht eukaryontischen Ursprungs ist oder wenn nicht die Absicht besteht, unbedingt von dem Teil des transkribierten Gens auszugehen, der im Verhältnis zu dem Translationsstartcodon am weitesten entfernt ist, schließt mindestens ein cDNA-Primer keinen Poly- oder Oligo-dT-Schwanz in dem 5'-Ende auf oder werden alternativ mindestens zwei cDNA- Primer verwendet, von denen mindestens einer einen Poly- oder Oligo-dT-Schwanz in dem 5'-Ende aufweist und von denen mindestens ein Zweiter keinen Poly- oder Oligo-dT-Schwanz in dem 5'- Ende aufweist. Vorzugsweise weist der cDNA-Primer, der keinen Poly- oder Oligo-dT-Schwanz in dem 5'-Ende einschließt, die folgende Struktur auf
• 5'-NxTTA-3' oder 5'-NxCTA-3' oder 5'-NxTCA-3',
• worin N entweder A, G, T oder C entspricht und x eine ganze Zahl von 1 ≤ · ≤ 20 ist. Es ist erkennbar, daß dies einem cDNA-Priming entspricht, das von irgendeinem Translationsstopcodon ausgeht. Wie bei den vorstehenden Ausführungsformen unter Verwendung eines Primers, der mit einem Poly- oder Oligo-dT-Schwanz versehen ist, ist es durch Herstellen von Primern, die alle möglichen Permutationen aufweisen, die in der Gruppe Nx darstellt sind, möglich, die Primer zusammenzusetzen, so daß sie jeder möglichen Sequenz entsprechen, die einem Stopcodon vorausgeht, wobei das Priming aller Sequenzen mit einem Stopcodon in ihrer Sequenz gewährleistet wird.
Schritt b
• Dieser Schritt wird durch Verfahren ausgeführt, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Es wird jedoch bevorzugt, daß Schritt (b) unter Bedingungen ausgeführt wird, welche die Bildung von Fehlpaarungen zwischen Nucleotiden des ersten und zweiten cDNA-Strangs minimieren. Das Verfahren unter Verwendung doppelsträngiger cDNA kann gemäß Standardverfahren, wie bei Sambrook et al. (1989) beschrieben, durchgeführt werden. Da es jedoch für übliche Polymerasen schwierig sein kann, Regionen zu synthetisieren, die Sekundärstrukturen enthalten oder einen hohen GC-Gehalt aufweisen, können die hitzestabile RNase H (hitzestabile Hybridase-RNase H, US- 5,268,289) und die hitzestabile rBst-DNA-Polymerase aus Bacillus stearothermophilus nützlich sein, um einige der Begrenzungen zu überwinden, die übliche Polymerasen (Tieftemperatur- Polymerasen) aufweisen.
Schritt c
• Nach Herstellung und gegebenenfalls Unterteilung der mRNA, welche in Schritt (b) erhalten wurde, wird jeder der verschiedenen cDNA-Pools mit mindestens einem Restriktionsenzym gespalten, um Fragmente einer Größe herzustellen, die unter Anwendung eines geeigneten Größenfraktionierungsverfahrens aufgetrennt werden können.
• Die Wahl des Restriktionsenzyms basiert größtenteils auf der Häufigkeit der Spaltstellen in einem bestimmten cDNA-Pool. Zu viele Spaltstellen in jedem cDNA-Fragment ergeben zu kleine Fragmente und umgekehrt. Optimalerweise sollte mindestens ein Enzym jede cDNA spalten, wobei Fragmente der gewünschten Größe erhalten werden. Statistisch ist es nicht möglich, jede cDNA zu spalten, aber andererseits kann ein sehr großer Prozentsatz durch die Wahl eines geeigneten Enzyms oder einer Kombination von Enzymen gespalten werden. Es wird bevorzugt, daß das erfindungsgemäße Verfahren mindestens ein Restriktionsenzym verwendet, das so gewählt ist, daß gewährleistet wird, das mindestens 60% der cDNAs gespalten werden, aber höhere Prozentsätze, wie mindestens 65%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80% oder auch mindestens 85%, werden stärker bevorzugt.
• Die Erfindung sollte Restriktionsenzyme verwenden, die überhängende Enden (klebrige Enden) an den Enden der DNA nach dem Verdau in Schritt (c) erzeugen, da dies die Einführung der Adapterfragmente in Schritt (d) sehr erleichtert.
• Aus dem Vorstehenden ist ersichtlich, daß die Häufigkeit, mit der die Restriktionsendonuclease spaltet, wichtig ist. Mindestens ein Restriktionsenzym wird vorzugsweise so gewählt, daß dieses jede cDNA in durchschnittlich etwa drei Fragmente spaltet. Es ist selbstverständlich, daß einige der cDNAs, welche aus den vorhergehenden Schritten erhalten wurden, überhaupt nicht gespalten werden (obwohl dies selten vorkommt, wenn das (die) Restriktionsenzym(e) sorgfältig ausgewählt wird (werden)), während andere mit hoher Häufigkeit gespalten werden. Es stellte sich heraus, daß die Verwendung eines seltenen 4 Basen-Schneiders als mindestens eine Restriktionsendonuclease (wie der 4 Basen-Schneider AciI, AIuI, Bfai, BstUI, Csp6I, DpnI, DpnII, HaeIII, Hhal, HinP1I, HpaII, MboI, MnII, MseI, MspI, NIaIII, RsaI, Sau3AI, TaiI, TaqI und Tsp509I) die optimale Leistungsfähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens gewährleistet. Unter Verwendung eines solchen seltenen 4 Basen-Schneiders ist die Verwendung von nur einem Restriktionsenzym in Schritt (c) ausreichend und führt zu einer hervorragenden Leistung.
• In einer anderen Ausführungsform kann eine Kombination von Restriktionsendonucleasen verwendet werden, wobei ein Gleichgewicht von z. B. 6 Basen-Schneidern und 4 Basen- Schneidern eine vernünftige Verteilung der Fragmentgrößen gewährleistet. Zum Beispiel ergibt die Verwendung eines ersten Restriktionsenzyms (z. B. eines 6 Basen-Schneiders), das statistisch mindestens 20% der vollständigen cDNA, die von der mRNA-Probe gewonnen wurde, in zwei Unterfragmente spaltet, und eines zweiten Restriktionsenzyms (z. B. eines 4 Basen-Schneiders), das statistisch mindestens 50% der Unterfragmente in drei weitere Unterfragmente spaltet, auch eine Reihe von Fragmenten, die für eine spätere Größenfraktionierung geeignet sind.
Schritt d
• Das (die) Gemisch(e), welche(s) in Schritt (c) erhalten wurde(n), wird (werden) dann einer Reaktion unterworfen, bei der Adapterfragmente an beide Enden der erhaltenen doppelsträngigen cDNA-Fragmente angehängt werden. Wie vorstehend erwähnt, wird dieser Teil des Verfahrens durch die gespaltenen cDNA-Fragmente, die überhängende "klebrige" Enden aufweisen, sehr erleichtert, da vorher entworfene Adapterfragmente, die mit diesen überhängenden Enden übereinstimmen, leicht hergestellt werden können.
• Die Adapter (oder Anker)-Fragmente werden dann an die gespaltenen Fragmente angehängt, um in dem folgenden Schritt eine "Ordnung im Chaos" zu erhalten. Durch das Hinzufügen von bekannten Sequenzen zu den Enden der gespaltenen Fragmente kann man Ziele für spezifische Amplifikationsprimer erzeugen, die spezifisch mit dem Ziel konstruiert werden können, Sequenzen zu amplifizieren, die den Adapterfragmenten entsprechen. Das so erhaltene Material (die primäre Matrize) kann unter Verwendung von Primern, die komplementär zu den ligierten Adaptersequenzen sind, präamplifiziert werden, wobei die sekundäre Matrize hergestellt wird. Die Präamplifikation der primären Matrize ermöglicht, daß praktisch unbegrenzte Mengen der Matrize von einer RNA-Präparation hergestellt werden können, wobei die Notwendigkeit wiederholter Isolierungen umgangen wird.
• Die Adaptersequenz wird so ausgewählt, daß sie als Startpunkt für die DNA- Polymerisierung in z. B. einer PCR-Reaktion dient. Die Adaptersequenzen werden in einer solchen Weise konstruiert, daß die spezifischen Endonucleasestellen nach der Ligierung des Adapters nicht wieder hergestellt werden.
• Mindestens ein Terminationsfragment wird auch mit dem 3'-Ende der einzelnen Stränge der gespaltenen cDNA-Fragmente ligiert, wobei dieses mindestens eine Terminationsfragment eine Blockierung der Polymerisierung der DNA in 5'→ 3'-Richtung von diesem mindestens einen Terminationsfragment aus einführt und dieses mindestens eine Terminationsfragment nicht an einen der Primer von mindestens zwei Sätzen von Primern in Schritt (f) während eines molekularen Amplifikationsverfahrens angelagert werden kann.
• Das Vorstehende ist ein sehr wichtiges Verfahren, wenn es mit der Verwendung eines Nachweises kombiniert wird, der durch markierte Primer in dem Amplifikationsschritt bewirkt wird, wobei nur ein Mitglied des Paars von Primern markiert ist, während das andere so konstruiert ist, daß es die amplifizierten Produkte gemäß ihrer Basenzusammensetzung direkt neben dem Adapterfragment aufteilt. Ein wichtiges Merkmal ist, daß ein einzelsträngiges cDNA-Fragment, das mit einem Terminationsfragment versehen wurde, nicht amplifiziert wird, weil sich kein Primer an die Produkte der ersten Polymerisierungsrunde anlagern kann, bei der ein solches Fragment die Matrize war, vgl. Fig. 7. Zweitens eröffnet der Ansatz die Möglichkeit, das "Rauschen" im Hintergrund in einer folgenden Phase des Nachweises zu entfernen.
• Normalerweise umfaßt das mindestens eine Terminationsfragment eine chemisch modifizierte Nucleotidsequenz oder ist eine solche, wie zum Beispiel eine Nucleotidsequenz, die ein Didesoxynucleotid in dem 3'-Ende umfaßt; diese Terminationstechnik ist von z. B. dem Kettenterminations-Sequenzierungsverfahren gemäß Sanger gut bekannt. Unter normalen Umständen sollte das Didesoxynucleotid erfindungsgemäß kovalent an den Nucleotidstrang gebunden sein, so daß der Verlust des Didesoxynucleotids während den folgenden Amplifikationsrunden vermieden wird. Eine hervorragende Stabilisierung wird erhalten, wenn das Didesoxynucleotid phosphoryliert ist.
• Wie vorstehend erwähnt, wird die Ligierung von Adapter- und/oder Terminationsfragmenten an die gespaltenen cDNA-Fragmente in Schritt (d) in einfacher Weise durch die Anlagerung der Adapterfragmente an die klebrigen Enden der cDNA, welche aus der Spaltung in Schritt (c) herrühren, und das Aussetzen des Produkts der Wirkung eines Enzyms mit einer DNA- Ligaseaktivität erzielt. Jede geeignete DNA-Ligase, die auf dem Fachgebiet bekannt ist, kann verwendet werden.
Schritt (e) und (f)
• Schritt (e) des erfindungsgemäßen Verfahrens resultiert in der endgültigen Sortierung der modifizierten cDNA-Fragmente aus Schritt (d).
• Die Primer mit der Struktur der Formel I (Schritt f) werden so konstruiert, daß sie synthetisierte doppelsträngige cDNA-Fragmente, welche in Schritt (b) erhalten wurden, oder vorher festgelegte Untersätze der angepaßten Fragmente, welche in Schritt (d) erhalten wurden, selektiv amplifizieren. Eine Reihe von Verfahren kann dafür in Betracht gezogen werden, aber die Hauptstrategie ist, die Amplifikation in einer Reihe von verschiedenen Reaktionen einzuleiten, wobei die Nucleotidsequenz eines Primers in einer Reaktion gewährleistet, daß sich die amplifizierten Produkte dieser Reaktion von denjenigen unterscheiden, die von einer der anderen Reaktionen erhalten wurden, und daß alle Reaktionen zu einer Amplifikation aller Fragmente, die in Schritt (d) erhalten wurden, führen.
• Selbst wenn der mindestens eine Satz von Amplifikationsprimern der Formel I, worin n1 ≥ 0 ist, verwendet wird, wird bevorzugt, daß in einem der Primer n1 = 1, n1 = 2, n1 = 3 oder n1 = 4 ist, da die Zahl der Primerfragmente, die in den Reaktionen verwendet werden müssen, um alle möglichen Nucleotidbereiche direkt neben dem Con- oder dem Adapterfragment abzudecken, leicht zu handhaben ist. Zum Beispiel, falls n1 = 5 ist, wäre die Verwendung von 4&sup5; = 1024 verschiedenen Primern erforderlich, um die Amplifikation aller möglichen Nucleotidsequenzen direkt neben dem relevanten Adapterfragment zu erzielen, und da die bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform erfordert, daß jeder solche Primer in einer getrennten Reaktion verwendet wird, wäre die damit in Zusammenhang stehende Arbeit schwierig.
• Es wird auch bevorzugt, daß in einem der Primer n = 0 ist, und es wird insbesondere bevorzugt, daß dieser Primer markiert ist, um die Bestimmung der amplifizierten Fragmente zu ermöglichen.
• Daher werden in den am meisten bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen die angepaßten cDNA-Fragmente in einer Reihe von verschiedenen Reaktionen amplifiziert, wobei ein markierter Primer (der normalerweise in allen Reaktionen identisch ist) und mindestens ein nichtmarkierter Primer, der ein Mitglied des vorstehend beschriebenen Satzes von Primern ist, worin n > 1 ist, verwendet wird. Es wird bevorzugt, daß dieser Satz von Amplifikationsprimern der Formel I, worin n1 > 0 ist, alle möglichen Kombinationen und Permutationen von A, G, T und C in der Gruppe Nn1 umfaßt, da dies gewährleistet, daß alle möglichen cDNA-Fragmente durch den Satz amplifiziert werden können.
• Daher werden die ligierten cDNA-Fragmente vor der molekularen Amplifikation in Schritt (f) in eine Reihe von Pools unterteilt, und mit jedem Pool wird unter Verwendung eines Untersatzes des Satzes von Amplifikationsprimern eine Amplifikation durchgeführt, und in der am meisten bevorzugten Ausführungsform werden die ligierten cDNA-Fragmente von Schritt (d) in 4n1 Pools unterteilt, die jeweils getrennt Schritt (f) unterworfen werden, wobei ein markierter Amplifikationsprimer, wie vorstehend beschrieben (n1 = 0), und ein Primer aus dem Satz von Amplifikationsprimern, wie vorstehend definiert (n > 0), verwendet werden, wobei der eine Primer von jedem der Primer, die zur Amplifikation eines der anderen Pools verwendet werden, verschieden ist. Unter Verwendung dieses Ansatzes werden die ursprünglich revers transkribierten und gespaltenen cDNA-Fragmente in 4n1 Pools unterteilt, die jeweils weiteren Schritten unterworfen werden können.
Weitere Schritte und Anwendungen
• Das aus der vorstehend beschriebenen Reihe von Reaktionen erhaltene Material kann nun in einer Reihe von Verfahren verwendet werden. Normalerweise wird ein weiterer Schritt der Trennung der amplifizierten Fragmente, die durch das molekulare Amplifikationsverfahren hergestellt wurden, durchgeführt. Dieses ergibt ein Gemisch aus amplifizierten Fragmenten, die z. B. durch Größenauftrennung, durch die Beweglichkeit in einer Gelelektrophorese oder durch ein geeignetes chromatographisches Verfahren getrennt werden. Außerdem wird normalerweise ein Schritt der Identifizierung (z. B. durch Sichtbarmachen dieser getrennten Fragmente) zum "Zwecke der Buchführung" durchgeführt; das aufgetrennte Gemisch der Fragmente wird normalerweise mit einer Art von Referenz verglichen, welche ein Material sein kann, das von dem gleichen oder einem anderen Zelltyp gewonnen wurde.
• Das Sichtbarmachen der aufgetrennten Fragmente kann, wie vorstehend erwähnt, dadurch erzielt werden, daß einer der Primer in der Amplifikationsreaktion markiert wird, aber natürlich stehen andere Verfahren zur Verfügung. Zum Beispiel macht eine spezifisch markierte Sonde, die z. B. an eine der Adaptersequenzen bindet, die Fragmente sichtbar, aber natürlich sind auch markierte Nucleotide, die während des Amplifikationsverfahrens (z. B. eine PCR) in die Fragmente eingeführt wurden, ein geeignetes Mittel für den Nachweis (z. B. durch das Einfügen eines radioaktiven oder fluoreszierenden alpha-dNTPs in das cDNA-Fragment während der PCR, wobei N = A, C, T, U oder G ist).
• Es wird jedoch bevorzugt, daß das Sichtbarmachen der spezifischen, von der RNA Gewonnenen Fragmente (RDFs) unter Verwendung von Primern erzielt wird, die radioaktiv oder fluoreszierend markiert sind und zu den Adaptern homolog sind. Die verhältnismäßig hohen Temperaturen für die Anlagerung (Anlagerung von 65ºC bis 56ºC), welche vorzugsweise verwendet werden, gewährleisten, daß die Polymerisierungsereignisse überwiegend von einem fehlerlosen Priming der Adaptersequenzen und benachbarter selektiver Basen herrühren. Die Bandenintensitäten sind größtenteils eine Funktion der anfänglichen Matrizenkonzentration, während die Bandenintensitäten der ursprünglichen Methoden der Differenziellen Darstellung von der Qualität der Paarung zwischen der einzelnen Matrize und dem Primer abhängen. Das Sichtbarmachen seltener mRNAs unter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren wird durch das übermäßige Vorhandensein von Signal von in sehr großer Zahl vorkommenden mRNAs weniger erschwert. Wie im Fall des Zufallprimers unterdrücken die Fehlpaarungs-Amplifikation und in großer Zahl vorkommende RDFs immer die Amplifikation seltener Basenpaare der Fragmente völlig. Die Experimente der Anmelder legen nahe, daß so wenig wie 100 Moleküle routinemäßig in einer bestimmten Matrize nachgewiesen werden können. Dies entspricht weniger als einem Transkript pro Zelle in dem ursprünglichen Gewebe.
• Ein anderer Teil der Erfindung betrifft die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Vergleich der Expressionsraten in verschiedenen Zellen. Ein Verfahren hierfür ist, die Änderungen in der Expression, im Vergleich zur Expression in einer Referenzzelle oder einer Referenzgruppe von Zellen, eines Expressionsprodukts in einer Zelle oder Gruppe von Zellen, welche unter einer ersten Reihe von Bedingungen zur Beeinflussung des Expressionsmusters dieser Zelle oder Gruppe von Zellen inkubiert wird, wobei die Referenzzelle oder die Referenzgruppe von Zellen einer zweiten Reihe von Bedingungen unterworfen wird, zu bestimmen, wobei das Verfahren umfaßt, die Bereitstellung einer RNA enthaltenden Probe von dieser Zelle oder Gruppe von Zellen und Verwendung dieser Probe in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Unterteilung, wobei Daten erhalten werden, welche die amplifzierten cDNA-Fragmente, die aus der Probe erhalten werden, beschreiben, die Bereitstellung von Referenzdaten, welche die amplifizierten cDNA-Fragmente, die aus RNA enthaltenden Referenzproben von der Referenzzelle oder der Referenzgruppe von Zellen erhalten wurden, beschreiben, wobei diese Referenzdaten erhalten wurden durch eine vorangegangene Verwendung der Referenzproben in dem erfindungsgemäßen Verfahren, die anschließende Durchführung eines Vergleichs der Daten und der Referenzdaten zur Identifizierung solcher cDNA-Fragmente, welche in unterschiedlichem Grad in diesen beiden Datensätzen exprimiert werden, und anschließend die Verwendung der unterschiedlich exprimierten cDNA-Fragmente, um zu bestimmen, bei welchen Expressionsprodukten unterschiedliche Expressionsgrade auftreten. Anders ausgedrückt, wird das erfindungsgemäße Verfahren zweimal auf der Grundlage von zwei verschiedenen RNA-Proben, die von Zellen erhalten wurden, die unter unterschiedlichen Bedingungen inkubiert wurden, durchgeführt.
• Normalerweise sind die Daten und Referenzdaten gewählt aus der Gruppe, bestehend aus den scheinbaren Molekulargewichten der amplifizierten DNA-Fragmente, dem MT dieser amplifizierten DNA-Fragmente, der absoluten Menge der amplifizierten DNA-Fragmente und der relativen Mengen der amplifizierten DNA-Fragmente. Die Referenzdaten können ferner aus einer Datenbank stammen, welche die vorstehend definierten Referenzdaten umfaßt und gegebenenfalls weitere Informationen, die sich auf den genetischen Ursprung jedes amplifizierten cDNA- Fragments dieser Referenz beziehen.
• In Verbindung mit dem Vorstehenden ermöglicht die Erfindung auch die Diagnose von Erkrankungen, die durch eine abweichende (erhöhte oder verminderte) Expressionsrate von mindestens einem Expressionsprodukt in mindestens einem Zelltyp gekennzeichnet sind, wobei das Verfahren umfaßt, die Bereitstellung einer RNA enthaltenden Probe, die aus mindestens einem Zelltyp gewonnen wird, die Verwendung dieser Probe in einem erfindungsgemäßen Verfahren, wobei die erhaltenen Daten die amplifizierten cDNA-Fragmente dieser Probe beschreiben, die Bereitstellung von Referenzdaten, welche die amplifizierten cDNA-Fragmente beschreiben, welche aus einer RNA enthaltenden Referenzprobe stammen, welche aus dem gleichen Zelltyp von einem Individuum, welches nicht unter dieser Erkrankung leidet, gewonnen wurde, wobei diese Referenzdaten erhalten wurden durch eine vorangegangene Verwendung der Referenzprobe in einem erfindungsgemäßen Verfahren, und den anschließenden Vergleich der erhaltenen Daten mit den Referenzdaten im Hinblick auf die cDNA-Fragmente, von welchen bekannt ist, daß diese mit der Erkrankung in Verbindung stehen, und das Abschätzen, ob eine signifikante Differenz zwischen den Daten und Referenzdaten besteht, um festzustellen, ob der Expressionsgrad eines Expressionsprodukts abweicht oder nicht.
• Wie bei der vorstehenden Ausführungsform sind auch hier die Daten und Referenzdaten gewählt aus der Gruppe, bestehend aus den scheinbaren Molekulargewichten der amplifizierten DNA-Fragmente, dem Mr dieser amplifizierten DNA-Fragmente, der absoluten Menge der amplifizierten DNA-Fragmente und der relativen Mengen der amplifizierten DNA-Fragmente; und auch hier können die Referenzdaten aus einer Datenbank stammen, welche die vorstehend definierten Referenzdaten umfaßt und gegebenenfalls weitere Informationen, die sich auf den genetischen Ursprung jedes amplifizierten cDNA-Fragments dieser Referenz beziehen.
• Die Gemische der amplifizierten Fragmente, welche in Schritt (f) des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wurden, können auch zur Herstellung einer mit cDNA-Fragmenten beschichteten Oberfläche (Chip) verwendet werden, umfassend
• - Verwendung einer RNA enthaltenden Probe in einem erfindungsgemäßen Unterteilungsverfahren einschließlich Trennschritten, und
• - Übertragen der aufgetrennten amplifizierten cDNA-Fragmente auf eine Chip-Oberfläche, welche für eine stabile Bindung der aufgetrennten amplifizierten cDNA-Fragmente angepaßt ist, wobei das relative räumliche Verteilungsmuster aufrechterhalten wird.
• In einer anderen Ausführungsform kann ein solcher Chip hergestellt werden durch:
• - Verwendung einer RNA enthaltenden Probe in einem erfindungsgemäßen Verfahren ohne Auftrennung, und anschließend
• - Auftrennung der so erhaltenen amplifizierten cDNA-Fragmente durch Elektrophorese auf einer speziellen Oberfläche, welche für eine stabile Bindung der aufgetrennten amplifizierten cDNA- Fragmente angepaßt ist, wobei das relative Verteilungsmuster nach der Elektrophorese erhalten bleibt.
• In dieser Ausführungsform wird die Elektrophorese vorzugsweise in Form einer Mikroelektrophorese durchgeführt.
• Der Transfer auf die Oberfläche wird vorzugsweise durch eine elektrophoretische Blot- Technik und/oder durch gut bekannte photoaktive, organische oder anorganische chemische Kupplungstechniken gewährleistet.
• Die Erfindung betrifft auch eine Oberfläche, welche durch das vorstehend erwähnte Verfahren zu deren Herstellung erhältlich ist. Solche Oberflächen werden als neu und erfindungsgemäß angesehen, da bekannte "DNA-Chips" auf der spezifischen Einführung eines Array von Nucleinsäurefragmenten bekannter Struktur beruhen, während das vorliegende Verfahren ein "Semi-Array" bereitstellt, welches cDNA-Fragmente enthält, die eine spezifische "Situation" für einen spezifischen Zelltyp gemäß Fig. 8 charakterisieren.
• Eine solche Oberfläche kann u. a. zur Durchmusterung von Genen innerhalb einer Genfamilie verwendet werden. Der "Array-Chip" wird bereitgestellt und anschließend läßt man eine markierte Sonde (welche ein Vertreter der Genfamilie ist) mit dem Chip bei niedriger Stringenz, d. h. unter Bedingungen, wie auf den Seiten 94-106 in "Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach", herausgegeben von Hames B. D. & Higgins S. J., IRL Press, beschrieben, hybridisieren. Eine Reihe von Fragmenten, die an den Chip gekoppelt sind, hybridisieren mit der Sonde, und diese Fragmente können anschließend identifiziert, isoliert und sequenziert/charakterisiert werden, um zu bestimmen, ob sie Vertreter der gleichen Genfamilie sind.
• Eine andere Anwendung solcher "Semi-Arrays" ist die Bestimmung einer Differenz im Expressionsmuster zwischen einer ersten Zelle oder einem ersten Zelltyp und einer zweiten Zelle oder einem zweiten Zelltyp, wobei das Verfahren umfaßt, die Bereitstellung von markierten RNA- oder cDNA-Proben der ersten und der zweiten Zelle oder des ersten oder zweiten Zelltyps, anschließend das Inkontaktbringen jeder dieser Proben mit einer Chip-Oberfläche, wie vorstehend beschrieben, und anschließend den Nachweis der Menge und Verteilung von gebundener, markierter RNA oder cDNA jeder Probe.
• Unter allen Verhältnissen kann die Chip-Oberfläche mit der daran gebundenen cDNA z. B. durch die in EP-0 654 061 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
• Ein noch anderer Teil der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchmusterung von Wechselwirkungen zwischen einem vorher ausgewählten Protein und einem Polypeptidfragment, umfassend die Herstellung einer unterteilten Bibliothek von amplifizierten cDNA-Fragmenten, welche aus Schritt (e) erhalten werden, gegebenenfalls das Anpassen der Enden der Mitglieder dieser Bank, um das Einfügen in einen Vektor zu erleichtern, das Einfügen der Fragmente in Vektoren, das Transformieren einer Population geeigneter Wirtszellen mit den Vektoren, das Züchten der Wirtszellen unter Bedingungen, welche die Expression von korrekt eingefügten cDNA- Fragmenten in der Wirtszelle ermöglichen und die anschließende Analyse der Polypeptidfragmente, die von den eingefügten cDNA-Fragmenten codiert werden, bezüglich ihrer Wechselwirkung mit dem vorher ausgewählten Protein.
• Ein geeignetes Verfahren hierfür ist eine Zweihybrid-Technik, wobei die Wirtszellen eukaryontische Zellen sind (wie Pilzzellen, insbesondere Hefezellen), welche gepaart oder mit Nucleinsäurematerial transfiziert werden, welches das vorher ausgewählte Protein codiert, wobei die erfolgreiche Paarung/Transfektion dieser Zelle(n) zur Bereitstellung einer Zelle oder von Zellen führt, in welchen die Wechselwirkung zwischen dem vorher ausgewählten Protein und einem Polypeptidfragment ein nachweisbares Signal auslöst.
• Solchen Verfahren wurde in letzter Zeit sehr große Aufmerksamkeit geschenkt, u. a. als Folge der Offenbarung von Fromont-Racine et al., Nature Genetics 16 (1997), 277-282, welche hier unter Bezugnahme eingeschlossen ist.
• Ein geeignetes System zur Bereitstellung des nachweisbaren Signals ist unter Verwendung des Grün Fluoreszierenden Proteins, das in EP-A-0 569 170 offenbart ist, wobei die Veränderungen im Fluoreszenzspektrum infolge von Wechselwirkungen als ein Marker verwendet werden.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
• Zuerst werden die Zeichnungen kurz beschrieben.
Fig. 1:
• Prinzip der Darstellung von Differenziell Exprimierten Transkripten ("Display of Differentially Expressed Transcripts".
Fig. 2:
• Anker- und PCR-Primer-Konstruktion.
Fig. 3:
• Autoradiogramm eines DODET-Gels unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Zellanordnung; Ratten-Phäochromocytom-PC12-Zellen wurden mit dem Nervenwachstumsfaktor (NGF) und dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) stimuliert.
• Bahnen 1-24: Reverse Transkription unter Verwendung des verankerten Poly-T-Primers 5'-T&sub2;&sub5;AA- 3'.
• Bahnen 25-48: Reverse Transkription unter Verwendung des verankerten Poly-T-Primers 5'-T&sub2;&sub5;GC- 3'.
• Die Bahnen 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41 und 45 entsprechen den unbehandelten PC 12-Zellen.
• Die Bahnen 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42 und 46 entsprechen den 60 Minuten mit dem NGF-Faktor behandelten PC 12-Zellen.
• Die Bahnen 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43 und 47 entsprechen den 90 Minuten mit dem NGF-Faktor behandelten PC12-Zellen.
• Die Bahnen 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 und 48 entsprechen den 90 Minuten mit dem EGF-Faktor behandelten PC12-Zellen.
• Bahnen 1-48: Unter Verwendung der folgenden Paare für die Prä-PCR-Amplifikationen:
• TaqI-Präamplifikationsprimer: 5'-CAGCAWAGTCCTGACCGA
• EclI-Präampliiikätionsprimer: 5'-CTCGTAGACTGCGTACCGATCA
• Für die zweite PCR-Amplifikation wurden die folgenden Primerpaare verwendet:
Bahnen 1-4
• 5'-CATGAGTCCTGACCCAA
• 5'-GACTGCGTACCGATCAA (5'-Endmarkierung)
Bahnen 5-8
• 5'-CATGAGTCaGACCGAA
• 5'-GACTGCGTACCGATCAC (5'-(Endmarkierung)
Bahnen 9-12
• 5'-CATGAGTCCTGACCGAA,
• 5'-GACTGCGTACCGATCAG (5'-Endmarkierung)
Bahnen 13-16
• 5'-CATGAGTCCTGACCGAA
• 5'-GACTGCGTACCGATCAT (5'-Endmarkierung)
Bahnen 17-20
• 5'-CATGAGTCCTGACCGAC
• 5'-GACTGCGTACCGATCAA (5'-Endmarkierung)
Bahnen 21-24
• 5'-CATGAGTCCTGACCGAC
• 5'-GACTGCGTACCGATCAC (5'-Endmarkierung)
Bahnen 25-48
• Wiederholung der Primerkombination der Bahnen 1-24.
Fig. 4a:
• Northern-Blot der RDF01-Sequenz aus der Gesamt-RNA einer Zelle.
• a) Unbehandelte PC12-Zellen; b) 60-minütige NGF-Behandlung;
• c) 90-minütige NGF-Behandlung; und d) 90-minütige EGF-Behandlung.
Fig. 4b:
• Beladungskontrolle: RNA-Extrakte wurden auf einem 1,2%igen Agarosegel, enthaltend Ethidiumbromid, einer Elektrophorese unterworfen und als Kontrolle verwendet, um die relative RNA-Konzentration in jeder Bahn zu bestimmen; a, b, c und d haben die gleiche Bedeutung wie in Fig. 4a.
Fig. 4c:
• Northern-Blot der RDF02-Sequenz aus der Gesamt-RNA einer Zelle.
• b) Unbehandelte PC12-Zellen; b) 60-minütige NGF-Behandlung;
• c) 90-minütige NGF-Behandlung; und d) 90-minütige EGF-Behandlung.
Fig. 4d:
• Beladungskontrolle: RNA-Extrakte wurden auf einem 1,2%igen Agarosegel, enthaltend Ethidiumbromid, einer Elektrophorese unterworfen und als Kontrolle verwendet, um die relative RNA-Menge in jeder Bahn zu bestimmen; a, b, c und d haben die gleiche Bedeutung wie in Fig. 4c.
Fig. 5:
• Suche nach Genen, die durch einen Wachstumsfaktor moduliert werden.
• Bahn 1: Größenmarker in bp (150 bp, 200 bp und 250 bp).
• Bahnen 2-6: Amplifikationsprimer 5'-Com-Nn1-3', worin Nn1 GAA ist.
• Bahnen 7-11: Amplifikationsprimer 5'-Com-Nn1-3', worin Nn1 GAC ist.
• Bahnen 12-16: Amplifikationsprimer 5'-Com-Nn1-3', worin Nn1 GAG ist.
• Bahnen 17-21: Amplifikationsprimer 5'-Com-Nn1-3', worin Nn1 GAT ist.
• Bahnen 22-26: Amplifikationsprimer 5'-Com-Nn1-3', worin Nn1 GCA ist.
• In Bahn 11 wird eine Herunterregulierung nach einer 6-tägigen Behandlung beobachtet, während in Bahn 16 eine Hochregulierung nach einer 6-tägigen Behandlung beobachtet wird. Beide Modulationen sind auf den Wachstumsfaktor zurückzuführen, da eine Regulierung nur beobachtet wird, wenn der aktive Wachstumsfaktor vorhanden ist.
Fig. 6:
• Suche nach Genen, die an einer Bakterienresistenz beteiligt sind.
• Bahn 1: Größenmarker in bp (150 bp, 200 bp, 250 bp und 300 bp).
• Bahnen 2-5: Amplifikationsprimer 5'-Com-Nn1-3', worin Nn1 GAA ist.
• Bahnen 6-9: Amplifikationsprimer 5'-Com-Nn1-3', worin Nn1 GAC ist.
• Bahnen 10-13: Amplifikationsprimer 5'-Gom-Nn1-3', worin Nn1 GAG ist.
• Bahnen 14-17: Amplifikationsprimer 5'-Com-Nn1-3', worin Nn1 GAT ist.
• Bahnen 18-21: Amplifikationsprimer 5'-Com-Nn1-3', worin Nn1 GCA ist.
• Bahnen 22-25: Amplifikationsprimer 5'-Com-Nn1-3', worin Nn1 GCC ist.
• In den Bahnen 8-9 wird eine Herunterregulierung beobachtet; in den Bahnen 20-21 wird eine Hochregulierung beobachtet. Beide Genmodulationen sind potentielle Gene, die an der Resistenz gegen das Bacteriamycin Inosin beteiligt sind.
Fig. 7:
• Prinzip der in den Beispielen 4 und 5 angewendeten Technik.
• Nach der ds-cDNA-Synthese wird die DNA mit einer 4 Basenpaar-Endonuclease gespalten, und die Anker werden mit den ds-cDNA-Enden ligiert. Unter Verwendung von speziell konstruierten Primern werden die Expressionsprofile durch die Amplifikation der mRNAs in verschiedenen Expressionsfenstern (Unterfraktionen) erhalten. Die Zahl der Expressionsfenster hängt von der Komplexität der Probe ab, d. h. 64 Expressionsfenster bei Eukaryonten.
Fig. 8:
• Prinzip einer Gennachweis-DNA-Oberfläche (ein DNA-Chip).
• Nach der Größenauftrennung der DNA-Fragmente werden die DNA-Fragmente unter Verwendung eines elekrophoretischen Prinzips auf eine Nylonmembran übertragen. Die Membran wird mit einer komplexen DNA-Sonde hybridisiert, welche gemäß dem erfindungsgemäßen Prinzip hergestellt wurde. In einer anderen Ausführungsform kann die Membran mit einem einzigen Gen hybridisiert werden, um neue Mitglieder einer bestimmten Genfamilie zu identifizieren. Die Membran ist bezüglich der x-Koordinaten in 64 Expressionsfenster und bezüglich der y- Koordinaten in Basenpaargrößen (von 50 Basenpaaren bis 1200 Basenpaaren) gemäß dem in Fig. 7 beschriebenen Prinzip aufgeteilt.
Fig. 9:
• Prinzip der Erzeugung von 64 Pools von cDNAs mit 3'-Ende.
Schritt 1:
• Herstellung einzelsträngiger cDNA unter Verwendung eines 5'-con&sub1;-TnV-Oligonucleotids, worin con&sub1; ein Oligonucleotid mit zwischen 1 bis 100 Nucleotiden ist, n zwischen 5-40 liegt und V ein Gemisch aus A, C und G ist.
Schritt 2:
• Die Synthese doppelsträngiger cDNA wird unter Verwendung eines 5'-con&sub2;Nx- Oligonucleotids durchgeführt, worin con&sub2; ein Oligonucleotid mit zwischen 1 bis 100 Nucleotiden ist, x zwischen 1-10 liegt und N ein Gemisch aus A, C, T und G ist. Die Synthese der ds-cDNA erfolgt unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Oligonucleotids durch das Klenow-Enzym.
Schritt 3:
• Präamplifikation der doppelsträngigen cDNA zur Amplifikation der doppelsträngigen cDNA; die cDNA wird unter Verwendung einer Kombination der con&sub1;- und con&sub2;-Primer mittels PCR amplifiziert.
Schritt 4:
• Die präamplifizierte cDNA wird weiter amplifiziert und unter Verwendung einer Kombination aus einem markierten con&sub1;-Primer und 64 con&sub2;NNN-Primern in einem PCR- Amplifikationsverfahren in 64 Pools aufgeteilt, wobei die NNNs unter Verwendung der Nucleotide A, T, G und C in 64 unterschiedlichen Weisen kombiniert werden.
Schritt 5:
• Jeder der 64 Pools wird unter Verwendung des PAGE-Elektrophoreseprinzips aufgetrennt.
Beispiele
• Zur Überprüfung der Wirksamkeit der Erfindung werden nachstehend Beispiele beschrieben, in denen das eukaryontische Entwicklungszellsystem Phäochromocytom-PC12 verwendet wurde.
• Der Nervenwachstumsfaktor (NGF) induziert den Wachstumsstillstand und das Auswachsen von Neuronen in dem In vitro-PC12-Zellsystem. Andere Wachstumsfaktoren, wie der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), fördern das Überleben und stimulieren das Wachstum. NGFinduzierte Gene schließen die sehr frühen Gene ein, welche Transkriptionsfaktoren, wie c-fos und c-myc, codieren. Man nimmt an, daß die Produkte der sehr frühen Gene an der Regulierung der Expression von Genen, die mit dem neuronalen Phänotyp in Zusammenhang stehen, zum Beispiel Neurofilamente, Peripherin, GAP43 und Transin, beteiligt sind.
• Um neue frühe Gene zu identifizieren, die an der Differenzierung und Proliferation von Neuronen beteiligt sind, wird das folgende DODET-Verfahren angewendet, um solche Gene zu identifizieren.
• In den folgenden Beispielen wird gezeigt, wie effizient das erfindungsgemäße Verfahren auf solche Zellsysteme angewendet werden kann.
Beispiel 1
• Die Ratten-Phäochromocytom-PC12-Zellen wurden in Anwesenheit und Abwesenheit des Nervenwachstumsfaktors (NGF) und des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) unter Wachstumsbedingungen gezüchtet (in vitro), welche anderswo beschrieben sind (Saltiel et al., 1996).
• Die gesamte RNA wurde unter Anwendung des Einzelschrittstandardverfahrens von Chomczynski und Sacchi gemäß Sambrook et al. (1989) isoliert.
• Die Gesamt-RNA-Konzentration wurde spektrophotometrisch bestimmt und dann auf 0,2 ug/ul eingestellt. Diese RNA wurde direkt in einer Northern-Analyse verwendet.
• Für die DODET wurden 4 · 0,5 ug Gesamt-RNA in verschiedenen Pools unter Verwendung des Primers 5'-1&sub2;&sub5;AA-3' revers transkribiert. Das gleiche Verfahren wurde unter Verwendung der 5'-1&sub2;&sub5;GC-3'-Poly-dT-verankerten Primer durchgeführt, wobei insgesamt 2 · 4 · 0,5 ug RNA erhalten wurden.
Synthese des ersten Strangs
• 20,0 ul RNA-Gesamtmenge, zwischen 0,3 bis 1,0 ug RNA
• 3,0 ul 5'-T&sub2;&sub5;AA-3', Konzentration 100 ng/ul, oder 5'-T&sub2;&sub5;GC-3', Konzentration 100 ng/ul
• 5,0 ul 10 · cDNA-Puffer (Puffer B von Epicentre Technologies #R19250)
• 2,0 ul dNTPs (25 mM, von Pharmacia Biotech)
• 1,0 ul SuperScript II RT (200 E/u1) (Gibco BRL # 18064-014)
• 5,0 ul Retrotherm RT (1 E/ul) (Epicentre Technologies #R19250)
• 14,0 ul H&sub2;O
• Um eine hohe Spezifität zu erhalten, wurde die cDNA-Reaktion bei 50ºC 30 Minuten inkubiert, gefolgt von einer 1-stündigen Inkubation bei 70ºC.
Synthese des zweiten Strangs
• Zu der Reaktion des ersten Strangs wurden die folgenden Komponenten zugegeben:
• 15,0 ul 10 · cDNA-Puffer
• 3,0 ul Hitzestabile Hybridase-RNase (1 E/ul) (Epicentre Technologies #H39050)
• 1,0 ul Hitzestabile rBst-DNA-Polymerase (1 E/ul) (Epicentre Technologies #BH1100)
• 81,0 ul H&sub2;O
• Die Reaktion wurde 1 Stunde bei 65ºC inkubiert.
• Die so erhaltene doppelsträngige cDNA wurde mit Phenol extrahiert und gefällt und in 20 ul H&sub2;O resuspendiert. Die Hälfte dieses Volumens wurde auf einem Gel überprüft; falls zwischen 100 bp und 3000 bp ein verwischter Fleck beobachtet wurde, wurde die restliche cDNA für die Herstellung von Matrizen für die DODET verwendet. Die so erhaltenen cDNAs wurden mit jeweils 10 E der hitzestabilen Restriktionsenzyme TaqI und BcII bei 50ºC 2 Stunden gespalten. Zu diesem Gemisch wurden DODET-Adapter zugegeben und mit den Enden der Restriktionsfragmente unter Verwendung der T4-DNA-Ligase (1 E) ligiert, wobei die primäre Matrize erhalten wurde. 8-15 Zyklen einer nichtradioaktiven Präamplifikation unter Verwendung von Primern, die komplementär zu den DODET-Adapter sind, wurden mit einem kleinen Aliquot (1/10tel Volumen) der primären Matrize durchgeführt (Denaturierung bei 94ºC für 30 sec; Aneinanderlagerung bei 56ºC für 30 sec; Polymerisierung bei 72ºC für 1 min). Die Produkte der Amplifikation (als sekundäre Matrize bezeichnet) wurden ebenfalls auf einem 1,5%igen Agarosegel überprüft. Wie erwartet, lagen die Fragmentgrößen überwiegend zwischen 100 bp und 1000 bp. Alle Amplifikationsreaktionen wurden mit einer PE-9600-Thermocycler-Vorrichtung unter Verwendung der Taq-DNA- Polymerase, beides von Perkin Elmer Corp. (Norwalk, CT, USA), durchgeführt. Die endgültige Matrize wurde dann mit H&sub2;O 10fach verdünnt.
• Die mit den Restriktionsfragmenten ligierten Adapter, die Präamplifikations- und wirksamen PCR-Primer sind nachstehend angegeben:
• Für die PCR standen alle unterschiedlichen Kombinationen einer Verlängerung (vorstehend als N gekennzeichnet) zur Verfügung, wobei insgesamt 4² Primerkombinationen erhalten wurden. Alle Oligonucleotide wurden von DNA Technology (Aarhus, Dänemark) bezogen.
• Die radioaktive Markierung des BclI-Primers wurde unter Verwendung von 1 E der T4- Polynucleotidkinase durchgeführt. Der Temperaturwechsel wurde im wesentlichen ausgeführt wie vorstehend beschrieben, aber mit 35 Zyklen und einschließlich einer Absenkung des Anlagerungspunkts in 11 Zyklen (die Temperatur für das Aneinanderlagern wurde in Schritten von 0,7ºC während 11 Zyklen von 65ºC auf 56ºC gesenkt und anschließend während 23 Zyklen bei 56ºC gehalten). Die Proben wurden dann nach Zugabe eines Farbstoffs und von 50% Formamid gekocht und auf einem S%igen Polyacrylamid-Sequenzierungsgel (Gibco BRL Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA) aufgetrennt. Alle Gele ließ man unter Standardbedingungen laufen, so daß sich der 70 bp-Marker 3 cm vom unteren Ende des Gels aus gesehen befand, wobei eine gute Auflösung zwischen 70-800 bp erhalten wurde. Die Gele wurden dann direkt auf Whatman 3M- Papier auf einem Plattengeltrockner getrocknet. Markierte DNA-Fragmente wurden mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Position der Gele und Filme wurde vor der Entwicklung markiert. Die selektiven 1 Base-Verlängerungen wurden empirisch ausgewählt, wobei etwa 50 radioaktiv markierte Fragmente pro Bahn erhalten wurden.
• Die auf dem Autoradiogram als interessant identifizierten Banden wurden an Markierungen auf dem Film und dem dehydratisierten Gel ausgerichtet und ausgeschnitten. Die ausgeschnittene Fragmente wurde auf eine Aktivität überprüft. Die Gelfragmente wurden unter Verwendung von GENECLEAN (BIO101, Kalifornien, USA) isoliert. Die DNA wurde dann gemäß den Empfehlungen des Herstellers gewonnen. Die DNA-Fragmente könnten dann unter Verwendung der gleichen PCR-Bedingungen und Primer, wie sie für die erste PCR verwendet wurden, reamplifiziert werden; jedoch ergaben 15 Zyklen im allgemeinen eine ausreichende Menge des Produkts zum Clonieren. Die Clonierung wurde unter Verwendung des ungereinigten PCR- Produkts und dem Vektor Display-p123T (Display Systems Biotech, USA) durchgeführt. Die verwendeten Bedingungen waren wie vom Hersteller empfohlen.
Beispiel 2
• Fig. 3 zeigt ein typisches DODET-Gel, das durch die Amplifikation einer Matrize, welche durch die Behandlung von PC12-Zellen mit NGF oder EGF gewonnen wurde, erzeugt wurde.
• Die gesamte RNA wurde mit den 5'-T&sub2;&sub5;AA-3'- und 5'-T&sub2;&sub5;GC-3'-Poly-dT-verankerten Primern revers transkribiert, und nach der Ankerligierung wurde eine Präampliflkation mit BclI- und TaqI-Präamplifikationsprimerpaaren durchgeführt.
• 6 von 16 möglichen Primerkombinationen sind unter Verwendung einer selektiven Base an jeder Restriktionsenzymstelle gezeigt (Fig. 3). Die größten sichtbaren Produkte (Fig. 3) sind etwa 1000 bp groß, und das untere Ende des Gels entspricht etwa 100 bp. In diesem Größenfenster können durchschnittlich 50 Banden für jede Primerkombination beurteilt werden. In Fig. 3 können verschiedene Expressionsmuster nachgewiesen werden.
• Hauptsächlich infolge der stringenten Bedingungen, welche bei der DODET möglich sind, ist die Auflösung des Bänderungsmusters hoch, während die Stärke des Hintergrunds bei annehmbaren Werten bleibt (Fig. 3). Außerdem scheinen sehr durchgreifende Veränderungen in der Intensität einzelner Banden über den Behandlungszeitraum die Muster anderer Banden in der gleichen Bahn nicht zu beeinflussen.
• Daher kann man schließen, daß die PCR von der Konzentration einzelner Substrate in der Reaktion proportional unabhängig bleibt.
• Die Verwendung einer optimierten Kombination von vorstehend beschriebenen Standardprotokollen zur Isolierung, Reamplifikation und Clonierung einzelner RDFs erlaubte die Identifizierung einer Reihe von Transkripten, die mit Differenzierungs- und Proliferationsereignissen in Zusammenhang stehen.
• Vier RDFs wurden zur weiteren Analyse isoliert; Fig. 3, Banden a, b, c und d.
• Eine Sequenzanalyse zeigte, daß RDF a = RDF b und RDF c = RDF d, wie in Fig. 3 veranschaulicht ist.
• In allen Fällen konnten geeignete terminale Sequenzen mit den korrekten selektiven 1 Base-Verlängerungen, die in der PCR verwendet wurden, wiedergewonnen werden, was die Stringenz und Genauigkeit des Systems zeigt (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 3
• Während der Sondierung der mit NGF oder EGF behandelten PC12-Zellsysteme mit verschiedenen Primerkombinationen wurden zwei RDFs (als RDF01 und RDF02 bezeichnet) isoliert, die eine unterschiedliche Expression während der NGF-Behandlung zeigten (RDF01 = RDF a = RDF b; und RDF02 = RDF c = RDF d in Fig. 3).
• Nach Reamplifikation, Subclonierung und DNA-Sequenzierung zeigte eine weitere DNA- Analyse zwei unbekannte RDFs, die nach einer 60-minütigen NGF-Behandlung oder einer 90- minütigen EGF-Behandlung in dem PC12-Zellsystem hochreguliert wurden. Die Nucleotidsequenzen von sowohl RDF01 als auch RDF02 zeigen eine Homologie von weniger als 10% mit irgendeinem vorliegenden Gen in den Geneßank- oder EMBL-Datenbanken.
• Die Expression von RDF01 und RDF02 wurde unter Verwendung eines Northern-Blots weiter analysiert (Fig. 4a-4d). Hier konnten Transkripte nach einer 60-minütigen NGF- Behandlung oder einer 90-minütigen EGF-Behandlung der PC12-Zellen eindeutig nachgewiesen werden, wodurch die unter Anwendung der DODET-Methode erhaltenen Ergebnisse, wie in Fig. 3 veranschaulicht, bestätigt wurden.
• Experimente zur Clonierung des vollständigen RDF01 und RDF02 und biologischen Charakterisierung ihrer Beteiligung an der Differenzierung und Proliferation des PC12-Zellsystems werden gegenwärtig geprüft.
Beispiel 4 Suche nach Genen, die von einem Wachstumsfaktor moduliert werden
• Eine menschliche Zelllinie wurde mit einem Wachstumsfaktor behandelt, und die RNA wurde zu verschiedenen Zeitpunkten, wie nachstehend angegeben, isoliert.
• 1 Unbehandelte Zellen (Bahnen 2, 7, 12, 17 und 22)
• 2 Zellen, behandelt mit einem Hilfsmittel, 1 Tag (Bahnen 3, 8, 13; 18 und 23)
• 3 Zellen, behandelt mit einem Hilfsmittel und dem Wachstumsfaktor, 1 Tag (Bahnen 4, 9, 14, 19 und 24)
• 4 Zellen, behandelt mit einem Hilfsmittel, 6 Tage (Bahnen 5, 10, 15, 20 und 25)
• 5 Zellen, behandelt mit einem Hilfsmittel und dem Wachstumsfaktor, 6 Tage (Bahnen 6, 11, 16, 21 und 26)
• Die menschliche RNA wurde isoliert, und die Gennachweisanalyse wurde im wesentlichen durchgeführt, wie in der Legende zu Fig. 3 beschrieben ist. 5 von 64 Amplifikationsprimern sind in Fig. 5 gezeigt, wobei jeder einen bestimmten Teil des mRNA-Pools in der menschlichen Zelllinie abdeckt. Die Expressionsanalyse wurde mit einer ALFexpress-Vorrichtung, ein automatisches Fragmentanalysengerät von Pharmacia Biotech, unter Verwendung des Cy5- Markers durchgeführt.
• In Bahn 11 wird nach einer 6-tägigen Behandlung eine Herunterregulierung beobachtet. In Bahn 16 wird nach einer 6-tägigen Behandlung eine Hochregulierung beobachtet. Beide Modulationen sind auf den Wachstumsfaktor zurückzuführen, da die Regulierung nur in Gegenwart des aktiven Wachstumsfaktors beobachtet wird.
Beispiel 5 Suche nach Genen, die an einer Bakterienresistenz gegen Antibiotika beteiligt sind
• Der Stamm Listeria monocylogia wurde mit dem Bacteriamycin Inosin behandelt. Die RNA aus einem Stamm, der gegen Inosin resistent ist, wurde weiter untersucht.
• 1 Unbehandelter Bakterienclon 1 (Bahnen 2, 6, 10, 14 und 18)
• 2 Unbehandelter Bakterienclon 2 (Bahnen 3, 7, 11, 15 und 19)
• 3 Bakterienclon 3, resistent gegen Inosin (Bahnen 4, 8, 12, 16 und 20)
• 4 Bakterienclon 4, resistent gegen Inosin (Bahnen 5, 9, 13, 17 und 21)
• Die bakterielle RNA wurde durch Standardtechniken isoliert, und die Gennachweisanalyse wurde gemäß Beispiel 4 und Fig. 5 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß ein 5'-NNNNNNYYA-Primer für die Synthese des ersten Strangs verwendet wurde.
• 6 von 64 Amplifikationsprimem sind in Fig. 6 gezeigt, wobei jeder einen bestimmten Teil des mRNA-Pools in dem eukaryontischen Zellsystem abdeckt. Die Expressionsanalyse wurde mit einer ALFexpress-Vorrichtung, ein automatisches Fragmentanalysengerät von Pharmacia Biotech, unter Verwendung des Cy5-Markers durchgeführt.
• In den Bahnen 8 und 9 wird eine Herunterregulierung beobachtet, und in den Bahnen 20 und 21 wird eine Hochregulierung beobachtet. Beide Genmodulationen sind potentielle Gene, die an der Resistenz gegen Inosin beteiligt sind.

Claims (38)

1. Verfahren zum Herstellen einer normalisierten, unterteilten Bibliothek von amplifizierten cDNA-Fragmenten der codierenden Region von mRNA, die in einer Probe enthalten ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) Durchführen einer reversen Transkription mit der aus der Probe gewonnenen mRNA unter Verwendung mindestens eines cDNA-Primers, wobei cDNA- Fragmente des ersten Strangs erhalten werden,

(b) Synthetisieren der cDNA des zweiten Strangs, die komplementär zu den cDNA- Fragmenten des ersten Strangs ist, unter Verwendung der DNA-Fragmente des ersten Strangs als Matrizen, wobei doppelstränge cDNA-Fragmente erhalten werden,

(c) Verdauen der doppelsträngen cDNA-Fragmente mit einer Restriktionsendonuclease, wobei die Restriktionsendonuclease überstehende Enden (klebrige Enden) gleicher Größe an den Endstellen der DNA nach dem Verdau erzeugt, wobei gespaltene cDNA-Fragmente erhalten werden,

(d) Hinzufügen von mindestens zwei Adapterfragmenten, die bekannte Sequenzen umfassen, zu den gespaltenen cDNA-Fragmenten, welche in Schritt (c) erhalten wurden, wobei mindestens diese zwei Adapterfragmente in der Lage sind, spezifisch an die klebrigen Enden der doppelsträngigen cDNA zu binden, welche in Schritt (c) hergestellt wurde, wobei ein Adapterfragment an den Primer mit der Formel I aus Schrift (e) angelagert werden kann, das zweite Adapterfragment ein Terminationsfragment darstellt, welches eine Blockierung der Polymerisation der DNA in 5'-> 3' Richtung von diesem Terminationsfragment aus einführt und dieses Terminationsfragment nicht an einen Primer von mindestens zwei Sätzen von Primern aus Schritt (e) während eines molekularen Amplifikationsverfahrens angelagert werden kann, wobei die mindestens zwei Adapterfragmente mit den gespaltenen cDNA-Fragmenten, die in Schritt (c) erhalten wurden, ligiert werden, so dass ligierte cDNA-Fragmente erhalten werden,

(e) Aufteilen der ligierten cDNA-Fragmente, die in Schritt (d) erhalten wurden, in 4n1 Ansätze wobei 1 ≤ n1 ≤ 4, und

(f) Verwenden jedes Ansatzes von ligierten cDNA-Fragmenten, die in Schritt (e) erhalten wurden, für ein molekulares Amplifikationsverfahren, um amplifizierte cDNA-Fragmente zu erhalten, unter Verwendung für ein Adapterfragment, welches in Schritt (d) verwendet wurde, eines Satzes von Amplifikationsprimern mit der allgemeinen Formel

5'-Com-Nn1-3'

wobei Com die komplementäre Sequenz zu mindestens dem 5'-Ende des einen Adapterfragments ist, weiches mit dem 3'-Ende der gespaltenen cDNA-Fragmente ligiert ist, N entweder A, G, T oder C entspricht, der eine Primer die allgemeine Formel I hat, in der n1 = 0, und der zweite Primer die allgemeine Formel I hat, in der 1 ≤ n1 ≤ 4 ist, und dieser zweite Primer in der Lage ist, die Amplifikation jeder Nucleotidsequenz, die mit ihrem 3'-Ende an das Adapterfragment ligiert ist, das in seinem 5'-Ende komplementär zu Com ist, einzuleiten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Restriktionsendonuclease aus Schritt (c) ein seltener 4 Basen-Schneider ist, welcher so gewählt wird, dass dieser jede cDNA in durchschnittlich etwa drei Fragmente spaltet.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, wobei der seltene 4 Basen-Schneider gewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus AciI, AluI, BfaI, BstUI, Csp6I, DpnI, DpnII, HaeIII, HhaI, HinP1I, HpaII, MboI, MnII, MseI, MspI, NlaIII, RsaI, Sau3AI, TaiI, TaqI und Tsp509I.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Terminationsfragment aus Schritt (d) eine chemisch modifizierte Nucleotidsequenz umfasst oder ist, wobei diese modifizierte Nucleotidsequenz ein Didesoxynucleotid ist, das mit dem 3'-Ende des Nucleotidstrangs kovalent verbunden ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Satz der Amplifikationsprimer mit der Formel I, in der 1 ≤ n1 ≤ 4 ist, alle möglichen Kombinationen und Permutationen von A, G, T und C in der Gruppe Nn1 enthält.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Satz der Amplifikationsprimer mit n 1 = 0 in der Formel I markiert ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Satz der Amplifikationsprimer der Formel I, in der 1 ≤ n1 ≤ 4 ist, den Wert n1 = 3 hat.

8. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, umfassend als weiteren Schritt die Trennung der amplifizierten Fragmente, die durch das molekulare Amplifikationsverfahren aus Schritt (f) hergestellt wurden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Trennung durch Gelelektrophorese oder Chromatographie erfolgt.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, ferner umfassend den Schritt der Identifizierung der aufgetrennten, amplifizierten Fragmente.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Identifizierung durch ein Sichtbar- machen erreicht wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die markierten Nucleotide sichtbar gemacht werden und die markierten Nucleotide Teil einer Sonde oder der amplifizierten Fragmente sind.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die markierten Nucleotide die markierten Nucleotide sind, die ein Teil der markierten Primer sind, welche in Anspruch 6 definiert sind.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Sichtbarmachen erreicht wird durch das Einfügen radioaktiver oder fluoreszierender alpha-dNTP in die cDNA-Fragmente während der PCR, wobei N = A, C, T, U oder G.

15. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei Schritt (b) unter Bedingungen durchgeführt wird, welche die Bildung von Fehlpaarungen zwischen Nucleotiden des ersten und zweiten cDNA-Strangs minimieren.

16. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die mRNA eukaryontischen, archebakterischen oder prokaryontischen Ursprungs ist.

17. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Expressionsprodukts in einer Zelle oder Gruppe von Zellen, umfassend die Bereitstellung einer RNA enthaltenden Probe einer Zelle oder Gruppe von Zellen und Verwenden dieser Probe in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 und einem anschließenden Vergleich der auf diese Weise identifizierten, amplifizierten cDNA-Fragmente mit dem Inhalt einer Datenbank, wobei der Inhalt dieser Datenbank eine computergenerierte Liste von Molekulargewichten von Restriktions-DNA-Fragmenten von bekannten Sequenzen umfasst, wobei die Liste erstellt wurde durch

- Eingeben und Speichern von DNA-Sequenzdaten in eine Datenbank als virtuelle DNA- Sequenzen,

- anschließendes Simulieren einer Spaltung der virtuellen DNA-Sequenzen mit mindestens einer Restriktionsendonuclease und Speichern der resultierenden simulierten Spaltprodukte als virtuelle, gespaltene DNA-Fragmente,

- Simulieren einer Ligierung der virtuell gespaltenen Fragmente mit mindestens zwei Adapterfragmenten und Speichern der resultierenden, virtuell ligierten DNA-Fragmente,

- für jede einzelne Kombination von Primern, die in Schritt (f) verwendet werden, Gruppieren der virtuell verknüpften DNA-Fragmente, die für die Amplifikation mit der Kombination von Primern empfänglich sind, zu einer Gruppe,

- Bestimmen des absoluten und/oder relativen Molekulargewichts jedes virtuell ligierten DNA-Fragments in jeder Gruppe, und

- Ausgabe des Inhalts jeder Gruppe in Form einer Liste umfassend die absoluten und/oder relativen Molekulargewichte der virtuell ligierten Fragmente in dieser Gruppe.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die eingegebenen DNA-Sequenzdaten verknüpft sind mit Daten, die sich auf den genetischen Ursprung der DNA-Sequenzdaten beziehen, und gegebenenfalls mit Daten, die sich auf funktionelle Merkmale beziehen, die sich auf den genetischen Ursprung beziehen.

19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die ausgegebenen Daten ferner Informationen über den genetischen Ursprung des virtuell ligierten DNA-Fragments und gegebenenfalls Informationen über funktionelle Merkmale liefern, die mit dem genetischen Ursprung verbunden sind.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei der Vergleich durchgeführt wird durch die Eingabe der identifizierten amplifizierten DNA-Fragmente in einem Format, welches den automatischen Vergleich mit der Datenbankausgabe ermöglicht, oder, alternativ, durch Ausgabe der Datenbankausgabe in einem Format, welches den direkten Vergleich zwischen den getrennten amplifizierten cDNA-Fragmenten und der Datenbankausgabe erlaubt.

21. Verfahren zur Bestimmung von Änderungen in der Expression, im Vergleich zur Expression in einer Referenzzelle oder einer Referenzgruppe von Zellen, eines Expressionsprodukts in einer Zelle oder Gruppe von Zellen, welche unter einer ersten Reihe von Bedingungen zur Beeinflussung des Expressionsmusters dieser Zelle oder Gruppe von Zellen inkubiert wird, wobei die Referenzzelle oder die Referenzgruppe von Zellen einer zweiten Reihe von Bedingungen unterworfen wird, das Verfahren umfassend die Bereitstellung einer RNA enthaltenden Probe von dieser Zelle oder Gruppe von Zellen und Verwendung dieser Probe in Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei Daten erhalten werden, welche die amplifizierten cDNA- Fragmente, die aus der Probe erhalten werden, beschreiben, Bereitstellung von Referenzdaten, welche die amplifizierten cDNA-Fragmente, die aus RNA enthaltenden Referenzproben von der Referenzzelle oder der Referenzgruppe von Zellen erhalten wurden, beschreiben, wobei diese Referenzdaten erhalten wurden durch eine vorangegangene Verwendung der Referenzproben in dem Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, anschließende Durchführung eines Vergleichs der Daten und der Referenzdaten zur Identifizierung solcher cDNA-Fragmente, welche in unterschiedlichem Grad in diesen beiden Datensätzen exprimiert werden, und anschließend Verwendung der unterschiedlich exprimierten cDNA-Fragmente, um zu bestimmen, bei welchen Expressionsprodukten unterschiedliche Expressionsgrade auftreten.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Daten und Referenzdaten gewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus den scheinbaren Molekulargewichten der amplifizierten DNA- Fragmente, dem Mr dieser amplifizierten DNA-Fragmente, der absoluten Menge der amplifizierten DNA-Fragmente und der relativen Mengen der amplifizierten DNA- Fragmente.

23. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Referenzdaten aus einer Datenbank stammen, welche nach Anspruch 22 definierte Referenzdaten umfasst und gegebenenfalls weitere Informationen, die sich auf den genetischen Ursprung jedes amplifizierten cDNA- Fragments dieser Referenz beziehen.

24. Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung in einem Individuum, wobei die Erkrankung durch einen abweichenden Expressionsgrad von mindestens einem Expressionsprodukt in mindestens einem Zelltyp gekennzeichnet ist, umfassend die Bereitstellung einer RNA enthaltenden Probe, die aus mindestens einem Zelltyp gewonnen wird, Verwendung dieser Probe in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei die dabei erhaltenen Daten die amplifizierten cDNA- Fragmente dieser Probe beschreiben, das Bereitstellen von Referenzdaten, welche die amplifizierten cDNA-Fragmente beschreiben, welche aus einer RNA enthaltenden Referenzprobe stammen, welche aus dem gleichen Zelltyp von einem Individuum, welches nicht unter dieser Erkrankung leidet, gewonnen wurde, wobei diese Referenzdaten erhalten wurden durch eine vorangegangene Verwendung der Referenzprobe in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, und anschließendem Vergleich der erhaltenen Daten mit den Referenzdaten im Hinblick auf die cDNA-Fragmente, von welchen bekannt ist, dass diese mit der Erkrankung in Verbindung stehen, und Abschätzen, ob eine signifikante Differenz zwischen den Daten und Referenzdaten besteht, um festzustellen, ob der Expressionsgrad eines Expressionsprodukts abweicht oder nicht.

25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Daten und die Referenzdaten ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus den scheinbaren Molekulargewichten der amplifizierten DNA-Fragmente, dem Mr der amplifizierten DNA-Fragmente, der absoluten Menge der amplifizierten DNA-Fragmente und den relativen Mengen der amplifizierten DNA- Fragmente.

26. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Referenzdaten aus einer Datenbank stammen, welche die in Anspruch 25 definierten Referenzdaten umfasst und gegebenenfalls weitere Informationen, die sich auf den genetischen Ursprung jedes amplifizierten cDNA-Fragments dieser Referenz beziehen.

27. Verfahren zur Herstellung einer mit cDNA-Fragmenten beschichteten Oberfläche (Chip), umfassend

- Verwendung einer RNA enthaltenden Probe in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 14, und

- Übertragen der getrennten amplifizierten cDNA-Fragmente auf eine Chip-Oberfläche, welche für eine stabile Bindung der getrennten amplifizierten cDNA-Fragmente angepaßt ist, wobei das relative räumliche Verteilungsmuster aufrechterhalten wird.

28. Verfahren zur Herstellung einer mit cDNA-Fragmenten beschichteten Oberfläche (Chip), umfassend

- Verwendung einer RNA enthaltenden Probe in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7,

- Auftrennung der so erhaltenen amplifizierten cDNA-Fragmente durch Elektrophorese auf einer spezieller Oberfläche, welche für eine stabile Bindung der getrennten amplifizierten cDNA-Fragmente angepasst ist, wobei das relative Verteilungsmuster nach der Elektrophorese erhalten bleibt.

29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Elektrophorese in Form einer Mikroelektrophorese durchgeführt wird.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 29, wobei der Transfer durch eine elektrophoretische Blot-Technik gewährleistet wird.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 29, wobei der Transfer durch fotoaktive, organische oder anorganische chemische Techniken gewährleistet wird.

32. Oberfläche, an welche cDNA stabil gebunden ist, wobei die Oberfläche erhältlich ist durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 31.

33. Verfahren zur Durchmusterung von Genen innerhalb einer Familie von Genen, umfassend die Bereitstellung einer Oberfläche nach Anspruch 32, wobei die an die Oberfläche stabil gebundene eDNA unter wenig stringenten Bedingungen hybridisiert wird mit einer nachweisbar markierten Nucleinsäure, die kennzeichnend für eine Familie von Genen ist, und anschließender Analyse der Fragmente auf dem Chip, für die eine Hybridisierung beobachtet wurde, und auf diesem Wege Bestimmen, ob diese Fragmente zur gleichen Genfamilie gehören.

34. Verfahren zur Bestimmung einer Differenz im Expressionsmuster zwischen einer ersten Zelle oder einem Zelltyp und einer zweiten Zelle oder einem Zelltyp, umfassend die Bereitstellung von markierten RNA- oder cDNA-Proben der ersten und der zweiten Zelle oder des Zelltyps, anschließend das Inkontaktbringen jede dieser Proben mit einer Oberfläche nach Anspruch 32 und anschließender Nachweis der Menge und Verteilung von gebundener, markierter RNA oder cDNA jeder Probe.

35. Verfahren zur Durchmusterung von Wechselwirkungen zwischen einem vorher ausgewählten Protein und einem Polypeptidfragment, umfassend die Bereitstellung einer unterteilten Bibliothek von amplifizierten cDNA-Fragmenten gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, gegebenenfalls Anpassen der Enden der Mitglieder dieser Bibliothek, um das Einfügen in einen Vektor zu erleichtern, das Einfügen der Fragmente in Vektoren, das Transformieren einer Population geeigneter Wirtszellen mit den Vektoren, Züchten der Wirtszellen unter Bedingungen, welche die Expression von korrekt eingefügten cDNA-Fragmenten in der Wirtszelle ermöglichen und anschließende Analyse der Polypeptidfragmente, die von den eingefügten cDNA- Fragmenten codiert werden, bezüglich ihrer Wechselwirkung mit dem vorher ausgewählten Protein.

36. Verfahren nach Anspruch 35, wobei die Polypeptidfragmente mit einer Zweihybrid- Technik analysiert werden, wobei die Wirtszellen eukaryontische Zellen sind, welche gepaart oder mit Nucleinsäurematerial transfiziert werden, das das vorher ausgewählte Protein codiert, wobei die erfolgreiche Paarung/Transfektion dieser Zelle(n) zur Bereitstellung einer Zelle oder von Zellen führt, in welchen die Wechselwirkung zwischen dem vorher ausgewählten Protein und einem Polypeptidfragment ein nachweisbares Signal auslöst.

37. Verfahren nach Anspruch 36, wobei ein Pilz, wie eine Hefezelle, für die Paarung/Transfektion verwendet wird.

38. Verfahren nach einem der Ansprüche 36 oder 37, wobei das nachweisbare Signal durch das grün fluoreszierende Protein bereitgestellt wird.