DE69428167T2

DE69428167T2 - Reagenz und Verfahren für reverse Transkription bei hoher Temperatur, verbunden mit einer Polymerase-Kettenreaktion

Info

Publication number: DE69428167T2
Application number: DE69428167T
Authority: DE
Inventors: David H Gelfand; Thomas W Myers; Christopher L Sigua
Original assignee: HOFFMANN LA ROCHE; F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: HOFFMANN LA ROCHE; F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1993-07-01
Filing date: 1994-06-20
Publication date: 2002-05-29
Anticipated expiration: 2014-06-21
Also published as: ES2161731T3; EP0632134A3; AU675318B2; DK0632134T3; CA2127188C; JP3097893B2; CA2127188A1; ATE205259T1; EP0632134A2; DE69428167D1; EP0632134B1; AU6594694A; JPH0759599A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie und stellt Verfahren und Reagenzien bereit, die für die Replikation und Amplifikation von Ribonucleinsäure (RNA)-Sequenzen besonders nützlich sind. Unter einem anderen Gesichtspunkt stellt die Erfindung Verfahren zum Sterilisieren einer reversen Transkriptionsreaktion, einer homogenen reversen Transkriptions/Amplifikationsreaktion oder einer Arnplifikationsreaktion, die mit Nucleinsäuren verunreinigt ist, die von einer vorangehenden reversen Transkriptionsreaktion stammen, bereit. Unter einem weiteren Gesichtspunkt stellt die Erfindung Verfahren zur reversen Transkription eines Ziel-RNA-Moleküls in einer Probe bereit.
Für eine Beschreibung des verwandten Fachgebiets und eine Erklärung der Begriffe, die in der vorliegenden Patentanmeldung verwendet werden, wird auf eine verwandte Patentanmeldung verwiesen, und zwar die Internationale Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 91/09944, die Verfahren zur reversen Transkription bei hoher Temperatur bereit stellt.
In Abstract C-344, Seite 181, 94th Meeting, 23.-27. Mai, Las Vegas, wird ein Puffer erwähnt, der Mn²&spplus; zur RT-PCR zusammen mit der Thermus thermophilus-DNA-Polymerase enthält. Das Dokument ist nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht.
Im Hinblick auf die vorliegende Erfindung wird angemerkt, daß über die Taq-Polymerase berichtet wurde, daß sie cDNA unter Verwendung von Mg²&spplus; als das divalente Metallion ineffizient synthetisiert (Iones und Foulkes, Nuc. Acids Res. 176 (1989), 8387-8388). Tse und Forget, Gene 88 (1990), 293-296; und Shaffer et al., Anal. Biochem. 190 (1990), 292- 296, beschrieben Verfahren zur Amplifikation von RNA unter Verwendung der Taq-Polymerase und von Mg²&spplus;-Ionen. Jedoch sind die Verfahren ineffizient und unempfindlich. Zum Beispiel zeigen Tse und Forget, daß 4 ug Gesamt-RNA erforderlich sind, um eine ausreichende Menge des PCR-Produkts unter Verwendung eines in großer Zahl exprimierten mRNA-Zielmoleküls zu erzeugen, damit es auf einem Ethidiumbromid gefärbten Gel sichtbar gemacht werden kann. Außerdem waren falsch positive Signale von einer DNA-Matrize (PCR-Produkt von vorangehenden Reaktionen oder eine Plasmid-DNA-Verunreinigung) nicht eindeutig ausgeschlossen.
Die vorliegende Erfindung spricht diese Notwendigkeit an und stellt verbesserte Verfahren und Reagenzien, insbesondere verbesserte Puffersysteme für die cDNA-Synthese bei hoher Temperatur durch hitzeaktive DNA-Polymerasen bereit. Die erfindungsgemäßen Reagenzien sind besonders für einen kombinierten Ein-Enzym/ein-Röhrchen-reversen Transkriptions/Amplifikationstest unter Verwendung einer hitzestabilen DNA-Polymerase geeignet.
Unter einem Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Amplifikation eines Ziel-RNA-Moleküls in einer Probe bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (a) Behandeln der Probe in einem Reaktionsgemisch, umfassend einen ersten und zweiten Primer, wobei der erste Primer ausreichend komplementär zu der Ziel-RNA ist, um damit zu hybridisieren und die Synthese eines cDNA-Moleküls zu veranlassen, das komplementär zu der Ziel-RNA ist, und der zweite Primer ausreichend homolog zu der Ziel-RNA ist, um mit der cDNA zu hybridisieren und die Synthese eines Verlängerungsprodukts zu veranlassen, und eine hitzestabile DNA-Polymerase, in Gegenwart aller vier Desoxyribonucleosidtriphosphate in einem geeigneten Puffer, umfassend einen Metallpuffer, der die Konzentration des divalenten Kations puffert und der in einer bevorzugten Ausführungsform sowohl den pH-Wert als auch die Konzentration des divalenten Kations puffert, wobei die Reaktion bei einer Temperatur durchgeführt wird, die ausreicht, damit die hitzestabile DNA-Polymerase die Synthese eines Verlängerungsprodukts des ersten Primers veranlassen kann, um ein cDNA-Molekül bereitzustellen, das komplementär zu der Ziel-RNA ist; (b) Behandeln des Reaktionsgemisches bei einer geeigneten Temperatur, um einzelsträngige cDNA bereitzustellen; (c) Behandeln des Reaktionsgemisches bei einer geeigneten Temperatur, damit die hitzestabile DNA-Polymerase die Synthese eines Verlängerungsprodukts des zweiten Primers veranlassen kann, um ein doppelsträngiges cDNA-Molekül bereitzustelleil; und (d) Amplifikation des doppelsträngigen cDNA-Moleküls von Schritt (c) durch eine Polymerasekettenreaktion. Die geeigneten Puffer der Schritte (a) und (d) umfassen ferner ein Pufferungsmittel, das das divalente Kation bindet, wobei das divalente Kation vorzugsweise Mn²&spplus; ist, wobei der KM-Wert der Bindungsreaktion des divalenten Kations des Puffers bei 20ºC und 0,1 M Ionenstärke zwischen 10 und 10&sup6;, vorzugsweise zwischen 10² und 10&sup4;, mehr bevorzugt zwischen 102,5 und 103,5 liegt. Das Pufferungsmittel ist vorzugsweise eine zwitterionische Verbindung, die Wasserstoffionenpufferung bereitstellt, wobei der pKa-Wert des Puffers bei 20ºC und 0,1 M Ionenstärke zwischen 7 und 9, vorzugsweise zwischen 7,5 und 8,5 liegt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Puffer ferner N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycin oder N[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycin und mehr bevorzugt ferner ein Acetatsalz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Natriumacetat, Kaliumacetat, Ammoniumacetat und Lithiumacetat. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Puffer Manganacetat (auch Mn(OAc)&sub2; oder Mn(CH&sub3;CO&sub2;)&sub2; geschrieben), Bicin-KOH (Bicin ist N,N-Bis(2- hydroxyethyl)glycin) und Kaliumacetat (auch KOAc oder KCH&sub3;CO&sub2; geschrieben). Die hitzestabile DNA-Polymerase ist vorzugsweise die Thermus aquaticus-DNA-Polymerase oder die Thermus thermophilus-DNA-Polymerase, mehr bevorzugt die rekombinante Tth-DNA- Polymerase. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Temperatur in Schritt (a) zwischen 40ºC und 80ºC.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum Sterilisieren von reversen Transkriptionsreaktionen, Amplifikationsreaktionen und homogenen reversen Transkriptions/Amplifikationsreaktionen, die mit Nucleinsäuren verunreinigt sind, die von vorangehenden reversen Transkriptions-, Amplifikations- und/oder homogenen reversen Transkriptions/Amplifikationsreaktionen stammen, bereit. Zum Beispiel stellt die Erfindung ein Verfahren zum Sterilisieren einer reversen Transkriptionsreaktion, die mit Nucleinsäuren verunreinigt ist, die von einer vorangehenden reversen Transkription stammen, bereit, wobei die vorangehende reverse Transkription vom Mischen üblicher und unüblicher Nucleosidtriphosphate in ein reverses Transkriptionsreaktionsgemisch und der Erzeugung von cDNA-Produkten mit darin eingebauten üblichen und unüblichen Nucleotiden herrührt, wobei das Verfahren den Abbau der verunreinigenden Nucleinsäuren durch Hydrolyse kovalenter Bindungen der unüblichen Nucleotide umfaßt.
Unter einem anderen Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Sterilisieren einer reversen Transkriptionsreaktion, die mit Nucleinsäuren verunreinigt ist, die von einer vorangehenden reversen Transkriptions/Amplifikationsreaktion stammen, bereit, wobei die vorangehende homogene Reaktion vom Mischen üblicher und unüblicher Nucleosidtriphosphate in ein homogenes reverses Transkriptions/Amplifikationsreaktionsgemisch und der Erzeugung von cDNA- und amplifizierten Produkten mit darin eingebauten üblichen und unüblichen Nucleotiden herrührt, wobei das Verfahren den Abbau der verunreinigenden amplifizierten Produkte durch Hydrolyse kovalenter Bindungen der unüblichen Nucleotide umfaßt.
In einer Ausführungsform umfaßt dieses Verfahren den Abbau des verunreinigenden Nucleinsäureprodukts mit Uracil-DNA-Glykosylase in einer wäßrigen Lösung, die eine Ziel-Nucleinsäuresequenz enthält; wobei das Verfahren ferner die Inaktivierung der Glykosylase in Gegenwart der Ziel-Nucleinsäuresequenzen (wie durch Erhitzen) und die reverse Transkription und Amplifikation der Zielsequenz durch eine hitzestabile DNA-Polymerase umfaßt. Der Abbau des verunreinigenden Produkts kann erzielt werden, während das Produkt in Kontakt mit einem Reaktionssystem zur reversen Transkription/Amplifikation einer Nucleinsäure ist. Auf diese Weise kann man eine Probe zur reversen Transkription/Amplifikation herstellen, die Probe durch das vorliegende Verfahren behandeln, um jegliche verunreinigende Nucleinsäure abzubauen, die von einer vorangehenden reversen Transkriptions-, Amplifikätions- und/oder homogenen reversen Transkriptions/Amplifikationsreaktion stammt, und dann die Ziel-Nucleinsäure in der Probe amplifizieren, ohne daß das Reaktionsvolumen oder die Zusammensetzung zwischen den Schritten angepaßt werden muß.
Unter einem anderen Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung Reagenzien bereit, die einen Metallpuffer umfassen, der die Manganionenkonzentration puffert und der in einer bevorzugten Ausführungsform sowohl den pH-Wert als auch die Manganionenkonzentration puffert. Die Puffer erweitern den Bereich der Mangan- und dNTP-Konzentrationen, der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann, wodurch die Stabilität des Tests erhöht und Probleme mit Mangan-Chelatbildnern, die während der Probenherstellung zugesetzt werden, vermindert werden. Die Puffer ermöglichen die Verwendung höherer dUTP-Konzentrationen in den erfindungsgemäßen Sterilisierungsverfahren, wodurch der dUTP-Einbau in einige Zielmoleküle verbessert und die Wirksamkeit der Sterilisierung durch die Verringerung der Konzentration des divalenten Kations und die Erniedrigung der Ionenstärke des Reaktionsgemisches erhöht wird. Die Puffer verringern auch die Mn²&spplus;-katalysierte RNA-Hydrolyse, was längere reverse Transkriptionszeiten für die reverse Transkription von seltenen und/oder längeren Zielmolekülen ermöglicht. Außerdem sind die erfindungsgemäßen Puffer und Reagenzien (z. B. dNTPs) wegen der erweiterten Konzentrationstoleranzen einfacher herzustellen und stellen verbesserte Lagerungs- und Stabilitätseigenschaften bereit. Folglich stellt die vorliegende Erfindung einen Puffer zur Durchführung einer homogenen reversen Transkriptions/Ampliflkationsreaktion bereit, der ein divalentes Kation, ein monovalentes Kation und ein Pufferungsmittel umfaßt, wobei das divalente Kation Mn²&spplus; ist und das Pufferungsmittel ein Chelatbildner ist, der Mn²&spplus; bindet, wobei der KM-Wert der Bindungsreaktion des Mangans des Pufferungsmittels bei 20ºC und 0,1 M Ionenstärke zwischen 10 und 10&sup6;, vorzugsweise zwischen 10² und 10&sup4;, mehr bevorzugt zwischen 102,5 und 103,5 liegt. In einem bevorzugten Puffer ist das Pufferungsmittel eine zwitterionische Verbindung, die Wasserstoffionenpufferung bereitstellt, wobei der pKa-Wert des Puffers bei 20ºC und 0,1 M Ionenstärke zwischen 7 und 9, vorzugsweise zwischen 7,5 und 8,5 liegt. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt der Puffer Manganacetat, Bicin-KOH und Kaliumacetat. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur reversen Transkription eines Ziel-RNA-Moleküls in einer Probe breit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: Behandeln der Probe in einem Reaktionsgemisch, umfassend einen Primer, wobei der Primer ausreichend komplementär zu der Ziel- RNA ist, um damit zu hybridisieren und die Synthese eines cDNA-Moleküls zu veranlassen, das komplementär zu der Ziel-RNA ist, eine hitzeaktive DNA-Polymerase, vier Desoxyribonucleosidtriphosphate und einen geeigneten Puffer, wobei der Puffer ein divalentes Kation, vorzugsweise Mn²&spplus; umfaßt, bei einer Temperatur, die ausreicht, damit die hitzeaktive DNA- Polymerase die Synthese eines Verlängerungsprodukts des Primers veranlassen kann, um ein cDNA-Molekül bereitzustellen, das komplementär zu der Ziel-RNA ist, wobei der Puffer ferner ein Pufferungsmittel umfaßt, das Mn²&spplus; bindet, wobei der KM-Wert der Bindungsreaktion des Mangans des Puffers bei 20ºC und 0,1 M Ionenstärke zwischen 10 und 106, vorzugsweise zwischen 102 und 104, mehr bevorzugt zwischen 102,5 und 103,5 liegt.
Für eine ausführliche Beschreibung des Hintergrunds der vorliegenden Erfindung wird auf WO 91/09944 verwiesen, die hier unter Bezugnahme eingeschlossen ist.
Die folgenden Figuren können zum Verständnis der vorliegenden Erfindung beitragen.
Fig. 1 veranschaulicht die Ergebnisse der in Beispiel 7 beschriebenen Verlängerungsreaktionen, wobei die Reaktionseffizienz über einen Bereich von Mangankonzentrationen unter Verwendung von verschiedenen Pufferbedingungen untersucht wurde.
Fig. 2 veranschaulicht die Ergebnisse der in Beispiel 9 beschriebenen RTIPCR, wobei der verwendbare dNTP-Konzentrationsbereich unter Verwendung von verschiedenen Pufferbedingungen untersucht wurde.
Die vorliegende Erfindung betrifft verbesserte Verfahren zur wirksamen reversen Transkription und Amplifikation von RNA. So werden z. B. Verfahren für ein kombiniertes · Ein-Röhrchen-Verfahren bereitgestellt, das die Notwendigkeit erübrigt, daß das Reaktionsgefäß zur Modifikation der Reaktionskomponenten zwischen dem reversen Transkriptionsschritt und dem Amplifikationsschritt geöffnet werden muß. Auf diese Weise werden die Effekte einer mitgeführten Verunreinigung von reversen Transkriptions/Ampliflkationstests von RNA aufgrund von reverse transkribierten oder amplifizierten Produkten, die von vorangehenden Reaktionen stammen, auf ein Minimum verringert.
Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen das Behandeln einer Probe, enthaltend die RNA-Matrize, mit einem Oligonucleotidprimer, wobei der Primer ausreichend komplementär zu der RNA-Matrize ist, um damit zu hybridisieren, und eine hitzeaktive DNA- Polymerase in Gegenwart aller vier Desoxyribonucleosidtriphosphate in einem geeigneten Puffer, umfassend einen Metallpuffer, der die Manganionenkonzentration puffert und der in einer bevorzugten Ausführungsform sowohl den pH-Wert als auch die Manganionenkonzentration puffert, und wobei die Reaktion bei einer Temperatur durchgeführt wird, die ausreicht, damit der Primer mit der RNA-Matrize hybridisieren kann und die hitzeaktive DNA-Polymerase die Polymerisierung der Desoxyribonucleosidtriphosphate katalysieren kann, um eine cDNA-Sequenz herzustellen, die komplementär zu der Sequenz der RNA-Matrize ist. Erfindungsgemäß kann die DNA-Polymerase sowohl hitzestabil als auch hitzeaktiv sein.
Unter einem anderen Gesichtspunkt kann ein Primer, der zur Anlagerung an eine RNA-Matrize geeignet ist, auch zur Amplifikation durch PCR geeignet sein. Für die PCR stellt ein zweiter Primer, der komplementär zu dem revers transkribierten cDNA-Strang ist, eine Initiationsstelle für die Synthese eines Verlängerungsprodukts bereit.
Bei der Amplifikation eines RNA-Moleküls durch eine hitzeaktive DNA-Polymerase ist die erste Verlängerungsreaktion die reverse Transkription unter Verwendung einer RNA-Matrize, und ein DNA-Strang wird hergestellt. Die zweite Verlängerungsreaktion unter Verwendung der DNA-Matrize erzeugt ein doppelsträngiges DNA-Molekül. Folglich stellt die Synthese eines komplementären DNA-Strangs von einer RNA-Matrize durch eine hitzeaktive DNA-Polymerase das Ausgangsmaterial für die Amplifikation bereit.
Hitzestabile DNA-Polymerasen können in einer kombinierten Ein-Enzym-reversen Transkriptions/Amplifikationsreaktion verwendet werden. Es werden Verfahren für sowohl nichthomogene als auch homogene RT/PCR-Tests bereitgestellt. Der Begriff "homogen", so wie hier verwendet, bezieht sich auf eine in zwei Stufen ablaufende Einzusatz-Reaktion zur reversen Transkription und Amplifikation eines RNA-Zlehnoleküls. Mit homogen ist gemeint, daß das Reaktionsgefäß nach dem reversen Transkriptionsschritt nicht geöffnet werden muß oder die Reaktionskomponenten vor dem Amplifikationsschritt anderweitig angepaßt werden müssen. Bei einer nichthomogenen RT/PCR-Reaktion werden nach der reversen Transkription und vor der Amplifikation irgendeine oder mehrere der Reaktionskomponenten, einschließlich des Enzyms, der Primer, des divalenten Kations, der Salze, des pH-Werts oder der dNTPs, angepaßt, zugegeben oder verdünnt.
Der Begriff "homogenes reverses Transkriptions/Amplifikationsreaktionsgemisch" bezieht sich auf eine wäßrige Lösung, umfassend die verschiedenen Reagenzien, die zur reversen Transkription und Amplifikation einer Ziel-RNA verwendet werden. Diese schließen Enzyme, wäßrige Puffer, Salze, Oligonucleotidprimer, die Ziel-Nucleinsäure und Nucleosidtriphosphate ein. In Abhängigkeit von dem Zusammenhang kann das Gemisch entweder ein komplettes oder ein inkomplettes homogenes reverses Transkriptions/Amplifikationsreaktionsgemisch sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch vereinfachte und verbesserte Verfahren zum Nachweis von RNA-Zielmolekülen in einer Probe. Diese Verfahren verwenden hitzestabile DNA-Polymerasen, um die reverse Transkription, die Sekundärstrang-cDNA-Synthese und gegebenenfalls die Amplifikation zu kafalysieren. Frühere Verfahren erforderten zwei Sätze von Inkubationsbedingungen, die durch die Verwendung verschiedener Enzyme für jedes Verfahren notwendig gemacht wurden. Die erfindungsgemäßen Verfahren stellen eine RNA-Transkription und -Amplifikation bereit, die eine erheblich verbesserte Spezifität und weniger Sehritte als vorangehende RNA-Clonierungs- und Diagnoseverfahren aufweist. Diese Verfahren können zur Verwendung in Kits für die Labor- oder klinische Analyse angepaßt werden.
Der Begriff "reverses Transkriptionsreaktionsgemisch" bezieht sich auf eine wäßrige Lösung, umfassend die verschiedenen Reagenzien, die zur reversen Transkription einer Ziel-RNA verwendet werden. Diese schließen Enzyme, wäßrige Puffer, Salze, Oligonucleotidprimer, die Ziel-Nueleinsäure und Nucleosidtriphosphate ein. In Abhängigkeit von dem Zusammenhang kann das Gemisch entweder ein komplettes oder ein inkomplettes reverses Transkriptionsreaktionsgemisch sein.
Zur Amplifikation des cDNA-Produkts steht dem Fachmann eine Reihe von Verfahren zur Verfügung. So wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Amplifikationsreaktionssystem" auf ein in-vitro-Mittel zur Vervielfältigung der Kopien einer Zielsequenz einer Nucleinsäure. Solche Verfahren schließen, aber sind nicht darauf begrenzt, Polymerase (PCR)-, DNA-Ligase (LCR)-, Qβ-RNA-Replicase- und auf RNA-Transkription basierende (TAS und 3SR) Amplifikationssysteme ein. Jedoch weisen die hier beschriebenen homogenen RT/PCR-Verfahren gegenüber von in mehreren Stufen ablaufenden Multienzym- Amplifikationsverfahren, wie 3SR, insofern erhebliche Vorteile auf, als nur ein Polymeraseenzym verwendet wird.
Tatsächlich können mehrere verschiedene Nucleinsäure-Amplifikationssysteme von der erheblichen Erweiterung der Optima des divalenten Metallions (z. B. Mn²&spplus;) und der überraschenden Erweiterung der deutlich voneinander verschiedenen zweifachen Optima für die RNA-Matrize-gerichtete Synthese und die DNA-Matrize-gerichtete Synthese profitieren. Alle diese Systeme basieren insofern auf dem PCR-Verfahren, als ein Produkt, das in einem Zyklus oder in einem Teil einer Reaktion synthetisiert wurde, als Matrize in einem folgenden Zyklus oder in einem folgenden Teil einer Reaktion dient. Bei der Ligasekettenreaktion (LCR, Wu und Wallace, Genomics 4 (1989), 560-569; und Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 189-193) werden vier Oligonucleotide verwendet, um ein gewünschtes DNA-Segment mit einer DNA-Ligase in Gegenwart von Mg²&spplus; und notwendigen Cofaktoren zu amplifizieren. Die Verwendung von stringenten Aneinanderlagerungstemperaturen und einer hitzeaktiven und hitzebeständigen DNA-Ligase verbessert die Empfindlichkeit dieses Verfahrens und die Fähigkeit, allele Unterschiede zu unterscheiden, erheblich. Unabhängig davon, ob eine native thermophile DNA-Ligase (z. B. Takahashi, Yamaguchi und Uchida, J. Biol. Chem. 259 (1984), 10041-10047, hier unter Bezugnahme eingeschlossen) oder eine rekombinante thermophile DNA-Ligase (z. B. Barany und Gelfand, Genie 109 (1991), 1-11) verwendet wird, sind die erfindungsgemäßen Puffer und Pufferungsmittel zur Erweiterung der Optima des Metallions, zur Erleichterung von sowohl der RNA-Matrize-gerichteten Ligierung als auch der DNA-Matrize-gerichteten Ligierung und zur Erhöhung der Stabilität der RNA- Matrizen bei erhöhten Temperaturen in Gegenwart von divalenten Metallionen verwendbar.
In ähnlicher Weise profitieren von der PCR und LCR abgeleitete Nucleinsäure- Amplifikationsverfahren, die zwei oder mehrere Enzyme verwenden (z. B. Polymerase- Ligase-Kettenreaktion, Barany, PCR Methods and Applic. 1 (1991), 5-16; oder Gap-LCR, PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 90/01069; oder Reparatur-Kettenreaktion, Europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer EP-A-439,182), von den erfindungsgemäßen Puffern und Pufferungsmitteln wegen der Erweiterung der Optima des divalenten Metallions für die RNA-Matrize-gerichtete Synthese und/oder DNA-Matrize-gerichtete Synthese und der erhöhten Stabilität der RNA-Matrizen bei erhöhten Temperaturen in Gegenwart von divalenten Metallionen. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn die mit verschiedenen Nucleinsäuren in Wechselwirkung tretenden Enzyme, die in dem Verfahren verwendet werden, normalerweise unterschiedliche Optima für das divalente Metallion auf weisen.
In ähnlicher Weise profitieren isothermale Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren (z. B. 35R, Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 1173-1177; Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 1874-1878; PCT-Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 92/0880A; NASBA, US-Patent Nr. 5,130; 238), die mehrere Enzyme verwenden, von dieser Erfindung und der Erweiterung der Optima für das divalente Metallion für die RNA-Matrize-gerichtete Synthese und/oder DNA-Matrize-gerichtete Synthese. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn die mit verschiedenen Nucleinsäuren in Wechselwirkung tretenden Enzyme, die in dem Verfahren verwendet werden, normalerweise unterschiedliche Optima für das divalente Metallion aufweisen. Die vorstehend beschriebenen isothermalen Amplifikationssysteme verwenden alle mesophile oder nicht-hitzeaktive und hitzeempfindliche, Nucleinsäure-bindende Enzyme. Isothermale Amplifikationssysteme auf der Grundlage von analogen hitzeaktiven und hitzebeständigen Enzymen (z. B. Substitution von [1] der Thermus thermophilus-DNA-Polymerase durch die AMV- oder MoMuLV-reverse Transkriptase, [2] der Thermus thermophilus-RNase H [Itaya und Kondo, Nuc. Acids Res. 19 (1991), 4443-4449) durch die E. coli-RNase H und [3] der Thermus thermophilus-RNA- Polymerase aus Phage φ YS40 (Sakaki und Oshima, J. Virol. 15 (1975), 1449-1453) durch RNA-Polymerasen der Bakteriophagen T3, T7 oder SP6) profitieren aus den vorstehend angegebenen Gründen sowie wegen der erhöhten Stabilität der RNA-Matrizen bei erhöhten Temperaturen in Gegenwart von divalenten Metallionen und der erfindungsgemäßen Puffer und Pufferungsmittel besonders von den erfindungsgemäßen Puffern und Pufferungsmitteln.
Diese Erfindung ist nicht auf einbestimmtes Amplifikationssystem begrenzt. So wie andere Systeme entwickelt werden, können solche Systeme von der Durchführung dieser Erfindung profitieren. Eine jüngste Übersicht über Amplifikationssysteme wurde bei Abramson und Myers, Current Opinion in Biotechnology 4 (1993), 41-47, veröffentlicht.
Der Begriff "Amplifikationsreaktionsgemisch" bezieht sich auf eine wäßrige Lösung, umfassend die verschiedenen Reagenzien, die zur Amplifikation einer Ziel-Nucleinsäure verwendet werden. Diese schließen Enzyme, wäßrige Puffer, Salze, Amplifikationsprimer, die Ziel-Nucleinsäure und Nucleosidtriphosphate ein. In Abhängigkeit von dem Zusammenhang kann das Gemisch entweder ein komplettes oder inkomplettes Amplifikationsreaktionsgemisch sein. In der bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Amplifikationssystem die PCR und das Amplifikationsreaktionsgemisch ist ein PCR- Gemisch.
Der Begriff "Puffer", so wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Lösung, die ein Pufferungsmittel oder ein Gemisch aus Pufferungsmitteln und gegebenenfalls ein divalentes Kation und ein monovalentes Kation enthält.
Die vorliegende Erfindung ist zur Transkription und Amplifikation von RNA aus einer Reihe von Quellen geeignet. Die RNA-Matrize kann in einer Nucleinsäurezubereitung aus einem Organismus, zum Beispiel eine virale oder bakterielle Nucleinsäurezubereitung, enthalten sein. Die Zubereitung kann Zelltrümmer und andere Komponenten, gereinigte Gesamt-RNA oder gereinigte mRNA enthalten. Die RNA-Matrize kann eine Population von heterogenen RNA-Molekülen in einer Probe oder ein spezifisches Ziel-RNA-Molekül sein.
RNA, die zur Verwendung in den vorliegenden Verfahren geeignet ist, kann in einer biologischen Probe enthalten sein, die im Verdacht steht, eine spezifische Ziel-RNA zu enthalten. Die biologische Probe kann eine heterogene Probe sein, in der die RNA einen kleinen Teil der Probe ausmacht, wie zum Beispiel in einer Blutprobe oder einer Gewebeprobe, die durch eine Biopsie gewonnen wurde. Folglich ist das Verfahren zum klinischen Nachweis und zur Diagnose anwendbar. Das RNA-Zielmolekül kann auf eine bestimmte Erkrankung oder ein bestimmtes infektiöses Agens hinweisen.
Die RNA kann durch eine Reihe von Verfahren präpariert werden, wie diejenigen, auf die in WO 91/099444 verwiesen wird.
Synthetische Oligonucleotide können unter Anwendung des Triesterverfahrens von Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103 (1981), 3185-3191, hergestellt werden. Alternativ kann die automatisierte Synthese bevorzugt werden, zum Beispiel mit einem Biosearch 8700 DNA-Synthesegerät unter Verwendung der Cyanoethylphosphoramidit-Chemie.
Um die Verlängerung des Primers zu veranlassen, muß sich dieser Primer an die RNA-Matrize anlagern. Nicht jedes Nucleotid des Primers muß sich an die Matrize anlagern, damit die reverse Transkription veranlaßt wird. Die Primersequenz muß nicht die genaue Sequenz der Matrize widerspiegeln. Zum Beispiel kann ein nichtkomplementäres Nucleotidsegment an das 5'-Ende des Primers gebunden sein, wobei der Rest der Primersequenz komplementär zu der RNA ist. In einer anderen Ausführungsform können nichtkomplementäre Basen vereinzelt in den Primer eingefügt sein, mit der Maßgabe, daß die Primersequenz eine ausreichende Komplementarität zu der RNA-Matrize aufweist, damit die Hybridisierung erfolgen kann und die Synthese eines komplementären DNA-Strangs ermöglicht wird.
Frühere Verfahren der cDNA-Herstellung machten einen Prä-Aneinanderlagerungsschritt erforderlich. Die Destabilisierung der Sekundär- und Tertiärstruktur der RNA-Matrize kann erforderlich sein; um die Hybridisierung des Primers mit der RNA zu ermöglichen. Im allgemeinen wird die Aneinanderlagerung durch verschiedene Mittel erreicht und wird üblicherweise in Gegenwart eines Puffers für das Aneinanderlagern erzielt. Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, New York (1982), stellen Beispiele für Puffer für das Aneinanderlagern bereit. Aneinanderlagerungsverfahren schließen, aber sind nicht darauf begrenzt, die Inkubation des RNA/Primer-Gemisches bei einer hohen Temperatur für einen kurzen Zeitraum, gefolgt vom schrittweisen Kühlen oder schnellen Abkühlen des Gemisches in einem Trockeneis/Ethanol-Bad ein. Um zu verhindern, daß Sekundärstrukturwechselwirkungen innerhalb des Strangs die cDNA-Synthese oder die Primeranlagerung bei den niedrigen Temperaturen, die früher zur reversen Transkription verwendet wurden, stören, modifizieren einige Forscher die RNA-Matrize durch Behandlung mit chemischen Denaturierungsmitteln, wie Methylquecksilberhydroxid (Baily und Davidson, Anal. Biochem. 70 (1976), 75). Jedoch sind solche Denaturierungsmittel im allgemeinen stark toxische, karzinogene Verbindungen und müssen sorgfältig entfernt werden, um eine Enzymhemmung zu verhindern.
Obwohl der Primer sich an die Matrize anlagern muß, damit die reverse Transkription erfolgen kann, ist kein getrennter Aneinanderlagerungsschritt erforderlich. Da die hitzeaktive reverse Transkriptaseaktivität bei den hohen Temperaturen, die für die stringente Aneinanderlagerung bevorzugt werden, nicht irreversibel denaturiert wird, muß die denaturierte Matrize vor Zugabe der Polymerase nicht schnell abgekühlt oder schrittweise gekühlt werden. Frühere Verfahren machten erforderlich, daß die erhitzte denaturierte RNA in einer Weise gekühlt wurde, daß die aneinandergelagerte Primer-Matrize-Struktur aufrechterhalten wurde, während die Temperatur gesenkt wurde, um Bedingungen vorzusehen, die mit der Enzymaktivität vereinbar sind, üblicherweise 37-42ºC. Verfahren zur reversen Transkription von RNA bei hoher Temperatur erübrigen die Notwendigkeit eines Prä-Aneinanderlagerungsschritts und die Verwendung von chemischen Denaturierungsmitteln (vgl. z. B. Beispiele 1 bis 4). Die vorliegende Erfindung stellt verbesserte Mittel zur Destabilisierung der RNA-Sekundär- und -Tertiärstruktur bereit. Die erhöhten Temperaturen zur reversen Transkription mit einer hitzestabilen DNA-Polymerase destabilisieren die RNA-Sekundär- und -Tertiärstruktur weiterhin und dienen auch dazu, das doppelsträngige RNA-Zielmolekül zu denaturieren.
Die vorliegenden Verfahren sehen vor, daß die reverse Transkription des aneinandergelagerten Primer-RNA-Matrize-Moleküls durch eine hitzeaktive oder hitzestabile DNA-Polymerase katalysiert wird. So wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "hitzestabile Polymerase" auf ein Enzym, das hitzestabil oder hitzebeständig ist und die Polymerisierung der Desoxyribonucleotide katalysiert, um Primerverlängerungsprodukte zu bilden, die komplementär zu einem Nucleinsäurestrang sind. Hier verwendbare hitzestabile DNA-Polymerasen werden nicht irreversibel inaktiviert, wenn sie erhöhten Temperaturen für einen Zeitraum ausgesetzt werden, der notwendig ist, um die Destabilisierung einzelsträngiger Nucleinsäuren oder die Denaturierung doppelsträngiger Nucleinsäuren während der PCR- Amplifikation zu bewirken. Irreversible Dertaturierung des Enzyms bedeutet einen wesentlichen Verlust der Enzymaktivität. Vorzugsweise wird eine hitzestabile DNA-Polymerase unter Polymerisierungsbedingungen bei etwa 90-100ºC nicht irreversibel denaturiert.
Unter einem anderen erfindungsgemäßen Gesichtspunkt ist es nur wesentlich, daß die DNA-Polymerase für die reverse Transkription bei hoher Temperatur hitzeaktiv ist. So wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "hitzeaktive Polymerase" auf ein Enzym, das fähig ist, die Polymerisierung der Desoxyribonucleotide bei Temperaturen von gleich oder höher als 60ºC wirksam zu katalysieren, um ein Primerverlängerungsprodukt zu bilden, das komplementär zu einem Nucleinsäurematrizenstrang ist. Erfindungsgemäß weisen hitzeaktive Polymerasen zur reversen Transkription oberhalb von 50ºC eine maximale Aktivität auf. Die hitzeaktive DNA-Polymerase wird unter Bedingungen zur RNA-Destabilisierung und Primeranlagerung bei Temperaturen zwischen 50-80ºC nicht irreversibel denaturiert.
In den bereitgestellten Beispielen sind die hitzeaktiven DNA-Polymerasen auch hitzestabil; jedoch ist ein hitzeaktives, nicht-hitzestabiles Enzym zur Durchführung der vorliegenden Erfindung ebenfalls geeignet. Da die Herstellung einer cDNA von einer RNA-Matrize nicht mit wiederholten Denaturierungszyklen bei erhöhten Temperaturen verbunden ist, ist es nicht notwendig, daß Enzyme, die in dem Verfahren verwendet werden können, sowohl hitzestabil als auch hitzeaktiv sind. Jedoch wird in einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ein homogenes RT/PCR-Verfahren bereitgestellt. Da die Reaktionskomponenten zwischen dem RT- und dem PCR-Schritt nicht angepaßt werden müssen, wird eine hitzestabile DNA-Polymerase bevorzugt.
Die Erhitzungsbedingungen hängen von dem Puffer, der Salzkonzentration und den zu denaturierenden Nucleinsäuren ab. Natürlich ist bekannt, daß das Matrizenmolekül für die reverse Transkription von mRNA im allgemeinen einzelsträngig ist, und daher ist ein Denaturierungsschritt bei hoher Temperatur nicht erforderlich. Jedoch stellt eine doppelsträngige RNA auch eine geeignete Matrize für die beschriebenen reversen Transkriptions/Amplifikationsverfahren nach einem anfänglichen Denaturierungs- oder Strangtrennungsschritt bereit. Die vorliegende Erfindung stellt Puffer bereit, die den RNA-Abbau bei den hohen Temperaturen, die zur Hitzedenaturierung einer doppelsträngigen RNA erforderlich sind, verringern, wodurch die Wirksamkeit von reversen Transkriptions/Amplifikationsreaktionen von doppelsträngigen RNA-Matrizen verbessert wird. Die erfindungsgemäßen Puffer erlauben kurz gesagt eine Behandlung des kompletten Reaktionsgemisches bei einer sehr hohen Temperatur, um jegliche RNA-Sekundär- und -Tertiärstruktur unmittelbar vor dem Primeranlagerungsschritt der reversen Transkriptionsreaktion weiter zu destabilisieren (Beispiel 12). Doppelsträngige RNA-Matrizen können zum Beispiel das REO-Virus, "Blue Tongue"-Virus, Colorado-Zeckenfiebervirus und den Hefekillerfaktor einschließen.
Die Temperaturen zur RNA-Destabilisierung reichen typischerweise von 50-80ºC. Ein erster Primerverlängerungszyklus stellt eine doppelsträngige Matrize bereit, die zur Denaturierung und Amplifikation geeignet ist, wie vorstehend angegeben. Die Temperaturen zur Nucleinsäuredenaturierung reichen typischerweise von etwa 90 bis etwa 100ºC für einen Zeitraum, der ausreicht, um die Denaturierung zu veranlassen, welcher von der Nucleinsäurelänge, dem Basengehalt und der Komplementarität zwischen den in der Probe vorhandenen einzelsträngigen Sequenzen abhängt, aber typischerweise etwa 10 Sekunden bis 4 Minuten beträgt.
Die hitzestabile oder hitzeaktive DNA-Polymerase weist vorzugsweise ein Aktivitätsoptimum bei einer Temperatur oberhalb von etwa 40ºC, z. B. 60-80ºC auf. Bei Temperaturen weit oberhalb von 42ºC werden DNA- und RNA-abhängige Polymerasen, die von hitzestabilen oder hitzeaktiven DNA-Polymerasen verschieden sind, inaktiviert. Shimomave und Salvato, Gene Anal. Techn. 6 (1989), 25-28, beschreiben, daß die AMV-RT bei 42ºC eine maximale Aktivität aufweist. Bei 50ºC weist das Enzym eine 50%ige Aktivität auf, und bei 55ºC behält die AMV-RT nur 10% ihres optimalen Aktivitätswerts bei. Folglich ist die AMV-RT für die Katalyse von Polymerisierungsreaktionen bei hoher Temperatur unter Verwendung einer RNA-Matrize ungeeignet. Nur das vorliegende Verfahren stellt Verfahren zur wirksamen reversen Transkription bei hoher Temperatur mit hitzeaktiven DNA-Polymerasen bereit.
Die Hybridisierung eines Primers mit einer Matrize hängt von der Salzkonzentration sowie von der Zusammensetzung und der Länge des Primers ab. Bei der Verwendung einer hitzestabilen oder hitzeaktiven Polymerase kann die Hybridisierung bei höheren Temperaturen (z. B. 45-70ºC) erfolgen, die für eine erhöhte Selektivität und/oder höhere Stringenz des Priming bevorzugt werden. Höhere Temperaturoptima für das Polymeraseenzym ermöglichen, daß die reverse Transkription und anschließende Amplifikation von RNA infolge der Selektivität des Primer-Hybridisierungsverfahrens mit größerer Spezifität voranschreitet. Vorzugsweise reicht das Temperaturoptimum zur reversen Transkription von RNA von etwa 55- 75ºC, mehr bevorzugt 60-70ºC.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur reversen Transkription einer RNA-Matrize mit verbesserter Primer-gerichteten Spezifität bereit, das von einer hitzestabilen DNA-Polymerase katalysiert wird. Die offenbarten Verfahren sind verglichen mit früheren Verfahren für die reverse Transkription von RNA verbessert. Diese Verfahren sorgen für die Amplifikation eines RNA-Segments über ein dazwischengeschaltetes RNA/cDNA-Hybridmolekül. Das Hybridmolekül ist eine geeignete Matrize für die Amplifikation durch PCR. Folglich sind die reversen Transkriptions- und Amplifikationsreaktionen gekoppelt. Frühere RNA-Amplifikationsverfahren erfordern die Inkubation des RNA%Primer-Gemisches in Gegenwart einer reversen Transkriptase bei 37-42ºC vor der Einleitung einer Amplifikationsreaktion. Nur bei der vorliegende Erfindung werden alle enzymatischen Schritte zur RNA- Amplifikation von einer hitzestabilen DNA-Polymerase katalysiert. Die Vorteile, die die kommerzielle Verfügbarkeit von Taq- und Tth-DNA-Polymerasen, die offenbarte Verfahren zur Herstellung der Tth-DNA-Polymerase und die kommerzielle Verfügbarkeit von Tth- DNA-Polymerase-reversen Transkriptions/DNA-Amplifikations-Kits (Perkin Elmer, Norwalk, CT) für die PCR brachte, können nun durch die hier offenbarten Verfahren auf die reverse Transkription, den RNA-Nachweis, die cDNA-Herstellung und die kombinierte reverse Transkription/cDNA-Amplifikation von RNA angewendet werden.
DNA-Amplifikationsverfahren durch PCR sind gut bekannt und in den US-Patenten Nrn. 4,683,195; 4,683,202 und 4,965,188 beschrieben.
Zur Erleichterung des Verständnisses der durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Vorteile wird eine Zusammenfassung der PCR bereitgestellt. Die PCR erfordert zwei Primer, die mit der doppelsträngigen Ziel-Nucleinsäuresequenz, die amplifiziert werden soll, hybridisieren. Bei der PCR wird diese doppelsträngige Zielsequenz denaturiert, und ein Primer wird an jeden Strang des denaturierten Zielmoleküls angelagert. Die Primer lagern sich an die Ziel-Nucleinsäure an voneinander entfernten Stellen und in einer Orientierung an, so daß das Verlängerungsprodukt eines Primers, wenn es von seinem Komplement getrennt wird, mit dem anderen Primer hybridisieren kann. Nach der Hybridisierung eines bestimmten Primers mit der Zielsequenz, wird der Primer durch die Wirkung einer DNA-Polymerase verlängert. Das Verlängerungsprodukt wird dann von der Zielsequenz durch Denaturierung getrennt, und der Vorgang wird wiederholt.
In aufeinanderfolgenden Zyklen dieses Verfahrens dienen die in früheren Zyklen hergestellten Verlängerungsprodukte als Matrizen für die DNA-Synthese. Ab dem zweiten Zyklus beginnt sich das Produkt der Amplifikation in einem logarithmischen Verhältnis anzureichern. Das Amplifikationsprodukt ist ein einzelnes doppelsträngiges DNA-Molekül, umfassend: einen ersten Strang, der die Sequenz des ersten Primers enthält, eventuell gefolgt von der Sequenz, die komplementär zu dem zweiten Primer ist, und einen zweiten Strang, der komplementär zu dem ersten Strang ist.
Wegen der außerordentlichen Amplifikation, die mit dem PCR-Verfahren möglich ist, können geringe Mengen einer DNA-Mitführung aus Proben mit hohen DNA-Anteilen, positiven Kontrollmatrizen oder aus vorangehenden Amplifikationen ein PCR-Produkt ergeben; auch in Abwesenheit einer absichtlich zugegebenen Matrizen-DNA. Falls möglich, werden alle Reaktionsgemische in einem von der PCR-Produktanalyse und -Probenherstellung getrennten Bereich hergestellt. Die Verwendung von zweckbestimmten oder Einmalbehältern, -lösungen und -pipetten (vorzugsweise Druckpipetten) zur RNA/DNA-Herstellung, Mischen der Reaktion und Probenanalyse verringert die wechselseitige Verunreinigung auf ein Minimum. Vgl. auch Higuchi und Kwok, Nature 339 (1989), 237-238; und Kwok und Orrego in: Innis et al., Hrsg., "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Academic Press, Inc., San Diego (1990).
Ein spezielles Verfahren zur Minimierung der Wirkungen einer wechselseitigen Verunreinigung einer Nucleinsäureamplifikation ist in der PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 92/01814 und in US-Patent Nr. 5,035,996 beschrieben. Das Verfahren schließt die Einführung von unüblichen Nucleotidbasen, wie dUTP, in das amplifizierte Produkt und das Aussetzen des mitgeführten Produkts einer enzymatischen und/oder physikalisch-chemischen Behandlung, um das DNA-Produkt als Matrize für folgende Amplifikationen unbrauchbar zu machen, ein. Zum Beispiel entfernt die Uracil-DNA-Glykosylase, auch bekannt als Uracil-N- Glykosylase oder UNG, Uracilreste aus dem Produkt, das diese Base enthält. Die Enzymbehandlung führt zum Abbau des verunreinigenden mitgeführten PCR-Produkts und dient dazu, die Amplifikationsreaktion zu "sterilisieren".
Der Begriff "unüblich", wenn auf eine Nucleinsäurebase, ein Nucleosid oder ein Nucleotid Bezug genommen wird, schließt Modifikationen, Abkömmlinge oder Analoga üblicher Basen, Nucleoside oder Nucleotide, die natürlicherweise in einem bestimmten Polynucleotid (z. B. DNA [dA, dU, dC und dT] oder RNA [A, G, C und U]) vorkommen, ein. Uracil ist eine übliche Base in RNA (d. h. kovalente Bindung an eine Ribose in einem Ribopolynucleotid), aber eine unübliche Base in DNA (d. h. kovalente Bindung an eine Desoxyribose in einem Desoxyribopolynucleotid). In einer kombinierten RT/PCR-Reaktion ist es wünschenswert, die Reaktion vor dem RT-Schritt zu sterilisieren, um mitgeführte Nucleinsäureprodukte von vorangehenden reversen Transkriptions- und/oder Amplifikationsreaktionen zu entfernen. Die Sterilisierung nach der reversen Transkription und vor der PCR führt zum Abbau von nicht-verunreinigenden cDNA-Produkten, die dUTP enthalten, sowie des verunreinigenden Produkts. Die Synthese von cDNA in Gegenwart von dTTP und in Abwesenheit von dUTP ist undurchführbar. Zum wirksamen Einbau von dUTP in das spätere PCR-Produkt wäre ein enormer Überschuß an dUTP erforderlich, um das dTTP zu verdünnen, das als mitgeführtes Produkt aus dem reversen Transkriptionsschritt vorhanden ist. Außerdem würde dies das Öffnen des Röhrchens erforderlich machen, um das dUTP zuzugeben. Folglich würde die Wirksamkeit der UNG-Sterilisierung vermindert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Sterilisierung der RTIPCR-Reaktion bereit. Beispiel 4 veranschaulicht diesen erfindungsgemäßen Gesichtspunkt. Wenn unübliche Nucleoside in Amplifikationsprodukte eingebaut werden, sind übliche Titrationsexperimente nützlich, um die Reaktionsbedingungen zu optimieren, und die Europäische Patentanmeldung EP-A-540,693 stellt Anleitungen zum Einbau unüblicher Nucleotide bereit. Die Parameter, die variiert werden, schließen, aber sind nicht darauf begrenzt, die Konzentration des divalenten Kations, den pH-Bereich, die Konzentration der DNA-Polymerase, die Konzentration des unüblichen Nucleosids, die Zugabe eines natürlichen Nucleosids, für das das unübliche Nucleosid eingebaut wird, die Dauer eines jeden Zyklus und die Temperatur ein.
Im allgemeinen liegt die Konzentration der dNTPs bei einer PCR unter Verwendung von MgCl&sub2; in einem Tris-Puffer im Bereich von 20-200 uM für jedes dNTP. Beim Einbau von dUTP wird die Wirksamkeit der Amplifikation bei einer erhöhten Nucleotidkonzentration verbessert. In Beispiel 4 beträgt die dUTP-Konzentration bei der PCR 200 uM, und dCTP, dGTP und dATP liegen ebenfalls in der gleichen Konzentration vor, obwohl dies nicht wesentlich ist. Wenn die Konzentration von dUTP oder der dNTPs erhöht wird, wird die Konzentration von MgCl&sub2; und MnCl&sub2; entsprechend erhöht. In Beispiel 4 enthält die PCR jeweils 200 uM dGTP, dATP, dUTP und dCTP und 2 mM MgCl&sub2; und sieht eine wirksame Amplifkation vor.
Zur reversen Transkription unter Verwendung einer hitzestabilen Polymerase wird Mn²&spplus; als das divalente Kation bevorzugt und ist typischerweise als ein Salz; zum Beispiel Manganchlorid (MnCl&sub2;), Manganacetat (Mn(OAc)&sub2;) oder Mangansulfat (MnSO&sub4;), eingeschlossen. Falls MnCl&sub2; in einer Reaktion eingeschlossen ist, die 10 mM Tris-Puffer enthält, liegt das MnCl&sub2; zum Beispiel im allgemeinen in einer Konzentration von 0,5-7,0 mM vor; 0,8-1,4 mM werden bevorzugt, wenn jeweils 200 uM dGTP, dATP, dUTP und dCTP verwendet werden; und 1,2 mM MnCl&sub2; werden am meisten bevorzugt. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Reagenzien bereit, um den verwendbaren Bereich der Konzentration des divalenten Kations zu erweitern. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Reaktionspuffer, umfassend Mn(OAc)&sub2;, Bicin-KOH und KOAc, anstelle des MnCl&sub2;/Tris/KCl-Puffers verwendet. Beispiel 8 beschreibt die Verwendung eines solchen Bicin/Acetat-Puffers, in dem das Mn²&spplus;, bereitgestellt als Mn(OAc)&sub2;, in Konzentrationen im Bereich von 1,2 bis 2,5 mM verwendet wird; Konzentrationen von 3,6 mM und 3,5 mM werden in der in Beispiel 10 beschriebenen RT/PCR verwendet.
Die optimalen Konzentrationen des unüblichen Nucleotids und des divalenten Kations können, wie vorstehend angemerkt, bei der reversen Transkriptionsreaktion, genauso wie bei der Amplifikationsreaktion in Abhängigkeit von der dNTP-Gesamtkonzentration und von den einzelnen Primern, der Matrize, dem Puffer, den Salzen und der vorhandenen Polymerase variieren. Die Beispiele beschreiben die Verwendung eines Bicin/Acetat-Puffers, der eine höhere dUTP-Konzentration in der reversen Transkriptionsreaktion erlaubt, wodurch der Einbau von dUMP in eine neu synthetisierte cDNA verbessert wird.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform, beschrieben in Beispiel 3, wird ein in zwei Stufen ablaufendes Einzusatz-Verfahren zur kombinierten RT/PCR unter Verwendung von MnCl&sub2; als das divalente Kation in einem Tris-HCl-Puffer für sowohl den RT- als auch den PCR-Schritt bereitgestellt. Bei dem Verfahren wird der Puffer nach der reversen Transkription nicht vor dem PCR-Schritt angepaßt. Folglich wird eine geringere MnCl&sub2;- Konzentration verwendet, unabhängig davon, ob dTTP oder dUTP eingebaut wird (unter Verwendung von 200 uM dNTPs), um eine Verringerung der Amplifikationseffizienz zu vermeiden, die auftreten kann, wenn die MnCl&sub2;-Konzentration während der PCR bei 1,2 mM gehalten wird.
Nach der Amplifikation und der Analyse des RT/PCR-Ergebnisses kann das RT/PCR-Produkt unabsichtlich als eine Verunreinigung in andere Reaktionen eingetragen werden. Vor folgenden RT-, RT/PCR- oder Amplifikationsreaktionen werden die Reaktionsgemische mit einer DNA-Glykosylase behandelt, die für das unübliche Nucleotid spezifisch ist, das während der vorangehenden RT/PCR eingebaut wurde. Auf diese Weise wird jedes vorangehende RT/PCR-Produkt, das als Verunreinigung in dem folgenden RT-, RT/PCR- oder Amplifikationsreaktionsgemisch, das eine Ziel-Nucleinsäure enthält, vorhanden ist, hydrolysiert.
Folglich wird in der Praxis die Sterilisierungsbehandlung vor dem RTIPCR-Test ausgeführt, um mitgeführte DNA-Produkte, die dUMP enthalten, zu entfernen. Zum Beispiel werden vor der Inkubation bei hoher Temperatur (60-70ºC) des reversen Transkriptionsreaktionsgemisches 0,01-0,05 Einheiten UNG pro ul RT-Reaktionsvolumen zugegeben und 1-10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. In einer anderen Ausführungsform wird die Inkubation 2 Minuten bei 50ºC durchgeführt. Der folgende RT-Schritt bei hoher Temperatur (60-70ºC) und der folgende Denaturierungsschritt bei 95ºC dienen dazu, die UNG zu inaktivieren, so daß neu synthetisierte cDNA- und PCR-Produkte nicht abgebaut werden. UNG ist im Handel von Perkin Eimer, Norwalk, CT, erhältlich. EP-A-540,693 beschreibt Verfahren zur Herstellung der UNG durch rekombinante Mittel und auch hitzelabile UNG- Derivate, die nach dem Erhitzen oberhalb der Denaturierungstemperatur der DNA-Probe ihre Aktivität nicht wiedergewinnen. Solche Derivate können zur Durchführung der vorliegenden Erfindung bevorzugt werden.
Das Ziel der Amplifikation kann ein RNA/DNA-Hybridmolekül sein. Das Zielmolekül kann eine einzelsträngige oder doppelsträngige Nucleinsäure sein. Obwohl das vorstehend beschriebene PCR-Verfahren ein doppelsträngiges Zielmolekül voraussetzt, stellt dies keine Notwendigkeit dar. Nach dem ersten Amplifikationszyklus eines einzelsträngigen DNA-Zielmoleküls enthält das Reaktionsgemisch ein doppelsträngiges DNA-Molekül, das aus dem einzelsträngigen Zielmolekül und einem neu synthetisierten, komplementären Strang besteht. In ähnlicher Weise enthält das Reaktionsgemisch nach dem ersten Amplifikationszyklus eines RNA/cDNA-Zielmoleküls ein doppelsträngiges cDNA-Molekül. Zu diesem Zeitpunkt laufen die aufeinanderfolgenden Amplifikationszyklen wie vorstehend beschrieben ab. Bei den vorliegenden Verfahren ist das Ziel der Amplifikation eine einzelsträngige RNA, und der erste Amplifikationszyklus ist der reverse Transkriptionsschritt. In einer anderen Ausführungsform, falls die Ausgangsmatrize eine doppelsträngige RNA ist, kann ein anfänglicher Denaturierungsschritt bei hoher Temperatur verwendet werden, um eine einzelsträngige RNA-Matrize herzustellen.
So wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "cDNA" auf ein komplementäres DNA-Molekül, das unter Verwendung eines Ribonucleinsäurestrangs (RNA) als Matrize synthetisiert wurde. Die RNA kann eine mRNA, tRNA, rmA oder eine andere RNA-Form, wie eine virale RNA, sein. Die cDNA kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein oder kann über Wasserstoffbrücken an ein komplementäres RNA-Molekül gebunden sein, wie in einem RNA/cDNA-Hybrid.
Die erfindungsgemäßen Verfahren stellen Mittel zum Erhalt einer cDNA von einer gewünschten RNA-Matrize bereit, wobei das gewünschte Endprodukt mit größerer Spezifität als durch frühere Verfahren hergestellt wird. Außerdem sieht die vorliegende Erfindung vor, daß die cDNA-Synthese mit einer Amplifikation durch PCR kombiniert werden kann. Diese Verfahren vereinigen vorher unbekannte Eigenschaften von hitzeaktiven DNA-Polymerasen. In den offenbarten Ausführungsformen werden Verfahren bereitgestellt, die Taq- und Tth- DNA-Polymerasen zur reversen Transkription verwenden. Diese Ausführungsformen sollten nicht als Begrenzung der vorliegenden Erfindung ausgelegt werden.
Hitzestabile Polymerasen sind von einer Reihe von Bezugsquellen erhältlich. Das Enzym kann ein natives oder rekombinantes Protein sein. Ein bevorzugtes hitzestabiles Enzym ist die Thermus thermophilus-DNA-Polymerase (Tth-DNA-Polymerase), das aus Thermus thermophilus gereinigt wurde (vgl. die PCT-Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 91/09950). In einer anderen Ausführungsform wird die Tth-DNA-Polymerase aus rekombinanten Wirtszellen gereinigt, wobei die Wirtszellen, wie in WO 91/09944 beschrieben, unter Verwendung der Primer
A SEQ ID Nr. 1 5'-GGCATATGGCTAGACTATTTCTTTTTG-3'
B SEQ ID Nr. 2 5'-AGGTTCCGATGAAGTCTGTAGGTGATGTCTG-3'
C SEQ ID Nr. 3 5'-CTACAGACTTCATCGGAACCTCCITAAGCG-3'
D SEQ ID Nr. 4 5'-CCAACCCGCCTCGCCACGAAGG-3'.
hergestellt werden können.
Die rekombinante Tth-Polymerase wird als rTth-DNA-Polymerase bezeichnet.
Ebenfalls bevorzugt zur Durchführung der Erfindung wird die Taq-DNA-Polymerase. Die Taq-DNA-Polymerase ist im Handel erhältlich als ein rekombinantes Produkt oder gereinigt als native Taq-DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus, entwickelt und hergestellt Hoffmann-La Roche Inc. und im Handel erhältlich von Perkin Elmer, Norwalk, CT. So wie hier verwendet, kann die rekombinante Taq-DNA-Polymerase als rTaq-DNA-Polymerase bezeichnet werden, und die native Taq-DNA-Polymerase kann als nlaq-DNA-Polymerase bezeichnet werden. Außerdem kann die T. flavus (Tfl)-DNA-Polymerase, erhältlich von Amersham, Arlington Heigths, IL, als "Hot Tub"-DNA-Polymerase geeignet sein. Weitere Einzelheiten über die Verwendung der Tth-DNA-Polymerase zur reversen Transkription und Amplifikation von Nucleinsäuren findet man in WO 91/09944.
Primer können mit geeigneten Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen konstruiert werden, die am oder nahe dem 5'-Ende des Primers angeordnet sind. Bei der Erzeugung des cDNA-Transkripts würde das so erhaltene doppelsträngige cDNA-Molekül eine spezifische Restriktionsenzym-Erkennungssequenz enthalten, solange das 3'-Ende des Primers über Wasserstoffbrücken an die Zielsequenz gebunden ist. Nach der Amplifikation unter Verwendung der cDNA als Matrize könnte die Restriktionsstelle verwendet werden, um andere Verfahren, zum Beispiel das Clonieren, zu erleichtern.
Nach der reversen Transkription der RNA durch eine hitzeaktive oder hitzestabile DNA-Polymerase kann die RNA aus dem RNA/cDNA-Hybrid durch Hitzedenaturierung oder durch eine Reihe von anderen bekannten Mitteln, wie eine Alkali-, Hitze- oder Enzymbehandlung, entfernt werden. Die Enzymbehandlung kann zum Beispiel aus der Behandlung des RNA/cDNA-Hybrids mit RNase H bestehen. RNase H ist für RNA-Stränge innerhalb eines doppelsträngigen RNA/DNA-Moleküls spezifisch. Tth- und Taq-assoziierte RNase H- und 5'→ 3'-Nucleaseaktivitäten können die Hydrolyse der RNA-Matrize und die Synthese des zweiten DNA-Strangs sowie die Primerverlängerung zur Amplifikation der cDNA-Sequenz erleichtern. In einer anderen Ausführungsform wird eine exogene RNase H von einer im Handel erhältlichen Quelle zugegeben.
Die RNase H-Aktivität hitzestabiler Polymerasen stellt ein Mittel bereit, um zwischen RNA- und DNA-Matrizen in einer Probe zu unterscheiden. Dies ist besonders für den Nachweis von RNA in Gegenwart eines homologen DNA-Doppelstrangs nützlich. Wo die DNA frei von Introns ist, zum Beispiel in proviraler HIV-DNA, kann die amplifizierte RNA und DNA nicht anhand der Größe unterschieden werden. Jedoch nach der reversen Transkription erübrigt die RNase H-Aktivität die Notwendigkeit einer Denaturierung des RNA/cDNA-Doppelstrangs. Folglich wird in Gegenwart einer genomischen oder proviralen DNA nur die RNA-Matrize im ersten PCR-Zyklus amplifiziert.
In einem bevorzugten Verfahren zur Unterscheidung zwischen homologen RNA- und DNA-Matrizen werden Amplifikationsprimer verwendet, um die Synthese des PCR- Produkts bei einer niedrigen Strangtrennungstemperatur zu steuern. Zum Beispiel erzeugen die Primerpaare:
ein PCR-Produkt zum Nachweis von HIV-RNA, das unterhalb von 94ºC hinreichend denaturiert wird. Typische Denaturierungstemperaturen für die PCR sind 94-96ºC. Bei der niedrigeren Temperatur wird die doppelsträngige DNA (d. h. die erwartete "Verunreinigung") nicht denaturiert und würde nicht amplifiziert werden. Verfahren zur Beeinflussung der Denaturierungstemperatur von PCR-Produkten sind in der Europäischen Patentanmeldung EP-A- 519,338 ausführlich beschrieben.
In einer anderen Ausführungsform sind unübliche Nucleotide nützlich, um die Denaturierungstemperatur des PCR-Produkts wirksam zu beeinflussen. Zum Beispiel kommt Hydroxymethyl-dUTP (HmUTP) natürlicherweise in SPO1-Phagen-DNA als 5'-Hydroxymethyluracil (HmUra) anstelle von Thymin vor (Kallen et al., J. Mol. Biol. 5 (1962), 248-250; und Levy und Teebor, Nuc. Acids Res. 19 (12) (1991), 3337). Das HmUra-enthaltende Genom schmilzt bei einer um 10ºC niedrigeren Temperatur als DNA mit dem entsprechenden Thymingehalt. Der Einbau von HmdUTP in cDNA erniedrigt wirksam die Denaturierungstemperatur von sowohl dem revers transkribierten Produkt als auch dem PCR-Doppelstrang- DNA-Produkt im Vergleich zu der Denaturierungstemperatur der homologen Thymin-enthaltenden DNA. Andere modifizierte Nucleosidtriphosphate, die in der Lage sind, die Tm des DNA-Produkts zu beeinflussen (z. B. c&sup7;dGTP, 7-Desaza-2'-desoxyguanosin-5'-triphosphat oder α-Phosphorothioat-dNTPs), sind zur Unterscheidung zwischen homologen RNA- und DNA-Matrizen ebenfalls geeignet.
Nach Entfernung oder Aufschmelzung des RNA-Matrizenstrangs kann der verbleibende cDNA-Strang dann als Matrize zur Polymerisierung eines selbst-komplementären Strangs dienen, wobei ein doppelsträngiges cDNA-Molekül bereitgestellt wird, das zur weiteren Amplifikation, zum Nachweis oder für andere Manipulation geeignet ist. Die Sekundärstrangsynthese macht ebenfalls einen Primer erforderlich. Ein sequenzspezifischer Primer kann in das Reaktionsgemisch eingebracht werden, um die Sekundärstrangsynthese zu veranlassen. In einer anderen Ausführungsform kann ein Adapter-Linker-Duplex mit der cDNA ligiert werden oder die cDNA kann mit einer terminalen Aktivität vom Transferase-Typ versehen werden. Der Sekundärstrang-Primer muß nur mit dem Schwanz anstatt mit der spezifischen cDNA-Sequenz hybridisieren (vgl. zum Beispiel Frohman in Innis et al., a.a.O.). Bei der Durchführung der offenbarten Verfahren kann es wünschenswert sein, einen ersten Satz von Primern zu verwenden, um ein spezifisches cDNA-Molekül zu synthetisieren, und einen zweiten ineinandergeschachtelten Satz von Primern, um ein gewünschtes cDNA- Segment zu amplifizieren. Alle diese Reaktionen können durch die gleiche hitzestabile DNA- Polymerase katalysiert werden.
Zur erfindungsgemäßen reversen Transkription wird das Primer-Matrize-Gemisch mit einer hitzeaktiven oder hitzestabilen Polymerase unter geeigneten Polymerisierungsbedingungen inkubiert. Diese Bedingungen werden durch ein Reaktionsgemisch bereitgestellt, das alle vier Desoxyribonucleotidtriphosphate (dNTPs) und einen Puffer, enthaltend ein Pufferungsmittel, ein divalentes Kation und ein monovalentes Kation, enthält.
DNA-Polymerasen benötigen für ihre katalytische Aktivität ein divalentes Kation. Tabor und Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 4076-4080, berichteten, daß Mg²&spplus; durch Mn²&spplus; bei DNA-Sequenzierungsverfahren ersetzt werden kann. Diese Verfahren erfordern eine DNA-Matrize und eine T7-DNA-Polymerase oder DNA-Polymerase I.
Jedes der Kationen Mn²&spplus;, Mg²&spplus; oder Co²&spplus; kann Taq-, Tth- und Tma-DNA-Polymerasen aktivieren; jedoch wird Mn²&spplus; in den vorliegenden Verfahren bevorzugt. In den offenbarten erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden Puffer, die Mn²&spplus; enthalten, zur reversen Transkription von Nucleinsäure von einer RNA-Matrize bereitgestellt. Diese Puffer sind verglichen mit vorangehenden Puffern zur reversen Transkription verbessert und ergeben erhöhte cDNA-Ausbeuten. Insbesondere sieht die Durchführung der vorliegenden Verfahren unter Verwendung der Tth-DNA-Polymerase und MnCl&sub2; oder Mn(OAc)&sub2; zur Amplifikation von RNA eine Erhöhung der Empfindlichkeit um mindestens das 10&sup6;fache vor, verglichen mit MgCl&sub2; und PCR-Standardbedingungen. Obwohl Puffer mit gemischten divalenten Kationen (z. B. Mn²&spplus; und Mg²&spplus;) die RNA-Matrize-gerichtete DNA-Synthese aktivieren können, werden sie auf Grund der verminderten Empfindlichkeit und Wirksamkeit nicht bevorzugt:
Das divalente Kation wird in Form eines Salzes, wie MgCl&sub2;, Mg(OAc)&sub2;, MgSO&sub4;, MnCl&sub2;, Mn(OAc)&sub2; oder MnSO&sub4;, bereitgestellt: Die in einem Tris-HC&sub1;-Puffer verwendbaren Kationenkonzentrationen betragen für MnCl&sub2; 0,5 bis 7 mM, vorzugsweise zwischen 0,5 und 2 mM, und für MgCl&sub2; 0,5 bis 10 mM. Die in einem Bicin/KOAc-Puffer verwendbaren Kationenkonzentrationen betragen 1 bis 20 mM für Mn(OAc)&sub2;, vorzugsweise zwischen 2 und 5 mM.
Vorzugsweise wird das monovalente Kation durch die Kalium-, Natrium-, Ammonium- oder Lithiumsalze von entweder Chlorid oder Acetat bereitgestellt. Für KCl liegt die Konzentration zwischen 1 und 200 mM, vorzugsweise liegt die Konzentration zwischen 40 und 100 mM, obwohl das Konzentrationsoptimum in Abhängigkeit von der bei der Reaktion verwendeten Polymerase variieren kann. Bei Verwendung der Tth-DNA-Polymerase wird eine optimale reverse Transkriptaseaktivität zwischen 50 und 75 mM KCl beobachtet. Jedoch wird eine verbesserte RT/PCR beobachtet, wenn die KCl-Konzentration auf bis zu 100 mM erhöht wird. Für eine Taq-DNA-Polymerase, wie AmpliTaq®-DNA-Polymerase; werden 50 mM KCl bevorzugt. Für KOAc wird eine optimale reverse Transkriptaseaktivität bei Konzentrationen zwischen 85 mM.und 115 mM beobachtet; wenn die Tth-DNA-Polymerase verwendet wird.
Desoxyribonucleotidtriphosphate werden als Lösungen der Salze von dATP, dCTP, dGTP, dUTP und dTTP, wie Dinatrium- oder Lithiumsalze, zugegeben. Bei den vorliegenden Verfahren ist eine Endkonzentration im Bereich von jeweils 1 um bis 2 mM geeignet, und 100-600 uM werden bevorzugt, obwohl die optimale Konzentration der Nucleotide bei der reversen Transkriptionsreaktion in Abhängigkeit von der dNTP-Gesamtkonzentration und der Konzentration des divalenten Metallions und von dem Puffer, den Salzen, den einzelnen Primern und der Matrize variieren können: Für längere Produkte, d. h. größer als 1500 bp, können 500 um jedes dNTP und 2 mM MnCl&sub2; bevorzugt werden, wenn ein Tris-HCl-Puffer verwendet wird.
Ein geeignetes Pufferungsmittel ist eine zwitterionische Verbindung, die Wasserstoffionenpufferung bereitstellt und vorzugsweise sowohl den pH-Wert als auch die Manganionenkonzentration puffert, wie im ersten Absatz auf Seite 2 spezifiziert ist. Ein besonders bevorzugtes Pufferungsmittel ist Bicin-KOH, vorzugsweise bei pH 8,3, obwohl der pH-Wert im Bereich von 7,8-8,7 liegen kann. Bicin ist sowohl als ein pH-Puffer als auch als ein Metallpuffer wirksam.
Außerdem können weniger als 0,5 mM EDTA in dem reversen Transkriptionsreaktionsgemisch vorhanden sein. Detergenzien, wie Tween-20TM und NonidetTM P-40, sind in den Enzymverdünnungspuffern vorhanden. Eine Endkonzentration des nichtionischen Detergens von etwa 0,1% oder weniger ist geeignet, jedoch werden 0,01-0,05% bevorzugt, und beeinträchtigt die Polymeraseaktivität nicht. Entsprechend ist oft Glycerin in Enzymzubereitungen vorhanden und wird im allgemeinen auf eine Konzentration von 1-20% in dem Reaktionsgemisch verdünnt. Ein Mineralölüberzug kann zugegeben werden, um ein Verdampfen zu verhindern, aber ist nicht notwendig, wenn eine TC9600-Thermocycler-Vorrichtung (Perkin Elmer, Norwalk, CT) oder AmpliwaxTM PCR Gem 100 (Perkin Elmer, Norwalk, CT) verwendet wird, wie in der PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 91/12342 und bei Chou et al., Nuc. Acids Res. 20 (1992), 1717-1723, beschrieben ist.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Verfahren für eine homogene RT/PCR bereitgestellt. Dieses in zwei Stufen ablaufende Einzusatz-Verfahren erübrigt die Notwendigkeit, das Röhrchen nach Zugabe der Ausgangsreagenzien zn öffnen. Folglich wird die Möglichkeit einer Verunreinigung zwischen dem RT- und dem PCR-Schritt ausgeschlossen. Jedoch wird auch die Möglichkeit ausgeschlossen, die Reaktionsreagenzien zwischen den Schritten austauschen, und die zwei Reaktionen müssen unter den gleichen Reaktionsreagensbedingungen durchgeführt werden, die sowohl für den RT- als auch für den PCR-Schritt nicht optimal sein können. Die Anpassung der Reaktionsbedingungen kann erforderlich sein, um die einzelnen-Anforderungen der zwei Reaktionsschritte anzupassen. Zum Beispiel wird infolge der hohen Enzymkonzentration, die für eine optimale RT-Aktivität erforderlich ist, ein kurzer Verlängerungszyklus, d. h. 10-30 Sekunden; in jeder PCR-Thermocycler-Vorrichtung bevorzugt, wenn kurze Zielmoleküle amplifiziert werden, obwohl die Dauer des Verlängerungszyklus von der verwendeten Thermocycler-Vorrichtung abhängen kann. Zum Beispiel wird 1 Minute bevorzugt, wenn eine von Perkin Elmer, Norwalk, CT, vertriebene TC480-Thermocycler-Vorrichtung verwendet wird.
In ähnlicher Weise, da keine Pufferanpassung zwischen dem RT- und dem PCR- Schritt in einem homogenen RTIPCR-Test erfolgt, ist eine Mangankonzentration erforderlich, die zwischen den verschiedenen RT- und PCR-Optima liegt, so daß jeder Schritt wirksam ist. Wie in Beispiel 7 gezeigt, liegt die optimale Konzentration für die DNA-Zielmolekül-PCR- Reaktion unter der für die RNA-Zielmolekül-RT-Reaktion. Es wurde festgestellt, daß die Mangankonzentration, die eine optimale Synthese an DNA-Matrizen bereitstellt, etwa 0,6 mM (bei 800 uM dNTP insgesamt, Tris-Puffer) beträgt, wobei das Enzym eine maximale reverse Transkriptaseaktivität an der RNA-Matrize bei etwa 1,4 mM Mangan (bei 800 uM dNTP insgesamt, Tris-Puffer) erzielte. Für die in Beispiel 3 beschriebene homogene Reaktion beträgt die MnCl&sub2;-Konzentration vorzugsweise gleich oder weniger als 1,0 mM und am meisten bevorzugt 0,8 mM. Während die bevorzugten Konzentrationen Bedingungen entsprechen, die ermöglichen, daß die Tth-DNA-Polymerase die RT/PCR durchführen kann, sind diese Bedingungen für sowohl die reverse Transkription als auch die DNA-Amplifikation suboptimal. Außerdem, obwohl, wie bei den erfindungsgemäßen Sterilisierungsverfahren, die Wirksamkeit des RT-Schritts in Gegenwart von dUTP bei einer höheren MnCl&sub2;-Konzentration verbessert ist, ist der PCR-Schritt weniger effizient. Folglich werden besonders bevorzugt 0,8 mM MnCl&sub2; verwendet, und das Produkt wird durch Mittel nachgewiesen, die empfindlicher als Ethidiumbromid-gefärbte Gele sind d. h. Sondenhybridisierung oder Einbau von markierten oder anderen nachweisbaren Nucleotiden.
Ein Verfahren zur Lösung des Problems der verschiedenen optimalen Reaktionsbedingungen für die zwei Schritte schließt die Verwendung eines Wachses mit hoher Schmelztemperatur (72ºC) in dem Reaktionsröhrchen ein, um die Reagenzien zu trennen, wie in der PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 91/12342 beschrieben. Das Wachs mit hoher Schmelztemperatur ermöglicht im wesentlichen, daß die zwei einzelnen Reaktionen bei ihren eigenen optimalen Bedingungen ablaufen können, indem eine Lösung aus EGTA und MgCl&sub2; von der RT-Reaktion durch eine Wachsschicht getrennt wird. Der RT-Schritt wird bei einer Temperatur unterhalb des Schmelzpunkts des Wachses durchgeführt, daher bleibt die Wachsschicht intakt und der RT-Schritt wird unter Verwendung von Mangan in einer optimalen Konzentration ausgeführt. Nach Beendigung des RT-Schritts wird das Wachs während des ersten Denaturierungsschritts der PCR bei hoher Temperatur geschmolzen, auf diese Weise wird das EGTA freigesetzt, um vorzugsweise mit dem Mangan ein Chelat zu bilden und eine DNA- Amplifikation auf Magnesium-Basis zu ermöglichen. Eine Modifikation dieser Technik verwendet die Mikroeinkapselung des EGTA und des Magnesiums in ein Kügelchen, das aus dem gleichen Wachs mit hoher Schmelztemperatur hergestellt ist.
Erfindungsgemäß wird ein Metallpuffer verwendet, dessen Pufferungsmittel als ein Chelatbildner wirksam ist. Ein solcher Puffer bindet Mangan und erlaubt auf diese Weise, daß eine höhere Mn²&spplus;-Konzentration verwendet werden kann. Der Metallpuffer kann die verfügbare Mn²&spplus;-Konzentration über einen großen Bereich an zugesetztem Mn²&spplus; bei einem konstanten Wert aufrechterhalten. Metallpufferungsmittel, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sein können, schließen N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycin (Bicin), N[Tris(hydroxymethyl)mathyl]glycin, (Tricin), Acetat, Glutamat, Asparat, N-hydroxyethylimindessigsäure (HIMDA), Citrat und Isocitrat ein. Eine Kombination von Pufferungsmitteln, die ähnliche Metallbindungs- und pH-Pufferungsfähigkeiten wie einer der beispielhaften Puffer bereitstellt, kann ebenfalls geeignet sein. Der Begriff "Pufferungsmittel", so wie hier verwendet, soll solche Kombinationen von Pufferungsmitteln einschließen. In einigen Fällen können ähnliche Pufferungswirkungen durch Veränderung der Konzentration des Pufferungsmittels erzielt werden. Zum Beispiel beschreibt Beispiel 13 die Verwendung einer erhöhten Tris- Konzentration, um eine Erweiterung des Manganbereichs zu erreichen.
Das Metallpufferungsmittel, das als ein Chelatbildner wirksam ist, bildet in einer reversiblen Reaktion mit dem Metallkation Komplexe. Die Stabilität des Chelatbildner- Metall-Komplexes, die die Affinität des Chelatbildners für das Metallion wiedergibt, wird als "Metallpuffer-Bindungskonstante" oder "Stabilitätskonstante" KM angegeben. Wegen des großen Bereichs von Stabilitätskonstanten ist es üblicher, den Logarithmus (Basis 10, hier als Log geschrieben) des KM-Werts eines Metallpuffers anzugeben. Die Stabilitätskonstante KM ist bei Good et al.; Biochemistry 5 (1966), 467-477; und Perrin und Dempsey, Kapitel 7 in "Buffers for pH and Metal Ion Control", Chapman und Hall, New York, NY (1974), beschrieben.
Geeignete Metallpuffer, die Mangan binden, zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren weisen einen Log KM-Wert (20ºC, 0,1 M Ionenstärke) zwischen 1 und 6 (d. h. 10 < KM < 10&sup6;) auf Vorzugsweise liegt der Log KM-Wert zwischen 2 und 4 und am meisten bevorzugt zwischen 2,5 und 3,5. Eine Zusammenstellung von Stabilitätskonstanten für eine Vielzahl von Chelatbildnern ist bei Martell und Smith, "Critical Stability Constants", Plenum Press, New York, NY (1974), Bd. 1; Martell und Smith, "Critical Stability Constants", Bd. 3, Plenum Press, New York (1977), Seiten 160-162; und Sillen und Martell, "Stability Constants of Metal-Ions Complexes", Spec. Publ. Chem. Soc. n17 (1964), Seite 458; London, bereitgestellt.
Bevorzugte Metallpuffer sind auch in der Lage, als Wasserstoffionenpuffer in dem pH-Bereich, der in den erfindungsgemäßen Verfahren erforderlich ist, zu dienen. Good et al., a.a.O., beschrieben eine Klasse von Puffern, die sowohl als Metallkationen- als auch als Wasserstoffionenpuffer dienen. Die Säuredissoziationskonstante Ka eines Puffers ist bei Good et al., a.a.O., und Perrin und Dempsey, 1974, a.a.O., beschrieben. Es wird bevorzugt, daß der Puffer einen als -Log Ka definierten pKa-Wert zwischen 7 und 9 bei 20ºC und 0,1 M Ionenstärke, vorzugsweise zwischen 7,5 und 8,5 aufweist.
Zur Verwendung in den erfindungsgemäßen verfahren bevorzugte Pufferungsmittel schließen N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycin (Bicin) und N[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycin (Tricin) ein. Beide sind zwitterionische aliphatische Amine, genauer substituierte Glycine mit Carboxylgruppen, die die Mn²&spplus;-Bindungsfähigkeit bereitstellen. Ein Vergleich der Eigenschaften von Bicin, Tricin und Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) ist nachstehend gezeigt und bei Good et al., 1966, a.a.O. zu finden, worin außerdem die Strukturen angegeben sind. Alle Werte gelten für 20ºC und 0,1 M Ionenstärke.
Die Veränderungen der Säurebindungskoristante mit der Temperatur (delta-pKa- Wert) für Bicin und Tricin sind wesentlich geringer als für Tris-HCl. Tricin und Bicin verringern auch die für Tris festgestellte starke Temperaturabhängigkeit des pH-Werts.
Tricin- und Bicinpuffer erweitern auch den verwendbaren Mn²&spplus;-Konzentrationsbereich bei DNA-Polymerase-Einbautests. Wenn die Konzentration von Tricin oder Bicin erhöht wird, ist die Verringerung der DNA-Polymeraseaktivität bei einer ansteigenden Mn²&spplus;- Konzentration weniger ausgeprägt, und das Mn²&spplus;-Konzentrationsoptimum wird zu einer höheren Konzentration verschoben. Wie in Beispiel 7 gezeigt, ergaben Mangankonzentrationen von 0,4 mM bis 2,6 mM unter Verwendung der Tth-DNA-Polymerase in einem 50 mM Bicin-KOH-Puffer (pH 8,3) einen hinreichenden Einbau an einer DNA-Matrize. Unter Verwendung einer RNA-Matrize wurden etwa 40% der maximalen Aktivität bei einer Mn²&spplus;- Konzentration von nur 1 mM beobachtet. Es wurde beobachtet, daß sich die Aktivität erhöhte, wenn die Mangankorizentration von 1,0 auf 6 mM erhöht wurde, und ein Plateau für Konzentrationen zwischen etwa 6 und 12,5 mM erreichte. Ein allmählicher Anstieg der Aktivität wurde bei höheren Mn²&spplus;-Konzentrationen beobachtet; 48% der maximalen Aktivität wurden bei 20 mM beobachtet.
Bei der kombinierten RTIPCR ist eine geringe freie Manganionenkonzentration für den DNA-Amplifikationsschritt erforderlich, aber eine hohe freie Manganionenkonzentration ist für den reversen Transkriptionsschritt erforderlich. Diese doppelte Wirkung der erfindungsgemäßen Tricin- und Bicinpuffer, daß die erlaubte Mangangesamtkonzentration bei einer DNA-Amplifikation durch Komplexieren des größten Teils der freien Manganionen erweitert wird, aber ausreichend freies Mangan für die RT-Reaktion bereitgestellt wird, sieht erhebliche Verbesserungen fur die RT/PCR vor. Dies ist ein sehr übertaschendes Ergebnis, da die Erweiterung der dualen Bereiche aufgrund der allgemeinen Theorie und Literatur hinter den Metallpuffern nicht vorausgesagt werden konnte.
Da Reaktionskomponenten, wie dNTPs, Primer, Nucleinsäuren, Proteine oder EDTA, und viele Stoffe, die aus Probenherstellungsverfahren mitgeführt werden, die Fähigkeit besitzen, mit Mangan ein Chelat zu bilden, ist die Regulierung einer genauen Mangankonzentration sehr schwierig. Obwohl diese Komponenten von dem einzelnen Forscher überwacht werden können (mit großer Sorgfalt), unterliegt die Herstellung dieser Reagenzien für Anwendungen in Diagnose und Forschung im großen Maßstab strengen Beschränkungen. Die Verwendung der Metallpuffer Tricin und Bicin verschiebt nicht nur die optimale Mn²&spplus;- Konzentration nach oben, sondern erweitert auch den verwendbaren Bereich der Mn²&spplus;-Konzentration und der dNTP-Konzentration. Das Vermögen, eine höhere Mangankonzentration und einen größeren Bereich von Konzentrationen zu verwenden, erleichtert die Probleme der Reagensherstellung und der genauen Regulierung der Mangankonzentration in einer Reaktion.
Obwohl die Metallbindungskonstante (Log KM) von Tris als vernachlässigbar angenommen wurde (Good et al., 1966, a.a.O.), kann die Erhöhung der Konzentration von Tris-HCl in einer RT/PCR von 10 mM auf 100 mM den Mn²&spplus;-Konzentrationsbereich bei RNA-Zielmolekülen erweitern. Obwohl angenommen wurde, daß der Tris-Puffer Mn²&spplus; (sowie die meisten andere Metalle) geringfügig bindet, gibt Mornson, Methods Enzymol. 24b (1979), 53-68, an, daß "die Dissoziationskonstantante den Mn-Tris-Tris-Komplex bei 250 mM hoch ist, aber in einer Lösung von 100 mM Tris und 2 mM Mn²&spplus; etwa 29% des Metallions in einem Chelat gebunden würden". Beispiel 13 beschreibt die Verwendung von 100 mM Tris in einer RTIPCR, was eine wesentliche Erweiterung des Mangankonzentrationsbereichs bereitstellt; in dem ein amplifiziertes Produkt beobachtet wurde. Das Ausmaß der Erweiterung war überraschend und konnte aufgrund der allgemeinen Theorie und der Literatur hinter den Metallpuffern und Tris insbesondere nicht vorausgesagt werden.
Bicin- und Tricinpuffer enthalten vorzugsweise entweder KCl oder KOAc als das monovalente Kation: Der Bicin/KOAc-Puffer weist eine etwas geringere Ionenstärke als der BicinIKCl-Puffer auf, was dazu beitragen könnte, die Sekundärstrukturen in einer Matrize mit einem hohen G+C-Gehalt zu destabilisieren. Der pH-Wert des zu der Reaktion zugegebenen KOAc ist nicht so entscheidend, da das Bicin, das sowohl als ein Metallpuffer als auch als ein pH-Puffer wirksam ist, den pH-Wert der Reaktion hinreichend puffert. Ein Produkt wurde unter Verwendung von KOAc zwischen pH 7,0 und 9,4 beobachtet, wobei das Optimum bei pH 7,5 lag. der pH-Endwert einer Lösung von 50 mM Bicin (pH 803), 100 mM KOAc (p#H 7,5) und 2,5 mM Mn(OAc)&sub2; beträgt 7,97.
Die Bicinpufferlösungen können für längere Zeiträume gelagert werden. Zum Beispiel entsprach das Produkt, das in einer RTIPCR unter Verwendung eines Puffers, verdünnt ausgehend von einer lOx Lösung von 500 mM Bicin, 800 mM KCl und 21 mM MgCl&sub2;, der bei 4ºC 47 Tage gelagert wurde, dem Produkt, das in einer RT/PCR unter Verwendung eines frisch hergestellten Puffers gebildet wurde. Das Bicin hält auch die Löslichkeit von Metallionen bei; ein weiterer Vorteil der Verwendung des bevorzugten Bicin/KOAc/Mn(OAc)&sub2;- Puffers für die RTIPCR ist, daß das Mn(OAc)&sub2; weniger Löslichkeitsprobleme aufwirft, verglichen mit MnCl&sub2;. Daher kann die Präzipitation von Manganhydroxiden und -oxiden, die in der RT/PCR nachteilig ist, verhindert werden.
Die erfindungsgemäßen Sterilisierungsverfahren schreiben vor, daß die RT/PCR in Gegenwart von dUTP durchgeführt wird. Die maximale Wirksamkeit der Uracil-N-Glykosylase (UNG)-Sterilisierung wird erzielt, wenn dUMP anstelle von jedem dTMP in der verunreinigenden Matrize eingebaut wird. Zur Maximierung des dUMP-Einbaus ist es wünschenswert, die zu der RT/PCR zugegebene Menge an dTTP um etwa das 2fache zu verringern, da die Tth-DNA-Polymerase dUTP benachteiligt, wenn dTTP während der reversen Transkription vorhanden ist. Da das dNTP Mn²&spplus; bindet, steht die freie Mn²&spplus;-Konzentration in direkter Beziehung mit der dNTP-Konzentration. Der Bicin/KOAc-Puffer, der den verwendbaren Mn²&spplus;-Konzentrationsbereich vergrößert, ermöglicht auch, daß eine höhere dNTP- Konzentration bei einer bestimmten Mn²&spplus;-Konzentration verwendet werden kann, da die Pufferung der freien Mn²&spplus;-Konzentration die zusätzliche Mn²&spplus;-Bindung durch das dNTP ausgleicht. Der Bicin/KOAc-Puffer läßt nicht nur erhöhte dNTP-Gesamtkonzentrationen zu, sondern erlaubt auch, daß höhere relative Konzentrationen von dUTP während der RT/PCR verwendet werden können, um die Einbaumengen von dUMP während des reversen Transkriptionsschritts durch die rTth-DNA-Polymerase zu erhöhen. Dies ist besonders vorteilhaft bei RNA-Zielmolekülen; die einen großen Prozentsatz an Adeninresten aufweisen, wie das menschliche Immunschwächevirus (HIV).
Ein weiterer Vorteil der bevorzugten erfindungsgemäßen Bicin- und Tricinpuffer ist, daß sie die Wirksamkeit der Sterilisierungsverfahren erhöhen. Es ist bekannt, daß sowohl divalente Metallkationen als auch eine hohe Ionenstärke die UNG hemmen (Lindahl et al., J. Biol. Chem. 252 (10) (1977), 3286-3294; Krokan und Witter, Nucl. Acids Res. 9 (11) (1981), 2599-2613; und Caradonna und Cheng, J. Biol. Chem. 255 (6) (1980), 2293-2300). Die bevorzugten Puffer verringern sowohl den Anteil des freien Metallions als auch die Ionengesammtstärke, wodurch die Hemmwirkung des Puffers auf die UNG auf ein Minimum verringert und die Wirksamkeit der Sterilisierung des Reaktionsgemisches verbessert wird:
Die durch das Metallion katalysierte Hydrolyse der RNA-Matrize verringert die Wirksamkeit der RT-Reaktion und begrenzt die Länge der Matrize, die revers transkribiert werden kann. Das Problem der Matrizenhydrolyse wird durch die hohe Temperatur des RT- Schritts bei den vorliegenden Verfahren verschlimmert. Verfahren und Reaktionsbedingungen unter Verwendung von MnCl&sub2; in einem Tris-Puffer, die die Hydrolyse der RNA-Matrizen auf ein Minimum verringem, werden in den Beispielen bereitgestellt und bei Myers und Gelfand, Biochemistry 30 (1991), 7661-7666, besprochen. Die bevorzugten Bicin/KOAc-Puffer bilden mit dem Mangan einen Komplex, so daß bei erhöhten Temperaturen eine geringere metallkatalysierte RNA-Hydrolyse auftritt. Außerdem tritt ein geringer, wenn überhaupt, zusätzlicher Verlust von markierter RNA vollständiger Länge durch die Einbeziehung einer Vorinkubation der RNA von 15 Sekunden bei 95ºC auf, wenn diese Puffer verwendet werden. Die bevorzugten Puffer erlauben die Verlängerung des reversen Transkriptionsreaktionszeitraums, um die Wirksamkeit in dem RT-Schritt zu erhöhen, und schließen eine Vorinkubation bei hoher Temperatur ein, um die RNA zu denaturieren, damit Bereiche mit einem hohen Sekundärstrukturgrad vor der reversen Transkription verringert werden oder, in dem Fall, daß eine doppelsträngige RNA-Matrize amplifiziert werden soll, die Matrize denaturiert wird, um eine einzelsträngige Matrize für die reverse Transkription bereitzustellen. Außerdem erleichtert die Verringerung der RNA-Hydrolyse die Synthese einer langen (> 2 kb) cDNA unter Verwendung der Tth-DNA-Polymerase durch Verringerung der Wahrscheinlichkeit, daß die RNA-Matrize abgebaut wird, bevor die reverse Transkription beendet ist.
Die vorliegenden Verfahren erfordern nur, daß RNA in der Probe vorhanden ist. In einem Beispiel wird eine synthetische RNA, die unter Verwendung eines Plasmids hergestellt wurde, das einen Promotor des Bakteriophagen T7 enthält, durch die erfindungsgemäßen Verfahren revers transkribiert und amplifiziert. In einem anderen Beispiel wird eine heterogene Population zellulärer Gesamt-RNA verwendet, um eine spezifische mRNA revers zu transkribieren und zu amplifizieren. Zur Durchführung der Erfindung liegt die in der Probe vorhandene Menge an RNA im allgemeinen im Bereich von 0,1 pg bis 1 ug. Die erforderliche Menge und die Ergebnisse variieren in Abhängigkeit von der Komplexität der Proben-RNA und der Art des verwendeten Nachweises. Wegen der Spezifität der reversen Transkriptionsreaktion bei hoher Temperatur sind 1 bis 108 Moleküle der Ziel-RNA ausreichend, um Mengen des PCR-Produkts bereitzustellen, die im Mikrogrammbereich oder darüber liegen. In mehreren der offenbarten Beispiele werden die Amplifikationsprodukte durch Ethidium- bromidfärbung nach einer Gelelektrophorese von 5% des gesamten reaktionsgemisches sichtbar gemacht. Auf diese Weise wird die erforderliche Menge des amplifizierten Zielmoleküls wesentlich verringert, wenn andere Mittel zur Untersuchung des Produkts verwendet werden.
Zum Beispiel könnten Isotopen-markierte DNA-Sonden, die zum Nachweis der einer Elektrophorese unterworfenen Produkte geeignet sind, die Empfindlichkeit des Nachweises erhöhen und daher den Grad der Amplifikation oder die Anzahl der Zyklen verringern, der bzw. die zum Nachweis des amplifzierten Produkts erforderlich sind (z. B. 1-10&sup8; Moleküle Ziel-RNA in der Probe).
Vorzugsweise beträgt die in einer 10 mM Tris-HCl-reversen Transkriptionsreaktion von 20 ul vorhandene Menge an RNA 10 pg bis 500 ng und am meisten bevorzugt 0,1 bis 300 ng. Wenn die Probe mehr als 300 ng RNA enthält, kann es wünschenswert sein, ein zusätzliches Enzym zu verwenden, um die Transkription eines cDNA-Produkts vollständiger Länge von der RNA-Matrize sicherzustellen. Jedoch, wenn die reverse Transkriptionsreaktion mit einer PCR verbunden ist, sollte die Wirkung einer hohen Enzymkonzentration in der PCR- Reaktion berücksichtigt werden. Wenn zum Beispiel die Taq-DNA-Polymerase als die hitzeaktive Polymerase verwendet wird, können hohe Enzymkonzentrationen unspezifische PCR-Produkte und geringere Ausbeuten ergeben (vgl. Saiki in "PCR Technology", Hrsg. Erlich, 1989, Stockton Press). Die möglichen Probleme, die sich aus einer hohen Enzymkonzentration ergeben, werden jedoch in einfacher Weise durch Inaktivierung der hitzeaktiven DNA-Polymerase zwischen der reversen Transkriptionsreaktion und der Ampliflkationsreaktion vermieden. Die Inaktivierung wird durch Inkubieren des cDNA-Synthese- Reaktionsgemisches bei 99ºC für 3 bis 10 Minuten erreicht. Eine geeignete Menge der hitzestabilen DNA-Polymerase wird dann wieder zu dem Reaktionsgemisch zugegeben, und die PCR wird wie üblich durchgeführt. Dieses Verfahren ist auch geeignet, wenn verschiedene hitzestabile DNA-Polymerasen für jede der zwei Reaktionen verwendet werden (vgl. Beispiel VII in WO 91/09944).
Ein Vorteil der hier beschriebenen Bicinpuffer ist, daß größere Mengen an RNA in der reversen Transkriptionsreaktion vorhanden sein können. Zum Beispiel beträgt die bevorzugte Menge an RNA unter Verwendung eines Bicinpuffers und dTTP bis zu 1 ug für eine 50 ul-Reaktion. In dem bevorzugten Bereich sind 1 bis 10 Einheiten der hitzeaktiven DNA- Polymerase ausreichend, um ein cDNA-Produkt vollständiger Länge bereitzustellen. Um überwiegend eine cDNA vollständiger Länge zu erhalten, ist das Enzym-zu-Matrize-Verhältnis vorzugsweise größer als 0,5.
Ein Verteil der RT/PCR-Verfahren unter verwendung der Tth- oder Taq-DNA Polymerase ist, daß niedrigere molare Konzentrationen der DNA-Polymerase für eine wirksame reverse Transkription und Amplifikation erforderlich sind. Zum Beispiel erfordert jede Aktivitätseinheit etwa 1,0 umol E. coli-DNA-Polymerase I, während nur etwa 0,043 umol der Taq-DNA-Polymerase oder etwa 20- bis 25mal weniger Protein erforderlich sind. Beispiel 3 beschreibt eine homogene RT/PCR, die 5 Einheiten der rTth-DNA-Polymerase in einer 20 ul- Reaktion verwendet, was einer DNA-Polymerase-Konzentration von etwa 15 nM entspricht. Unter Verwendung der bevorzugten Bicin- und Tricinpuffer kann die Menge der DNA- Polymerase weiter verringert werden. Die Beispiele 8, 10 und 12 beschrieben eine homogene RT/PCR unter Verwendung von 10 Einheiten der rTth-DNA-Polymerase in 100 ul-Reaktionen, was einer DNA-Polymerase-Konzentration von etwa 6 nM entspricht. Außerdem erfordert die hier beschriebene Ein-Enzym-RT/PCR erheblich weniger Gesamtprotein in der Reaktion, verglichen mit Multienzym-Amplifikationssystemen, wie 3SR (Kwoh et al., a.a.O.; Guatelli et al., a.a.O.; und PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 92/0880A). Während die beispielhaften 100 ul-RT/PCR-Reaktionen 40 ng (10 Einheiten) der rTth-DNA-Polymerase enthalten, würde eine 100 ul-3SR-Reaktion 1,44 ug Enzym (0,6 ug AMV-RT, 0,83 ug T7- RNA-Polymerase und 0,01 ug E. coli-RNase H) oder etwa 36mal mehr Protein enthalten. Sowohl die Verringerung des Gesamtproteins als auch die Verwendung von nur einem Enzym in der homogenen RT/PCR vereinfachen die Probleme bei der Reagensherstellung und Qualitätskontrolle erheblich.
Nach Herstellung der RNA-enthaltenden Probe und Zugabe des geeignete Primers und der Salze wird die Reaktion mit der hitzeaktiven DNA-Polymerase 1-60 Minuten inkubiert. Üblicherweise ist jedoch eine Reaktionszeit von 2 bis 30 Minuten geeignet. Falls das Zielmolekül lang ist oder das Verhältnis von Gesamt-RNA-zu-Ziel-RNA hoch ist, z. B. 100 Kopien Ziel-RNA in Gegenwart von 250 ng RNA insgesamt, wird eine Inkubationszeit von 10-30 Minuten bevorzugt.
Es wird bevorzugt, aber ist nicht wesentlich, daß die hitzeaktive DNA-Polymerase zu dem reversen Transkriptionsreaktionsgemisch zugegeben wird, nachdem sowohl der Primer als auch die RNA-Matrize zugegeben wurden. In einer anderen Ausführungsform zum Beispiel werden das Enzym und der Primer zuletzt zugegeben, oder das MnCl&sub2; oder die Matrize plus MnCl&sub2; werden zuletzt zugegeben. Es ist im allgemeinen wünschenswert, daß mindestens eine Komponente, die für die Polymerisationsaktivität wesentlich ist, bis zu dem Zeitpunkt, wo sowohl der Primer als auch die Matrize vorhanden ist und das Enzym an das gewünschte Primer/Matrize Substrat binden und dieses verlängern kann, nicht vorhander ist (vgl. Europäische Patentanmeldung EP-A-515,506).
Bei der Durchführung der vorliegenden Verfahren wird das Reaktionsgemisch oberhalb von 40ºC inkubiert, obwohl eine bevorzugte Temperatur 55-75ºC ist. Bei dieser Temperatur wird die Spezifität der Primer-Matrize-Aneinanderlagerung verbessert, verglichen mit der Aneinanderlagerungsspezifität bei einer niedrigeren Temperatur, und das hitzeaktive Enzym weist eine größere Aktivität bei der erhöhten Temperatur auf. Die erhöhte Temperatur verringert das unspezifische Priming durch abgebaute native Nucleinsäure und durch eine falsche Primer-Matrize-Hybridisierung.
Nach der reversen Transkription kann die RNA-Matrize abgebaut oder alternativ denaturiert werden, wobei eine Matrize zur fortlaufenden Replikation bereitgestellt wird, die einen Überschuß an einzelsträngigen DNA-Molekülen ergibt. Dieser Überschuß an einzelsträngiger DNA kann durch übliche Sondenhybridisierungsverfahren nachgewiesen werden. Folglich stellt die Erfindung Mittel zum direkten Nachweis von Zielsegmenten bereit. Die so erhaltenen Nucleinsäureprodukte können durch eine Reihe von elektrophoretischen oder chromatographischen Mitteln nachgewiesen werden. Die Verwendung eines radiomarkierten Triphosphats ist bei der Überwachung des Ausmaß der Reaktion und der Größe der gebildeten Produkte nützlich obwohl dies keine wesentliche Komponente der Erfindung darstellt.
Die reversen Transkriptionsreaktionsprodukte sind als M021J32U zur Amplifikation durch PCR geeignet. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die reverse Transkriptionsreaktion nach der reversen Transkription unter Inkubieren bei einer hohen Tempera- 112 den PCR-Pufferungsbedingungen angepaßt, und die Amplifikation wird nach Zugabe eines zweiten Primers eingeleitet. PCR-Puffer wird zugegeben, um die geeignete Pufferungskapazität, den pH-Wert und die Konzentration des monovalenten Kations aufrechtzuerhalten und die Konzentration des Enzyms und der dNTPs unter-20-200 uM jedes dNTP zu verdünnen. MgCl&sub2; wird bis zu einer Endkonzentration von 1-3 mM zugegeben. Vorzugsweise sind die Konzentrationen dNTPs in sowohl dem reversen Transkriptase- als auch dem PCR-Reaktionsgemisch ausgeglichen. Da Mn²&spplus; die PCR-Amplifikation verringern kann, wenn es in hohen Konzentrationen vorhanden ist, wird das Mn²&spplus; in einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform vor der PCR-Amplifikation in einem Chelat gebunden. Vorhandensein von großen Mengen an Mn²&spplus; kann auch die Genauigkeit während der Amplifikation verringern, jedoch wird dieses Problem durch die Bindung des Mn²&spplus; in einem Chelat umgangen. Demgemäß wird in einer bevorzugten Ausführungsform nach der reversen Tran Transkriptionsreaktion EGTA bis zu einer Konzentration, zwischen dem etwa 1 bis 3fachen der molaren Konzentration von Mn²&spplus; liegt, um das Mn²&spplus; in einem chelat zu binden. In Gegenwart von sowohl Mg²&spplus; als auch Mn²&spplus; bindet EGTA vorzugsweise Mn²&spplus;. Niedrige dNTP- und Mg²&spplus;-Konzentrationen, wie hier beschrieben, können auch die Genauigkeit der Tth-DNA-Polymerase während der Amplifikation erhöhen. Glycerin und ein nichtionisches Detergens (zum Beispiel Tween-20TM) können bis zu einer Endkonzentration zwischen 1-20% bzw. 0,01-0,05% zugegeben werden, um die Enzymstabilität zu erhöhen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird das Mn²&spplus; vor der PCR nicht in einem Chelat gebunden. Die PCR kann Mn²&spplus; anstelle von Mg²&spplus; verwenden, obwohl Mg²&spplus; bevorzugt wird, wie vorstehend beschrieben. Insbesondere wird für Anwendungen, wie zum Beispiel das diagnostische Screening im großen Maßstab, das Risiko einer Ungenauigkeit während der Amplifikation und einer möglichen geringfügigen Hydrolyse der Matrize im Hinblick auf die enormen Vorteile, die ein homogenes RT/PCR-Verfahren bereitstellt, ohne weiteres toleriert. Das in zwei Stufen ablaufende Einzusatz-Verfahren beschränkt die Probenhandhabung auf ein Minimum und verringert die Möglichkeit einer wechselseitigen Verunreinigung. Da das MnCl&sub2; die Wirksamkeit der PCR beeinflußt, wird die optimale Konzentration vorzugsweise für die einzelnen verwendeten Reaktionskomponenten: Primer, Zielmolekülkonzentration, dNTP-Konzentration, Puffer, Salze etc., durch Standardmittel titriert. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Mn(OAc)&sub2; enthaltender Bicin/KOAc-Puffer verwendet, der einen größeren Bereich von Mn²&spplus;- und dNTP- Konzentrationen erlaubt.
Die hier bereitgestellten Verfahren finden zahlreiche Anwendungen, besonders auf den Gebieten der Molekularbiologie und der medizinischen Diagnostik. Die beschriebene reverse Transkriptaseaktivität stellt ein cDNA-Transkript von einer RNA-Matrize bereit. Die Verfahren zur Herstellung und Amplifikation von DNA-Segmenten von einem RNA-Molekül sind geeignet, wo das RNA-Molekül ein Vertreter einer Population der Gesamt-RNA ist oder in einer geringen Menge in einer biologischen Probe vorhanden ist. Der Nachweis eines in einer Probe vorhandenen spezifischen RNA-Moleküls wird durch eine hitzeaktive oder hitzestabile DNA-Polymerase, die in den hier beschriebenen Verfahren verwendet wird, sehr erleichtert. Die außerordentliche Erhöhung der Spezifität erübrigt die Notwendigkeit für eine "ineinandergeschachtelte PCR", um seltene Zielmoleküle nachzuweisen. Ein spezifisches RNA-Molekül oder eine Gesamtpopulation von RNA-Molekülen kann unter Verwendung eines hitzeaktiven oder hitzestabilen Enzyms, wie hier beschrieben, amplifiziert, quantifiziert, isoliert und gegebenenfalls cloniert und sequenziert werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen stehen verglichen mit früheren Verfahren zur reversen Transkription von RNA in ein DNA-Produkt eine enorme Verbesserung dar. Ausgehend von einer RNA-Matrize weisen diese Verfahren eine verbesserte Spezifität auf und stellen Matrizen zur PCR-Amplifikation bereit, die verglichen mit vorher verfügbaren Verfahren effizienter hergestellt werden. Die Erfindung stellt spezifischere und daher genauere Mittel zum Nachweis und zur Charakterisierung spezifischer Ribonucleinsäuresequenzen bereit, wie jene, die mit Infektionskrankheiten, Erbkrankheiten oder Zellschädigungen in Zusammenhang stehen.
Dem Fachmann ist bekannt, daß die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in Kits eingebracht werden können. Folglich betrifft die Erfindung auch Kits, umfassend einen Puffer mit einem geeigneten Pufferungsmittel, das eine zwitterionische Verbindung ist, die Wasserstoffionenpufferung bereitstellt und auch vorzugsweise die Konzentration des divalenten Kations puffert, und eine hitzeaktive DNA-Polymerase sowie vorzugsweise eine Gebrauchsanweisung, die die Anwendung des Verfahrens zur reversen Transkription von RNA beschreibt. In einer Ausführungsform kann ein solcher Kit mit dem Nachweis von mindestens einer spezifischen Ziel-RNA-Sequenz in einer Probe verbunden sein. Ein solcher Kit würde zusätzlich zu den vorstehend aufgeführten Elementen einen Primer umfassen, der eine Sequenz umfaßt, die ausreichend komplementär zu einer spezifischen Ziel-RNA-Sequenz ist, um damit zu hybridisieren. Diagnostische Kits zur Amplifikation und zum Nachweis von mindestens einer spezifischen Ziel-RNA-Sequenz in einer Probe können einen Primer umfassen, der eine Sequenz umfaßt, die ausreichend übereinstimmt mit dem RNA-Zielmolekül, damit er mit dem ersten synthetisierten cDNA-Strang hybridisieren kann, um die Synthese eines zweiten cDNA-Strang zu veranlassen. Die Kits können zusätzlich zu den aufgeführten Komponenten die vier Desoxyribonucleotidtriphosphate, geeignete Puffer, wie hier beschrieben, Oligo(dT), RNase H, Linker zur Clonierung sowie ein oder mehrere Restriktionsenzyme enthalten.
Die folgenden Beispiele werden nur zur Veranschaulichung bereitgestellt und sollten in keiner Weise als Begrenzung der in der vorliegenden Patentanmeldung offenbarten Erfindung ausgelegt werden. Weitere Einzelheiten über die in diesen Beispielen ver- bzw. angewendeten Materialien und Methoden findet man in WO 91/09944. Insbesondere stellt. WO 91/09944 ausführliche Informationen über die synthetische Matrize pAW106 und die Primer DM156 (SEQ ID Nr. 9), DM151 (SEQ ID Nr. 10), DM152 (SEQ ID Nr. 11) und TM01 (SEQ ID Nr. 12) bereit, wobei die Sequenz dieser Primer wie folgt ist:
DM156 SEQ ID Nr. 9 5'-TGGAGAACACCACTTGTTGCTCCA-3'
DM151 SEQ ID Nr. 10 5'-GTCTCTGAATCAGAAATCCTTCTATC-3'
DM152 SEQ ID Nr. 11 5'-CATGTCAAATTTCACTGCTTCATCC-3'
TM01 SEQ ID Nr. 12 5'-GCTTGCAAGCTTTATTTAGTTATGACTGATAACACTC-3'

Beispiel 1

Vergleich der Taq-Polymerase und der Tth-Polymerase in einer kombinierten RT/PCR- Reaktion

Die Verwendung des in Beispiel VII von WO 91/09944 beschriebenen cRNA- Standards erleichtert die direkte Analyse der Wirkung von Versuchsbedingungen auf die RT/PCR-Wirksamkeit, da die Anzahl der in dem Reaktionsgemisch vorhandenen Zielmoleküle bekannt ist. Insbesondere wurde die Wirksamkeit der Tth- und Taq-DNA- Polymerasen in einer kombinierten RT/PCR-Reaktion verglichen.
Die RT-Reaktionen (20 ul) enthielten 10 mM Tris-HCl, pH 8,3; 90 mM KCl (40 mM für Reaktionen enthaltend Taq); 1,0 mM MnCl&sub2;; jeweils 200 uM dATP, dCTP, dGTP und dTTP; 15 umol DM152 (SEQ a Nr. 11); und 5 Einheiten der rTth- oder Taq-DNA- Polymerase; und 10&sup6;, 10&sup5; oder 10&sup4; Kopien pAW109-cRNA. Die sechs Reaktionen wurden mit 75 ul Mineralöl überschichtet und 15 Minuten bei 70ºC inkubiert.
Nach der RT-Reaktion wurden 80 ul einer Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 100 mM KCl (50 mM für Reaktionen enthaltend Taq), 1,88 mM MgCl&sub2;, 0,75 mM EGTA, 5% Glycerin (Vol./Vol.) und 15 umol Primer DM151, zugegeben. Die Proben (100 ul) wurden dann in einer Thermocycler-Vorrichtung von Perkin Elmer, Norwalk, CT, wie folgt amplifiziert: 2 Minuten bei 95ºC für 1 Zyklus; 1 Minute bei 95ºC und 1 Minute bei 60ºC für 35 Zyklen; und 7 Minuten bei 60ºC für 1 Zyklus: Aliquots (5 ul) der PCR-Amplifikationen wurden durch Elektrophorese auf 2% (Gew./Vol.) NuSieve®, 1% (Gew./Vol.) Seakem®-Agarose, gefärbt mit Ethidiumbromid, analysiert.

Ergebnisse

Die rTth-DNA-Polymerase erzeugte ausgehend von 10&sup4; Kopien der Ziel-cRNA ein 308 bp großes Produkt, das durch Elektrophorese auf einem mit Ethidiumbromid gefärbten Gel sichtbar gemacht wurde. Das Produkt wurde bei 10&sup4; oder 10&sup5; Kopien des Zielmoleküls nicht für die Taq-Polymerase beobachtet, obwohl niedrigere Nachweisgrenzen zu erwarten gewesen wären, wenn Hybridisierungsverfahren anstelle der Ethidumbromidfärbung verwendet wurden. Diese ergebnisse zeigen, daß unter ähnlichen Reaktionsbedingungen die Tth DNA-Polynierase eine etwa 100fach größere Empfndlichkeit als die analoge Taq-DNA-Polymerase in einer kombinierten reversen Transkription/PCR-Amplifikation bereitstellt.

Beispiel 2

Bevorzugtes Protokoll einer nichthomogenen reversen Transkription/PCR

A. Reverse Transkriptionsreaktion

In einem 0,5 ml-Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen werden 9,4 ul steriles destilliertes Wassei; 2 ul 10x rTth-RT-Puffer; 2 ul MnCl&sub2; (10 mM); jeweils 0,4 ul dGTP, dATP, dTTP und dCTP (jeweils mit 10 mM); 2 ul rTth-DNA-Polymerase, 2,5 E/ul; 1 ul Primer DM152 (SEQ ID Nr. 11) (15 u I) (oder ein anderer "Stromabwärts"-Primer); und 2 ul Positivkontroll-RNA oder Versuchsprobe, enthaltend ≤ 250 ng RNA insgesamt, vereinigt.
In dieser Ausführungsform dient die Positivkontroll-RNA als Matrize für DM152 (SEQ ID Nr. 11). Die Konzentration der Kontroll-RNA beträgt vorzugsweise ~10&sup4; Kopien/120 j.d. Zum Beispiel kann die Kontroll-RNA eine RNA sein, die von pAW109 in 30 ug/ml E. coli-rmA in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA und 10 mM NaCl transkribiert wurde:
Das Gesamtvolumen der reversen Transkriptionsreaktion sollte 20 ul pro Probe betragen:
Um ein Verdampfen oder Rückfluss zu verhindern, wird das Gemisch mit 50-100 ul Mineralöl überschichtet.
Die Röhrchen werden in einer Thermocycler-Vorrichtung von Perkin Elmer, Norwalk, CT, unter Verwendung eines Inkubationsschrittes ("soak file") bei 70ºC 5-15 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird dadurch beendet, daß die Röhrchen bis zum Gebrauch auf Eis gestellt werden.

B. PCR-Reaktion

Für jede Probe werden mindestens 80 ul eines PCR-Hauptgemisches wie folgt hergestellt: 8 ul 10x Chelatbildungspuffer, 6-10 ul 25 mM MgCl&sub2;, 1 ul Primer DM 151 (SEQ ID Nr. 10) (15 uM) oder ein experimenteller "Stromaufwärts"-Primer und steriles destilliertes Wasser. Jede Kombination von Volumina aus Wasser, MgCl&sub2; und "Stromaufwärts"-Primer kann verwendet werden, solange das Gesamtvolumen des Hauptgemisches 80 ul pro Probe entspricht.
Die optimale MgCl&sub2;-Konzentration kann in Abhängigkeit von der dNTP-Gesamtkonzentration und dem verwendeten Primer und der verwendeten Matrize variieren. In den meisten Fällen ergibt eine MgCl2 Endkonzentration im bereich von 1,5-2,5 mM dem Reaktionsgemisch ausgezeichnete Ergebnisse. Wenn die verwendete Matrize die PositivkontrollpAW 109-RNA ist, werden 6 ul einer 25 mM MgCl&sub2;-Stammlösung für eine MgCl&sub2;-Endkonzentration von 1,5 mM bevorzugt.
80 ul des PCR-Hauptgemisches werden in jedem reversen Transkriptionsreaktionsröhrchen dispensiert. Die Pipettenspitzen werden zwischen den Zugaben gewechselt, um eine Probenmitführung zu vermeiden. Die Röhrchen werden ~30 Sekunden in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert.
Zur Amplifikation der positiven pAW109-RNA-Kontrolle wird die Thermocycler- Vorrichtung (Perkin Elmer, Norwalk, CT) wie folgt vier miteinander verbundene Daten gruppen programmiert:
Zyklusschritt: 2 Minuten bei 95cC für 1 Zyklus
Zyklusschritt: 1 Minute bei 95ºC und 1 Minute bei 60ºC fur 35 Zyklen
Zyklusschritt: 7 Minuten bei 60ºC Zyklus
Inkubationsschritt: 4ºC
Die PCR-amplifizierten Proben können bis zur anschließenden Analyse tiefgefroren gelagert werden.
Die Wahl von 60ºC für die Aneinanderlagerungs-Verlängerungstemperatur ist zur Amplifikation der Positivkontroll-cDNA optimal. Es kann notwendig sein, die Aneinanderlagerungs-Verlängerungs-Temperatur für andere Primer-Matrize-Paare zu erniedrigen oder zu erhöhen. Höhere Aneinanderlagerungs-Verlängerungs-Temperaturen ergeben im allgemeinen eine verbesserte oduktspezifität (vgl. Saiki et al., Science 239 (1988), 487-491). Das Optimum kann empirisch dadurch bestimmt werden, daß in Anstiegen von 5ºC oder weniger getestet wird, bis eine maximale Spezifität und Produktausbeute erzielt wird.
Die optimale Magnesiumchloridkonzentration für die PCR-Amplifikation kann empirisch dadurch bestimmt werden, daß Konzentrationen von 1,5 bis 2,5 mM Magnesiumchlorid für jeden Primersatz getestet werden. Zu wenig oder zu viel Magnesiumchlorid kann die Amplifikationseffizienz beeinflussen. Es kann bevorzugt werden, die Magnesiumchloridkonzentration parallel zu wesentlichen Veränderungen der Konzentration der Proben-RNA, dNTPs, cDNA und DNA anzupassen.
Für Matrizen von denen bekannt ist, daß sie einen hohen Strukturgrad aufweisen, kann ein "Hot Start"-Protokoll bevorzugt werden. Zwei Reaktionsgemische für die reverse Transkriptionsreaktion werden hergestellt. Gemisch A: 9,4 ul steriles destilliertes Wasser; 2 ul rTth-reverse Transkriptasepuffer; 1 ul "Stromabwärts"-Primer; und 2 ul Proben-RNA (< 250 ng RNA insgesamt). gemisch B. 2 ul 10 mM MnCl&sub2;-Lösung, 0,4 ul dGTP; 0,4 ul dATP; 0,4 ul dCTP; 0,4 u1 dTTP (jeweils mit 10 mM); und 2 ul rTth-DNA- Polymerase.
Beide Reaktionsgemische werden bei Raumtemperatur hergestellt. Gemisch A wird 5 Minuten bei 70ºC inkubiert, dann wird Gemisch B zugegeben (während das Reaktionsgemisch A noch bei 70ºC gehalten wird) und 5 bis 15 Minuten bei 70ºC inkubiert, wie vorstehend in dem Abschnitt mit dem Titel "Reverse Transkriptionsreaktion" beschrieben ist. Die PCR-Reaktion wird durchgeführt wie vorstehend beschrieben.

C. Reagenzien

Das bevorzugte Protokoll verwendet die folgenden Reagenzien:
1351 INA-Polymerase 2,5 Einheiten/ul
Primer DM 152 (SEQ ID Nr. 11) 15 l
Primer DM 151 (SEQ ID Nr. 10) 15 uM
Positivkontroll-RNA 5 · 10³ Kopien/ul
dATP 10 mM
dGTP 10 mM
dCTP 10 mM
dTTP 10 mM
10x rTth-reverse Transkriptase-RT-Puffer: 100 mM Tris-HCl, pH 8,3; 900 mM KCl
10x Cheltbildungspuffer 50% Glycerin (Vol./Vol.) 100 mM Tris-HCl, pH 8,3; 1 M KCl 7,5 EGTA, 0,5% Tween-20
MnCl&sub2;-Lösung 10 mM
MgCl&sub2;-Lösung 25 mM
Diese Komponenten können als Kit zur reversen Transkription bei hoher Temperatur zusammengestellt werden. Variationen des Kits sind im Schutzumfang der offenbarten Erfindung eingeschlossen. Zum Beispiel kann das MnCl&sub2; in den reversen Transkriptase- Puffer eingeschlossen sein, und das MgCl&sub2; kann in den Chelatbildungspuffer eingeschlossen sein. Jedoch werden MnCl&sub2; und MgCl&sub2; zur Optimierung der Reaktionen als einzelne Reagenzien bereitgestellt. Die Verwendung einer Positivkontrolle, obwohl nicht erforderlich, wird in einer im Handel erhältlichen Ausführungsform der Erfindung bevorzugt.

Beispiel 3

Homogener RT/PCR-Test

Diese Methode stellt ein Verfahren für eine in zwei Stufen ablaufende Einzusatzreverse Transkriptions/PCR-Amplifikationsreaktion bereit. Eine TC9600-Thermocycler-Vorrichtung (Perkin Eliner, Norwalk, CT) wurde verwendet, und das Gerät wurde vor der Herstellung des Reaktionsgemisches angeschaltet, um die Abdeckung vorzuheizen. Die Reaktionen wurden in 0,2 ml-MicroAmp®-Röhrchen ausgeführt, die im Handel von Perkin Elmer, Norwalk, CT, erhältlich sind. Jede Reaktion enthielt 6,4 ul steriles destilliertes H&sub2;O; 2 ul 10x RT-Puffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,3; 900 mM KCl); 1,6 ul 10 mM MnCl&sub2;; 2 ul 10x dNTP- T (jeweils 2 mM dATP, dCTP und dGTP in H&sub2;O, pH 7,0); 2 ul 2 mM dTTP; 1 ul Primer DM152 (SEQ ID Nr. 11) (15 uM); 1 ul Primer DM151 (15 uM); und 2 ul rTth-DNA-Polymerase (2,5 E/ul). Ein 20x Reaktionsgemisch wurde hergestellt (360 ul Gesamtvolumen), und 18 ul des Gemisches wurden wie nachstehend beschrieben in 16 Röhrchen aliquotiert, die die Matrize enthielten. Die verwendete Matrize war AW109-cRNA. Die Röhrchen Nr. 1-3 und 9- 11 enthielten 10&sup4; Kopien der Matrize in 2 ul. Die Röhrchen Nr. 4-6 und 12 = 14 enthielten jeweils 10² Kopien in 2 ul. Die Röhrchen Nr. 7, 8, 15 und 16 enthielten nur 2 ul 30 ng/ul rRNA als negative Kontrolle.
Die Röhrchen Nr. 1-8 wurden während der RT-Reaktion als -RT-Kontrollen auf Eis gelagert. Die Röhrchen Nr. 9-16 wurden in eine TC9600-Thermocycler-Vorrichtung (Perkin Elmer, Norwalk, CT) gestellt und für 1 Zyklus bei 70ºC 15 Minuten erhitzt und dann auf 95ºC erhitzt, während die Röhrchen Nr. 1-8 für den PCR-Schritt in die Thermocycler-Vorrichtung gestellt wurden. Alle Röhrchen wurden den folgenden Zyklen unterworfen: 75 Sekunden bei 95ºC für 1 Zyklus;
30 Sekunden bei 95ºC und 20 Sekunden bei 60ºC für 35 Zyklen; und
2 Minuten bei 60ºC für 1 Zyklus.

Ergebnisse

5 ul jeder Reaktion wurden dann auf einem mit Ethidiumbromid gefärbten 2% NuSieve, 1% Agarose-Gel analysiert und fotografiert. In den -RT-Kontrollen (Röhrchen Nr. 1-8) oder den "Kontrollen ohne Zielmolekül" (Röhrchen Nr. 15 und 16) war kein Produkt mit der vorhergesagten Größe sichtbar. Das Produkt mit der erwarteten Größe war ohne weiteres in den Bahnen 9-11 (10&sup4; Kopien des Zielmoleküls) sichtbar und auch in den Bahnen 12-14 (10²) Kopien des Zielmolekuls) vorhanden, jedoch erwärtungsgemäß mit einer geringeren Intensität.

Beispiel 4

Verwendung von dUTP und der Uracil-N-Glykosylase (UNG) zur Verhinderung einer Verunreinigung der PCR durch ein mitgeführtes Produkt während einer reversen Transkription bei hoher Temperatur in Verbindung mit einer Amplifikation

Dieses Beispiel veranschaulicht den Einbau eines unüblichen Nucleotids, um eine Verunreinigung durch ein mitgeführtes Produkt auf ein Mindestmaß zu begrenzen. Das Reaktionsgemisch wurde vor der reversen Transkription mit UNG behandelt, um verunreinigende Produkte abzubauen, die aus vorangehenden Tests stammen, welche das gleiche unübliche Nucleotid enthalten. Die UNG-Behandlung wird wie folgt durchgeführt: 0,5 Einheiten UNG (entwickelt und hergestellt von Hoffmann-La Roche Inc. und im Handel erhältlich von Perkin Elmer, Norwalk, CT) pro 20 ul-RT-Reaktion. Die Reaktion wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend bei 70ºC 15 Minuten erhitzt, um die Glykosylase zu inaktivieren und die reverse Transkription zu veranlassen. Das Experiment veranschaulicht auch die Titration der MnCl&sub2;-Konzentration zur Bestimmung der optimalen Konzentration für die einzelne Matrize, die Primer und die aufgeführten Reaktionsbedingungen. Die cDNA wird dann durch eine PCR amplifiziert.
Ein 8x RT-Reaktionsgemisch wurde hergestellt, enthaltend: 48 ul steriles, DEPCbehandeltes, destilliertes Wasser; 16 ul 10x RT-Puffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,3; 900 mM KCl); 16 ul eines dNTP-Gemisches, enthaltend jeweils 2 mM dATP, dCTP, dGTP und dUTP; jeweils 16 ul DM152 (SEQ ID Nr. 11) (1,5 uM) und DM151 (SEQ ID Nr. 10) (1,5 uM); 16 ul AW109-cRNA-Matrize (5 · 10³ Kopien/ul); und 16 ul rTth-DNA-Polyrnerase (2,5 Einheiten/ul). Das Endvolumen betrug 144 ul (18 ul/Reaktion). Ein 7x PCR-Hauptgemisch wurde hergestellt, enthaltend: 297 ul steriles, DEPC-behandeltes, destilliertes Wasser; 56 ul 10x PCR-Puffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,3; 1 M KCl; 7,5 mM EGTA; 50% Glycerin (Vol./Vol.)); 140 ul 10 mM MgCl&sub2;; 56 ul eines dNTP-Gemisches, enthaltend jeweils 2 mM dATP, dCTP, dGTP und dUTP; und jeweils 5,6 ul DM152 und DM151 (SEQ ID Nrn. 11 und 10) (15 uM). Das Endvolumen betrug 560 ul, 18 ul/Reaktion.
18 ul des RT-Gemisches wurden in sechs sterile Mikrozentrifugenröhrchen aliquotiert, und MnCl&sub2; wurde in einem Volumen von 2 ul zugegeben, um eine MnCl&sub2;-Endkonzentration wie folgt bereitzustellen: Röhrchen Nr. 1 und 2 (1, 2 mM MnCl&sub2;); Röhrchen Nr. 3 und 4 (1,0 mM MnCl&sub2;); und Röhrchen Nr. 5 und 6 (0,8 mM MnCl&sub2;). Mineralöl zum Überschichten (75 ul) wurde zu jedem Röhrchen zugegeben, und die Reaktionen wurden bei 70ºC 15 Minuten in einem Wasserbad inkubiert. Nach der Inkubation bei 70ºC wurden zu jeder Reaktion 80 ul des PCR-Hauptgemisches zugegeben. Die Reaktionsröhrchen wurden dem folgenden Temperaturwechsel unterworfen: 2 Minuten bei 95ºC für 1 Zyklus; 1 Minute bei 95ºC und 1 Minuten bei 60ºC für 35 Zyklen; 7 Minuten bei 60ºC für 1 Zyklus; und Inkubieren bei 4ºC.

Ergebnisse

5 ul jedes Reaktionsgemisches wurden einer Elektrophorese auf einem 2% NuSieve, 1% Agarose-Gel unterworfen. Das Gel wurde gefärbt und fotografiert. Das PCR- Produkt mit der erwarteten Größe war in Proben aller drei MnCl&sub2;-Konzentrationen deutlich sichtbar. Die Produktausbeute erhöhte sich mit einer ansteigenden MnCl&sub2;-Konzentration.

Beispiel 5

Verfahren zur Sterilisierung eines homogenen RT/PCR-Tests

Dieses Beispiel veranschaulicht ein Verfahren zur Sterilisierung einer homogenen RT/PCR-Reaktion, die mit Nucleinsäuren verunreinigt ist, die aus einer vorangehenden Reaktion stammen. Das Reaktionsgemisch wird vor der reversen Transkription mit UNG behandelt.
Das unübliche Nucleotid dUTP wird während der RT/PCR-Reaktion eingebaut.
Folglich kann jedes DNA-Produkt, das als Verunreinigung in folgenden Reaktionen vorhanden ist, unter Verwendung der UNG hydrolysiert werden.
In einem 0,2 ml-MicroAmp®-Röhrchen werden 5,5 ul steriles destilliertes Wasser; 2 ul 10x RT-Puffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,3; 900 mM KCl); 2 ul 8 mM MnCl&sub2;; 2 ul eines dNTP-Gemisches, enthaltend jeweils 2 mM dATP, dCTP, dGTP und dUTP; jeweils 2 ul DM152 (SEQ ID Nr. 11) (1,5 uM) und DM151 (SEQ ID Nr. 10) (1,5 uM); 2 ul AW109- cRNA-Matrize (5 · 10³ Kopien/ul); 0,5 ul UNG (1 Einheit/ul); und 2 ul rTth (2,5 Einheiten/ul) vereinigt. Die Reaktion wird 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend bei 70ºC 15 Minuten erhitzt, um die Glykosylase vor der reversen Transkription zu inaktivieren. Die cDNA wird dann durch eine PCR amplifiziert.
In diesem Beispiel dient die Positivkontroll-RNA als Matrize für DM152 (SEQ ID Nr. 11), und DM151 (SEQ ID Nr. 10) ist der Stromaufwärtsprimer. Das Reaktionsgesamtvolumen beträgt 20 ul/Probe. Die Röhrchen werden in einer Thermocycler-Vorrichtung (zum Beispiel eine TC9600-Thermocycler-Vorrichtung (Perkin Elmer, Norwalk, CT]) wie folgt inkubiert: ·
15 Minuten bei 70ºC für 1 Zyklus;
15 Sekunden bei 95ºC und 20 Sekunden bei 60ºC für 2 Zyklen;
15 Sekunden bei 90ºC und 20 Sekunden bei 60ºC für 33 Zyklen; und
4 Minuten bei 60ºC für 1 Zyklus.
Die optimale Mangankonzentration kann in Abhängigkeit von der einzelnen Probe, der Matrize, den Primern und der dNTP-Konzentration in dem Reaktionsgemisch variieren.

Beispiel 6

Zusätzliche Matrizen-Nucleinsäuren

Zusätzliche RNA- und DNA-Matrizen wurden in den Experimenten verwendet, die in den nachstehenden Beispielen beschrieben werden.

I. pTM3

Das Plasmid pTM3 ist eine ringförmige, einzelsträngige DNA von 7821 Nucleotiden, wobei etwa 700 Nucleotide der pAW 109-DNA vorhanden sind. Diese stellt eine DNA- Matrize mit der gleichen Sequenz und der gleichen Primerbindungsstelle wie die pAW109- cRNA bereit. Bei der Transkription unter Verwendung des Primers MT24 (SEQ ID Nr. 13) stimmen die ersten 253 Nucleotide mit der pAW109-cRNA überein. Jenseits dieses Bereichs wird die DNA G + C-reich und umfaßt DNA aus Thermus aquaticus, einschließlich des Gens für die Taq-DNA-Polymerase. Das pTM3-Plasmid wurde unter Verwendung des folgenden Protokolls unter Anwendung von Verfahren konstruiert, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind (vgl. Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
Die Insertion wurde durch Linearisierung der pAW109-DNA, vorstehend beschrieben, mit BamHI hergestellt. Die Linker-Adaptoren MT20 (SEQ ID Nr. 14) und MT21 (SEQ ID Nr. 15) wurden an die linearisierte pAW109-DNA angelagert und ligiert. Diese Linker lagern sich an die BamHI-Stelle an. Das Fragment wurde mit EcoRI gespalten, und das so erhaltene 706 bp große Fragment wurde in einem Gel gereinigt.
Der Expressionsvektor pLSG1 ist in US-Patent Nr. 4,889,818 beschrieben und enthält das Gen, das die Taq-DNA-Polymerase codiert. Das Plasmid pLSG1 wurde mit EcoRI linearisiert, mit einer überschüssigen Menge des in einem Gel gereinigten Fragments gemischt und mit dem Fragment ligiert. Das so erhaltene Plasmid wurde in DG98 transformiert, und einzelsträngige DNA wurde mit einem Helferphagen (beschrieben in den US- Patenten Nrn. 4,889,818 und 5,079,352 und bei Lawyer et al., 1993, a.a.O.) isoliert. Die in den vorstehenden Reaktionen verwendeten Oligonucleotidsequenzen sind nachstehend angegeben:

II. HCV

Das HCV-RNA-Transkript wurde erzeugt wie bei Young et al., J. Clin. Microbiol. 31 (1993), 882-886, beschrieben. Der cDNA-Clon wurde darin als pHCVI.1A bezeichnet. Bevorzugte Primer für die Amplifikation von HCV-Matrizen sind KY78 (SEQ ID Nr. 16; 5'-CTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT-3') und KY90 (SEQ a Nr. 17; 5'-GCAGAAA- GCGTCTAGCCATGGCGT-3'). KY78 (SEQ ID Nr. 16) und KY90 (SEQ ID Nr. 17) werden am 5'-Ende biotinyliert; KY80 (SEQ ID Nr. 17) ist eine nichtbiotinylierte Ausführungsform von KY90 (SEQ ID Nr. 17).

III. HIV

Eine Matrize mit Primerbindungsbereichen, die mit HIV-1 übereinstimmen, und einem internen Bereich, der von den Primerbindungsstellen umgeben ist, mit einer Nucleotidsequenz, die, während sie die gleiche Basenzusammensetzung beibehält, sich von der entsprechenden HIV-1-Sequenz ausreichend unterscheidet, um den Nachweis durch eine einzige sequenzspezifische Sonde zu ermöglichen, wurde konstruiert. Bevorzugte Primer für die Amplifikation von HIV-Matrizen sind die vorstehend beschriebenen 5'-biotinylierten Derivate von 5K431 (SEQ ID Nr. 6) und SK462 (SEQ ID Nr. 5).
Die Matrize wurde durch die Anlagerung und Verlängerung von zwei Oligonucleotiden erzeugt, die sich über eine Länge von 8 komplementären Basen an den 3'-Enden decken. Die Oligonucleotidkomponenten können durch irgendeines der Mittel zur Synthese der vorstehend beschriebenen Oligonucleotide synthetisiert werden. Das erste Oligonucleotid SK550 (SEQ ID Nr. 18) enthält einen Sall-Linker und einen SK462 (SEQ ID Nr. 5)-Primerbindungsbereich. Das zweite Oligonucleotid SK551 (SEQ ID Nr. 19) enthält einen SK431 (SEQ ID Nr. 6)-Primerbindungsbereich. Die Synthese der Kontroll-Matrize wurde unter Anwendung von Verfahren ausgeführt, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind (vgl. Sambrook et al., 1989, a.a.O.).
Das Reaktionsgemisch für die Aneinanderlagerungs- und Verlängerungsreaktion war wie folgt:
7 ul 10x Polyrnerasepuffer (100 mM Tris-HCl bei pH 7,5, 500 mM Natriumchlorid (NaCl), 100 mM Magnesiumacetat [Mg(OAc)&sub2;])
50 umol SK550 (SEQ ID Nr. 18)
50 umol SK551 (SEQ ID Nr. 19)
jeweils 15 ul dATP, dGTP, dCTP und dTTP (10 mM Stammlösungen) 1 ul Klenow-Fragment (5 E)
H&sub2;O auf 70 ul
Die zwei Oligonucleotide wurden gemischt und 10 Minuten auf Eis gehalten, um zu ermöglichen, daß sich die 3'-Enden der Oligonucleotide aneinander anlagern können. Die Verlängerungsreaktion wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von 30 Minuten bei 37ºC ausgeführt. Nach der Verlängerung wurde das Reaktionsgemisch 10 Minuten bei 72ºC gehalten, um die Polymerase zu inaktivieren.
Die Verlängerungsprodukte wurden mit SaII gespalten, das das SK550 (SEQ ID Nr. 18)-Ende der Duplexsequenz spaltet; das SK551 (SEQ ID Nr. 19)-Ende bleibt glatt. Das so erhaltene Fragment wurde in die SaII- und SmaI-Stellen des Transkriptionsvektors pSP64 (Promega, Madison, W1) (mit Poly-A) cloniert, wobei Plasmid pNAS-2 erhalten wurde.
Nach der Isolierung und Reinigung wurde pNAS-2 durch Spaltung mit EcoRI linearisiert und mit der SP6-RNA-Polymerase in vitro transkribiert. Zur Entfernung der restlichen DNA wurde die RNA mit RNase-freier DNase behandelt und über eine Oligo-dT- Säule geleitet.
Die in den vorstehenden Reaktionen verwendeten Nucleotidsequenzen sind nachstehend angegeben.

Beispiel 7

Mangankonzentrationsbereich

Verlängerungsreaktionen unter Verwendung von RNA- und DNA-Matrizen in entweder einem Bicin- oder einem Tris-Puffer wurden durchgeführt, um den verwendbaren Bereich von Mn²&spplus;-Konzentrationen für jede Reaktion zu bestimmen. Eine Reihe von Mn²&spplus;- Konzentrationen für Verlängerungsreaktionen mit einer DNA-Matrize und Verlängerungsreaktionen mit einer RNA-Matrize wurde verwendet. Alle Reaktionen wurden bei 60ºC 10 Minuten in einem Gesamtvolumen von 20 ul ausgeführt. Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt:

RNA-Matrize, Bicinpuffer

3 · 10¹¹ Kopien pAW 109-cRNA
0,125 uM MT24 (SEQ ID Nr. 13)
jeweils 300 uM dATP, dCTP, dGTP und dTTP
50 mM Bicin-KOH (pH 8,3)
100 mM KOAc (pH 7,5)
Mn(OAC)&sub2; (1-20 mM, 1-6 mM gezeigt)
5 E rTth*-DNA-Polymerase

RNA-Matrize, Tris-Puffer

3 · 10¹¹ Kopien pAW 109-cRNA
0,125 uM MT24 (SEQ ID Nr. 13)
jeweils 200 uM dATP, dCTP, dGTP und dTTP
10 mM Tris-HCl (pH 8,3)
90 mM KCl
MnCl&sub2; (0,4-2,5 mM)
5 E rTth*-DNA-Polymerase

DNA-Matrize, Bicinpuffer

1,5 · 10¹¹ Kopien pTM3-ssDNA
0,0625 uM MT24 (SEQ ID Nr. 13)
jeweils 300 uM dATP, dCTP, dGTP und dTTP
50 mM Bicin-KOH (pH 8,3)
100 mM KOAc (pH 7,5)
Mn(OAC)&sub2; (1-5 mM)
0,15 E rTth*-DNA-Polymerase

DNA-Matrize, Tris-Puffer

1,5 · 10¹¹ Kopien pTM3-ssDNA
0,0625 uM MT24 (SEQ ID Nr. 13)
jeweils 200 uM dATP, dCTP, dGTP und dTTP
10 mM Tris-HCl (pH 8,3)
90 mM KCl
MnCl&sub2; (0,4-2,5 mM)
0,15 E rTth*-DNA-Polymerase
*Entwickelt und hergestellt von Hoffmann-La Roche Inc. und im Handel erhältlich von Perkin Elmer, Norwalk, CT.
Die eingebaute Menge an dNMP wurde untersucht wie bei Myers und Gelfand, 1991, a.a.O., beschrieben. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. Die eingebaute Menge an dNMP ist als Prozentsatz der maximalen Menge, die für jede der Reaktionen eingebaut wurde, angegeben. Die für jede der Reaktionen eingebaute maximal Menge ist nachstehend angegeben.
Unter Verwendung des Tris-Puffers betrug die Mangankonzentration, die eine optimale Synthese mit DNA-Matrizen bereitstellte, etwa 0,6 mM; das Enzym erreichte eine maximale reverse Transkriptaseaktivität mit der RNA-Matrize bei etwa 1,4 mM Mangan. Durch Ersetzen des Bicinpuffers wurde die optimale Mn²&spplus;-Konzentration für jede Reaktion sowohl erhöht als auch erweitert. Unter Verwendung des Bicinpuffers wurde die maximale Synthese mit DNA-Matrizen zu 1,5 mM Mangan verschoben, während Erhöhungen der mit RNA-Matrizen synthetisierten Menge bis zu 6 mM Mangan beobachtet wurden. Obwohl die Mn²&spplus;-Optima für die reverse Transkriptaseaktivität der rTth-DNA-Polymerase bei RNA- Matrizen und die DNA-Polymerase-Aktivität bei DNA-Matrizen für die einzelnen Reaktionen noch verschieden sind, wenn ein Bicinpuffer verwendet wird, scheint eine einzige Mn²&spplus;- Konzentration von etwa 3,2 mM für eine homogene RT/PCR mindestens so wirksam zu sein, wie die RT/PCR-Bedingungen unter Verwendung eines vorstehend in Beispiel 3 beschriebenen Tris-Puffers. Jedoch wurde der Bereich der verwendbaren Mangankonzentrationen für jede Reaktion stark erweitert. Dies ist ein überraschendes Ergebnis, da die Erweiterung des dualen Bereichs aufgrund der allgemeinen Theorie und der Literatur hinter Metallpuffern nicht vorausgesagt werden konnte.

Beispiel 8

RT/PCR unter Verwendung von HIV-Matrizen, Tricin- und Bicinpuffern

Eine Titrationsreihe der MnCl&sub2;-Konzentration wurde in RT/PCRs unter Verwendung von HIV-Matrizen in sowohl Tricin- als auch Bicinpuffern verwendet. Die Reaktionen wurden in einem Reaktionsgesamtvolumen von 100 ul im wesentlichen ausgeführt wie nachstehend in Beispiel 10 beschrieben. Die spezifischen Reaktionsbedingungen waren wie folgt:
200 Kopien HIV-cRNA (pNAS-2)
1 ug Poly-rA
13% Glycerin (Gew./Vol.)
jeweils 150 uM dATP, dCTP, dGTP und dTTP
200 uM dUTP
jeweils 0,20 uM SK431 (SEQ ID Nr. 6), SK462 (SEQ ID Nr. 5)
2 Einheiten UNG*
10 Einheiten rTth*-DNA-Polymerase
65 mM KCl
50 mM Tricin-KOH (pH 8,3) oder Bicin-KOH (pH 8,3)
MnCl&sub2; (1,0, 1,2, 1,5, 1,75, 2,0 und 2,5 mM)
*Entwickelt und hergestellt von Hoffmann-La Roche Inc. und im Handel erhältlich von Perkin Elmer, Norwalk, CT.
Die Reaktionspuffer enthielten 150 uM dTTP zusätzlich zu 200 uM dUTP infolge des hohen Prozentsatzes an Adenin in dem HIV-RNA-Zielmolekül und der verringerten Wirksamkeit mit der die Tth-DNA-Polymerase dUMP während der reversen Transkription einbaut. Das Temperaturwechselprofil war im wesentlichen wie in Beispiel 10 beschrieben, außer daß der reverse Transkriptionsschritt bei 70ºC 15 Minuten ausgeführt wurde. Das amplifizierte Produkt wurde durch Gelelektrophorese analysiert, wie in Beispiel 10 beschrieben.
Es wurde festgestellt, daß das Zielmolekül sowohl in dem Bicin- als auch dem Tricinpuffer innerhalb eines Mnz+-Konzentrationsbereichs von 1,0 bis 2,5 mM revers transkribiert und amplifiziert wurde, wobei höhere Werte der Produktbildung innerhalb eines Mn²&spplus;-Konzentrationsbereichs von 1,2 bis 2,0 mM festgestellt wurden.

Beispiel 9

Erhöhte dNTP-Toleranz

Um die Erhöhung der dNTP-Konzentrationstoleranz unter Verwendung eines Bicin/KOAc/Mn(OAc)&sub2;-Puffers zu beurteilen, wurden RT/PCR-Amplifikationen eines HCV- cRNA-Zielmoleküls (pHCV1.1A) unter Verwendung von sowohl Bicin- als auch Tris-Puffern bei verschiedenen dNTP-Konzentrationen ausgeführt. Die Reaktionen wurden im wesentlichen ausgeführt, wie nachstehend in Beispiel 10 beschrieben, bis auf die hier beschriebenen Modifikationen.
Das HCV-cRNA-Zielmolekül ist vorstehend in Beispiel 6 beschrieben. Die Reaktionen wurden in einem Volumen von 100 ul unter den folgenden Bedingungen ausgeführt:
300 Kopien HCV-cRNA
jeweils 0,15 uM KY78 (SEQ ID Nr. 16) und KY90 (SEQ ID Nr. 17)
1 ug Poly-rA
8% Glycerin
10 E rTtht*-DNA-Polymerase
2 E UNG*
dATP, dCTP, dGTP und dUTP (jeweils 100 uM bis jeweils 500 uM)
50 mM Bicin-KOH (pH 8,3) oder 10 mM Tris-HCl (pH 8,3)
100 mM KOAc (pH 7,5) oder 90 mM KCl
2,5 mM Mn(OAc)&sub2; oder 0,9 mM MnCl&sub2;
*Entwickelt und hergestellt von Hoffmann-La Roche Inc. und im Handel erhältlich von Perkin Elmer, Norwalk, CT.
Die Temperaturwechselparameter waren im wesentlichen wie nachstehend in Beispiel 10 beschrieben, außer daß die reverse Transkription bei 70ºC für 25 Minuten ausgeführt und 40 Amplifikationszyklen durchgeführt wurden. Das Amplifikationsprodukt wurde, wie in Beispiel 10 beschrieben, durch Gelelektrophorese analysiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt.
Die Bildung des Amplifikationsprodukts unter Verwendung des Bicin/KOAc/Mn(OAc)&sub2;-Puffers wurde über einen dNTP-Konzentrationsbereich von 100 bis S00 um jedes dNTP beobachtet. Im Gegensatz dazu wurden beträchtliche Mengen des Amplifikationsprodukts unter Verwendung des Tris/KCl/MnCl&sub2;-Puffers nur bei einer Konzentration von 200 uM jedes dNTP gebildet.

Beispiel 10

Homogene RT/PCR unter Verwendung von HCV- und HIV-Matrizen

Die auf einer RT/PCR-Amplifikation basierenden Tests zum Nachweis des Hepatitis-C-Virus (HCV) sind in der Europäischen Patentanmeldung EP-A-529,493 und bei Young et al., 1993, a.a.O., beschrieben. EP-A-529,493 beschreibt den Nachweis des amplifizierten Produkts unter Verwendung einer Mikrotiterplattennachweisanordnung. Ähnliche Tests sind zum Nachweis des menschlichen Immunschwächevirus (HIV) verwendbar. Die erfindungsgemäßen homogenen RT/PCR-Verfahren sind zur Amplifikation von viralen HIV- und HCV-Matrizen unter Verwendung der nachstehend beschriebenen Protokolle anwendbar. Homogene Reaktionen unter Verwendung von so wohl Bicin/KOAc/Mn(OAc)&sub2;- als auch Tris/KCl/MnCl&sub2;-Puffern werden nachstehend beschrieben; die Verwendung des Bicin/KOAc/Mn(OAc)&sub2;-Puffers wird bevorzugt. Die Probenmatrize kann entweder aus klinischen Proben stammen oder die vorstehend in Beispiel 6 beschriebenen HIV- und HCV- Matrizen umfassen. Geeignete Verfahren zur Herstellung einer klinischen Probenzubereitung sind in der vorstehend angeführten Literatur zu dem HCV-Test beschrieben.
Bevorzugte Primer für die RT/PCR-Amplifikation von HIV-Matrizen sind die 5'- biotinylierten Derivate von SK431 (SEQ ID Nr. 6) und SK462 (SEQ ID Nr. 5). Bevorzugte Primer für die RT/PCR-Amplifikation von HCV-Matrizen sind KY78 (SEQ ID Nr. 16) und KY90 (SEQ ID Nr. 17).
Die Reaktionsbedingungen für die HIV- und HCV-RT/PCR untere Verwendung von Bicin-KOH (pH 8,3), KOAc (pH 7,5) und Mn(OAC)&sub2; in einem Reaktionsgesamtvolumen von 100 ul sind nachstehend angegeben. Die HIV-Reaktionsbedingungen veranschaulichen die Verwendung einer erhöhten dUTP-Konzentration, um den Einbau von dUMP zu erleichtern.

Für HIV-Matrizen: Für HCV-Matrizen:

15% Glycerin (Gew./Vol.) 10% Glycerin (Gew./Vol.)
300 uM dATP 200 pxMdATP
300 uM dCTP 200 uM dCTP
300 uM dGTP 200 uM dGTP
50 uM dTTP
500 uM dUTP 200 uM dUTP
20 umol/rxn Stromaufwärtsprimer 15 umol/rxn Stromaufwärtsprimer
20 umol/rxn Stromabwärtsprimer 15 umol/rxn Stromabwärtsprimer
2 Einheiten UNG* 2 Einheiten UNG*
10 Einheiten rTth*-DNA-Polymerase 15 Einheiten rTth*-DNA-Polymerase
50 mM Bicin-KOH, pH 8,3 50 mM Bicin-KOH, pH 8,3
100 mM KOAc, pH 7,5 100 mM KOAc, pH 7,5
3,6 mM Mn(OAc)&sub2; 3,5 mM Mn(OAc)&sub2;
*Entwickelt und hergestellt von Hoffmann-La Roche Inc. und im Handel erhältlich von Perkin Elmer, Norwalk, CT.
Reaktionsbedingungen für Tris-HCl (pH 8,3), KCl, MnCl&sub2; in einem Reaktionsgesamtvolumen von 100 ul:

Für HIV-Matrizen: Für HCV-Matrizen:

15% Glycerin (Gew./Vol.) 10% Glycerin (Gew./Vol.)
150 uM dATP 200 uM CIATP
150 uM dCTP 200 uM dCTP
150 uM dGTP 200 uM dGTP
150 uM dTTP
200 uM dUTP 200 uM dUTP
20 umol/rxn Stromaufwärtsprimer 15 pmol/rxn Stromaufwärtsprimer
20 pmol/rxn Stromabwärtsprimer 15 pmol/rxn Stromabwärtsprimer
2 Einheiten UNG* 2 Einheiten UNG*
10 Einheiten rTth*-DNA-Polymerase 10 Einheiten rTth*-DNA-Polymerase
90 mM KCl 90 mM KCl
10 mM Tris-HCl, pH 8,3 10 mM Tris-HCl, pH 8,3
0,85 mM MnCl&sub2; 0,90 mM MnCl&sub2;
*Entwickelt und hergestellt von Hoffmann-La Roche Inc. und im Handel erhältlich von Perkin Elmer, Norwalk, CT.
Die Reaktionen werden in einer TC9600-Thermocycler-Vorrichtung (Perkin Elmer, Norwalk, CT) ausgeführt. Die Thermocycler-Vorrichtung wird so programmiert, daß das folgende Temperaturprofil für die Amplifikation der HIV-Matrize bereitgestellt wird:
2 Minuten bei 50ºC für die UNG-Sterilisierung;
30 Minuten bei 60ºC für den reversen Transkriptionsschritt;
4 Zyklen von 95ºC für 10 Sekunden, 55ºC für 10 Sekunden und 72ºC für 10 Sekunden;
24 Zyklen (Mikrotiterplattentest) oder 36 Zyklen (Agarosegelanalyse) von 90ºC für 10
Sekunden, 60ºC für 10 Sekunden und 72ºC für 10 Sekunden; und Halten bei 72ºC.
Die Thermocycler-Vorrichtung wird so programmiert, daß das folgende Temperaturprofil für die Amplifikation der HCV-Matrize bereitgestellt wird:
2 Minuten bei 50ºC für die UNG-Sterilisierung;
30 Minuten bei 60ºC für die reverse Transkription;
2 Zyklen von 95ºC für 15 Sekunden und 60ºC für 20 Sekunden;
38 Zyklen von 90ºC für 15 Sekunden und 60ºC für 20 Sekunden;
4 Minuten bei 60ºC; und
Halten bei 72ºC.
Das Amplifikationsprodukt wird entweder durch Sichtbarmachen nach einer Agarosegelelektrophorese oder durch einen Mikrotiterplattentest analysiert. Für die Agarosegelanalyse werden 5 ul jeder Reaktion zu 2 ul Ladepuffer (30% Saccharose, 0,1% Bromphenolblau, 10 mM EDTA) zugegeben und durch Elektrophorese auf einem 4%igen (3% NuSieve, 1% Agarose) Agarosegel in 1x Tris-Borat-EDTA mit Ethidiumbromid (10 ug pro 100 ml Agarose), eingemischt in die Agarose, analysiert. Die Elektrophorese wird 30 Minuten bei 125 V durchgeführt.
Die Mikrotiterplattenanalyse für HCV ist in EP-A-529,493 und allgemein in US- Patent Nr. 5,232,829 beschrieben. Die Mikrotiterplattenanalyse des HIV-Amplifikationsprodukts erfolgt wie für HCV beschrieben, aber unter Verwendung der bei Jackson et al., AIDS 5 (1991), 1463-1467, beschriebenen HIV-spezifischen Sonden.

Beispiel 11

RNA-Stabilität

Um die Stabilität der RNA unter Verwendung verschiedener Pufferbedingungen zu untersuchen, wurde die RNA bei erhöhten Temperaturen in Reaktionsgemischen inkubiert, die denen einer reversen Transkriptionsreaktion entsprechen, aber unter Weglassen der Polymerase, um sicherzustellen, daß keine Synthese stattfindet. Die Reaktionsgemische (Volumen jeweils 20 ul) setzten sich wie folgt zusammen:
100 ng [³³P]-markierte pAW109-cRNA
1,5 uM KY80 (SEQ ID Nr. 17)
jeweils 200 uM dATP, dCTP, dGTP und dUTP
2 ul rTth-DNA-Polymerase-Aufbewahrungspuffer (entspricht 5 Einheiten Polymerase)
Die Pufferbedingungen wurden durch die Zugabe der nachstehend beschriebenen Pufferreagenzien zu den vorstehenden Reagenzien variiert. Alle Reaktionsgemische wurden bei 70ºC 25 Minuten inkubiert, mit Ausnahme von Probe 1, die zum Vergleich 25 Minuten bei 4ºC inkubiert wurde. Die gewonnene Menge an RNA vollständiger Länge wurde unter Verwendung eines Ambis 4000-Radioanalyseabbildungssystems (Ambis, Inc., San Diego, CA) nach einer Gelelektrophorese bestimmt. Alle Werte wurden unter Verwendung der Ergebnisse von Probe 2 als 100% normalisiert. Bicin-KOH und Tris-HCl wurden bei pH 8,3 zugegeben; KOAc wurde bei pH 7,5 zugegeben.

Zugegebenene Reagienze Gewonnene Menge

1. Keine zugegeben (Inkubation bei 4ºC) 113%
2. Keine zugegeben (Inkubation bei 70ºC) 100%
3. 2.5 mM Mn(OAc)&sub2; 6%
4. 2.5 mM Mn(OAc)&sub2;; 100 mM KOAc 1%
5. 2.5 mM Mn(OAc)&sub2;; 50 mM Bicin-KOH 3%
6. 2.5 mM Mn(OAc)&sub2;; 100 mM KOAc; 50 mM Bicin-KOH 25%
7. * 2.0 mM Mn(OAc)&sub2;; 100 mM KOAc; 50 mM Bicin-KOH 47%
8. 2.5 mM Mn(OAc)&sub2;; 100 mM KOAc; 50 mM Bicin-KOH 29%
9. 3.0 mM Mn(OAc)&sub2;; 100 mM KOAc; 50 mM Bicin-KOH 25%
10. 0.9 mM MnCl&sub2; 40%
11. 1.0 mM MnCl&sub2; 36%
12. 1.0 mM MnCl&sub2;; 90 mM KCl; 10 mMTris-HCl 16%
* Probe 7 weist weitere 100 uM jedes dNTP (300 uM jedes dNTP) auf.
Die Zugabe von Mangan, das die Hydrolyse der RNA katalysiert, erhöht den Abbau der RNA bei hohen Temperaturen, wie aus dem Vergleich der Proben 2 und 3 ersichtlich ist. Die Zugabe eines Puffers, enthaltend 2,5 mM Mn(OAc)&sub2;, 100 mM KOAc und 50 mM Bicin- KOH, verringert den RNA-Abbau wesentlich. Der Vergleich der Proben 3, 4, 5 und 6 zeigt, daß alle Komponenten des Puffers vorhanden sein müssen, um das Ausmaß des beobachteten RNA-Abbaus zu verringern. Die Mn(OAc)&sub2;/KOAc/Bicin-KOH-Puffer verringerten das Ausmaß des RNA-Abbaus verglichen mit den MnCl&sub2;/KCl/Tris-HCl-Puffern, wie aus dem Vergleich der Proben 6-9 mit Probe 12 ersichtlich ist.
Eine Vorinkubation bei hoher Temperatur erleichtert die Amplifikation von doppelsträngigen RNA-Zielmolekülen sowie von Zielmolekülen mit einem hohen Sekundärstrukturgrad durch die Denaturierung der RNA vor der reversen Transkription. Um die Wirkung einer Vorinkubation bei hoher Temperatur auf die Stabilität der RNA in einem Bicin/KOAc/Mn(OAc)&sub2;-Puffer zu beurteilen, wurde die RNA bei erhöhten Temperaturen in Reaktionsgemischen inkubiert, die denen einer reversen Transkriptionsreaktion ähnelten, aber unter Weglassen der Polymerase, um sicherzustellen, daß keine Synthese stattfindet. Die Reaktionsgemische (Volumen jeweils 20 ul) setzten sich wie folgt zusammen:
250 ng[³³P]-markierte pAW109-cRNA
1,5 uM DM151 (SEQ ID Nr. 10)
jeweils 300 uM dATP, dCTP, dGTP und dUTP
50 mM Bicin-KOH (pH 8,3)
100 mM KOAc (pH 7,5)
2,5 mM Mn(OAc)&sub2;
2 ul rTth-DNA-Polymerase-Aufbewahrungspuffer (entspricht 5 Einheiten Polymerase)
Die Reaktionsgemische wurden bei den nachstehend aufgeführten Temperaturen inkubiert, und die endgültige Menge an RNA vollständiger Länge wurde unter Verwendung eines Ambis 4000-Radioanalyseabbildungssystems (Ambis, Inc., San Diego, CA) nach einer Gelelektrophorese bestimmt. Die Inkubationen wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, und die durchschnittliche Menge der zurückbleibenden nicht abgebauten RNA wurde auf die Menge, die nach einer 25-minütigen Inkubation bei 4ºC zurückbleibt, normiert. Die durchschnittliche Standardabweichung für die aus den 3 Reaktionsinkubationen gewonnene Menge innerhalb einer Gruppe betrug 11%.

Inkubationstemperatur Gewonnene Menge

25 Minuten bei 4ºC 100%
15 Sekunden bei 95ºC und 25 Minuten bei 4ºC 84%
25 Minuten bei 60ºC 66%
15 Sekunden bei 95ºC und 25 Minuten bei 60ºC 68%
Eine Inkubation bei 60ºC für 25 Minuten ist mit den Bedingungen einer reversen Transkription, wie in den vorangehenden Beispielen beschrieben, vergleichbar. Es trat kein nachweisbarer zusätzlicher Verlust der markierten RNA vollständiger Länge auf, wenn eine Vorinkubation von 15 Sekunden bei 95ºC der RNA eingeschlossen war.

Beispiel 12

Wirkung der Mangankonzentration auf eine RT/PCR unter Verwendung von HCV-Matrizen

Die RT/PCR-Amplifikationsreaktionen wurden über einen Bereich von Mangankonzentrationen unter Verwendung von sowohl Bicin/KOAc/Mn(OAc)&sub2;- als auch Tris/KCl/MnCl&sub2;-Puffern ausgeführt. Die Reaktionsbedingungen für die HCV-RT/PCR in einem Reaktionsgesamtvolumen von 100 ul sind nachstehend angegeben:
100 Kopien HCV-cRNA
200 uM dATP
200 uM dCTP
200 uM dGTP
200 uM dUTP
15 umol/rxn KY78 (SEQ ID Nr. 16)
15 umol/rxn KY90 (SEQ ID Nr. 17)
2 Einheiten UNG*
10 Einheiten rTth*-DNA-Polymerase
8% Glycerin (Gew./Vol.)
50 mM Bicin-KOH (pH 8,3) oder 10 mM Tris-HCl (pH 8,3)
100 mM KOAc (pH 7,5) oder 90 mM KCl
Mn(OAc)&sub2; oder MnCl&sub2;
*Entwickelt und hergestellt von Hoffmann-La Roche Inc. und im Handel erhältlich von Perkin Elmer, Norwalk, CT.
Die verwendeten Mangankonzentrationen waren 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 und 4,0 mM Mn(OAc)&sub2; und 0,7, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 und 1,0 mM MnCl&sub2;. Die Reaktionen wurden in einer TC9600-Thermocycler-Vorrichtung (Perkin Elmer, Norwalk, CT) ausgeführt. Die Thermocycler-Vorrichtung wurde so programmiert, daß das in Beispiel 10 beschriebene Temperaturprofil bereitgestellt wurde, mit der Ausnahme, daß die reverse Transkription 25 Minuten bei 70ºC, gefolgt von einer 1-minütigen Inkubation bei 95ºC durchgeführt wurde. Das Amplifikationsprodukt wurde durch Sichtbarmachen nach einer Agarosegelelektrophorese analysiert, wie in Beispiel 10 beschrieben.
Das Amplifikationsprodukt wurde unter Verwendung des Bicin/KOAc/Mn(OAc)&sub2;- Puffers für einen Mn(OAc)&sub2;-Konzentrationsbereich von 2,0-4,0 mM beobachtet. Das Amplifikationsprodukt wurde unter Verwendung des Tris/KCl/MnCl&sub2;-Puffers für einen MnCl&sub2;- Konzentrationsbereich von 0,8-1,0 mM beobachtet. Unter diesen Reaktionsbedingungen wurde das Produkt über einen um das 10fache größeren Mangankonzentrationsbereich unter Verwendung des Bicin/KOAc/Mn(OAc)&sub2;-Puffers beobachtet, verglichen mit dem Tris/KCl/MnCl&sub2;-Puffer.

Beispiel 13

RT/PCR unter Verwendung einer hohen Tris-Konzentration

Die RT/PCR-Amplifikationsreaktionen wurden über einen Bereich von Mangankonzentrationen unter Verwendung von Tris/KCl/MnCl&sub2;-Puffern mit zwei Tris-Konzentrationen ausgeführt. Die Reaktionsbedingungen für die HCV-RT/PCR in einem Reaktionsgesamtvolumen von 100 ul sind nachstehend angegeben:
500 Kopien HCV-cRNA
200 uM dATP
200 uM dCTP
200 uM dGTP
200 uM dUTP
15 pmol/rxn KY78 (SEQ ID Nr. 16)
15 umol/rxn KY90 (SEQ ID Nr. 17)
2 Einheiten UNG*
10 Einheiten rTth*-DNA-Polymerase
8% Glycerin (Gew./Vol.)
10 mM Tris-HCl (pH 8,3) oder 100 mM Tris-HCl (pH 8,3)
90 mM KCl oder 45 mM KCl
MnCl&sub2;
*Entwickelt und hergestellt von Hoffmann-La Roche Inc. und im Handel erhältlich von Perkin Elmer, Norwalk, CT.
Die verwendeten Mangankonzentrationen waren 0,7, 0,8, 1,0, 1, 2, und 1,3 mM MnCl&sub2; für jede Tris-Konzentration. Die Reaktionen wurden in einer TC9600-Thermocycler- Vorrichtung (Perkin Elmer, Norwalk, CT) ausgeführt. Die Thermocycler-Vorrichtung wurde so programmiert, daß das in Beispiel 10 beschriebene Temperaturprofil bereitgestellt wurde, mit der Ausnahme, daß die reverse Transkription 25 Minuten bei 70ºC, gefolgt von einer 1- minütigen Inkubation bei 95ºC durchgeführt wurde. Das Amplifikationsprodukt wurde durch Sichtbarmachen nach einer Agarosegelelektrophorese analysiert, wie in Beispiel 10 beschrieben.
Das Ampliflkationsprodukt wurde unter Verwendung des 100 mM Tris-Puffers für einen MnCl&sub2;-Konzentrationsbereich von 0,7-1, 2 mM beobachtet. Das Amplifikationsprodukt wurde unter Verwendung des 10 mM Tris-Puffers für einen MnCl&sub2;-Konzentrationsbereich von 0,8-1,0 mM beobachtet. Unter diesen Reaktionsbedingungen wurde das Produkt über einen größeren Mangankonzentrationsbereich beobachtet, wenn die Tris-Konzentration in einem Tris/KClIMnCl&sub2;-Puffer von 10 mM auf 100 mM erhöht wurde.
Die Erfindung wurde ausführlich beschrieben, aber es ist selbstverständlich, daß Variationen und Modifikationen innerhalb des Geistes und des Schutzumfangs der folgenden Patentansprüche durchgeführt werden können.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION

(i) ANMELDER:
(A) NAME: F. Hoffmann-La Roche AG
(B) STRASSE: Grenzacherstrasse 124
(C) STADT: Basel
(D) STAAT: BS
(E) LAND: Schweiz
(F) POSTLEITZAHL: CH-4002
(G) TELEFON: (0)61 688 24 03
(H) TELEFAX: (0)61 688 13 95
(I) TELEX: 962292/965542 hlr ch
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Reagenzien und Verfahren für reverse Transkription bei hoher Temperatur, verbunden mit einer Polymerase-Kettenreaktion
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 19
(iv) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIUMTYP: Floppy Disk
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1,U, Version #1,25 (EPO)
(vi) DATEN DER FRÜHEREN ANMELDUNG:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US 08/086,483
(B) EINREICHUNGSDATUM: 1. Juli 1993

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr. 1:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 1:

GGCATATGGC TAGACTATTT CTTTTTG 27

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr. 2:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 31 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 2:

AGGTTCCGAT GAAGTCTGTA GGTGATGTCT G 31

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr. 3:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 3:

CTACAGACTT CATCGGAACC TCCTTAAGCG 30

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr. 4:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 23 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 4:

CCAACCCGCC TCGGCCACGA AGG 23

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr. 5:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ a Nr. 5:

AGTTGGAGGA CATCAAGCAG CCATGCAAAT 30

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr. 6:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 6:

TGCTATGTCA GTTCCCCTTG GTTCTCT 27

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr. 7:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 28 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 7:

ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT 28

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr. 8:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 8:

TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC 28

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr. 9:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 9:

TGGAGAACAC CACTTGTTGC TCCA 24

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr. 10:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 26 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 10:

GTCTCTGAAT CAGAAATCCT TCTATC 26

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr. 11:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 25 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 11:

CATGTCAAAT TTCACTGCTT CATCC 25

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr. 12:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 37 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 12:

GCTTGCAAGC TTTATTTAGT TATGACTGAT AACACTC 37

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr. 13:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 44 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 13:

CAGGTCTCCC AAGTCTGGCG CCCTGCAAAT GAGACACTTT CTCG 44

(2) INFORMATION PUR SEQ ID Nr. 14:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 14:

GATCTCCGGA CTCTAGA 17

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr. 15:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 15:

AATTTCTAGA GTCCGGA 17

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr. 16:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 16:

CTCGCAAGCA CCCTATCAGG CAGT 24

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr. 17:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 17:

GCAGAAAGCG TCTAGCCATG GCGT 24

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr. 18:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 79 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 18:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr. 19:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 85 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 19:

Claims

1. Verfahren zur Amplifikation eines Ziel-RNA-Moleküls in einer Probe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

a) Behandeln der Probe in einem Reaktionsgemisch, umfassend einen ersten und zweiten Primer, wobei der erste Primer ausreichend komplementär zu der Ziel- RNA ist, um damit zu hybridisieren und die Synthese eines cDNA-Moleküls zu veranlassen, das komplementär zu der Ziel-RNA ist, und der zweite Primer ausreichend homolog zu der Ziel-RNA ist, um mit der cDNA zu hybridisieren und die Synthese eines Verlängerungsprodukts zu veranlassen, und eine hitzestabile DNA-Polymerase in Gegenwart aller 4 Desoxyribonucleosidtriphosphate in einem Puffer, wobei der Puffer ein divalentes Kation umfaßt, bei einer Temperatur, die ausreicht, damit die hitzestabile DNA-Polymerase die Synthese eines Verlängerungsprodukts des ersten Primers veranlassen kann, um ein cDNA- Molekül bereitzustellen, das komplementär zu der Ziel-RNA ist;

b) Behandeln des Reaktionsgemisches bei einer geeigneten Temperatur, um einzelsträngige cDNA bereitzustellen;

c) Behandeln des Reaktionsgemisches bei einer geeigneten Temperatur, damit die hitzestabile DNA-Polymerase die Synthese eines Verlängerungsproduktes des zweiten Primers veranlassen kann, um ein doppelsträngiges cDNA-Molekül bereitzustellen; und

d) Amplifikation des doppelsträngigen cDNA-Moleküls von Schritt c) durch eine Polymerasekettenreaktion;

dadurch gekennzeichnet, daß die Puffer der Schritte a) und d) ferner ein Pufferungsmittel umfassen, das das divalente Kation bindet; wobei das divalente Kation vorzugsweise Mn²&spplus; ist, wobei der KM-Wert der Bindungsreaktion des divalenten Kations des Puffers bei 20ºC und 0,1 M Ionenstärke zwischen 10 und 10&sup6;, vorzugsweise zwischen 10² und 10&sup4;, mehr bevorzugt zwischen 102,5 und 103,5 liegt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Pufferungsmittel eine zwitterionische Verbindung ist, die Wasserstoffionenpufferung bereitstellt, wobei der pKa Wert des Puffers bei 20ºC und 0,1 M Ionenstärke zwischen 7 und 9, vorzugsweise zwischen 7,5 und 8,5 liegt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Puffer N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycin oder N[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycin umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Puffer ferner ein Acetatsalz umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Natriumacetat, Kaliumacetat, Ammoniumacetat und Lithiumacetat.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die hitzestabile DNA-Polymerase die Thermus aquaticus-DNA-Polymerase oder die Thermus thermophilus-DNA- Polymerase ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die DNA = Polymerase die rekombinante Tth-DNA- Polymerase ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Temperatur in Schritt a) zwischen 40ºC und 80ºC liegt.

8. Verfahren zum Sterilisieren einer reversen Transkriptionsreaktion, einer homogenen reversen Transkription/Amplifikationsreaktion oder einer Amplifikationsreaktion, die mit Nucleinsäuren verunreinigt sind, die von einer vorangehenden reversen Transkriptionsreaktion stammen, wobei die vorangehende Transkriptionsreaktion vom Mischen üblicher und unüblicher Nucleosidtriphosphate in ein reverses Transkripitionsreaktionsgemisch und der Erzeugung von cDNA-Produkten mit darin eingebauten üblichen und unüblichen Nucleotiden herrührt, wobei das Verfahren den Abbau der verunreinigenden Nucleinsäuren durch Hydrolyse kovalenter Bindungen der unüblichen Nucleotide umfaßt und wobei das reverse Transkriptionsreaktionsgemisch ferner eine Thermus thermophilus-DNA-Polymerase, ein divalentes Kation, vorzugsweise Mn²&spplus;, und einen Puffer umfaßt, wobei der Puffer ein Pufferungsmittel umfaßt, das das divalente Kation bindet, wobei der KM-Wert der Bindungsreaktion des divalenten Kations des Puffers bei 20ºC und 0,1 M Ionenstärke zwischen 10 und 10&sup6;, vorzugsweise zwischen 10² und 10&sup4;, mehr bevorzugt zwischen 102,5 und 103,5 liegt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die vorangehende reverse Transkriptionsreaktion eine homogene reverse Transkriptions/Amplifikationsreaktion ist.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei das Pufferungsmittel eine zwitterionische Verbindung ist, die Wasserstoffionenpufferung bereitstellt, wobei der pKa-Wert des Puffers bei 20ºC und 0,1 M Ionenstärke zwischen 7 und 9, vorzugsweise zwischen 7,5 und 8,5 liegt.

11. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei der Puffer N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycin oder N[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycin umfaßt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Puffer ferner ein Acetatsalz umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Natriumacetat, Kaliumacetat, Ammoniumacetat und Lithiumacetat.

13. Puffer zur Durchführung einer homogenen reversen Transkriptions/Amplifikationsreaktion, umfassend ein divalentes Kation, ein monovalentes Kation und ein Pufferungsmittel, wobei das divalente Kation vorzugsweise Mn²&spplus; ist und das Pufferungsmittel ein Chelatbildner ist, der das divalente Kation bindet, wobei der KM- Wert der Bindungsreaktion des divalenten Kations des Pufferungsmittels bei 20ºC und 0,1 M Ionenstärke zwischen 10 und 10&sup6;, vorzugsweise zwischen 10² und 10&sup4;, mehr bevorzugt zwischen 102,5 und 103,5 liegt.

14. Puffer nach Anspruch 13, wobei das Pufferungsmittel eine zwitterionische Verbindung ist, die Wasserstoffionenpufferung bereitstellt, wobei der pKa-Wert des Puffers bei 20º C und 0,1 M Ionenstärke zwischen 7 und 9, vorzugsweise zwischen 7,5 und 8,5 liegt.

15. Puffer nach Anspruch 13, wobei das Pufferungsmittel N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycin oder N[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycin ist.

16. Puffer nach Anspruch 15, wobei das divalente Kation durch Manganacetat, Manganchlorid oder Mangansulfat und das monovalente Kation durch ein Acetatsalz bereitgestellt wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Natriumacetat, Kaliumacetat, Ammoniumacetat und Lithiumacetat.

17. Puffer nach Anspruch 16, wobei das divalente Kation durch Manganacetat bei einer Konzentration zwischen 1,2 und 5 mM bereitgestellt wird.

18. Puffer nach Anspruch 16, wobei das monovalente Kation durch Kaliumacetat bereitgestellt wird.

19. Verfahren zur reversen Transkription eines Ziel-RNA-Moleküls in einer Probe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

Behandeln der Probe in einem Reaktionsgemisch, das einen Primer umfaßt, wobei der Primer ausreichend komplementär zu der Ziel-RNA ist, um damit zu hybridisieren und die Synthese eines cDNA-Moleküls zu veranlassen, das komplementär zu der Ziel-RNA ist, eine hitzeaktive DNA-Polymerase, 4 Desoxyribonucleosidtriphosphate und einen geeigneten Puffer, wobei der Puffer ein divalentes Kation umfaßt, vorzugsweise Mn²&spplus;, bei einer Temperatur, die ausreicht, damit die hitzeaktive DNA-Polymerase die Synthese eines Verlängerungsprodukts des Primers veranlassen kann, um ein cDNA- Molekül bereitzustellen, das komplementär zu der Ziel-RNA ist, wobei der Puffer ferner ein Pufferungsmittel umfaßt, das das divalente Kation bindet, wobei der KM-Wert der Bindungsreaktion des divalenten Kations des Puffers bei 20ºC und 0,1 M Ionenstärke zwischen 10 und 10&sup6;, vorzugsweise zwischen 10² und 10&sup4;, mehr bevorzugt zwischen 102,5 und 103,5 liegt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Pufferungsmittel eine zwitterionische Verbindung ist, die Wasserstoffionenpufferung bereitstellt, wobei der pKa-Wert bei 20º C und 0,1 M Ionenstärke zwischen 7 und 9, vorzugsweise zwischen 7,5 und 8,5 liegt.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Puffer N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycin oder N[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycin umfaßt.

22. Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Puffer N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycin oder N[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycin umfaßt und wobei der Puffer ferner ein Acetatsalz umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Natriumacetat, Kaliumacetat, Ammoniumacetat und Lithiumacetat.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die hitzeaktive DNA-Polymerase die Thermus aquaticus-DNA-Polymerase oder die Thermus thermophilus-DNA-Polymerase ist.

24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die DNA-Polymerase die rekombinante Tth-DNA- Polymerase ist.

25. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, wobei die Temperatur des Reaktionsgemisches zwischen 40ºC und 80ºC liegt.

26. Verwendung eines Puffers nach Anspruch 13 bis 18 für die Durchführung einer reversen Transkriptionsreaktion unter Verwendung einer hitzestabilen DNA- Polymerase.

27. Kit, umfassend einen Puffer nach Anspruch 13 bis 18 und eine hitzeaktive DNA- Polymerase.