DE69924118T2

DE69924118T2 - Verfahren und reagentiensatz zur erkennung von antiviralen wirkstoff resistenzen

Info

Publication number: DE69924118T2
Application number: DE69924118T
Authority: DE
Inventors: M. Walid HENEINE; Gerardo Garcia Lerma; Shinji Yamamoto; M. William SWITZER; M. Thomas FOLKS
Original assignee: Us Gov Sec Dis & Prev; Centers of Disease Control and Prevention CDC; US Department of Health and Human Services
Current assignee: Us Gov Sec Dis & Prev; Centers of Disease Control and Prevention CDC; US Department of Health and Human Services
Priority date: 1998-06-19
Filing date: 1999-06-18
Publication date: 2005-12-22
Anticipated expiration: 2019-06-19
Also published as: WO1999066068A3; ATE290605T1; EP1100959B1; CA2331260A1; WO1999066068A2; ES2237923T3; DE69924118D1; CA2331260C; EP1100959A2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Tests zum Nachweis der Resistenz eines Retrovirus gegen Therapien mit einem Inhibitor der reversen Transkriptase und genauer betrifft sie einen nicht in Kultur durchgeführten auf der Polymerasekettenreaktion basierenden phänotypischen Test zum Nachweis einer antiviralen wirkstoffresistenten Reverse-Transkriptaseaktivität in einer Probe von einem Patienten, der mit einem Retrovirus infiziert ist.
Hintergrund der Erfindung
Eine der schlimmsten Krankheiten des späten 20. Jahrhunderts ist AIDS (erworbenes Immunschwächesyndrom), das durch eine HIV-(Humanimmunschwächevirus)-Infektion entsteht. Derzeit gibt es keine Heilung für diese Krankheit und nur minimal wirksame Behandlungen. Eines der Probleme, die bei der Entwicklung von Therapien für eine HIV-Infektion bestehen, ist es, dass der HIV-Virus schnell eine Resistenz gegen eine große Vielzahl chemotherapeutischer Mittel entwickelt. HIV, insbesondere das Humanimmunschwächevirus Typ 1 (HIV-1) mutiert mit der Zeit und wird resistent gegen viele der zur Behandlung verabreichten antiviralen Wirkstoffe. AIDS-Ärzte müssen wissen, wann die antivirale Therapie, die verwendet wird, um einen einzelnen Patienten zu behandeln, nicht mehr wirksam ist, so dass der antivirale Wirkstoff oder die Wirkstoffkombination modifiziert werden kann, wodurch die virale Replikation und das Einsetzen der Immunschwächesymptome minimiert werden können.
Inhibitoren der reversen Transkriptase (RT), wie Zidovudine (ZDV, auch als Azidothymidin (AZT) bezeichnet), Didanosin (ddI oder Didesoxyinosin), Zalcitabine (ddC oder Didesoxycytosin), Lamivudine (3TC), Stavudine (d4T) und Nevirapine (NVP) sind Nucleosid- oder Nichtnucleosidanaloga, die derzeit für die Behandlung von HIV-1-Infektionen zugelassen sind. Es ist bekannt, dass 3TC eine potente Anti-HIV-1-Aktivität und minimale Toxizität aufweist und einer der am häufigsten verwendeten Wirkstoffe in der Kombinationstherapie als Erstbehandlung oder First-line-Behandlung für mit HIV-1 infizierte Patienten ist. 3TC, das in Kom bination mit AZT verabreicht wird, liefert einen größeren und länger anhaltenden Anstieg der CD4⁺-Zellzahlen und höhere Reduktionen der HIV-1-RNA-Viruslast, als eine fortgesetzte AZT- oder 3TC-Monotherapie. 3TC in Kombination mit AZT und Proteaseinhibitoren verlangsamt das Fortschreiten der HIV-1-Krankheit und vermindert den Pegel an HIV-1-RNA auf weniger als 500 Kopien pro Milliliter für bis zu einem Jahr bei 90% der Patienten (Gulick et al., N. Engl. J. Med. 1997; 337:734–739).
Die Verwendung von Inhibitoren der reversen Transkriptase, wie 3TC, sowohl als Monotherapie als auch als Kombinationstherapie hat jedoch zum Auftreten von wirkstoffresistenten Varianten von HIV-1 geführt (Gulick et al., 1997). Bei einem Wirkstoff, wie 3TC, wird die Resistenz durch Mutationen im Codon 184 des HIV-1-Reverse-Transkriptasegens beigesteuert, das den Methioninrest des Wildtyps (M; ATG) durch ein Valin (V; GTG) über eine vorübergehende Substitution durch ein Isoleucin (I; ATA) ersetzt. Das Vorliegen dieser M184V-Mutation wurde mit einer mehr als 500-fachen Resistenz gegenüber 3TC und dem teilweisen Verlust der antiretroviralen und klinischen Vorteile des Wirkstoffs in Verbindung gebracht. Es ist daher wichtig, Personen, die mit Inhibitoren der reversen Transkriptase behandelt werden, auf Wirkstoffresistenz zu überwachen.
Phänotypische Tests liefern einen direkten und definitiven Beweis einer Resistenz gegenüber Wirkstoffen mit Inhibitoren der reversen Transkriptase. Derzeit verfügbare Tests bzw. Assays zur Analyse der phänotypischen Resistenz basieren jedoch auf einer Viruskultur und sind daher arbeitsintensiv und zeitaufwändig (2 bis 5 Wochen), teuer und ungeeignet für eine schnelle klinische Überwachung der Wirkstoffresistenz (Kavlick et al., Antiviral Research 1995; 28:133–146; Wainberg et al., AIDS 1995; 9:351–357). Außerdem sind diese Tests mit biologischen Variabilitäten befrachtet, einschließlich solcher, die mit der Virenisolierung und dem Tropismus zusammenhängen. Da die Gewebekultur hoch selektiv für Virenstämme mit in-vitro-Wachstumsvorteilen ist, könnten diese auf Kultur basierenden Testmethoden nicht repräsentativ für die gesamte Viruspopulation, die in vivo vorhanden ist, sein (Li et al., J. Virol. 1991; 65:3973–3985).
Ohne schnelle phänotypische Assays werden genotypische Tests derzeit verwendet, um einen indirekten Beweis der Resistenz zu liefern. Mit genotypischen Tests wird die Gegenwart von Mutationen überwacht, die mit der Resistenz verbunden sind, wie die M184V-Mutation. Von diesen genotypischen Tests sind primerspezifische PCR, Punktmutation und reverse Hybridisierungstests die am häufigsten verwendeten (Wainberg et al., 1995; Frenkel et al., J. Clin. Microbiol. 1995; 33:342–347; Stuyver et al., Antimicrob. Agents Chemother. 1997; 41:284–291). Unglücklicherweise kann die klinische Überwachung der Resistenz gegen einen Inhibitorwirkstoff für reverse Transkriptase durch genotypische Tests unerkannte Mutationen oder mögliche synergistische oder antagonistische Wirkungen komplexer Mutationsmuster, die durch Kombinationstherapie mit verschiedenen Inhibitoren der reversen Transkriptase entstehen, möglicherweise nicht nachweisen. Die Unterdrückung der phänotypischen Resistenz gegen AZT, die durch die M184V-Mutation beigetragen wird, zeigt z.B. deutlich die Wirkung, dass eine Kombination von Mutationen einen gegebenen Phänotyp haben kann (Larder et al., Science 1995; 269:696–699). Genotypisches Testen weist auch nur eine Resistenz nach, die mit bekannten Mutationen verbunden ist (d.h. Codon 184 für die 3TC-Resistenz).
U.S.-Patent Nr. 5 631 128 von Kozal beschreibt Polymerase-Kettenreaktions(PCR)-Tests zur Überwachung antiviraler Therapien bei der Behandlung von AIDS. Diese genotypischen Assays verwenden PCR, um die HIV-1-RNA-Kopienzahl in Plasma zu messen oder um spezifische bekannte HIV-1-RNA-Mutationen zu messen, nämlich die Mutation an Codon 215 oder Codon 74 des pol-Gens. Die HIV-1-RNA-Kopienzahl ist ein Hinweis auf die zirkulierende HIV-Virenlast. Eine Abnahme der HIV-1-RNA-Kopienzahl korreliert mit einer erfolgreichen antiretroviralen Therapie, wohingegen ein Anstieg der HIV-1-RNA-Kopienzahl ein Voranschreiten der Krankheit anzeigt, das höchstwahrscheinlich durch die Resistenz gegen die Therapie verursacht wird. Daher weisen die genotypischen Tests, die in U.S.-Patent Nr. 5 631 128 beschrieben werden, nur vorher identifizierte Mutationen der Viren-RNA nach und können keine phänotypische Resistenz nachweisen, die durch bekannte oder neue Mutationen verursacht wird oder die Tests weisen einen Anstieg der HIV-1-RNA-Kopienzahl nach, der auf anderen Bedingungen beruhen könnte, als der Resistenz. Eine falsche Diagnose der Wirkstoffresistenz gefolgt von einem Abbruch der antiviralen Therapie, die verabreicht wird, könnte zu einer Verschlimmerung einer Krankheit führen, die auf die Therapie angesprochen hatte.
Es besteht daher ein Bedarf für empfindliche schnelle Methoden zum Nachweis einer HIV-Resistenz gegenüber Wirkstofftherapien bei Patienten, so dass dann, wenn der Virus gegenüber einem speziellen Wirkstoff oder einer Kombination von Wirkstoffen resistent wird, die Therapie modifiziert werden kann, wodurch die virale Replikation auf einem Minimum gehalten wird und das Einsetzen von AIDS verhindert oder hinausgeschoben wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Test und ein Kit zum Nachweis einer phänotypischen Resistenz gegen einen Inhibitorwirkstoff gegen reverse Transkriptase in einer biologischen Probe wird bereitgestellt. Bevorzugt stammt die biologische Probe von einem Patienten, der mit einem Retrovirus infiziert ist. Der Test basiert auf der direkten Analyse der Empfänglichkeit oder Suszeptivität einer retroviralen reversen Transkriptase für eine Hemmung durch einen Inhibitorwirkstoff für eine reverse Transkriptase.
Die enzymatische Aktivität des reversen Transkriptaseenzyms wird bestimmt, indem das DNA-Produkt gemessen wird, das erzeugt wird, wenn eine RNA-Matrize und ein erster komplementärer DNA-Primer aus einem geeigneten Bereich des Enzephalomyokarditis-Virusgenoms mit einer biologischen Probe, die reverse Transkriptase enthält, in Gegenwart des Wirkstoffs, gegen den die Resistenz bestimmt werden soll, inkubiert werden. Als Kontrolle wird auch die enzymatische Aktivität des reversen Transkriptaseenzyms ohne den Wirkstoff bestimmt. Die Inkubationsmischung wird unter solchen Bedingungen umgesetzt, bei denen RNA-Matrize und DNA-Primer hybridisieren bzw. reassoziieren und ein DNA-Strang als Verlängerung des DNA-Primers synthetisiert wird, wenn die reverse Transkriptase in der Probe resistent gegen den Wirkstoff ist und von ihm nicht gehemmt wird. Das DNA-Produkt wird amplifiziert unter Verwendung eines zweiten komplementären DNA-Primers aus dem Enzephalomyokarditis-Virusgenom und geeigneter PCR-Reagenzien und Bedingungen und das amplifizierte Produkt wird mit Methoden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, nachgewiesen. Der Nachweis der amplifizierten DNA zeigt eine Resistenz gegen den in dem Test angewendeten Wirkstoff. Der Unterschied in der Aktivität der reversen Transkriptase in Tests mit und ohne Wirkstoff sichert das Auffinden der Resistenz ab und liefert einen Hinweis auf den Grad der Resistenz gegen den Wirkstoff.
Bevorzugt ist die zu untersuchende biologische Probe eine biologische Flüssigkeit, am meisten bevorzugt 0,5 μl bis 1,0 ml Blutplasma oder Serum. Bevorzugt besteht die RNA-Matrize aus dem Ribonucleotid von SEQ ID Nr. 4; der erste DNA-Primer besteht aus dem Oligonucleotid von SEQ ID Nr. 2; der zweite DNA-Primer besteht aus dem Oligonucleotid von SEQ ID Nr. 1 und die PCR-Amplifikation wird erreicht, indem 30 bis 40 Zyklen mit Erhitzen der synthetisierten DNA und des Primerpaars auf 93 bis 97°C für 30 bis 90 Sekunden, auf 53 bis 57°C für 30 bis 90 Sekunden und auf 70 bis 74°C für 30 bis 90 Sekunden verwendet werden. Die amplifizierte synthetisierte DNA wird bevorzugt nachgewiesen durch Hybridisierung mit einer internen spezifischen Oligosonde unter Verwendung eines Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA), von Southern Blot Hybridisierungsmethoden oder ähnlichen Methoden.
Außerdem wird ein Kit zum Nachweis einer Resistenz gegen einen Inhibitorwirkstoff gegen reverse Transkriptase in einer biologischen Probe bereitgestellt. Der Kit enthält einen geeigneten Bereich des Enzephalomyokarditis-Virusgenoms als RNA-Matrize, einen ersten komplementären DNA-Primer für die reverse Transkriptase und einen zweiten komplementären DNA-Primer zur Amplifikation über die Polymerase-Kettenreaktion und den zu untersuchenden RT-Inhibitor oder die RT-Inhibitoren, wobei jede Komponente in getrennten Behältern bereitgestellt wird oder irgendeine Kombination der Komponenten in einem einzelnen Behälter bereitgestellt wird. Der Kit kann gegebenenfalls die Vorrichtung und einen oder mehrere Behälter aufweisen, um die Probe vor und während der Analyse aufzunehmen und aufzubewahren und geeignete Puffer und andere Reagenzien, um die Nucleinsäurehybridisierung, Synthese, Amplifikation und den Nachweis zu erleichtern.
Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, empfindliche Methoden zum Nachweis einer Wirkstoffresistenz gegen reverse Transkriptaseinhibitoren in einer mit Retrovirus infizierten Probe bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Methode zum Nachweis einer Wirkstoffresistenz bereitzustellen, die schnell, zuverlässig, empfindlich und nicht arbeitsaufwändig ist.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Wirkstoffresistenzassay oder Wirkstoffresistenztest bereitzustellen, der phänotypisch und nicht genotypisch ist.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Test auf die Wirkstoffresistenz bereitzustellen, bei dem nur eine kleine Menge einer Probe für eine hoch empfindliche Analyse notwendig ist.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Test für das direkte Testen biologischer Körperflüssigkeitsproben, wie Serum, Plasma, Cerebrospinalflüssigkeit, Speichel, Samen und dgl. bereitzustellen, ohne übermäßige Konzentration, Kultivierung oder andere Aufarbeitungstechniken, die erforderlich wären, um den Gehalt an reverser Transkriptase in der zu analysierenden Probe zu erhöhen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Test zur Wirkstoffresistenz gegen einen Retrovirus bereitzustellen, der keinen Nachweis oder eine Amplifikation von Nucleinsäuremolekülen des Retrovirus beinhaltet.
Diese und weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Methode und des Kits ergeben sich nach einer Durchsicht der folgenden detaillierten Beschreibung der offenbarten Ausführungsformen und der beigefügten Ansprüche.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A ist ein Fließdiagramm, das einen phänotypischen Test zur Analyse einer Plasma-HIV-1-Resistenz gegen die antiviralen Wirkstoffe 3TC, ddC, ddI, AZT und NVP zeigt.
1B ist ein Fließdiagramm, das ein Protokoll für die schnelle Analyse einer HIV-1-Resistenz gegen 3TC zeigt unter Verwendung des auf reverser Transkriptase basierenden phänotypischen Assays zeigt.
2A ist ein Diagramm, das die Konzentration von 3TC-Triphosphat (3TC-TP) aufgetragen gegen die Hemmung der Aktivität der reversen Transkriptase bei Wildtyp-(xxBRU_pitt) und 3TC-resistentem (M184V_pitt) HIV-1 zeigt. Der Pfeil zeigt die 3TC-TP-Konzentration, die zwischen Wildtyp und 3TC-resistenter RT unterscheidet basierend auf dem Ausmaß der RT-Hemmung.
2B ist eine schematische Darstellung elektrophoretischer Gele, die 10-fache Reihenverdünnungen sowohl von Wildtyp-(xxBRU_pitt)- als auch 3TC-resistentem (M184V_pitt) HIV-1 zeigen, die mit und ohne 3TC-TP getestet wurden. Eine Konzentration von 5 μm 3TC-TP unterscheidet zwischen Wildtyp und 3TC-resistenter RT innerhalb eines breiten Bereichs an RT-Pegeln.
3 ist eine schematische Darstellung von Elektrophoresegelen, die die Hemmung von HIV-1 mit 3TC-, Nevirapine- oder AZT-Resistenzmutationen durch 3TC-TP zeigen. Bahn 1 ist Wildtyp-(xxBRU_pitt)-HIV-1; Bahn 2 ist 3TC-resistenter (M184V_pitt) HIV-1; Bahn 3 ist 3TC/Nevirapine-resistenter (M184V/Y181C_EU) HIV-1; Bahn 4 ist Nevirapine-resistenter (181C/Y_EU) HIV-1; Bahn 5 ist AZT-resistenter (HIV-1_RTMC/MY-2) HIV-1; Bahn 6 ist die negative Kontrolle.
4 ist ein Diagramm, das den Anteil an 3TC-resistentem (M184V_pitt) HIV-1 in einem Hintergrund von Wildtyp-(xxBRU_pitt)-HIV-1 im Vergleich zur Hemmung der RT-Aktivität durch 3TC-TP (5 μM) zeigt.
5 ist eine schematische Darstellung von Elektrophoresegelen, die die Hemmung von HIV-1-RT aus Plasma von drei mit HIV-1 infizierten Patienten vor und während der Therapie mit AZT plus 3TC durch 3TC-TP zeigen. Die Bahn SC ist HIV-1/2, HTLV-I/II-seronegative Kontrolle. Bahn W ist Wasser als Kontrolle.
6 ist ein Diagramm, in dem die Nevirapine-Konzentration gegen die Hemmung der Aktivität der reversen Transkriptase für Wildtyp und Nevirapineresistente Referenzisolate gezeigt ist.
7 ist ein Diagramm, in dem der Anteil von Nevirapine-resistentem HIV-1 gegen die Hemmung der reversen Transkriptaseaktivität aufgetragen ist, das eine Analyse von Mischungen von Wildtyp- und Nevirapine-resistentem HIV-1 mit dem Amp-RT-Assay, der hier beschrieben wird, zeigt.
8 ist eine Reihe von drei Diagrammen, in denen die Tage nach der Behandlung mit Nevirapine gegen die Hemmung der reversen Transkriptaseaktivität für drei mit HIV-1 infizierte Patienten gezeigt sind.
9 ist eine Reihe von drei Diagrammen, in denen die Tage nach Behandlung mit Nevirapine gegen log₁₀ RNA-Kopien/ml für drei mit HIV-1 infizierte Patienten gezeigt sind.
Detaillierte Beschreibung der offenbarten Ausführungsformen
Ein Assay und ein Kit zum Nachweis und zur Überwachung einer antiviralen Wirkstoffresistenz eines Retrovirus in einer biologischen Probe werden bereitgestellt. Der Test ist ein nicht in Kultur durchzuführender auf PCR basierender phänotypischer Test zum Nachweis eines wirkstoffresistenten Reverse-Transkriptaseenzyms in der Probe. Der Test ist geeignet, um das Ansprechvermögen eines Patienten auf eine Behandlung mit Inhibitoren der reversen Transkriptase zu überwachen, so dass dann, wenn die Resistenz gegen einen speziellen antiviralen Wirkstoff nachgewiesen wird, die Behandlung modifiziert werden kann, sogar bevor aktuelle Symptome der Resistenz beobachtet werden, wodurch die Virenreplikation und das Einsetzen opportunistischer Infektionen und der Krankheit auf einem Minimum gehalten werden. Der Test ist auch nützlich, um neue antivirale wirkstoffresistente Retrovirenstämme zu isolieren und zu identifizieren und zum Nachweis der Übertragung von antiviralen wirkstoffresistenten retroviralen Stämmen von Patient zu Patient.
Der phänotypische Test basiert auf der direkten Analyse der Empfindlichkeit oder Suszeptivität der reversen Transkriptase in der Probe für eine Hemmung durch einen Inhibitorwirkstoff für reverse Transkriptase, wie Zidovudine (ZDV, auch bekannt als Azidothymidin oder AZT), Didanosin (ddI), Zalcitabine (ddC), Lamivudine (3TC), Stavudine (d4T) oder Nevirapine (NVP), ohne darauf beschränkt zu sein. Abacavir (ABC), Delavirdine (DLV), Loviride (LVD), Efavirenz (EFV) oder Adefovir (bis-POM PMEA) können auch verwendet werden.
Der reverse Transkriptase-Phänotyp basiert auf dem Anteil an Hemmung der reversen Transkriptase durch eine vorgegebene Konzentration des Wirkstoffs und wird bestimmt nach Berechnung des Verhältnisses von Einheiten der rever se-Transkriptaseaktivität/ml von einer reversen Transkriptasereaktion, die in Gegenwart des Wirkstoffs erfolgt, zu den Referenzreaktionen ohne Wirkstoff (× 100). Wirkstoffkonzentrationen, die zu 50% oder 90% Hemmung führen (IC₅₀ und IC₉₀) können auch bestimmt werden, indem die reverse Transkriptase mit steigenden Konzentrationen des Wirkstoffs getestet wird. Der Anteil der Hemmung der reversen Transkriptase durch den Wirkstoff wird verwendet, um die Empfindlichkeit oder Empfänglichkeit des Retrovirus für den Wirkstoff zu bestimmen.
Die Ausdrücke "ein", "eine" und "der", "die", "das", wie sie hier verwendet werden, sind so definiert, dass sie "ein oder mehrere" bedeuten und schließen den Plural ein, wenn der Zusammenhang nicht dagegen spricht.
Die zu testende biologische Probe kann von einer Person genommen werden, z.B. aus einer Wunde, Blut, einer Ausscheidung, Gewebe, Knochen, Muskel, Knorpel oder einer Hautprobe oder kann eine Laborprobe sein, wie ein Zellkulturüberstand, ein Virenisolat oder ein Virenkonzentrat. Die Probe kann aus irgendeiner biologischen Quelle erhalten werden und wird bevorzugt aus einem Menschen oder Tier entnommen, das mit einem Retrovirus infiziert werden kann oder einen Retrovirus beherbergt. Die Probe kann z.B. eine biologische Flüssigkeit sein, wie z.B. Vollblut, Blutserum, Blutplasma, Vaginalspülung, Samen, Urin, Speichel, Sputum, Cerebrospinalflüssigkeit, Tränenflüssigkeit, Fermentationsflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Gewebekulturflüssigkeit, Aszitesflüssigkeit, Gelenkflüssigkeit, Pleuraflüssigkeit und dgl. Die bevorzugte biologische Probe ist eine biologische Flüssigkeit, aus der die Zellen entfernt werden können. Die am meisten bevorzugten Proben sind Blutplasma oder Serum. Die Probe wird gesammelt oder erhalten unter Verwendung von Methoden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt sind.
Die Probe kann verdünnt, gereinigt, eingeengt, filtriert, gelöst, suspendiert oder in anderer Weise vor der Verwendung im Test manipuliert werden. Bevorzugt wird eine Probe, die teilchenförmiges Material enthält, vor der Verwendung verdünnt, filtriert oder sowohl verdünnt als auch filtriert. Ein Merkmal des vorliegenden Tests ist es, dass er nützlich ist für die direkte Analyse der Wirkstoffresistenz in einer biologischen Körperflüssigkeitsprobe, wie Blutserum oder Plasma, Speichel, Cerebrospinalflüssigkeit und ähnlichen Körperflüssigkeiten. Eine solche Probe muss daher nicht verarbeitet werden, bevor sie mit den Testreagenzien vereinigt wird, was die Probenanalyse erleichtert und die Menge an Arbeit, Materialien, Zeit und Kosten, die an der Durchführung des Tests beteiligt sind, minimiert. Die Probengröße für die biologische Flüssigkeitsprobe ist bevorzugt ungefähr 0,5 μl bis 1 ml.
Der in der Probe vorhandene Retrovirus oder der Retrovirus, der den Menschen oder das Tier infiziert, aus dem die Probe entnommen wurde, ist ein Virus, der durch die Gegenwart von reverser Transkriptase gekennzeichnet ist, die die virale genomische RNA in eine doppelsträngige DNA-Kopie umschreibt. Beispielhafte Retroviren, für die eine Bestimmung der Wirkstoffresistenz gedacht ist, schließen Lentiviren, wie HIV-1 und HIV-2, und Onkoviren, wie Human-T-Lymphozytenvirustypen I und II (HTLV-1 und HTLV-II) ein. Es versteht sich für den Fachmann auf diesem Gebiet, dass Tests für eine retrovirale Wirkstoffresistenz in anderen Arten als Menschen, wie nicht-menschlichen Primaten, Katzen, Schweinen, Pferden und Mäusen im Schutzbereich des hier beschriebenen Tests liegen.
Die enzymatische Aktivität des reversen Transkriptaseenzyms eines Retrovirus in der Probe wird bestimmt, indem das DNA-Produkt gemessen wird, das erzeugt wird, wenn eine RNA-Matrize und ein erster komplementärer DNA-Primer aus einem geeigneten Bereich des Enzephalomyokarditis-Virusgenoms mit einer biologischen Probe, die reverse Transkriptase enthält, in Gegenwart eines oder mehrerer Wirkstoffe, gegen die eine Resistenz bestimmt werden soll, oder von Wirkstoffhomologen inkubiert werden. Als Vergleichskontrolle wird die enzymatische Aktivität des reversen Transkriptaseenzyms auch ohne den Inhibitor der reversen Transkriptase bestimmt. Ein Vergleich dieser Ergebnisse liefert eine Bestätigung der Wirkstoffresistenz und einen Hinweis auf das Ausmaß der Resistenz.
Die Konzentration des zu dem Test zugegebenen Wirkstoffs hängt von dem angewendeten Wirkstoff und der normalerweise einem Patienten verabreichten Konzentration des Wirkstoffs ab. Z.B. ist die Konzentration von 3TC, das einem Test zur Bestimmung der 3TC-Resistenz zugegeben wird, bevorzugt ungefähr 1 bis 10 μM, am meisten bevorzugt ungefähr 5 μM. Die bevorzugte Konzentration von Nevirapine, die im Test verwendet wird, ist ungefähr 1 bis 100 μM, am meisten bevorzugt ungefähr 50 μM. Es versteht sich, dass geeignete Konzentrationen für andere Inhibitoren der reversen Transkriptase berechnet oder experimentell bestimmt werden können unter Verwendung von Methoden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind.
Der Ausdruck "geeignete Region" oder "geeigneter Bereich" wird hier definiert als eine Region der RNA-Sequenz ohne signifikante Sekundärstruktur, mit weniger als 50% GC-Gehalt und für die komplementäre DNA-Primer erzeugt werden können, die Tm-Werte in einem Bereich von Reaktionstemperaturen haben, die geeignet sind für die Synthese eines DNA-Strangs, wie unten beschrieben. Die RNA-Matrize kann eine Länge haben, die ausreicht, um ein DNA-Produkt zu erzeugen, dessen Größe im Bereich von 100 bis 500 Basenpaaren liegt, am meisten bevorzugt mit einer Länge von 300 Basenpaaren. Die RNA-Matrize ist am meisten bevorzugt das Ribonucleotid von SEQ ID Nr. 4 mit der folgenden Sequenz:
5' CAUUAGCCAU UUCAACCCAU GCGUUUGAGG AGAAGCGCUU 40 UCUGAUAACC GGUGGUCUCC CAUCAGGUUG UGCAGCGACC 80₂₀ UCAAUGCUAA ACACUAUAAU GAAUAAUAUA AUAAUUAGGG 124 CGGGUUUGUA UCUCACGUAU AAAAAUUUUG AAUUUGAUGA 160 UGUGAAGGUG UUGUCGUACG GAGAUGAUCU CCUUGUGGCC 200 ACAAAUUACC AAUUGGAUUU UGAUAAGGUG AGAGCAAGCC 240 UCGCAAAGAC AGGAUAUAAG AUAACUCCCG CUAACACAAC 280 UUCUACCUUU CCUCUUAAUU CGACGCUUGA AGACGUUGUC 320 UUCUUAAAAA GAAAGUUUAA GAAAGAGGGC CCUCUGUAUC 360 GGCCUGUCAU GAAC 3'
Die Inkubationsmischung wird unter Bedingungen, unter denen die RNA-Matrize und der DNA-Primer reassoziieren, umgesetzt oder inkubiert und ein DNA-Strang wird als Verlängerung von dem DNA-Primer synthetisiert, wenn die reverse Transkriptase in der Probe gegenüber dem Wirkstoff resistent ist und daher nicht von dem Wirkstoff gehemmt wird. Das DNA-Produkt wird amplifiziert unter Verwendung eines zweiten komplementären DNA-Primers aus dem Enzephalomyokarditis-Virusgenom und geeigneter DNA-Amplifikationsreagenzien und -bedingungen und das amplifzierte Produkt wird nachgewiesen mit Methoden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind. Der Nachweis der amplifizierten DNA zeigt die Resistenz gegen den im Test angewendeten Wirkstoff.
Der Ausdruck "komplementärer DNA-Primer", wie er hier verwendet wird, bedeutet ein Oligonucleotid, das sich mit der RNA-Matrize in einer speziellen Orientierung reassoziiert, um die Synthese eines naszierenden DNA-Strangs in Gegenwart der reversen Transkriptase in der biologischen Probe unter den hier beschriebenen Bedingungen zuzulassen. Der Begriff "Bedingung", unter der ein DNA-Strang synthetisiert wird, der hier auch verwendet wird, schließt die Gegenwart von Nucleotiden, Kationen und geeigneten Puffermitteln in solchen Mengen und bei solchen Temperaturen ein, dass RNA-Matrize und DNA-Primer sich assoziieren und Oligonucleotide in einen synthetisierten DNA-Strang eingebaut werden, wenn die reverse Transkriptase nicht durch den Inhibitorwirkstoff für die reverse Transkriptase gehemmt wird. Beispielhafte Bedingungen sind in den Beispielen unten angegeben. Die beschriebenen Bedingungen wurden von anderen bekannten RT/cDNA-Syntheseprotokollen optimiert. Es ist allgemein bekannt, dass andere Bedingungen etabliert werden können zur Optimierung einer speziellen Reverse-Transkriptase-Reaktion auf Basis der dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannten Protokolle. Der DNA-Primer kann der reverse Primer eines Primerpaars sein, der in der nachfolgenden Amplifikation verwendet wird, wie z.B. das Oligonucleotid von SEQ ID Nr. 2 (EMCR2), das die folgende Sequenz hat:
5' GTTCATGACA GGCCGATACA GAGG 3'
Bevorzugt besteht der zweite DNA-Primer aus dem Oligonucleotid von SEQ ID Nr. 1, das die folgende Sequenz hat:
5' CATTAGCCAT TTCAACCCAT 3'
Der synthetisierte Strang kann mit irgendeinem der im Stand der Technik jetzt oder in der Zukunft bekannten Amplifikationsprotokolle amplifiziert werden, was die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die Ligierungsamplifikationsreaktion (LAR), das auf Ligase basierende Amplifikationssystem (LAS), das sich selbst erhaltende Sequenzreplikations-(3SR)-System, das auf Transkription basierende Amplifikationssystem (TAS) und die Qβ-Replikaseamplifikationsmethode ein schließt, ohne darauf beschränkt zu sein. Die bevorzugte Amplifikationsmethode ist PCR.
Für die Amplifikation mit PCR können die Bedingungen für die Amplifikation 30 bis 40 Zyklen (bevorzugt 35 Zyklen) der Erwärmung der synthetisierten DNA und des Primerpaars auf 93 bis 97°C (bevorzugt 95°C) über 30 bis 90 Sekunden (bevorzugt 1 Minute), auf 53 bis 57°C (bevorzugt 55°C) über 30 bis 90 Sekunden (bevorzugt 1 Minute), und auf 70 bis 74°C (bevorzugt 72°C) über 30 bis 90 Sekunden (bevorzugt 1 Minute) einschließen. Die amplifizierte synthetisierte DNA wird bevorzugt mit einem Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) nachgewiesen. Alternativ wird die amplifizierte DNA mit Southern-Blot-Hybridisierungsmethoden nachgewiesen.
Der Ausdruck "Primerpaar", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf zwei Primer, von denen einer eine Vorwärtsbezeichnung hat und der andere eine Rückwärtsbezeichnung hat bezogen auf die jeweiligen Orientierungen an einem doppelsträngigen DNA-Molekül, das aus einer Sense- bzw. codierenden und einer Antisense-Sequenz besteht, so dass unter den hier beschriebenen Amplifikationsbedingungen der Vorwärtsprimer mit der codierenden Sequenz hybridisiert und deren Amplifikation startet und der reverse Primer mit der Antisense-Sequenz hybridisiert und deren Amplifikation startet. Primer können zur Verwendung in der Amplifikationsreaktion auf der Basis ausgewählt werden, dass sie weniger als 50% GC-Gehalt haben, eine minimale Komplementarität mit anderen Primern in der Reaktion (um die Bildung von Primerdimeren zu minimieren) und Tm-Werte haben in einem Bereich von Reaktionstemperaturen, die für die Amplifikationsmethode, bevorzugt PCR, geeignet sind. Außerdem können Primer so ausgewählt werden, dass sie mit spezifischen Regionen der RNA-Matrize hybridisieren, so dass die Größe des entstehenden DNA-Amplifikationsproduktes in einem Bereich von 100 bis 500 Basenpaaren Länge und am meisten bevorzugt etwa 300 Basenpaaren Länge liegt. Z.B. kann unter den oben beschriebenen Bedingungen das Primerpaar aus dem Oligonucleotid von SEQ ID Nr. 1 (EMCF1) als Vorwärtsprimer und dem Oligonucleotid von SEQ ID Nr. 2 (EMCR2) als reversem Primer bestehen.
Der Ausdruck "nachweisen" oder "Nachweis" der amplifizierten DNA, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die qualtitative oder quantitative Bestimmung der Gegenwart des amplifizierten DNA-Strangs, der nur synthetisiert wird, wenn die reverse Transkriptase gegen den der Testmischung zugegebenen Inhibitorwirkstoff für reverse Transkriptase resistent ist. Die Amplifikation der synthetisierten DNA kann mit jeder Methode zum Nachweis von DNA, die im Stand der Technik bekannt ist, nachgewiesen werden. Z.B. kann der Nachweis der amplifizierten DNA mit Southern-Blot-Hybridisierungsassay, durch Sichtbarmachung der DNA-Amplifikationsprodukte mit spezifischem Molekulargewicht auf mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegelen, durch Messung des Einbaus von radioaktiv markierten Nucleotiden in den synthetisierten DNA-Strang durch Autoradiografie oder Szintillationsmessung, mit ELISA, der modifiziert ist zum Einfang einer nachweisbaren Einheit, die an die amplifizierte DNA gebunden ist, oder jeder anderen dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannten Nachweismethode erfolgen. Die bevorzugte Nachweismethode ist die Hybridisierung der amplifizierten DNA an eine interne spezifische Oligosonde unter Verwendung von Techniken, wie ELISA, Southern-Blot-Hybridisierung oder eine ähnliche Methode, am meisten bevorzugt unter Verwendung der spezifischen Hybridisierungssonde von SEQ ID Nr. 3, die die folgende Sequenz aufweist:
5' TGCTCTCACC TTATCAAAAT CCAAT 3'
Außerdem wird ein Kit bereitgestellt, um die Resistenz gegen einen Inhibitorwirkstoff gegen reverse Transkriptase in einer biologischen Probe zu bestimmen. Der Kit enthält einen geeigneten Bereich des Enzephalomyokarditis-Virusgenoms als RNA-Matrize, einen ersten komplementären DNA-Primer für die reverse Transkriptase und einen zweiten komplementären DNA-Primer für die Amplifikation über die Polymerase-Kettenreaktion, wobei jede Komponente in getrennten Behältern bereitgestellt wird oder irgendeine Kombination von Komponenten in einem einzelnen Behälter bereitgestellt wird. Der Kit kann gegebenenfalls eine Probe des Wirkstoffs, gegen den die Resistenz bestimmt werden soll, eine Hybridisierungssonde zum Nachweis des amplifizierten DNA-Produkts, eine Vorrichtung zur Durchführung des Tests, eine Vorrichtung zum Testnachweis, einen oder mehrere Behälter, um die Probe vor und während der Analyse aufzunehmen und aufzubewahren und geeignete Puffer und andere Reagenzien, um die Nucleinsäurehybridisierung, Synthese, Amplifikation und den Nachweis zu erleichtern, enthalten.
Eine bevorzugte Ausführungsform der hier beschriebenen Testmethode zum Nachweis von einer für 3TC-, ddC-, ddI-, AZT- und NVP-resistenten HIV-1-reversen Transkriptaseaktivität in Plasma wird als Fließdiagramm in 1A gezeigt. Das Protokoll für den Test ist in 1B angegeben. Der bevorzugte Test, auch als Amp-RT-Test bezeichnet, wird in der gleichzeitig schwebenden Anmeldung mit der Seriennummer 08/763 762 beschrieben, der hier durch Bezugnahme miteingeschlossen wird.
Im Gegensatz zu den auf Kultur basierenden phänotypischen Assays ist der hier beschriebene auf der reversen Transkriptase basierende phänotypische Assay eine hoch empfindliche, schnelle und einfache Methode für die direkte Analyse der phänotypischen Resistenz gegenüber Inhibitorwirkstoffen für reverse Transkriptase und liefert daher ein geeignetes Mittel für die klinische Überwachung und Behandlung der Wirkstoffresistenz. Der Test ist geeignet zur Bestimmung der phänotypischen Resistenz sowohl bei bekannten als auch unbekannten genotypischen Mutationen. Dieser Testansatz kann ausgedehnt werden auf die Analyse der Resistenz gegenüber einer Vielzahl von Inhibitorwirkstoffen für die reverse Transkriptase und kann auch nützlich sein zur Überwachung der Übertragung von wirkstoffresistenten Viren.
Beispiel 1
Bestimmung der phänotypischen Resistenz gegen 3TC
Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung eines schnellen nicht auf einer Kultur basierenden Assays für die Analyse der phänotypischen Resistenz gegen 3TC in Plasma HIV-1. Der Test, als Amp-RT-Test bezeichnet, basierte auf der direkten Analyse der Empfänglichkeit von Plasma HIV-1-reverser Transkriptase für die Hemmung durch 3TC-TP. Der Test wies erfolgreich die phänotypische Resistenz gegen 3TC in Plasmaproben von mit 3TC behandelten Patienten nach. Die Resistenz gegen 3TC bei HIV-1-reverser Transkriptase, die Mutationen aufweist, verbunden mit einer Mehrfachwirkstoff-(MD)-Resistenz für Nucleosidanaloga wurde auch identifiziert.
Materialien und Methoden
Der in diesem Beispiel verwendete phänotypische Test basierte auf der Analyse der Empfindlichkeit der Reverse-Transkriptaseaktivität von HIV-1 aus Plasma für die Hemmung durch 3TC-TP. Die Empfindlichkeit der reversen Transkriptase in Plasma für 3TC-TP wurde bestimmt basierend auf dem Ausmaß der Hemmung, das durch 3TC-TP erzeugt wurde und wurde gemessen durch laufende quantitative Tests in Gegenwart und Abwesenheit von 3TC-TP.
Der Test weist reverse Transkriptaseaktivität nach unter Verwendung einer nicht retroviralen heteropolymeren RNA-Matrize, die aus dem Enzephalomyokarditisvirus-(EMCV)-Genom stammt, und eines komplementären EMCV-spezifischen DNA-Oligoprimers. Die mit RT erzeugte EMCV-cDNA wird mit PCR-Amplifikation und interner Oligosondierung des PCR-Produktes mit einer EMCV-spezifischen Sonde nachgewiesen.
Für den Kulturüberstand wurden 10 μl direkt für die reverse Transkriptasereaktion verwendet. Die Analyse der phänotypischen Resistenz in Plasmaproben erfolgte in plasmafreien Viruspellets, wie in dem in 1B angegebenen Protokoll beschrieben. Ein Volumen von 100 μl EDTA-Plasma wurde durch Zentrifugation mit 10.000 g 5 Minuten lang geklärt und dann mit einem festen Winkel bei 99.000 g 1 Stunde bei 4°C ultrazentrifugiert. Das Virenpellet wurde in 100 μl Reverse-Trankriptasepuffer (50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl₂) resuspendiert und Aliquots von 2 bis 10 μl wurden für die Analyse der phänotypischen Resistenz verwendet.
Für die quantitative Auswertung der Pegel von reverser Transkriptase wurde eine Standardkurve erzeugt unter Verwendung von bekannten Reverse-Transkriptaseeinheiten aus einem Referenz-HIV-1-Vorrat (Virology Quality Assurance Laboratory, Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center, Chicago, IL). Es wurde gezeigt, dass dieser Virusvorrat 0,96 × 10^–10 Einheiten an reverser Transkriptaseaktivität/Virion aufwies. Der quantitative Nachweis der Amp-RT-Produkte erfolgte unter Verwendung eines auf ELISA basierenden nicht radioaktiven oligosondierenden Systems mit einer internen EMCV-spezifischen Sonde. Die Ergebnisse der Amp-RT-Signale wurden ausgedrückt als Einheiten der reversen Transkriptaseaktivität pro Milliliter und spiegeln den Durchschnitt von doppelten oder dreifa chen Versuchen wider. Der qualitative Nachweis von Amp-RT-Produkten erfolgte mit Southern-Blot-Hybridisierung an einer ³²P-endmarkierten EMCP1-Sonde.
Die phänotypische Resistenz von HIV-1 gegen 3TC wurde mit dem Amp-RT-Test gemessen. Amp-RT weist reverse Transkriptaseaktivität nach unter Verwendung einer heterologen RNA-Matrize, die aus dem Enzephalomyokarditisvirus (EMCV) stammt, eines komplementären DNA-Oligoprimers und einer PCR-Amplifikation von mit reverser Transkriptase erzeugter EMCV-cDNA. Für die phänotypische Analyse der 3TC-Resistenz wurden 10 μl Kulturüberstand oder Viruspellets aus 2 bis 10 μl Plasma jeweils in doppeltem Ansatz auf einen Reverse-Transkriptasepuffer aufgetragen, der 10 ng EMCV-RNA-Matrize, 10 Einheiten RNasin, 0,6% NP-40, 100 ng 5'-Biotin-markierten EMCR2-Antisense-Primer, 1 mM EGTA, 2 mM Dithiothreitol, 50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl und 10 mM MgCl₂, 20 μM dATP, dGTP und dTTP, 5 μM dCTP enthielt. Um die Empfindlichkeit der reversen Transkriptase gegenüber 3TC-TP zu bestimmen, wurde eine weitere Amp-RT-Reaktion in Gegenwart von 3-TC-TP durchgeführt mit Konzentrationen von 3TC-TP im Bereich von 0,1 bis 10 μM. Die Reaktionen bzw. Ansätze wurden 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert und 5 Minuten lang auf 95°C erhitzt, um Reverse-Transkriptaseaktivität zu zerstören. Die PCR-Amplifikation der Reverse-Transkriptaseprodukte geschah wie folgt nach Zugabe von jeweils 200 μM dNTP. Ein Volumen von 50 μl PCR-Puffer, der 2,5 Einheiten Taq-Polymerase, 100 ng Sense-Primer EMCF1 und jeweils 200 μM dNTP enthielt, wurde der Reverse-Transkriptasemischung zugegeben. Die Reaktion wurde 35 Mal im Zyklus bei 95°C 1 Minute, 55°C 1 Minute und 72°C 1 Minute durchgeführt.
Wie oben für die quantitative Auswertung der Reverse-Transkriptasepegel beschrieben, wurde eine Standardkurve erzeugt unter Verwendung bekannter Virionzahlen des Referenz-HIV-1-Virusvorrats. Die von Garcia Lerma et al., J. Infect. Dis. 1998; 177:1221–1229 beschriebene Methode wurde für die Charakterisierung der reversen Transkriptaseaktivität in dem Referenzvirus ebenso wie bei der quantitativen Auswertung der Amp-RT-Produkte mit einem auf ELISA basierenden nicht radioaktiven oligosondierenden System verwendet. Die Proben wurden als positiv angesehen, wenn im Doppelversuch Testergebnisse positiv waren. Der qualitative Nachweis der Amp-RT-Produkte erfolgte mit einem auf ELISA basierenden nicht radioaktiven oligosondierenden System, wie in 1B und von Heneine et al., J. Infect. Dis. 1995:171:1210–1216 beschrieben.
Die Empfindlichkeit von HIV-1-reverser Transkriptase gegenüber 3TC-TP wurde bestimmt über den Grad der Hemmung der reversen Transkriptaseaktivität durch 3TC-TP. Der Prozentanteil der Hemmung wurde berechnet unter Verwendung des Verhältnisses des Pegels an reverser Transkriptase, der in Amp-RT-Ansätzen erreicht wurde, die 3TC-TP enthielten, zu dem, der bei Amp-RT-Ansätzen gezeigt wurde, die in Abwesenheit von 3TC-TP gemacht wurden (× 100). Wirkstoffkonzentrationen, die zu 50% und 90% Hemmung führten (IC₅₀ und IC₉₀) wurden auch bestimmt, indem reverse Transkriptase in Gegenwart verschiedener 3TC-TP-Konzentrationen getestet wurde.
Nachweis von 3TC-Resistenzmutationen
Genotypische Resistenz gegen 3TC wurde analysiert, indem sequenziert wurde und/oder mit dem genotypisierenden HIV-1 Line Probe Assay (LiPA) genotypisiert wurde, um Mutationen am Codon 184 nachzuweisen. Dieser Test basiert auf der reversen Hybridisierung eines biotinylierten PCR-Fragments mit kurzen, immobilisierten Oligonucleotiden, wie von Stuyver et al., Antimicrob. Agents Chemother. 1997; 41:284–291 beschrieben. Ein Bereich der reversen Transkriptase von HIV-1, der die Aminosäuren 19 bis 233 umfasst, wurde in ausgewählten Proben sequenziert.
Population für die Untersuchung
Insgesamt 30 EDTA-Plasmaproben von 15 mit HIV-1 infizierten Patienten aus dem Veteran Administration Medical Center, Decatur, GA, wurden untersucht. Die Proben wurden von Patienten vor und während der antiretroviralen Therapie mit 3TC gesammelt. Der auf Amp-RT basierende phänotypische Test wurde unter einem Code im Hinblick auf das Datum der Reihenblutentnahme und des reversen Transkriptasegenotyps durchgeführt. Eine Plasmaprobe von einem Blutspender, der auf Antikörper für HIV-1/2, HTLV-I/II negativ getestet worden war, wurde als negative Testkontrolle verwendet.
Viren und 3TC-5'-Triphosphat (3TC-TP)
Für die Testentwicklung und Validierung wurden HIV-1-molekularinfektiöse Klone (MIC) xxBRUpitt und M184Vpitt als Wildtyp (WT) und 3TC-resistente (M184V-Mutation) HIV-1-Referenzviren verwendet. Andere Referenzviren (Kontrollen) beinhalteten M184V/Y181CEU, Y181CEU und HIV-1_RTMC/MT-2, die 3TC- und Nevirapine-resistente (M184V/Y181C) und Nevirapine-resistente (Y181C) und AZT-resistente (D67N/K70R/T215F/K219Q) HIV-1 darstellen, wie von Larder und Kemp, Science 1989; 246:1155–1158 beschrieben. Wildtyp HIV-1_SUM9 und Mehrfachdidesoxynucleosid-resistenter HIV-1_SUM8 (Q151M-Mutation), HIV-1_SUM12 (F77L/F116Y/Q151M) und HIV-1_SUM13 (A62V/V751/F77L/F116Y/Q151M) MICs wurden von Dr. Mitsuya bereitgestellt, wie von Shirasaka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995; 92:2398–2402 beschrieben. Die Synthese und Vorbereitung von 3TC-TP wurden durchgeführt, wie von Schinazi et al., Antimicrob. Agents Chemother. 1992; 36:2423–2431 beschrieben. Rohes 3TC-5-TP wurde mit FPLC gereinigt unter Verwendung einer HiLoad 26/10, Q Sepharose Fast Flow^TM Pharmacia Chromatographiesäule (Pharmacia, Piscataway, NJ) und eines Gradienten von TEAE-Puffer (pH 7,0). Die Verbindung wurde mit UV, Protonen- und Phosphor-NMR, Massenspektroskopie und Hochdruckchromatographie charakterisiert. Die Konzentration von 3TC-TP, die zu einer 50%igen Hemmung des Einbaus von 3HdCTP in einen (rl)n-dC12-18-Matrizenprimer durch rekombinante p66/p51 HIV-1-reverse Transkriptase (Biotechnology General, Rehovot, Israel) führte, war 1,3 μM, was durch Abnahme der Bildung eines säureunlöslichen Produkts bestimmt wurde im Vergleich zu unbehandelter Kontrolle.
Ergebnisse
Amp-RT-Testbedingungen, die zwischen Wildtyp und 3TC-resistentem HIV-1 unterscheiden
Die Hemmung der reversen Transkriptase durch 3TC-TP entsteht durch die Fähigkeit von 3TC-TP, als kompetitiver Inhibitor für 2'-Desoxycytidin-5'-triphosphat (dCTP) und Kettenabbruch zu wirken, wie von Arts und Wainberg, Antimicrob. Agents Chemother. 1996; 40:527–540 beschrieben. Um das optimale Verhältnis von 3TC-TP zu dCTP zu bestimmen, das notwendig ist, um reverse Transkriptase von Wildtyp HIV-1 zu hemmen, aber nicht 3TC-resistente reverse Transkriptase, wurden reverse Transkriptasen von einem Wildtyp (xxBRUpitt) und einem 3TC-resistenten (M184Vpitt) HIV-1 in Gegenwart ansteigender Konzentrationen von 3TC-TP (von 0,1 bis 10 μM) bei einer festen Konzentration von dCTP (5 μM) getestet. 5 μM dCTP war die geringste Konzentration, bei der gefunden wurde, dass sie die Empfindlichkeit des Amp-RT-Tests nicht beeinflusste.
Die 2A und 2B zeigen die Hemmung, die mit 10^–7 Einheiten reverser Transkriptaseaktivität gezeigt wurde und zeigen, dass eine vollständige Hemmung der reversen Transkriptase aus Wildtyp, nicht aber aus 3TC-resistenten Virus bei 5 μM 3TC-TP erreicht wurde. Diese Konzentration von 3TC-TP konnte 10^–7 und 10^–8 Einheiten von reverser Transkriptaseaktivität aus Wildtyp HIV-1 vollständig hemmen, dem Äquivalent von 10⁵ bis 10⁴ HIV-1 Teilchen pro ml des Referenzvirus, wie in 2 gezeigt. Bei einem höheren Eintrag von reverser Transkriptase (10^–6 Einheiten reverse Transkriptaseaktivität; äquivalent 10⁶ HIV-1 Teilchen/ml Referenzvirus) führten diese Bedingungen nicht zu einer vollständigen Hemmung. Die restliche reverse Transkriptaseaktivität in der Amp-RT-Reaktion, die 3TC-TP enthielt, war 0,4% des Amp-RT-Signals von der Kontrollreaktion, die kein 3TC-TP aufwies. Diese Reduktion des Reverse-Transkriptasesignals ist äquivalent einem Abfall von 2,35 log₁₀ der Amp-RT-Viruslast. Keine signifikante Hemmung war zu sehen bei 3TC-resistentem HIV-1, der entweder bei hohem oder niederem Eintrag von reverser Transkriptase getestet wurde, was die Fähigkeit des Tests zeigt, zwischen Wildtyp und 3TC-resistenten reversen Transkriptasen in einem weiten Bereich von Reverse-Transkriptasepegeln zu unterscheiden. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden Amp-RT-Bedingungen, die 5 μM 3TC-TP enthielten, als primärer Screeningtest für 3TC-Resistenz bei allen Tests verwendet, wenn nicht anders angegeben.
Um zu zeigen, dass der auf Amp-RT basierende phänotypische Test spezifisch war für die 3TC-Resistenz, wurden mehrere HIV-1-Referenzviren mit gut charakterisierter phänotypischer Resistenz gegen Nucleosid- und Nichtnucleosidanaloga getestet. 3 zeigt, dass die Resistenz gegen 3TC nur bei reversen Transkriptasen zu sehen war, die die M184V-Mutation trugen. Wie erwartet erwiesen sich alle HIV-1-reversen Transkriptasen, die AZT-(D67N, K70R, T215F, K219Q)- oder Nevirapine-(Y181C)-Resistenzmutationen trugen, als empfindlich gegen 3TC-TP. Diese Ergebnisse bestätigen, dass der Test spezifisch war für Viren mit einer phänotypischen Resistenz gegen 3TC und zeigen, dass die Gegenwart von anderen Mutationen, die mit AZT- und Nevirapine-Resistenz ver bunden sind, die Hemmung der reversen Transkriptaseaktivität durch 3TC-TP nicht beeinflusst.
Testnachweisgrenze für die phänotypische Resistenz gegen 3TC
Die Testnachweisgrenze für 3TC-Resistenz wurde getestet, indem Wildtyp-(xxBRUpitt) und 3TC-resistente (M184Vpitt) MIC in verschiedenen Anteilen gemischt wurden und auf das Vorliegen einer 3TC-Resistenz getestet wurden. Die Referenzviren wurden auf gleiche Pegel der Reverse-Transkriptaseaktivität eingestellt, bevor die Virusmischungen hergestellt wurden. Das Ausmaß der Hemmung der Reverse-Transkriptaseaktivität durch 3TC-TP, das für jede Mischung mit dem Anteil an 3TC-resistentem Virus beobachtet wurde, wurde verglichen. 4 zeigt, dass die Testnachweisgrenze 10% 3TC-resistente Viren bei einem Hintergrund von Wildtyp HIV-1 war. Eine gute Korrelation zwischen dem Anteil an Viren, die die M184V-Mutation trugen und dem Anteil an Hemmung wurde auch beobachtet. Z.B. war in den Mischungen, die 25% oder 75% 3TC-resistenten Virus enthielten, die beobachtete Hemmung 87% bzw. 26%, was sehr wahrscheinlich die Signale der 3TC-resistenten reversen Transkriptase bedeutet und daher darauf hindeutet, dass nur die reverse Transkriptaseaktivität des Wildtyps gehemmt wurde.
Die gleichen Mischungen wurden verwendet, um die Nachweisgrenze des auf Amp-RT basierenden phänotypischen Tests mit der genotypischen Nachweisgrenze bei Viren, die die M184V-Mutation tragen mit dem in 4 gezeigten LiPA-Assay zu vergleichen. Die Nachweisgrenze für 3TC-resistenten Virus mit dem HIV-1 LiPA-Test war 10%, was darauf hindeutet, dass beide Tests zuverlässig geringe Anteile entweder von genotypischer oder phänotypischer Resistenz gegen 3TC nachweisen können. Die Signalintensitäten in Mischungen, die 50% Wildtyp und 50% 3TC-resistenten Virus enthielten, waren jedoch nicht mit dem LiPA-Assay vergleichbar. Dies mag auf unterschiedlichen Anteilen an HIV-1-RNA in beiden Referenzviren liegen, was durch Einstellung des Virus gemäß der reversen Transkriptaseaktivität statt gemäß der RNA-Pegel entstehen kann oder aufgrund unterschiedlicher Effizienzen bei der Hybridisierung von Wildtyp- oder 184V-spezifischen Sonden.
Mehrfachwirkstoffresistenzmutationen tragen phänotypische Resistenz gegen 3TC bei
Mutationen im Codon 151 der reversen Transkriptase von HIV-1 wurden in Verbindung gebracht mit der Resistenz gegen verschiedene Didesoxynucleosidanaloga, einschließlich AZT, ddC, ddI und d4T. HIV-1 mit Mutationen, die mit einer MD-Resistenz gegen verschiedene Didesoxynucleosidanaloga verbunden sind, wurden analysiert, um zu bestimmen, ob andere Mutationen als 184V eine Resistenz gegen 3TC beitragen. Die Amp-RT IC₅₀- und IC₉₀-Werte für 3TC von Viren, die eine (Q151M; HIV-1SUM8), drei (F77L/F116Y/Q151M; HIV-1SUM12) und alle fünf Mutationen, die mit einer MD-Resistenz verbunden sind (A62V/V751/F77L/F116Y/Q151M; HIV-1SUM13), aufwiesen, wurden bestimmt. Zur Kontrolle wurden auch reverse Transkriptasen von Wildtyp HIV-1 getestet.
Die reverse Transkriptase von HIV-1, die die Q151M-Mutation trug, hatte eine leicht verminderte Empfindlichkeit gegenüber 3TC, wobei die IC₅₀- und IC₉₀-Werte ungefähr zweifach höher waren als die für reverse Transkriptase-Referenzviren. Die Gegenwart von zusätzlichen Mehrfachwirkstoff-(MD)-Resistenzmutationen führte jedoch zu einem höheren Ausmaß der Resistenz gegen 3TC mit einem Anstieg der IC₅₀-Werte um das 6- bzw. 8-fache für Viren mit drei oder allen fünf MD-Resistenzmutationen verglichen mit Wildtypvirus, der ähnliche IC₅₀- und IC₉₀-Werte für 3TC-TP hatte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Mehrfachwirkstoff-Resistenzmutationen bei HIV-1-reverser Transkriptase die phänotypische Resistenz gegen 3TC beitragen.
Analyse der phänotypischen Resistenz gegen 3TC in Plasma HIV-1-RT und Korrelation mit Mutationen am Codon 184
Die Leistung des auf Amp-RT basierenden phänotypischen Tests mit Plasmaproben wurde ausgewertet, indem 30 Proben getestet wurden, die von 15 mit HIV-1 infizierten Patienten vor und während der Behandlung mit 3TC gesammelt wurden. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 unten gezeigt. Alle Vorbehandlungsproben (n = 12) hatten Wildtyp-Phänotypen mit Hemmungswerten für reverse Transkriptase von mehr als 95%. Die beobachtete Hemmung in diesen Proben lag in einem Bereich von 95,9 bis 100% (Durchschnittswert = 98,7% + 1,8%; Median = 99,8%). Von diesen Proben hatten elf Wildtyp-Genotypen am Codon 184 und eine hatte eine Mischung von Wildtyp und M184I (Probe 7A).
Mutationen am Codon 69, die mit einer Resistenz gegen ddC verbunden sind, wurden in Proben von zwei Einzelpersonen beobachtet, die eine geringere Empfindlichkeit gegenüber 3TC-TP hatten (Proben 13A und 15A; Hemmungswerte für reverse Transkriptase von 95,9% bzw. 95,5%). Es wurde kürzlich gezeigt, dass die T69D-Mutation eine geringe Kreuzresistenz gegen 3TC (12-fach) beiträgt und daher für die verringerte Empfindlichkeit gegen 3TC, die bei diesen Proben mit dem Amp-RT-Test beobachtet wurde, verantwortlich sein kann.
Im Gegensatz dazu wurden Werte für die Hemmung der reversen Transkriptase von weniger als 95% nur in Proben gefunden, die von Patienten nach 1 bis 60 Wochen einer antiretroviralen Therapie mit 3TC (n = 18) erhalten wurden. Von diesen Proben hatten 12 die M184V-Mutation, vier hatten Mischungen von Wildtyp und M184V-Genotypen und zwei (Proben 10A und 14A) hatten nur Wildtypgenotypen. Die mittlere Hemmung in den Proben mit Evidenz für 184V war nur 30,8% (Median = 24,9%), was den hohen Grad der Resistenz gegen 3TC widerspiegelt. Die mittlere Hemmung in Proben mit Mischungen von Wildtyp und resistenten Genotypen war 49,3% (Median = 52,4%), was auf ein niedrigeres Ausmaß an Resistenz hindeutet, was erwartet wurde, da diese Proben höhere Anteile an reverser Transkriptase vom Wildtyp haben. Das geringere Ausmaß der Resistenz gegen 3TC, das in Posttherapieproben beobachtet wurde, zeigte sich in Proben, die nach einer und vier Wochen Therapie gesammelt wurden (Proben 14A und 10A; Hemmungswert für die reverse Transkriptase 94,7 bzw. 87,8%). Beide Proben hatten am Codon 184 den Wildtypgenotyp. Die Probe 14A hatte jedoch eine T69D-Mutation, was die Grenzempfindlichkeit gegen 3TC erklären kann. Die Abwesenheit einer nachweisbaren 184V-Mutation in Probe 10A kann einen früheren Nachweis der phänotypischen Resistenz bedeuten oder kann auf der Unfähigkeit der Sequenzierung und des LiPA-Tests liegen, den geringen Anteil an 3TC-resistenten Viren nachzuweisen. Beide Patienten hatten ein hohes Ausmaß an 3TC-Resistenz in Proben, die nach 12 und 44 Wochen der 3TC-Behandlung erhalten wurden (Tabelle 1). 5 erläutert beispielhafte Ergebnisse für das Plasma von 3 Patienten und zeigt die Gegenwart von phänotypischen Unterschieden zwischen Proben, die vor und während der antiretroviralen Therapie mit 3TC gesammelt wurden.
Schlussfolgerung
Die Wirksamkeit einer antiretroviralen Therapie mit Reverse-Transkriptase-Inhibitoren, wie 3TC, ist stark beschränkt durch das Auftreten von wirkstoffresistenten HIV-1-Varianten. Der in diesem Beispiel verwendete Test ist ein schneller nicht auf Kultur basierender Test zur Analyse der phänotypischen Resistenz von Plasma-HIV-1-reverser Transkriptase gegen 3TC. Der Test verwendete ein kleines Volumen von Plasma und der HIV-1-reverse Transkriptasephänotyp für 3TC wurde bestimmt basierend auf dem Ausmaß der Hemmung der reversen Transkriptase durch eine einzige 3TC-TP-Konzentration. Verglichen mit auf Kultur basierenden phänotypischen Standardtests hat dieser Ansatz verschiedene Vorteile. Erstens wurden die Testergebnisse innerhalb von einem oder zwei Tagen erhalten, was eine schnelle Information über die Resistenz gegen 3TC liefert, die von klinischer Relevanz ist für Entscheidungen über die Behandlung und das Management des Patienten. Zweitens erfolgt der Test direkt an reverser Transkriptase aus Plasma und daher wählt der Test nicht, wie bei auf Kultur basierenden Methoden spezielle Virenisolate aus. Drittens hat der Test eine niedrige Nachweisgrenze für 3TC-resistente reverse Transkriptase und kann für den frühen Nachweis der 3TC-Resistenz nützlich sein.
Die in diesem Beispiel erzeugten Daten zeigen, dass der Test erfolgreich verwendet werden kann, um eine Resistenz gegen 3TC, die durch Mutationen am Codon 184 vermittelt wird, zu überwachen. Eine geringere Hemmung der reversen Transkriptase durch 3TC-TP trat in Proben auf, die von Personen nach Behandlung mit 3TC erhalten wurden und stimmte überein mit dem Auftreten von resistenten Genotypen. Zusätzlich dazu, dass phänotypische Information zur Resistenz gegen 3TC geliefert wird, kann die Amp-RT-Reaktion, die ohne 3TC-TP erfolgte, Informationen basierend auf der reversen Transkriptase über Virus im Plasma liefern und kann daher gleichzeitig verwendet werden, um die virologische Antwort auf die Behandlung mit 3TC zu überwachen.
Der Test wurde entwickelt für eine schnelle Auswertung der Resistenz gegen 3TC und schloss das Testen mit einer optimalen Konzentration von 3TC-TP ein. Unter Verwendung dieses Testformats wurde eine interessante Verknüpfung gefunden zwischen Mutationen am Codon 69 und der Borderlineempfindlichkeit gegen 3TC-TP, was darauf hindeutet, dass diese Mutation ein gewisses Ausmaß an Resistenz gegen 3TC beitragen kann. Um die Rolle der beobachteten Borderlineempfindlichkeit in Proben mit Mutationen am Codon 69 oder anderen aufzuklären, kann das Testformat so modifiziert werden, dass es Tests mit verschiedenen Konzentrationen von 3TC-TP beinhaltet, um das Ausmaß der Resistenz gegen 3TC besser quantitativ auszuwerten. Zusätzlich zu der klinischen Überwachung der 3TC-Resistenz kann der Test auch als schnelle Methode zur Überwachung der Übertragung von 3TC-Resistenz verwendet werden zwischen Personen mit neu diagnostizierten HIV-1-Infektionen und zum Nachweis der Resistenz gegen 3TC in 3TC-naiven mit HIV-1 infizierten Patienten.
Tabelle 1
Vorherige Behandlungen waren: Patient 9 bekam AZT vor der ersten Probe; Patient 13 bekam AZT/ddC vor der ersten Probe und Patient 14 bekam ddI über einen Zeitraum zwischen der ersten und zweiten Probe.
Tabelle 2 Amp-RT-Nachweis der phänotypischen Resistenz korreliert mit Mutationen an Codon 184
Beispiel 2
Bestimmung der phänotypischen Resistenz gegen Nevirapine
Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung eines nicht auf einer Kultur basierenden Tests für die schnelle Analyse der phänotypischen Resistenz gegen Nevirapine in HIV-1 aus Plasma. Der Test basiert auf der direkten Analyse der Empfindlichkeit von Plasma-HIV-1-RT auf eine Hemmung durch Nevirapine. Der in diesem Beispiel verwendete Test war der auf PCR basierende Amp-RT, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Materialien und Methoden
Die Empfindlichkeit von Plasma-RT gegen Nevirapine wurde bestimmt basierend auf dem Ausmaß der Hemmung, die durch den Wirkstoff erzeugt wurde und wur de gemessen durch laufende quantitative Amp-RT-Reaktionen in Gegenwart und Abwesenheit von Nevirapine.
Für den Kulturüberstand wurden 10 μl direkt in dem Amp-RT-Assay verwendet. Für den Plasmatest wurde ein Volumen von 100 μl durch Zentrifugation bei 10.000 g 5 Minuten lang geklärt und dann mit einem festen Winkel bei 99.000 g 1 Stunde bei 4°C ultrazentrifugiert.
Das Virenpellet wurde in 100 μl RT-Puffer (50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl₂) resuspendiert. Aliquots mit 10 μl Viruspellets wurden auf einen RT-Puffer, der 10 ng EMCV-RNA-Matrize, 10 Einheiten RNasin, 0,6% NP-40, 100 ng des mit 5'-Biotin markierten EMCR2-Antisense-Primers, 1 mM EGTA, 2 mM Dithiothreitol, 50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl₂ und jeweils 400 μM dNTP enthielt, aufgetragen. Die Reaktionen wurden bei 37°C 2 Stunden lang inkubiert und dann 5 Minuten lang auf 95°C erhitzt, um die RT-Aktivität zu zerstören. Die PCR-Amplifikation der RT-Produkte wurde durchgeführt, wie vorher in Beispiel 1 beschrieben. Die Bedingungen für die PCR waren 35 Zyklen bei 95°C für eine Minute, 55°C für eine Minute und 72°C für eine Minute.
Zur quantitativen Auswertung der RT-Pegel wurde eine Standardkurve erzeugt unter Verwendung bekannter RT-Einheiten aus einem Referenz-HIV-1-Vorrat (Virology Quality Assurance Laboratory, Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center, Chicago, IL). Es wurde gezeigt, dass dieser Virenvorrat, der als VQA bezeichnet wurde, 0,96 × 10^–10 Einheiten RT-Aktivität/Virion aufwies. Der quantitative Nachweis der Amp-RT-Produkte erfolgte unter Verwendung eines auf ELISA basierenden nicht radioaktiven oligosondierenden Systems mit einer internen EMCV-spezifischen Sonde, wie von Garcia Lerma, J. Infect. Dis. 1998; 177:1221–1229 beschrieben. Alle Proben wurden im linearen Bereich des Amp-RT-Assays getestet (von 10^–6 bis 10^–10 Einheiten RT-Aktivität). Proben, die einen Anteil an RT-Aktivität über dem linearen Bereich des Tests hatten, wurden weiter in RT-Puffer verdünnt und wieder getestet. Die unterste Nachweisgrenze der HIV-1-RT-Aktivität mit Amp-RT in Plasma ist 10^–10 Einheiten, das Äquivalent von einem HIV-1-Teilchen des zur quantitativen Auswertung verwendeten Referenzvirus. Die Ergebnisse der Amp-RT-Signale wurden ausgedrückt als Einheiten RT- Aktivität pro ml Plasma und spiegeln den Durchschnitt von doppelt erhaltenen Ergebnissen wider.
Nachweis der phänotypischen Resistenz gegen Nevirapine durch Amp-RT-Assay
Um die Empfindlichkeit von Plasma-HIV-1-RT für Nevirapine zu bestimmen, wurden Amp-RT-Reaktionen in Gegenwart und Abwesenheit von Nevirapine durchgeführt. Der Prozentanteil der Hemmung wurde berechnet, indem das Verhältnis des RT-Pegels, der sich in Gegenwart von Nevirapine zeigte, zu dem, der sich bei Amp-RT-Reaktionen zeigte, die ohne Nevirapine durchgeführt wurden (× 100) verwendet wurde. Nevirapine-Konzentrationen, die zu 50% und 90% Hemmung (IC₅₀ und IC₉₀) der RT-Aktivität führten, wurden gemessen, indem RTs in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Nevirapine getestet wurden und durch nicht lineare Regression bestimmt wurden, wie von Shafer et al., J. Infect. Dis. 1995; 172:70–78 beschrieben.
Nachweis von Mutationen am Codon 181 des HIV-1-RT-Gens in Plasmaproben
Der Anteil an Y181C-Mutation in Plasma-HIV-1-RT wurde vorher bestimmt durch differenzielle Hybridisierung, wie von Havlir et al., J. Virol. 1996; 70:7894–7899 beschrieben. Kurz gesagt wurde virale RNA durch RT-PCR unter Verwendung der Primer 5RT und 3RT amplifiziert. Das entstehende PCR-Produkt wurde in mit Streptavidin beschichtete Näpfe gegeben und 30 Minuten lang bei 50°C inkubiert. Nach dem Waschen wurde eine Hybridisierungslösung, die eine spezifische Sonde für die Y181C-Mutation (MUT-Sonde) enthielt, zugefügt und 1 Stunde bei 45°C inkubiert. Um die Menge des PCR-Produktes, die an jeden Napf gebunden war, zu normalisieren, wurde auch eine zusätzliche Sonde für einen hoch konservierten Bereich von HIV-1-RT (generische Probe; GNR) verwendet. Die Hybridisierung wurde durch Chemilumineszenz gemessen und die Ergebnisse sind ausgedrückt als Verhältnis MUT/GNR. Die Grenze für das In-Betrachtziehen der nachweisbaren Y181C-Mutation wurde von Havlir et al. 1996 definiert als ein Verhältnis MUT/GNR von 0,03.
Quantitative Auswertung der HIV-1-RNA-Pegel in Plasma
HIV-1-RNA-Pegel in Plasmaproben wurden bestimmt mit einer auf RT-PCR basierenden Methode (Roche Amplicor HIV Monitor Test), wie vom Hersteller an gegeben. Die angegebene Nachweisgrenze des Tests ist 200 RNA-Kopien/ml Plasma.
Population für die Untersuchung
Insgesamt 30 Plasmaproben, die von vier mit HIV-1 infizierten Patienten erhalten wurden (Patienten N12, N06, N07 und E01) wurden analysiert, wie von Havlir et al., 1996, beschrieben. Die vier Patienten wurden für einen klinischen Doppelblindversuch von Nevirapine gegen Placebo an der Universität von Kalifornien, San Diego, eingeschrieben. Die tägliche Dosis von Nevirapine war 200 mg für die ersten 14 Tage und dann 400 mg. Eine detailliertere Beschreibung der Untersuchungspopulation wurde bereits von Havlir et al., 1996, berichtet.
Referenzviren
Für die Entwicklung und Validierung des Tests wurden die HIV-1-Isolate V818-5, S469-2/M3, X165-11, W786-6, X82-5, X403-4, X165-6 und X267-1 verwendet. Die Empfindlichkeit dieser Isolate für Nevirapine wurde vorher durch einen Plaque-Reduktionsassay bestimmt, wie von Havlir et al., 1996, beschrieben. Die Sequenzanalyse des RT-Gens erfolgte mit Standardmethoden, wie von Mulder et al., J. Clin. Microbiol. 1994; 32:292–300 beschrieben. Andere Referenzviren, die verwendet wurden, schlossen N119, L6KL5, M184V/Y181C_EU, M184V_pitt, HIV-1_RTMC/MT-2 und HIV-1_RTMDR1/MT-2 ein, die Nevirapine-resistente Y181C (N119), K103N (L6KL5), Nevirapine/3TC-resistente (181C/184V), 3TC-resistente (184V), AZT-resistente (67N/70R/215F/219Q) und Nevirapine/AZT/ddI-resistente (74V/41L/106A/215Y) HIV-1 repräsentieren, wie von Richman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991; 88:11241–11245; Larder und Kemp, Science 1989; 246:1155–1158; Larder et al., Nature 1993; 365:451–453; Schinazi et al., Antimicrob. Agents Chemother. 1993; 37:875–881 beschrieben.
Ergebnisse
Korrelation zwischen den Ergebnissen für Wirkstoffempfindlichkeit abgeleitet aus Amp-RT-Analyse und auf Kultur basierenden Tests
Die Amp-RT-IC₅₀-Werte für Nevirapine in 8 HIV-1-Referenzisolaten wurden verglichen mit den IC₅₀-Werten, die mit einem Plaque-Reduktionstest erhalten wurden. Tabelle 3 unten erläutert den Anteil der RT-Hemmung, der sich bei Amp-RT mit 5 × 10^–8 Einheiten zugegebener RT-Aktivität zu jedem Isolat zeigte (äquivalent 500 HIV-1-Teilchen des VQA-Referenzvirus). Die zwei WT-Isolate (Isolate X267-1 und X165-6) hatten in beiden Tests gleiche IC₅₀-Werte, während Isolate, die Mutationen trugen, die mit einer Nevirapine-Resistenz verbunden sind (K103N-, Y181C-, G190A- oder Y188L-Mutationen) ein höheres Ausmaß an phänotypischer Resistenz zeigten (> 100-facher Anstieg des IC₅₀-Werts verglichen mit den WT-Isolaten). Eine starke Korrelation (r² = 0,95, p < 0,001) zwischen den IC₅₀-Werten, die durch Amp-RT bestimmt wurden und denen, die in Kultur bestimmt wurden, wurde beobachtet, was darauf hindeutet, dass auf RT basierende Wirkstoffempfindlichkeitstests verwendet können, um den HIV-1-Phänotyp für Nevirapine zu bestimmen.
Tabelle 3 Spezifität von Amp-RT-Test im Vergleich zu Kultur
Nachweis der Nevirapine-Resistenz in einem einzelnen Amp-RT-Ansatz, der 50 μM Nevirapine enthält
Die Analyse der RT-Hemmungswerte mit Nevirapine in Wildtyp- und Nevirapineresistenten Referenzisolaten zeigte, dass eine Konzentration von 50 μM Nevirapine nur die RT aus den zwei Wildtypisolaten hemmte (Isolate X267-1 und X165-6), während eine geringe oder keine Hemmung der RT-Aktivität gezeigt wurde bei den resistenten Isolaten, wie in 6 gezeigt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein einziger Amp-RT-Ansatz, der 50 μM Nevirapine enthält, für ein schnelles Screening der Nevirapine-Resistenz in Plasma verwendet werden könnte.
Eine Konzentration von 50 μM Nevirapine wurde analysiert, um zu bestimmen, ob die Konzentration zwischen Wildtyp und Nevirapine-resistentem HIV-1-RT unterscheiden könnte, die bei verschiedenen Anteilen von zugefügter RT-Aktivität getestet wurden. Wie in Tabelle 4 unten gezeigt, führte 50 μM Nevirapine zu einer vollständigen Hemmung von ungefähr 7 × 10^–8 und 7 × 10^–9 Einheiten RT-Aktivität aus einem Nevirapine-empfindlichen HIV-1-Isolat (Isolat X267-1), was äquivalent war ungefähr 700 bzw. 70 HIV-1-Teilchen des VQA-Referenzvirus. Bei einem höheren Eintrag an RT-Aktivität (7 × 10^–7 Einheiten) führten diese Bedingungen zu einer RT-Hemmung von 98,6%. Im Gegensatz dazu wurde keine signifikante Hemmung bei Nevirapine-resistentem HIV-1-RT aus den Isolaten X403-4 und W786-6 gezeigt, die entweder bei hohem oder geringem Eintrag von RT getestet wurden. Wenn z.B. 8,3 × 10^–9 Einheiten RT-Aktivität aus dem Isolat W786-6 getestet wurden (äquivalent 80 Teilchen des VQA-Referenzvirus) wurde keine signifikante Hemmung durch 50 μM Nevirapine beobachtet, wie in Tabelle 4 gezeigt. Diese Ergebnisse deuten auf die Fähigkeit dieses Tests, zwischen Wildtyp und Nevirapine-resistenten RTs zu unterscheiden innerhalb eines 3-log₁₀-Bereichs von zugefügter RT.
Tabelle 4 Wirkung der Zufuhr an RT-Aktivität auf die RT-Hemmung durch 50 μM Nevirapine in dem Amp-RT-Test
Die Spezifität des Amp-RT-Tests wurde analysiert, um zu bestimmen, ob Amp-RT-Tests in Gegenwart von 50 μM Nevirapine nur die Resistenz bei RTs nachwiesen, die Mutationen trugen, die mit der Resistenz gegen Nevirapine verbunden sind und nicht bei RTs, die andere nicht damit in Beziehung stehende Resistenzmutationen tragen. Tabelle 5 unten zeigt, dass RTs, die Y181C- und K103N-Mutationen tragen (N119 bzw. L6KL5), hoch resistent gegen Nevirapine waren (Hemmungswerte von 0% bzw. 7%). Im Gegensatz dazu wurde gefunden, dass Viren, die Mutationen enthielten, die mit AZT- oder 3TC-Resistenz verbunden sind, alle empfindlich für Nevirapine waren. Die RT-Aktivität eines Virus, der die V106A-Mutation trägt (HIV-1_RTMDR1/MT-2) wurde teilweise durch 50 μM Nevirapine gehemmt, was ein geringeres Ausmaß an Resistenz gegen Nevirapine zeigt verglichen zu einer RT mit der Y181C-Mutation. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden Amp-RT-Bedingungen, die 50 μM Nevirapine enthielten, verwendet als primärer Screening-Test auf Nevirapine-Resistenz in allen nachfolgenden Tests von Plasmaproben, wenn nicht anders angegeben.
Tabelle 5 Hemmung der Amp-RT-Aktivität von AZT-, 3TC-, ddI- und Nevirapine-resistenten HIV-1-Referenzviren durch 50 μM Nevirapine
Nachweisgrenze für resistente Viren in Mischungen von Wildtyp und Nevirapine-resistenten Viren
Um die Nachweisgrenze des Tests zu bestimmten, wurden ein empfindliches bzw. sensitives (X267-1) HIV-1-Klinikisolat und ein Nevirapine-resistentes (W786-6) HIV-1-Klinikisolat in unterschiedlichen Anteilen gemischt und auf das Vorliegen von Resistenz getestet. Beide Isolate wurden auf gleiche Anteile an RT-Aktivität eingestellt, bevor die Virusmischungen hergestellt wurden. Wie in 7 gezeigt, wurden Werte für die RT-Hemmung von > 99% nur beobachtet, wenn das sensitive Isolat getestet wurde. Im Gegensatz dazu hatten Mischungen, die 10% resistente Viren und 90% sensitive Viren enthielten, Werte für die RT-Hemmung von 94%, was darauf hindeutet, dass nur sensitive RTs durch Nevirapine gehemmt wurden und auf eine Testnachweisgrenze für resistente Viren von ungefähr 10% hindeutet. Das beobachtete Ausmaß der RT-Hemmung in den Virenmischungen nahm ab, wenn das Verhältnis von resistenten zu sensitiven Viren zunahm. Mischungen, die z.B. 25% oder 75% resistente Viren enthielten, hatten einen Anteil an RT-Hemmung von 80% bzw. 29%.
Analyse der phänotypischen Resistenz gegen Nevirapine in Plasma und Korrelation mit Mutationen am Codon 181
Um den Test zum Nachweis der phänotypischen Resistenz gegen Nevirapine in HIV-1 aus Plasma zu validieren, wurden 30 Plasmaproben, die von vier Patienten vor und während der Nevirapine-Monotherapie gesammelt worden waren (Patienten N12, N06, N07 und E01), getestet. Die mit Amp-RT bestimmte phänotypische Resistenz wurde verglichen mit dem relativen Anteil an Mutationen am Codon 181 in HIV-1 aus Plasma (MUT/GNR-Verhältnis).
8 erläutert die Kinetik des Nachweises sowohl der Y181C-Mutation als auch des Vorliegens einer phänotypischen Resistenz gegen Nevirapine in dem Amp-RT-Test, was durch ein verringertes Ausmaß der Hemmung der RT bei drei Patienten gezeigt wird. Patient E01 hatte nur zwei Plasmaproben, die vor und nach 28 Tagen Behandlung entnommen wurden und ist in der Figur nicht enthalten. Die Ergebnisse zeigen eine klare Korrelation zwischen der Abnahme des Ausmaßes der RT-Hemmung und dem Auftreten von Viren, die die Y181C-Mutation tragen. Alle vor der Therapie gesammelten Proben (n = 7) oder während der ersten 6 Tage der Behandlung gesammelten Proben (n = 14) erwiesen sich als empfindlich für Nevirapine mit mittleren RT-Hemmungswerten von 99,3% (Bereich = 100% bis 99,5%) bzw. 98,2% (Bereich = 100% bis 90,4%). Das MUT/GNR-Verhältnis in diesen Proben lag in einem Bereich von 0,01 bis 0,03 (Mittelwert = 0,02) vor der Therapie und 0,008 bis 0,02 (Mittelwert = 0,02) während der ersten 6 Tage der Behandlung, was auf die Abwesenheit nachweisbarer Y181C-Mutationen in diesen Proben hindeutet. Der erste Hinweis auf eine phänotypische Resistenz gegen Nevirapine wurden in zwei Proben gefunden, die an den Tagen 7 und 14 der Behandlung gesammelt wurden (Patienten N07 und N12; RT-Hemmungswerte von 24% bzw. 32%). Die beobachtete phänotypische Resistenz gegen Nevirapine korrelierte mit dem Nachweis der Y181C-Mutation (MUT/GNR-Verhältnis 0,12 bzw. 1,34). Bei zwei anderen Proben, die nach 7 Tagen Behandlung gesammelt wurden, hatte eine (Patient N12) eine Borderline-Empfindlichkeit gegen Nevirapine (RT-Hemmung 94%) und einen Grad der Y181C-Mutation (MUT/GNR-Verhältnis 0,05) an der Nachweisgrenze des geno typischen Tests (definiert als MUT/GNR-Verhältnis von 0,03). Bei der anderen Probe (Patient N06) gab es einen Hinweis auf eine nachweisbare Y181C-Mutation (MUT/GNR-Verhältnis von 0,4) und eine WT-Empfindlichkeit für Nevirapine (RT-Hemmungswert 100%). Die auseinander fallenden Ergebnisse, die bei dieser speziellen Probe von Patient N06 beobachtet wurden, sind unerwartet, weil andere Proben mit MUT/GNR-Verhältnissen von 0,4 und 0,12 eine nachweisbare phänotypische Resistenz im Amp-RT-Test hatten. Ein phänotypisches Testen mit anderen Methoden kann notwendig sein, um eine Nevirapine-Empfindlichkeit bei dieser speziellen Probe zu klären.
Alle nach mehr als 2 Wochen der Behandlung erhaltenen Proben hatten ein hohes Ausmaß an phänotypischer Resistenz gegen Nevirapine mit einem mittleren RT-Hemmungswert von 13,82% (Bereich = 0 bis 43,1 %) und einem mittleren MUT/GNR-Verhältnis von 1,45 (Bereich = 0,4 bis 2,16). Diese Ergebnisse deuten auf eine klare Korrelation zwischen dem Nachweis der phänotypischen Resistenz gegen Nevirapine mit dem Amp-RT-Test und dem Vorliegen einer Y181C-Mutation und deuten darauf hin, dass der Test als schnelles Mittel für die klinische Überwachung der phänotypischen Resistenz gegen Nevirapine in HIV-1 aus Plasma verwendet werden kann.
Amg-RT-IC₅₀-Werte für Nevirapine in Plasma-HIV-1
Um das Ausmaß der Nevirapine-Resistenz quantitativ auszuwerten, wurden Amp-RT-IC₅₀-Werte in Langzeitproben von Patient N12 durch Testen der Plasma-RT in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Nevirapine bestimmt. Die an den Tagen 6 und 7 der Therapie beobachteten Amp-RT-IC₅₀-Werte (ungefähr 15 μM) entsprachen denen, die in WT-Isolaten beobachtet wurden, was auf die WT-Empfindlichkeit für Nevirapine hindeutet. Im Gegensatz dazu wurde keine Hemmung beobachtet in zwei Proben, die an den Tagen 21 und 28 der Behandlung bei allen Konzentrationen von Nevirapine, die verwendet wurden, gesammelt wurden, was zu einem Amp-RT-IC₅₀ > 100 μM führt. Der beobachtete Anstieg der Amp-RT-IC₅₀-Werte korrelierte mit dem genotypischen Nachweis der Y181C-Mutation (MUT/GNR-Verhältnis von 0,018 bzw. 0,05 an den Tagen 6 und 7 verglichen mit 1,81 bzw. 2,16 an den Tagen 21 bzw. 28). Diese Ergebnisse validierten weiterhin die Verwendung von 50 μM Nevirapine in Amp-RT-Ansätzen zum schnellen Screening der phänotypischen Resistenz gegen diesen Wirkstoff.
Quantitative Auswertung der Plasma-RT-Aktivität mit Amp-RT-Test und Korrelation mit HIV-1-RNA-Gehalten
Die Kinetik der auf RT basierenden Virenlast wurde analysiert und verglichen mit der RNA-Virenlast, die mit RT-PCR bestimmt wurde. 9 zeigt die Anteile sowohl an RNA als auch RT in Plasmaproben von drei Patienten, bei denen mehr als zwei Bestimmungen der Virenlast durchgeführt wurden (Patienten N12, N06 und N07). Auf RT basierende Virenbelastungen wurden aus Amp-RT-Ansätzen abgeleitet, die ohne Nevirapine erfolgten. Die Ergebnisse zeigten, dass die Plasmavirenlast, die mit RT oder RNA gemessen wurde, für jeden der drei Patienten gleich war, was darauf hindeutet, dass der Amp-RT-Test auch verwendet werden könnte, um Veränderungen der Virenlast nach antiretroviraler Therapie zu überwachen.
Schlussfolgerungen
Der Amp-RT-Test hat verschiedene Vorteile im Vergleich zu üblichen auf Kultur basierenden Tests. Erstens liefert der Test schnelle Informationen über die Resistenz, da die Ergebnisse in 1 bis 2 Tagen erhalten werden, was Ärzten bei Entscheidungen über die Behandlung helfen kann. Zweitens misst der Test direkt die phänotypische Resistenz in HIV-1 aus Plasmaproben und erzeugt daher keinen Selektionsdruck, der mit der Virenisolation in Kultur verbunden ist.
Das phänotypische Testen misst üblicherweise die Nevirapine-Empfindlichkeit durch Analyse der Hemmung bei verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen und durch Bestimmung der IC₅₀-Werte. Die Amp-RT-Teststrategie vertraut auf die Verwendung einer einzelnen Wirkstoffkonzentration (50 μM) für ein schnelles Screenen der Nevirapine-Resistenz im Plasma. Verschiedene Beobachtungen validieren diesen Testansatz. Erstens wurde eine vollständige Hemmung von Wildtyp-HIV-1-RTs erreicht in Amp-RT-Ansätzen, die 50 μM Nevirapine enthielten. Zweitens wurde eine mangelnde Hemmung nur in RTs beobachtet, die Nevirapine-Resistenzmutationen trugen, einschließlich Y181C, V106A, K103N, Y190A, G190A und Y188L. Drittens waren die Ergebnisse innerhalb eines weiten Bereichs an RT-Pegeln reproduzierbar. Viertens korrelierten die Ergebnisse für die RT-Empfindlichkeit mit dem Anteil der genotypischen Marker der Resistenz (Y181C-Mutation) in Plasmaproben. Alle diese Erkenntnisse zeigen, dass die Analyse der RT-Hemmung unter Verwendung von 50 μM Nevirapine in dem Amp-RT-Test verwendet werden kann, um schnell auf Nevirapine-Resistenz zu screenen. Dieser Testansatz liefert jedoch keine IC₅₀-Werte für Nevirapine. Zusätzliche Amp-RT-Tests mit verschiedenen Konzentrationen von Nevirapine sind erforderlich, um das Ausmaß der Resistenz quantitativ auszuwerten, wie in 4 Proben von Patient N12 gezeigt.
Zusätzlich zu der phänotypischen Resistenz gegen Nevirapine liefert der Test Informationen über den Anteil an funktioneller RT im Plasma. Die beobachtete Korrelation zwischen dem Anteil an funktioneller RT-Aktivität im Plasma und HIV-1-RNA-Virenlast zeigt, dass der Amp-RT-Test geeignet ist, um die Virenlast nach antiretroviraler Behandlung zu überwachen.
Nicht-Nucleosid-HIV-1-RT-Inhibitoren beinhalten eine Reihe strukturell unterschiedlicher Verbindungen, die den gleichen Wirkungsmechanismus teilen und an die gleiche Stelle des Enzyms binden. Einige der mit der Nevirapine-Resistenz verbundenen Mutationen tragen eine Kreuzresistenz innerhalb dieser Klasse von Verbindungen bei. Z.B. sind rekombinante Viren, die die Y181C-Mutation tragen, hoch resistent gegen Delavirdine und Loviride zusätzlich zu Nevirapine und die K103N-Mutation trägt eine Kreuzresistenz gegen Efavirenz, Delavirdine und Loviride bei. Die vorhergehenden Ergebnisse, die darauf hindeuten, dass der Test eine Resistenz, die durch diese Mutationen vermittelt wird, nachweist, zeigen, dass dieser Ansatz für den Nachweis der Resistenz gegen andere Nicht-Nucleosid-RT-Inhibitoren angepasst werden könnte, wie Efavirenz, das zur Behandlung von mit HIV-1 infizierten Personen vorgeschlagen wird.
Modifikationen und Variationen des vorliegenden Tests und des Kits ergeben sich im Schutzbereich der beigefügten Ansprüche für den Fachmann auf diesem Gebiet aus der vorhergehenden detaillierten Beschreibung.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Nachweis einer Wirkstoffresistenz eines Retrovirus, das beinhaltet: dass der Retrovirus mit einem Reverse Transcriptase inhibierenden antiviralen Wirkstoff, einer RNA-Matrize und einem ersten komplementären DNA-Primer inkubiert wird, wobei die RNA-Matrize und der erste komplementäre DNA-Primer Oligonukleotide aus einem Bereich des Encephalomyocarditisvirusgenoms sind, der im wesentlichen keine sekundäre Struktur aufweist und einen G-C-Gehalt von weniger als 50% hat, und ein DNA-Produkt nachweist, wobei der Nachweis des DNA-Produkts auf eine Resistenz für den Wirkstoff hinweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die RNA-Matrize ein Oligonukleotid mit der in SEQ ID NO: 4 angegebenen Sequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der erste komplementäre DNA-Primer ein Oligonukleotid mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Sequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Reverse-Transcriptase-Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lamivudine, Zalcitabine, Didanosine, Stavudine, Zidovudine und Nevirapine.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das DNA-Produkt durch Hybridisierung mit einer nachweisbaren Hybridisierungssonde nachgewiesen wird, wobei die Hybridisierungssonde ein Oligonukleotid mit der in SEQ ID NO: 3 angegebenen Sequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 1, das weiter beinhaltet, dass der Retrovirus, die RNA-Matrize und der erste komplementäre DNA-Primer mit einem zweiten komplementären DNA-Primer aus dem Encephalomyocarditis virusgenom inkubiert werden, wobei der zweite komplementäre DNA-Primer das DNA-Produkt amplifiziert.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der zweite komplementäre DNA-Primer ein Oligonukleotid mit der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Sequenz ist.
Kit zum Nachweis einer antiviralen Wirkstoffresistenz eines Retrovirus aufweisend: a) eine Region des Encephalomyocarditisvirusgenoms, die im wesentlichen keine Sekundärstruktur aufweist und einen G-C-Gehalt von weniger als 50% hat, als RNA-Matrize; b) einen ersten komplementären DNA-Primer für Reverse Transcriptase, wobei der Primer zu einem Teil der RNA-Matrize komplementär ist; c) einen zweiten komplementären DNA-Primer für die Amplifikation, wobei der Primer zu einem Teil der RNA-Matrize komplementär ist und d) einen Reverse Transcriptase hemmenden antiviralen Wirkstoff, für den die Resistenz bestimmt werden soll.
Kit nach Anspruch 8, wobei die RNA-Matrize ein Oligonukleotid mit der in SEQ ID NO: 4 angegebenen Sequenz ist, der erste komplementäre DNA-Primer ein Oligonukleotid mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Sequenz ist, der zweite komplementäre DNA-Primer ein Oligonukleotid mit der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Sequenz ist und der Reverse-Transcriptase-Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lamivudine, Zalcitabine,. Didanosine, Stavudine, Zidovudine und Nevirapine.
Kit nach Anspruch 8, weiter enthaltend eine Hybridisierungssonde zum Nachweis eines DNA-Produkts, wobei die Hybridisierungssonde ein Oligonukleotid mit der in SEQ ID NO: 3 angegebenen Sequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine vorbestimmte Menge eines reverse Transcriptase hemmenden antiviralen Wirkstoffs zu der Inkubationsprobe zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 11, wobei eine zweite Probe ohne einen reverse Transcriptase hemmenden antiviralen Wirkstoff inkubiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 11, wobei Proben mit ansteigenden Konzentrationen des Wirkstoffs getestet werden, wobei der Grad an Hemmung der reversen Transcriptase durch den Wirkstoff verwendet wird, um die Empfindlichkeit des Retrovirus gegenüber dem Wirkstoff zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei zwei Konzentrationen des Wirkstoffs getestet werden und die zweite Menge Null ist.