DE69918691T2

DE69918691T2 - Glucagonähnliches peptid 1 (glp-1) verbessert die beta zellen antwort auf glukose in patienten mit verminderter glukosetoleranz

Info

Publication number: DE69918691T2
Application number: DE69918691T
Authority: DE
Inventors: Burkhard Goke; Maria Byrne; R. Thomas
Original assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1998-06-12
Filing date: 1999-05-07
Publication date: 2005-07-21
Anticipated expiration: 2019-05-08
Also published as: CN1311687A; CZ20004614A3; DK1083924T3; NO20006336L; PT1083924E; KR20010052800A; IL140223A0; NO20006336D0; UA69412C2; AU2003212050B2; NZ508823A; GEP20033015B; EA200100029A1; EP1419783A2; WO1999064061A1; TR200100079T2; EA004538B1; ID28617A; ATE270897T1; BG105079A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gestörte Glucosetoleranz (impaired glucose tolerance, IGT) kommt in der US-Bevölkerung häufig vor. Die Prävalenz der gestörten Glucosetoleranz steigt von 11% in der allgemeinen Bevölkerung im Alter von 20 bis 74 Jahren auf 24% bei denjenigen im Alter von 40 bis 75 Jahren, deren Familiengeschichte Diabetes aufweist und deren Körpergewicht mehr als 120% des normalen beträgt. Personen mit gestörter Glucosetoleranz haben ein hohes Risiko, kardiovaskuläre Erkrankungen sowie nichtinsulinabhängigen Diabetes mellitus (NIDDM), auch als Typ 2 Diabetes bekannt, zu entwickeln.
Eine gestörte Glucosetoleranz ist durch frühe subtile Defekte der pankreatischen β-Zellfunktion, begleitet von Insulinresistenz, gekennzeichnet. Diese frühen Defekte umfassen eine gestörte Fähigkeit der β-Zellen, geringe Änderungen der Plasmaglucosekonzentrationen zu erkennen und auf diese mit geeigneten Konzentrationen an Insulinsekretion und einer sanften Verschiebung der Glucoseinsulinsekretions-Dosis-Antwort-Kurve nach rechts zu antworten. Die Fähigkeiten der β-Zellen zur Glucoseerkennung und raschen Insulinsekretionsantwort werden im Verlauf von IGT sehr früh verloren, wenn zwei 2-Stunden-Glucosespiegel minimal erhöht sind. Die Schädigung der Glucosekontrolle bei IGT mit der Zeit ist vorherrschend aufgrund der fortschreitenden Störung der β-Zellfunktion. Dies führt in vielen Fällen zu verschlechterten Zuständen von Hyperinsulinämie, Fettleibigkeit und kardiovaskulären Erkrankungen, die manchmal als Syndrom X bekannt sind. In vielen Fällen führt ein fortgeschrittenes IGT-Leiden zu einem definitiven Verlust der Glucosekontrolle und dem schädlichen Beginn von NIDDM.
Wie bereits erwähnt, birgt die Erkrankung an IGT ernsthafte Gesundheitsrisiken. Der IGT-Patient ist häufig fettleibig und weist hohe Plasmainsulinspiegel auf, die häufig toxisch sind. Diese hohen Insulinspiegel rühren im allgemeinen von der kontinuierlich zunehmenden Fähigkeit von Muskel-, anderen Gewebe- und Fettzellen her, Insulin zu verwenden, um die Aufnahme von Glucose aus Blutplasma zu bewirken. Die IGT-Erkrankung führt zu einem erhöhten Risiko für den gesamten Bereich kardiovaskulärer Erkrankungen.
Glucagon-like Peptid 1 (GLP-1), ein natürliches enterisches Peptid, wird von den L-Zellen des Darms sekretiert und agiert als ein Inkretinhormon, das pankreatische β-Zellen dazu stimuliert, Insulin auf glucoseabhängige Weise zu sekretieren. Sein therapeutisches Potenzial in NIDDM ist bereits dadurch gezeigt worden, dass eine exogene Infusion von pharmakologischen Dosen von GLP-1 den Plasmaglucosespiegel im allgemeinen senkt. GLP-1 verbesserte jedoch die β-Zellfunktion bei NIDDM nicht signifikant. Nathan DM, Schreiber E, Fogel H, Mojsov S, Habener JF. Insulinotropic action of glucagon-like peptide-1 (7-37) in diabetic and nondiabetic subjects. Diabetes Care 15: 270–276, 1992; Gutniak M, ∅rskov C, Holst JJ, Ahrén B, Efendric S. Antidiabetogenic effects of glucagon-like peptide-1 (7-36) amide in normal subjects and patients with diabetes mellitus. N Engl J Med 326: 1316–1322, 1992; Nauck MA, Kleine N, Orskov C, Holst JJ, Willms B, Creutzfeldt W. Normalization of fasting hyperglycemia by exogenous glucagon-like peptide-1 (7-36 amide) in type II (non-insulindependent) diabetic patients. Diabetologia 36: 741–744, 1993; Gutniak MK, Linde B, Holst JJ, Efendie S. Subcutaneous injection of the incretin hormone glucagon-like peptide-1 abolishes postprandial glycemia NIDDM. Diabetes Care 17: 1039–1044, 1994; Rachman J, Gribble FM, Barrow BA, Levy JC, Buchanan KD, Turner RC. Normalization of insulin responses to glucose by overnight infusion of glucagon -like peptide 1 (7-36) amide in patients with NIDDM. Diabetes 45: 1524–1530, 1996; Rachman J, Barrow BA, Levy JC, Turner RC. Near-normalization of diurnal glucose concentrations by continuous administration of glucagon-like peptide-1 (GLP-1) in subjects with NIDDM, Diabetologia 40: 205–211, 1997.
IGT ist derzeit nicht behandelbar. Es ist jedoch ein erkennbarer Krankheitszustand, der mit ernsthaften Gesundheitsrisiken verbunden ist. Im Allgemeinen geht mit IGT eine progressive Verschlechterung des Zustands einher, was seine Symptome betrifft und führt häufig zu einem Verlust der Plasmaglucosekontrolle, die einen Typ 2 Diabetes begründet. Es besteht daher ein Bedürfnis nach einer Therapie.
Zahlreiche Untersuchungen in den vergangenen letzten Jahren haben gezeigt, dass die Anwendung von GLP-1 in Fällen von NIDDM den Glucose- und Insulinspiegel im Blut senkt und daher eine vielversprechende Therapie für diese Erkrankung sein sollte. Bislang hat jedoch keine Studie gezeigt, dass GLP-1 ein Potenzial aufweist, um den Verlust der Fähigkeit von β-Zellen zu korrigieren, einen Anstieg der Blutglucose zu erkennen und mit der Sekretion von Insulin rasch zu antworten. Diese Verschlechterung der Fähigkeit, auf das Erkennen einer Zunahme an Blutglucose zu antworten und mit Insulinsekretion aus den β-Zellen eng zu verknüpfen, ist die Hauptursache des IGT-Leidens. In früheren Untersuchungen zeigte die Applikation von GLP-1 bei NIDDM-Probanden die Fähigkeit, Fastenplasmaglucose zu normalisieren und eine kumulative β-Zell-Insulinsekretion zu stimulieren. Eine Infusion von GLP-1 in NIDDM-Probanden über Nacht verbesserte jedoch die Glucoseantworten auf Mahlzeiten am nächsten Tag nicht. Wenn GLP-1 19 Stunden lang, über Nacht und während dreier Standardmahlzeiten in Probanden mit NIDDM infusioniert wurde, wurden die Plasmaglucosespiegel gesenkt, die gestörte postprandiale β-Zellfunktion war jedoch nur geringfügig verbessert.
β-Zellantworten auf eine verlängerte Infusion von GLP-1 sind in Testpersonen mit IGT bislang nicht untersucht worden und da es keine Anzeichen gab, dass das Ergebnis von GLP-1 Infusionen in NIDDMs verschieden sein würde, wurden bislang keine detaillierten Untersuchungen der Auswirkung von GLP-1 auf β-Zellantworten auf geringfügige Zunahmen und Abnahmen der Plasmaglucosekonzentrationen durchgeführt.
Demgemäß besteht ein Bedürfnis nach einem Verfahren, um ein Fortschreiten der IGT aufzuhalten und normale Glucosestoffwechselbedingungen wiederherzustellen.
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Wiederherstellen oder Verbessern der β-Zellfunktion und Empfindlichkeit und somit der Insulinsekretionsmuster als Antwort auf Plasmaglucosespiegel in einem Wirt mit gestörter Glucosetoleranz bereitzustellen. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, um die Verschlechterung der β-Zellfunktion zu verzögern oder zu verhindern, welche für das Fortschreiten einer gestörten Glucosetoleranz bis zum Kontrollverlust über die Plasmaglucose, welche den Beginn von NIDDM charakterisiert, verantwortlich ist.
Noch ein anderes Ziel der Erfindung ist es, Auswirkungen von IGT auf kardiovaskuläre Erkrankungen zu mildern und dadurch Herzgefäß- und Schlaganfallrisiken zu vermindern.
Das Verfahren, mit dem diese und andere Ziele erreicht werden, wird aus der folgenden ausführlichen Beschreibung ersichtlich.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Das Ziel der Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert.
Die Erfinder haben nun gefunden, dass die Applikation von GLP-1 bei Testpersonen mit gestörter Glucosetoleranz die fest abgestimmte Antwort der Insulinsekretion auf einen Anstieg der Plasmaglucosespiegel wiederherstellt, wodurch die Insulinsekretionsantwortsmuster der β-Zelle auf einen Anstieg des Plasmaglucosespiegels wiederhergestellt werden, die für normale Testpersonen ohne IGT charakteristisch sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch die Verwendung von GLP-1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten mit gestörter Glucosetoleranz und Insulinresistenz in einer wirksamen Menge, um die β-Zellempfindlichkeit und Funktion und die Insulinssekretionsmuster in diesem Patienten wiederherzustellen, zu verbessern oder zu normalisieren. Die Erfindung ist auch darauf gerichtet, den Plasmainsulinspiegel in Personen mit IGT zu senken und gleichzeitig den Zustand der Insulinresistenz und das damit einhergehende Leiden der kardiovaskulären Erkrankung zu vermindern.
Bei der Durchführung der hier beschriebenen Beispiele haben die Erfinder überraschenderweise gefunden, dass die Applikation von GLP-1 in Testpersonen mit IGT, im Gegensatz zur zufälligen und unkoordinierten Insulinantwort, die charakteristischerweise bei IGT Testpersonen aufgefunden wird, empfindliche, rasche und koordinierte Insulinsekretionen aus den β-Zellen in Antwort auf diskrete pulsierende Anstiege der Plasmaglucose ähnlich der Insulinsekretionsmuster, die in normalen Patienten gefunden werden, in tiefgreifender Weise wiederherstellt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Glucose-, Insulin- und GLP-1-Antworten auf eine orale Verabreichung von 75 mg Glucose in fünf Testpersonen mit gestörter Glucosetoleranz (IGT•) und fünf Testpersonen mit insulinabhängigem Diabetes mellitus (NIDDM ☐). 1A zeigt eine mittlere Glucoseantwort. 1B zeigt eine Insulinantwort. 1C zeigt eine GLP-1 Antwort.
2 stellt einen Vergleich bereit zwischen mittleren Insulinsekretionsraten (ISR) und mittleren Glucosekonzentrationen in jeder Testperson während Glucoseinfusion mit Kochsalzinfusion (O) oder GLP-1 Infusion (•). 2A zeigt den Vergleich in Testpersonen mit IGT. 2B zeigt den Vergleich in Testpersonen mit NIDDM.
3 stellt Profile der Glucose-, Insulinsekretionsraten (ISR) und Insulinkonzentrationen in zwei Testpersonen mit IGT, Testpersonen D01 und D02, bereit. 3A und 3C zeigen die Antworten auf eine Kochsalzinfusion. 3B und 3D zeigen die Antworten auf eine GLP-1 Infusion.
4 stellt einen Vergleich von Glucosespiegeln, Insulinsekretionsraten (ISR) und Insulinspiegeln in zwei Testpersonen mit NIDDM, Testpersonen D07 und D09, bereit. 4A und 4C zeigen die Profile während Kochsalzinfusion. 4B und 4D zeigen die Profile während GLP-1 Infusion.
5 stellt einen Vergleich der Spektralanalysen der Insulinsekretion in Testpersonen während Kochsalz- und GLP-1-Infusionen bereit. Die auf der linken Seite der Spektralanalyse gezeigten Ergebnisse stammen von Testpersonen mit IGT. Die auf der rechten Seite der Spektralanalyse gezeigten Ergebnisse stammen von Testpersonen mit NIDDM.
6 stellt einen Vergleich von normierter Stärke des Spektrums während Kochsalzinfusion und während GLP-1 Infusion bereit. 6A zeigt einen Vergleich der normierten Stärke des Spektrums während Kochsalzinfusion und GLP-1 Infusion in einer Testperson mit IGT (D02). 6B zeigt einen Vergleich von normierter Stärke des Spektrums während Kochsalzinfusion und GLP-1 Infusion in einer Testperson mit NIDDM (D07).
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder haben gefunden, dass die Verabreichung von GLP-1 in Testpersonen mit gestörter Glucosetoleranz (IGT) die pankreatische β-Zellfunktion und die Fähigkeit von β-Zellen, in Antwort auf geringe Erhöhungen oder Veränderungen der Plasmaglucosekonzentration rasch zu antworten, indem Insulin in koordinierter Weise ausgeschüttet wird, d. h. pulsierende Sekretionen von Insulin, ähnlich den Insulinsekretionsmustern, die in Testpersonen ohne IGT gefunden werden, wiederherstellte oder verbesserte. Dieses Muster der Insulinsekretion wird nicht wiederhergestellt in Testpersonen, die bereits NIDDM entwickelt haben, welches durch den Verlust der Plasmaglucosekontrolle charakterisiert ist.
Die β-Zellfunktion wird durch die normierte Stärke des Spektrums quantifiziert. Die Stärke des Spektrums misst die β-Zellfunktion, die nicht auf einer Anpassung an die Insulinempfindlichkeit beruht. Die Erfinder haben gefunden, dass GLP-1 in Testpersonen mit IGT die Stärke des Spektrums zu einem normalen Bereich hin verbessert. Die Profile der Stärke des Spektrums zeigten, dass das Entrainment oder die enge Koordination von Plasmaglucose und Insulinsekretionsoszillationen bei IGT-Testpersonen nach Verabreichung von GLP-1 auf normale Spiegel wiederhergestellt wurde. Diese Verbesserung des oszillatorischen Musters der Insulinsekretion ist für die Aufrechterhaltung der normalen Glucosehomöostase von Bedeutung. Beispielsweise ist gezeigt worden, dass Insulininfusionen, die die ultradianen Oszillationen innerhalb eines Zeitraums von 120 Minuten nachahmen, bei der Reduktion von Plasmaglucosekonzentrationen wirksamer sind als konstante Insulininfusionen (27).
Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine Verbindung umfasst, die an einen Rezeptor für Glucagon-like Peptid-1 bindet und eine Verbesserung der Fähigkeit von β-Zellen bewirkt, geringfügige Veränderungen in Plasmaglucosekonzentrationen in Testpersonen mit IGT wahrzunehmen und darauf zu antworten. In einer Ausführungsform ist die Rezeptor-bindende Verbindung Glucagon-like Peptid-1. In einer anderen Ausführungsform ist die Rezeptor-bindende Verbindung eine Peptidvariante, bei der sich die Kombination der Substitutionen, Deletionen und Varianten von Glucagon-like Peptid-1 um nicht mehr als zehn Aminosäuren unterscheidet. Die Rezeptor-bindende Verbindung kann darüber hinaus ein Polynukleotid oder ein Agens umfassen, das die Freisetzung von GLP-1 aktiviert, ein Molekül, das den GLP-1 Rezeptor aktiviert oder eine GLP-1 Rezeptor-bindende Verbindung, die ein chemisch konstruiertes Molekül, Peptid-Analoge oder GLP-1-Agonisten umfasst.
Die Erfinder haben gefunden, dass die Verabreichung von humanem GLP-1 das Entrainment der Insulinsekretionsantworten auf geringe Veränderungen oder Zunahmen der Plasmaglucose verbesserten oder wiederherstellten. Demgemäß ist die erfindungsgemäße Zusammensetzung bei der therapeutischen Behandlung zur Normalisierung gestörter Glucosetoleranz brauchbar.
Die Erfinder haben hier gezeigt, dass eine niedrig dosierte Infusion von GLP-1 die Funktion der β-Zellen Insulin in Antwort auf eine Zunahme im Plasmaglucosespiegel zu sekretieren, verbessern kann. GLP-1 kann daher also dazu verwendet werden, die Erhaltung der β-Zellfunktion in Testpersonen mit IGT zu verbessern. Die Verabreichung von GLP-1 reguliert oder normalisiert auch Insulinsekretionsmuster, was zu einer Gesamtreduktion von Plasmainsulin bei IGT führt. Diese Normalisierung wiederum reduziert den Zustand der Insulinresistenz.
Der Begriff „GLP-1" oder Glucagon-like Peptid schließt GLP-1 Mimetika mit ein, und kann, so wie es im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet wird, aus Glucagon-like peptides und verwandten Peptiden und Analogen von Glucagon-like Peptid-1, die an ein Glucagon-like Peptid-1 (GLP-1)-Rezeptorprotein binden, wie beispielsweise das GLP-1 (7-36) Amidrezeptorprotein, zusammengesetzt sein und weist einen entsprechenden biologischen Effekt auf die Insulinsekretion auf, wie GLP-1 (7-36) Amid, das eine native biologisch aktive Form von GLP-1 ist. Siehe Göke, B und Byrne, M, Diabetic Medicine. 1996, 13: 854–860. Die GLP-1-Rezeptoren sind Zelloberflächenproteine, die beispielsweise auf insulinproduzierenden pankreatischen β-Zellen gefunden werden. Glucagon-like Peptide und Analoge umfassen Spezies, die eine insulinotrope Aktivität aufweisen und Agonisten des GLP-1 Rezeptormoleküls sind, d. h. dieses aktivieren, und dessen zweite Messengeraktivität auf u. a. insulinproduzierende β-Zellen. Agonisten von Glucagon-like Peptid, die Aktivität durch diesen Rezeptor zeigen, sind bereits beschrieben worden: EP 0708179A2; Hjorth, S. A. et al., J. Biol. Chem. 269 (48): 30121–30124 (1994); Siegel, E. G. et al. Amer. Diabetes Assoc. 57^th Scientific Sessions, Boston (1997); Hareter, A. et al. Amer. Diabetes As soc. 57^th Scientific Sessions, Boston (1997); Adelhorst, K. et al. J. Biol. Chem. 269(9): 6275–6278 (1994); Deacon C. F. et al. 16^th International Diabetes Federation Congress Abstracts, Diabetologia Supplement (1997); Irwin, D. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 7915–7920 (1997); Mosjov, S. Int. J. Peptide Protein Res. 40: 333–343 (1992). Glucagon-ähnliche Moleküle umfassen Polynukleotide, die GLP-1-Agonisten exprimieren, d. h. Aktivatoren des GLP-1-Rezeptormoleküls und seiner zweiten Messengeraktivität, die u. a. auf insulinproduzierenden β-Zellen gefunden wird. GLP-1-Mimetika, die ebenfalls β-Zellagonisten sind, umfassen beispielsweise chemische Verbindungen, die spezifisch zum Aktivieren des GLP-1 Rezeptors entworfen worden sind. Glucagon-like Peptid-1-Antagonisten sind ebenfalls bekannt, sie beispielsweise Watanabe, Y. et al., J. Endocrinol. 140(1): 45–52 (1994) und umfassen Exendin (9-39) Amin, ein Exendinanaloges, das ein potenter Antagonist für GLP-1-Rezeptoren ist (siehe z. B. WO97/46584). Kürzliche Veröffentlichungen beschreiben Black Widow GLP-1 und Ser² GLP-1, siehe G. G. Holz, J. F. Hakner/Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 121(1998) 177–184 und Ritzel, et al. A synthetic glucagon-like peptide-1 analog with improved plasma stability, J. Endocrinol 1998 Oct.; 159(1): 93–102.
Weitere Ausführungsformen umfassen chemische und synthetisierte Glucagon-like Polypeptide, sowie beliebige Polypeptide oder Fragmente davon, die im Wesentlichen homolog sind. „Im Wesentlichen homolog", das sich sowohl auf Nukleinsäure- als auch Aminosäuresequenzen beziehen kann, bedeutet dass eine spezielle Sequenz, z. B. eine Mutantensequenz, von einer Referenzsequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen oder Additionen variiert, deren Nettoauswirkungen nicht zu einer gegenteiligen funktionellen Unähnlichkeit zwischen Referenz und betreffender Sequenz führt. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden Sequenzen, die eine Homologie von größer als 50 Prozent, und vorzugsweise eine Homologie von größer als 90 Prozent, äquivalente biologische Aktivität bei der Verbesserung von β-Zellantworten auf Plasmaglucosespiegel und äquivalente Expressionscharakteristika aufweisen, als im Wesentlichen homolog angesehen. Für die Zwecke zur Bestimmung der Homologie sollte die Trunkierung der reifen Sequenz außer Acht gelassen werden. Sequenzen, die einen niedrigeren Homologiegrad aufweisen, eine vergleichbare Bioaktivität und äquivalente Expressionscharakteristika werden als äquivalent angesehen.
GLP-Peptide von Säugern und Glucagon werden durch das selbe Gen kodiert. Im Ileum wird der Phänotyp zu zwei Hauptklassen von GLP-Peptidhormonen, nämlich GLP-1 und GLP-2 verarbeitet. Es sind vier mit GLP-1 verwandte Peptide bekannt, die von den phänotypischen Peptiden abstammen. GLP-1 (1-37) weist die Sequenz His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEQ. ID NR: 1) auf. GLP-1 (1-37) wird amidiert durch posttranslationale Verarbeitung und ergibt GLP-1 (1-36) NH₂ das die Sequenz His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH₂) (SEQ. ID NR: 2) aufweist; oder es wird enzymatisch verarbeitet und ergibt GLP-1 (7-37), das die Sequenz His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEQ. ID NR: 3) aufweist. GLP-1 (7-37) kann ebenfalls amidiert werden, wobei GLP-1 (7-36) Amid erhalten wird, welches die natürliche Form des GLP-1-Moleküls ist und das die Sequenz His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH₂) (SEQ. ID NR: 4) aufweist und die natürliche Form des GLP-1-Moleküls ist.
Intestinale L-Zellen sekretieren GLP-1 (7-37) (SEQ. ID NO: 3) und GLP-1 (7-36) NH₂ (SEQ. ID NR: 4) in einem Verhältnis von 1 zu 5, respektive. Diese trunkierten Formen von GLP-1 weisen in situ kurze Halbwertszeiten auf, d. h. weniger als 10 Minuten und werden durch eine Aminodipeptidase IV inaktiviert, wobei Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEQ. ID NO: 5); bzw. Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH₂) (SEQ. ID NR: 6) erhalten wird. Es ist spekuliert worden, dass die Peptide Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEQ. ID NO: 5) und Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH₂) (SEQ. ID NO: 6), die hepatische Glucoseproduktion beeinträchtigen, die Produktion oder Freisetzung von Insulin aus dem Pankreas jedoch nicht stimulieren.
Es gibt sechs Peptide in Gila-Monster-Gift, die zu GLP-1 homolog sind. Ihre Sequenzen werden mit der Sequenz von GLP-1 in Tabelle 1 verglichen. Tabelle 1

a: GLP-1 (SEQ. ID NR: 4)
b: Exendin 3 (SEQ. ID NR: 7)
c: Exendin 4 (9-39NH₂(SEQ. ID NR: 8)
d: Exendin 4 (SEQ. ID NR: 9)
e: Helospectin I (SEQ. ID NR: 10)
f: Helospectin II (SEQ. ID NR: 11)
g: Helodermin (SEQ. ID NR: 12)
h: Q⁸, Q⁹ Helodermin (SEQ. ID NR: 13)

Die Haupthomologien, die durch die in Tabelle 1 umrissenen Bereiche angegeben werden, sind:
Peptide c und h sind abgeleitet von b bwz. g. Alle 6 natürlich vorkommenden Peptide (a, b, d, e, f und g) sind homolog in den Positionen 1, 7, 11 und 18. GLP-1 und Exendine 3 und 4 (a, b und d) sind darüber hinaus in den Positionen 4, 5, 6, 8, 9, 15, 22, 23, 25, 26 und 29 homolog. In Position 2 sind A, S und G strukturell ähnlich. In Position 3 sind die Reste D Amid E (Asp und Glu) strukturell ähnlich. In Positionen 22 und 23 sind F (Phe) und I (Ile) strukturell ähnlich mit Y (Tyr) bzw. L (Leu). In Position 26 sind L und I ebenfalls strukturell äquivalent.
Somit sind von den 30 Resten von GLP-1 die Exendine 3 und 4 in 15 Positionen identisch und 5 weiteren Positionen äquivalent. Die einzigen Positionen, in denen radikale, strukturelle Veränderungen offensichtlich sind, sind bei den Resten 16, 17, 19, 21, 24, 27, 28 und 30. Exendine weisen auch 9 Extrareste am Carboxylterminus auf.
Die GLP-1-artigen Peptide können durch chemische Festkörperpeptidsynthese hergestellt werden. GLP-1 kann auch durch herkömmliche rekombinante Techniken unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt werden, wie sie beispielsweise bei Sambrook und Maniatis beschrieben sind. Der hierfür verwendete Begriff „rekombinant" bedeutet, dass ein Protein von rekombinanten (z. B. mikrobiellen oder Säugetier) Expressionssystemen stammt, die genetisch modifiziert worden sind, so dass sie ein Expressionsgen für GLP-1 oder seine biologisch aktiven Analogen enthalten.
Die GLP-1-artigen Peptide können aus rekombinanten Zellkulturen durch Verfahren gewonnen und gereinigt werden, die Ammoniumsulfat- oder Ethanolausfällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphocellulosechromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylapatitchromatographie und Lectinchromatographie umfassen, jedoch nicht auf diese beschränkt sind. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) kann für endgültige Reinigungsschritte ebenfalls eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können ein natürlich gereinigtes Produkt sein oder ein Produkt chemischer Syntheseverfahren oder durch rekombinante Techniken aus prokaryotischen oder eukaryotischen Wirten (beispielsweise durch Bakterien, Hefen, höheren Pflanzen, Insekten und Säugerzellen in Kultur oder in vivo) hergestellt werden. Je nach dem Wirt, der in einem rekombinanten Produktionsverfahren verwendet wird, sind die erfindungsgemäßen Polypeptide im Allgemeinen nicht glykosiliert, können jedoch glykosiliert sein.
Die GLP-1-Aktivität kann mittels Standardverfahren bestimmt werden, im Allgemeinen durch Screeningverfahren zur Rezeptor-bindenden Aktivität, wozu das Bereitstellen von geeigneten Zellen gehört, die den GLP-1-Rezeptor auf ihrer Oberfläche exprimieren, beispielsweise Insulinomazelllinien wie RINmSF-Zellen oder INS-1-Zellen. Siehe auch Mosjov, S. (1992) und EP0708170A2. Zusätzlich zum Messen der spezifischen Bindung von Tracern an Membran unter Verwendung von Radioimmunoassayverfahren kann auch die cAMP-Aktivität oder glucoseabhängige Insulinproduktion gemessen werden. In einem Verfahren wird ein Polynukleotid, das für den erfindungsgemäßen Rezeptor kodiert, zur Zelltransfektion eingesetzt, um dadurch das GLP-1-Rezeptorprotein zu exprimieren. Daher können diese Verfahren beispielsweise zum Screenen für einen Rezeptoragonisten eingesetzt werden, in dem solche Zellen mit zu screenenden Verbindungen in Kontakt gebracht werden und bestimmt wird, ob solche Verbindungen ein Signal erzeugen, d. h. den Rezeptor aktivieren.
Es können polyklonale und monoklonale Antikörper verwendet werden, um GLP-1-artige Peptide zur Verwendung in den hier beschriebenen Verfahren nachzuweisen, zu reinigen und zu identifizieren. Antikörper wie ABGA1178 erkennen intaktes, ungespleißtes GLP-1 (1-37) oder N-terminaltrunkiertes GLP-1 (7-37) oder- (7-36) Amid. Andere Antikörper detektieren das genaue Ende des C-Terminus des Vorläufermoleküls, ein Verfahren, das es durch Subtraktion erlaubt, die Menge an biologisch aktivem trunkierten Peptid zu berechnen, d. h. GLP-1 (7-37) oder- (7-36) Amid (Orskov et al. Diabetes, 1993, 42: 658–661; Orskov et al. J. Clin. Invest. 1991, 87: 415–423).
Andere Screeningtechniken umfassen die Verwendung von Zellen, die den GLP-1-Rezeptor exprimieren, z. B. transfizierte CHO-Zellen, in einem System das den extrazellulären pH oder ionische Veränderungen die durch Rezeptoraktivierung verursacht werden, misst. Beispielsweise können potentielle Agonisten mit einer Zelle in Kontakt gebracht werden, die den GLP-1 Proteinrezeptor exprimiert und eine zweite Messengerantwort, z. B. Signaltransduktion oder ionische oder pH-Veränderungen kann gemessen werden um zu bestimmen ob der potentielle Agonist wirksam ist.
Die erfindungsgemäßen Glucagon-like Peptid-1 Rezeptor-bindenden Proteine können in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger verwendet werden. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge des Polypeptids und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers oder Exzipients. Derartige Träger umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol, Laktose, Phosphat, Mannit, Arginin, Trehalose und Kombinationen davon. Die Formulierungen sollten zum Verabreichungsmodus passen und vom Fachmann ohne weiteres bestimmt werden können. Das GLP-1-Peptid kann auch in Kombination mit aus dem Stand der Technik bekannten Agentien verwendet werden, die die Halbwertszeit des Peptids in vivo ver bessern, um die biologische Aktivität des Peptids zu verbessern oder zu verlängern. Beispielsweise kann ein Molekül oder eine chemische Gruppe mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kovalent verknüpft werden bevor sie verabreicht wird. Alternativ kann das Verbesserungsagens gleichzeitig mit der Zusammensetzung verabreicht werden. Darüber hinaus kann das Agens ein Molekül umfassen, von dem bekannt ist, dass es den enzymatischen Abbau von GLP-1-artigen Peptiden inhibiert und kann gleichzeitig mit oder nach Verabreichung der GLP-1-Peptidzusammensetzung verabreicht werden. Ein solches Molekül kann beispielsweise oral oder mittels Injektion verabreicht werden.
GLP-1 kann intravenös oder subkutan verabreicht werden und kann kontinuierlich oder mittels Bolusinjektion verabreicht werden. Die gesamte Verabreichung kann zusammen mit, vor oder nach Glucoseinjektion oder -infusion erfolgen. Es können folgende Dosen verwendet werden: Für kontinuierliche Infusion mittels intravenöser Injektion (i. V.) 0,1 pmol/kg/min bis 10 pmol/kg/min und mittels subkutaner Injektion (S. C.) 0,1 pmol/kg/min bis 75 pmol/kg/min und für eine Einzelinjektion (Bolus) mittels I. V: 0,005 nmol/kg bis 20 nmol/kg und S. C. 0,1 nmol/kg bis 100 nmol/kg.
Das bevorzugte Verfahren zur Verabreichung des GLP-1-Peptids ist eine kontinuierliche Applikation. GLP-1 kann jedoch auch durch subkutanes, intramuskuläres, interperitoneales, injiziertes Depot mit verzögerter Freisetzung, tiefe Insufflation der Lunge mit verzögerter Freisetzung sowie mittels intravenöser, buccaler, Pflaster oder anderer Freisetzungsmethoden verabreicht werden.
Die wirksame Behandlung von IGT vermindert auch das Risiko kardiovaskulärer oder cerebrovaskulärer Ereignisse. Es kann daher als ein Präventativ bereitgestellt werden für Patienten, bei denen ein hohes Risiko für derartige Ereignisse bekannt ist.
Darüber hinaus veranschaulichen die folgenden Beispiele einen Aspekt der vorliegenden Erfindung. Diese Beispiele sollten jedoch keinesfalls eine Einschränkung des Umfangs der Lehren oder der Beschreibung der vorliegenden Erfindung auf die in den Beispielen angegebenen Grenzen sein.
BEISPIELE
Die hier beschriebenen Untersuchungen wurden an zehn Testpersonen durchgeführt, die auf Grund ihrer Plasmaglucoseantwort auf einen oralen Glucosetoleranztest in zwei Gruppen aufgeteilt wurden, wobei die Kriterien der Weltgesundheitsorganisation (21) zur Definition des Grades für Glucoseintoleranz verwendet wurden. Fünf Testpersonen hatten IGT und fünf Testpersonen hatten NIDDM. Geschlecht, Alter, Bodymassindex (BMK), Basalspiegel von Nüchternglucose, 2 Stundenglucose, Nüchterninsulin und HBA1c für jede Testperson sind in Tabelle 2 angegeben. Diabetische Testpersonen waren älter als diejenigen mit IGT, die Gruppen passten jedoch beim BMI zusammen. Mittlere Nüchternglucosespiegel und glykosilierte Hämoglobinkonzentrationen waren bei der IGT-Gruppe im Vergleich zu den Testpersonen mit NIDDM geringer. Nüchterninsulinspiegel zwischen den Gruppen unterschieden sich nicht.
Tabelle 2 Klinische Basislinienparameter von IGT- und NIDDM-Testpersonen
Plasmaglucosespiegel wurden gemessen durch Glucoseoxidasetechniken (YSI, 1500 G, Schlag Company, Bergisch-Gladbach, Deutschland). Der Variationskoeffizient dieses Verfahren betrug < 2%. Plasmainsulin wurde mittels Abbott IMx Microparticle Enzyme Immunoassay gemessen. Der durchschnittliche Intraassayvariationskoeffizient betrug 5%. Plasma C-Peptid wurde wie zuvor in (22) beschrieben gemessen, Faber OK, Binder C, Markussen, J, Heding LG, Naithani VK, Kuzuya H, Blix P, Horwitz DL, Rubenstein AH. Characterization of seven c-peptide antisera. Diabetes 27, Suppl 1: 170–177, 1978. Die untere Grenze der Empfindlichkeit des Assays betrug 0,02 pmol/ml und der Intraassayvariationskoeffizient betrug durchschnittlich 6%. Glucagon wurde unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Radioimmunoassaykits (Biermann, Bad Nauheim, Deutschland) gemessen und der Intraassayvariationskoeffizient betrug durchschnittlich 8%. IR-GLP-1 wurde unter Verwendung des spezifischen polyklonalen Antikörpers GA 1178 (Affinity Research, Nottingham, UK) (23) gemessen. Er weist mit GLP-1 (1-36) Amid und dem trunkierten GLP-1 (7-36) Amid eine Reaktivität von 100% auf. Immunoreaktives GLP-1-artiges Material wurde aus Plasmaproben auf C-18 Patronen extrahiert, wobei Acetonitril zur Elution der Proben verwendet wurde. Die Nachweisgrenze des Tests betrug 2 fmol/Röhrchen. Das Antiserum kreuzreagierte nicht mit GIP, pankreatischem Glucagon, Glicentin, Oxyntomodulin oder GLP-2. Die Intra- und Interassayvariationskoeffizienten betrugen 3,4% bzw. 10,4%.
Sämtliche Ergebnisse sind als Mittel ± SEM (mittlere Standardabweichung) angegeben. Die Datenanalyse wurde unter Verwendung des statistischen Analysesystems (SAS Version 6. Ausgabe für Personal Computers, SAS Institute, Inc., Cary, NC) durchgeführt. Die Bedeutung von Abweichungen im Individuum, die durch GLP-1-Infusion induziert werden, wurden unter Verwendung von paarweisen T-Tests bestimmt. Die Abweichungen wurden als signifikant angesehen, wenn P < 0,05.
Kinetische Standardparameter für C-Peptid-Clearance, die auf Alter, Geschlecht und Körperoberfläche abgestimmt waren, wurden verwendet (24), Van Cauter E, Mestrez, F, Sturis J, Polonsky KS. Estimation of insulin secretion rates from C-peptide levels: comparison of individual and standard kinetic parameters for C-peptide clearance. Diabetes 41: 368–377, 1992. Diese Parameter wurden dazu verwendet, in jedem 15-Minuten Intervall zwischen Blutprobenentnahmen den ISR aus den Plasma C- Peptidkonzentrationen durch Dekonvolution, wie zuvor beschrieben (25, 26) abzuleiten.
Die diabetischen Testpersonen wurden alleine mit Diät behandelt, mit Ausnahme der Testperson D07, die zuvor mit einem oralen hypoglykämischen Agens behandelt wurde, was 4 Wochen vor der Untersuchung unterbrochen wurde. Keine der diabetischen Patienten hatte jemals Insulin erhalten. Sämtliche Testpersonen wurden zwei Wochen lang vor der Untersuchung auf eine gewichtserhaltende Diät gesetzt, die mindestens 200 g Kohlenhydrate pro Tag enthielt.
Jede Testperson wurde bei drei getrennten Gelegenheiten untersucht. Sämtliche Untersuchungen wurden nach einem 12-stündigen Fasten über Nacht durchgeführt und begannen um 07.00 Uhr, wenn nichts anderes angegeben ist, wobei die Testpersonen in Ruhestellung waren. Ein intravenöser Katheter wurde in jeden Vorderarm plaziert, einer für die Blutprobe, und einer für die Verabreichung von Glucose und GLP-1 nach Bedarf. Bei sämtlichen Experimenten wurde der den Probekatheter enthaltende Arm in einer Heizdecke gehalten um eine Arterialisation der venösen Probe zu gewährleisten. In den folgenden Beispielen wurde das GLP-1 den Testpersonen in der GLP-1 (7-36) Amidform verabreicht.
Beispiel 2 (Oraler Glucosetoleranztest)
120 Minuten nach Einnahme von 75 g Glucose (Boehringer, Mannheim, Mannheim, Deutschland) wurden in 30 Minuten Intervallen Blutproben zur Messung von Glucose, C-Peptid, Insulin, Glucagon und GLP-1 entnommen. Inkrementflächen unter der Kurve (AUC, areas under the curve) von 0 bis 120 Minuten wurden für Glucose, Insulin, C-Peptid, Glucagon und GLP-1 berechnet. Die Glucosekonzentrationen wurden dazu verwendet, den Grad der Glucoseintoleranz gemäß den Kriterien der Weltgesundheitsorganisation zu definieren. Die Antwort der IGT- und NIDDM-Gruppen auf orale Glucose ist in Tabelle 3 dargestellt.
Die Glucose-, Insulin- und GLP-1-Antworten von Testpersonen auf 75 mg Glucose sind in 1 gezeigt. Die AUC für Glucose von 0–120 Minuten war bei der IGT- Gruppe geringer, die AUC für Insulin, C-Peptid, Glukagon und GLP-1 unterschied sich jedoch nicht. Tabelle 3 Antwort auf orale Glucose
P < 0.05 für IGT vs. NIDDM
Wenn mittlere ISR's gegen mittlere Glucosespiegel aufgetragen wurden, wurde beobachtet, dass GLP-1 eine signifikante Reduktion der Glucosespiegel verursachte, ohne die mittleren Insulinsekretionsraten signifikant zu ändern. (2).
Beispiel 3 (Verabreichung einer oszillatorischen Glucoseinfusion)
Die periphere Verabreichung von Glucose in einem oszillatorischen Muster führt zu regulären Oszillationen in der Plasmaglucose. In normalen Testpersonen sind die β-Zellen in der Lage, wiederholte Zunahmen und Abnahmen der Glucose wahrzunehmen und darauf mit parallelen Veränderungen der Insulinsekretionen zu antworten. Diese Anpassung der insulinsekretorischen Oszillationen auf die Glucoseoszillationen bzw. -schwankungen wird als Entrainment bezeichnet. Ein Mangel an Entrainment auf Glucose ist eine frühe Manifestierung einer β-Zelldisfunktion in Personen mit IGT oder leichtem NIDDM.
Wir verwendeten ein niedrig dosiertes oszillatorisches Glucoseinfusionsprotokoll, da es ein sehr empfindlicher Test auf die Fähigkeit der β-Zellen ist, geringe Veränderun gen in Plasmaglucosekonzentrationen wahrzunehmen und auf diese zu antworten. Es prüft die Integrität der Rückkopplung, die Glucose und Insulinsekretion verknüpft. Für eine normale Antwort ist eine intakte Glucosewahrnehmungsfähigkeit erforderlich.
Um zu bestimmen, ob die β-Zellen in der Lage sind, Oszillationen von Glucose zu erkennen und auf diese zu antworten, wurde Glucose in einem oszillatorischen Muster mit einem geringen Volumen Kochsalzlösung 12 Stunden lang infusioniert. Die Amplitude der verabreichten Oszillationen betrug 33% über und unter der mittleren Rate von 4 mg/kg/Min. und ihre Periodizität betrug 144 Minuten.
Um die Wirkung von GLP-1 auf die Fähigkeit der β-Zellen, auf Oszillationen von Glucose zu antworten, zu ermitteln, wurde Glucose auf die selbe Weise infusioniert und GLP-1 wurde mit einer konstanten Rate von 0,4 pmol/kg/Min. für die gesamten 12 Stunden infusioniert. Jede Untersuchung bestand auf einer anfänglichen 2 Stunden Periode (0700-0900), um die Erreichung eines stabilen Zustands zu ermöglichen. Daran schloss sich eine nachfolgende Zeitspanne von 10 Stunden (0900-1900) an, während der in 15 Minutenintervallen Blutproben für Glucose, Insulin, C-Peptid und Glucagon und in 60 Minutenintervallen für GLP-1 Blutproben entnommen wurden.
Die mittleren Glucosespiegel waren in beiden Gruppen während der GLP-1-Infusion verglichen mit Kochsalzlösung signifikant niedriger, wobei der durchschnittliche Abfall bei IGT-Testpersonen (P < 0,02) 2,4 ± 0,6 mM betrug und bei den Diabetikern (P < 0,0005) 5,2 ± 0,5 mM betrug. Trotz dieser signifikanten Abnahme der Plasmaglucosekonzentration waren die mittleren ISRs während der GLP-1-Infusion im Vergleich zur Kochsalzinfusion in beiden Gruppen nicht signifikant verschieden (Tabelle 4).
Tabelle 4 Mittlere Glucose- und ISR-Antworten auf 12 stündige Kochsalz- oder GLP-1-Infusion
Die mittleren Insulinspiegel wurden während der GPL-1-Infusion im Vergleich zu Kochsalzlösung ebenfalls aufrechterhalten, Anstieg um 102 ± 90 pmol/L; P = 0,32 in Testpersonen mit IGT und Anstieg 7 ± 12 pmol/L; P = 0,56 in Testpersonen mit NIDDM. Mittlere Glucagonspiegel waren während der GLP-1-Infusion im Vergleich zu Kochsalzlösung ebenfalls nicht unterschiedlich (39,3 ± 5,4 pg/ml vs. 39,4 ± 5,9 pg/ml; P = 0,94) in Testpersonen mit IGT und (46,4 ± 3,2 pg/ml vs. 42,8 ± 4,5 pg/ml; P = 0,4) in Testpersonen mit NIDDM. Während der GLP-1-Infusion erreichte GLP-1-Spiegel betrugen 15,6 ± 4,6 pmol/L im Vergleich zu 2,0 ± 0,8 pmol/L während Kochsalzinfusion (P < 0,001). Diese Spiegel entsprechen postprandialen physiologischen Spiegeln.
Beispiel 4 (Beziehung zwischen Glucose und ISR in einzelnen Testpersonen mit IGT).
In normalen Testpersonen ist jeder Glucosepuls eng gekoppelt an einen Puls in der ISR. Es ist bereits gezeigt worden, dass diese Kopplung in Testpersonen mit IGT gestört ist. Glucose- und ISR-Profile während der oszillatorischen Glucoseinfusion mit Kochsalzlösung von einer repräsentativen Testperson mit IGT, D02, sind in den 3A und 3C gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass in Testpersonen mit IGT während Kochsalzinfusion ein Verlust der engen Kopplung zwischen Glucose und ISR, mit vielen glucoseunabhängigen Oszillationen in der ISR auftritt. In Gegenwart physiologischer postprandialer Spiegel von GLP-1 (3B und 3D) ist das Muster insulinsekretorischer Antworten auf Glucose in der Testperson mit IGT verbessert, wobei auf jeden Glucosepuls ein ISR-Puls folgt. GLP-1 verbessert in Folge dessen die Fähigkeit der β-Zellen, sich an eine exogene Glucoseinfusion in der Testperson mit IGT anzupassen.
Beispiel 5 (Beziehung zwischen Glucose und ISR in einzelnen Testpersonen mit NIDDM)
4 zeigt die Glucose- und ISR-Profile einer Testperson mit NIDDM, D07. In merklichem Kontrast zu Testpersonen mit IGT war das Muster von insulinsekretorischer Antworten auf Glucose während der GLP-1-Infusion, trotz der Absenkung von Plasmaglucosekonzentrationen und der Aufrechterhaltung von ISR, nicht verbessert (4B und 4D), wobei in ISR viele glucoseunabhängige Oszillationen bestehen blieben. Glucose- und ISR-Profile während der oszillatorischen Glucoseinfusion mit Kochsalzlösung sind in 4A und 4C angegeben.
Beispiel 6 (Auswirkung von GLP-1 auf die Stärke des Spektrums bei IGT und bei NIDDM)
Um festzustellen, ob die Insulinsekretion in einzelnen Testpersonen durch Glucose hervorgerufen wurde, wurden die temporalen Profile der Insulinsekretion mittels Spektralanalyse analysiert. Die Analyse der Stärke des Spektrums wurde dazu verwendet, das Vorliegen einer engen Kopplung zwischen Oszillationen in Glucose und Oszillationen in ISR zu bewerten. Dieses Verfahren bewertete die Regelmäßigkeit insulinsekretorischer Oszillationen bei einer vorherbestimmten Frequenz. Spektralpeaks entsprechen der vorherrschenden Periodizität und die Höhe der Peaks entspricht der Stärke des Spektrums. Jedes Spektrum wurde normiert, wobei die totale Varianz einer jeden Serie als 100% angenommen wurde und als die normierte Stärke des Spektrums angegeben wurde.
Die mittlere normierte Stärke des Spektrums für Glucose bei Testpersonen mit IGT betrug 11,2 ± 1,5 während Kochsalzinfusion und 13,2 ± 1,6 während GLP-1-Infusion (P = 0,19) und in Testpersonen mit NIDDM 6,5 ± 1,8 während Kochsalzinfusion und 9,8 ± 0,7 während GLP-1-Infusion (P = 0,18). 5 zeigt eindeutig, dass eine Infusion von GLP-1 in Testpersonen mit IGT die insulinsekretorischen Antworten auf die Oszillationen der Plasmaglucose verbesserte, was zu einem höheren Grad an Entrainment der Insulinsekretion auf Glucose führte. Die Wirkung wurde durch Vergleichen der normierten Stärke des Spektrums auf die insulinsekretorischen Profile quantitativ bestimmt. Die Stärke des Spektrums für ISR stieg von 2,9 ± 1,4 während Kochsalzinfusion, auf 8,9 ± 1,7 während GLP-1-Infusion; (P < 0,006) und war in Testpersonen mit NIDDM (1,1 ± 0,5 bis 1,5 ± 0,8; P = 0,6) unverändert.
Die Spektralanalyse der oszillatorischen Glucoseprofile bestätigte das Vorliegen von Peaks in den Plasmaglucosespektren bei 144 Minuten entsprechend der Periode exogener Glucoseinfusion. Individuelle Spektren für Glucose und ISR in einer Testperson mit IGT (6A) und einer Testperson mit NIDDM (6B) während Kochsalzinfusion und während GLP-1-Infusion sind in 6 gezeigt. Diese entsprechen den in 3C und 3D und den in 4A und 4B gezeigten Daten. Die Stärke des Spektrums stieg von 0,6 auf 8,9 in der IGT-Testperson und war in der Testperson mit NIDDM minimal verändert von 0,28 auf 1,51. Peaks in Plasmaglucosespektren traten bei 144 Minuten auf. Während Kochsalzinfusion trat der dominate spektrale Peak für ISR bei 144 Minuten nicht auf, sondern trat bei 0,2 auf. Die Stärke des Spektrums bei GLP-1-Infusion betrug 1,5.
Während der Kochsalzinfusion war das Entrainment gering (3A), da die Stärke des Spektrums für ISR bei 144 0,6 betrug. Während GLP-1 Infusion (3B) trat die Periodizität des dominanten Spektralpeaks bei ISR bei 144 Minuten auf, was zeigte, dass GLP-1 das Entrainment der β-Zellen in dieser Testperson verursacht hatte.
Der mittlere Wert für die normierte Stärke des Spektrums in historischen Kontrolltestpersonen mit entsprechend passendem Gewicht (BMI 28,3) mit normaler Glucosetoleranz betrug 7,2 ± 0,6 (9).
Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen, dass eine kontinuierliche Infusion von physiologischen postprandialen Konzentrationen an GLP-1 die Plasmaglucosekonzentrationen senkte und die Insulinsekretion in Testpersonen mit IGT und NIDDM stimulierte. Am wichtigsten ist, dass GLP-1 bei sämtlichen IGT-Testpersonen die Fähigkeit der β-Zellen wiederherstellte, Plasmaglucose wahrzunehmen und auf diese zu reagieren (quantifiziert durch normierte Stärke des Spektrums), wobei die Antwort in Testpersonen, die bereits NIDDM entwickelt hatten, variabel war.
Die möglichen Mechanismen, über die die β-Zellfunktion durch GLP-1 verbessert wird, umfassen eine Aufregulierung glucosewahrnehmender Elemente, Eliminierung von Glukotoxizität und Verbesserung der Insulinresistenz. GLP-1 und Glucose üben auf β-Zellen synergistische, insulinotrope Aktionen aus, einschließlich Stimulierung der zyklischen AMP-Bildung, Insulinsekretion, Insulinbiosythese und Proinsulingenexpression.
Diese Beispiele zeigen, dass eine kontinuierliche Infusion von physiologischen Konzentrationen von GLP-1 die Plasmaglucosekonzentration absenkte und die Insulinsekretion in IGT- und NIDDM-Testpersonen stimulierte. Am wichtigsten ist, dass GLP-1 die Fähigkeit der β-Zelle, geringe Änderungen in der Plasmaglucosekonzentration in IGT-Testpersonen wahrzunehmen und auf diese zu reagieren, wiederherstellte, wobei lediglich in NIDDM-Testpersonen eine variable Antwort erhalten wurde. In IGT-Testpersonen wurde ein signifikanter Anstieg der Stärke des Spektrums beobachtet, eine Messung der β-Zellfunktion, die nicht auf der Einstellung für Veränderungen in der Insulinsensitivät beruht.

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung, die eine Verbindung, die an einen Rezeptor für Glucagon-like Peptide-1 bindet und einen pharmazeutischen Träger umfasst, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung gestörter Glucosetoleranz bei einem Individuum, bei dem kein nicht-insulinabhängiger Diabetes mellitus diagnostiziert wurde.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung die Verbindung in einer Menge enthält, die eine Steigerung der Sensitivität und Antwort von pankreatischen β-Zellen auf Änderungen der Plasmaglucose bewirkt, gemessen durch zeitliche Koordinierung und Menge der Insulinsekretionen als Antwort auf einen Anstieg der Plasmaglucose bei einem Menschen mit gestörter Glucosetoleranz.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung die Verbindung in einer Menge enthält, die eine Steigerung der Regularität der Insulinantworten und deren Amplitude als Reaktion auf Veränderungen der Plasmaglucose bewirkt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung die Verbindung in einer Menge enthält, die ein Verzögern oder Aufhalten des Verlustes der Plasmaglucosekontrolle und der Entwicklung von nicht-insulinabhängigem Diabetes mellitus bewirkt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung die Verbindung in einer Menge enthält, die eine Verbesserung des Entrainments von β-Zellinsulin-sekretorischen Antworten auf exogene Glucoseschwankungen bewirkt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung die Verbindung in einer Menge enthält, die eine Verbesserung einer Normalisierung der insulinsekretorischen Muster bei gestörter Glucosetoleranz bewirkt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung die Verbindung in einer Menge enthält, die ein Absenken der Plasmainsulinspiegel in einem Individuum mit gestörter Glucosetoleranz bewirkt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung die Verbindung in einer Menge enthält, die ein Abnehmen der Insulinresistenz in einem Individuum mit gestörter Glucosetoleranz bewirkt.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–8, wobei die an den Rezeptor bindende Verbindung ausgewählt ist aus (a) einem Peptid, das die Aminosäuresequenz des Glucagon-like Peptide-1 umfasst und (b) eine Peptidvariante, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die sich von der Sequenz des Glucagon-like Peptide-1 um eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen oder Insertionen unterscheidet.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die an den Rezeptor bindende Verbindung Glucagon-like Peptide-1 ist.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei die an den Rezeptor bindende Verbindung Glucagon-like Peptide-1 (7-37) ist, das die Sequenz His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEQ. ID Nr: 3) aufweist.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei die an den Rezeptor bindende Verbindung Glucagon-like Peptide-1-(7-36)-Amid ist, das die Sequenz His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH₂) (SEQ. ID Nr: 4) aufweist.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei die an den Rezeptor bindende Verbindung eine Peptidvariante ist, in der die Kombination der Substitutionen, Deletionen und Insertionen in der Aminosäuresequenz sich nicht um mehr als zehn Aminosäuren von der Aminosäuresequenz des Glucagon-like Peptide-1 unterscheidet.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die an den Rezeptor bindende Verbindung durch ein Polynucleotid exprimiert wird.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die an den Rezeptor bindende Verbindung ein organisches Molekül ist, das ein Molekulargewicht von nicht größer als etwa 5000 aufweist.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9–15, wobei der Schritt der Verabreichung in der Behandlung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus intravenös, subkutan, intramuskulär, interperiotoneal, injiziertem Depot mit fortgesetzter Freisetzung, Lungeninsufflation mit fortgesetzter Freisetzung, buccal oder Pflaster.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9–16, wobei die Behandlung darüber hinaus das Verabreichen eines Mittels umfasst, das die in vivo-Halbwertszeit der an den Rezeptor bindenden Verbindung erhöht.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei das Mittel gleichzeitig mit der Zusammensetzung zu verabreichen ist.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 17 oder 18, wobei das Mittel mit der an den Rezeptor bindenden Verbindung kovalent verknüpft ist.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die Behandlung darüber hinaus die intravenöse Verabreichung eines Mittels umfasst, das die in-vivo-Halbwertszeit der an den Rezeptor bindenden Verbindung erhöht und wobei der Dosisbereich von 0,3–2,0 pmol/kg pro Minute beträgt.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die Behandlung darüber hinaus die kontinuierliche subkutane Verabreichung eines Mittels umfasst, das die in vivo-Halbwertszeit der an den Rezeptor bindenden Verbin dung erhöht und wobei der Dosisbereich von 1,0–20,0 pmol/kg pro Minute beträgt.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 4, wobei die Behandlung darüber hinaus die intravenöse Verabreichung innerhalb eines Dosisbereichs von 0,1–10,0 pmol/kg pro Minute umfasst.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die Behandlung darüber hinaus die intravenöse Verabreichung innerhalb eines Dosisbereichs von 0,1 bis 75,0 pmol/kg pro Minute umfasst.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung, die an einen Rezeptor von Glucagon-like Peptide-1 bindet, und einen pharmazeutischen Träger zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Individuums, dessen Symptome ein erhöhtes Risiko eines kardiovaskulären Ereignisses vor dem Auftreten von nicht-insulinabhängigem Diabetes mellitus anzeigen, wobei die Zusammensetzung die Verbindung in einer Menge enthält, die eine Steigerung der Regularität der Insulinantworten und deren Amplitude in Reaktion auf Veränderungen der Plasmaglucose und ein Senken der Plasmainsulinspiegel bewirkt.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung, die an einen Rezeptor für Glucagon-like Peptide-1 bindet, und einen pharmazeutischen Träger, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Individuums, dessen Symptome ein erhöhtes Risiko eines cerebrovaskulären Ereignisses vor dem Auftreten eines nicht-insulinabhängigen Diabetes mellitus anzeigen, wobei die Zusammensetzung die Verbindung in einer Menge enthält, die eine Steigerung der Regularität von Insulinantworten und deren Amplitude in Reaktion auf Veränderungen der Plasmaglucose und ein Absenken der Plasmainsulinspiegel bewirkt.