DE69903831T2

DE69903831T2 - Trenn- und nachweisverfahren für spermatozoide

Info

Publication number: DE69903831T2
Application number: DE69903831T
Authority: DE
Inventors: North Bateman
Original assignee: Genosis Ltd
Current assignee: Genosis Ltd
Priority date: 1998-08-14
Filing date: 1999-08-13
Publication date: 2003-07-03
Anticipated expiration: 2019-08-14
Also published as: AU5431999A; CN1312855A; ATE227337T1; WO2000009648A1; US6391654B1; EP1104454B1; CA2333900A1; CN1190485C; BR9913039A; GB9817795D0; EP1104454A1; JP3980271B2; AU756890B2; JP2002522064A; DE69903831D1

Description

Technisches Gebiet

Diese Erfindung bezieht sich auf die Trennung und Detektion bzw. Feststellung von Spermatozoen bzw. Spermatozoiden bzw. Samenfäden. Sie stellt Verfahren und Bausätze für die Trennung und/oder Detektion bzw. den Nachweis von beweglichen Spermatozoen in einer Probe zur Verfügung, welche in einer Anzahl von Anwendungen, umfassend die Diagnose und Behandlung von männlicher Unfruchtbarkeit verwendbar sind.

Stand der Technik

Es wurde angenommen, daß bei etwa 14-16% aller Paare, die zu empfangen versuchen, Schwierigkeiten auftreten und die von Fruchtbarkeitstherapeuten als unfruchtbar definiert werden. 40% dieser Fälle resultieren aus männlichen Faktoren. Bei einem wesentlichen Anteil dieser ist eine Behandlung verfügbar, um den Zustand, welcher zu Unfruchtbarkeit führt, zu mildern oder zu verbessern.
Andere Bedingungen existieren auch, in welchen es wünschenswert ist, das Vorhandensein oder anderweitig lebensfähige Spermatozoen in einer Probe zu überprüfen bzw. zu testen. Beispielsweise werden nun häufig Vasektomien als ein Verfahren zur Empfängnisverhütung durchgeführt, jedoch ist es notwendig, die Effizienz einer Vasektomie zu verifizieren, indem bestätigt wird, daß das Ejakulat frei von lebensfähigen Spermatozoen für einen Zeitraum nach der Operation ist.
Es existiert eine Anzahl von Verfahren zur Bestimmung der Bewegungsfähigkeit und der Anzahl von Spermatozoen bzw. Samenfäden in einer Probe. Ein derartiges Verfahren ist mikroskopische Analyse, welche typischerweise in einem Spital oder einem kommerziellen Laboratorium durchgeführt wird. Kürzlich wurde jedoch eine Anzahl von Vorschlägen für Testkits bzw. Bausätze getätigt, welche darauf abzielen, die Detektion bzw. den Nachweis von Spermatozoen zu vereinfachen, und welche daher in der Diagnose von männlicher Unfruchtbarkeit verwendbar sein können. Beispielsweise offenbart WO 97/40386 einen Bausatz, welcher auf der Detektion des 34kD menschlichen Epididymalspermatozoenproteins (P34H) basiert. Von diesem Protein wird angenommen, daß es in der Wechselwirkung zwischen Spermatozoen und Zona pellucida involviert ist. Dieser in der WO 97/40386 geoffenbarte Bausatz verwendet einen Antikörper, der gegen P34H oder ein entsprechendes Antigen gerichtet ist, und ein Reagens zum Detektieren bzw. Feststellen der Antikörperbindung an P34H. Wie dies in der WO 97/40386 geoffenbart ist, werden Spermatozoen in einer Testprobe dreimal durch Zentrifugieren in Dulbecco-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Die Proben werden dann bei 95ºC denaturiert, mit 137,480 ms&supmin;² (14000 g) zentrifugiert und die überstehenden Lösungen werden dann für die Analyse verwendet.
EP-A 0 387 873 offenbart ebenfalls einen Bausatz für die Bewertung von männlicher Fruchtbarkeit. Dieser Bausatz verwendet feste Kügelchen, an welche ein Antikörper, der für eine antigenische Stelle an dem menschlichen Spermatozoen- Akrosom spezifisch ist, gebunden ist. Derartige Kügelchen werden mit einer Testprobe vermischt und für einen Zeitraum von 10 bis 30 min inkubiert. Die Testkugeln werden dann von der Suspension getrennt, gewaschen und einer Messung in bezug auf die Anzahl von Spermatozoen, die an die feste Kugel gebunden sind, vorzugsweise durch Überprüfen mit Hilfe eines Mikroskops, unterworfen.
Ein Bausatz für die Detektion von Spermatozoen in einer Probe ist ebenfalls in der WO 95/29188 geoffenbart. In diesem Fall basiert der Test auf Antikörpern für ein Antigen, wie das SP-10-Antigen von menschlichen Spermatozoen.
US-A 5 575 914 offenbart eine Filterfalle zum Entfernen von Spermatozoen mit relativ niedrigerer Lebensfähigkeit (Spermatozoen, die eine niedrigere Beweglichkeit und eine schlechtere Membranqualität aufweisen) aus einer Samenprobe. Diese Vorrichtung zielt darauf ab, die Qualität (Fruchtbarkeitspotential) einer Samenprobe durch Fließenlassen der Samenprobe mittels Schwerkraft durch ein Glaswollfilter zu verbessern. JP-A 04 200 473 offenbart ein Verfahren zum Erhalten einer konzentrierten Samenprobe ohne Verlust von Fruchtbarkeitskapazität. Die Samen werden mit alpha-Amylase behandelt, durch Schwerkraft durch eine Säule, die mit Glaskugeln befüllt ist, hindurchgeleitet und das Eluat durch ein Filter filtriert, welches adaptiert ist, um Spermium daran zu hindern, hindurchzutreten. Die EP-A 0 446 509 offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Verbessern des Fruchtbarkeitspotentials einer Samenprobe. Die Probe wird mit beweglichen und morphologisch normalen Spermatozoen bzw. Samenfäden angereichert, indem die Probe durch eine Säule geleitet wird, die mit einem Mehrschichtfilter versehen ist, in welchem Spezies mit niedrigerer Lebensfähigkeit zurückgehalten werden.
Ein signifikanter Nachteil dieser Testbausätze, die im oben erwähnten Stand der Technik geoffenbart sind, ist jener, daß sie nicht zwischen beweglichen und nicht-beweglichen Samenfäden unterscheiden. Bei der Detektion von männlicher Unfruchtbarkeit ist die Fähigkeit zur Bestimmung der Anzahl von beweglichen Samenfäden der aussagekräftigste Indikator männlicher Unfruchtbarkeit. Darüber hinaus umfassen zahlreiche der Testbausätze gemäß dem Stand der Technik Verfahren, wie Zentrifugieren oder mikroskopische Überprüfung, welche diese nicht für eine Verwendung zu Hause brauchbar machen, sondern stattdessen die Beiziehung eines Fachmanns erfordern.
Es ist daher gewünscht, eine Vorrichtung, welche in sich geschlossen oder in einer Mehrzahl von Komponenten zur Verfügung gestellt werden kann, und ein Verfahren zum Trennen von beweglichen Samenfäden von nicht-beweglichen Samenfäden und für ein Sammeln und Detektieren bzw. Nachweisen der Anwesenheit der beweglichen Spermatozoen bzw. Samenfäden zur Verfügung zu stellen.

Offenbarung der Erfindung

Die Erfindung stellt eine Vorrichtung zum Trennen von beweglichen Samenfäden von nicht-beweglichen Samenfäden in einer flüssigen Probe zur Verfügung, wobei die Vorrichtung aufweist: (i) einen Behälter bzw. ein Gefäß mit einem eine Probe aufnehmenden Einlaß, einem Auslaß für eine gefilterte Probe und einem dazwischen angeordneten Probentrennfilter, wobei das Probentrennfilter eine eine Probe aufnehmende Oberfläche bzw. Fläche und eine entgegengesetzte bzw. gegenüberliegende Oberfläche bzw. Fläche aufweist und wobei das Probentrennfilter wirksam ist, um ein Strömen bzw. Fließen der Probe durch dieses im wesentlichen zu verhindern, jedoch einen Durchlaß von beweglichen Spermatozoen durch dieses erlaubt, wenn die gegenüberliegende Fläche des Probentrennfilters in Berührung mit einem flüssigen Medium plaziert bzw. angeordnet ist, und (ii) ein Mittel bzw. eine Einrichtung zum Zuführen einer Flüssigkeit zu der gegenüberliegenden Fläche des Filters. Die Probe kann bewegliche Samenfäden, nicht-bewegliche Samenfäden und/oder Samenfäden mit reduzierter Beweglichkeit umfassen bzw. enthalten.
Um die abgetrennten, beweglichen Samenfäden bzw. Spermatozoen zu detektieren bzw. nachzuweisen, können Spermatozoen- Detektionsmittel, wie ein Spermatozoen-Detektionsfilter, an einer Probenauslaßseite des Probentrennfilters und beabstandet davon zur Verfügung gestellt werden. Die Nachweis- bzw. Detektionsmittel können einstückig mit der Vorrichtung sein oder sie können als eine gesonderte Komponente davon zum Einsetzen in die Vorrichtung vor, während oder nach dem Anordnen des Filters in Kontakt mit dem flüssigen Medium vorgesehen sein. Das Samenfäden-Detektionsfilter kann analoge Charakteristika zu dem Probentrennfilter aufweisen.
Die Filter können eine Dicke von 100-2000 um, vorzugsweise 200-1000 um, und noch bevorzugter 400-800 um aufweisen. Beispielsweise können die Filter eine Dicke von etwa 600 um besitzen. Die minimale Teilchenrückhaltegröße der Filter kann 5-100 um, vorzugsweise 8-60 um, und noch bevorzugter 10-40 um betragen. Die Filter können faserig sein, beispielsweise aus Glaswolle oder aus Polypropylen gefertigt sein, oder sie können eine Gel- oder eine Schaumkonstruktion aufweisen. Für Gel- oder Schaumkonstruktionen, welche nicht selbsttragend sind, kann ein darunterliegendes Gitternetz bzw. eine -matrix oder ein anderer Träger zur Verfügung gestellt sein. Ein insbesondere bevorzugtes Filter ist ein Glasfaserfilter, welches ein Bindemittel, wie einen Acrylester, enthalten kann. Es wird geschätzt, daß die Verwendung eines Gels als das Filter das Erfordernis zur Zufuhr von Flüssigkeit zu der gegenüberliegenden Oberfläche vermeiden kann, da das Gel selbst als ein geeignetes Mittel zum Erreichen desselben wirkt. Bevorzugte Gele sind Hyaluronsäure und Methylzellulose.
Ein Reagens oder eine Kombination von Reagenzien kann in den Spermatozoen- bzw. Samenfäden-Detektionsmitteln angeordnet sein, welche direkt oder indirekt fähig sind, ein visuelles Signal bei einer Wechselwirkung mit Samenfäden zu generieren. Dieses Reagens oder diese Kombination von Reagenzien kann Antikörper umfassen, welche ein Antigen feststellen bzw. nachweisen, das auf Spermatozoen vorhanden ist und/oder fähig sein kann, Samenfäden zu binden. Samenfäden, welche durch derartige Antikörper immobilisiert sind, können visuell unter Verwendung eines visuell detektierbaren Reagens, welches sich an Samenfäden bindet, detektiert werden. Antikörper für CD59, wie sie in WO 99/66331 diskutiert sind, wurden als für diesen Zweck geeignet befunden.
Ein Samenfäden chemisch anziehendes Material bzw. ein chemischer Lockstoff für Samenfäden, wie Follikelfluid, wie dies in WO 99/66331 identifiziert ist, kann in den Samenfäden-Nachweismitteln angeordnet sein. Derartige Samenfäden chemisch anziehende Mittel sind vorzugsweise in einem Bereich der Samenfäden-Detektionsmittel distal von dem Probentrennfilter angeordnet.
Eine Aufnahmezone kann entweder in dem Probentrennfilter oder den Samenfäden-Detektionsmitteln angeordnet sein, welche Aufnahmezone eine Reagens oder eine Kombination von Reagenzien umfaßt, welche(s) fähig ist (sind), sich an Samenfäden zu binden und damit durch das (die) Filter zu einem Detektionsbereich der Samenfäden-Detektionsmitteln transportiert zu werden. Das Reagens oder die Kombination von Reagenzien der Aufnahmezone kann (können) Antikörper umfassen, welche ein Antigen detektieren, das an Samenfäden vorhanden ist. Diese Antikörper können detektierbar markiert sein, beispielsweise mit Goldteilchen.
Die Antikörper, welche in dem Detektionsbereich der Samenfäden-Detektionsmittel angeordnet sind, können dasselbe oder ein verschiedenes Samenfäden-Antigen von denjenigen erkennen, die in der Aufnahmezone angeordnet sind.
Die Samenfäden-Detektionsmittel können ein Spermatozoen- Akrosom lysierendes Reagens und ein Mittel zum Feststellen bzw. Detektieren einer pH-Änderung umfassen. Das Spermatozoen-Akrosom lysierende Reagens ist typischerweise ein Lysis-Puffer bzw. Auflösepuffer und kann Proteinase K oder das Calciumionophor A24297 umfassen. Die Mittel zum Detektieren einer pH-Änderung können eine pH-empfindliche Probe oder ein pH-Indikatorreagens sein, das fähig ist, visuell eine pH-Änderung zu detektieren, beispielsweise Bromkresolpurpur.
Die probenempfangende Oberfläche des Probentrennfilters kann ein enzymatisches Verflüssigungsagens, wie Chymotrypsin, enthalten, welches fähig ist, eine Samenverflüssigung zu bewirken.
Die Erfindung stellt auch einen Testbausatz für männliche Fruchtbarkeit zur Verfügung, umfassend eine Vorrichtung, wie sie oben beschrieben ist, wobei der Bausatz weiters einen Flüssigkeitsfreisetzungsmechanismus umfaßt, worin nach Aktivierung des Flüssigkeitsfreisetzungsmechanismus Flüssigkeit aus einer Flüssigkeitszufuhr auf die gegenüberliegende Oberfläche des Samentrennfilters aufgebracht wird, um eine Flüssigkeitskommunikation mit einem Samenfäden-Detektionsmittel zur Verfügung zu stellen.
Die Samenfäden-Detektionsmittel können einstückig mit der Vorrichtung vorliegen bzw. sein oder sie können als eine gesonderte oder abtrennbare Komponente des Bausatzes zur Verfügung gestellt sein.
Der Bausatz kann eine integrale bzw. einstückige Flüssigkeitszufuhr umfassen oder es kann eine externe Flüssigkeitszufuhr verwendet werden. Es wird erkannt werden, daß die Flüssigkeit eine sein muß, in welcher bewegliche Samenfäden für einen ausreichenden Zeitraum beweglich bleiben, um in die Samenfäden-Detektionsmittel zu migrieren bzw. zu wandern, d. h. die Flüssigkeit ist allgemein nicht toxisch gegenüber Spermatozoen bzw. Samenfäden. Jedoch kann die Flüssigkeit derart sein, daß sie eine Toxizität gegenüber Spermatozoen aufweist, welche ausreichend niedrig ist, daß ausreichend Samenfäden erfolgreich die Detektionsmittel erreichen. Diese Flüssigkeit ist vorzugsweise ein Puffer, wie eine Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder Earle's Balanced Salt Solution (EBSS), wie sie in WO 99/66331 beschrieben ist.
Es wird erkannt werden, daß, wo ein auf Gel basierendes Filter verwendet wird, das Gel als seine eigene Flüssigkeitszufuhr wirken kann. Es kann jedoch wünschenswert sein, Flüssigkeit zu der gegenüberliegenden Oberfläche eines auf Gel basierenden Filters zuzuleiten, beispielsweise um eine Probe nach einer Trennung durch das Filter zu verdünnen.
Der Bausatz kann zwei oder mehrere trennbare Komponenten umfassen, beispielsweise die Vorrichtung und eine Basiseinheit für die Vorrichtung, die mit dieser in Eingriff bringbar ist. Die Aufbringung der Vorrichtung auf die Basiseinheit kann adaptiert sein, um den Flüssigkeitsfreisetzungsmechanismus zu aktivieren, wobei das Samenfäden-Detektionsfilter und Probentrennmittel befeuchtet werden. Alternativ kann eine Knopf- bzw. Tastenfreisetzung für die Flüssigkeit zur Verfügung gestellt sein. Das Befeuchten bzw. Benetzen des Samenfäden-Detektionsfilters kann die Detektionsagentien, die auf die Samenfäden-Detektionsmittel aufgebracht sind, aktivieren.
Ein Überlaufbehälter zum Sammeln von überschüssiger Flüssigkeit, die auf die Vorrichtung nach Aktivierung des Flüssigkeitsfreisetzungsmechanismus aufgebracht wurde, kann vorgesehen sein.
Die Flüssigkeitszufuhr kann ein zerbrechliches Kompartment bzw. Abteil oder einen Bereich umfassen, worin der Flüssigkeitsfreisetzungsmechanismus das Abteil zum Freisetzen der darin enthaltenen Flüssigkeit zerbricht. Die hiebei freigesetzte Flüssigkeit kann dann über eine Rampe zu einer Vertiefung, die zwischen der Vorrichtung und einem Basisbereich des Bausatzes ausgebildet ist, kanalisiert werden. Das Abteil kann durch einen Flüssigkeitsfreisetzungsmechanismus in Form eines Stanz- bzw. Durchbohrungsmechanismus durchbohrbar sein, welcher beispielsweise durch einen Stop bzw. Anschlag zurückgehalten ist, wobei der Stop verhindert, daß der Durchbohrungsmechanismus das Abteil durchstößt, bis es durch einen Verwender aktiviert wird.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Detektieren der Anwesenheit von beweglichem Sperma in einer Probe zur Verfügung, umfassend die Schritte eines Bereitstellens eines Filters, das erste und zweite Oberflächen bzw. Flächen aufweist, wobei das Filter eine Wanderung von beweglichem Sperma dadurch erlaubt, wenn eine Flüssigkeit auf die zweite Oberfläche aufgebracht wird, eines Aufbringens der Probe auf die erste Oberfläche, eines Aufbringens einer Flüssigkeit auf die zweite Oberfläche und eines Detektierens bzw. Nachweisens von Sperma, das durch das Filter gewandert ist. Die Probe kann eine Mischung, umfassend bewegliche und nicht-bewegliche Spermatozoen sein. Das Filter kann das Filter sein, das in der Vorrichtung oder dem Bausatz, wie sie (er) oben beschrieben wurde, enthalten ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt einen Bausatz in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung vor einem Aufbringen eines Behälters auf eine Basiseinheit. Fig. 2 zeigt den Bausatz von Fig. 1 mit einem Überlauf nach Aufbringen des Behälters auf die Basiseinheit. Fig. 3 zeigt eine alternative Ausbildung, in welcher die Nachweis- bzw. Detektionsmittel eine trennbare Komponente des Bausatzes sind.

Arten der Ausführung der Erfindung

Ein Bausatz 10 zum Testen der männlichen Fruchtbarkeit ist in Fig. 1 und 2 gezeigt. Der Bausatz umfaßt einen Behälter 12, eine Basiseinheit 14, eine Flüssigkeitszufuhr 16, enthaltend Flüssigkeit 18, und zwei Filter 20, 22.
Das erste Filter 20 ist ein Probentrennfilter 20, welches ein Hindernis für den Übertrag bzw. Durchgang von Spermatozoen aufgrund der Zusammensetzung und der Konstruktion desselben darstellt. Beispielsweise wird das Filter an einer probenempfangenden Oberfläche desselben im wesentlichen Samenfluid und nicht-bewegliche Samenfäden, die in der darauf abgeschiedenen Probe enthalten sind, zurückhalten. Dies kann beispielsweise aufgrund der Porengröße des Filters stattfinden. Nicht-bewegliche Spermatozoen werden nicht durch das Filter hindurchtreten. Wenn jedoch die Samenfäden beweglich sind, werden sie fähig sein, durch das Filter "zu schwimmen".
Der Kopf eines menschlichen Samens ist typischerweise 3-5 um im Durchmesser und die Schwanzlänge ist etwa 50-60 um. Das Filter sollte derart sein, daß diese Samenfäden durch das Filter nach Anwenden bzw. Aufbringen der Flüssigkeit auf der gegenüberliegenden Oberfläche durchschwimmen können. Geeignete Filtermaterialien können durch eine Serie von einfachen Experimenten identifiziert werden.

Experiment 1: Die Bewertung von Spermatoxizität.

Ein aufschwimmender Anteil von einer Samenprobe wird hergestellt (Practical Laboratory Andrology - David Mortimer, Seite 272) und die resultierende Präparation von beweglichen Samenfäden wird für die Bewertung der Spermatoxizität des Filters verwendet. Ein 2 cm mal 2 cm Quadrat des Filters wird in 2 mm mal 1 cm Streifen zerschnitten. 3 · 1 ml Aliquote der frisch hergestellten beweglichen Proben werden zu Rundbodenröhrchen zugefügt (z. B. Falcon Nr. 2001 oder 2037), die mit Doppel A, Doppel B und Vergleich C markiert sind. 10 der dünnen Streifen des Filters werden in jedes der Duplikate von A und B eingebracht. A, B und C werden dann bei 37ºC für 1 h unter häufigem Schütteln inkubiert. Die Bewertung der Spermabeweglichkeit und/oder Spermalebensfähigkeit wird dann (Practical Laboratory Andrology, Seiten 49-50 für die Beweglichkeit und Seiten 66-69 für die Lebensfähigkeit) an beiden Duplikaten und dem Vergleich durchgeführt. Ein merkbarer oder bemerkenswerter Unterschied in der Spermabeweglichkeit und -lebensfähigkeit zwischen den das Filter enthaltenden Proben und dem Vergleich zeigt an, daß das Filter gegenüber Sperma toxisch ist.

Experiment 2: Die Auswertung von Sperma-"Dochtwirkung" durch ein Filter.

200 ul verflüssigter Samen werden in einem Rundbodenröhrchen angeordnet. Ein 0,5 cm mal 4 cm Streifen Filter wird dann in die Samenprobe derart eingebracht, daß nur die unteren 1-2 mm des Filters in direktem Kontakt mit der Samenprobe sind. In einigen Filtern wird sich die Samenprobe durch Kapillarwirkung oder "Dochtwirkung" des Filters bewegen, wobei bewegliche und nicht-bewegliche Spermatozoen mitgenommen werden, wodurch die Trennung ungültig bzw. unmöglich wird. Das Ausmaß der Dochtwirkung in einem angegeben Zeitrahmen, z. B. 15 min. kann durch Entfernen des Filters aus der Samenprobe und Analysieren derselben mit Lichtmikroskopie von 2 mm Segmenten des Filters auf die Anwesenheit von Spermatozoen bestimmt werden. Um eine effektive Trenneinrichtung von beweglichen Spermatozoen aus einer Mischung von beweglichem und nicht-beweglichem Sperma zu sein, sollte das Ausmaß der Dochtwirkung in dem Filter (in dem Zeitrahmen, welchen die Probe auf dem Filter vor der Detektion bzw. dem Nachweis oder Sammlung der filtrierten, beweglichen Spermien belassen wurde) geringer als die Dicke des Filters sein.

Experiment 3: Effizienz eines Filters, um den Durchgang von toten oder nicht-mobilen Spermatozoen zu verhindern.

Eine Probe von totem oder immobilisiertem Sperma wird entweder durch Erhitzen einer Samenprobe auf 95ºC in einem Wasserbad oder durch Zusetzen von 10% Cyanidlösung erhalten. 200 ul der toten oder immobilisierten Samenprobe wird auf die obere Oberfläche des Filters aufgebracht, wobei die Unterseite des Filters in direkter Wechselwirkung mit 1 ml EBSS ist. Nach 5, 10, 15 oder 30 min Intervallen wird ein 10 ul Aliquot des Filtrats entfernt und unter Lichtmikroskopie in bezug auf die Anwesenheit von Spermatozoen überprüft. Ein effizientes Filter wird einen Durchgang von toten oder immobilen Spermatozoen für den Zeitraum, welchen die Samenprobe in Kontakt mit der Oberfläche des Filters verbleiben muß, nicht zulassen.

Experiment 4: Effizienz eines Filters, um den selektiven Durchgang von beweglichen Spermatozoen zu erlauben.

Eine Bewertung der feuchten Zubereitung einer Samenprobe wird durchgeführt (Practical Laboratory Andrology, Seiten 49-50) und die Charakteristika notiert. 250 ul der Samenprobe werden auf die obere Oberfläche des Filters aufgebracht, wobei die Unterseite des Filters in direkter Wechselwirkung mit 1 ml EBSS ist. Nach 5, 10, 15 und 30 min Intervallen wird ein 10 ul Aliquot des Filtrats entfernt und unter Lichtmikroskopie in bezug auf die Anwesenheit von beweglichen Spermatozoen überprüft und das Verhältnis von beweglichen gegenüber nicht-beweglichen Spermatozoen in dem Filtrat mit der ursprünglichen Probe verglichen. Ein effizientes Filter sollte den Durchgang von beweglichen Spermatozoen erlauben. Beispielsweise sollte, wenn die ursprüngliche Samenprobe eine Beweglichkeit von 40% aufwies (d. h. 60% der Spermatozoen sind nicht beweglich), das Filtrat vorzugsweise eine Beweglichkeit von wenigstens 90% aufweisen, wobei weniger als 10% nicht beweglich sind.
Das zweite Filter 22 des Bausatzes ist ein Spermatozoen-Detektionsfilter 22 bzw. Filter zum Nachweisen bzw. Feststellen von Spermatozoen. Das Spermatozoen-Detektionsfilter 22 bildet eine Nachweis- bzw. Detektionszone 26 für die Spermatozoen, welche durch das Probentrennfilter 20 wandern können. Die Detektionszone 26 ist innerhalb des Samenfäden- Detektionsfilters 22 zur Verfügung gestellt und umfaßt ein Reagens, das fähig ist, ein Signal nach bzw. bei Wechselwirkung mit Samenfäden zu generieren. Jedoch ist ein Spalt 24 zwischen den zwei Filtern 20 und 22 ausgebildet, um eine Aktivierung des Bausatzes bis zu dem Zeitpunkt zu verhindern, bei welchem ein Transportmedium, beispielsweise die Flüssigkeit 18 in der Flüssigkeitszufuhr 16, zugeführt wurde, um den Spalt 24 anzufüllen, um es den Samenfäden zu ermöglichen, daß sie in die Detektionszone 26 übertragen werden, und somit der Fruchtbarkeitstest mit dem Bausatz durchgeführt wird.
Die Zusammensetzung und Konstruktion von geeigneten Filtern 20, 22 und der Detektionszone 26 kann derart, wie hier beschrieben, sein oder derart, wie dies in weiterem Detail im Stand der Technik beschrieben ist. Jedoch sind bevorzugte Zusammensetzungen und Konstruktionen, wie in der WO 99/66331 beschrieben. Ein insbesondere bevorzugtes Filtermaterial ist als Filter 4622 identifiziert, das von Ahlstrom Filtration, Inc., 122 W. Butler Street, PO Box A, Mt. Holly Springs, PA 17065-0238, USA, erhältlich ist. Es umfaßt eine Mikroglasfaser mit einem acrylischen Bindemittel. Das Acryllatex ist eine anionische Dispersion von Acrylatpolymeren und Copolymeren in einer Wasserbasis. Diese Polymere basieren auf Acrylestern. Die Porengröße ist 20 um und die Dicke beträgt 580 um.
Der Behälter 12 weist einen kreisförmigen Querschnitt mit einer Seitenwand 28, eine offene Oberseite 30, eine ringförmige Basis 32 und einer offene Düse 34 auf, die auf der ringförmigen Basis 32 ausgebildet ist. Das Samenfäden-Detektionsfilter 22 ist innerhalb der Düse 34 vorgesehen. Ein Deckel (nicht dargestellt) kann auf der offenen Oberseite 30 angeordnet sein, um eine sterile Umgebung innerhalb des Behälters 12 aufrecht zu erhalten. Der Deckel über der offenen Oberseite 30 müßte für die Aufbringung einer Probe in den Behälter 12 entfernt werden.
Die Basiseinheit 14 umfaßt die Flüssigkeitszufuhr 16, einen Flüssigkeitsfreisetzungsmechanismus 36 und eine Vertiefung 38. Die Vertiefung 38 umfaßt ein Loch 40, das für die Aufnahme der Düse 34 adaptiert ist. Das Loch 40 kann ein Fenster (nicht dargestellt), das darin für eine Inspektion der Nachweis- bzw. Detektionszone 26 nach Aktivierung des Bausatzes 10 vorgesehen ist, aufweisen. Die Basiseinheit 14 umfaßt weiters eine Rampe 42, um Flüssigkeit 18 von der Flüssigkeitszufuhr 16 in die Vertiefung 38 zu kanalisieren, und einen Überlauf 44, um überschüssige Flüssigkeit 18, die in der Vertiefung 38 aus der Flüssigkeitszufuhr 16 vorgesehen ist, zu sammeln.
Der Flüssigkeitsfreisetzungsmechanismus 36 ist in der Form eines Durchstechelements 37 ausgebildet, das adaptiert ist, um durch Aufbringung des Behälters 12 auf der Basiseinheit 14 aktiviert zu werden. Vor einer Aktivierung des Durchstechelements 37 wird das Durchstechelement 37 durch einen Anschlag bzw. Stop 48 zurückgehalten. Eine Aufbringung des Behälters 12 zieht das Durchstechelement 37 über den Stop 48. Ein zerbrechlicher Bereich kann für die Flüssigkeitszufuhr 16 vorgesehen sein, um diese mit dem Durchstechelement 37 zu punktieren, wenn er über den Stop 48 gezogen wurde. Dieser zerbrechliche Bereich kann einen Wandbereich mit einer dünnen Folie umfassen.

Experiment 5: Trennung von beweglichen Samenfäden unter Verwendung von Gelfiltern.

Verschiedene, gelartige Filter können für die Samenfäden- Trennung verwendet werden. Die Gelmedien wurden von Sigma- Aldrich oder Pharmacia-Upjohn erhalten und wurden in EBSS (Gibco-BRL) resuspendiert. Vier verschiedene Hyaluronsäuregele und ein Methylzellulosegel wurden untersucht.
Abgeflachte Glaskapillarröhrchen (Camlab) mit Abmessungen von 1,2 · 4,8 mm und einem Innendurchmesser-Sichtweg von 0,4 mm wurden mit den resuspendierten Medien befüllt und an einem Ende abgedichtet. Das offene Ende des Röhrchens wurde in ein 1,5 ml Mikrofugenröhrchen, enthaltend 100 ul oder 200 ul verflüssigten Samen, angeordnet. Sperma wurde in das Gel für 30 min bei Raumtemperatur wandern gelassen und das Röhrchen wurde gereinigt und unter dem Mikroskop beobachtet.
Die Anzahl der Spermatozoen in 1 cm Abständen von dem offenen Ende des Röhrchens wurden aufgezeichnet, um das Eindringen und die Migration in die verschiedenen Gele zu bestimmen. Die Anzahl von Spermatozoen pro Gesichtsfeld unter Verwendung von x10- oder x20-Objektiven und einem x10-Okular, um eine Endvergrößerung von x100 oder x200 zu ergeben, wurden auf einem Olympus BH-2 Mikroskop gezählt. Der bei 100-facher Vergrößerung beobachtete Bereich war 0,785 mm²; bei 200-facher Vergrößerung war die Fläche 0,196 mm².
Die Ergebnisse für die vier Hyaluronsäure-Produkte waren wie folgt:
Die Ergebnisse für Methylzellulose bei einer Viskosität von 15 cp waren wie folgt:
Die Ergebnisse für Methylzellulose bei einer Viskosität von 4000 cp waren wie folgt:
* - Diese zwei Messungen wurden 0,25 cm vom offenen Ende entfernt aufgenommen.
Es ist daher offensichtlich, daß Gele als Filter verwendet werden können, um bewegliches Sperma aus einer Probe, enthaltend Spermatozoen, abzutrennen.
Ein Verfahren zur Durchführung eines männlichen Fruchtbarkeitstests mit dem oben beschriebenen Bausatz bzw. der oben beschriebenen Vorrichtung wird nun beschrieben.
Eine Probe von Samenfluid 46 oder Ejakulat wird in einem nicht-benutzten oder rezyklierten Behälter 12 durch die offene Oberseite 30 und auf das Probentrennfilter 20 eingebracht. Die Probe kann beispielsweise durch direktes Aufbringen durch den Benutzer oder durch eine Pipettenapplikation aus einer Ejakulatsamenprobe aufgebracht werden. Der dafür verwendete Behälter 12 wird dann auf eine nicht-benutzte oder rezyklierte Basiseinheit 14, welche eine Frischflüssigkeitszufuhr 16 aufweist, aufgebracht, so daß die Düse 34 des Behälters 12 in das Loch 40 der Basiseinheit 14 eingesetzt ist. Während der Aufbringung des Behälters 12 auf die Basiseinheit 14 aktiviert die Seitenwand 28 des Behälters 12 das Durchstechelement 37, um die Flüssigkeitszufuhr 16, wie dies in Fig. 2 gezeigt ist, zu punktieren, in welcher das Durchstechelement 37 durch den zerbrechlichen Bereich der Flüssigkeitszufuhr 16 gestochen wurde. Alternativ kann ein Durchstechknopf 50, siehe Fig. 3, verwendet werden, um die Flüssigkeitszufuhr 16 zu durchstechen.
Nach Durchstechen der Flüssigkeitszufuhr 16 wird die in der Flüssigkeitszufuhr 16 enthaltene Flüssigkeit 18 über die Rampe 42 in die Vertiefung 38 kanalisiert, füllt das Loch und die Vertiefung 38 mit Flüssigkeit 18, wobei die Flüssigkeit 18 auch durch die Düse 34 des Behälters 12 tritt, welche innerhalb des Lochs 40 der Basiseinheit 14 angeordnet ist. Dadurch tritt die Flüssigkeit durch das Samenfäden-Detektionsfilter 22, um den Spalt 24 zwischen den zwei Filtern 20, 22 mit der Flüssigkeit 18 zu befüllen.
Überschüssige Flüssigkeit 18 strömt über die Vertiefung 38 und wird durch den Überlauf 44 gesammelt.
Die Flüssigkeit 18 wirkt als ein Transportmedium für Samenfäden, welche durch das Probentrennfilter 20 gewandert sind, um es den Samenfäden zu erlauben, über das Samentrennfilter 20 zu dem Samenfäden-Detektionsfilter 22 zu wandern, so daß sie durch die Nachweis- bzw. Detektionszone 26 in dem Samenfäden-Detektionsfilter 22 detektiert werden können. Nach Detektion bzw. Feststellung der Samenfäden in der Detektionszone 26 wird ein Signal durch das dafür vorgesehene Reagens produziert, worin die Anwesenheit von beweglichen Samenfäden nachgewiesen wird. In der Abwesenheit von beweglichen Samenfäden in der Probe werden keine Spermatozoen die Detektionszone 26 erreichen, da nicht- bewegliche Samenfäden oder Samenfäden mit reduzierter Beweglichkeit nicht durch das Probentrennfilter 20 hindurchtreten werden.
Der Bausatz 10 von Fig. 3 ist eine alternative Ausbildung der vorliegenden Erfindung. Er hat eine offene Oberseite 30, die ein Probentrennfilter 20, wie oben beschrieben, freilegt. Eine Probe 46 ist auf dem Probentrennfilter 20 auf einer Probenaufnahmefläche desselben abgeschieden gezeigt.
Die Seitenwand 28 des Bausatzes 10 definiert eine Vertiefung 38. Eine Flüssigkeitszufuhr 16 ist einstückig mit dem Bausatz 10, benachbart der Vertiefung 38, vorgesehen, wobei die Flüssigkeitszufuhr 16 Flüssigkeit 18 enthält und einen zerbrechlichen Bereich 60 an einem Umfang derselben aufweist, um die Flüssigkeitszufuhr 16 von der Vertiefung 38 vor der Aktivierung des Bausatzes 10 zu trennen. Ein Samenfäden-Detektionsfilter 22 ist an einem Gleitelement 56 vorgesehen, welches gleitbar an dem Bausatz 10 festgelegt sein kann, oder es kann als eine gesonderte Komponente des Bausatzes vorgesehen sein kann, die durch eine abdichtbare Öffnung 58 in der Seitenwand 28 einsetzbar ist, um eine Detektion bzw. Feststellung der Samenfäden innerhalb der Vertiefung 38 durchzuführen.
Der Flüssigkeitsfreisetzungsmechanismus umfaßt einen Durchstechknopf 50 und ein Durchstechelement bzw. -glied 37. Der Durchstechknopf 50 ist in eine Nichtdurchstech-Position durch eine Feder 52 vorgespannt. Ein Drücken des Durchstechknopfs treibt das Durchstechelement 37 durch den zerbrechlichen Bereich 60 der Flüssigkeitszufuhr, wodurch ermöglicht wird, daß in der Flüssigkeitszufuhr 16 enthaltene Flüssigkeit 18 in die Vertiefung 38 fließt.
Alternativ könnte das Schiebe- bzw. Gleitelement 56 adaptiert sein, um die Flüssigkeit 18 innerhalb der Flüssigkeitszufuhr 16 automatisch nach Einsetzen derselben in die Vertiefung 38 freizugeben, beispielsweise indem ein Durchstechelement darauf vorgesehen ist, welches den zerbrechlichen Bereich 60 der Flüssigkeitszufuhr 16 durchstechen würde.
Eine transparente Scheibe bzw. ein Fenster 54 ist in der Seitenwand 28 der Vertiefung 38 vorgesehen, um eine Inspektion der Detektionszone 26, die in dem Spermatozoen-Detektionsfilter enthalten ist, durchzuführen. Jedoch kann die Seitenwand 28 aus einem transparenten Material hergestellt sein, wodurch das Erfordernis für das Fenster 54 vermieden wird.
Das Prinzip der Verwendung des Bausatzes 10 von Fig. 3 ist analog zu jenem der Ausbildung von Fig. 1 und 2. Jedoch kann die Flüssigkeit 18 in die Vertiefung vor, während oder nach dem Einsetzen des Spermatozoen-Detektionsfilters innerhalb der Vertiefung freigegeben werden.

Claims

1. Vorrichtung zum Trennen von beweglichen Samenfäden bzw. Spermatozoen von nicht-beweglichen Samenfäden bzw. Spermatozoen in einer flüssigen Probe, wobei die Vorrichtung aufweist: (i) einen Behälter bzw. ein Gefäß mit einem eine Probe aufnehmenden Einlaß, einem Auslaß für eine gefilterte Probe und einem dazwischen angeordneten Probentrennfilter, wobei das Probentrennfilter eine eine Probe aufnehmende Oberfläche bzw. Fläche und eine entgegengesetzte bzw. gegenüberliegende Oberfläche bzw. Fläche aufweist und wobei das Probentrennfilter wirksam ist, um ein Strömen bzw. Fließen der Probe durch dieses zu verhindern, jedoch einen Durchlass von beweglichen Spermatozoen durch dieses erlaubt, wenn die gegenüberliegende Fläche des Probentrennfilters in Berührung mit einem flüssigen Medium plaziert bzw. angeordnet ist, und (ii) ein Mittel bzw. eine Einrichtung zum Zuführen einer Flüssigkeit zu der gegenüberliegenden Fläche des Filters.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der das Probentrennfilter eine Ausbildung als Gel oder Schaum aufweist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der das Filter faserig ist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, bei der das faserige Filter aus Glaswolle oder aus Polypropylen hergestellt ist.

5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die an der Auslaßseite des Probentrennfilters und von diesem beabstandet ein Mittel bzw. eine Einrichtung zur Feststellung bzw. zum Nachweis von Spermatozoen aufweist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, bei der die Einrichtung zur Feststellung mit der Vorrichtung einstückig ist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 5, bei der die Einrichtung zur Feststellung ein abnehmbares bzw. trennbares Bauteil der Vorrichtung ist, um es in die Vorrichtung vor, während oder nach dem Anordnen des Probentrennfilters in Berührung mit dem flüssigen Medium einzubringen bzw. einzusetzen.

8. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das Filter eine Stärke bzw. eine Dicke von 100 bis 2000 um aufweist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, bei der das Filter eine Dicke von 200-1000 um, vorzugsweise 400-800 um, noch mehr bevorzugt 600 um aufweist.

10. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das Filter eine minimale Teilchenrückhalte- bzw. Teilchenretentionsgröße von 5-100 um, vorzugsweise 8-60 um, noch mehr bevorzugt 10-40 um aufweist.

11. Vorrichtung nach Anspruch 2 oder nach einem der Ansprüche 5 bis 10, bei der die Vorrichtung ein darunterliegendes Gitternetz bzw. -matrix bzw. einen darunterliegenden Gitterrost zum Abstützen des Filters aufweist.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 11, bei der ein Reagens oder eine Kombination von Reagenzien, das oder die unmittelbar oder mittelbar dazu befähigt ist bzw. sind, ein visuelles bzw. sichtbares Signal bei Wechselwirkung mit Spermatozoen zu erzeugen, in der Einrichtung zur Feststellung von Spermatozoen angeordnet ist bzw. sind.

13. Vorrichtung nach Anspruch 12, bei der das Reagens oder die Kombination von Reagenzien Antikörper enthält, die ein Antigen feststellen bzw. nachweisen, das bei den Spermatozoen vorhanden ist, und dazu befähigt sind, Spermatozoen zu binden.

14. Vorrichtung nach Anspruch 13, bei der Spermatozoen, wenn sie durch die Antikörper immobilisiert bzw. trägerfixiert sind, unter Verwendung eines visuell feststellbaren Reagens visuell festgestellt werden können, das sich an die Spermatozoen bindet.

15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 14, bei der ein chemisches Attraktanz bzw. ein chemischer Lockstoff für Spermatozoen in der Einrichtung zur Feststellung von Spermatozoen angeordnet ist.

16. Vorrichtung nach Anspruch 15, bei der der chemische Lockstoff für Spermatozoen in einem Bereich der Einrichtung zur Feststellung von Spermatozoen angeordnet ist, der von dem Probentrennfilter distal ist bzw. entfernt liegt.

17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 17, bei der eine Auffang- bzw. Aufnahmezone entweder in dem Probentrennfilter oder in der Einrichtung zur Feststellung von Spermatozoen angeordnet ist, wobei diese Aufnahmezone ein Reagens oder eine Kombination von Reagenzien aufweist, das oder die dazu befähigt ist bzw. sind, sich an Spermatozoen zu binden und mit diesen in einen Feststellungs- bzw. Nachweisbereich der Einrichtung zur Feststellung bzw. zum Nachweis von Spermatozoen transportiert bzw. überführt zu werden.

18. Vorrichtung nach Anspruch 17, bei der das Reagens oder die Kombination von Reagenzien der Aufnahmezone Antikörper enthalten, die ein bei den Spermatozoen vorhandenes Antigen feststellen bzw. nachweisen.

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, bei der die Antikörper, die ein bei den Spermatozoen vorhandenes Antigen feststellen bzw. nachweisen, feststellbar bzw. nachweisbar markiert bzw. gelabelt sind.

20. Vorrichtung nach Anspruch 19, bei der die Antikörper, die ein bei den Spermatozoen vorhandenes Antigen feststellen bzw. nachweisen, mit Goldteilchen bzw. -partikeln feststellbar bzw. nachweisbar markiert sind.

21. Vorrichtung nach Anspruch 18, Anspruch 19 oder Anspruch 20, bei der die Antikörper, die in einem Feststellungs- bzw. Nachweisbereich der Einrichtung zur Feststellung bzw. zum Nachweis von Spermatozoen angeordnet sind, ein unterschiedliches Spermatozoen-Antigen erkennen, verglichen mit den in der Aufnahmezone angeordneten Antikörpern.

22. Vorrichtung nach Anspruch 18, Anspruch 19 oder Anspruch 20, bei der die Antikörper, die in einem Feststellungs- bzw. Nachweisbereich der Einrichtung zur Feststellung bzw. zum Nachweis von Spermatozoen angeordnet sind, dasselbe Spermatozoen-Antigen wie die in der Aufnahmezone angeordneten Antikörper erkennen.

23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 22, bei der die Einrichtung zur Feststellung bzw. zum Nachweis von Spermatozoen ein ein Spermatozoen- Akrosom lysierendes bzw. auflösendes Reagens und ein Mittel bzw. eine Einrichtung zum Feststellen bzw. Nachweisen einer pH-Änderung aufweist.

24. Vorrichtung nach Anspruch 23, bei der das ein Spermatozoen-Akrosom lysierendes Reagens ein Lysis-Puffer ist.

25. Vorrichtung nach Anspruch 24, bei der der Lysis-Puffer Proteinase K oder das Calciumionophor A24297 aufweist.

26. Vorrichtung nach Anspruch 23, Anspruch 24 oder Anspruch 25, bei der die Einrichtung zum Feststellen bzw. Nachweisen einer pH-Änderung eine pH- empfindliche Sonde ist.

27. Vorrichtung nach Anspruch 23, Anspruch 24 oder Anspruch 25, bei der die Einrichtung zum Feststellen bzw. Nachweisen einer pH-Änderung ein pH- Indikatorreagens ist, das dazu befähigt ist, eine pH-Änderung visuell festzustellen bzw. nachzuweisen.

28. Vorrichtung nach Anspruch 27, bei der das pH-Indikatorreagens ein Bromkresolpurpur ist.

29. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Probenaufnahmefläche des Probentrennfilters ein enzymatisches Verflüssigungsagens bzw. -mittel enthält.

30. Verfahren zum Feststellen bzw. Nachweisen des Vorhandenseins von beweglichem Samen bzw. Sperma in einer Probe, aufweisend:

(a) Bereitstellen eines Filters mit einer ersten Oberfläche bzw. Fläche und einer zweiten Oberfläche bzw. Fläche, wobei das Filter eine Migration bzw. Wanderung bzw. Durchtreten des beweglichen Spermas durch das Filter erlaubt, wenn eine Flüssigkeit auf die zweite Fläche aufgebracht ist, und wobei das Filter das Filter ist, das in der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 29 enthalten ist,

(b) Aufbringen der Probe auf die erste Fläche,

(c) Aufbringen einer Flüssigkeit auf die zweite Fläche und

(d) Feststellen bzw. Nachweisen von Sperma, das durch das Filter durchgetreten ist.