DE69834422T2

DE69834422T2 - Klonierungsverfahren durch multiple verdauung

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Publication number: DE69834422T2
Application number: DE69834422T
Authority: DE
Inventors: Marc Delcourt
Original assignee: Biomethodes SA
Current assignee: Biomethodes SA
Priority date: 1997-12-04
Filing date: 1998-12-04
Publication date: 2007-04-19
Anticipated expiration: 2018-12-05
Also published as: FR2772048A1; DE69834422D1; JP2001525169A; WO1999028451A1; EP1034259B1; FR2772048B1; ATE325189T1; CA2312029A1; EP1034259A1; AU1491499A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie, und insbesondere die Klonierung von Genen.
Die Klonierung von Genen ist ein in voller Entwicklung befindliches Gebiet, das insbesondere auf die Zuordnung zwischen Funktionen und Genen abzielt. Dieses Gebiet entwickelt sich hauptsächlich auf zwei großen Zweigen, nämlich zum einen dem der inversen Molekularbiologie, die darauf basiert, in großem Stil genomische oder komplementäre DNA-Banken zu sequenzieren, und zum anderen die unmittelbare Molekularbiologie, die darauf basiert, die Sequenz zu finden, die für eine beobachtete Aktivität verantwortlich ist, beispielsweise eine enzymatische Aktivität oder eine Homologie mit sonstigen Genen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es insbesondere, ein im Folgenden auch als DMD für "Differentielle multiple Digestion" bezeichnetes neues Verfahren zum Klonieren eines Nucleinsäurefragments vorzuschlagen, wobei das Verfahren auf der systematischen, kombinierten und präparativen Nutzung von auf den Inserten vorhanden Restriktionsstellen beruht, die eine komplementäre oder genomische DNA-Bank bilden.
Die DMD lässt sich insbesondere für das Screening von Expressionsbanken und die Klonierung mittels Homologie anwenden.
Die vorliegende Erfindung findet ferner Anwendung auf dem arbeitsintensiven Gebiet der Sequenzierung, wo diese keinerlei Aktivität zur Identifizierung von Inserten aufweist, sowie in der Erforschung des menschlichen Polymorphismus, insbesondere auf dem Gebiet der Erforschung der genetischen Anlagen.
Der Artikel von Galli und seinem Team (Galli, I, et al., (1993), "Mammalian genomic sequences can substitute for the SV40 AT stretch in sustaining replication of the SV40 origin of replication", FEBS Letters, 318, S.335-40) beschreibt ein Verfahren zum Klonieren einer Genombank unter Verwendung der Restriktionsstellen MboI und XbaI eines von PUC19 abgeleiteten Vektors. Allerdings wird kein einziges spezifisches Screening nach klonierten Fragmenten gleichzeitig an den unterschiedlichen gewonnenen Klonen durchgeführt, was einer Fachkraft mühsame Tests auferlegt.
Dieses Problem wird durch das erfindungsgemäße Verfahren gelöst, das ein universelles Verfahren zum Isolieren eines Nucleinsäurefragments in einer Bank ist und eine Erleichterung des Klonierens des gewünschten Nucleinsäurefragments erlaubt.
Im Folgenden wird durch die enzymatische Charakteristik (CE = Caracteristique Enzymatique) die Resistenz eines Nucleinsäurefragments gegenüber einem Restriktionsenzym mit "r" vermerkt, oder dessen Ansprechen mit "s" vermerkt. Dies bedeutet:

– dass ein mit "s" bezeichnetes Fragment für ein gegebenes Restriktionsenzym die Spaltungsstelle dieses Enzyms enthält, und
– dass ein mit "r" bezeichnetes Fragment für ein Restriktionsenzym die Spaltungsstelle dieses Enzyms nicht enthält.

Die multiple enzymatische Charakteristik (CEM = Caracteristique Enzymatique Multiple) ist dann die enzymatische Gesamtcharakteristik, die sich für mehrere Enzyme ergibt. Die CEM eines DNA-Fragments, die eine Eco-Stelle, eine Bam-Stelle, zwei Sca-Stellen, jedoch weder Hind- noch Stu-Stellen enthält, kann dann wie folgt dargestellt werden: Eco^sBam^sSca^sHind^rStu^r.
Das erfindungsgemäße Verfahren schlägt daher vor, dem in einer Probe zu isolierenden Fragment dessen multiple enzymatische Charakteristik (CEM) zuzuordnen. Die Suche nach diesem Fragment kann durch beliebige, dem Fachmann bekannte Mittel durchgeführt werden, beispielsweise hinsichtlich der Fähigkeit des Fragments mit einer Nukleinsonde zu hybridisieren, der enzymatischen Aktivität seines Proteinprodukts, der Expression eines Proteins, das detektiert werden könnte, usw.
Das erfindungsgemäße Klonierungsverfahren basiert auf der Beweisführung, dass im Falle einer ausreichend großen Anzahl von Enzymen jedes Insert der Bank eine eigene CEM aufweist, und die Erfindung bietet infolgedessen eine einfache Strategie zum Klonieren von Genen ausgehend von deren CEM. Das erfindungsgemäße Verfahren beruht somit auf dem Abtasten von DNA-Banken, wobei die Verteilung der Restriktionsstellen auf den Inserten, auf denen diese Bank basiert, kombinatorisch verwendet werden.
Das Prinzip des erfindungsgemäßer. Verfahrens beruht ferner auf der Verwendung eines neuen Typs eines Vektors, von dem im Wesentlichen sämtliche Spaltungsstellen, außer den für den Aufbau der Bank erforderlichen, unabhängig davon, ob diese orientiert ist oder auch nicht, durch Restriktionsenzyme entfernt sind, und auf dessen eventueller Subklonierung in einen anderen Vektor. In einer speziellen minimalen Ausführungsform enthält der Vektor:

– eine für den Aufbau der Bank erforderliche Stelle A und
– zwei miteinander identische, die Stelle A flankierende Stellen B, die dazu geeignete sind, das Gen zu subklonieren, sobald dieses identifiziert und kloniert ist.

Diese Einheit könnte im Folgenden als "Trilinker" bezeichnet werden, dessen Herstellung in der beigefügten 1 schematisch dargestellt ist.
In einem weiteren speziellen Ausführungsbeispiel enthält der Vektor:

– eine Stelle A und eine davon unterschiedliche Stelle A' zum Konstruieren der Bank, und
– zwei Stellen B und B', identisch oder verschieden, die die Stellen A und A' flankieren, um das Gen zu subklonieren, sobald dieses identifiziert und kloniert ist.

Vorzugsweise sind die Stellen B Oktonukleotidstellen, um die Gefahr zu minimieren, dass die Stellen B in den klonierten Inserten vorkommen. Auf diese Weise ist es möglich, die Subklonierung ohne Weiteres in einem Stück durchzuführen.
Bisher wurden etwa 100 Restriktionsenzyme mit Hexanukleotidstelle entdeckt. 70 davon weisen eine Erkennungsstelle von dem Typ kontinuierliches oder diskontinuierliches Palindrom auf.
Ein erfindungsgemäßer Vektor, vorteilhafterweise ein Plasmid, enthält keine an seinen drei Stellen angeordnete Hexa- oder Pentanukleotid-Restriktionsstellen mehr, die bereits identifizierten oder in Zukunft identifizierten Restriktionsenzymen entsprechen. Der Begriff "im Wesentlichen" soll daher bedeuten, dass dieser Abbau partiell sein kann, in dem Sinne, dass nur gewisse der bekannten Stellen davon betroffen sind; in dem erfindungsgemäßen Verfahren werden somit lediglich die entsprechenden Enzyme verwendet. In der folgenden Beschreibung der Erfindung wird, wie zuvor erwähnt, in Betracht gezogen, dass ca. 50 bis 70 Typen von Stellen abgebaut wurden.
Ein erfindungsgemäßer Vektor lässt sich ausgehend von einem bereits vorhandenen Plasmid aufbauen, das sämtliche Funktionen aufweist, die erforderlich sind, um darauf basierend die Erzeugung oder Handhabung einer cDNA- oder einer Genbank zu ermöglichen. Es kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft sein, dass die Bank keinen Vektor mehr enthält, der in sich geschlossenen ist. Es ist daher vorteilhaft, dass der erfindungsgemäße Vektor ein System enthält, das jeden nur in sich geschlossenen Vektor eliminiert, beispielsweise ein Suizidgen, eine Abbausystem in der Nähe eines Lambdapromotors oder ein beliebiges sonstiges, dem Fachmann bekanntes System.
Die innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung zum Abbau sämtlicher Restriktionsstellen verwendete Technik ist eine der im Stand der Technik bereits beschriebenen, einfach- oder mehrfach ausgerichteten Mutagenesetechniken oder eine beliebige sonstige dem Fachmann bekannte Technik, beispielsweise der Austausch von Segmenten des Plasmids durch Oligonucleotide. Auf diese Weise erhält man einen Vektor, der gegen 70, von I bis LXX nummerierte, Restriktionsenzyme resistent ist und auf 2, vorausgehend mit A und B bezeichnete, Restriktionssysteme anspricht. Die Idee eines gleichzeitigen Abbaus des Großteils der auf einem Plasmid vorhandenen Restriktionsstellen wurde bereits von D. H. Jones et al. (BioTechniques 1994, 16, 4: 694) in Betracht gezogen, allerdings in einem völlig anderen Zusammenhang. Tatsächlich beschreibt jener Artikel den Abbau von 31 der 37 Stellen eines sehr kleinen Vektors durch multiple Mutagenese, um ein neues Tool zu schaffen, das gewisse Manipulationen der DNA erleichtert.
Das erfindungsgemäße Verfahren basiert außerdem auf der Erzeugung einer DNA-Bank, die abhängig von der in Betracht gezogenen Verwendung 1 bis 10⁸, und vorzugsweise etwa 10⁵ bis 4·10⁶, unterschiedliche Fragmente der Größenordnung von jeweils 0,1 kb bis 5 kb, und in Abhängigkeit von den Verwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise der Länge 1 bis 2 kb, enthält. In der speziellen Form der Verwirklichung des erfindungsgemäßen Verfahrens, das im Zusammenhang mit dem die Untersuchung des Polymorphismus betreffenden Ausführungsbeispiel 6 nachstehend beschriebenen ist, enthält die Bank möglicherweise kein einziges Fragment.
Für die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Expressionsbanken oder zur Klonierung durch Homologie, wurde daher, wie in der beigefügten 2 schematisch dargestellt, eine cDNA-Bank mit 10⁵ unterschiedlichen Fragmenten der Länge von jeweils 1 kb hergestellt.
Allerdings basiert dieses Modell auf einem Näherungswert und ist folglich geringfügig fehlerhaft, da die Größe der Fragmente heterogen ist. Da die mittlere Größe der Inserte zu klein bewertet ist, und die Größe der Bank zu groß bewertet ist, wurde dieses Modell geeignet gewählt, um über eine einfache Basis (Homogenität der Größe der Fragmente) und ein Untersuchungssytem zu verfügen, das die Analyse (Größe der Bank zu groß bewertet, Größe der Fragmente zu klein bewertet) in einer Weise beeinflusst, dass das erfindungsgemäße Verfahren auf jeden Fall (noch) reproduzierbar ist.
Für die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Southern-Blot-Identifizierung und zur Untersuchung des Polymorphismus, wurde, wie in der beigefügten 3 schematisch dargestellt, eine genomische DNA-Bank mit 4·10⁶ unterschiedlichen Fragmenten von jeweils 1 kb hergestellt. Diese Bank wurde durch die Anwendung eines Enzyms gewonnen, das einer Stelle einer theoretischen Häufigkeit von 1/1024 (des Typs AT (ACGT) (TGCR) TA) entspricht.
Sämtliche Arten von beispielsweise mittels PCR durch Amplifikation zufällig erhaltenen DNA-Banken, die Oligonucleotide verwenden, seien diese entartet oder nicht, sind von dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung abgedeckt.
Dementsprechend ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein zum Klonieren eines Nucleinsäurefragments dienendes Verfahren zu schaffen, das die folgenden Schritte umfasst:

– Herstellen einer DNA-Bank, die geeignet ist, das Fragment zu enthalten,
– Screenen der Bank indem wenigstens 10, und vorzugsweise 50 bis 70, Restriktionsenzyme kombinatorisch verwendet werden, um durch ein beliebiges geeignetes Mittel den das Fragment enthaltenden Klon zu isolieren.

In diesem Verfahren basiert die Erzeugung der DNA-Bank, die geeignet ist, das Nucleinsäurefragment zu enthalten, darauf, dass jedes der DNA-Fragmente einer Probe in einen Vektor inseriert wird, von dem sämtliche Spaltungsstellen durch Restriktionsenzyme entfernt wurden, ausgenommen:

– eine Stelle für den Aufbau der Bank und
– möglicherweise zwei weitere miteinander identische Stellen, die sich von der (den) ersten Stelle(n) und der (den) flankierenden unterscheiden und dazu geeignet sind, die Nukleinsäuresequenz zu subklonieren, sobald diese identifiziert und kloniert ist.

In einer weiteren Ausführungsform dieses Verfahrens wird jedes der DNA-Fragmente einer Probe in einen Vektor inseriert, von dem im Wesentlichen sämtliche Spaltungsstellen durch Restriktionsenzyme entfernt wurden, ausgenommen:

– zwei ausgerichtete Stellen für den Aufbau der Bank und
– möglicherweise zwei weitere Stellen, die miteinander identisch sind oder auch nicht, die sich von den zwei ersten Stellen unterscheiden und diese flankieren und dazu geeignet sind, die Nukleinsäuresequenz zu subklonieren, sobald diese identifiziert und kloniert ist.

Das Verfahren umfasst insbesondere die folgenden Schritte:

a) Herstellen einer DNA-Bank, die geeignet ist, um das Nucleinsäurefragment zu enthalten, basierend darauf, dass jedes der DNA-Fragmente einer Probe in einen Vektor eingefügt wird, von dem im Wesentlichen sämtliche Spaltungsstellen durch Restriktionsenzyme entfernt wurden, wobei jedoch beibehalten werden: – eine oder zwei Stellen für den Aufbau der Bank und – möglicherweise wenigstens zwei weitere Stellen, und vorzugsweise lediglich zwei miteinander identische oder auch nicht identische Stellen, die sich von der oder den ersten Stelle(n) und der (den) flankierenden unterscheiden und sich für eine Subklonierung des Nucleinsäurefragments eignen, sobald dieses identifiziert und kloniert ist.

Die Probe, von der ausgehend die die Bank bildenden Fragmente erzeugt werden, kann auf jeder eukariotischen Zelle (Säuger, Pflanze, Hefepilz, usw.) oder jedem prokaryotischen Organismus (Virus, Bakterium, usw.) basieren. Es kann sich um genomische DNA, cDNA, Fragmente einer Amplifikation durch PCR oder um jede beliebige sonstige DNA-Bank handeln, die ein auf dem Gebiet bewanderter Fachmann herstellen kann.

b) Die Digestion wird parallel zu der Bank mittels mehrerer Restriktionsenzyme durchgeführt, wenigstens sind dies 10 und vorzugsweise ca. 50 bis 70 Restriktionsenzyme, um ebenso viele monoaufgeschlossene Banken wie verwendete Enzyme zu erhalten.
c) Die monoaufgeschlossenen Banken werden voneinander unabhängig in geeignete zelluläre Wirte transfiziert, um entsprechende Partien der zellulären Wirte zu erhalten.
d) Jede der in Schritt (c) erhaltenen Partien wird durch ein beliebiges geeignetes Mittel getestet, um die Integrität der zu klonierenden Nukleinsäuresequenz zu bewerten und auf diese Weise deren CEM zu bestimmen.

In der Praxis wird das in der Bank vorhandene Insert, falls die Digestion durch ein mit "I" bezeichnetes Enzym die Integrität des Inserts nicht ändert, als I^r erachtet, während es im Gegensatz dazu als I^s erachtet wird, falls die Digestion die Integrität verändert.
Die oben erwähnten Schritte (a) bis (d) ermöglichen die Analyse des erfindungsgemäßen zu klonierenden Fragments.
Zu dem Verfahren der Erfindung gehören ferner die folgenden Schritte, die es erlauben, das zu klonierende Fragment zu reinigen:

e) Erneute Verwendung der Gesamtbank des Schritts (a) und weitgehend gleichzeitiges Aufschließen derselben durch die Enzyme, die die Integrität des zu klonierenden Fragments nicht beeinträchtigen. Für diese wurde daher "r" in Betracht gezogen.
f) Isolieren des resistenten Klons, der das zu klonierende Nucleinsäurefragment enthält, durch ein beliebiges geeignetes Mittel, und eventuelles Subklonieren desselben unter Verwendung der zwei in dem Vektor zu diesem Zweck angeordneten Stellen.
g) Eventuelles Sequenzieren des zu klonierenden Nucleinsäurefragments.

Die multiple Digestion des Schritts (e) bewirkt die Spaltung sämtlicher oder nahezu sämtlicher DNA-Fragmente, auf der die Bank basiert, mit Ausnahme des zu klonierenden Fragments.
Die Isolierung des resistenten Klons, der das zu klonierende Nucleinsäurefragment des Schritts (f) enthält, kann durch Transformation der mehrfach aufgeschlossenen Bank in kompetente Bakterien oder durch PCR unter Verwendung von Initialoligonucleotiden durchgeführt werden, die die Klonierungsstelle der Bank flankieren.
Unter Umständen können zwischen dem Schritt (a) und (b) zum einen, und zwischen (e) und (f) zum anderen, zur Sicherheit Verifizierungschritte durchgeführt werden, die beinhalten:

a') Verifizieren der Anwesenheit des zu klonierenden Nucleinsäurefragments in der Bank durch Transfizieren in einen zellulären Wirt, der das Fragment nicht aufweist, und indem durch ein beliebiges geeignetes Mittel die Anwesenheit des Fragments in dem Wirt getestet wird. Vorteilhaf terweise werden in diesem Schritt (a') COS-Zellen verwendet, die auf herkömmliche Weise für die Transfektionen erzeugt werden.
e') Transformieren der mehrfach aufgeschlossenen Bank des Schritts (e) in kompetente Wirte, um die Natur der klonierten Fragmente zu verifizieren. Beispielsweise basiert dieser Schritt auf einem Auftragen auf Petri und einem Verifizieren durch Minipräparationen von Plasmid-DNA (Miniprep), ob die Inserte während der Bestimmung der CEM angemessen auf die mit "s" bezeichneten Enzyme ansprechen.

Vorteilhafterweise enthält die in Schritt (a) erzeugte DNA-Bank 1 bis 10⁸, und vorzugsweise etwa 10⁵ bis 4·10⁶ unterschiedliche Fragmente der Größenordnung von jeweils 0,1 kb bis 5 kb, und vorzugsweise der Größenordnung von 1 bis 2 kb.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, dass die beiden Subklonierungsstellen Oktonukleotidstellen sind, um die Gefahr zu minimieren, dass die Stellen B in den klonierten Inserten vorkommen.
In einem ganz speziellen Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält die Bank keinen nur sich geschlossenen Vektor mehr. Es ist daher vorteilhaft, dass der erfindungsgemäße Vektor ein System enthält, das jeden nur in sich geschlossenen Vektor eliminiert, beispielsweise ein Suizidgen, ein Abbausystem in der Nähe eines Lambdapromotors oder ein beliebiges sonstiges, dem Fachmann bekanntes System.
Die in den Schritten (d) und (a') zum Verifizieren der Integrität der zu klonierenden Nukleinsäuresequenz durchgeführten Versuche können auf einem beliebigen Mittel zum Nachweis, sei es für die Sequenz selbst, als Sonde, sei es für das durch die Sequenz kodierte Protein, beispielsweise ein Ligand als Antikörper, oder für die Aktivität dieses Proteins, als enzymatischer Marker, die durch beliebige dem Fachmann bekannte Mittel, beispielsweise als eine fluoreszierende oder radioaktive Markierung, erfasst werden können.
Die Verwendungen der erfindungsgemäßen Klonierungsverfahren sind sehr zahlreich, und es wird insbesondere auf jene verwiesen, die in den nachstehenden Ausführungsbeispielen im Einzelnen erläutert sind:

– Klonieren eines Gens durch Expressionsbanken.
– Klonieren mittels Homologie.
– Southern-Blot-Identifizierung, die durch den Erfinder mit "Identiblot" benannt wurde.
– Untersuchung des Polymorphismus.

Außerdem wird im Folgenden das gemäß dem oben beschriebenen Verfahren der Erfindung zu klonierende Nucleinsäurefragment gleichbedeutend mit Gen oder Insert oder Sequenz bezeichnet.
Ein erfindungsgemäßes Klonierungsverfahren eines Gens durch Expressionsbanken umfasst die folgenden Schritte:

a) Herstellen einer cDNA-Bank, die geeignet ist das Gen zu enthalten, indem die Bank in einen Vektor inseriert wird, von dem im Wesentlichen sämtliche Spaltungsstellen durch Restriktionsenzyme entfernt wurden, ausgenommen: – eine oder zwei Stellen für den Aufbau der Bank, und – möglicherweise wenigstens zwei weitere Stellen, und vorzugsweise lediglich zwei Stellen, die miteinander identisch sind oder auch nicht, sich von der oder den ersten Stellen unterscheiden und diese flankieren, und sich für eine Subklonierung des Gens eignen, sobald dieses identifiziert und kloniert ist.
b) Verifizieren der Anwesenheit des gewünschten Gens in der Bank, indem es in eine Zelllinie transfiziert wird, die nicht die Aktivität oder den gewünschten Phänotypus aufweist, und indem deren Wiederherstellung durch eine Technik gemessen wird, die es erlaubt, die transfizierten Zellen, beispielsweise durch einen cytometrischen oder enzymatischen Test, von den nicht transfizierten Zellen zu unterscheiden.
c) Unabhängiges Aufschließen der Bank durch wenigstens 10 und vorzugsweise ca. 50 bis 70 Restriktionsenzyme.
d) Unabhängiges Transfizieren der monoaufgeschlossenen Banken des Schritts (c).
e) Testen durch ein beliebiges geeignetes Mittel jeder der in Schritt (d) gewonnenen Partien auf die Anwesenheit der dem zu klonierenden Gen zugeordneten Aktivität und Ermitteln der Integrität der Sequenz des Gens, um die CEM der dem Gen zugeordneten Aktivität zu bestimmen.

Unter dem Begriff "dem Gen zugeordnete Aktivität" ist das ein beliebiges Mittel verwendende Detektieren des durch das Gen kodierten Proteins oder der Aktivität dieses Proteins zu verstehen, worin immer diese bestehen mag (Ligand, Enzym, Tumorinduktion, usw.).

f) Erneute Verwendung der Gesamtbank des Schritts (a) und weitgehend gleichzeitiges Aufschließen derselben durch die ca. 50 bis 55 Enzyme, die die in Schritt (e) gemessene Aktivität im Mittel nicht beeinträchtigen. Infolgedessen werden statistisch sämtliche der die Bank bildenden Fragmente mit Ausnahme des gesuchten Fragments gespalten.
g) Transformieren der mehrfach aufgeschlossenen Bank in kompetente Bakterien. Demzufolge werden allein die Vektoren, die ein nicht gespaltenes Fragment enthalten, in die kompetenten Bakterien transformiert.
h) Subklonieren unter Verwendung des oder der Enzyme, die der (den) in dem Vektor angeordnete(n) Subklonierungsstelle(n) entsprechen, und eventuell anschließende Sequenzierung des Gens.

Ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Klonieren mittels Homologie umfasst die folgenden Schritte:

a) Herstellen einer cDNA-Bank, wie im vorausgehende Schritt (a) beschrieben.
b) Unabhängiges Aufschließen der Bank durch jedes der wenigstens 10 und vorzugsweise ca. 70 Restriktionsenzyme.
c) Transfizieren der Digestionsprodukte des Schritts (b) in kompetente Bakterien.
d) Zusammenbringen der transformierten Bakterien mit einem selektiven Milieu, um aufgeschlossene Banken zu erzeugen, die von den abgespaltenen Produkten befreit sind.
e) Unabhängiges Spalten jeder dieser Banken durch das bzw. die Enzyme, die der (den) in dem Vektor angeordneten Subklonierungsstelle(n) entsprechen, und getrenntes Anordnen jedes dieser Digestionsprodukte in Agarose- oder Acrylamidschalen.
f) Migrieren der Digestionsprodukte des Schritts (e), anschließendes Übertragen auf eine beispielsweise auf Nitratzellulose basierende Membran und Hybridisieren mit einer für das Gen spezifischen Sonde zum Klonieren durch Homologie, oder aber unmittelbares Anordnen der Produkte des Schritts (d) auf einer Nitratzellulosemembran.
g) Analysieren der CEM des Signals;
e) Durchführung der entsprechenden Mehrfachdigestionen, so dass der einzige resistente Klon der Vektor ist, der das zu klonierende Gen trägt.

Das oben erwähnte Verfahren zur Klonierung mittels Homologie kann zur Identifizierung eingesetzt werden von:

a) Allelen unterschiedlicher Quellen derselben tierischen Spezies, bzw. im Falle des Menschen unterschiedlicher Individuen (häufig stark homolog).
b) genetischen Übereinstimmungen, die bei unterschied lichen Spezies vorhanden sind (mäßig homolog).
c) alternativen Spleißungen bei ein und demselben Gen in ein und demselben Gewebe oder zwischen unterschiedlichen Geweben (abschnittsweise vollkommene Homologie).
d) unterschiedlichen Mitgliedern einer genetischen Familie, die in ein und demselben Gewebe oder in unterschiedlichen Geweben verteilt ist (unberechenbare Homologie, in gewissen Gebieten häufig sehr stark).

Die vereinfachte Ausführungsform dieses Verfahrens basiert darauf, anstelle von Blots Dots durchzuführen, d. h., die Spaltung der monoaufgeschlossenen Banken durch das entsprechende Enzym an der in dem Vektor angeordneten Subklonierungsstelle zu unterlassen und die Banken unmittelbar an einem Punkt auf einer Nitratzellulosemembran anzuordnen.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Southern-Blot-Identifizierung von Inserten erlaubt es, ein DNA-Fragment zu identifizieren, ohne dass es erforderlich ist, dieses auch nur teilweise zu sequenzieren. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

(a) Herstellen einer DNA-Bank, die geeignet ist, um das Insert zu enthalten, basierend darauf, dass jedes der DNA-Fragmente einer Probe in einen Vektor eingefügt wird, von dem im Wesentlichen sämtliche Spaltungsstellen durch Restriktionsenzyme entfernt wurden, wobei jedoch beibehalten werden: – eine oder zwei Stellen für den Aufbau der Bank und – möglicherweise wenigstens zwei weitere Stellen, und vorzugsweise lediglich zwei Stellen, die miteinander identisch sind oder auch nicht, und sich von der oder den ersten Stellen und der (den) flankierenden unterscheiden, und sich für eine Subklonierung des Inserts eignen, sobald dieses identifiziert und kloniert ist.
b) Aufschließen dieser Bank durch jedes der wenigstens 10 und vorzugsweise ca. 50 bis 70 Restriktionsenzyme.
c) Transformieren der in dem oben erwähnten Schritt (b) gewonnenen monoaufgeschlossenen Banken in kompetente Bakterien oder äquivalente Wirte.
d) Zusammenbringen der Bakterien mit einem selektiven Milieu, um mono-aufgeschlossene Banken zu erzeugen, die von abgespaltenen Produkten befreit sind.
e) Unabhängiges Spalten jeder dieser Banken durch das Enzym, das den zwei weiteren Stellen entspricht, die identisch sind und sich von der oder den ersten Stelle(n) unterscheiden und diese flankieren, und Anordnen der Digestionsprodukte in Agarose- oder Acrylamidgelschalen.
f) Migrieren lassen dieses Gels und Übertragen desselben auf eine beispielsweise auf Nitratzellulose basierende Membran.
g) Verwenden der Identifizierungsinserte als markierte Sonden, sei es einzeln nacheinander oder sei es in Gruppen.
h) Testen jeder der in Schritt (g) erhaltenen Partien durch ein beliebiges geeignetes Mittel, um die zu identifi zierende Inserte einer CEM zuzuordnen. Diese CEM entspricht der Aktivität der Enzyme des Schritts (b).

Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Untersuchung des Polymorphismus ist mit dem Verfahren zur Southern-Blot-Identifizierung von Inserten identisch, ist jedoch dadurch gekennzeichnet, dass

– die genomische DNA-Bank des Schritts (a) Ergebnis des untersuchten Objekts, beispielsweise eine s, Patienten, oder von Familienmitgliedern des Patienten ist.
– die als Sonden verwendeten Inserte bereits beschriebene Polymorphismusmarker sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Untersuchung des Polymorphismus kann auf dem Gebiet der Erforschung von Polymorphismusmarkern, die mit einer Krankheit assoziiert sind, oder auf dem Gebiet einer Diagnostik dieser Krankheit genutzt werden.
Eine Abwandlung des vorausgehenden Klonierungsverfahrens zur Untersuchung des Polymorphismus eines Individuums beinhaltet die folgenden Schritte:

a) Definieren der CEM jedes der bekannten Marker, um deren Identifizierung zu ermöglichen.
b) Erzeugen einer genomischen DNA-Bank des untersuchten Objekts, basierend darauf, dass jedes der DNA-Fragmente einer Probe in einen Vektor inseriert wird, von dem im Wesentlichen sämtliche Spaltungsstellen durch Restriktionsenzyme entfernt wurden, ausgenommen: – eine oder zwei Stellen für den Aufbau der Bank und – möglicherweise wenigstens zwei weitere Stellen, und vorzugsweise lediglich zwei Stellen, die identisch sind oder auch nicht, und sich von der oder den ersten Stellen und der (den) flankierenden unterscheiden, und geeignet sind, das Insert zu subklonieren, sobald dieses identifiziert und kloniert ist.
c) Durchführen der Digestion der Bank mittels Sätzen von Enzymen, die den CEM entsprechen, die den untersuchten Markern zugeordnet sind.
d) Transformieren der mehrfach aufgeschlossenen Banken in kompetente Bakterien.
e) Züchten dieser Bakterien in einem flüssigen oder festen Milieu, das die für das Plasmid selektive Substanz enthält. Falls das gesuchte Allel vorhanden ist, vermehren sich die Bakterien, während sie sich hingegen nicht vermehren, falls das Allel nicht vorhanden ist, und es steht auf diese Weise für jedes Allel ein entsprechendes Profil zur Verfügung.

Vorteilhafterweise wird in Schritt (b) eine Bank hergestellt, deren Fragmente eine mittlere Länge von 1000 bis 4000 und vorzugsweise von 2000 Nucleotiden aufweisen.
Ein Ausführungsbeispiel der oben erwähnten Abwandlung ermöglicht ferner auf dem Gebiet der Forschung oder einer Diagnostik die Detektion zahlreicher Allele polymorpher Segmente, beispielsweise des gp120 von HIV-Viren oder des p53 zellulärer Oncogenesen. Das betreffende Segment wird vorteilhafterweise durch PCR amplifiziert und in das Plasmid kloniert; danach ist das Verfahren identisch mit dem zuvor beschriebenen, das nachstehend im Einzelnen in dem Ausführungsbeispiel 6 erläutert wird.
Weitere Vorteile und Merkmale des erfindungsgemäßen Verfahrens werden aus der folgenden Beschreibung offensichtlich, die sich auf detaillierte Beispiele der Verwirklichung des erfindungsgemäßen Verfahrens in unterschiedlichen Anwendungen bezieht, die keinesfalls als Beschränkung der Erfindung zu bewerten sind.
Beispiel 1: Herstellung und Auswertung einer Expressionsbank.
Eine erste Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft die Herstellung und Auswertung einer Expressionsbank.
Diese Technik ist seit Mitte der Achtzigerjahre von großem Interesse. Zahlreiche Gene, beispielsweise für Zytokineserezeptoren kodierende Gene, Oberflächenmarker von Lymphozyten, DNA bindende Proteine, usw., wurden durch diese Technik identifiziert (U. Gubler et al., Annals of the N.Y. Academy of Science 795: 36-40, 1996; D. Pennica et al. PNAS 92(4): 1142, 1995; R.M. O'Brien et al., Biochemical Journal 312: 17-21, 1995). Allerdings sind die Klonierungstechniken durch Expressionsbanken bisher in der Regel arbeitsaufwändig und schwer reproduzierbar.
Die gegenwärtigen Anwendungen von Expressionsbanken betreffen die Identifizierung des für ein Protein kodierenden Gens, wobei sich die Mittel zum Nachweis in vier Haupt kategorien einteilen lassen:

– Antikörper,
– Protein/Protein-Verbindungen, die nicht Antikörper/Antigen-Verbindungen sind,
– beispielsweise durch Fluoreszenz markierte Oligonucleotide, falls das gesuchte Protein ein an die DNA bindendes Protein ist,
– Untersuchungen der Aktivität eines beliebigen Proteins.

Die Bank, die das für das gesuchte Protein kodierende Gen enthält, kann in Bakterien oder Hefepilze transformiert sein, und es wird der Antikörper, das Protein oder das Oligonucleotid verwendet, das für ein Screenen der Bank hinsichtlich der Suche nach der Kolonie markiert ist, die jene exprimiert. Diese Systeme arbeiten häufig sehr unbefriedigend, da die Proteine bei den Bakterien oder Hefepilzen und bei den Säugerzellen nicht dieselbe Konformation und nach der Übersetzung nicht dieselben Veränderungen aufweisen.
Das Problem der Transfektion von Banken in die Säugerzellen besteht darin, dass im Gegensatz zu den Systemen von Bakterien oder Hefepilzen in jeder Zelle mehrere Plasmide integriert sind. Um dieses Problem zu lösen, ist es erforderlich, Techniken einer sukzessiven Fraktionierung von Banken oder wiederholter zytofluorometrischer Sortierungen zu verwenden (T. Kitamura et al., PNAS 92 (20): 9146, 1995; D.R. Gehlert et al., Molecular Pharmacology, 49 (2): 224, 1996). Jede dieser beiden Techniken ist mit einem hohen und langwierigen (mehrere Wochen erfordernden) Arbeitsaufwand verbunden, der nicht immer zu einem endgültigen Ergebnis führt und sich nicht für die gleichzeitige Klonierung von zwei oder mehr Inserten eignet.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist wesentlich einfacher und weniger kostspielig als sämtliche der oben erwähnten Verfahren aus dem Stand der Technik. Darüber hinaus kann es für die gleichzeitige Klonierung mehrerer Inserte eingesetzt werden. Letzteres ist von größter Bedeutung, da bekannt ist, dass viele Oberflächenproteine aus mehreren Ketten bestehen und die Oberfläche, beispielsweise im Falle von größeren Histokompatibilitätskomplexen, nur erreichen, wenn sämtliche der Ketten erzeugt sind. Außerdem erlaubt keine der auf den Expressionsbanken basierenden herkömmlichen Techniken einen Zugriff auf diese Proteine.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Aufbau von Expressionsbanken umfasst die folgenden Schritte:

a) Herstellen einer Bank, indem die komplementäre DNA des interessierenden Gewebes bzw. der Zelllinie in die Stelle A des Vektors inseriert wird. Die beigefügte 2 veranschaulicht diesen Schritt schematisch.
b) Verifizieren der Anwesenheit des gesuchten Gens in der Bank, indem es in eine Zelllinie transfiziert wird, die nicht die Aktivität oder den gewünschten Phänotypus aufweist, und indem deren Wiederherstellung, beispielsweise mit einem Antikörper, gemessen wird, um die transfizierten (+) Zellen von nicht transfizierten (–) Zellen zu unterscheiden. Die beigefügten 4 und 5 zeigen eine schema tische Darstellung dieses Schritts.

Vorteilhafterweise werden für die Transfektionen auf herkömmliche Weise erzeugte COS-Zellen verwendet.

c) Unabhängiges Aufschließen der Bank durch jede der 50 bis 70 verfügbaren Restriktionsenzyme. Auf diese Weise werden 50 bis 70 Röhrchen gewonnen. Die beigefügte 6 veranschaulicht diesen Schritt schematisch.
d) Unabhängiges Transfizieren der 50 bis 70 monoaufgeschlossenen Banken und Testen der Anwesenheit der gesuchten Aktivität in jeder dieser 50 bis 70 Partien transfizierter Zellen. Dieser Schritt ist in der beigefügten 7 schematisch veranschaulicht.
e) Bestimmen der CEM der gesuchten Aktivität. Falls die Digestion durch das Enzym I die Aktivität des in der Bank vorhandenen Inserts nicht ändert, wird I^r vermerkt. Andernfalls wird I^s vermerkt.

In dem Ausführungsbeispiel der beigefügten 7 ergibt sich die folgende CEM: I^s II^r .. LXX^r.
Es wird geschätzt, dass im Falle eines Inserts von 1 kb im Mittel 55±4 Enzyme von 70 ein "r" und 15±4 ein "s" aufweisen werden. Tatsächlich berechnet sich die Wahrscheinlichkeit einer Spaltung durch ein Restriktionsenzym mit Hexanukleotidstelle an einer zufällig gewählten vorgegebenen Position zu p = 1/4⁶ = 1/4096. Bei einem Gen, dessen Größe n Nucleotide beträgt, ergibt sich die theoretische Wahrscheinlichkeit für ein Auftreten von 1, 2, 3, ... Spaltungen aus einem binomischen Gesetz der Wahrscheinlich keit p und der Anzahl der Ereignisse n. Die Wahrscheinlichkeit, dass keinerlei Spaltung auftritt, beträgt C_n ⁰pⁿ(1 – p)⁰ Für n = 1000, ergibt sich eine Wahrscheinlichkeit von 78,3 %. Die Wahrscheinlichkeit für das Vorhandensein einer oder mehrerer Spaltungen beträgt etwa 21,7 %. Die durchschnittliche Anzahl von sich nicht spaltenden Enzymen liegt folglich im Bereich von 0,783 × 70 = 55, und die Abweichung beträgt etwa 4.

f) Erneute Verwendung der Gesamtbank und weitgehend gleichzeitiges Aufschließen derselben durch die 55 Enzyme, die die gemessene für das gesuchte Insert mit "r" assoziierte Aktivität nicht beeinträchtigen. Die beigefügte 8 veranschaulicht diesen Schritt schematisch.

In der Praxis kann diese Digestion aus Gründen der Kompatibilität von Gazebauschen nicht völlig gleichzeitig stattfinden, und es werden 2 oder 3 aufeinanderfolgende Multidigestionen benötigt, die den zwei oder drei ausgewählten Gazebauschen entsprechen.
Die Wahrscheinlichkeit dafür, dass ein zufällig gewähltes Insert durch x dieser 55 Enzyme gespalten wird, folgt ebenfalls einem binomischen Gesetz, mit einer Wahrscheinlichkeit gleich 0,783 und einer Anzahl von 55 Ereignissen. Die Wahrscheinlichkeit dafür, dass ein Insert durch kein einziges der 55 Enzyme gespalten wird, beträgt folglich C₅₅ ⁰ × (0,783)⁵⁵ × (1 – 0,783)⁰ = (0,783)⁵⁵ = 1,4·10^–6.
Es verbleiben daher im Mittel nur das gesuchte Insert, plus 1,4·10^–6 × 10⁵ = 0, 14 parasitäre Inserte.
Die Verwendung eines Teils der CEM, der ausschließlich den mit r assoziierten Enzymen entspricht, reicht aus, um das gesuchte Gen zu isolieren, das bereits zu mehr als 85 rein ist.

g) Transformieren der mehrfach aufgeschlossenen Bank in kompetente Bakterien. Vorzugsweise wird auf Petri aufgetragen und mittels Miniprep verifiziert, ob die Inserte während der Bestimmung der CEM angemessen auf mit "s" vermerkte Enzyme ansprechen. Die beigefügte 9 veranschaulicht diesen Schritt schematisch.
h) Subklonieren unter Verwendung des Enzyms B in einem zu untersuchenden Vektor, beispielsweise Bluescript. Anschließend erfolgt vorteilhafterweise eine Sequenzierung.

Das oben in Schritt (e) beschriebene Modell entspricht der Wirklichkeit, repräsentiert allerdings nur einen Mittelwert. In der Praxis variiert die Wahrscheinlichkeit der Spaltung eines Enzyms von dem Typ mit Hexanukleotidstelle von einem zum anderen.
Jeder dieser 8 Schritte nimmt nur sehr wenig Zeit in Anspruch, da das oben erwähnte Verfahren sich in 16 Tagen durchführen lässt, von, denen 10 mit Arbeit verbunden sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht insbesondere, Expressionsbanken für zahlreiche Gewebe und Stämme zu erzeugen, anschließend die 50 bis 70 einfachen Digestionen daran durchzuführen, sie zu transfizieren, aus den transfizierten Zellen den Zellextrakt zu gewinnen und, wie in 10 veranschaulicht, sie auf einer Membran aufzubringen.
Es verbleibt nun nur noch, die Membran beispielsweise mit einem Antikörper nach dem sogenannten Western-Blot-Verfahren auszuwerten, um die CEM des gesuchten Inserts, wie in 11 dargestellt, unmittelbar zu erhalten. Die Bank ist dann abhängig von der erhaltenen CEM mehrfach aufgeschlossen; anschließend werden kompetente Bakterien mit diesem mehrfach aufgeschlossenen Produkt transformiert, und das Gen ist innerhalb von 3 Tagen und nicht erst nach mehreren Monate kloniert, wie es in Verfahren nach dem Stand der Technik der Fall ist.
Diese Membranen sind bei 4° C oder eingefroren unbegrenzt haltbar.
Das oben beschriebene Ausführungsbeispiel basiert auf der Verwendung eines speziellen Antikörpers, allerdings können anstelle eines enzymatischen Tests andere Systeme der Aufdeckung des der CEM zugeordneten Phänotypus verwendet werden.
Beispiel 2: Klonierung mittels Homologie
Die Klonierung mittels Homologie wird von zahlreichen Labors der Molekularbiologie in großem Stil eingesetzt für die Identifizierung von

a) Allelen unterschiedlichen Ursprungs von Tieren derselben Spezies, oder beim Menschen von unterschiedlichen Individuen (häufig sehr homolog).
b) genetischen Übereinstimmungen, die bei unterschiedlichen Spezies vorhanden sind (mäßig homolog).
c) alternativen Spleißungen ein und desselben Gens in ein und demselben oder in unterschiedlichen Geweben (abschnittsweise vollkommene Homologie).
d) unterschiedlichen Mitgliedern einer genetischen Familie, die in ein und demselben oder in unterschiedlichen Geweben verteilt sind (unberechenbare Homologie, häufig in gewissen Gebieten sehr stark).

Die im Stand der Technik verwendeten Strategien sind im Wesentlichen die beiden folgenden (M. Parmentier et al., Nature, 355: 453, 1992):

– PCR durch Homologie und deren Derivate, die das Problem der Wahl der Startpunkte lösen, während die bewahrten Partien noch unbekannt sind. Das Fenster zwischen dem unspezifischen Hintergrundrauschen und der tatsächlichen homologen Amplifikationen ist schmal. Darüber hinaus repräsentiert die amplifizierte Partie meist nicht das ganze Gen, und es ist daher erforderlich, die fehlenden Stücke und insbesondere die Partie in 5' mittels arbeitsintensiver Techniken, wie der verankerten PCR, zu suchen.
– Hybridisierung gegenwärtig vorhandener Banken. Dieses Verfahren ist effizient, allerdings auch sehr arbeitsaufwändig. Darüber hinaus ist es nicht zur Identifizierung von Allelen (a) oder von genetischen Übereinstimmungen (b) geeignet. Für die Identifizierung alternativer Spleißungen (c) oder unterschiedlicher Mitglieder einer genetischen Familie (d) wird die mehrheitlich vorhandene cDNA wiederholt kloniert, d.h. in den meisten Fällen das Gen, über das bereits verfügt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, sobald ein Gen kloniert ist, eine Sonde zu erzeugen, die sich auf homologe Gene hybridisiert. Diese Sonde wird daher verwendet, um durch Hybridisierung mit geringer Stringenz deren Homologe aufzufangen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Klonierung mittels Homologie umfasst die folgenden Schritte:

a) Herstellen einer cDNA-Bank, wie es in Schritt (a) des Beispiels 1 beschrieben ist.
b) Unabhängiges Aufschließen der Bank durch jedes der 70 Restriktionsenzyme, wie in Schritt (c) des Ausführungsbeispiels 1 beschrieben.
c) Transformieren dieser 50 bis 70 Digestionen in kompetente Bakterien. Dieser Schritt in der beigefügten 12 schematisch veranschaulicht.
d) Zusammenbringen der transformierten Bakterien mit einem selektiven Milieu, um große Mengen von aufgeschlossenen Banken zu erzeugen, die von abgespaltenen Produkten befreit (d.h. aufgrund ihrer Linearisierung nicht transformiert) sind. Die gespaltenen Elemente sind danach in den Banken abwesend. Die beigefügte 13 veranschaulicht diesen Schritt schematisch.
e) Getrenntes Spalten jeder dieser Banken durch das Enzym B. Die beigefügte 14 veranschaulicht diesen Schritt schematisch.

Anschließend werden sämtliche dieser 50 bis 70 Di gestionsprodukte, wie in der beigefügten 15 veranschaulicht, in einer Agarosegelschale getrennt angeordnet.
Anschließend wird, wie in der beigefügten 16 veranschaulicht, Migration zugelassen, und die Übertragung auf Nitratzellulose sowie die Hybridisierung mit der Sonde durchgeführt.

f) Analysieren der CEM des Signals. Wenn auf dem Laufstreifen "Bank nicht aufgeschlossen" eine Bande vorhanden ist, jedoch nicht auf dem Laufstreifen "Bank durch I aufgeschlossen", bedeutet dies also, dass das hybridisierte Insert auf das Enzym I anspricht, und zwar sofort.
g) Durchführen der entsprechender Mehrfachdigestionen, wobei das einzige resistente Plasmid das gesuchte Plasmid ist. Vorteilhafterweise können danach mit diesem Plasmid unter Verwendung der "s"-Enzyme Minipreps zur Bestätigung durchgeführt werden.

Dieses Verfahren kann industriell eingesetzt werden, indem die Blots gewählt werden, die zahlreichen Banken entsprechen, beispielsweise jener, die in dem Ausführungsbeispiel 1 erzeugt sind. Nachdem die Sonde und die sinnvoll ausgewählten Blots zur Verfügung stehen, lassen sich daher nahezu unmittelbar sämtliche Allele, Entsprechungen von Spezies, alternative Spleißungen und Isotypen auffinden (zwei Arbeitstage, ohne die Sequenzierung mitzuzählen).
Eine vereinfachte Ausführungsform dieses Verfahrens basiert auf der Erzeugung von Dots anstelle von Blots, d.h. das Spalten der monoaufgeschlossenen Banken durch das Enzym B wird unterlassen, und diese werden unmittelbar an einem Punkt auf einer Nitratzellulosemembran angeordnet. Während der Hybridisierung mit der Sünde werden die ein Signal erzeugenden, beispielsweise radioaktiven Punkte den Enzymen entsprechen, für die das Plasmid resistent ist. Jene Punkte, die kein Signal mehr aufweisen werden den Enzymen entsprechen, auf die das Insert anspricht. Die Analyse ähnelt somit derjenigen, die in dem Beispiel 1 entwickelt wurde, wie in den beigefügten 17 und 18 dargestellt.
Diese vereinfachte Ausführungsform eignet sich jedoch nicht zum Klonieren von Isotypen oder von in ein und derselben Zelle exprimierten alternativen Spleißungen.
Beispiel 3: Southern-Blot-Identifizierung "Identiblot".
Die vorausgehenden Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens zielen darauf ab, eine Klonierung, die Expression oder Homologie verwendet, zu vereinfachen und rascher durchzuführen und hierfür neue Möglichkeiten zu schaffen.
Die Southern-Blot-Identifizierung schlägt ein abgekürztes Verfahren vor, das die Forschungsarbeiten in Zusammenhang mit molekularen Klonierungstechniken erleichtert.
Im Stand der Technik tritt in der Praxis häufig der Fall auf, dass die Strategie des Klonierens schließlich zahlreiche Inserte hervorbringt, unter denen sich das gesuchte Gen sowie zahlreiche Parasiten befinden. Allerdings ist es nach dem Stand der Technik für eine Identifizierung eines Inserts unter sämtlichen dieser Parasiten unentbehrlich, das Insert zumindest teilweise zu sequenzie ren, was mit einem beträchtliche Arbeitsaufwand verbunden ist. Die Sequenzierung ist eine zu arbeitsintensive und komplizierte Technik für diese einfache Anwendung der Identifizierung von Inserten, denn in der Praxis genügt es in der Regel, 10 Nucleotide zu Lesen, um ein Insert zu identifizieren. An die Stelle der Sequenzierung könnte eine DMD verwendende Technik treten, die einfacher und zudem weniger arbeitsaufwendig ist.
Es ist daher möglich, wie zuvor beschrieben, Southern-Blots genomischer DNA-Banken industriell durchzuführen. Die beigefügte 3 zeigt eine schematische Darstellung der Herstellung einer derartigen genomischen DNA-Bank. Dieses innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung auch mit "Identiblot" bezeichnete Southern-Blot-Verfahren ist hinreichend aussagekräftig, um die Identifizierung des homologen DNA-Fragments der Sonde zu ermöglichen.
Dieses Southern-Blot-Verfahren übertrifft die Aussagekraft sogar um ein Hundertmillionenfaches. Tatsächlich basiert die genomische Bank auf 4 Millionen unterschiedlichen Inserten der Länge 1 kb. Aus den bereits oben erläuterten Gründen ist ein zufällig gewähltes Insert gegen 55 Enzyme von 70 resistent und spricht auf 15 Enzyme an. Die Anzahl der möglichen enzymatischen Kombinationen beträgt folglich C₇₀ ¹⁵, d. h. 70!/(55!15!) = 7,2·10¹⁴. Diese Anzahl ist über hundert Millionen mal größer als die Größe der Bank. Die zu berücksichtigende Tatsache, dass sämtliche Inserte eine unterschiedliche Größe aufweisen, steigert die Anzahl der Möglichkeiten noch weiter. Jedem Insert der Bank ist folglich eine ureigene CEM zugeordnet.
Dieses Verfahren ist von hauptsächlichem Interesse im Falle von Klonierungsstrategien, bei denen sich ein großer Anteil von tatsächlich fehlerhaften Klonen ergibt, beispielsweise bei der Verwendung von Subtraktionsbanken oder von Klonierungsstrategien die Insertion verwenden.
In der Praxis genügt es, anhand der fünfzig untersuchten Klone eine "Multiplex-Sonde" zu erzeugen, d.h. eine gemeinsame Markierung von fünfzig Inserten (in einem einzigen Röhrchen), und eine einzige Hybridisierung des Nitratzellulosefilters durchzuführen. Die Identität der fünfzig Inserte wird in einem einzigen Arbeitsgang erhalten, indem deren CEMs mit denjenigen verglichen wird, die zuvor in einer elektronischen Datenbank eingegeben wurden.
Die beigefügte 19 repräsentiert ein Ausführungsbeispiel, in dem drei Sonden A, B, und C gleichzeitig verwendet wurden. Die genomischen Inserte, die CEMs entsprechen, die nicht beschrieben wurden, und nur diese, werden beispielsweise durch Mehrfachdigestion kloniert und anschließend sequenziert.
Im umgekehrten Fall der cDNA-Banken, bei denen die Variation unermesslich ist, genügt es, für jede der zur Zeit untersuchten 10 Spezies in der Biologie: Mensch, Maus, Ratte, Drosophila, Tabak, Hefepilz, usw., einen einzigen Typ von Blot zu erzeugen.
Beispiel 4: Untersuchung des menschlichen Polymorphismus.
Die mit dem Gebiet der Untersuchung des Polymorphismus befassten Forschungsarbeiten erfordern den Einsatz einer wachsenden Anzahl genetischer Marker. Deren Verwendung auf dem Gebiet der Diagnostik von Erbkrankheiten nimmt ebenfalls in hohem Maße zu. In naher Zukunft ist wahrscheinlich die Erstellung persönlicher Genkarten genetischer Prädispositionen möglich, so dass sich ein Mensch gewissen Umweltrisiken entziehen kann, beispielsweise dem Tabak im Falle einer Anlage zu Lungenkrebs, dem Zucker bei Diabetes, usw.
Die nach dem Stand der Technik verfügbaren Verfahren, die die Untersuchung des Polymorphismus an einem Allel erlauben, sind hauptsächlich PCR, Southern-Blot und (möglicherweise in Kombination verwendet) die Erforschung von Markern der Satelliten-DNA. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht daher eine im Vergleich zu diesen Techniken effizientere Alternative.
Die Durchführung des erfindungsgemäßen Klonierungsverfahrens zur Untersuchung des menschlichen Polymorphismus ähnelt derjenigen des oben erwähnten Ausführungsbeispiels 3. Der hauptsächliche Unterschied beruht auf der Tatsache, dass es erforderlich ist für jedes Objekt die Bank, deren Digestionen, die Gelmigration und den Membrantransfer zu verwirklichen.
Dieses Verfahren ermöglicht es außerdem, den Ursprung einer genetischen Erkrankung sehr rasch zu lokalisieren, indem an unterschiedlichen Mitgliedern einer die Krankheit beherbergenden Familie eine Analyse durchgeführt wird. Bei einer Familie, die mit dem "pathologischen Risiko" behaftet ist, sind lediglich die den unterschiedlichen Mitgliedern der Familie entsprechenden Identiblots durchzuführen und diese mittels Polysonden zu testen, die anhand bereits vorhandener genetischer Marker hergestellt sind. Es ist möglich an einem Tag wenigstens zwanzig Membranen zu hybridisieren, d.h. das Allel von 1000 Markern zu erhalten. Mit dieser Technik lassen sich die vielfältigen genetischen Faktoren definieren.
Diese Nutzung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfordert zwar eine Zeitinvestition in der Größenordnung einiger Stunden an Arbeit, amortisiert sich allerdings rasch durch die Möglichkeit, die Marker einer genetischen Prädisposition mittels routinemäßig erzeugter und auf einer äquivalenten Anzahl von Markern basierender Multiplexsonden in Gruppen von 50 zu testen.
Beispiel 5: Zweiter Ansatz der erfindungsgemäßen Untersuchung des menschlichen Polymorphismus.
Diese zweite Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Untersuchung des Polymorphismus betrifft die Verwendung der DMD nach dem Lesen der genetischen Marker mittels RFLP (= Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus). Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst somit die folgenden Schritte:

a) Vorbereitetes Definieren der CEM jedes der bekannten Marker, um deren Identifizierung zu ermöglichen. Diese Identifizierung wird ein für allemal durchgeführt und ein Polymorphismus ist daher durch eine Änderung der CEM gekennzeichnet.
b) Erzeugen einer genomischen DNA-Bank des untersuchten Objekts in dem im vorausgehenden beschriebenen Vektor. Wie zuvor erwähnt, kann es von Vorteil sein, dass die nur in sich selbst gebundenen Vektoren eliminiert sind. Vor teilhafterweise wird eine Bank erzeugt, deren Fragmente eine mittlere Länge von 2000 Nucleotiden aufweisen.
c) Durchführen der Digestion der Bank durch Sätze von Enzymen, die den CEMs entsprechen, die den untersuchten Markern zugeordnet sind.

Auf diese Weise werden beispielsweise in der ersten Kulturschale die fünfzig Enzyme angeordnet, die die gesamte Bank außer einen ersten Marker aufschließen. In der zweiten Kulturschale wird ein weiterer Satz von Enzymen für einen zweiten Marker angeordnet, usw.

d) Übertragen der mehrfach aufgeschlossenen Banken in kompetente Bakterien.
e) Züchten in einem festem Milieu (Petri-Schale), das die für das Plasmid selektive Substanz enthält, so dass die Bakterien sich vermehren, falls das gesuchte Allel vorhanden ist. Diese vermehren sich jedoch nicht, falls dieses Allel nicht vorhanden ist. Auf diese Weise steht für jedes Allel ein Profil bereit, und es lassen sich eine unbegrenzte Anzahl von Markern in einem Arbeitsgang untersuchen.

Dieses Verfahren lässt sich automatisieren, indem Platten à 96 Schalen hergestellt werden, die sämtliche enzymatische Mischungen enthalten, wobei diese Platten in einem Gefrierschrank gelagert werden. Es könnten unterschiedliche Typen von Platten erzeugt werden:

– über das gesamte Genom verteilte Marker.
– auf ein einziges Chromosom verteilte Marker.
– auf eine genau festgelegte Region verteilte Marker.
– mit Risiken von Krankheiten verknüpfte Marker.
– usw.

In jeder Kulturschale wird eine vorgegebene Menge DNA in Form einer Bank verteilt und anschließend bei 37°C für die Digestionen inkubiert. Anschließend werden die kompetente Bakterien hinzugefügt, und danach folgt die herkömmliche Technik der Transformation (Wärmeschock, Inkubation ohne Selektionsagens, usw.). Mit der Pipette werden 96 Kanülen entnommen und auf einer Petrischale angeordnet. Die Auslese wird per Augenschein oder mittels eines Spektrometers durchgeführt.
Dieser zweite Ansatz bietet den Vorteil, dass er sich ohne Weiteres automatisieren lässt und bedeutend Zeit einspart. In der Praxis sind für jedes Individuum eine große Anzahl von Markern zu untersuchen, denn die Herstellung der Bank bedeutet einen Arbeitsaufwand. Darüber hinaus ermöglicht dieser Ansatz einen völligen Verzicht auf den Einsatz kostspieliger und gesundheitsschädlicher Radioaktivität.
Ausführungsbeispiel 6: Dritter erfindungsgemäßer Ansatz der Untersuchung des menschlichen Polymorphismus.
Diese Abwandlung des erfindungsgemäßen Verfahrens der Untersuchung des menschlichen Polymorphismus betrifft die Anwendung der DMD auf die Untersuchung unterschiedlicher Allele eines einzigen Markers.
Nach dem Stand der Technik lassen sich diese Unterscheidungen hauptsächlich durch Sequenzierung treffen. In naher Zukunft werden DNA-Chips (T. Pastinen et al., Genome Research 7: 606-14, 1997; J.G. Hacia et al., Nature Genetics, 14: 441, 1996) eine Automatisierung dieser Arbeiten erlauben. Die DNA-Chips sind besonders nützlich im Falle der Untersuchung der gp120 des HIV-Virus oder zellulärer Oncogenesen wie p53, die unter zahlreichen Allelen vorkommen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung basiert diese Abwandlung darauf, zuvor die CEM jedes der Allele des untersuchten Segments zu bilden. Diese Identifizierung wird ein für allemal durchgeführt und ist auf die Allele beschränkt, die wenigstens eine unterschiedliche Restriktionsstelle aufweisen. Anschließend wird das untersuchte Fragment mittels PCR amplifiziert. Das Fragment wird in den erfindungsgemäßen Vektor kloniert. Dieses Verfahren ähnelt daher sehr demjenigen des Ausführungsbeispiels 5, mit dem Unterschied, dass eine Bank lediglich ein oder zwei Inserte aufweist, die den beiden Kopien des in einem Individuum vorhandenen Gens entsprechen. Die Schrittabfolge dieses Verfahrens ist identisch zu derjenigen des Ausführungsbeispiels 5.
Diese Arbeit kann in einem Schritt an mehreren Inserten gleichzeitig ausgeführt werden.

Claims

Verfahren zum Klonen eines Nucleinsäurefragments, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Herstellen einer DNA-Bank, die geeignet ist, um das zu klonierende Nucleinsäurefragment zu enthalten, indem DNA-Fragmente einer Probe in einen Vektor eingefügt werden, von dem sämtliche Spaltungsstellen durch Restriktionsenzyme entfernt wurde, bei denen die Stelle 5 bis 6 Nucleotide enthält, die jenen entsprechen, die für die Digestionen der Bank verwendet werden, wobei jedoch wenigstens eine oder zwei Stellen für den Aufbau der Bank beibehalten werden. b) Durchführen der Digestion parallel zu der Bank mittels wenigstens 10 Restriktionsenzymen, bei denen die Stelle 5 bis 6 Nucleotide enthält, so dass die Anzahl der gewonnenen monoaufgeschlossenen Banken gleich der Anzahl der verwendeten Enzyme ist. c) Testen jeder der in dem vorhergehenden Schritt gewonnenen monoaufgeschlossenen Banken, um die Integrität des zu klonierenden Nucleinsäurefragments zu bewerten und dementsprechend dessen multiples enzymatisches Merkmal (CEM = Caractéristique enzymatique multiple) zu bestimmen. d) erneute Verwendung der anfänglichen Gesamtbank und gleichzeitiges Aufschließen derselben durch Restriktionsenzyme, die die Integrität des zu klonierenden Nucleinsäurefragments nicht beeinträchtigen, so dass eine mehrfach aufgeschlossene Bank gewonnen wird. e) Isolieren des resistenten Klons, der das zu klonierende Nucleinsäurefragment enthält.
Verfahren zur Klonierung eines Nucleinsäurefragments nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Schritt (b) die Bank durch 50 bis 70 Restriktionsenzyme aufgeschlossen wird.
Verfahren zur Klonierung eines Nucleinsäurefragments gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Klonierungsvektor des Schritts (a) ferner wenigstens zwei weitere Stellen aufweist, die miteinander identisch sind oder auch nicht, sich von der oder den ersten Stellen und de(n) flankierenden unterscheiden und sich für eine Subklonierung des Nucleinsäurefragments eignen, sobald dieses isoliert ist.
Verfahren zur Klonierung eines Nucleinsäurefragments gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den Schritten (b) und (c) der folgende Schritt eingefügt ist: b') unabhängiges Transfizieren der monoaufgeschlossenen Banken in zelluläre Wirte, um Partien? zu erhalten, die den zellulären Wirten entsprechen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den Schritten (a) und (b) der folgende Schritt eingefügt ist: a') Verifizieren der Anwesenheit des zu klonierenden Nucleinsäurefragments in der Bank durch Transfizieren in einen zellulären Wirt, der das Fragment nicht aufweist, und Testen der Anwesenheit des Fragments in dem Wirt.
Verfahren nach einem der vordergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass dieses zwischen dem Schritt (d) und (e) den folgenden Schritt enthält: d') Transformieren der mehrfach aufgeschlossenen Bank des Schritts (d) in kompetente Wirte, um die Natur der klonierten Fragmente zu verifizieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Bank 1 bis 10⁸ unterschiedliche Fragmente der Größenordnung 0,1 kb bis 5 kb enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die in den Schritten (c) und/oder (a') durchgeführten Tests zum Verifizieren der Integrität der zu klonierenden Nucleinsäuresequenz allesamt Mittel zum Nachweis sind, sei es für die Sequenz selbst, als Sonde, sei es für das durch die Sequenz kodierte Protein, von der Art eines Liganden in Form eines Antikörpers, oder auch die Aktivität diese Protein als enzymatischer Marker, die durch beliebige dem Fachmann bekannte Mittel als fluoreszierende oder radioaktive Markierung erfasst werden können.
Verfahren zur Klonierung eines Gens durch Expressionsbanken nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass dieses umfasst: – den Schritt (a), – den Schritt (a'), zu dem es gehört, die Anwesenheit des gewünschten Gens in der Bank zu verifizieren, indem in eine Zelllinie transfiziert wird, die nicht die Aktivität oder den gewünschten Phänotypus aufweist, und indem deren Wiederherstellung gemessen wird, um die transfizierten Zellen von den nicht transfizierten Zellen zu unterscheiden, – den Schritt (b), – den Schritt (b'), zu dem es gehört, die monoaufgeschlossenen Banken des Schritts (b) unabhängig zu transfizieren, – den Schritt (c), zu dem es gehört, jede der in Schritt (b') gewonnenen Partien auf die Anwesenheit der Aktivität zu testen, die dem zu klonierenden Gen zugeordnet ist, und die Integrität der Sequenz des Gens zu ermitteln, um die CEM der dem Gen zugeordneten Aktivität zu bestimmen, – den Schritt (d), – den Schritt (d'), zu dem es gehört, die mehrfach aufgeschlossene Bank in kompetente Bakterien umzuwandeln, – den Schritt (e).
Verfahren zur Klonierung durch Homologie nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass dieses umfasst: – den Schritt (a), – den Schritt (b), – den Schritt (b'), zu dem es gehört, die Digestionsprodukte des Schritts (b) in kompetente Bakterien umzuwandeln, – den Schritt (c), zu dem es gehört, die transformierten Bakterien mit einem selektiven Milieu zusammen zu bringe, um große Mengen der aufgeschlossenen Banken zu erzeugen, die von abgespaltenen Produkten befreit sind, anschließend jede dieser Banken für sich durch das entsprechende Enzym an der in dem Vektor vorhandenen Subklonierungsstelle zu spalten, jedes der Digestionsprodukte getrennt in einer Agarosegelschale anzuordnen, die Digestionsprodukte migrieren zu lassen, diese auf eine Membran zu transferieren und sie mit einer für das zu klonierende Gen spezifischen Sonde durch Homologie zu hybridisieren, um ihre CEM zu bestimmen, – den Schritt (d), – den Schritt (e).
Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 9 zur Identifizierung – von Allelen aus unterschiedlichen Quellen von Tieren derselben Spezies, oder, im Falle des Menschen, von unterschiedlichen Individuen, – von genetischen Übereinstimmungen, die bei unterschiedlichen Spezies vorhanden sind, – von alternativen Spleißungen eines Gens. – von unterschiedlichen Mitgliedern einer genetischen Familie.
Southern-Blot-Verfahren zur Identifizierung von Inserts, wobei das Verfahren ein Klonierungsverfahren einer Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 9 verwendet, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren umfasst: – den Schritt (a), – den Schritt (b), – den Schritt (b'), zu dem es gehört, die in dem oben erwähnten Schritt (b) gewonnenen monoaufgeschlossenen Banken in kompetente Bakterien, oder äquivalente Wirte umzuwandeln, – den Schritt (c), zu dem es gehört die Bakterien mit einem selektiven Milieu zusammen zu bringen, um aufgeschlossene Banken zu erzeugen, die von abgespaltenen Produkten befreit sind, anschließend jede dieser Banken für sich durch das bzw. die Enzyme zu spalten, die der (den) Stelle(n) der Subklonierung entsprechen, die die eine (oder mehreren) Konstruktionsstellen der Bank flankieren, und die Digestionsprodukte in Agarose- oder Acrylamidgelschalen anzuordnen, dieses Gel migrieren zu lassen und auf eine Membran zu übertragen und mit den verwendeten Identifizierungsinserten als markierte Sonde, sei es einzeln, sei es in Gruppen, zu hybridisieren, um ihre CEM zu bestimmen,
Verfahren zur Untersuchung des Polymorphismus, wobei das Verfahren ein Southern-Blot-Verfahren zur Identifizierung von Inserts nach Anspruch 12 verwendet, dadurch gekennzeichnet, dass: – die genomische DNA-Bank des Schritts (a) wird zum Gegenstand der Untersuchung, – die in Schritt (c) als Sonden verwendeten Inserte sind Marker für den Polymorphismus.
Verfahren zur Untersuchung des Polymorphismus, dadurch gekennzeichnet, dass dieses umfasst: – die Schritte (a), bis (c) des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 10, zu dem es gehört, die CEM jedes bekannten Markers und anschließend den Aufbau einer genomischen DNA-Bank zu definieren, – den Schritt (d), zu dem es gehört, die Digestion durch Sätze von Enzymen zu bewirken, die der CEM entsprechen und den untersuchten Markern zugeordnet sind, – den Schritt (d'), zu dem es gehört, die mehrfach aufgeschlossenen Banken in kompetente Bakterien umzuwandeln, – den Schritt (e), zu dem es gehört, diese Bakterien in einem flüssigen oder festen Milieu zu züchten, das eine Substanz enthält, die für das Plasmid selektiv ist.