DE69913092T2

DE69913092T2 - Microassay zur Serienanalyse der Genexpression und Anwendungen davon

Info

Publication number: DE69913092T2
Application number: DE69913092T
Authority: DE
Inventors: Lydie Cheval; Jean-Marc Elalouf; Berangère Virlon
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1999-01-27
Filing date: 1999-01-27
Publication date: 2004-09-09
Anticipated expiration: 2019-01-28
Also published as: US6506561B1; DE69913092D1; JP2002535012A; CA2359272A1; US20030165910A1; EP1024201A1; WO2000044936A1; EP1024201B1

Description

Es stehen inzwischen verschiedene Methoden zur Verfügung, um die Genexpression auf der Stufe des Genoms zu verfolgen. Diese umfassen DNA-Microarrays (1, 2) und Macroarrays (3, 4), Bestimmung von Expressed Sequence Tags (EST) (5, 6) und serieller Analyse der Genexpression (7). Solche Verfahren wurden entwickelt und werden auch noch verwendet, um Makromengen von biologischem Material (1–5 μg Poly(A)-mRNAs, d. h. ~10⁷ Zellen) zu testen. Säugergewebe bestehen jedoch aus mehreren verschiedenen Zelltypen mit spezifischen physiologischen Funktionen und Genexpressionsmustern. Dies macht die Interpretation größerer Mengen von Expressionsdaten in höheren Organismen offensichtlich kompliziert. Es ist daher äußerst wünschenswert, Methoden zu entwickeln, die sich zur Analyse definierter Zellpopulationen eignen.
Ein nicht-quantitatives Verfahren zum Nachweis differentieller Genexpression aus Makromengen von cDNA unter Verwendung von Adapter-DNA und PCR-Primern, die an Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme, wie Sau3A I, hybridisieren, wurde in der Internationalen PCT-Anmeldung WO 97/29211 beschrieben.
Die Verwendung von kovalent mit Oligo(dT)₂₅ verknüpften paramagnetischen Kügelchen in einem RT-PCR-Verfahren wurde in AM. Biotechnol. Lab., 12, 12–145, 5/94 beschrieben, um eine cDNA-Genbank aus kleinen Mengen mRNA zu konstruieren; dieses Verfahren besitzt die Nachteile der PCR-Verfahren.
Es wurde gezeigt, daß SAGE rasche und detaillierte Information über die Transkripthäufigkeit und -diversität liefert (7–10). Sie beinhaltet mehrere Schritte für die mRNA-Reinigung, die Erzeugung und Isolierung von cDNA-Tags und die PCR-Amplifikation. Wir vermuteten, daß eine Steigerung der Ausbeute der verschiedenen Extraktionsvorgänge zusammen mit leichten Modifikationen bei der Anzahl der PCR-Zyklen die Potentialität der SAGE erweitern könnte. Hier stellen wir eine Mikroadaption der SAGE vor, die als SADE bezeichnet wird (11), da sie es im Gegensatz zum ursprünglichen Verfahren erlaubt, quantitative Daten der Genexpression für eine geringe Anzahl (30.000–50.000) Zellen zu liefern.
SAGE wurde erstmals 1995 von Velculescu et al. beschrieben (US-Patent 5 695 937 und 7) und beruht auf 3 Prinzipien, die nun alle experimentell bestätigt wurden: a) Tags mit kurzen Nukleotidsequenzen (10 bp) sind lang genug, um für ein Transkript spezifisch zu sein, besonders wenn sie aus einem definierten Teil eines jeden Transkripts isoliert werden; b) die Konkatenierung mehrerer Tags innerhalb eines einzigen DNA-Moleküls erhöht den Durchsatz der Datenerfassung beträchtlich; c) die quantitative Rückgewinnung Transkript-spezifischer Tags erlaubt es, repräsentative Genexpressionsprofile aufzustellen.
Dieses Verfahren wurde jedoch entwickelt, um Makromengen biologischer Materialien zu untersuchen (5 μg Poly(A)-RNAs, d. h. etwa 10⁷ Zellen). Da Säugergewebe aus mehreren verschiedenen Zelltypen mit spezifischen physiologischen Funktionen und Genexpressionsmustern bestehen, ist es äußerst wünschenswert, den SAGE-Ansatz zu verkleinern, um gut abgegrenzte Gewebefragmente oder isolierte Zellpopulationen zu untersuchen.
Die Erfinder haben nun ein neues Verfahren gefunden, mit dem sich Mikromengen von Proben handhaben lassen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Erhalt einer Genbank von Tags, die in der Lage sind, einen spezifischen Zustand einer biologischen Probe, wie eines Gewebes oder einer Zellkultur, zu definieren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es die folgenden aufeinanderfolgenden Schritte umfaßt:

(1) Einstufiges Extrahieren von mRNA mit kovalent an paramagnetische Kügelchen gebundenem Oligo(dT)₂₅ aus einer kleinen Menge einer biologischen Probe,
(2) Generieren einer doppelsträngigen cDNA-Genbank aus der mRNA gemäß den folgenden Schritten:
– Synthetisieren des ersten Strangs der cDNA durch reverse Transkription des mRNA-Templates mit einer reversen Transkriptase, die keine RNase H-Aktivität aufweist, zu einer ersten komplementären einzelsträngigen cDNA,
– Synthetisieren des zweiten Strangs der cDNA durch Nicktranslation der mRNA in dem gebildeten mRNA-cDNA-Hybrid mittels einer E. coli DNA-Polymerase,
(3) Spalten der erhaltenen cDNAs mit der Restriktionsendonuklease Sau3A I als Anchoring-Enzym,
(4) Auftrennen der gespaltenen cDNAs in zwei Aliquote,
(5) Ligieren der in jedem der beiden Aliquote enthaltenen cDNA über die Sau3A I-Restriktionsschnittstelle mit einem Linker, der aus einem doppelsträngigen cDNA-Molekül besteht, das eine der folgenden Formeln besitzt: GATCGTCCC-X₁ oder GATCGTCCC-X₂ wobei X₁ und X₂, die 30 bis 37 Nukleotide umfassen und verschieden sind, eine PCR-Startstelle von 20–25 bp mit einer Tm von 55–65°C einschließen, und wobei GATCGTCCC (SEQ ID NO: 1) einer mit einer BsmF I-Restriktionsschnittstelle verknüpften Sau3A I-Restriktionsschnittstelle entspricht,
(6) Verdauen der in Schritt (5) erhaltenen Produkte mit dem Tagging-Enzym BsmF I und Freisetzen von Linkern mit einem verankerten kurzen Stück cDNA, das einem Transkript-spezifischen Tag entspricht, wobei der Verdau BsmF I-Tags liefert, die für die ursprüngliche mRNA spezifisch sind,
(7) Erzeugen glatter Enden an den BsmF I-Tags mit einer DNA-Polymerase, vorzugsweise T7 DNA-Polymerase oder Vent-Polymerase, und Mischen der mit den verschiedenen Linkern ligierten Tags,
(8) Ligieren der in Schritt (7) erhaltenen Tags mit einer DNA-Ligase unter Bildung von Ditags,
(9) Amplifizieren der in Schritt (8) erhaltenen Ditags mit Primern, die 20–25 bp umfassen und eine Tm von 55–65°C besitzen,
(10) Isolieren der Ditags, die zwischen 20 und 28 bp aufweisen, aus den in Schritt (9) erhaltenen Amplifikationsprodukten durch Verdau der Amplifikationsprodukte mit dem Anchoring-Enzym Sau3A I und Auftrennen der verdauten Produkte auf einem geeigneten Elektrophoresegel,
(11) Ligieren der in Schritt (10) erhaltenen Ditags zu Konkatemeren, Reinigen der Konkatemeren und Abtrennen der Konkatemeren mit mehr als 300 bp,
(12) Klonieren und Sequenzieren der Konkatemeren und
(13) Testen der verschiedenen erhaltenen Tags.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform dieses Verfahrens wird die Synthese des ersten Strangs der cDNA in Schritt (2) mit reverser Transkriptase von Moloney-Maus-Leukämie-Virus (Moloney Murine Leukemia Virus-RT, M-MLV RT) und mit Oligo(dT)₂₅ als Primern durchgeführt.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform dieses Verfahrens sind die Linker von Schritt (5) vorzugsweise Hybrid-DNA-Moleküle, die aus Linkern 1A und 1B oder aus Linkern 2A und 2B mit den folgenden Formeln gebildet sind:
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens beträgt die Menge von jedem Linker in Schritt (5) höchstens 8–10 pmol und liegt vorzugsweise zwischen 0,5 pmol und 8 pmol für Anfangsmengen von 10–40 ng mRNAs bzw. 5 μg mRNAs.
Gemäß noch einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens haben die Primer von Schritt (9) vorzugsweise die folgenden Formeln:
Gemäß noch einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens umfaßt die biologische Probe von Schritt (1) ≤ 5·10⁶ Zellen, entsprechend höchstens 50 μg Gesamt-RNA oder 1 μg Poly(A)-RNA.
Erfindungsgemäß bedeutet biologische Probe beispielsweise: Gewebe, Zellen (native oder kultivierte Zellen), die zur Extraktion von mRNA lysiert werden.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens stammt die Gewebeprobe aus Nieren, insbesondere aus Nephronsegmenten entsprechend etwa 15.000 bis 45.000 Zellen, entsprechend 0,15–0,45 μg Gesamt-RNA.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung einer nach dem oben definierten Verfahren erhaltenen Genbank von Tags zum Beurteilen des physiologischen oder pathologischen Zustands einer biologischen Probe, wie eines Gewebes oder einer Zellkultur.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Bestimmung eines Genexpressionsprofils, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es umfaßt:

– Durchführen der Schritte (1) bis (13) nach Anspruch 1 und
– Übertragen der Häufigkeit von cDNA-Tags auf ein Genexpressionsprofil.

Beispielsweise ist das Genexpressionsprofil des äußeren medullären Sammelrohrs (OMCD) der Maus und des medullären dicken aufsteigenden Schenkels (MTAL) der Maus in Tabelle I angegeben und es wird unter Durchführung des hier oben definierten Verfahrens erhalten.
Die Erfindung betrifft ferner einen Kit zur Feststellung eines Genexpressionsprofils, der dadurch gekennzeichnet ist, daß die Anwesenheit eines cDNA-Tags, das von der aus einer biologischen Probe extrahierten mRNA erhalten wurde, auf die Expression eines Gens schließen läßt, das diese Tag-Sequenz an einer geeigneten Stelle trägt, d. h. unmittelbar benachbart zu der dem 3'-Ende in dieser cDNA, die aus der mRNA erhalten wurde, am nächsten gelegenen Sau3A I-Stelle, wobei der Kit zusätzlich zu üblichen Puffern zur cDNA-Synthese, zum Verdau mit Restriktionsenzymen, zur Ligation und zur Amplifikation umfaßt:

– Behälter, die Linker enthalten, die aus einem doppelsträngigen cDNA-Molekül bestehen, das eine der folgenden Formeln besitzt: GATCGTCCC-X₁ oder GATCGTCCC-X₂ wobei X₁ und X₂, die 30 bis 37 Nukleotide umfassen und verschieden sind, eine PCR-Startstelle von 20–25 bp mit einer Tm von 55–65°C einschließen, und wobei GATCGTCCC (SEQ ID NO: 1) einer mit einer BsmF I-Restriktionsschnittstelle verknüpften Sau3A I-Restriktionsschnittstelle entspricht, und
– Behälter, die Primer enthalten, die 20–25 bp umfassen und eine Tm von 55–65°C besitzen.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des Kits enthält dieser vorteilhaft

– Behälter, die Hybrid-DNA-Moleküle enthalten, die aus Linkern 1A und 1B oder aus Linkern 2A und 2B mit den folgenden Formeln gebildet sind:
– Behälter, die die folgenden Primer enthalten:

Im Vergleich mit SAGE umfaßt das vorliegende SADE-Verfahren die folgenden Merkmale: 1) einstufige mRNA-Reinigung aus Gewebelysat; 2) Verwendung einer reversen Transkriptase, die keine Rnase H-Aktivität aufweist; 3) Verwendung eines unterschiedlichen Anchoring-Enzyms; 4) Modifikation von Verfahren zum Erzeugen von cDNA-Tags mit glatten Enden; 5) Konstruktion neuer Linker und PCR-Primer.
1, abgeändert aus den ursprünglichen Untersuchungen von Velculescu et al., faßt die verschiedenen Schritte des SADE-Verfahrens zusammen, das eine Mikroadaption von SAGE ist. Kurz gesagt werden mRNAs, wie bereits oben ausgeführt, mit Oligo(dT)₂₅, das kovalent an paramagnetische Kügelchen gebunden ist, extrahiert. Doppelsträngige cDNA wird aus mRNA synthetisiert, wobei Oligo(dT)₂₅ als Primer für die Synthese des ersten Strangs verwendet wird. Die cDNA wird dann mit einer Restriktionsendonuklease (Anchoring-Enzym: Sau3A I) mit einer 4 bp-Erkennungsstelle gespalten. Da ein solches Enzym DNA-Moleküle im Schnitt alle 256 bp (44) spaltet, läßt sich vorhersagen, daß im wesentlichen alle cDNAs wenigstens einmal gespalten werden. Das 3'-Ende einer jeden cDNA wird mit Hilfe der Eigenschaft der paramagnetischen Kügelchen isoliert und in zwei Hälften geteilt. Jedes der beiden Aliquote wird über die Restriktionsstelle des Anchoring-Enzyms an einen der beiden Linker, die eine Erkennungsstelle vom IIS-Typ (Tagging-Enzym: BsmF I) und eine Startstelle für die PCR-Amplifikation enthalten, ligiert. Restriktionsendonukleasen vom IIS-Typ weisen Erkennungs- und Spaltstellen auf, die durch eine definierte Länge voneinander getrennt sind (für BsmF I 14 bp), gleich durch welche dazwischen liegende Sequenz. Verdau mit dem Restriktionsenzym vom Typ IIS setzt folglich Linker mit einem verankerten kurzen Stück cDNA frei, das einem Transkript-spezifischen Tag entspricht. Nach Erzeugung von Tags mit glatten Enden werden die beiden Aliquote miteinander verknüpft und durch PCR amplifiziert. Da alle Targets die gleiche Länge aufweisen (110 bp) und mit den gleichen Primern amplifiziert werden, werden potentielle durch PCR eingeführte Distorsionen stark reduziert. Außerdem lassen sich diese Distorsionen bestimmen und die Daten entsprechend korrigieren (7, 8). Ditags in den PCR-Produkten werden durch Verdau mit dem Anchoring-Enzym und Gelreinigung zurückgewonnen und dann konkateniert und kloniert.
Bei dem SAGE-Verfahren werden mRNAs mit herkömmlichen Verfahren isoliert und dann für die cDNA-Synthese mit biotinyliertem Oligo(dT) hybridisiert. Nach Spaltung mit dem Anchoring-Enzym Nla III wird die biotinylierte cDNA-Fraktion (3'-Ende) duch Bindung an Streptavidinkügelchen gereinigt.
Bei dem SADE-Verfahren werden mRNAs direkt aus dem Gewebelysat durch Hybridisierung mit kovalent an magnetische Kügelchen gebundenem Oligo(dT) isoliert. Dann werden alle Schritte des Experiments (bis Schritt 3 von Versuchsvorschrift 5, wie nachfolgend beschrieben) an magnetischen Kügelchen durchgeführt. Diese Vorgehensweise spart zu Anfang des Experiments Zeit und, noch wichtiger, liefert eine bessere Rückgewinnung. Eine quantitative Analyse der cDNA-Mengen, die zur Konstruktion einer Genbank zur Verfügung stehen, ergab dramatische Unterschiede zwischen SAGE und SADE. Bei dem SAGE-Verfahren werden ausgehend von 500 mg Gewebe 1,7 μg cDNA erhalten, und nur 4 ng waren in der Lage, nach Verdau mit Sau3A I an Streptavidinkügelchen zu binden. Bei dem SADE-Verfahren wurden ausgehend von 250 mg Gewebe 3,2 μg cDNA an Kügelchen synthetisiert und 0,5 μg blieben nach Spaltung mit Sau3A I gebunden. Die höhere Ausbeute mit SADE (× 250) erklärt den Erfolg bei der Konstruktion von Genbanken aus so wenig wie 30.000 Zellen. Die Verwendung unterschiedlicher Quellen für Oligo(dT) führte zu einer schlechten Rückgewinnung von cDNA. Dies läßt sich durch die Tatsache erklären, daß die Bindungskapazität von Streptavidinkügelchen durch mehrere Parameter verändert werden kann, beispielsweise die Anwesenheit von Phenol, die Länge und Zusammensetzung der biotinylierten DNA-Fragmente und die Länge des Spacers zwischen dem Oligo(dT)- und dem Biotinmolekül.
Ein weiterer wichtiger Unterschied zwischen SAGE und SADE betrifft das gewählte Anchoring-Enzym. Obwohl jedes beliebige Restriktionsenzym mit einer 4 bp-Erkennungsstelle als Anchoring-Enzym dienen könnte, wurde Sau3A I in unseren Untersuchungen gegenüber Nla III (7–10) oder anderen Enzymen bevorzugt. Mehrere cDNA-Genbanken, die zur Sequenzierung im Großmaßstab verwendet werden, werden durch Vektor-Priming konstruiert, gefolgt von cDNA-Spaltung mit Mbo I (einem Isoschizomer von Sau3A I, das die (methylierte) Vektor-DNA nicht schneidet) und Zirkularisierung (6). SADE-Tags entsprechen daher den 5'-Enden der cDNA dieser Genbanken, was es ermöglicht, EST-Datenbasen zur Analyse der Daten effizienter zu nutzen.
Zusätzlich zu den vorhergehenden Ausführungsformen umfaßt die Erfindung weitere Ausführungsformen, die sich aus der folgenden Beschreibung ergeben, die auf Beispiele zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie die anliegenden Zeichnungen verweist. dabei ist:
1: Darstellung der Verfahrensschritte zur Konstruktion von SADE-Genbanken. Poly(A)-RNAs werden aus Gewebelysat unter Verwendung von kovalent mit paramagnetischen Kügelchen verknüpftem Oligo(dT)₂₅ isoliert und cDNA wird unter Festphasenbedingungen synthetisiert. Fettgedruckte Buchstaben entsprechen biologisch relevanten Sequenzen, während schwache Buchstaben Sequenzen darstellen, die sich von den Linkern ableiten. Das Anchoring-Enzym (AE) ist Sau3A I, während das Tagging-Enzym (TE) BsmF I ist. Für Einzelheiten, siehe Text.
2: Gelanalyse von cDNAs, die aus verschiedenen Mengen Gewebe synthetisiert wurden. Poly(A)-RNAs wurden aus den angegebenen Mengen Mäuseniere isoliert, und cDNAs wurden synthetisiert und an paramagnetischen Kügelchen mit Sau3A I verdaut (siehe Versuchsvorschriften 1–2). Von den Kügelchen freigesetzte cDNAs wurden zurückgewonnen und die Hälfte des aus jeder Reaktion erhaltenen Materials wurde auf einem 1%igen Agarosegel, das mit Ethidiumbromid gefärbt war, analysiert. Die Positionen der Molekulargewichtsmarker sind in bp angegeben: links, BstE II-Verdau von λ; rechts, Msp I-Verdau von pBR.
3: PCR-Amplifikation von Ditags. Poly(A)-RNAs wurden aus 50 oder 150 mm mikropräparierten Nephronsegmenten isoliert (entsprechend etwa 15.000 bzw. 45.000 Zellen). Die entsprechenden Ditags wurden durch PCR mit der angegebenen Anzahl von Zyklen amplifiziert und auf einem mit Ethidiumbromid gefärbten 3%igen Agarosegel analysiert. Das erwartete Produkt (Linker + 1 Ditag) ist 110 bp lang. Molekulargewichtsmarker (M) ist eine 10 bp-DNA-Leiter (Life Technologies).
4: Gelanalyse von Konkatemeren. Ditags wurden durch Ligation konkateniert (2 h bei 16°C) und dann einer Elektrophorese durch ein 8%iges Polyacrylamidgel unterworfen. Das Gel wurde nachträglich mit SYBR Green I angefärbt und durch UV-Belichtung bei 305 nm sichtbar gemacht. Die Migration der Molekulargewichtsmarker (BstE II-Verdau von λ) ist auf der rechten Seite angegeben.
5: Vergleich des Genexpressionsniveaus in zwei Nephronteilen der Mäuseniere. SADE-Genbanken wurden aus 50.000 Zellen konstruiert, die durch Mikropräparation aus medullären Sammelrohren oder medullären dicken aufsteigenden Schenkeln isoliert worden waren, und in jedem Fall wurden 5000 Tags sequenziert. Die Daten zeigen die 18 häufigsten Tags der Sammelrohre, die von nukleären Transkripten stammen (mitochondriale Tags wurden von der Analyse ausgeschlossen), und ihre entsprechende Häufigkeit in der Genbank für den dicken aufsteigenden Schenkel.
Es versteht sich jedoch, daß diese Beispiele lediglich der Erläuterung des Gegenstands der Erfindung dienen und diesen in keiner Weise beschränken.
Beispiel:
1. Gewebeprobenbereitung und mRNA-Isolierung
1.1. Gewebeprobenbereitung und Lyse
Die Anfangsschritte der Genbankkonstruktion erfordern die üblichen Vorsichtsmaßnahmen, die bei Experimenten, die mit RNAs durchgeführt werden, empfohlen werden (12). Da die Genbankkonstruktion PCR im Großmaßstab beinhaltet (Versuchsvorschrift 6), muß man zusätzlich sorgfältig darauf achten, Verunreinigungen aus früheren Genbanken zu vermeiden. Das Arbeiten unter PCR-Reinheitsbedingungen ist besonders wichtig, wenn geringe Mengen an Gewebe oder Zellen verwendet werden.
Ausgehend von ganzen Geweben (z. B. Niere, Leber, Hirn ...) kann routinemäßig die folgende Vorgehensweise angewandt werden. Nach Anästhesie oder Köpfen der Tiere wird das Gewebe so schnell wie möglich entnommen, rasch in eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült, in ~50 mg-Stücke geschnitten und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die eingefrorene Probe wird dann unter flüssigem Stickstoff mit einem Mörser und einem Pistill zu einem feinen Pulver verrieben, in Lysis-Bindungspuffer überführt (Versuchsvorschrift 1) und mit einem Dounce-Gewebezerkleinerer homogenisiert. Um Materialverlust zu vermeiden, können kleine Proben (≤ 20 mg) ohne vorheriges Einfrieren in den Lysis-Bindungspuffer überführt und in einem 1 ml-Dounce homogenisiert werden. Die jeweiligen Mengen an Gewebe und Lysis-Bindungspuffer, die für verschiedene Bedingungen benötigt werden, sind in Tabelle II angegeben.
Tabelle II. mRNA-Isolierung im Klein- und Großmaßstab und cDNA-Synthese
Das Verfahren ist ausgehend von isolierten oder kultivierten Zellen viel schneller. Die Zellsuspension, die in einem geeigneten Kultur- oder Überlebensmedium gehalten wird, muß nur 5 min bei 600–1200 g zentrifugiert werden. Nach Entfernung des Überstands wird der Lysis-Bindungspuffer auf das Zellpellet gegeben und die Probe wird durch Vortexen homogenisiert. Diese Vorgehensweise wurde erfolgreich auf 3 × 10⁴–3 × 10⁷ Zellen angewandt (Tabelle II).
1.2. mRNA-Isolierung.
Die Versuchsvorschriften 1–7 beschreiben die Herstellung einer SADE-Genbank aus 0,5 mg Gewebe. Die wiedergewonnene Menge cDNA entspricht einem Experiment, das an Mäusenieren durchgeführt wurde. Leicht unterschiedliche Mengen sind aus anderen Geweben zu erwarten, entsprechend ihrem mRNA-Gehalt. Die hier beschriebenen Verfahrensschritte wurden ohne Modifikationen wiederholt mit 3 × 10⁴–10⁵ isolierten Zellen angewandt. Da manche Applikationen an großen Mengen Gewebe oder Zellen durchgeführt werden können, werden auch Anpassungen der Versuchsvorschriften und erwartete Ergebnisse für diese Art von Experimenten angegeben.
Bei den Experimenten zu Beginn wurden RNAs mit StandardVerfahrenn extrahiert (13) und Poly(A)-RNAs wurden an Oligo(dT)-Säulen isoliert. Abgesehen davon, daß diese Vorgehensweise zeitaufwendig ist, liefert sie geringe und schwankende Mengen mRNA und läßt sich nicht leicht im Maßstab verkleinern. Das hier beschriebene alternative Verfahren (Verwendung von kovalent an paramagnetische Kügelchen gebundenem Oligo(dT)₂₅) ist ein Assay für die mRNA-Isolierung aus Gewebelysat in einem einzigen Teströhrchen. Bei uns liefert er 4mal höhere mRNA-Mengen als Standardverfahren. Kits und hilfreiche Anleitungen zur mRNA-Isolierung mit Oligo(dT)-Kügelchen sind von Dynal erhältlich. Die Handhabung dieser Kügelchen ist relativ einfach, Zentrifugation, Trocknen oder Einfrieren sind jedoch sorgfältig zu vermeiden, da bei allen drei Verfahren eine Abnahme ihrer Bindungskapazität zu erwarten ist. Andererseits lassen sich Kügelchen durch sanftes Vortexen oder Pipettieren ohne extreme Vorsichtsmaßnahmen resuspendieren.
Versuchsvorschrift 1. mRNA-Reinigung
Geräte und Reagenzien

– Geeignetes Gewebe oder geeignete Zellen.
– Dynabead mRNA Direct Kit (Dynal, Ref. 610–11), enthaltend Dynabeads-Oligo(dT)₂₅, Lysis-Bindungspuffer und Waschpuffer.
– 5 × Puffer zur reversen Transkription (RT) (250 mM Tris-HCl (pH 8,3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl₂), geliefert mit dem cDNA-Synthesekit (siehe Versuchsvorschrift 2).
– Magnetic Particle Concentrator·(MPC) für 1,5 ml-Röhrchen (Dynal, Ref. 12004).
– Glykogen zur Molekularbiologie (Boehringer Mannheim, Ref. 901393).

Verfahren

1. Lysieren der Gewebeprobe in 100 μl Lysis-Bindungspuffer, supplementiert mit 10 μg Glykogen.
2. Zugeben von 20 μl Dynabeads in ein 1,5 ml-Röhrchen und Konditionieren von diesen gemäß den Angaben des Herstellers.
3. Entfernen des Überstands von den Dynabeads mittels dem MPC und Zugeben des Gewebelysats (100 μl). Mischen durch Vortexen und Hybridisieren der mRNAs an die Kügelchen durch 10 min Inkubatieren bei Raumtemperatur.
4. Röhrchen 2 bis 5 min in den MPC geben und Entfernen des Überstands. Die mRNAs sind an den Kügelchen fixiert.
5. Durchführen der folgenden Waschschritte mit dem MPC (alle Puffer enthalten 20 μg/ml Glykogen): zweimal mit 200 μl Waschpuffer, enthaltend Lithiumdodecylsulfat (LiDS), dreimal mit 200 μl Waschpuffer und zweimal mit 200 μl eiskaltem 1 × RT-Puffer. Resuspendieren der Kügelchen durch Pipettieren, Überführen der Suspension in ein frisches 1,5 ml-Röhrchen, einmal Waschen mit 200 μl eiskaltem 1 × RT-Puffer und unmittelbar Fortfahren mit Versuchsvorschrift 2. Die mRNAs an den Kügelchen sind nun zur Synthese des 1. cDNA-Strangs bereit.

1.3. mRNA-Integrität und -Reinheit
Vor Herstellung einer cDNA-Genbank ist es allgemein ratsam, die mRNA-Integrität durch Northern Blot-Analyse zu prüfen. Dieses Kontrollexperiment verbraucht jedoch einen Teil des Materials, benötigt mehrere Tage und führt häufig zu nicht eindeutigen Ergebnissen (zahlreiche Gründe können zu schwachen Signalen bei der Northern Hybridisierung führen). Außerdem ist es nicht mehr möglich, wenn man geringe Mengen Gewebe oder Zellen verwendet. Abbau von RNA ist nur unter den drei folgenden Bedingungen zu erwarten: 1) Das Überleben der Zellen vor Lysis oder Einfrieren ist nicht gewährleistet; 2) Auftauen von Zellen außerhalb von Lysis-Puffer, und 3) Verwendung von Reagenzien schlechter Qualität. Da RNase-freie Reagenzien nun von verschiedenen Firmen erhältlich sind, ist es sehr viel rascher und effektiver, die Bedingungen für ein Überleben (d. h. Auswahl des geeigneten Kulturmediums) und Einfrieren zu prüfen, als aufwendige Tests an RNA-Aliquoten durchzuführen.
Die Reinheit der mit Oligo(dT)-Kügelchen isolierten mRNAs ist besser als die, die mit herkömmlichen Verfahren erhalten wurde. Als wir SAGE-Genbanken mit mRNAs herstellten, die mit Guanidiniumthiocyanat und Olligo(dT)-Säulen extrahiert worden waren, beliefen sich die nukleär codierten rRNAs auf 1% der sequenzierten Tags. Bei dem alternativen Extraktionsverfahren für mRNA gibt es in der Genbank keine rRNA-Tags mehr.
2. Synthese des 1. und 2. Strangs
2.1. Synthese des 1. cDNA-Strangs
Der erste Schritt bei der Synthese von cDNA ist die Kopie des mRNA-Templates zu komplementärer einzelsträngiger cDNA. In Versuchsvorschrift 2 wird der 1, cDNA-Strang mit Moloney-Maus-Leukämie-Virus-RT (M-MLV RT) synthetisiert.
Mit diesem Enzym konnten wir SADE-Genbanken sowohl aus großen als auch sehr kleinen Mengen von Zellen herstellen (Tabelle 1). In unserer letzten Reihe von Experimenten haben wir jedoch SuperScript II M-MLV RT verwendet, die mit dem SuperScript-cDNA-Synthesekit (Life Technologies, Ref. 18090-019) geliefert wird. In diesem Fall war die Menge an gebildeter cDNA (siehe 2.3) ~4mal höher. Obwohl diese bessere Ausbeute wahrscheinlich sowohl auf die Synthese längerer cDNAs (was für die vorliegende Anwendung nicht wesentlich ist) als auch auf eine höhere Zahl von cDNR-Molekülen zurückzuführen ist, empfehlen wir stark, für sehr kleine Proben (≤ 50.000 Zellen) SuperScript II M-MLV RT zu verwenden. Die Versuchsvorschrift ist der hier beschriebenen mit Ausnahme der Reaktionsvolumina ähnlich (20 μl zur Synthese des 1. Strangs und 150 μl zur Synthese des 2. Strangs).
mRNAs werden vor der reversen Transkription im allgemeinen 5 min bei 65°C erhitzt, um Sekundärstrukturen aufzubrechen. Da solch eine hohe Temperatur auch das mRNA-Oligo(dT)₂₅-Hybrid denaturiert, erhitzen wir die Probe vor der Synthese des ersten Strangs nur bei 42°C.
2.2. Synthese des 2. Strangs
Zur Synthese des 2. cDNA-Strangs wurden zahlreiche Verfahrenn entwickelt. Das hier verwendete Verfahren ist eine Modifikation der Verfahren von Grubler und Hoffman. Kurz gesagt wird die mRNA (in dem mRNA-cDNA-Hybrid) durch E. coli RNAse H "genickt". E. coli DNA-Polymerase initiiert die Synthese des zweiten Strangs durch Nicktranslation. E. coli DNA-Ligase schließt sämtliche Bruchstellen, die im zweiten cDNA-Strang verbleiben. Das Verfahren wird in Versuchsvorschrift 2 beschrieben. Dieser Schritt ist üblicherweise sehr effizient (etwa 100%), so daß eine Inkubationsdauer von 2 h ausreicht, wenn man von Makromengen an Material ausgeht (> 100 mg Gewebe oder 10⁷ Zellen).
Versuchsvorschrift 2. cDNA-Synthese und -Spaltung
Geräte und Reagenzien

– cDNA-Synthesekit (Life Technologies, Ref. 18267-013) enthält alle Puffer und Enzyme, die für die Synthese des ersten und zweiten cDNA-Strangs notwendig sind.
– α[³²P]dCTP, 6000 Ci/mmol (Amersham, Ref. AA0075).
– TEN (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 1 M NaCl). Restriktionsendonuklease Sau3A I, 4 U/μl (New England Biolabs, Ref. 169L), geliefert mit 10 × Reaktionspuffer und gereinigtem 100 × Rinderserumalbumin (BSA, 10 mg/ml).
– Magnetic Particle Concentrator MPC (Dynal).
– Geigerzähler.
– Automatischer Thermocycler oder bei 42°C, 37°C und 16°C äquilibrierte Wasserbäder.

Verfahren

1. Resuspendieren der Kügelchen in 12,5 μl 1 × Reaktionspuffer für den ersten Strang (d. h. RT).
2. 2 min Inkubieren bei 42°C.
3. Röhrchen 2 min bei 37°C halten. Zugeben von 12,5 μl der folgenden Mischung: 5 μl DEPC-behandeltes Wasser, 2,5 μl 5 × Puffer für den ersten Strang, 1,25 μl 10 mM dNTP, 2,5 μl 100 mM DTT, 1,25 μl Reverse Transkriptase von MMLV.
3. 1 h Inkubieren bei 37°C und Kühlen auf Eis.
4. Herstellen der folgenden Mischung auf Eis: 169,7 μl DEPC-behandeltes Wasser, 4,5 μl 10 mM dNTP, 24 μl Puffer für den 2. Strang, 2 μl α[³²P]dCTP, 6 μl E. coli DNA-Polymerase I, 1,05 μl E. coli RNAse H, 0,75 μl E. coli DNA-Ligase, 2 μl Glykogen, 5 μg/μl.
5. Zugeben von 175 μl zum Röhrchen für den ersten Strang und Inkubieren bei 16°C über Nacht. Aufbewahren der restlichen Mischung zur anschließenden Messung der Radioaktivität und Berechnung der spezifischen Aktivität von dCTP.
6. Waschen der Kügelchen zur Entfernung von nicht eingebautem α[³²P]dCTP: 4mal mit 200 μl TEN + BSA und 3mal mit 200 μl eiskalter 1 × Mischung Sau3A I + BSA . Prüfen mit Geigerzähler, daß das letzte Eluat nicht radioaktiv ist, während das an die Kügelchen gebundene Material hoch radioaktiv ist.
7. Zugeben der folgenden Mischung auf die Kügelchen: 88 μl H₂O, 10 μl 10 × Mischung Sau3A I, 1 μl 100 × BSA, 1 μl Sau3A I. 2 h Inkubieren bei 37°C. Zwischenzeitlich Vortexen.
8. 5 min Kühlen auf Eis.
9. Entfernen des Überstands, der das 5'-Ende der cDNA enthält, mittels MPC. Einmal Waschen mit 200 μl 1 × Mischung Sau3A I + BSA . Entfernen dieses zweiten Überstands, Poolen mit dem ersten und Aufbewahren der resultierenden Lösung (300 μl), um die Ausbeute der Synthese des zweiten Strangs zu messen (siehe Text). Vor Weitermachen mit Schritt 10 Prüfen mit Geigerzähler, daß sowohl das Eluat als auch die Kügelchen radioaktiv sind.
10. Resuspendieren der Kügelchen in 200 μl TEN, supplementiert mit BSA .

2.3. Ausbeute der Synthese des 2. Strangs
Ein Verfahren zur Berechnung der Ausbeute der Synthese des ersten und des zweiten cDNA-Strangs wird in der Anleitung für den cDNA-Synthesekit angegeben. Wir bestimmen die Ausbeute der Synthese des 1. cDNA-Strangs nicht, da dies, wie oben diskutiert (1.3), den Verzicht auf einen Teil des Präparats beinhaltet.
Die Menge der gebildeten doppelsträngigen (ds) cDNA wird durch Messen des Einbaus von Radioaktivität in das 5'-Ende der cDNA berechnet, die nach Sau3A I-Verdau in den Überstand freigesetzt wird (siehe Versuchsvorschrift 2). Der 300 μl-Überstand wird mit PCI extrahiert und die ds cDNA wird in Gegenwart von Glykogen (50 μg/ml) und 2,5 M Ammoniumacetat mit Ethanol präzipitiert. Das Pellet wird in 8 μl TE resuspendiert. Die Hälfte des Materials wird zur Flüssigszintillationszählung verwendet und der Rest wird auf ein 1,0- oder 1,5%iges Agarosegel aufgetragen. Für Experimente, die an 250, 30, 4 und 0,5 mg Mäuseniere durchgeführt wurden, erhielten wird die folgenden Mengen (μg) an ds cDNA: 2,8, 0,3, 0,05 und 0,01. Die höhere Menge entspricht dem Einbau von 1,3% der eingesetzten Radioaktivität. In diesen Experimenten konnten drei der vier cDNA-Proben durch Färben mit Ethidiumbromid nach der Gelelektrophorese nachgewiesen werden (2). Ihre Größe lag zwischen < 0,2 und ~3 kbp (die geringere Größe der meisten cDNA-Fragmente ist auf den Verdau mit Sau3A I zurückzuführen). Wenn die cDNA-Mengen unterhalb der Nachweisgrenze für die FärbeVerfahren mit Ethidiumbromid liegen, kann eine Analyse mittels Autoradiographie erfolgen. In diesem Fall wird das Gel in 10%iger Essigsäure fixiert, vakuumgetrocknet und über Nacht bei –80°C mit einer Verstärkerfolie für die Autoradiographie exponiert.
3. Konstruktion, Herstellung und Ligation von Linkern
3.1. Konstruktion von Linkern
Zu diesem Zweck können zahlreiche Linker verwendet werden. Die Linker müssen drei wichtige Sequenzen enthalten: a) den geeigneten Überhang des Anchoring-Enzyms; b) eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym vom Typ IIS (Tagging-Enzym); c) eine Startstelle für die PCR-Amplifikation. Für die erfolgreiche Herstellung von Genbanken sind hochqualitative Linker entscheidend.
Tabelle III gibt die Sequenz der Linker und PCR-Primer an, die in unseren Experimenten verwendet wurden. Alle vier Linker müssen gelgereinigt erhalten werden. Die Linker 1B und 2B zeigen zwei Modifikationen: a) Phosphorylierung am 5'-Ende und b) C7-Amino-Modifikation am 3'-Ende. Die Linkerphosphorylierung kann entweder enzymatisch mit T4 Polynukleotidkinase oder chemisch während der Oligonukleotidsynthese erfolgen. In beiden Fällen muß die Phosphorylierungseffizienz getestet werden (Versuchsvorschrift 3). Wir verwenden chemisch phosphorylierte Linker. Linkermodifikation am 3'-Ende dient dazu, die Effizienz der Ditag-Bildung zu erhöhen (Versuchsvorschrift 5, Schritt 8–11). Tatsächlich kann das modifizierte 3'-Ende nicht in glatte Enden überführt werden und ligiert nicht an cDNA-Tags oder Linker.
Tabelle III. Sequenz von Linkern und PCR-Primern
Was die PCR-Startstelle betrifft, so wurde sie mit Hilfe der Oligo^TM-Software (Medprobe, Norwegen) konstruiert, um PCR-Primer mit hoher Tm (60°C) zu erhalten und um ein Selfpriming oder die Bildung von Sense/Antisense-Dimeren zu vermeiden. In "linken" und "rechten" Linkern müssen zwei unterschiedliche Startstellen konstruiert werden, da das Target ansonsten eine "Panhandle"-Bildung eingeht und so der PCR-Amplifikation entgeht.
Versuchsvorschrift 3. Herstellen und Testen von Linkern
Geräte und Reagenzien

– Linker 1A, 1B, 2A und 2B zu 20 pmol/μl.
– Primer 1 und 2 zu 20 pmol/μl.
– T₄ DNA-Ligase, 1 U/μl (Life Technologies, Ref. 15224-017) und 5 × Reaktionspuffer.
– 10 mM ATP.
– PCR-Reagenzien: Taq-DNA-Polymerase 5 U/μl (Eurobio), 10 × PCR-Puffer (200 mM Tris-HCl (pH 8,3), 15 mM MgCl₂, 500 mM KCl, 1 mg/ml Gelatine), 1,25 mM dNTP, 100 mM MgCl₂ und 100 mM DTT.
– Restriktionsendonukleasen Sau3A I (4 U/μl) und BsmF I (2 U/μl) (New England Biolabs, Ref. 169L und 572L), geliefert mit 10 × Reaktionspuffer und 100 × BSA.
– 10 bp-DNA-Leiter (Life Technologies, Ref. 10821-015). Automatischer Thermocycler und bei 14°C, 37°C und 65°C äquilibrierte Wasserbäder.
– Tris-HCl-gepufferter (pH 7,9) Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (PCI).
– 10 M Ammoniumacetat.
– TE (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), EDTA 1 mM).

Verfahren

1. Mischen von 25 μl Linker 1A und 25 μl Linker 1B in einem 0,5 ml-PCR-Röhrchen (Endkonzentration: 10 pmol/μl). Entsprechendes Vorgehen für Linker 2A und 2B.
2. Überführen der PCR-Röhrchen in den Thermocycler. 2 min Erhitzen bei 95°C, dann 20 min auf der Laborbank auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Aufbewahren bei –20°C.
3. Testen der Selbstligation von jedem Hybrid sowie Ligation von Hybrid (1A/1B) mit Hybrid (2A/2B). Herstellen von 3 Ligationsreaktionen durch Mischen von 1 μl Hybrid (1A/1B) (Röhrchen 1), 1 μl Hybrid (2A/2b) (Röhrchen 2), 0,5 μl Hybrid (1A/1B) und 0,5 μl Hybrid (2A/2B) (Röhrchen 3) mit 2 μl 10 mM ATP, 4 μl 5 × Ligase-Mischung, 12 μl H₂O und 1 μl T4 DNA-Ligase.
4. 2 h oder über Nacht Inkubieren bei 14°C. Analyse von 10 μl-Aliquoten auf einem 3%igen Agarosegel mit einer 10 bp-DNA-Leiter als Marker. Das meiste Material (≥ 80%) besteht aus einem 94 bp DNA-Fragment.
5. Fortfahren mit PCR unter Verwendung von 10⁵ Targets aus der Reaktion von Röhrchen 3 (Verdünnen mit TE-Puffer, der mit 0,1 mg/ml BSA supplementiert ist). Mischen von 1 μl verdünntem Ligationsprodukt, 5 μl 10 × PCR-Puffer, 1 μl 100 mM MgCl₂, 8 μl 1,25 mM dNTP, 2,5 μl Primer 1, 2,5 μl Primer 2 und 30 μl Wasser. Herstellen von 4 solchen Reaktionen und einem Kontrollröhrchen ohne Linker, Überführen in den Thermocycler und 2 min Erhitzen bei 80°C.
6. Zugeben zu jedem Röhrchen von 50 μl Taq-Polymerase-Amplifikationsmischung (5 μl 10 × PCR-Puffer, 4 μl 100 mM DTT, 0,5 μl Taq-Polymerase, 40,5 μl Wasser) und, falls nötig, 60 μl Mineralöl für den Thermoreaktor.
7. Durchführen von 29 PCR-Zyklen (95°C, 30 s; 58°C, 30 s; 70°C, 45 s), gefolgt von einem weiteren Zyklus mit 5 min Elongationszeit.
8. Analyse von 10 μl-Aliquoten auf einem 3%igen Agarosegel. Ein 90 bp-Amplifikationsfragment ist deutlich sichtbar.
9. Poolen aller 4 PCR-Proben, Extrahieren mit einem gleichen Volumen PCI. Überführen der wäßrigen (oberen) Phase in ein frisches Röhrchen, dann Zugeben von 100 μl 10 M-Ammoniumacetat und 500 μl Isopropanol. Mehrmaliges Umschwenken der Röhrchen zum Mischen, 20 min Zentrifugieren (15.000 g) bei 4°C, zweimal Waschen mit 400 μl 75%igem Ethanol, Vakuumtrocknen und Resuspendieren des Pellets in 12 μl TE-Puffer.
10. Herstellen von zwei 50 μl-Verdaureaktionen mit 5 μl DNA und 4 U Sau4A I oder BsmF I. 1 h Inkubieren bei 37°C oder 65°C, wie zweckmäßig.
11. Analyse von 10 μl-Aliquoten auf einem 3%igen Agarosegel. Paralleles Laufenlassen von 1 μl ungeschnittenem PCR-Produkt. Sau3A I- und BsmF I-Verdaus müssen zu ≥ 80% vollständig sein.

3.2. Linkerpräparation
Es ist wesentlich zu prüfen, daß ds Linker ligiert, mit PCR amplifiziert und mit dem Anchoring- und Tagging-Enzym verdaut werden können. Ein erfolgreiches Experiment nach Versuchsvorschrift 3 ist Voraussetzung, bevor man versucht, eine Genbank herzustellen. Die hier beschriebenen PCR-Bedingungen wurden für Hybaid-Thermoreaktoren (TR1 und Touch Down) optimiert, die unter den Bedingungen für die Kontrollröhrchen oder die simulierten Röhrchen arbeiten. Bei anderen Geräten können unterschiedliche Bedingungen angewandt werden. Da das Target ziemlich klein ist (90 bp), ist zu beachten, daß die Elongation bei relativ niedriger Temperatur durchgeführt wird.
3.3. Ligation von Linkern an cDNA
Die Konzentration von ds Linkern sollte an die cDNA-Menge, die zur Herstellung der Genbank verwendet wird, angepaßt sein. In der Originalversuchsvorschrift von Velculescu et al. werden 2 μg (74 pmol) ds Linker verwendet. Wenn man berücksichtigt, daß ausgehend von 5 μg mRNAs 2 μg cDNAs mit einer durchschnittlichen Größe von 1– 2 kb erhalten werden, liegt die cDNA-Menge, die für die Ligation zur Verfügung steht, im Bereich von 1,5–3 pmol. Da ein großer Überschuß von Linkern das Verhältnis von PCR-Signal zu Hintergrund verringert, führen wir die Ligation für Genbanken, die aus 250 mg Gewebe (~5 μg mRNAs) hergestellt werden, mit 8 pmol ds Linkern durch. Ausgehend von 5 × 10⁴–10⁵ Zellen (10–40 ng mRNAs) werden 0,5 pmol ds Linker eingesetzt. Eine kleinere Menge mag eine effiziente Ligation erlauben, wir haben hiermit jedoch keine Erfahrung.
Versuchsvorschrift 4. Ligieren von ds Linkern an cDNA
Geräte und Reagenzien

– Hybrid (1A/1B) und (2A/2B) zu 0,5 pmol/μl, erhalten nach Versuchsvorschrift 3, Schritte 1–2.
– TEN, TE und LoTE (3 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,2 mM EDTA), aufbewahrt bei 4°C.
– 10 × NEB IV-Reaktionspuffer und 100 × BSA (New England Biolabs).
– T₄ DNA-Ligase 5 U/μl (Life Technologies, Ref. 15224-041) und 5 × Ligationsmischung; 10 mM ATP.
– MPC (Dynal).
– Wasserbäder, äquilibriert bei 45°C und 16°C.
– Geigerzähler

Verfahren

1. Sobald die in Versuchsvorschrift 2 beschriebenen Experimente durchgeführt wurden, Durchführen von zwei zusätzlichen Waschschritten der Kügelchen vor Ligieren der ds Linker an die cDNA. Waschen der Kügelchen mit 200 μl TEN + BSA unter Verwendung des MPC. Resuspendieren der Kügelchen in 200 μl des gleichen Puffers (Aufpassen, daß die Kügelchen vollständig zurückgewonnen werden: Mischen durch wiederholtes Pipettieren und Abkratzen der Wand des Röhrchens mit der Pipettenspitze), dann Auftrennen in zwei 100 μl- Aliquote: eines wird an Hybrid (1A/1B) ligiert, das andere wird an Hybrid (2A/2B) ligiert.
2. Eintragen von 10 μl frischen Dynabeads in zwei 1,5 ml-Röhrchen. Diese Röhrchen werden nun wie die beiden anderen behandelt und werden als negative Kontrollen verwendet.
3. Zweimal Waschen der 4 Röhrchen mit 200 μl eiskaltem TE-Puffer + BSA .
4. Unmittelbar nach dem letzten Spülen Zugeben zu jedem Röhrchen von 34 μl der geeigneten Mischung, die 8 μl 5 × Ligasepuffer und 0,5 pmol Hyrid (1A/1B) oder Hybrid (2A/2B) enthält. 5 min Erhitzen bei 45°C, dann Kühlen auf Eis.
5. Zugeben zu jedem Röhrchen von 4 μl 10 mM ATP und 2 μl T4 DNA-Ligase (Endvolumen: 40 μl). Über Nacht Inkubieren bei 14°C.
6. Gründliches Waschen der Kügelchen (freie Linker vergiften die PCR-Amplifikation) wie folgt: 4mal mit 200 μl TEN + BSA und 3mal mit 200 μl 1 × NEB IV + BSAa. Nach dem ersten Spülen mit NEB IV Aufpassen, daß die Kügelchen vollständig resuspendiert werden (siehe oben) und Überführen der Kügelchen in frische Röhrchen. Nach dem letzten Spülen Prüfen, daß die Radioaktivität noch an den Kügelchen vorhanden ist, aber im Überstand fehlt.
7. Fortfahren mit Versuchsvorschrift 5 oder Aufbewahren bei 4°C.

Nach der Ligation (Schritt 5 in Versuchsvorschrift 4) ist es sehr wichtig, die Kügelchen ausgiebig zu waschen, um freie ds Linker zu entfernen. Wenn ds Linker, die nicht an cDNA-Fragmente ligiert sind, nicht gründlich aus jeder Probe entfernt werden, enthält die Genbank tatsächlich große Mengen (bis zu 25%) Linkersequenzen. Dies macht die Datenerfassung wenig effizient.
4. Bildung von Ditags
4.1. Freisetzung von cDNA-Tags
Verdau mit dem Tagging-Enzym (BsmF I) setzt nur kleine DNA-Fragmente aus den Oligo(dT)-Kügelchen frei. Folglich bleibt bei dieser Stufe viel Radioaktivität an die Kügelchen gebunden. Um zu prüfen, daß ausgiebiges Spülen keinen großen Materialverlust zur Folge hatte, messen wir die Radioaktivität der Kügelchen nach BsmF I-Verdau üblicherweise durch Cerenkov-Zählung (die Daten müssen für eine effiziente Cerenkov-Zählung korrigiert werden (~50% der Effizienz der Flüssigszintillationszählung)). Für die zuvor beschriebenen Experimente an 250, 30, 4 und 0,5 mg Mäuseniere erreichten die Mengen an ds cDNA, die an den Kügelchen verblieben, 450, 67, 13 bzw. 1,8 ng. Ein Vergleich dieser Daten mit denen, die die mit Sau3A I freigesetzten Fragmente betreffen (2.3), zeigt, daß ~6mal geringere cDNA-Mengen an den Kügelchen wiedergewonnen werden als in den Sau3A I-Überständen. Die durchschnittliche Größe von mit Sau3A I geschnittenen Fragmenten läßt sich zu 256 bp voraussagen. Der Bruchteil, der nach Verdau mit Sau3A I an den Kügelchen gebunden bleibt, legt daher nahe, daß die durchschnittliche Länge der gebildeten cDNA ~1,5 kb ist, was ganz vernünftig erscheint.
Die gesamte Menge an durch BsmF I freigesetztem Material wird zur Bildung von Ditags verwendet, und wir haben niemals versucht, sie zu quantifizieren. Nichtsdestoweniger kann die Effizienz des BsmF I-Verdaus überprüft werden, wenn ≥ 4 mg Gewebe zur Herstellung der Genbank eingesetzt werden. In diesem Fall kann die Radioaktivität im BsmF I-Überstand mit einem Geigerzähler nachgewiesen werden.
4.2. Erzeugung glatter Enden an freigesetzten cDNA-Tags
Um an mit BsmF I freigesetzten Tags glatte Ende zu erzeugen, können verschiedene Enzyme verwendet werden. Velculescu et al. (7) führten in ihren ursprünglichen Studien die Umsetzung zur Erzeugung glatter Enden mit T4 DNA-Polymerase durch. Bei jüngeren Anwendungen wurde Klenow-DNA-Polymerase verwendet (8) und wird jetzt empfohlen. Es ist auch unsere Erfahrung, daß die Herstellung einer Genbank mit T4 DNA-Polymerase wenig erfolgreich verläuft. Dies ist wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, daß die Erzeugung glatter Enden mit T4 DNA-Polymerase bei 11°C durchgeführt wird (12). Eine derart niedrige Temperatur erlaubt es, daß überstehende Enden von nicht-verwandten cDNA-Tags hybridisieren, und es ist daher zu erwarten, daß sie die für die Umsetzung zu glatten Enden zur Verfügung stehende Menge Material deutlich verringert. Wir haben zur Erzeugung glatter Enden erfolgreich Vent-Polymerase und T7 DNA-Polymerase mit Reinheitsgrad zur Sequenzierung verwendet. Das in Versuchsvorschrift 5 beschriebene Verfahren beinhaltet T7 DNA-Polymerase.
Versuchsvorschrift 5. Freisetzung, Erzeugung glatter Enden und Ligation von cDNA-Tags
Geräte und Reagenzien

– BsmF I, 10 × NEB IV-Puffer und 100 × BSA.
– PCI.
– 10 M Ammoniumacetat
– T7 DNA-Polymerase, Reinheitsgrad zur Sequenzierung (Pharmacia Biotech, Ref. 27098503).
– 5 × Salzmischung (200 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM MgCl₂, 250 mM NaCl).
– 2 mM dNTP.
– T4 DNA-Ligase (5 U/μl) und 5 × Reaktionspuffer.
– 100% Ethanol, 75% Ethanol. Geigerzähler.
– Wasserbäder, äquilibriert bei 65°C, 42°C und 16°C.

Verfahren

1. Entfernen des Überstands und unmittelbares Zugeben von 100 μl der folgenden Mischung auf die Kügelchen: 87 μl H₂O, 10 μl 10 × NEB IV, 1 μl 100 × BSA, 2 μl BsmFI.
2. 2 h Inkubieren bei 65°C. Zwischenzeitlich Vortexen.
3. 5 min Abkühlen bei Raumtemperatur, Sammeln des Überstands (der die Ditags enthält) und zweimal Waschen der Kügelchen mit 75 μl eiskaltem TE + BSA . Poolen aller 3 Überstände (250 μl Endvolumen) und Zugeben von 60 μg Glykogen zu jedem der 4 Reaktionsröhrchen. Messen der Radioaktivität, die sich noch an den Kügelchen befindet, durch Cerenkov-Zählung (siehe Text).
4. Zugeben von 250 μl (1 Volumenteil) PCI zu allen 4 Überständen.
5. Vortexen, dann 10 min bei 4°C Zentrifugieren (10.000 g). Überführen der oberen (wäßrigen) Phase in ein frisches Röhrchen.
6. Präzipitieren mit hoher Ethanolkonzentration: Zugeben zu der wäßrigen Phase von 125 μl 10 M Ammoniumacetat, 1,125 ml 100 Ethanol und 20 min Zentrifugieren (15.000 g) bei 4°C.
7. Zweimal Waschen des Pellets mit 400 μl 75%igem Ethanol. Vakuumtrocknen und Resuspendieren des Pellets in 10 μl L_OTE.
8. Zugeben von 15 μl 1 × Salzmischung in jedes Röhrchen und 2 min Erhitzen bei 42°C. Halten der Röhrchen bei 42°C und Zugeben von 25 μl der folgenden Mischung: 7,5 μl H₂O, 5,5 μl 100 mM DTT, 11 μl dNTP-Mischung, 1 μl T7 DNA-Polymerase. 10 min Inkubieren bei 42°C.
9. Zusammenpoolen der an Hybrid (1A/1B) und Hybrid (2A/2B) ligierten Tags. Spülen der Röhrchen mit 150 μl LoTE + 20 μg Glykogen und Zugeben dieser Lösung zu den gepoolten Reaktionen (Endvolumen: 250 μl). Man hat nun 2 Röhrchen (1 Probe, 1 negative Kontrolle).
10. Extrahieren mit einem gleichen Volumen PCI und Präzipitieren mit hoher Ethanolkonzentration (siehe Schritte 4–6). Resuspendieren des Pellets in 6 μl LoTE.
11. Ligieren der Tags unter Bildung von Ditags durch Zugeben zu der 6 μl-Probe von: 2 μl 5 × Ligase-Mischung, 1 μl 10 mM ATP und 1 μl T4 DNA-Ligase (5 U/μl). Entsprechended Vorgehen für die negative Kontrolle, über Nacht Inkubieren bei 16°C, dann Zugeben von 90 μl LoTE.

5. PCR-Amplifikation
Unter Berücksichtigung der in unseren Untersuchungen eingesetzten Linker und Primer ist das gewünschte PCR-Produkt 110 bp lang (90 bp Sequenzen von Linkern und 20 bp von Ditag).
5.1. PCR-Puffer und Verfahrensschritte
Zur PCR-Amplifikation von Ditags verwenden wir Puffer und Bedingungen, die sich von den von Velculescu et al. beschriebenen unterscheiden:

(a) Die Amplifikation erfolgt mit Standard-PCR-Puffern ohne DMSO und β-Mercaptoethanol. Die Zusammensetzung unseres 10 × PCR-Puffers ist in Versuchsvorschrift 3 angegeben. Promega-Puffer (Ref. M1901) funktioniert ebenso gut. Die in unserem Assay angewandten Bedingungen sind wie folgt: 100 μM dNTP, 2,5 mM MgCl₂ (2 mM mit Promega-Puffer), 0,5 μM Primer und 5 U Taq-Polymerase. Es werden große Mengen an Primern und Taq-Polymerase eingesetzt (Standardreaktionen werden im allgemeinen mit 0,1 μM Primern und 1,25 U Enzym durchgeführt), um eine hohe Ausbeute bei der Produktion von Ditags sicherzustellen. Die dNTP-Konzentration ist ebenfalls leicht höher (100 gegenüber 50 μM) als für Standard-PCR-Amplifikationen. Nichtsdestoweniger sollten sehr hohe dNTP-Konzentrationen vermieden werden, da bekannt ist, daß sie Taq-Polymerase-abhängige Fehleinbauten erhöhen.
b) Wie zu Beginn vorgeschlagen (7), führen wir die PCR noch im Kleinmaßstab durch, reinigen das 110 bp-Fragment und führen dann damit eine präparative PCR durch.

5.2. Anzahl der PCR-Zyklen
Vor Beginn der Versuchsvorschrift 6 muß die optimale Anzahl der PCR-Zyklen bestimmt werden. Dies wird am besten dadurch erreicht, daß man an 2% des Ligationsprodukts eine doppelte PCR durchführt und bei verschiedenen Zyklen 7 μl-Aliquote als Probe entnimmt. Die Anzahl der Zyklen hängt natürlich von der Menge des Ausgangsmaterials ab. Für 250 mg-Gewebestücke sollte mit 18 Zyklen ein PCR-Signal erhalten und das Plateau bei 22–23 Zyklen erreicht werden. Das 110 bp-Fragment sollte deutlich überwiegen (amplifizierte Produkte mit 90 und 100 bp sind nicht ungewöhnlich). Beispiele für PCR, die an Ditags durchgeführt wurde, die aus winzigen Mengen von Zellen (15.000 bis 45.000) erzeugt wurden, sind in 3 angegeben. Bei Verwendung solch geringer Mengen von Zellen überwiegt das 110 bp-Produkt nicht länger. Nichtsdestoweniger läßt sich, wenn man mit weniger als 30 Zyklen eine maximale Ausbeute erreicht (wie sie in 3 aus 45.000 Zellen erhalten wird), eine Genbank herstellen, die für das Gewebe ziemlich repräsentativ ist. PCR im Kleinmaßstab (10 Reaktionen, Schritte 1–5 in Versuchsvorschrift 6) wird an 2 μl- und 4 μl-Aliquoten des Ligationsprodukts für Makro- bzw. Mikromengen Gewebe durchgeführt.
Versuchsvorschrift 6. PCR-Amplifikation von Ditags
Geräte und Reagenzien

– Automatischer Thermoreaktor (Hybaid).
– PCR-Reagens: Taq-Polymerase, Primer 1 und 2 zu 20 pmol/μl, 10 × PCR-Puffer (siehe Versuchsvorschrift 3), 1,25 mM dNTP, 100 mM MgCl₂ und 100 mM DTT.
– β-Agarase und 10 × Reaktionspuffer (New England Biolabs, Ref. 392L).
– Sau3A I-Reaktionspuffer und 100 × BSA.
– Niedrigschmelzende (LMP) Agarose (Life Technologies, Ref. 15517-022).
– 10 × TBE (1,12 M Tris, 1,12 M Borsäure, 20 mM EDTA).
– Vertikalgel-Elektrophoreseeinheit mit 20 × 20 cm-Platten, 1,5 mm dicken Spacern und präparativem Kamm.
– 10 bp-DNA-Leiter.
– Bromphenolblau-Auftragspuffer (0,125% Bromphenolblau, 10% Ficoll 400, 12,5 mM EDTA), filtriert durch eine 0,45 μm-Membran.

Verfahren

1. Herstellen einer Master-Mischung mit den folgenden Reagenzien: 5 μl 10 × PCR-Puffer, 1 μl 100 mM MgCl₂, 8 μl 1,25 mM dNTP, 2,5 μl Primer 1, 2,5 μl Primer 2, 27 μl H₂O (Multiplizieren dieser Mengen mit der Anzahl der Reaktionsröhrchen (üblicherweise 12)). Verteilen gleicher Aliquote (46 μl) in PCR-Röhrchen und Zugeben von 4 μl DNA-Probe (10 Röhrchen), negativer Kontrolle oder H₂O.
2. Überführen der Röhrchen in den Thermoreaktor und 2 min Erhitzen bei 80°C (Heißstartbedingungen).
3. Zugeben von 50 μl der folgenden Mischung in jedes Röhrchen: 5 μl 10 × PCR-Puffer, 4 μl 100 mM DTT, 40 μl H₂O, 1 μl Taq-Polymerase. Zugeben eines Tropfens Mineralöl, falls dies der Thermocycler erfordert.
4. Durchführen der PCR bei den folgenden Temperaturen: 30 s bei 94°C, 30 s bei 58°C und 45 s bei 70°C (27–30 Zyklen), gefolgt von einem Zyklus mit einer Elongationszeit von 5 min.
5. Analysieren eines Aliquots von jedem Röhrchen (7 μl) auf einem 3%igen Agarosegel mit einer 10 bp-DNA-Leiter als Marker.
6. Bei zufriedenstellender Ausbeute (siehe 3) Poolen der 10 PCR-Röhrchen in zwei 1,5 ml-Röhrchen. Zugeben von 30 μg Glykogen zu jedem Röhrchen, Extrahieren mit PCI. Rückgewinnen der wäßrigen Phase und Präzipitieren der DNA durch Zentrifugation nach Zugeben von 0,1 Volumenteilen 3 M Natriumacetat und 2,5 Volumenteilen 100%igem Ethanol. Waschen des Pellets mit 75%igem Ethanol, Vakuumtrocknen und Resuspendieren in 300 μl L_OTE. Zugeben von 75 μl Bromphenolblau-Auftragspuffer.
7. Elektrophorese des PCR-Produkts durch ein 3%iges LMP-Agarose-Vertikalgel (15 min Erwärmen der Platten bei 55°C vor Gießen des Gels). Laufenlassen, bis das Bromphenolblau das Ende des Gels erreicht hat (~3 h).
8. Ausschneiden des 110 bp-Fragments aus dem Gel und Hineingeben des Agarosestücks in ein 2 ml-Röhrchen. Zugeben von 0,1 Volumen 10 × β-Agarase-Mischung, 10 min Erhitzen bei 70°C, dann 10 min bei 40°C und Zugeben von β-Agarase (6 U/0,2 g Agarose). 1,30 h Inkubieren bei 40°C. Zugeben von 30 μg Glykogen. Extrahieren mit PCI und Präzipitieren mit Ethanol, wie unter Abschnitt 6 angegeben. Resuspendieren des Pellets in 300 μl LoTE.
9. Nach Bestimmen der optimalen Anzahl von PCR-Zyklen (üblicherweise 12), Durchführen einer PCR im Großmaßstab (140–150 Reaktionen) mit 2 μl DNA und der in Abschnitt 1–4 angegebenen Versuchsvorschrift.
10. Poolen der PCR-Reaktionen in 2 ml-Röhrchen. Extrahieren mit PCI, Präzipitieren mit Ethanol (Abschnitt 6) und zweimal Waschen des Pellets mit 75%igem Ethanol. Resuspendieren der trockenen Pellets in einem Endvolumen von 470 μl 1 × Sau3A I-Mischung.

5.3. Reinigung und Reamplifikation
Das 110 bp-PCR-Produkt kann entweder auf einem 12%igen Polyacrylamidgel (7) oder einem 3%igen Agarose-Plattengel gereinigt werden. Um ein Überladen zu vermeiden und eine effiziente Reinigung zu erreichen, sollten nicht mehr als 10–12 PCR-Reaktionen auf einem Agarosegel gepoolt und die Agarose so nahe wie möglich am 110 bp-Fragment ausgeschnitten werden. Reinigung und optimale Anzahl von PCR-Zyklen sollten dann an doppelten 2 μl-Aliquoten des gereinigten Produkts getestet werden. Es sollte nun eine einzige Bande von 110 bp erhalten werden. Das Fehlen einer Überlagerung mit anderen amplifizierten Produkten ist wesentlich, um große Mengen des 110 bp-Fragments zu produzieren.
6. Isolierung von Ditags, Konkatenierung und Klonierung von Konkatemeren
6.1. Isolierung von Ditags
Für die Reinigung von Ditags sind zwei wichtige Punkte anzusprechen. Erstens, da die Gesamtmasse an Linkern nahe fünfmal die der Ditags beträgt, benötigt man ein hochauflösendes Polyacrylamidgel, um die Ditags gründlich zu reinigen. Zweitens, die kurze Länge der Ditags macht es schwierig, sie durch Färbung mit Ethidiumbromid auf einem Gel nachzuweisen. Dieses Problem läßt sich beseitigen, indem man das Gel mit SYBR-Green I (oder äquivalenten Produkten) färbt, was eine geringere Nachweisgrenze als Ethidiumbromid sicherstellt (0,1 anstelle von 2 ng DNA). Zum Erreichen einer hohen Empfindlichkeit sollte der Auftragspuffer kein Bromphenolblau enthalten (Bromphenolblau wandert zusammen mit den Ditags). Das Gel wird nach der Migration in einem Polypropylen- oder PVC-Behälter angefärbt.
Ditags laufen auf einem Polyacrylamidgel nicht als einzelne Bande. Dies kann auf feine Effekte der Basenzusammensetzung auf die elektrophoretische Mobilität und/oder auf Wobble für den Verdau mit BsmF I (7) zurückzuführen sein. Wir schneiden aus dem Gel alles Material von 22 bis 26 bp aus. Das Elutionsverfahren ist arbeitsaufwendig, liefert aber Ditags, die effizient konkateniert werden können.
6.2. Konkatenierung
Ausgehend von 150 PCR-Reaktionen sollte wenigstens 1 μg Ditags erhalten werden. Die optimale Ligationszeit hängt von der Menge der Ditags und von der Reinheit der Präparation ab. Wir führen die Ligation üblicherweise 2 h lang durch. Bei hoher Ausbeute (≥ 1,4 μg) stellen wir zwei Ansätze für Ligationsreaktionen her und lassen diese 1 oder 2 h ablaufen. Die entsprechenden Konkatemere werden dann getrennt auf einem 8%igen Agarosegel gereinigt.
Versuchsvorschrift 7. Isolierung von Ditags und Konkatenierung
Geräte und Reagenzien

– Sau 3A I, 10 × Reaktionspuffer und 100 × BSA.
– 50 × TAE (2 M Tris, 57%iger Eisessig, 50 mM EDTA).
– 12%iges Polyacrylamidgel: 53,6 ml H₂O, 24 ml 40%iges Acrylamid (19 : 1 Acrylamid : Bis), 1,6 ml 50 × TAE, 800 ml 10%iges Ammoniumpersulfat, 69 μl TEMED.
– 10 bp-DNA-Leiter.
– SYBR Green I-Farbstoff (FMC Bioproducts, Ref. 50513).
– T4 DNA-Ligase 5 U/μl und 5 × Ligationsmischung; 10 mM ATP.
– Vertikalgel-Elektrophoreseeinheit mit 20 × 20 cm-Platten, 1,5 mm dicken Spacern und präparativem Kamm.
– Xylencyanol-Auftragspuffer (0,125 Xylencyanol, 10% Ficoll 400, 12,5 mM EDTA).
– SpinX-Mikrozentrifugenröhrchen (Costar, Ref. 8160).

Verfahren

1. Zurückbehalten von 1 ml des 110 bp DNA-Fragments (Abschnitt 10 von Versuchsvorschrift 6) und Verdauen des Rests durch Zugeben von 5 μl 100 × BSA und 25 μl Sau3A I. Über Nacht Inkubieren bei 37°C in einem Heißluftinkubator.
2. Prüfen auf Sau3A I-Verdau: Analysieren von 1 μl ungeschnittener DNA, 1 μl und 3 μl Sau3A I-Verdau (Verwendung von Bromphenolblau-Auftragspuffer und Xylencyanol-Auftragspuffer für ungeschnittene bzw. mit Sau3A I verdaute DNA) auf einem 3%igen Agarosegel. Der größte Teil (> 80%) des 110 bp-Fragments wurde verdaut und es kann nun eine schwache Bande bei ~25 bp nachgewiesen werden, die den Ditags entspricht.
3. Zugeben von 125 μl Xylencyanol-Auftragspuffer zu der verdauten DNA-Probe und Auftragen auf ein präparatives 12%iges vertikales Polyacrylamidgel in 1 × TAE. Laufenlassen bei 30 mA, bis das Bromphenolblau des Größenmarkers 12 cm von der Vertiefung entfernt ist.
4. Überführen des Gels in SYBR Green I-Farbstoff bei einer Verdünnung von 1 : 10.000 in 1 × TAE. Einwickeln des Behälters in Aluminiumfolie und 20 min Färben des Gels. Sichtbarmachen auf UV-Box.
5. Ausschneiden der Bande mit Ditags (24–26 bp) und Überführen der Acrylamidstücke in 0,5 ml-Röhrchen (für ein 20 cm breites Gel sind 8 Röhrchen zu verwenden). Einstechen des Bodens der 0,5 ml-Röhrchen mit einer 18 Gauge-Nadel. Einbringen der Röhrchen in 2 ml-Röhrchen und 5 min Zentrifugieren bei 10.000 g. Herstellen des folgenden Elutionspuffers für jedes Röhrchen: 475 μl LoTE, 25 μl 10 M Ammoniumacetat, 5 μg Glykogen. Zugeben von 250 μl Elutionspuffer in jedes 0,5 ml-Röhrchen und erneutes Zentrifugieren. Verwerfen der 0,5 ml-Röhrchen und Zugeben von 250 μl Elutionspuffer direkt in jedes 2 ml-Röhrchen. Über Nacht Inkubieren bei 37°C in einem Heißluftinkubator.
6. Herstellen einer Reihe von 16 SpinX-Mikrozentrifugenröhrchen: Zugeben von 20 μg Glykogen in jedes Sammelröhrchen. Überführen des Inhalts von jedem 2 ml-Röhrchen (~600 μl) in zwei SpinX-Mikrozentrifugenröhrchen. 5 min Zentrifugieren bei 13.000 g. Überführen von 350 μl eluierter Lösung in 1,5 ml-Röhrchen (10–11 Röhrchen), Extrahieren mit PCI, Präzipitieren mit hoher Ethanolkonzentration. Zweimal Waschen mit 75%igem Ethanol, Vakuumtrocknen und Poolen aller Pellets in 15 μl LoTE.
7. Messen der Menge gereinigter Ditags durch Dot-Quantifizierung (12) mit 1 μl Probe. Die Gesamt-DNA bei dieser Stufe beträgt üblicherweise 1 μg, eine Genbank kann jedoch auch noch mit 400 ng hergestellt werden.
8. Ligieren der Ditags unter Bildung von Konkatemeren: Zugeben zur Probe (14 μl) von 4,4 μl 5 × Ligase-Mischung, 2,2 μl 10 mM ATP und 2,2 μl konzentrierte (5 U/μl) T4 DNA-Ligase.
9. 2 h Inkubieren bei 16°C. Stoppen der Reaktion durch Zugeben von 5 μl Bromphenolblau-Auftragspuffer und Aufbewahren bei –20°C.

6.3. Reinigung von Konkatemeren
Konkatemere werden unmittelbar vor Auftragen auf ein Gel 5 min bei 45°C erhitzt, um unligierte kohäsive Enden zu trennen. Konkatemere bilden auf dem Gel einen Schmier von etwa 100 bp bis zu mehreren kbp (4) und können mit SYBR Green I-Farbstoff leicht nachgewiesen werden. Alle Fragmente > 300 bp (d. h. mit 25 oder mehr Tags) sind zur Konstruktion einer Genbank potentiell interessant. Wir schneiden üblicherweise Fragmente mit 350–600, 600–2000 und > 2000 bp aus und stellen eine erste Genbank mit den DNA- Fragmenten mit 600–2000 bp her. Längere Fragmente liefern mehr Information, es ist aber zu erwarten, daß sie mit schlechterer Effizienz kloniert werden.
Versuchsvorschrift 8. Reinigung und Klonierung von Konkatemeren
Geräte und Reagenzien.

– SYBR Green I-Farbstoff
– Vertikalgel-Elektrophoreseeinheit mit 20 × 20 cm-Platten, 1,5 mm dicken Spacern und Kamm mit 20 Zähnen. 8%iges Polyacrylamidgel: 61,6 ml H₂O, 16 ml 40%iges Acrylamid (37,5 : 1 Acrylamid : Bis), 1,6 ml 50 × TAE, 800 μl 10%iges Ammoniumpersulfat, 69 μl TEMED.
– 100 bp-DNA-Leiter (Liefe Technologies, Ref. 15628-019). T4 DNA-Ligase, 1 U/μl (Life Technologies, Ref. 15224-017) und 5 × Reaktionspuffer.
– 10 mM ATP.
– pBluescript II, linearisiert mit BamH I und dephosphoryliert.
– Ultrakompetente Zellen von E. coli XL2 Blue (Stratagene, Ref. 200150).

Verfahren

1. 5 min Erhitzen der Probe bei 45°C und Auftragen auf eine Spur eines 8%igen Acrylamidgels mit 20 Vertiefungen. Laufenlassen bei 30 mA, bis das Bromphenolblau 10–12 cm aus der Vertiefung gelaufen ist.
2. Färben des Gels mit SYBR Green I, wie in Versuchsvorschrift 7 beschrieben, und Sichtbarmachen auf UV-Box.
3. Konkatemere bilden auf dem Gel einen Schmier innerhalb eines Bereichs von etwa 100 bp bis zur Gelvertiefung (4). Ausschneiden der Bereiche, die DNA mit 350– 600, 600–2000 und > 2000 bp enthalten. Getrenntes Reinigen der DNA von allen drei Stücken, wie in den Abschnitten 5–6 von Versuchsvorschrift 7 beschrieben (eine einstündige Inkubationsdauer der Gelstücke in einer LoTE/Ammoniumacetat-Lösung genügt). Resuspendieren des Pellets in 6 μl LoTE und Herstellen einer ersten Genbank mit den Konkatemeren mit 600–2000 bp.
4. Mischen von 6 μl Konkatemeren und 2 μl (25 ng) von mit BamH I geschnittenem pBluescript II. 5 min Erhitzen bei 45°C, dann Abkühlen auf Eis.
5. Zugeben von 3 μl 5 × Ligase-Mischung, 1 μl H₂O, 1,5 μl 10 mM ATP und 1,5 μl T4 DNA-Ligase (1 U/μl). Mischen und über Nacht Inkubieren bei 16°C.
6. Zugeben von 20 μg Glykogen und 285 μl LoTE und Extrahieren mit PCI. Präzipitieren mit Ethanol, zweimal Waschen mit 75%igem Ethanol, Vakuumtrocknen und Resuspendieren des Pellets in 12 μl LoTE.
7. Transformieren ultrakompetenter Zellen von E. coli XL2 Blue mit 1/3 (4 μl) der Ligationsreaktion gemäß den Angaben des Herstellers. Ausplattieren verschiedener Volumina (5 μl, 10 μl, 20 μl, 40 μl) der Transformationsmischung auf Petrischalen mit Luria-Agar, der mit Ampicillin, X-gal, und IPTG supplementiert ist. 15–16 h Inkubieren bei 37°C. Zurückbehalten der restlichen (~900 μl) Transformationslösung (Zugeben von 225 μl 80%igem Glycerin, zwischenzeitlich 5 min Mischen und Aufbewahren bei –80°C). Sie wird dazu verwendet, weitere Bakterien auszuplattieren, wenn die Genbank korrekt aussieht.
8. Zählen von Insert-freien (d. h. blauen) und rekombinanten (d. h. weißen) Bakterienkolonien auf jeder Platte. Der Anteil rekombinanter Kolonien sollte > 50% sein und ihre Gesamtzahl sollte für 1 ml Transformationsmischung im Bereich von 10.000–60.000 liegen.

6.4. Klonierung von Kontatemeren
Konkatemere können in einem beliebigen Vektor kloniert und sequenziert werden. Zur Zeit klonieren wir Konkatemere in pBluescript II, das mit BamH I linearisiert und durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm dephosphoryliert wurde. Jede Art Vektor mit einer BamH I-Stelle in der "Multiple Cloning Site" ist geeignet. Velculescu et al. (7, 8) verwenden pZero-1 von Invitrogen, mit dem nur Rekombinanten wachsen können (DNA-Insertion in die Multiple Cloning Site zerstört ein lethales Gen). Die kompetenten Zellen und die Transformationsverfahren (Hitzeschock oder Elektroporation) können ebenfalls entsprechend den Möglichkeiten geändert werden. Was immer die Wahl, es ist wichtig, Bakterienzellen zu verwenden, die eine sehr hohe Klonierungseffizienz erlauben (≥ 5 × 10⁹ Transformanten/μg Supercoil-DNA). Ein wichtiger Punkt ist die Auswertung der Anzahl von Klonen (Versuchsvorschrift 8, Schritt 8), die in der Genbank erhalten werden. Da eine große Anzahl (1000–2000) Klone sequenziert wird, sollte die Gesamtzahl der Rekombinanten > 10.000 sein.
Das Screenen der Genbank kann mittels PCR oder DNA-Miniprep erfolgen. Bei uns liefert eine DNA-Miniprep reproduzierbarere Mengen an DNA als PCR und vermeidet falsche positive Signale. Wir verwenden einen Qiaprep 8-Miniprep-Kit (Qiagen, Ref. 27144), der es ermöglicht, 96 Minipreps in ~2 Stunden durchzuführen. Plasmid-DNA wird aus Qiagen-Säulen mit 100 μl Elutionspuffer eluiert; 5 μl werden verdaut, um die Größe des Inserts zu bestimmen, und wenn das Insert > 200 bp ist, werden 5 μl direkt zur DNA-Sequenzierung verwendet.
7. Datenanalyse
7.1. Software
Wenn die klonierten Konkatemeren sequenziert sind, müssen Tags extrahiert, quantifiziert und durch mögliche Datenbank-Matches identifiziert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden zwei Programme geschrieben.
Das SAGE-Programm (7) wurde in Visual Basic geschrieben und läuft auf Personal Computern über das Microsoft Windows-System. Es extrahiert Tags aus Sequenz-Textdateien, quantifiziert sie, erlaubt den Vergleich mehrerer Genbanken und liefert Links zu GenBank-Daten, die von CD-ROM-Flatdateien oder über das Internet heruntergeladen wurden. Letztgenannte Funktion ermöglicht eine rasche Identifizierung von Tags, die sich von charakterisierten Genen oder cDNAs ableiten. Die Beschreibung von EST-Sequenzen ist jedoch beschnitten, was dazu zwingt, nach individuellen GenBank-Reports zu suchen. Das SAGE-Programm enthält auch mehrere Simulationstools, was es beispielsweise erlaubt, die Signifikanz der zwischen zwei Genbanken beobachteten Unterschiede zu bewerten und die Sequenziergenauigkeit zu bestimmen.
Das zweite Programm wird zur Zeit an der Universität von Montpellier-2 (Frankreich) von J. Marti und Mitarbeitern als Teil einer Datenbank (CbC, für Cell by Cell) entwickelt, die Daten von SAGE-Experimenten speichern und wieder heraussuchen soll. Die Skripten zur Extraktion der Daten sind in C-Sprache unter Unix-Umgebung entwickelt und das Datenbank-Managementsystem ist in Acces^® implementiert. Textdateien werden konkateniert, um die Arbeitsdatei zu liefern, aus der Tag-Sequenzen extrahiert und ausgezählt werden. Die Behandlung der Rohdaten beinhaltet die Identifizierung von Vektorverunreinigungen, trunkierten und wiederholten Ditags (siehe unten). Für Experimente an Proben von Mensch-, Maus- und Rattenzellen werden die Tags in dem nicht-redundanten Sequenzsatz gesucht, den die UniGene Collection liefert. Diese Daten können von der anonymen FTP-Seite ncbi.nlm.gov/repository/unigene/ geladen werden. Nützliche Dateien sind Hs.data.Z und Hs.seq.uniq.Z für den Menschen und ähnliche Dateien für Maus und Ratte. Die Ergebnisse werden in einer Tabelle dargestellt, die die Sequenz von jedes Taq, die Anzahl seines Auftretens mit der Matching-Cluster-Zahl (Hs# für Homo sapiens, Mm# für Mus musculus und Rn# für Rattus norvegicus) und andere aus den Quelldateien extrahierte Daten, einschließlich den GenBank-Zugangsnummern liefert. Für humane Gene wird, falls verfügbar, automatisch ein Link mit GeneCards etabliert (http://bioinfo.weizmann.ac.il/cards/), was es erlaubt, zusätzliche Informationen zu erhalten.
7.2. Genbankvalidität
7.2.1. Insertlänge
Eine anfängliche Bewertung der Genbankqualität wird durch Screenen auf Insertlängen erhalten. Eine gute Genbank sollte > 60% Klone mit Inserts ≥ 240 bp (20 Tags) enthalten. Nur ein DNA-Strang wird sequenziert, da die Genauigkeit durch die Zahl der registrierten Tags und nicht durch die Qualität der individuellen Versuchsläufe erhalten wird. Abhängig vom Budget und den Sequenziereinrichtungen werden entweder alle Klone oder nur die informativsten sequenziert. Es ist festzuhalten, daß die durchschnittliche Länge der Inserts nicht mit der der gelgereinigten Konkatemeren übereinstimmt. Obwohl wir üblicherweise 600– 2000 bp lange Konkatemere extrahieren, haben die meisten Klone Inserts von < 600 bp, und wir bekommen nie Inserts mit > 800 bp. Ein solch paradoxes Ergebnis läßt sich mit einer Reihe von Gründen erklären. In der Tat ist es bekannt, daß lange Inserts mit schlechter Effizienz kloniert werden. Außerdem ist es zu erwarten, daß sie mehrere Repeats und Inverted Repeats enthalten und daher instabile Plasmidkonstrukte bilden. Unterstützend zu dieser Interpretation wurde gezeigt (14), und auch wir haben dies beobachtet, daß eine effiziente Entfernung von Linkern (die in schlechten Genbanken bis zu 20% aller Tags ausmachen) die durchschnittliche Länge der klonierten Inserts erhöht. In jedem Fall ist es wert zu betonen, daß aus Genbanken mit kurzen und langen Inserts ähnliche biologische Informationen erhalten werden.
7.2.2. Genexpressionsmuster
Das Grundmuster der Genexpression in eukaryontischen Zellen wurde lange zuvor durch Analyse der Kinetik der mRNA-cDNA-Hybridisierung bestimmt (15, 16). In einer "typischen" Säugerzelle besteht die gesamte RNA-Masse aus 300.000 Molekülen, was 12.000 Transkripten entspricht, die sich auf drei Häufigkeitsklassen verteilen. Eine sehr kleine Anzahl von mRNAs (~10) wird in äußerst hohen Mengen exprimiert (3000–15.000 Kopien/Zelle). Eine größere Anzahl von mRNAs (500) erreicht ein Expressionsniveau im Bereich von 100–500 Kopien/Zelle. Der größte Teile der mRNAs (> 10.000) wird schließlich schlecht exprimiert (10–100 Kopien/Zelle). Dieses Grundmuster sollte in SAGE- oder SADE-Genbanken zu beobachten sein. Bevor man jedoch die Tag-Häufigkeit in ein definiertes Genexpressionsprofil überträgt, müssen die Daten gründlich auf Artefakte überprüft werden, denen man bei der Konstruktion von Genbanken begegnet.
7.2.3. Auftreten von Sequenzen, die sich von Linkern ableiten
Wie oben erwähnt, weisen einige Genbanken eine große Mengen Linkersequenzen auf. Wenn diese Menge 20% oder mehr beträgt, ist die Sequenzierung ziemlich teuer und es ist besser, wieder mit der RNA-Probe zu beginnen. Die Verunreinigung einer Genbank mit 10–15% Linkersequenzen ist akzeptabel, 5–10% ist gut und < 5% ist ausgezeichnet. Zusätzlich zu den beiden perfekten Linker-Matches (GTCCCTGTGC und GTCCCTTCCG) können Leseungenauigkeiten zu Sequenzen mit einem Mismatch führen. Auch diese Linkerähnlichen Sequenzen lassen sich leicht identifizieren, da, wenn man eine effiziente enzymatische Spaltung annimmt, die Wahrscheinlichkeit, daß in den Konkatemeren benachbarte Sau3A I- und BsmF I-Stellen vorliegen, normalerweise Null ist. Linker und Linker-ähnliche Sequenzen können mit dem SAGE- oder CbC-Programm automatisch aussortiert werden, und ihre relativen Mengen können dazu verwendet werden, die Sequenziergenauigkeit zu bewerten (siehe 7.1.).
7.2.4. Doppelte Ditags
Eine weitere Kategorie von Sequenzen, die aussortiert werden müssen, sind diejenigen, die doppelten Ditags entsprechen. Tatsächlich ist die Wahrscheinlichkeit, irgendwelche zwei Tags mehrmals im gleichen Ditag zu finden, sehr gering, ausgenommen bei einzelnen Geweben (z. B. der Milchdrüse oder dem Ovidukt von Legehennen), in denen ein oder eine sehr geringe Anzahl von Transkript(en) den Großteil der mRNA-Masse ausmachen. Die Eliminierung wiederholter Ditags stellt daher eine Korrektur für die präferentielle PCR-Amplifikation einiger Targets und für das Picken verschiedener Bakterienkolonien dar, die sich vom selben Klon ableiten. Die meisten Ditags (> 95%) treten im allgemeinen nur einmal auf, wenn die Genbank aus Makromengen Gewebe konstruiert wird. Für Mikro-Genbanken ist der Prozentsatz einmaliger Ditags im allgemeinen geringer. Wenn er sich nicht länger mit einer effizienten Datenerfassung verträgt (< 75%), wird empfohlen, wieder mit der ersten PCR (im Kleinmaßstab) zu beginnen (siehe Versuchsvorschrift 6). Doppelte Ditags werden durch das SAGE- und CbC-Programm automatisch aus den Sequenzdateien herausgesucht.
7.3. Zahl der zu sequenzierenden Tags
Die Zahl der zu analysierenden Tags hängt offensichtlich von der Applikation und der Gewebequelle ab. Tatsächlich ermöglicht es eine Reduktion der Gewebekomplexität durch Isolierung definierter Zellpopulationen, die minimale Anzahl an Tags für eine genaue Analyse deutlich zu verringern und molekulare und physiologische Phänotypen besser zu korrelieren.
Eine Darstellung der in einem Gewebe am stärksten exprimierten Gene (> 500 Kopien/Zelle) in linearer Form und Vergleich mit ihrem Expressionsniveau in einem anderen erfordert nur die Sequenzierung von ein paar tausend Tags (5). Bei einer Analyse von 5000 Tags werden 300 wenigstens 3mal aufgefunden. Da automatische Sequenziergeräte gleichzeitig 48–96 Template lesen können, werden von 5–10 Gelen 10.000 Tags registriert, wenn die durchschnittliche Zahl an Tags/Klon ~20 ist.
Die schwierigsten Projekte sind die, die darauf abzielen, Genexpressionsprofile im gleichen Gewebe unter sowohl physiologischen als auch pathologischen Bedingungen zu vergleichen. Differentiell exprimierte Gene könnten zu irgendeiner der drei Häufigkeitsklassen gehören, und außerdem können sie entweder herauf- oder herunterreguliert sein. Eine vernünftige Zahl von zu sequenzierenden Tags würde im Bereich von 30.000–50.000 liegen. Die Wahrscheinlichkeit (P), eine Sequenz mit einer gegebenen Häufigkeit nachzuweisen, läßt sich aus der Gleichung von Clarke und Carbon (17) berechnen (N = ln(1 – P)/ln(1 – x/n)), wobei N die Zahl der analysierten Sequenzen, x das Expressionsniveau und n die Gesamtzahl an mRNAs pro Zelle (300.000) ist. Die Analyse von 30.000 und 50.000 Tags ergibt eine 95%ige statistische Sicherheit, Transkripte nachzuweisen, die in 30 bzw. 18 Kopien/Zelle exprimiert werden. Daher werden die meisten Prozesse des Hochregulierens ausgewertet. Beispielsweise lassen sich Tags, die schlecht exprimierten Transkripten entsprechen, 1- und ≥ 5mal unter Kontrollbedingungen bzw. experimentellen Bedingungen nachweisen. Wir müssen uns jedoch bewußt sein, daß die Möglichkeit, Prozesse des Herunterregulierens auszuwerten, weniger umfassend ist. Sie betrifft nur Tags, die unter den Kontrollbedingungen > 5–10mal vorliegen, was einen Teil der schlecht exprimierten Transkripte von der Analyse ausschließt.
In der obigen Tabelle I, die der Charakterisierung der häufigsten nukleären Transkripte im äußeren medullären Sammelrohr (OMCD) der Maus entspricht und deren differentielle Expression im medullären dicken aufsteigenden Schenkel (MTAL) nachweist, entsprechen die beiden linken Spalten den in 5 dargestellten Daten und geben die Häufigkeit für jedes Tag in den beiden Genbanken an. Die dritte Spalte gibt die Sequenz der Tags an. Die rechte Spalte zeigt die Ergebnisse einer individuellen BLAST-Suche in GenBank an, die mit einer 14 bp-Sequenz (der Sau3A I-Erkennungssequenz plus den für jedes Tag spezifischen 10 bp) durchgeführt wurde.
Literaturstellen

1. DeRisi, J. L., Vishwanath, R. Y. und Brown, P. O. (1997). Science, 278, 680.
2. Wodicka, L., Dong, H., Mittmann, M., Ho, M. H. und Lockhart, D. J. (1977). Nature Biotechnology, 15, 1359.
3. Gress, T. M., Hoheisel, J. D., Lennon, G. G., Zehetner, G. und Lehrach, H. (1992). Mamm. Genome, 3, 609.
4. Piétu, G., Ailbert, A., Guichard, V., Lamy, B., Bois, F. et al. (1996). Genome Research, 6, 492.
5. Adams, M. A., Kerlavage, A. R., Fleischmann, R. D., Fuldner, R. A., Bult, C. J. et al. (1995). Nature, 377 (Nr. 65475), 3.
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8. Velculescu, V. E., Zhang, L., Zhou, W., Vogelstein, J., Basrai, M. et al. (1997). Cell, 88, 243.
9. Zhang, L., Zhou, W., Velculescu, V. E., Kern, S. E., Hruban, R. H. et al. (1997). Science, 276, 1268.
10. Polyak, K., Xia, Y. Zweier, J. L., Kinzler, K. W. und Vogelstein, B. (1997). Nature, 389, 300.
11. Sade, D. A. F. (1990). Oeuvres complètes. Gallimard, Paris.
12. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G. et al. (1993, vierteljährlich aktualisiert). Current protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York.
13. Chomchynski, P. und Sacchi, N. (1987). Anal. Biochem., 162, 156.
14. Powell, J. (1998). Nucleic Acids Res., 26, 3445.
15. Hastie, N. D. und Bishop, J. O. (1976). Cell, 9, 761.
16. Hereford, L. M. und Rosbash, M. (1977). Cell, 10, 453.
17. Clarke, L. und Carbon, J. (1976). Cell, 9, 91.

Wie sich aus dem Vorausgehenden ergibt, ist die Erfindung in keiner Weise auf die soeben im einzelnen definierte Ausführungsform, Implementierung und Applikation beschränkt; sie umfaßt im Gegenteil alle Varianten, die einem Spezialisten auf diesem Gebiet begegnen können, ohne daß damit vom Rahmen oder dem Umfang der vorliegenden Erfindung, die nur durch die anliegenden Ansprüche definiert wird, abgewichen würde.

Claims

Verfahren zum Erhalt einer Genbank von Tags, die in der Lage sind, einen spezifischen Zustand einer biologischen Probe zu definieren, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden aufeinanderfolgenden Schritte umfaßt: (1) Einstufiges Extrahieren von mRNA mit kovalent an paramagnetische Kügelchen gebundenem Oligo(dT)₂₅ aus einer kleinen Menge einer biologischen Probe, (2) Generieren einer doppelsträngigen cDNA-Genbank aus der mRNA gemäß den folgenden Schritten: – Synthetisieren des ersten Strangs der cDNA durch reverse Transkription des mRNA-Templates mit einer reversen Transkriptase, die keine RNase H-Aktivität aufweist, zu einer ersten komplementären einzelsträngigen cDNA, – Synthetisieren des zweiten Strangs der cDNA durch Nicktranslation der mRNA in dem gebildeten mRNA-cDNA-Hybrid mittels einer E. coli DNA-Polymerase, (3) Spalten der erhaltenen cDNAs mit der Restriktionsendonuklease Sau3A I als Anchoring-Enzym, (4) Auftrennen der gespaltenen cDNAs in zwei Aliquote, (5) Ligieren der in jedem der beiden Aliquote enthaltenen cDNA über die Sau3A I-Restriktionsschnittstelle mit einem Linker, der aus einem doppelsträngigen cDNA-Molekül besteht, das eine der folgenden Formeln besitzt: GATCGTCCC-X₁ oder GATCGTCCC-X₂ wobei X₁ und X₂, die 30 bis 37 Nukleotide umfassen und verschieden sind, eine PCR-Startstelle von 20–25 bp mit einer Tm von 55–65°C einschließen, und wobei GATCGTCCC (SEQ ID NO: 1) einer mit einer BsmF I-Restriktionsschnittstelle verknüpften Sau3A I-Restriktionsschnittstelle entspricht, (6) Verdauen der in Schritt (5) erhaltenen Produkte mit dem Tagging-Enzym BsmF I und Freisetzen von Linkern mit einem verankerten kurzen Stück cDNA, das einem Transkript-spezifischen Tag entspricht, wobei der Verdau BsmF I-Tags liefert, die für die ursprüngliche mRNA spezifisch sind, (7) Erzeugen glatter Enden an den BsmF I-Tags mit einer DNA-Polymerase, vorzugsweise T7 DNA-Polymerase oder Vent-Polymerase, und Mischen der mit den verschiedenen Linkern ligierten Tags, (8) Ligieren der in Schritt (7) erhaltenen Tags mit einer DNA-Ligase unter Bildung von Ditags, (9) Amplifizieren der in Schritt (8) erhaltenen Ditags mit Primern, die 20–25 bp umfassen und eine Tm von 55–65°C besitzen, (10) Isolieren der Ditags, die zwischen 20 und 28 bp aufweisen, aus den in Schritt (9) erhaltenen Amplifikationsprodukten durch Verdau der Amplifikationsprodukte mit dem Anchoring-Enzym Sau3A I und Auftrennen der verdauten Produkte auf einem geeigneten Elektrophoresegel, (11) Ligieren der in Schritt (10) erhaltenen Ditags zu Konkatemeren, Reinigen der Konkatemeren und Abtrennen der Konkatemeren mit mehr als 300 bp, (12) Klonieren und Sequenzieren der Konkatemeren, und (13) Testen der verschiedenen erhaltenen Tags.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Synthese des ersten Strangs der cDNA in Schritt (2) mit reverser Transkriptase von Moloney-Maus-Leukämie-Virus (M-MLV RT) und mit Oligo(dT)₂₅ als Primern erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Linker von Schritt (5) vorzugsweise Hybrid-DNA-Moleküle sind, die aus Linkern 1A und 1B oder aus Linkern 2A und 2B mit den folgenden Formeln gebildet sind:
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge von jedem Linker in Schritt (5) höchstens 8–10 pmol beträgt und vorzugsweise zwischen 0,5 pmol und 8 pmol für Anfangsmengen von 10–40 ng mRNAs bzw. 5 μg mRNAs liegt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Primer von Schritt (9) vorzugsweise die folgenden Formeln haben:
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe von Schritt (1) ≤ 5·10⁶ Zellen umfaßt, entsprechend höchstens 50 μg Gesamt-RNA oder 1 μg Poly(A)-RNA.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewebeprobe aus Nieren stammt, insbesondere aus Nephronsegmenten entsprechend etwa 15.000 bis 45.000 Zellen, entsprechend 0,15–0,45 μg Gesamt-RNA.
Verwendung einer nach dem Verfahren der Ansprüche 1 bis 7 erhaltenen Genbank von Tags zum Beurteilen des physiologischen oder pathologischen Zustands einer biologischen Probe.
Verfahren zum Bestimmen eines Genexpressionsprofils, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt: – Durchführen der Schritte (1) bis (13) nach Anspruch 1 und – Übertragen der Häufigkeit von cDNA- Tags auf ein Genexpressionsprofil.
Kit zur Feststellung eines Genexpressionsprofils, dadurch gekennzeichnet, daß die Anwesenheit eines cDNA-Tag, das von der aus einer biologischen Probe extrahierten mRNA erhalten wurde, auf die Expression eines Gens schließen läßt, das diese Tag-Sequenz an einer geeigneten Stelle trägt, d. h. unmittelbar benachbart zu der dem 3'-Ende in dieser cDNA am nächsten gelegenen Sau3A I-Stelle, wobei der Kit zusätzlich zu üblichen Puffern zur cDNA-Synthese, zum Verdau mit Restriktionsenzymen, zur Ligation und zur Amplifikation umfaßt: – Behälter, die Linker enthalten, die aus einem doppelsträngigen cDNA-Molekül bestehen, das eine der folgenden Formeln besitzt: GATCGTCCC-X₁ oder GATCGTCCC-X₂ wobei X₁ und X₂, die 30 bis 37 Nukleotide umfassen und verschieden sind, eine PCR-Startstelle von 20–25 bp mit einer Tm von 55–65°C einschließen, und wobei GATCGTCCC (SEQ ID NO: 1) einer mit einer BsmF I-Restriktionsschnittstelle verknüpften Sau3A I-Restriktionsschnittstelle entspricht, und – Behälter, die Primer enthalten, die 20–25 bp umfassen und eine Tm von 55–65°C besitzen.
Kit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß er enthält: – Behälter, die Hybrid-DNA-Moleküle enthalten, die aus Linkern 1A und 1B oder aus Linkern 2A und 2B mit den folgenden Formeln gebildet sind:
– Behälter, die die folgenden Primer enthalten: