CN101952461B - 用于检测核糖核酸的组合物、方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
公开了用于检测一个或多个RNA分子类别的组合物、方法和试剂盒。在一个实施方案中，使用包含双链特异性RNA连接酶活性的多肽将第一衔接子和第二衔接子连接至RNA分子，而无需插入的纯化步骤。反转录连接产物，然后除去反转录产物中的至少一些核糖核苷。加入引物，并且产生扩增产物。在某些实施方案中，确定至少一个类别的扩增产物的至少一部分的序列，和确定相应的RNA分子的至少一部分。在一些实施方案中，直接或间接地检测至少一些扩增产物类别，从而使得能够确定目的RNA分子的存在和/或数量。
Description
领域
本教导总地说来涉及用于检测、扩增和定量核糖核酸(RNA)包括但不限于编码RNA和非编码RNA(ncRNA)的方法、试剂和试剂盒。
引言
基因组表达模式的分析为差异表达在许多生物学过程(包括但不限于各种疾病状态)中的作用提供了有价值的见解。这样的分析，无论是基于mRNA的基因表达还是基于小非编码RNA的表达分析，将成为生物科学的许多科目中快速扩展的研究手段。小非编码RNA的发现也是引起巨大的科学和医学兴趣的领域。据信，通过了解基因组的哪些部分何时和为什么被转录，可获得对许多复杂且相关的生物学过程的更好理解。
小非编码RNA在横跨进化谱的许多生物中正快速显现为基因调控的重要效应物。动物、植物和真菌包含几个不同种类的小RNA；包括但不限于miRNA、siRNA、piRNA和rasiRNA。此类微小的基因表达调节剂的长度通常在大约18-40nt的大小范围内，然而它们对细胞过程的影响却是深远的。已显示它们在发育时间选择(developmentaltiming)和细胞命运机制、肿瘤进展、神经发生、转座子沉默、病毒防御等中起着关键作用。它们通过结合至它们的靶并利用许多机制(包括异染色质修饰、翻译抑制、mRNA衰减和甚至新生肽翻转(turnover)机制)负作用于基因表达来进行基因调控。因此，给定的样品中小RNA的鉴定可极大地促进基因表达分析。
一些小RNA从基因组中确定的位置产生。微RNA是这样的种类；它们通常由RNA聚合酶II从多顺反子基因簇转录，或也可从前mRNA内含子产生。迄今已知数千个独特的miRNA序列。其他种类的小RNA， 例如piRNA或内源siRNA通常不从基因组中确定的基因座转录。相反，它们响应事件例如病毒感染或反转录转座子表达而产生并且用于沉默此类否则将导致对细胞的严重损害的‘外源’序列。ncRNA的描述可见于，特别地，Eddy，Nat.Rev.Genet.2：919-29，2001；Mattick和Makunin，Human Mol.Genet.15：R17-29，2006；Hannon等人，ColdSprings Harbor Sympos.Quant.Biol.LXXI：551-64，2006。测定样品中全部的小RNA群体的序列提供了同时鉴定和甚至表征所有类别的此类RNA的直接方法。
概述
本教导涉及用于检测和定量下列的方法、试剂和试剂盒：(i)小RNA分子，也称为非翻译功能性RNA、非编码RNA(ncRNA)和小非信使RNA(snmRNA)；和(ii)编码RNA，其可以是或可以不是通过本领域内已知的方法片段化和/或分级分离(fractionate)的。
根据某些公开的方法，形成包含至少一种待检测的RNA分子、至少一种第一衔接子(adaptor)、至少一种第二衔接子和双链特异性RNA连接酶的连接反应组合物。第一衔接子包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸在3’末端上含有至少2个核糖核苷，所述第二寡核苷酸，当第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交在一起时，包含单链部分。第二衔接子包含第三寡核苷酸和第四寡核苷酸，所述第三寡核苷酸含有5’磷酸基团，所述第四寡核苷酸，当第三寡核苷酸与第四寡核苷酸杂交在一起时，包含单链部分。在连接反应组合物中通过双链特异性RNA连接酶将第一衔接子和第二衔接子连接至RNA分子，从而形成连接产物。第一衔接子和第二衔接子以定向方式与RNA分子退火(由于它们的结构)，并且各衔接子同时或几乎同时而非相继地(例如，将第二衔接子和RNA分子与连接酶组合，然后第二衔接子被连接至RNA分子的3’末端，然后将第一衔接子与连接的RNA分子-第二衔接子组合，然后第一衔接子连接至RNA分子-第二衔接子的5’末端，在将第二衔接子连接至RNA分子与将第一衔接子连接至RNA 分子之间插入纯化步骤，参见，例如，Elbashir等人，GenesandDevelopment 15：188-200，2001；Berezikov等人，Nat.Genet.Supp.38：S2-S7，2006)连接至与其退火的RNA分子。应理解，向连接反应组合物中加入组分的顺序不受限制，并且可以以任何顺序添加组分。还应理解，在加入组分的过程中，可在加入反应组合物的所有组分之前在连接酶存在的情况下将衔接子与相应的RNA分子连接，例如但不限于，可在加入第一衔接子之前在连接酶存在的情况下将第二衔接子与相应的RNA分子连接，和应理解，此类反应在本教导的预期的范围内，只要将一种衔接子连接至RNA分子的时间与将另一种衔接子连接至RNA分子的时间之间不存在纯化步骤即可。将RNA指导的DNA聚合酶(有时称为依赖于RNA的DNA聚合酶)与连接产物组合以形成反应混合物，将所述混合物在适合于反转录产物的条件下进行温育。将反转录产物与核糖核酸酶，通常核糖核酸酶H(RNA酶H)组合，并从反转录产物中降解至少一些核糖核苷以形成扩增模板。
将扩增模板与至少一种正向引物、至少一种反向引物和DNA指导的DNA聚合酶(有时称为依赖于DNA的DNA聚合酶)组合以形成扩增反应组合物。将扩增反应组合物在适合于允许产生扩增产物的条件下进行热循环。在一些实施方案中，检测至少一种扩增产物。在一些实施方案中，使用报告探针和/或核酸染料间接检测至少一种RNA类别在样品中的存在。在某些实施方案中，扩增反应组合物还包含报告探针，例如但不限于 探针、分子信标、ScorpionTM引物等，或核酸染料，例如但不限于 Green或其他核酸结合染料或核酸嵌入染料。在本教导的某些实施方案中，检测包括实时或终点检测技术，包括但不限于定量PCR。在一些实施方案中，确定扩增产物的至少一部分的序列，这使得能够鉴定相应的RNA分子。在一些实施方案中，从起始材料中的RNA分子产生包含文库特异性核苷酸序列的扩增产物的文库，其中至少一些扩增产物类别共有文库特异性标识符(identifier)，例如但不限于文库特异性核苷酸序列，包括但不限于条形码序列(barcode sequence)或杂交标签或公共标志物(common marker)或亲和标签。在一些实施方案中，可组合和分析两个或更多个文库，然后基于文库特异性标识符对结果进行去卷积(deconvoluted)。
根据某些公开的方法，在反转录反应组合物中只使用一种聚合酶，包含DNA指导的DNA聚合酶活性和RNA指导的DNA聚合酶活性的DNA聚合酶并且不使用另外的聚合酶。在其他方法实施方案中，向反转录反应组合物中加入RNA指导的DNA聚合酶和DNA指导的DNA聚合酶，并且不向扩增反应组合物中加入另外的聚合酶。
在一些实施方案中，用于检测样品中的RNA分子的方法包括将样品与至少一种第一衔接子、至少一种第二衔接子和包含双链特异性RNA连接酶活性的多肽组合以形成连接反应组合物(其中将至少一种第一衔接子和至少一种第二衔接子连接至样品的RNA分子，从而在相同的连接反应组合物中形成连接产物)，和检测连接产物的RNA分子或其替代物(surrogate)。在一些实施方案中，至少一种第一衔接子包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸具有10至60个核苷酸的长度并且在3’末端含有至少2个核糖核苷，所述第二寡核苷酸包含与第一寡核苷酸大体上互补的核苷酸序列并且当第一寡核苷酸与第二寡核苷酸形成双链时还包含1至8个核苷酸的单链5’部分。在一些实施方案中，至少一种第二衔接子包含第三寡核苷酸和第四寡核苷酸，所述第三寡核苷酸具有10至60个核苷酸的长度并且包含5’磷酸基团，所述第四寡核苷酸包含与第三寡核苷酸大体上互补的核苷酸序列并且当第三寡核苷酸与第四寡核苷酸形成双链时还包含1至8个核苷酸的单链3’部分。在一些实施方案中，单链部分独立地具有简并核苷酸序列，或与RNA分子的一部分互补的序列。在一些实施方案中，第一和第三寡核苷酸具有不同的核苷酸序列。在连接反应组合物中，待检测的RNA分子与至少一种第一衔接子的单链部分和至少一种第二衔接子的单链部分杂交。
在一些实施方案中，检测RNA分子或其替代物包括，将连接产物与i)RNA指导的DNA聚合酶，ii)含有依赖于DNA的DNA聚合酶活性 和依赖于RNA的DNA聚合酶活性的DNA聚合酶，或iii)RNA指导的DNA聚合酶和DNA指导的DNA聚合酶组合；反转录连接产物以形成反转录产物；用核糖核酸酶H从反转录产物中降解至少一些核糖核苷以形成扩增模板；当如i)中那样组合连接产物时，将扩增模板与至少一种正向引物、至少一种反向引物和DNA指导的DNA聚合酶组合以形成扩增反应组合物；循环扩增反应组合物以形成至少一种扩增产物，然后确定扩增产物的至少一部分的序列，从而检测RNA分子。
在一些实施方案中，用于产生RNA文库的方法包括，将许多不同的RNA分子与许多第一衔接子类别、许多第二衔接子类别和双链特异性RNA连接酶组合以形成连接反应组合物，其中至少一种第一衔接子包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸在3’末端上包含至少2个核糖核苷，所述第二寡核苷酸，当第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交在一起时，包含单链部分，并且其中至少一种第二衔接子包含第三寡核苷酸和第四寡核苷酸，所述第三寡核苷酸包含5’磷酸基团，所述第四寡核苷酸，当第三寡核苷酸与第四寡核苷酸杂交在一起时，包含单链部分，和将至少一种第一衔接子和至少一种第二衔接子连接至RNA分子以形成许多不同的连接产物类别，其中在相同的连接反应组合物中将第一衔接子和第二衔接子连接至RNA分子。该方法还包括将许多连接产物类别与RNA指导的DNA聚合酶组合，反转录许多连接产物类别中的至少一些以形成许多反转录产物类别，用核糖核酸酶H(RNA酶H)从许多反转录产物中的至少一些中降解至少一些核糖核苷以形成许多扩增模板类别，将许多扩增模板类别与至少一种正向引物、至少一种反向引物和DNA指导的DNA聚合酶组合以形成扩增反应组合物，然后循环扩增反应组合物以形成含有许多扩增产物类别的文库，其中至少一些扩增产物类别包含对于文库中至少一些其他扩增产物类别是共同的标识序列(identification sequence)。
还公开了用于进行某些本方法的试剂盒。本文中展示了本教导的这些和其他特征。
附图
本领域技术人员将理解，下面描述的附图仅用于举例说明目的。这些图无意以任何方式限定本教导的范围。
图1提供了本教导的各种示例性方法实施方案的示意性概述。
图2A-图2B：图2A示意性描述了示例性第一衔接子21和示例性第二衔接子22；图2B示意性描述图1A中显示的示例性第一和第二衔接子与示例性RNA分子23定向退火。通过箭头24显示第一衔接子21与RNA分子23的5’末端的连接接合点(ligation junction)，以及通过箭头25显示第二衔接子22与RNA分子23的3’末端的连接接合点。空心矩形描述了RNA序列例如21A和23的序列。水平实线描述了DNA序列例如21B和22A的DNA序列。
图3提供了本教导的示例性实施方案的示意性概述。将一群小RNA分子33与第一衔接子31和第二衔接子32以及Rnl2连接酶组合以形成连接产物34。未退火的衔接子和/或不期望的退火副产物分子35也可存在于连接反应组合物中。将反应组合物与RNA指导的DNA聚合酶组合以产生反转录产物36，然后将该组合物与核糖核酸酶H组合以产生扩增模板38。将扩增模板38与DNA指导的DNA聚合酶、正向引物310和反向引物311组合以形成扩增反应组合物。在该示例性实施方案中，反向引物还包含标识序列312，有时称为“条形码”序列。
图4提供了本教导的示例性实施方案的示意性概述。在该示例性实施方案中，凝胶纯化(Gel Purif.)扩增产物，所述扩增产物包含插入序列(由图4中弯曲括号显示)、第一引物区域(图4中显示为P1)和包括条形码或标识序列(图4中显示为bc)的第二引物区域(图4中显示为P2)。
图5描述了如实施例1中所述产生的示例性扩增产物的电泳图。
泳道1：10bp DNA梯(100ng；Invitrogen P/N 10821-015，Carlsbad，CA)；
泳道2：起始材料为100ng总RNA，无连接酶的对照；
泳道3：起始材料为100ng总RNA，无RT的对照；
泳道4：起始材料为100fmol mirVanaTM Reference Panel v.9.1(AppliedBiosystems P/N 4388891，Foster City，CA)；
泳道5：起始材料为100ng总RNA；和
泳道6：起始材料为来自5μg总RNA的flashPAGETM FractionatorSystem纯化的RNA。
图6描述了如实施例2中所述单独或组合地使用各种双链依赖性连接酶产生的示例性扩增产物的电泳图。
泳道1：100ng 10bp DNA梯(Invitrogen)；
泳道2：10个单位的噬菌体T4RNA连接酶2，200U逆转录酶(RT)；
泳道3：10个单位的噬菌体T4RNA连接酶2，无RT；
泳道4：10个单位的噬菌体T4RNA连接酶I，200U RT；
泳道5：10个单位的噬菌体T4RNA连接酶1，无RT；
泳道6：10个单位的噬菌体T4DNA连接酶，200U RT；
泳道7：10个单位的噬菌体T4DNA连接酶，无RT；
泳道8：噬菌体T4RNA连接酶I和噬菌体T4DNA连接酶各5个单位，200U RT；
泳道9：噬菌体T4RNA连接酶I和噬菌体T4DNA连接酶各5个单位，无RT；和
泳道10：无连接酶，200U RT。
图7A描述了连接反应组合物中产生的示例性连接产物(由箭头注释的双连接显示的)的电泳图，所述连接反应组合物包含各种第一衔接子、各种第二衔接子或各种第一衔接子和各种第二衔接子的组合，以及许多不同miRNA分子(包含大致等摩尔浓度的大约500个不同类别的合成的miRNA分子)和噬菌体T4的RNA连接酶2，如实施例4中所描述的。横跨图7A的顶部的数字4、6和8相应于反应组合物中各第一衔接子的第二寡核苷酸和各第二衔接子的第四寡核苷酸上的简并核苷酸序列的数目(在图7B中显示为N)。
X-轴：
T3-4表示在只包含含有结构T3:27N(参见图7B)的第一衔接子的连接组合物中产生相应的连接产物，其中在该情况下N等于4个简并核苷酸；
T3-6表示在只包含含有结构T3:27N的第一衔接子的连接反应组合物中产生相应的连接产物，其中N在该情况下等于6个简并核苷酸；
T3-8表示在只包含含有结构T3:27N的第一衔接子的连接反应中产生相应的连接产物，其中N在该情况下等于8个简并核苷酸；
T7-4表示在只使用含有结构T7:N28(参见图7B)的第二衔接子的连接反应中产生相应的连接产物，其中N在该情况下等于4个简并核苷酸；
T7-6表示在只使用含有结构T7:N28(参见图7B)的第二衔接子的连接反应中产生相应的连接产物，其中N在该情况下等于6个简并核苷酸；
T7-8表示在只使用含有结构T7:N28的第二衔接子的连接反应中产生相应的连接产物，其中N在该情况下等于8个简并核苷酸；
T3-4+T7-4表示在使用含有结构T3:27N的第一衔接子和含有结构T7:N28的第二衔接子的连接反应中产生相应的连接产物，其中N在该情况下在两种衔接子的所有类别中等于4个简并核苷酸；
T3-6+T7-6表示在使用含有结构T3:27N的第一衔接子和含有结构T7:N28的第二衔接子的连接反应中产生相应的连接产物，其中N在该情况下在两种衔接子的所有类别中等于6个简并核苷酸；和
T3-8+T7-8表示在使用含有结构T3:27N的第一衔接子和含有结构T7:N28的第二衔接子的连接反应中产生相应的连接产物，其中N在该情况下在两种衔接子的所有类别中等于8个简并核苷酸；
数字27是指第一衔接子的第一寡核苷酸的长度，数字28是指第二衔接子的第三核苷酸的长度。
图7B示意性描述了本教导的示例性第一和第二衔接子，其中N分别代表示例性第一衔接子或第二衔接子的下链(lower strand)即第二寡核苷酸或第四寡核苷酸上的一系列简并核苷。
图8A：描述了使用各种第一衔接子、各种第二衔接子、或各种第一衔接子和各种第二衔接子的组合产生的示例性连接产物(由箭头标示)的电泳图，如实施例5中描述的和图8B中描绘的。
X-轴：
T3r2-6表示在只使用含有T3r2:276N(参见图8B)的第一衔接子的连接反应中产生相应的连接产物，其中6N等于6个简并核苷酸，r2表示2个3’核糖核苷酸；
T7-6表示在只使用含有T7:6N 28(参见图8B)的第二衔接子的连接反应中产生相应的连接产物，其中6N等于6个简并核苷酸；
T3r2-6+T7-6表示在使用含有T3r2:27 6N的第一衔接子和含有T7:6N 28的第二衔接子的连接反应中产生相应的连接产物，其中r2表示2个3’核糖核苷酸，以及其中6N在两种衔接子的所有类别中等于6个简并核苷酸；
rT3-6表示在只使用含有rT3:27 6N的第一衔接子的连接反应中产生相应的连接产物，其中6N等于6个简并核苷酸，rT3表示所有核苷酸，
rT7-6表示在只使用含有rT7:6N 28的第二衔接子的连接反应中产生相应的连接产物，其中rT7表示所有核糖核苷酸，6N等于6个简并核苷酸；和
rT3-6+rT7-6表示在使用含有rT3:27 6N的第一衔接子和含有rT7:6N 28的第二衔接子的连接反应中产生相应的连接产物，其中rT3和rT7表示所有核糖核苷酸，并且6N在两种衔接子的所有类别中等于6个简并核苷酸。
图8B示意性描述了本教导的第一和第二衔接子的两个示例组(所述两个组包括(i)rT3:27 6N(上部第一衔接子)和rT7:6N 28(上部第二衔接子)和(ii)T3r2:27 6N(底部第一衔接子)和T7:6N 28(底部第二衔接子)，其中6N代表示例性第一衔接子的下链和示例性第二衔接子的下链上的一系列6个简并核苷。
图9A-图9C.图9A和图9B描述了根据实施例6中描述的本教导 的某些实施方案产生的示例性连接产物的电泳图。就双连接效率检测第一衔接子和第二衔接子的3种不同组合。这些组合包括具有两个DNA上链(即，第一和第三寡核苷酸)(除了第一寡核苷酸的3’末端上的2个核糖核苷外)，具有两个RNA上链(即，第一和第三寡核苷酸)或具有5’(第一)衔接子上的RNA上链(即，第一寡核苷酸)和3’(第二)衔接子上的DNA上链(即，第三寡核苷酸)的第一衔接子和第二衔接子。图9C提供了具有示例性第一衔接子(rT3:27 6N)和第二衔接子(T7:6N28)(也在图8B中单独描述)的较后的衔接子结构实施方案的示意图。
图10A和图10B描述了显示使用一系列连接反应组合物根据本教导的某些实施方案产生的示例性连接产物的2个电泳图，所述连接反应组合物各自包含(1)Rnl2连接酶，(ii)以2和0.2皮摩尔(pmol)的浓度存在的合成的miRNA分子的库(mirVana miRNAReference Panelv 9.1，P/N 4388891(Ambion，Austin，TX；本文中描述的)，和(iii)以10/50，5/25、1/5、1/50、5/50、10/50、25/50、5/100或5/500(上链/下链)的上链对下链的比存在的本文中公开的第一和第二衔接子，如实施例6中显示和描述的。
图11示意性描述本教导的某些实施方案，其中从样品中取出和/或纯化核酸的各种亚群。可将该方法的实施方案用于小RNA检测和分离以及用于全转录组测序。
图12描述了使用按照本教导的一个方法产生的示例性扩增产物的基于的示例性检测测定的-ΔΔCT的log2倍数变化(FC)(在y-轴上显示为Log2(FC)TaqMan(-ddCt))对利用使用SOLiDTMSequencing System的示例性测序检测技术且使用相同示例性扩增产物的等分测定的Log2(FC)(在x-轴上显示为Log2(FC SOLiDTM)的图，如由实施例7提供的。
图13A和图13B描述了使用 Gold染色显现的包括通过本教导的某些实施方案产生的示例性扩增产物的电泳图，如实施例7中描述的。
图14示意性描述了本教导的各种实施方案，包括通过使用嵌入染 料 Green(例如，实施例8)(用于在实时PCR反应中进行检测)或电泳分离的扩增产物的Gold染色(“ Assay”)定量按照本教导产生的示例性扩增产物来检测目的RNA分子。LEGenD：连接酶增强的基因检测是指将依赖于双链的连接酶用于本文中提供的测定。
图15示意性描述了实施例8中描述的本教导的扩增产物。P1指正向PCR引物的一部分。P2指反向PCR引物的一部分。
图16A和图16B描述了实时PCR检测的RNA分子的示例性曲线，所述RNA分子是加入至示例性样品的RNA分子(图16A)或存在于样品中的两个ncRNA分子(内源miRNA miR-16(图16B，具有菱形符号的顶部曲线)和miR-21(图16B，具有方形符号的底部曲线)，如实施例8中所描述的。图16A的斜率和y-截距是：SIC 34(圆圈，顶部线)：y＝-3.2568x+32.916，R2＝0.9918；SIC 8(三角形)：y＝-3.4116x+29.444，R2＝0.9886；SIC 37(方形)：y ＝-2.8517x+23.685，R2＝0.9935；和SIC 36(菱形，底部线)：y＝-3.0381x+19.587，R2＝0.999。
图17提供了用于产生小RNA文库的SOLiDTMSmall RNA ExpressionKit步骤的概述，如实施例11中提供的。经大小选择的扩增的小RNA在“模板珠粒制备”阶段进入SOLiDTM乳液PCR步骤。
示例性实施方案的描述
应理解，上述一般描述和下列的详细描述都只是示例性的和说明性的，并且无意限定本教导的范围。在本申请中，除非明确地指出，否则单数的使用包括复数。例如，“aforward primer”意指可存在1个以上的正向引物；例如，一个或多个拷贝的特定正向引物类别，以及一个或多个不同的正向引物类别。同样地，“包含”、“含有”和“包括”或这些根词的修饰形式例如但不限于“包括”、“包含的”和“含有”，也不期望受到限定。术语“和/或”指之前和之后的术语可一起或分别地使用。例如，但不作为限定，“X和/或Y”可表示“X” 或“Y”或“X和Y”。
本文中使用的章节标题只是为了组织目的而不应被解释为以任何方式限定所描述的主题。本申请中引用的所有文献和相似材料，包括专利、专利申请、论文、书籍和专题论文明确地以它们的全文通过引用合并入本文，用于任何目的。如果一个或多个合并的文献和相似材料以与本说明书中的术语定义相矛盾的方式定义或使用术语，则以本说明书为准。虽然结合不同实施方案描述了本教导，但本教导无意限定于此类实施方案。相反地，本教导包括各种改变、修饰和等价物，如本领域技术人员所理解的。
术语“或其组合”，如本文中所使用的，是指该术语之前所列的项的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”意欲包括：A、B、C、AB、AC、BC或ABC中的至少一个，并且如果顺序在特定上下文中是重要的，那么，还包括BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。对该实例进行延伸，明确包括的是包含一个或多个项或项目的重复的组合，例如BB，AAA，AAB，BBC，AAABCCCC，CBBAAA，CABABB等。本领域技术人员将理解，除非根据上下文很明显地，否则通常对任何组合中的项或项目的数目没有限制。
根据某些公开的方法，例如但不限于，图1中显示的示例性实施方案，形成包含至少一种待检测的RNA分子、至少一种第一衔接子、至少一种第二衔接子以及双链特异性RNA连接酶的连接反应组合物(显示为第一和第二衔接子与RNA分子的杂交)。通常，起始材料包含许多RNA类别和许多不同的第一衔接子和不同的第二衔接子。
如图2A和图2B中所示，至少一种第一衔接子21包含第一寡核苷酸21A和第二寡核苷酸21B，所述第一寡核苷酸21A在3’末端上包含至少2个核糖核苷，所述第二寡核苷酸21B，当第一寡核苷酸21A与第二寡核苷酸21B杂交在一起时，包含单链5’部分21C(图2A)，并且其中至少一种第二衔接子22包含第三寡核苷酸22A和第四寡核苷酸22B，所述第三寡核苷酸22A包含5’磷酸基团(在图2B中显示为“P”)，所述第四寡核苷酸22B，当第三寡核苷酸22A与第四寡核苷酸22B杂 交在一起时，包含单链3’部分22C(图2A)。应理解，在本举例说明性实施方案中，第一寡核苷酸中所有核苷是核糖核苷，但在其他实施方案中，第一寡核苷酸的多至全部和少至2个的核苷可以是核糖核苷，只要第一寡核苷酸21A的最3’的2个核苷是核糖核苷；第一寡核苷酸的其余部分可包含核糖核苷、脱氧核糖核苷或两者的组合。
图2A的举例说明性第二和第四寡核苷酸的单链部分(分别地21B的21C和22B的22C)描述为简并六聚体序列(显示为NNNNNN)。然而，具有序列特异性单链部分和同样地更长的和更短的单链部分的第一和/或第二衔接子的使用在本教导的范围内。在一些实施方案中，简并序列是脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，简并序列的长度是4、6或8个核苷酸。在一些实施方案中，第一寡核苷酸包含核糖核苷并且第二、第三和第四寡核苷酸包含脱氧核糖核苷酸。
设计第一和第二寡核苷酸使之除了单链部分21C外大体上互补。大体上互补的部分可具有10至60个核苷酸的长度。当退火或双链化以形成第一衔接子时，第一和第二寡核苷酸可具有一个平端(如图2A和图2B中)或可在与具有单链部分的末端相对的末端上具有1、2或3个核苷酸的悬突。悬突可在第一或第二寡核苷酸上。
设计第三和第四寡核苷酸使之除了单链部分22C外大体上互补。大体上互补的部分可具有10至60个核苷酸的长度。当退火或双链化以形成第二衔接子时，第三和第四寡核苷酸可具有一个平端(如图2A和图2B中)或可在与具有单链部分的末端相对的末端上具有1、2或3个核苷酸的悬突。悬突可在第一或第二寡核苷酸上。
回到图1，将连接反应组合物在适合于第一衔接子和第二衔接子与RNA分子退火的条件下进行温育。第一和第三寡核苷酸(“上链”)可以以1∶1至1∶10的对第二和第四寡核苷酸(“下链”)的摩尔比存在。在一些实施方案中，“上链”对“下链”的摩尔比为1∶5或1∶2。将包含双链特异性RNA连接酶活性的多肽用于连接退火的第一衔接子-RNA分子-第二衔接子复合物以形成连接产物(在图1中显示为“连接”)。在相同的反应组合物中将第一衔接子和第二衔接子与RNA分子 连接(而不是作为两个分开的相继的连接反应(其在将两个衔接子连接至RNA分子之间具有一个或多个插入的分离或纯化步骤))。还应理解，添加连接反应组合物的组分的顺序和将两个衔接子连接至RNA分子的顺序通常不是对提供的本教导的限定。
如图2B中所示，在某些实施方案中，将第一和第二衔接子与RNA分子杂交以便(i)第一衔接子的第一寡核苷酸的3′末端和RNA分子的5′末端毗邻退火以形成第一连接接合点(例如，图2B中的24)(由于RNA分子与第一衔接子的单链部分之间的互补性)和(ii)第二衔接子的第三寡核苷酸的5’末端与相同RNA分子的3’末端毗邻退火以形成第二连接接合点(例如，图2B中的25)(由于RNA分子与第二衔接子的单链部分之间的互补性)，其中第一和第二连接接合点都适合于使用包含双链特异性RNA连接酶活性的多肽进行连接。在一些实施方案中，包含双链特异性RNA连接酶活性的多肽包括Rnl2家族连接酶，包括但不限于Rnl2连接酶。
将RNA指导的DNA聚合酶与连接产物以及合适的核苷三磷酸和含有合适的盐的缓冲溶液组合。将该反应混合物在适合于使用连接产物作为模板来产生反转录产物的条件下进行温育(图1中显示为“反转录”)。由于第四寡核苷酸用作RT引物，因此不需要单独的反转录引物。
在一些实施方案中，将反转录产物置于阵列上并且使用本领域技术人员已知的标准方法进行检测。在一些实施方案中，用生物素标记反转录产物，并使用与其结合的链霉抗生物素蛋白来进行检测。在一些实施方案中，使用玻璃纤维过滤器、珠粒来纯化或凝胶纯化反转录产物。在一些实施方案中，将反转录产物与包含核糖核酸酶活性的肽组合以形成降解反应组合物，并且将其在适合于从反转录产物中降解至少一些核糖核苷的条件下进行温育以形成扩增模板。在一些实施方案中，包含核糖核酸酶活性的肽包含核糖核酸酶H(RNA酶H)活性(在图1中显示为“RNA酶H降解”)。
将扩增模板与至少一种正向引物、至少一种反向引物和包含DNA 指导的DNA聚合酶活性的肽组合以形成扩增反应组合物。当具有RNA指导的和DNA指导的聚合酶活性的DNA聚合酶用于上述反转录反应时，不必加入另外的包含DNA指导的DNA聚合酶的肽。将扩增反应组合物在适合于允许扩增产物产生的条件下进行热循环(图1中显示为“扩增”)。确定扩增产物的至少一部分的序列，这使得能够检测相应的RNA分子(图1中显示为“序列确定”)。
根据图3中示意性描述的一个示例性实施方案，将一群小RNA分子33与包含含有RNA的第一寡核苷酸(空心框中显示的)的第一衔接子31和第二衔接子32以及Rnl2连接酶组合以形成连接反应组合物。将连接反应组合物在适合于退火发生的条件下进行温育，从而第一衔接子和第二衔接子与小RNA分子退火形成含有与RNA分子的5’末端退火的第一衔接子和与小RNA分子的3’末端退火的第二衔接子的连接模板。连接酶将通过在连接接合点(在图3中显示为实点并且用箭头标示)将第一衔接子连接至RNA分子的5’末端和将第二衔接子连接至RNA分子的3’末端来产生连接产物34。取决于连接反应组合物中衔接子与RNA分子的浓度，一些未退火的第一衔接子31和/或第二衔接子32也可存在于连接反应组合物中。此外，特别地当第一和/或第二衔接子包含简并序列时，还可形成不期望的退火副产物分子35。
将含有连接产物的反应组合物与RNA指导的DNA聚合酶组合，并且在合适的条件下产生反转录产物36。将含有反转录物36的反应组合物与核糖核酸酶H组合，降解连接产物的至少一些核糖核苷，从而产生扩增模板38。本领域技术人员将理解，在这一点上，扩增模板本质上包含与第二衔接子的第三寡核苷酸退火的反转录物的cDNA链。将扩增模板38与DNA指导的DNA聚合酶、正向引物310和反向引物311组合，以形成扩增反应组合物。在该举例说明性实施方案中，反向引物还包含标识序列312，有时称为“条形码”序列。如果给定的扩增反应组合物中所有反向引物包含相同的标识序列并且该序列被掺入随后的扩增子中，则从相同扩增反应组合物产生的所有扩增子可被鉴定为来自该反应组合物。
将扩增反应组合物进行温度循环以允许聚合酶链式反应发生并且产生多种扩增产物。在该举例说明性实施方案中，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和/或高效液相色谱(HPLC；有时称为高压液相色谱)纯化扩增产物。使用本领域内已知的任何技术测定纯化的扩增产物的序列，鉴定相应于该序列的RNA分子。本领域技术人员将理解，公开的方法可用于多种分析，包括但不限于，表达特征谱分析、定量一个或多个相应样品(例如，进行和未进行药物处理的；恶性/肿瘤组织和相应的正常组织样品；使用相应的胚胎、新生儿、青少年和/或成人组织进行的发育研究)中的一种或多种特定RNA分子和小RNA发现。
应理解，如果待产生多个扩增产物文库，那么可通过该文库的独特标识序列或条形码鉴定各扩增产物文库。在一些实施方案中，用于给定的扩增产物文库的PCR引物混合物包含正向引物(例如，参见图3中的正向引物310)和含有独特标识序列或条形码的反向引物(例如，参见图3中含有标识序列312的反向引物311)。当循环包含这样的引物对的扩增反应组合物时，条形码被掺入该文库的扩增产物。因此，可将示例性第一引物与此类示例性反向引物的任一个在扩增反应组合物中匹配以产生包含反向引物的条形码或其互补序列的扩增产物的文库。
例如而非作为限定，使用PCR引物混合物(其包括示例性正向引物和示例性反向引物BC1(参见实施例11))产生的第一文库中的各扩增产物将包含条形码序列AAGCCC和/或其互补序列；而使用PCR引物混合物(其包括示例性正向引物和示例性反向引物BC2)产生的第二文库中的各扩增产物将包含条形码序列CACACC和/或其互补序列等。因此，可在测序之前将扩增产物的多个文库混合，并且相应于各文库的起始材料中的RNA分子可使用靶(RNA分子)序列或该序列的至少一部分，结合该文库的条形码或标识序列来鉴定。本领域技术人员将理解，可将不同的标识序列用于独特地标记在给定的扩增反应组合物中产生的扩增产物。
图4示意性描述了本教导的另一个示例性实施方案。根据该实施方案，将第一和第二衔接子与RNA分子杂交(在图4中显示为衔接子杂交)，在合适的条件下并且在合适的连接酶存在的情况下，产生连接产物(在图4中显示为连接)。向连接产物中加入反转录酶，在合适的条件下产生反转录产物(在图4中显示为反转录)。用核糖核酸酶H降解反转录产物，从而形成扩增模板(在图4中显示为RNA酶H)。形成包含扩增模板、正向引物、反向引物和DNA指导的DNA聚合酶的扩增反应组合物。将扩增反应组合物进行热循环，进行一定数目的循环(其保持在扩增的线性范围内)(通常，根据一个示例性实施方案，大约12至15个循环或12至18个循环)，从而允许聚合酶链式反应发生和扩增产物产生(在图4中显示为PCR)。在该举例说明性实施方案中，对扩增产物进行凝胶纯化(在图4中显示为Gel Purif)，从而产生纯化的扩增产物。只要使用恰当地大小分级分离的或片段化的RNA分子，则扩增产物包含插入序列(由图4中的弯曲括号显示的；在某些实施方案中，插入物大小为大约15个碱基对至大约100个碱基对)、第一引物区域(在图4中显示为P1)和包含条形码或标识序列(在图4中显示为bc)的第二引物区域(在图4中显示为P2)。
如本文中所使用的，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用并且是指通过核苷酸间磷酸二酯键或核苷酸间类似物连接的核苷单体(包括2′-脱氧核糖核苷(DNA)和核糖核苷(RNA))的单链和双链聚合物以及结合的抗衡离子例如H+、NH4 +、三烷基铵、Mg2+、Na+等。多核苷酸可完全由脱氧核糖核苷、完全由核糖核苷或其嵌合混合物组成。如在下面进一步描述的，例如，第一衔接子包含在其3’末端具有至少2个核糖核苷的第一寡核苷酸。第一寡核苷酸可具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个核糖核苷并且在一些实施方案中，核糖核苷是连续的。在一些实施方案中，第二、第三或第四寡核苷酸包含脱氧核糖核苷酸。核苷酸单体单位可包括本文中描述的任何核苷酸，包括但不限于，核苷酸和核苷酸类似物。多核苷酸的大小范围通常在一些单体单位，例如5至40或5至60个(在本领域内它们有时称为寡核苷酸)至数千个单体核苷酸单位 之间。除非另外指出，否则每当描述多核苷酸序列时，应理解核苷酸以5′至3′的顺序从左至右显示。
待检测的RNA分子：在一些实施方案中，本教导的RNA分子包括总RNA，总RNA的亚组或级分，或两者。在一些实施方案中，包含待检测的RNA分子的样品包含从特定样品或样品库获得的所有RNA。在其他实施方案中，将总RNA分级分离为亚组，并且待检测的RNA分子存在于一个或多个分级分离的亚组中。通常，使用本领域内已知的任何技术(所述技术产生样品中的总RNA或RNA分子的亚组)从样品提取RNA分子。
在一些实施方案中，通常在形成连接反应组合物之前，将待检测的RNA分子片段化。在一些实施方案中，可片段化总RNA或可使用本文中提供的方法片段化和分析分级分离的RNA。在一些实施方案中，待检测的RNA分子包含多个不同的RNA类别，包括但不限于，多个不同的mRNA类别，在产生连接产物之前可对其或可以不对其进行片段化。在一些实施方案中，可使用本领域内熟知的方法通过化学、酶促、机械方法，通过加热或其组合片段化RNA。使用本文中提供的方法分析片段化的RNA。因此可进行全转录组分析，其中分析从DNA转录的序列，包括编码RNA(例如，以进行表达分析)或非编码RNA。
在一些实施方案中，例如使用大小分级分离方法从样品获得某些大小范围内的小RNA分子和/或片段化的RNA。在一些实施方案中，可在连接第一和第二衔接子之前片段化总RNA，和也可对其进行大小分级分离；然而在其他实施方案中，将总RNA用于连接反应组合物。例如，而非作为限定，某些分级分离技术描述于图11中。
在一些实施方案中，进行poly A选择方法以将信使RNA(mRNA)与缺乏poly A的RNA分子(poly A-RNA分子)分离。在一些实施方案中，通过例如但不限于使用本领域内已知的polyA选择技术(包括但不限于，oligo-dT层析)从总RNA中分离至少一些mRNA来将总RNA分级分离为亚组。在此类实施方案中，poly A+级分或poly A除尽级分可用于本教导中以检测存在于该级分中的至少一些RNA分子。在一 些实施方案中，可分开地使用两种级分以检测存在于各级分中的至少一些RNA分子。在一些实施方案中，目的RNA分子包含poly A-RNA分子，例如但不限于大非编码RNA。
在某些实施方案中，使一群mRNA分子或一群poly A-RNA分子除尽群体中至少一个类别的丰富的RNA分子，例如但不限于核糖体RNA或来自持家基因或高表达的基因的mRNA，包括但不限于肌动蛋白mRNA和球蛋白mRNA。例如，从总RNA中除尽某些mRNA或RNA种类，例如但不限于高拷贝数目mRNA例如肌动蛋白、GAPDH、球蛋白和其他“持家”mRNA；和RNA的种类例如但不限于18S RNA和28S RNA(例如，使用可商购获得的试剂盒例如RiboMinus(Invitrogen，Carlsbad，CA)或GLOBINclearTM(Ambion，Austin，TX)试剂盒(也参见美国专利申请公开案US 2006/0257902，Methods and Compositions forDepleting Abundant RNATranscripts)。
术语化学片段化在本文中以广义使用，包括但不限于，将包含RNA的样品暴露于金属离子例如但不限于锌(Zn2+)、镁(Mg2+)和锰(Mn2+)和加热。
术语酶促片段化以广义使用，且包括将包含RNA的样品与包含核酸酶活性的肽例如内切核糖核酸酶或外切核糖核酸酶在适合于所述肽切割或降解至少一些RNA分子的条件下组合。示例性核酸酶包括但不限于核糖核酸酶(RNA酶)例如RNA酶A、RNA酶T1、RNA酶T2、RNA酶U2、RNA酶PhyM、RNA酶III、RNA酶PH、核糖核酸酶V1、寡核糖核酸酶(例如，EC3.1.13.3)，外切核糖核酸酶I(例如，EC 3.1.11.1)和外切核糖核酸酶II(例如，EC3.1.13.1)，然而，催化RNA分子水解为一个或多个更小的组成成分的任何肽在本教导的预期内。通过核酸例如但不限于核酶进行的RNA分子的片段化也在本教导的范围内。
术语机械片段化以广义使用并且包括借助其在暴露于机械力包括但不限于，超声、碰撞或物理撞击(physical impact)和剪切力时片段化核酸的任何方法。
在一些实施方案中，根据本教导，在使用剩余的较大的RNA分子 之前，使用“净化”步骤例如但不限于使用凝胶电泳、玻璃纤维滤器或使用磁珠进行的纯化来除去非常小的RNA片段。
在某些实施方案中，本教导的方法使用利用物理分离法分级分离的RNA分子，所述分离法包括但不限于大小分离法例如离心、柱层析/凝胶筛分和电泳分离。在一些实施方案中，目的RNA分子的电泳分离包括flashPAGETM Fractionator System(Ambion，Austin，TX)或按照本领域内已知的方法通过从琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶切割条带进行的大小选择。在一些实施方案中，用于某些公开方法的RNA分子可通过使用多种样品制备试剂盒和试剂中的任一种(包括但不限于，mirVanaTM miRNA Isolation Kit(Ambion))提取样品中的RNA分子的亚组来获得。在一些实施方案中，可免疫沉淀RNA。
术语非编码RNA或ncRNA是指无论大小，不翻译成蛋白质的任何RNA分子。示例性ncRNA包括转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、微RNA(miRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、导向RNA(gRNA)、传出RNA(efference RNA，eRNA)、Piwi-interacting RNA(piRNA)、重复相关siRNA(Repeat-associated siRNA，rasiRNA)、信号识别颗粒RNA(signalrecognition particle RNA)、启动子RNA(pRNA)、小干扰RNA(siRNA)和转运-信使RNA(tmRNA)。
本领域技术人员将理解，待检测的RNA分子的长度不是对本教导的限定，因为可分级分离和/或片段化更长的分子并且可检测级分和/或片段以重构RNA分子。在一些实施方案中，待检测的RNA分子的长度是12至500个核苷酸、15至110个核苷酸、15到100个核苷酸、18至110个核苷酸、20至80个核苷酸、25至大约60个核苷酸、20至大约45个核苷酸、20至大约41个核苷酸、20至大约40个核苷酸、21、22、23、24或25至大约36、37、38、39、40或41个核苷酸，或其间的任何整数范围。在一些实施方案中，待检测的RNA分子具有12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或41个核苷酸的长度。
本领域技术人员将理解，用于分级分离或片段化RNA的技术不是对本教导的限定，和理解，取决于将要检测的RNA分子的级分或片段，通常可使用不同的分级分离或片段化技术。
在某些实施方案中，起始材料包含至少一种合成的RNA分子例如加料对照(spike-in control)，其可用于，特别地，校准或标准化。在一些实施方案中，向含有天然发生的RNA分子的样品中加入至少一种合成的RNA分子类别，并按照公开的方法检测至少一种合成的RNA类别和至少一种天然发生的RNA类别的存在。
在一些实施方案中，待检测的RNA分子具有用于有效连接的5′-单磷酸和3′-羟基。例如，一些小RNA的生物发生导致具有包含三磷酸的5’末端的RNA分子。根据本教导的某些实施方案，此类RNA分子不适合于衔接子连接和扩增。因此，不能将具有5′帽结构的完整mRNA分子和具有5′三磷酸的RNA分子，包括小RNA例如来自线虫(C.elegans)的内源siRNA(Pak 2007)有效地连接至反应组合物中的杂交的衔接子，除非首先用脱帽酶(decappingenzyme)例如但不限于烟草酸焦磷酸酶(TAP)、核酸酶P1、Dcp1p脱帽酶、Dcp2脱帽酶或DcpS脱帽酶处理它们以将RNA分子的5′末端转变成5′单磷酸。当目的RNA分子包含5’-三磷酸时，本教导的某些实施方案使用烟草酸焦磷酸酶将RNA分子的5’末端转变成5’单磷酸，从而使得它们适合用于连接。
在一些实施方案中，通过某些片段化技术产生的片段最初不具有适合用于酶促连接的末端；在一些实施方案中，用激酶例如但不限于噬菌体T4多核苷酸激酶处理此类片段，以使5’末端或3’末端适合用于根据本教导的连接。
待检测的RNA可以是单链或双链的，因为将待检测的RNA与至少一种第一衔接子、至少一种第二衔接子组合，并退火以便包含双链特异性RNA连接酶的多肽可形成连接产物。
根据本教导，目的RNA分子可以是合成的或天然发生的。可使用本领域内熟知的寡核苷酸合成法合成RNA分子。还可按照本领域内已知的方法，例如但不限于体外转录技术，包括但不限于美国专利 5,958,688；5,723,290；5,514,545；5,021,335；5,168,038；5,545,522；5,716,785；5,891,636；和6,291,170，通过生物化学方法在体内或体外合成RNA分子。此类技术的详细描述可见于，特别地，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry，Beaucage等人，eds.，John Wiley & Sons，New York，New York，包括自2005年5月以来的最新资料(在下文中“Beaucage等人”)；以及Blackburn和Gait。用于合成RNA分子、衔接子和引物的自动化核酸合成仪可从许多来源商购获得，包括例如Applied Biosystems(FosterCity，CA)。还可使用本领域内熟知的体内方法和/或体外方法通过生物合成产生RNA分子、衔接子和引物。此类技术的描述可见于，特别地，Sambrook等人和Ausubel等人。可将核苷类似物例如2′-OMe-、LNA-、卤素-或阿拉伯糖-衍生物，例如，或通用核碱基(universalnucleobase)整合入衔接子，只要第四寡核苷酸是可引发的(primeable)底物。纯化或部分纯化的RNA可从许多来源商购获得，包括 TotalRNA、 Poly(A)、 Tumor RNA和mirVanaTMmiRNA Reference Panel(Ambion，Austin，TX)；Reference Total RNA，Human and Mouse，和Universal Reference RNA(Stratagene，LaJolla，CA)；和美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA。
在一些实施方案中，待检测的RNA分子存在于样品中。术语“样品”在本文中以广义使用，并且意在包括广泛的生物材料以及从此类包含或怀疑包含RNA的生物材料衍生或提取的组合物。示例性样品包括全血；红细胞；白细胞；血沉棕黄层；毛发；趾甲和表皮材料；拭子，包括口腔拭子、咽喉拭子、阴道拭子、尿道拭子、子宫颈拭子、直肠拭子、伤口拭子、囊肿拭子(abcess swab)、鼻咽拭子等；尿；痰；唾液；精液；淋巴液；羊膜液；脑脊髓液；腹膜渗出液；胸腔积液；来自囊肿的液体；滑液；玻璃体液；眼房水；粘液囊液(bursafluid)；洗眼液；眼抽吸物(eye aspirates)；血浆；肺灌洗液；肺抽吸物；和组织，包括肝、脾、肾、肺、肠、脑、心脏、肌肉、胰腺、活组织检查材料等。本领域技术人员将理解，从上述示例性生物 样品的任一种获得的裂解物、提取物或材料也在本教导的范围内。组织培养细胞，包括外植材料、原代细胞、次级细胞系等以及获自任何细胞的裂解物、提取物或材料也在本文中使用的术语生物样品的含义内。从法院、农业和/或环境背景获得的包含或怀疑包含至少一种RNA分子的材料也在术语样品的期望的含义内。在某些实施方案中，样品包含合成的核酸序列。在一些实施方案中，样品是完全合成的，例如但不限于，包含含有至少一种合成的核酸序列的缓冲液的对照样品。在某些实施方案中，样品是环境样品，例如土壤、水或空气样品。
植物miRNA可在3’末端具有2′-O-甲基基团并且可在本文中引述的连接反应中进行连接。然而，这样的连接的效率，与在3’末端具有2′-OH的RNA类别相比较，将降低。
第一衔接子和第二衔接子：如上所说明的，至少一种第一衔接子包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸在3’末端包含至少2个核糖核苷，所述第二寡核苷酸，当第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交在一起时，包含单链5’部分，如图2A中所描述的。设计第一和第二寡核苷酸使之除了单链部分外大体上互补，如下文进一步描述的。大体上互补的部分可具有10至60个核苷酸的长度。在一些实施方案中，大体上互补的部分可具有10至40个核苷酸，12或15至30个核苷酸、20、21、22或23至25、27或29个核苷酸，或任何这些范围之间的任何整数范围的长度。当退火或双链化以形成第一衔接子时，第一和第二寡核苷酸可具有一个平端(如图2A和图2B中)或可在与具有单链部分的末端相对的末端上具有1、2或3个核苷酸的悬突。悬突可以在第一或第二寡核苷酸上。
还如上所说明的，至少一种第二衔接子包含第三寡核苷酸和第四寡核苷酸，所述第三寡核苷酸包含5’磷酸基团，所述第四寡核苷酸，当第三寡核苷酸与第四寡核苷酸杂交在一起时，包含单链3’部分，也如图2A中所描述的。设计第三和第四寡核苷酸使之除了单链部分外大体上互补，如下文进一步描述的。大体上互补的部分可具有10至60个核苷酸的长度。当退火或双链化以形成第二衔接子时，第三和第 四寡核苷酸可具有一个平端(如图2A和图2B中)或可在与具有单链部分的末端相对的末端上具有1、2或3个核苷酸的悬突。悬突可在第一或第二寡核苷酸上。
在一些实施方案中，除了第一寡核苷酸在3’末端包含至少2个核糖核苷外，第一、第二、第三和第四寡核苷酸独立地包含脱氧核糖核苷、核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸两者。应理解，在图2A的举例说明性实施方案中，第一寡核苷酸中的所有核苷是核糖核苷，但在其他实施方案中，第一寡核苷酸的多至所有和少至2个的核苷可以是核糖核苷，只要第一寡核苷酸的最3’的2个核苷是核糖核苷；第一寡核苷酸的剩余部分可包含核糖核苷、脱氧核糖核苷或两者的组合。在一些实施方案中，第二、第三和第四寡核苷酸包含脱氧核糖核苷并且第一寡核苷酸包含所有核糖核苷。在一些实施方案中，第一寡核苷酸包含核糖核苷并且第二、第三和第四寡核苷酸包含脱氧核糖核苷酸。第一和第二衔接子的寡核苷酸的长度彼此独立。
第一、第二、第三和第四寡核苷酸的序列使得在衔接子的双链化部分中获得实质的互补性，如上所述的。在一些实施方案中，第一和第三寡核苷酸的序列是不同的。衔接子的双链化部分的核苷酸的特定序列不限定本文中的方法。在一些实施方案中，衔接子序列的一部分包含“启动子序列”，包括但不限于适合于使用合适的聚合酶例如但不限于T3 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶起始转录的序列。在一些实施方案中，第一衔接子包含第一启动子的“启动子序列”，第二衔接子包含第二启动子的“启动子序列”。
第一寡核苷酸的3’末端和第三寡核苷酸的5’末端适合用于连接至待检测的RNA分子，所述RNA分子也适合用于连接。“适合用于连接的”寡核苷酸是指至少一种待检测的RNA分子和至少一种第一衔接子和/或至少一种第二衔接子，其各自包含合适的反应基团。示例性反应基团包括但不限于第一衔接子的第一寡核苷酸的3′末端上的游离羟基和待检测的RNA分子的5′末端上的游离磷酸基团，待检测的RNA分子的3′末端上的游离羟基和第二衔接子的第三寡核苷酸的5′末端 上的游离磷酸基团。
衔接子的单链部分：举例说明性的第二和第四寡核苷酸的单链部分在图2A中描述为简并六聚体序列(显示为NNNNNN)。然而，具有序列特异性单链部分和同样地更长和更短的单链部分的第一和/或第二衔接子的使用在本教导的范围内。
在一些实施方案中，单链部分独立地包含脱氧核糖核苷、核糖核苷或脱氧核糖核苷和核糖核苷的组合。在一些实施方案中，单链部分包含脱氧核糖核苷。
在衔接子的单链部分的一些实施方案中，单链部分的长度短至1个核苷酸和长至8个核苷酸。在一些实施方案中，单链部分的长度为2，4，6或8个核苷酸。在一些实施方案中，单链部分的长度为4或6个核苷酸。第二寡核苷酸的单链部分的长度不依赖于第四寡核苷酸的单链部分的长度。
在一些实施方案中，将单链部分的核苷序列设计成与待检测的特定RNA分子的5’序列或3’序列互补。在一些实施方案中，待检测的特定RNA分子与至少一种第一衔接子的单链部分和至少一种第二衔接子的单链部分杂交以使连接反应可发生。为了与特定序列杂交，在一些实施方案中，单链部分的长度独立地是4至6个核苷酸长。在这样的方法中，通过本文中的方法定向检测RNA分子。本领域技术人员可设计相应于待检测的RNA分子的5’序列或3’序列的单链部分，和使用本文中提供的检测方法检测相应于RNA分子的有义序列或反义序列。
在一些实施方案中，将单链部分的序列设计为简并序列，以允许样品的所有RNA分子具有对简并序列的互补性，从而与衔接子的单链部分退火。在一些实施方案中，简并单链部分具有1至8个核苷酸的长度。在一些实施方案中，简并单链部分具有4、6或8个核苷酸的长度。在一些实施方案中，简并核苷序列是脱氧核糖核苷酸。
在一些实施方案中，第二或第四寡核苷酸的单链部分的序列是简并序列，第二或第四寡核苷酸的其他的序列是相应于待检测的RNA分 子的序列。
退火或杂交：术语“退火”和“杂交”，包括但不限于，根词杂交和退火的变型，可互换使用并且是指一个核酸与另一个核酸的核苷酸碱基配对相互作用(其导致双链体、三链体或其他高级结构的形成)。一级相互作用通常是核苷酸碱基特异性的，例如通过Watson-Crick和Hoogsteen类型氢键产生的A:T、A:U和G:C。在某些实施方案中，碱基堆积和疏水相互作用还可促成双链稳定性。例如，引物与互补或大体上互补的序列退火的条件在本领域内是熟知的，例如，如NucleicAcid Hybridization，A Practical Approach，Hames和Higgins，eds.，IRL Press，Washington，D.C.(1985)以及Wetmur和Davidson，Mol.Biol.31：349，1968中所描述的。一般地，退火是否发生受到，特别地，核酸的互补部分的长度、pH、温度、单价和二价阳离子的存在、杂交区域中G和C核苷酸的比例、介质的粘度和变性剂的存在的影响。此类变量影响杂交所需的时间。某些核苷酸类似物或小沟结合剂在核酸的互补部分中的存在也可影响杂交条件。因此，优选的退火条件将取决于特定应用。然而，此类条件可由本领域技术人员常规地确定而无需过度的实验。通常，选择退火条件以允许核酸在反应中选择性地与互补或大体上互补的序列杂交，但不与其他序列杂交至任何显著的程度。
术语“选择性杂交”和其变型意指在合适的条件下，给定的序列与包含互补或大体上互补的核苷酸串的第二序列退火，但不与不期望的序列退火。在本申请中，一个序列选择性地与另一个序列杂交或退火的陈述包括其中两个序列完全彼此杂交的情况，和其中一个或两个序列的仅一部分与完整的另一个序列或另一个序列的一部分杂交的情况。为了该定义的目的，术语“序列”包括核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、引物、靶特异性部分、扩增产物特异性部分、引物结合位点、杂交标签和杂交标签的互补序列。
术语“相应的”，如本文中所用的，是指该术语涉及的元素之间的至少一种特定关系。例如，第一衔接子的单链5’部分相应于具有 与单链部分杂交的末端核苷酸序列的RNA分子。第二衔接子的单链3’部分相应于具有与单链部分杂交的末端核苷酸序列的RNA分子。另外的实例包括其中引物结合核酸的相应的互补或大体上互补的引物结合部分的情况，其中特定亲和标签结合相应亲和标签的情况，例如但不限于，生物素结合链霉抗生物素蛋白的情况，以及其中特定杂交标签与其相应的杂交标签互补序列退火的情况等。
在本申请中，一个序列与另一个序列相同、大体上相同、互补或大体上互补的陈述包括其中两个序列彼此完全相同、大体上相同、或互补或大体上互补的情况，以及其中序列之一的仅一部分与另一个序列的一部分或与完整的另一个序列相同、大体上相同、互补或大体上互补的情况。为了该定义的目的，术语“序列”包括RNA、DNA、多核苷酸、寡核苷酸、引物、连接产物、反转录产物、扩增模板、扩增产物、引物结合位点、杂交标签和杂交标签互补序列。
术语“变性的”或“变性”，如本文中所使用的，是指其中将双链多核苷酸，包括双链扩增产物或双链DNA或DNA:RNA双链体转变成两个单链多核苷酸的任何过程。使双链多核苷酸变性包括但不限于用于使双链体变性，从而释放其两条单链组分的许多种热或化学技术。本领域技术人员将理解，除非使用的变性技术抑制或略微干扰随后的扩增和/或检测步骤，否则其通常是不受限制的。
连接：术语“连接”或其形式，在本文中用于指使用包含双链特异性RNA连接酶活性的多肽的酶促连接过程，在该过程中在与模板毗邻杂交的寡核苷酸的紧邻末端之间形成核苷酸间的连接。连接的形成是双链依赖性和特异性的，也称为双链体依赖性的和特异性的或模板依赖性和特异性的。核苷酸间的连接可以包括但不限于3’核糖核苷与5’核糖核苷之间或3’核糖核苷与5’脱氧核糖核苷之间的磷酸二酯键的形成。术语“双链特异性RNA连接酶”，如本文中所使用的，是指包含RNA连接酶活性的多肽，其优先封闭或连接具有3’末端核糖核苷酸的寡核苷酸与具有5’磷酸基团的寡核苷酸之间的缺口，特别地当寡核苷酸与模板分子紧邻杂交时。例如，但不限于第一衔接子 的第一寡核苷酸的3’末端与该第一衔接子与之退火的RNA分子之间的缺口在图2B中示意性地呈现为连接接合点24。
在某些实施方案中，包含双链特异性RNA连接酶活性的多肽是Rnl2家族连接酶，例如噬菌体T4 RNA连接酶2(T4 Rnl2)，包括但不限于Rnl2的酶促活性突变体或变体。T4 Rnl2是因变异的核苷酸转移酶基序而与连接酶的Rnl1家族不同的RNA连接酶家族的原型连接酶(参见，例如，Ho和Shuman，Proc.Natl.Acad.Sci.99(20)：12709-14(2002)；和Yin等人，J.Biol.Chem.278：17601-08(2003))。T4Rnl2家族包括，特别地，弧菌噬菌体KVP40 Rnl2、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)的RNA-编辑连接酶(REL)(TbREL1和TbREL2)和Leishmaniatarentolae的RNA-编辑连接酶(LtREL1和LtREL2)、痘病毒AmEPV(昆虫痘病毒)连接酶、杆状病毒AcNPV连接酶和杆状病毒XcGV连接酶。在一些实施方案中通过使用REL连接酶，第二和第四寡核苷酸可包含核糖核苷酸以及，在某些实施方案中，第二和第四寡核苷酸的单链部分可包含核糖核苷酸。
T4 Rnl2连接酶可从NEW ENGLAND (Ipswich，MA)商购获得，或可如Nandakumar等人，JBC 280(25)：23484-23489，2005；Nandakumar等人，JBC 279(30)：31337-31347，2004；和Nandakumar等人，Molecular Cell 16：211-221，2004中所述分离连接酶。T4Rnl2酶由噬菌体T4的基因gp24.1编码。在某些实施方案中，包含连接酶活性的多肽包括T4Rnl2或连接酶的Rnl2家族的另一个成员，或其酶促活性突变体或变体。
在某些实施方案中，包含双链特异性RNA连接酶活性的多肽是耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)RNA连接酶(DraRnl)(Raymond等人，Nucl Acids Res 35(3)：839-849，2007)，或DraRnl型连接酶，包括但不限于，来自真菌稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)的具有GenBank登录号XP_367846的、来自粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)的具有GenBank登录号CAE76396的、来自玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)的具有登录号XP_380758的或来自阿米巴盘基网 柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)的具有登录号EAL61744的连接酶。在一些实施方案中，连接酶可包括任何上述连接酶、或其酶促活性突变体或变体的组合。
在某些实施方案中，可预先腺苷酸化包含双链特异性RNA连接酶活性的多肽，可预先腺苷酸化第三寡核苷酸的5’末端核苷酸，或可预先腺苷酸化待检测的RNA分子的5’末端核苷酸，或其组合。Ho等人(Structure 12：327-339)提出了T4 Rnl2的机制，其中其C末端结构域用于封闭3’-OH和5’-P RNA末端。Rnl2蛋白的N末端区段(1-249)据报导用作自主腺苷酰转移酶/App-RNA连接酶结构域。通常，RNA连接酶通过一系列牵涉激活的共价中间体的三个核苷酸基转移步骤连接3′-OH与5′-PO4RNA末端。RNA连接酶与ATP反应形成共价的连接酶-AMP中间体+焦磷酸盐。然后AMP从连接酶-腺苷酸转移至5′-PO4 RNA末端以形成RNA-腺苷酸中间体(AppRNA)。然后连接酶催化RNA 3′-OH对RNA-腺苷酸的攻击以通过磷酸二酯键封闭两个末端，并且释放AMP。RNA连接的机制由Nandakumar等人(ibid 2005，2004a，2004b)Yin等人(JBC 278：20，17601-17608；Virology 319：141-151，2004)，Ho等人(ibid；PNAS，99：20，12709-12714，2002)，Gumport等人(在Gene Amplification and Analysis中，第2卷，由Chirikjian，J.G.，和Papas编辑，T.S.，1981，313-345)和由Raymond等人(NucleicAcidsRes.35：3，839-849，2007)进一步论述。预先腺苷酸化的试剂例如连接酶-腺苷酸、RNA-腺苷酸或嵌合DNA/RNA-腺苷酸预期用于本教导的一些实施方案。
根据某些实施方案，将至少一个第一衔接子的类别、至少一个第二衔接子的类别、至少一个RNA分子的类别和包含双链特异性RNA连接酶活性的多肽组合在连接反应组合物中。应理解，与其中在一个反应中将一种衔接子连接至目的RNA分子的一个末端，然后在第二反应中将另一种衔接子连接至或整合入相同目的RNA分子的相对侧，且通常具有插入的凝胶纯化、磷酸化或反转录步骤的其他技术不同，在相同的温育时间中在相同的反应组合物中(即同时或几乎同时地)将本 教导的衔接子各自与相应的RNA分子连接(参见，例如，Elbashir等人，Genes and Development 15：188-200，2001；Ambros和Lee，MethodsinMol.Biol.265：131-58，2004；Berezikov等人，Nature Genet.Supp.38：S2-S7，2006；Takada等人，Nucl.Acids Res.34(17)：e115，2006；Michael，Methods in Mol.Biol.342：189-207，2006；以及Takada和Mano，Nature Protocols 2(12)：3136-45，2007)。应理解，除非另外明确地提及，否则对于本教导，向连接反应组合物中加入组分的顺序通常不是重要的，并且意欲包括在术语“形成连接反应组合物”或本文中使用的相似术语内。因此，一种衔接子(例如，第一衔接子)至包含RNA分子和连接酶的反应组合物的相继加入，然后另一种衔接子(在本实例中，第二衔接子)至该反应组合物的随后加入在本教导的期望的范围内，无论一种衔接子的加入与另一种衔接子的加入之间是否存在温育步骤。
反转录：在一些实施方案中，检测RNA分子包括反转录连接产物以形成反转录产物。术语“反转录”和“逆转录”和其形式，如本文中所使用的，是指从连接产物开始，基于使用具有RNA指导的DNA聚合酶转录活性的多肽以模板依赖性的方式进行的脱氧核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的类似物至杂交分子的顺序催化加入，产生双链RNA-DNA杂交分子的过程。根据本教导，第二衔接子的第四寡核苷酸可用作用于反转录连接产物以产生反转录产物的引物。因此加入单独的引物以进行反转录不是必需的。
在一些实施方案中，具有RNA指导的DNA聚合酶转录活性的多肽包括MMLV逆转录酶，包括其酶促活性突变体或变体，例如但不限于ArrayScriptTM逆转录酶(Ambion)、SuperScriptTM逆转录酶(Invitrogen)；或包含反转录活性但当与相应的野生型逆转录酶相比时具有降低的RNA酶H活性的多肽，例如但不限于“RNA酶H-”突变体，例如RNA酶H-HIV-1逆转录酶(Wu等人，J.Virol.73(6)：4794-4805，1999)。
在一些实施方案中，可利用在某些反应条件下具有RNA指导的 DNA聚合酶活性的DNA指导的DNA聚合酶例如但不限于来自生氢氧化碳嗜热菌(Carboxydothermushydrogenoformans)的Tth DNA聚合酶和DNA聚合酶I进行RNA指导的DNA聚合酶转录活性。
核糖核酸酶H降解：在一些实施方案中，用核糖核酸酶H降解反转录产物以除去至少一些核糖核苷从而形成扩增模板。术语“降解”，特别地当提及核糖核酸酶时，是指催化RNA成更小的组分，例如但不限于通过RNA酶H切割反转录产物的RNA链以产生可用作本教导的扩增模板的单链或基本上单链的cDNA分子。
扩增：术语“扩增的”和“扩增”以广义使用并且是指借助于其再生或拷贝(包括互补拷贝的合成)扩增模板的至少一部分、扩增产物的至少一部分或两者(通常以模板依赖性方式)的任何技术，包括但不限于，用于线性或指数地扩增核酸序列的许多技术。扩增技术的一些非限定性实例包括聚合酶链式反应(PCR)，包括但不限于，逆转录PCR(RT-PCR)、异步引物PCR(asynchronous primer PCR)、乳液PCR(ePCR)、定量PCR(qPCR)和不对称PCR、引物延伸、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)、基于核酸链的扩增(NASBA)、滚环扩增(RCA)、转录介导的扩增(TMA)、转录等，包括其多重形式(multiplexversion)或组合。此类技术的描述见于，特别地，Sambrook和Russell同上；Sambrook等人；Ausubel等人；PCR Primer：ALaboratoryManual，Diffenbach，Ed.，Cold Spring Harbor Press(1995)；TheElectronicProtocol Book，Chang Bioscience(2002)；Msuih等人，J.Clin.Micro.34：501-07(1996)；McPherson和Moller，PCR TheBasics，Bios Scientific Publishers，Oxford，U.K.，2000(“McPherson”)；Rapley，The Nucleic Acid Protocols Handbook(2000)，Humana Press，Totowa，New Jersey(“Rapley”)；美国专利6,027,998和6,511,810；PCT公开案WO 97/31256和WO01/92579；Ehrlich等人，Science 252：1643-50(1991)；Innis等人，PCR Protocols：AGuide to Methods and Applications，Academic Press(1990)；Favis等人，NatureBiotechnology 18： 561-64(2000)；Williams等人，Nature Methods 3(7)：545-50(2006)；和Rabenau等人，Infection 28：97-102(2000)。
扩增可包括热循环(有时称为循环或热学循环)或可等温进行。在某些实施方案中，扩增包括至少一个循环，和通常地多个循环的连续步骤：将引物与扩增模板、扩增产物或任一个的互补序列的互补或大体上互补的序列杂交；使用聚合酶以模板依赖性的方式合成核苷酸的链；和使新形成的核酸双链体变性以分开链。需要时，可以重复或可以不重复循环。在一些实施方案中，扩增包括在热循环仪，例如但不限于 PCR System9700、9600、2700或2400热循环仪(全都来自Applied Biosystems)中循环扩增反应组合物。在某些实施方案中，开始时不对新形成的核酸双链体进行变性，而是以它们的双链形式将其用于一个或多个随后的步骤中，并且任一条链或两条链可以，但非必需，用作相应的目的RNA分子的替代物。在某些实施方案中，产生单链扩增子，例如但不限于不对称PCR、异步PCR或转录。
引物延伸是扩增技术，其包括使用延伸酶例如聚合酶以5’＝＞3’方向延伸与模板退火的引物以形成延伸产物，例如但不限于反转录连接产物或扩增扩增模板或扩增产物。根据某些实施方案，利用合适的缓冲液、盐、pH、温度和核苷三磷酸，聚合酶从退火的引物的3’末端开始掺入与模板链互补的核苷酸，以产生互补链。在某些实施方案中，用于引物延伸的聚合酶缺乏或基本上缺乏5’外切核酸酶活性。
在一些实施方案中，将扩增模板与至少一种正向引物、至少一种反向引物和具有DNA指导的DNA聚合酶活性的多肽组合以形成扩增反应组合物。
术语“DNA聚合酶”在本文中以广义使用，并且是指任何多肽，所述多肽能够以模板依赖性的方式催化脱氧核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的类似物至核酸聚合物的加入，例如但不限于在引物延伸反应期间脱氧核糖核苷酸至与核酸模板退火的引物的3’末端的相继加入。通常，DNA聚合酶包括DNA指导的DNA聚合酶和RNA指导的DNA聚合酶，包括逆转录酶。一些逆转录酶在某些反应条件下具有DNA指导的 DNA聚合酶活性，包括AMV逆转录酶和MMLV逆转录酶。一些DNA指导的DNA聚合酶在某些反应条件下具有逆转录酶，例如但不限于嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(Tth)DNA聚合酶。DNA聚合酶的描述可见于，特别地，Lehninger Principles of Biochemistry，第3版，Nelson和Cox，Worth Publishing，NewYork，NY，2000，特别地第26和29章；Twyman，Advanced Molecular Biology：AConciseReference，Bios Scientific Publishers，New York，NY，1999；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons，Inc.，包括自2005年5月以来的补充内容(下文中“Ausubel等人”)；Lin和Jaysena，J.Mol.Biol.271：100-11，1997；Pavlov等人，Trends in Biotechnol.22：253-60，2004；以及EnzymaticResource Guide：polymerases，1998，Promega，Madison，WI。明确地在术语DNA指导的DNA聚合酶和RNA指导的DNA聚合酶的期望的范围内的是其酶促活性突变体或变体，包括经修饰赋予不同温度敏感特性的酶(参见，例如，美国专利5,773,258；5,677,152；和6,183,998；以及DNAAmplification：Current Techniques and Applications，Demidov和Broude，eds.，Horizon Bioscience，2004，特别地第1.1章)。
酶的酶促活性突变体或变体：为了本教导的目的，当描述或主张特定酶或包含酶促活性的多肽时，除非另外明确地声明，否则预期包括该酶/多肽的酶促活性突变体或变体。例如，而非作为限定，当术语“Rnl2”或“Rnl2连接酶”用于本说明书或所附权利要求书中时，除非另外明确地声明，否则预期包括天然发生的或野生型Rnl2连接酶以及Rnl2连接酶的所有酶促活性突变体或变体。类似地，RNA指导的DNA聚合酶、核糖核酸酶或DNA指导的DNA聚合酶被认为与其酶促活性突变体或变体等价。术语“其酶促活性突变体或变体”是指来源于相应的酶的一种或多种多肽，其保持至少一些期望的酶促活性例如连接、反转录、降解、扩增活性(或需要时)。也在本术语的范围内的是：酶促活性片段，包括但不限于，切割产物，例如但不限于Klenow片段、 Stoffel片段或在大小上比相应的酶更小的重组表达的片段和/或多肽；相应的酶的突变体形式，包括但不限于，天然发生的突变体，例如与“野生型”或共有氨基酸序列不同的突变体，使用物理和/或化学诱变剂产生的突变体，和遗传工程例如但不限于随机和定点诱变技术产生的突变体；氨基酸插入和缺失，截断形式，和由于核酸无义突变、错义突变和移码突变而产生的变化(参见，例如，Sriskanda和Shuman，Nucl.AcidsRes.26(2)：525-31，1998；Odell等人，Nucl.Acids Res.31(17)：5090-5100，2003)；可逆修饰的核酸酶、连接酶和聚合酶，例如但不限于美国专利5,773,258中描述的那些；通过基因改组技术获得的生物学活性多肽(参见，例如，美国专利6,319,714和6,159,688)、剪接变体(天然发生的和遗传工程产生的)，只要它们至少部分来源于一个或多个相应的酶；至少部分相应于一个或多个这样的酶的多肽，其包含对天然序列的一个或多个氨基酸的修饰，包括但不限于，添加、除去或改变糖基化、二硫键、羟基侧链和磷酸侧链，或交联，只要此类修饰的多肽保持至少一些期望的催化活性；等等。当针对特定酶使用时，明确地在术语“其酶促活性突变体或变体”的含义内的是该酶的酶促活性突变体、该酶的酶促活性变体或该酶的酶促活性突变体和该酶的酶促活性变体。
本领域技术人员通过使用本领域内已知的合适测定法将能够容易地测量酶促活性。因此，用于聚合酶催化活性的合适测定可包括例如测量变体在合适的条件下以模板依赖性方式将rNTP或dNTP整合入新生的多核苷酸链的能力。同样地，用于连接酶催化活性的合适测定可包括例如，测量连接毗邻杂交的包含合适的反应基团(例如本文中公开的那些)的寡核苷酸的能力。用于此类测定的方案可见于，特别地，Sambrook等人，MolecularCloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Press(1989)(在下文中“Sambrook等人”)，Sambrook和Russell，编辑，Molecular Cloning，第3卷，第3版，Cold SpringHarborPress(2001)，Ausubel等人，以及Housby和Southern，Nucl.Acids Res.26：4259-66，1998)和下文引用的关于Rnl2连接酶的家 族的参考文献。
扩增引物：术语“引物”是指与扩增模板、扩增产物或两者的相应的引物-结合位点选择性杂交；并且允许从其3’末端合成与相应的多核苷酸模板互补的序列的多核苷酸。“引物对”包括与扩增产物的一条链或其互补序列退火的正向引物和反向引物。引物对可特别用于某些指数扩增技术，例如聚合酶链式反应。在某些实施方案中，引物对的正向引物和相应的反向引物具有不同解链温度(Tm)以允许异步引物PCR。
如本文中所使用的，“正向”和“反向”用于表示引物在多核苷酸序列例如扩增模板或扩增产物上的相对方向。例如，但非作为限定，认为单链多核苷酸以其5’末端在左边，以水平地从左至右的方向延伸。设计“反向”引物使之以5’至3’方向，从右至左与该举例说明性多核苷酸的“3’末端”上或其附近的下游引物-结合位点退火。设计相应的“正向”引物使之以5’至3’的“正向”方向从左至右与多核苷酸的“5’末端”上或其附近的上游引物-结合位点的互补序列退火。因此，反向引物包含与多核苷酸的“反向”或下游引物-结合位点互补的序列，并且正向引物包含与正向或上游引物-结合位点相同的序列。应理解，术语“3末端”和“5’末端”，如本段落中所使用的，只是举例说明性的，并且不必按字面表示多核苷酸的各自末端，因为此类引物-结合位点可位于内部。相反地，唯一的限定是该示例性引物对的反向引物与反向引物-结合位点退火，所述反向引物-结合位点在正向引物-结合位点的下游或在其右边，所述正向引物-结合位点包含与相应的正向引物相同的序列。如本领域技术人员所公认的，这些术语不意欲是限定性的，而是在给定的实施方案中提供说明性方向。
引物可包含衔接子寡核苷酸的核苷酸序列或相应于衔接子寡核苷酸的核苷酸序列。例如，具有SEQ ID NO：5的正向引物包含具有SEQ ID
NO：1的第一寡核苷酸的序列(用T替代U)。引物与衔接子序列之间的关系的一些实施方案可根据图15的示意图来理解，在所述示意图中箭头描述了不同的正向和反向PCR引物或正向和反向SYBR引物。P1和 P2指引物部分。
如本文中所使用的，术语“引物-结合位点”是指可直接或利用其互补序列作为模板的多核苷酸序列的区域，引物可在所述模板上退火以进行本领域内已知的多种引物核苷酸延伸反应中的任一种(例如，PCR)。本领域技术人员将理解，当两个引物-结合位点存在于单个多核苷酸(例如但不限于第一延伸产物或第二延伸产物)上时，两个引物-结合位点的方向通常是不同的。例如，引物对的一个引物与第一引物-结合位点互补并且可与其杂交，而引物对的相应引物经设计与第二引物-结合位点的互补序列杂交。换句话说，在一些实施方案中，第一引物-结合位点可以为有义方向，第二引物-结合位点可以为反义方向。此外，如本文中所使用的，通常选择“通用”引物和引物-结合位点使之尽可能独特(相对于特定测定和宿主基因组)以确保测定的特异性。
在一些实施方案中，引物和/或扩增产物包含“启动子序列”，包括但不限于适合于使用合适的聚合酶起始转录的序列，所述聚合酶例如但不限于T 3RNA聚合酶、T7RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶。本教导的一些实施方案在将启动子序列整合入扩增产物的方法中使用“启动子-引物”。在一些实施方案中，启动子序列包括适合用于结合RNA聚合酶的许多不同序列，例如但不限于适合用于结合第一RNA聚合酶的第一序列和适合用于结合第二RNA聚合酶的第二序列。本领域技术人员理解，当通过某些扩增方法扩增包含启动子序列的扩增产物时，可在互补的扩增子中合成启动子序列的互补序列。因此，应理解，启动子序列的互补序列明确地包括在术语启动子序列的期望的含义内，如本文中所使用的。公开的方法和试剂盒的一些实施方案在将期望的启动子序列整合入扩增产物的方法中使用“启动子-引物”。
本领域技术人员理解，当通过某些扩增方法扩增扩增产物时，可在互补的扩增子中合成引物-结合位点的互补序列。因此，应理解，引物-结合位点的互补序列明确地包括在术语引物-结合位点的期望的含义内，如本文中所使用的。
在一些实施方案中，本教导的扩增方法包括Q-PCR反应。术语“定 量PCR”、“实时PCR”或“Q-PCR”是指用于定量特定核酸序列的聚合酶链式反应的结果的许多方法。此类方法通常分类为基于动力学的系统(其通常确定或比较扩增因子(amplification factor)，例如确定循环阈值(CT))或共扩增法(其通常比较从靶和标准模板的同时扩增产生的产物的量)。许多Q-PCR技术包括报告探针、嵌入剂或两者。例如但不限于 探针(Applied Biosystems)、i-探针、分子信标、Eclipse探针、蝎形引物、LuxTM引物、FRET引物、溴化乙锭、 Green I(Molecular Probes)和 (MolecularProbes)。在一些实施方案中，检测包括实时检测仪器。示例性实时仪器包括ABI 7000Sequence Detection System、ABI 7700 Sequence Detection System、AppliedBiosystems 7300Real-Time PCR System、Applied Biosystems 7500 Real-TimePCRSystem、Applied Biosystems 7900 HT Fast Real-Time PCR System(全部来自Applied Biosystems)；LightCyclerTM System(RocheMolecular)；Mx3000PTM Real-TimePCR System、Mx3005PTM Real-TimePCR System和 Multiplex QuantitativePCR System(Stratagene，La Jolla，CA)；和Smart Cycler System(Cepheid，由FisherScientific分销)。实时仪器的描述可见于，特别地，它们各自的厂商的用户手册；McPherson；DNA Amplification：CurrentTechnologies and Applications，Demidov和Broude，eds.，HorizonBioscience，2004；以及美国专利No.6,814,934。
在某些实施方案中，扩增反应包括多重扩增，其中使用许多不同的引物对同时扩增许多不同的扩增模板、许多不同的扩增产物类别或两者(参见，例如，Henegariu等人，BioTechniques 23：504-11，1997；和Rapley，特别地第79章)。公开的方法的某些实施方案包括单重扩增反应，包括但不限于，包括平行进行的许多单重扩增的扩增反应，例如但不限于某些 Array配置，其中平行进行大约100个核酸酶测定以确定特异性扩增产物是否存在和以什么量存在。
在某些实施方案中，扩增反应包括不对称PCR。根据某些实施方 案，不对称PCR包括扩增组合物，所述组合物包含(i)至少一个引物对，其中一个引物相对于引物对的相应引物过量，例如但不限于5倍、10倍或20倍过量；(ii)至少一个引物对，其只包含正向引物或只包含反向引物；(iii)至少一个引物对，其包含，在给定的扩增条件中，导致一条链的扩增的引物和丧失功能的相应的引物；或(iv)至少一个引物对，其满足上述(i)和(iii)的描述。因此，当扩增扩增模板或扩增产物时，随后的扩增产物的一条链过量(相对于其互补链)。不对称PCR的描述可见于，特别地，McPherson，特别地在第5章中；和Rapley，特别地在第64章中。
在某些实施方案中，可使用至少一个引物对，其中一个引物的解链温度(Tm50)高于另一个引物的Tm50，有时称为异步引物PCR(A-PCR，参见，例如，美国专利6,887,664)。在某些实施方案中，正向引物的Tm50与相应的反向引物的Tm50相差至少4-15℃。在某些实施方案中，正向引物的Tm50与相应的反向引物的Tm50相差至少8-15℃。在某些实施方案中，正向引物的Tm50与相应的反向引物的Tm50相差至少10-15℃。在某些实施方案中，正向引物的Tm50与相应的反向引物的Tm50相差至少10-12℃。在某些实施方案中，在至少一个引物对中，正向引物的Tm50与相应的反向引物的Tm50相差至少大约4℃，至少大约8℃，至少大约10℃，或至少大约12℃。
在某些扩增实施方案中，除了引物对中引物的Tm50的差异外，引物对中一个引物相对于另一个引物过量。在某些实施方案中，引物对中一个引物相对于另一个引物过量5至20倍。在A-PCR的某些实施方案中，引物浓度是至少50nM。
根据某些实施方案在A-PCR中，可在扩增的第一循环中使用常规PCR以便两个引物退火和扩增双链扩增子的两条链。然而，通过升高相同扩增反应的随后循环中的温度，可使具有较低Tm的引物丧失功能，以便只扩增一条链。因此，其中使具有更低的Tm的引物丧失功能的A-PCR的随后循环导致不对称扩增。因此，当扩增靶区域或扩增产物时，随后的扩增产物的一条链过量(相对于其互补链)。
根据A-PCR的某些实施方案，可通过在第一阶段的常规PCR循环期间改变循环的次数来控制扩增的水平。在此类实施方案中，通过改变初始常规循环的次数，可改变将在更高的温度下经历PCR的随后循环(其中具有较低Tm的引物丧失功能)的双链扩增产物的量。
在某些实施方案中，扩增包括体外转录。在一些实施方案中，第一衔接子、第二衔接子、第一引物、第二引物或其组合，包含启动子序列或其互补序列，例如但不限于启动子-引物。在一些实施方案中，将包含启动子的反转录产物或包含启动子的扩增产物与核糖核苷三磷酸、合适的缓冲系统和合适的RNA聚合酶例如但不限于SP6、T3或T7RNA聚合酶组合，并且按照已知的方法产生扩增RNA(aRNA)。aRNA可用于阵列分析，例如微阵列或珠粒阵列分析，其中可确定aRNA类别的序列和量。因此，在某些实施方案中，此类aRNA用作相应的RNA分子的替代物。
最优化扩增反应的某些方法对于本领域技术人员来说是已知的。例如，已知可通过改变退火、聚合和变性的时间和温度以及改变反应组合物中的缓冲剂、盐和其他试剂来最优化PCR。还可通过设计使用的引物来进行最佳化。例如，引物的长度以及G-C∶A-T的比可改变引物退火的效率，从而改变扩增反应。扩增最优化的描述可见于，特别地，JamesG.Wetmur，″Nucleic Acid Hybrids，Formation and Structure″，于Molecular Biologyand Biotechnology中，第605-8页，(RobertA.Meyers ed.，1995)；McPherson，特别地第4章；Rapley；和Protocols& Applications Guide，rev.9/04，Promega Corp.，Madison，WI。
根据本教导，纯化扩增产物包括在至少一个扩增循环后，除去连接反应组合物、扩增反应组合物或两者的至少一些未连接的衔接子、未连接的RNA分子、副产物、引物、酶或其他组分的任何方法。此类方法包括但不限于，分子量/大小排阻法，例如凝胶过滤层析或透析、基于序列特异性杂交的拉出法(pullout method)、亲和捕获技术、沉淀、吸附、凝胶电泳、常规克隆、使用拼接(concatamerization)的常规克隆，或其他核酸纯化技术。在一些实施方案中，纯化扩增产 物包括凝胶电泳，包括但不限于，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和/或琼脂糖凝胶电泳。在某些实施方案中，使用高效液相色谱(HPLC；有时也称为高压液相色谱)纯化扩增产物。
检测：通过检测连接产物或其替代物来检测目的RNA分子。在一些实施方案中，如上所述反转录连接产物，然后使用本领域技术人员已知的标准方法将反转录产物置于阵列上，并且进行检测。在一些实施方案中，用生物素标记反转录产物，通过使用与其结合的链霉抗生物素蛋白进行检测。在一些实施方案中，使用玻璃纤维滤器、珠粒纯化反转录产物或凝胶纯化反转录产物。在一些实施方案中，将反转录产物与包含核糖核酸酶活性的肽组合以形成降解反应组合物，并且将其在适合于从反转录产物中降解至少一些核糖核苷的条件下温育以形成扩增模板。
术语“检测”和“探测”在本文中以广义使用，且包括借助于其可确定特定RNA分子，即，目的RNA分子是否存在于样品中的任何技术。在一些实施方案中，直接或间接地检测替代物的存在，从而允许确定相应的RNA分子的存在或不存在。例如，通过检测使用扩增产物或连接产物作为模板获得的一族标记的测序产物；或当与扩增产物退火的核酸酶报告探针被聚合酶切割时检测产生的荧光来检测替代物的存在，其中可检测的信号或可检测的信号变化表明相应的扩增产物和/或连接产物已被扩增，从而表明相应的RNA分子存在于样品中。在一些实施方案中，检测包括定量可检测的信号，包括但不限于，实时检测法例如定量PCR(“Q-PCR”)。在一些实施方案中，检测包括确定使用扩增产物作为模板产生的测序产物或一族测序产物的序列；在一些实施方案中，此类检测包括获得一族测序产物的序列。在一些实施方案中，检测RNA分子包括核酸染料，例如但不限于在Q-PCR反应组合物中。本领域技术人员将理解，连接产物、反转录产物、扩增模板和扩增序列各自用作它们直接或间接从其产生的RNA分子的替代物，和理解，通过检测此类产物的任一种，可直接或间接检测相应的RNA分子。
术语“报告探针”是指与相应的扩增子例如但不限于PCR产物特异性退火的一列核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸和核苷酸类似物，并且当检测时，包括但不限于强度或发射波长的变化用于鉴定、检测和/或定量相应的扩增子(从而相应的RNA分子)。因此，通过间接检测扩增子，可确定相应的RNA分子是否存在于样品中。可基于报告探针的作用模式分类大多数报告探针，例如但不限于：核酸酶探针，包括但不限于 探针；延伸探针，包括但不限于蝎形引物、LuxTM引物、Amplifluors等；以及杂交探针，包括但不限于分子信标、探针、light-up探针、成对的单标记的报告探针、杂交探针对等。在某些实施方案中，报告探针包含酰胺键、锁核酸(LNA)、通用碱基或其组合，并且可包括茎-环和无茎报告探针构型。某些报告探针是单标记的，然而其他报告探针是双标记的。在毗邻杂交的探针之间包含FRET的双探针系统在术语报告探针的期望的范围内。在某些实施方案中，报告探针包含荧光报告基团和猝灭剂(包括但不限于暗猝灭剂(darkquencher)和荧光猝灭剂)。报告探针的一些非限定性实例包括 探针；蝎形探针(也称为蝎形引物)；LuxTM引物；FRET引物； 探针；分子信标，包括但不限于基于FRET的分子信标、多色分子信标、适体信标(aptamer beacon)、PNA信标和抗体信标；标记的PNA钳(clamp)、标记的PNAopener、标记的LNA探针和包含纳米晶体、金属纳米颗粒的探针和相似的混合探针(hybridprobe)(参见，例如，Dubertret等人，Nature Biotech.19：365-70，2001；Zelphati等人，BioTechniques 28：304-15，2000)。在某些实施方案中，报告探针还包括小沟结合剂，包括但不限于 MGB探针和 MGB-NFQ探针(两者都来自AppliedBiosystems)。在某些实施方案中，报告探针检测包括荧光偏振检测(参见，例如，Simeonov和Nikiforov，Nucl.Acids Res.30：e91，2002)。
术语“报告基团”在本文中以广义使用，并且是指任何可鉴定的标签、标记或部分。本领域技术人员将理解，许多不同类别的报告基团可单独地或与一个或多个不同报告基团组合用于本教导。在某些实 施方案中，报告基团发射荧光、化学发光、生物发光、磷光或电化学发光信号。报告基团的一些非限定性实例包括荧光团、放射性同位素、色原、酶、抗原包括但不限于表位标签、半导体纳米晶体例如量子点、重金属、染料、磷光基团、化学发光基团、电化学检测部分、结合蛋白、磷光体、稀土螯合物、过渡金属螯合物、近红外染料、电化学发光标记和质谱相容性报告基团例如质量标签(mass tag)、电荷标签和同位素(参见，例如，Haff和Smirnov，Nucl.Acids Res.25：3749-50，1997；Xu等人，Anal.Chem.69：3595-3602，1997；Sauer等人，Nucl.Acids Res.31：e63，2003)。
术语报告基团还包括多要素报告系统的要素，包括但不限于，亲和标签例如生物素：抗生物素蛋白、抗体：抗原等，其中一个要素与系统的一个或多个其他要素相互作用以实现可检测信号的潜能。多要素报告系统的一些非限定性实例包括含有生物素报告基团的寡核苷酸和缀合有链霉抗生物素蛋白的荧光团，或反之亦然；包含DNP报告基团的寡核苷酸和荧光团标记的抗DNP抗体等。用于将报告基团连接至核酸的详细方案可见于，特别地，Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego，1996；CurrentProtocols in NucleicAcid Chemistry，Beaucage等人，eds.，John Wiley & Sons，NewYork，NY(2000)，包括自2005年4月以来的补充内容；和Haugland，Handbookof FluorescentProbes and Research Products，第9版，MolecularProbes，2002。
多要素相互作用报告基团也在术语报告基团的期望的范围内，例如荧光团-猝灭剂对，包括但不限于荧光猝灭剂和暗猝灭剂(也称为非荧光猝灭剂)。荧光猝灭剂可吸收从荧光团发射的荧光信号并且在吸收足够的荧光能量后，荧光猝灭剂可发射特征性波长的荧光，例如荧光共振能量转移(FRET)。例如但不限于，FAMTM-TAMRATM染料对可在492nm(FAMTM染料的激发峰)处被照亮，并且在580nm(TAMRATM染料的发射峰)处发射荧光。适合与荧光报告基团配对的暗猝灭剂从荧光团吸收荧光能量，但其本身不发荧光。相反地，暗猝灭剂消耗吸收的能量 (通常作为热)。暗或非荧光猝灭剂的一些非限定性实例包括Dabcyl、Black HoleQuenchers、Iowa Black、QSY-7、AbsoluteQuencher、 非荧光猝灭剂、金属簇例如金纳米颗粒等。包含荧光团-猝灭剂对的某些双标记的探针，当对的成员在物理上分离时，可发射荧光，例如但不限于核酸酶探针例如 探针。其他包含荧光团-猝灭剂对的双标记的探针，当对的成员在空间上分离时，可发射荧光，例如但不限于杂交探针，例如分子信标或延伸探针例如ScorpionTM引物。荧光团-猝灭剂对在本领域内是熟知的并且广泛地用于许多报告探针(参见，例如，Yeung等人，BioTechniques 36：266-75，2004；Dubertret等人，Nat.Biotech.19：365-70，2001；和Tyagi等人，Nat.Biotech.18：1191-96，2000)。
术语“核酸染料”，如本文中所使用的，是指荧光分子，所述荧光分子特异于双链多核苷酸或当与双链多核苷酸结合时发射比与单链多核苷酸结合时显著更强的荧光信号。通常，核酸染料分子通过嵌入双链区段的碱基对之间，通过结合在双链区段的大沟或小沟中，或两者而与多核苷酸的双链区段结合。核酸染料的非限定性实例包括溴化乙锭、DAPI、Hoechst衍生物包括但不限于Hoechst 33258和Hoechst33342、包含镧系元素螯合物(例如但不限于具有两个荧光四配位基β-二酮基-Eu3+螯合物的萘二亚胺(nalthalene diimide)衍生物(NDI-(BHHCT-Eu3+)2)的嵌入剂，参见，例如，Nojima等人，Nucl.AcidsRes.Supplement No.1，105-06(2001))、溴化乙锭和某些非对称花青染料例如 Green、 Gold、 和BOXTO。
在某些实施方案中，检测包括仪器，即，使用可以包括，但不必包括计算机算法的自动化或半自动化检测装置。在某些实施方案中，检测仪器包括或偶联至装置，所述装置用于在描记器、监控器、电子屏、磁介质、扫描仪输出或其他二或三维显示器上图形显示延伸产物或其替代物的观察到或测量的参数的强度和/或记录观察到的或测量的参数。在某些实施方案中，将检测步骤与至少一个分离步骤组合或所述检测步骤是至少一个分离步骤的延续，例如但不限于包括至少一 个荧光扫描仪和至少一个绘图、记录或读取组件的毛细管电泳仪；与吸光度监控器或荧光扫描仪和图形记录器偶联的层析柱；与包括记录和/或检测组件的质谱仪偶联的层析柱；或具有数据记录装置例如扫描仪或CCD照相机的微阵列。在某些实施方案中，将检测步骤与扩增步骤组合，例如但不限于实时分析例如Q-PCR。用于进行检测步骤的示例性系统，特别地，包括ABI Genetic Analyzer仪器系列、ABIDNA Analyzer仪器系列、ABI Sequence DetectionSystems仪器系列和Applied Biosystems Real-Time PCR仪器系列(全都来自Applied Biosystems)；以及微阵列和相关软件例如AppliedBiosystems微阵列和Applied Biosystems 1700ChemiluminescentMicroarray Analyzer和其他可商购获得的微阵列和可从Affymetrix，Agilent获得的分析系统(也参见Gerry等人，J.Mol.Biol.292：251-62，1999；De Bellis等人，Minerva Biotec 14：247-52，2002；和Stears等人，Nat.Med.9：140-45，包括补充内容，2003)或珠粒阵列平台(Illumina，San Diego，CA)。示例性软件包括GeneMapperTMSoftware、 Analysis Software和 software(全都来自Applied Biosystems)。
在某些实施方案中，可基于扩增产物和/或连接产物的至少一部分的质荷比(m/z)检测和定量RNA分子。例如，在一些实施方案中，引物或衔接子包含质谱-相容性报告基团，包括但不限于，质量标签、电荷标签、可切割部分或被整合入扩增产物并且可用于质谱仪检测的同位素(参见，例如，Haff和Smirnov，Nucl.Acids Res.25：3749-50，1997；和Sauer等人，Nucl.Acids Res.31：e63，2003)。可通过质谱检测扩增产物，从而允许确定相应的RNA分子的存在或不存在。在一些实施方案中，引物或衔接子包含限制性酶位点、可切割部分等，以促进释放扩增产物的一部分用于检测。在某些实施方案中，通过液相色谱或毛细管电泳分离许多扩增产物，使之经历ESI或MALDI，并通过质谱法进行检测。质谱法的描述可见于，特别地，The ExpandingRoie of Mass Spectrometry in Biotechnology，Gary Siuzdak，MCC Press，2003。
在某些实施方案中，直接或间接地检测替代物例如报告探针或报告探针的切割部分。例如但不限于，将扩增产物与包含猝灭剂的报告探针杂交，所述报告探针包括但不限于，分子信标，包括茎-环和无茎信标， 探针或其他核酸酶探针，LightSpeedTMPNA探针或微阵列捕获探针。在某些实施方案中，当分子信标和扩增产物在溶液中游离时，发生杂交，并且发射可检测的信号或可检测的不同信号。在其他实施方案中，扩增产物与固体表面例如微阵列杂交或结合，并且发射可检测的信号或可检测的不同信号(参见，例如，EviArraysTM和EviProbesTM，Evident Technologies)。
在某些实施方案中，检测包括测量或定量通常因扩增产物的存在而引起的报告基团的可检测信号或报告基团的可检测信号的变化。例如，但非作为限定，未杂交的报告探针可发射低水平但可检测的信号(当与扩增产物杂交时，所述信号定量地增加)，包括但不限于，某些分子信标、LNA探针、PNA探针和light-up探针(参见，例如，Svanik等人，Analyt.Biochem.281：26-35，2000；Nikiforov和Jeong，Analyt.Biochem.275：248-53，1999；以及Simeonov和Nikiforov，Nucl.Acids Res.30：e91，2002)。在某些实施方案中，检测包括测量荧光偏振。
在一些实施方案中，确定特定RNA分子是否存在于样品中包括评估内部标准或对照序列，例如相应的靶区域、内部大小标准或其组合的标准曲线。在一些实施方案中，对照序列或内部参照染料用于说明泳道之间、毛管之间和/或测定之间的变化性。在某些实施方案中，内部对照序列包括平行扩增以验证扩增反应或检测技术的无关核酸。
本领域技术人员理解，使用的检测技术通常不是限定性的。相反，许多检测方法在公开的方法和试剂盒的范围之内，只要它们允许确定样品中RNA分子的存在或不存在。
在一些实施方案中，公开的方法和试剂盒包括微流体装置，“芯片上的实验室”或微全分析系统(μTAS)。在一些实施方案中，使用微 流体装置进行样品制备。在一些实施方案中，使用微流体装置进行扩增反应。在一些实施方案中，使用微流体装置进行测序或Q-PCR反应。在一些实施方案中，使用微流体装置获得扩增产物的至少一部分的核苷酸序列。在一些实施方案中，检测包括微流体装置，包括但不限于， Low Density Array(Applied Biosystems)。示例性微流体装置的描述可见于，特别地，公开的PCT申请案WO/0185341和WO04/011666；Kartalov和Quake，Nucl.Acids Res.32：2873-79，2004；以及Fiorini和Chiu，BioTechniques 38：429-46，2005。
测序：在一些实施方案中，确定扩增产物的至少一部分的序列，从而检测目的RNA分子。术语“测序”在本文中以广义使用并且是指本领域内已知的任何技术，所述技术允许鉴定RNA的至少一部分(包括但不限于延伸产物或载体插入物的至少一部分)中至少一些连续核苷酸的顺序。测序技术的一些非限定性实例包括Sanger’s双脱氧终止法和Maxam和Gilbert的化学断裂法，包括此类方法的变型；通过杂交例如但不限于扩增产物与微阵列或珠粒例如珠粒阵列的杂交进行的测序；焦磷酸测序(参见，例如，Ronaghi等人，Science281：363-65，1998)；和限制性作图法。一些测序法包括电泳，包括但不限于毛细管电泳和凝胶电泳；质谱法；和单分子检测。在一些实施方案中，测序包括直接测序、双链体测序、循环测序、单碱基延伸测序(SBE)、固相测序或其组合。在一些实施方案中，测序包括使用仪器例如但不限于ABI 377DNA Sequencer、ABI 310，3100，3100-Avant，3730或3730xl Genetic Analyzer、ABI 3700DNA Analyzer或Applied BiosystemsSOLiDTM System(全部来自AppliedBiosystems)、Genome Sequencer 20System(RocheApplied Science)或质谱仪来检测测序产物。在某些实施方案中，测序包括乳液PCR(参见，例如，Williams等人，Nature Methodds 3(7)：545-50，2006)。在某些实施方案中，测序包括高通量测序技术，例如但不限于大规模平行测序技术(massively parallel signaturesequencing，MPSS)。MPSS的描述可见于，特别地，Zhou等人，Methods of MolecularBiology 331：285-311，Humana Press Inc.；Reinartz等人，Briefingsin FunctionalGenomics and Proteomics，1：95-104，2002；Jongeneel等人，Genome Research 15：1007-14，2005中。在一些实施方案中，测序包括将dNTP，包括但不限于dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、dITP或其组合整合入扩增产物和将dNTP的双脱氧核糖核苷酸形式包括入扩增产物。
可用于确定核酸分子的至少一部分的序列的另外的示例性技术包括但不限于基于乳液的PCR，然后进行任何合适的大规模平行测序或其他高通量技术。在一些实施方案中，确定扩增产物的至少一部分的序列以检测相应的RNA分子包括定量扩增产物。在一些实施方案中，使用例如PCT专利申请公开案WO 06/084132(标题为“Reagents，Methods，andLibraries For Bead-Based Sequencing”)和WO07/121489(标题为“Reagents，Methods，and Libraries for Gel-FreeBead-Based Sequencing”)中描述的SOLiDTM System(AppliedBiosystems)进行测序。在一些实施方案中，定量扩增产物包括实时或终点定量PCR或两者。在一些实施方案中，定量扩增产物包括产生待检测的RNA分子的表达特征谱，例如mRNA表达特征谱和miRNA表达特征谱。在某些实施方案中，定量扩增产物包括一个或多个5′-核酸酶测定，例如但不限于， Gene Expression Assays和 miRNA Assays，其可包括微流体装置，包括但不限于，低密度阵列。本领域内已知的任何合适的表达特征谱分析技术可用于公开的方法的不同实施方案中。
本领域技术人员将理解，使用的测序方法通常不是对本方法的限定。相反地，提供相应的扩增产物或待检测的RNA的至少一部分的或来源于扩增产物的载体插入物的至少一部分的至少一些连续核苷酸的顺序的任何测序技术通常可用于本方法。测序技术的描述可见于，特别地，McPherson，特别地第5章中；Sambrook和Russell；Ausubel等人；Siuzdak，TheExpanding Role of Mass Spectrometry inBiotechnology，MCC Press，2003，特别地第7章；和Rapley。在一 些实施方案中，在测序步骤之前通过酶促降解，包括但不限于外切核酸酶I和虾碱性磷酸酶降解例如但不限于 试剂(USBCorporation)来除去未整合的引物和/或dNTP。在一些实施方案中，通过凝胶或柱纯化、沉降、过滤、珠粒、磁性分离或基于杂交的拉出(适当时)来除去未整合的引物、dNTP和/或ddNTP(参见，例如，ABIDuplexTM 384 Well F/R Sequence Capture Kit，AppliedBiosystems P/N4308082)。
本领域技术人员将理解，在某些实施方案中，使用的测序/再测序(resequencing)技术的阅读长度可以是可被有效检测的RNA分子的大小的因子(参见，例如，Kling，Nat.Biotech.21(12)：1425-27)。在一些实施方案中，用第一标识序列(在本文中有时称为“条形码”)或其他标记物标记从来自第一样品的RNA分子产生的扩增产物，用第二标识序列或第二标记物标记从来自第二样品的RNA分子产生的扩增产物，并且在确定相应的样品中相应的RNA分子的序列之前将包含第一标识序列的扩增产物和包含第二标识序列的扩增产物混合。在某些实施方案中，组合3个或更多个不同的RNA文库，各文库包含特异于该文库的标识序列。在一些实施方案中，第一衔接子、第二衔接子、正向引物、反向引物或其组合包含标识序列或标识序列的互补序列。在某些实施方案中，标识序列包含：(i)5′-AAGCCC、(ii)5′-CACACC、(iii)5′-CCCCTT、(iv)5′-CATCGG、(v)5-TCGTTG、(vi)5′-GGGCAC、(vii)5′-CCAGAC、(viii)5′-CTCCGT、(ix)5′-CCCTTC、(x)5′-GCGGTC中的一个或此类序列(i)-(x)的任一个的互补序列。在一些实施方案中，反向引物包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：15至SEQID NO：23的序列(如实施例11中描述的)。
文库：本教导提供了用于检测RNA分子的组合物、方法和试剂盒。根据某些实施方案，产生包含许多不同的扩增产物类别的文库，其中扩增产物的至少一个类别相应于存在于样品中的小RNA的一个类别。
根据本教导的某些举例说明性实施方案，例如，将包含许多小RNA类别、许多mRNA类别或两者的样品与许多不同的第一衔接子类别、许 多不同的第二衔接子类别和包含双链特异性RNA连接酶活性的多肽组合以形成连接反应组合物。在一些实施方案中，将mRNA片段化、除尽不期望的核酸类别(例如但不限于rRNA、高拷贝数mRNA或基因组DNA)，或进行除尽和片段化。将连接反应组合物在适合于至少一些衔接子类别与相应的RNA分子杂交的条件下进行温育。应理解，除非明确地声明，否则(i)将衔接子类别与包含RNA的样品组合，(ii)温育以允许衔接子与相应的RNA分子退火，然后(iii)向反应组合物中加入连接酶的过程在形成连接反应组合物和温育的期望的范围内。
许多不同的衔接子类别通常包含成组的RNA/DNA寡核苷酸，所述RNA/DNA寡核苷酸在一个末端具有单链简并序列，且在某些实施方案中在另一末端上或其附近具有确定的序列，所述确定的序列可用作扩增引物或报告探针的结合位点、用于样品鉴定(例如但不限于将从不同起始材料产生的文库混合和随后鉴定扩增文库的来源)，和/或随后产生的扩增产物的测序。在某些实施方案中，将样品与衔接子混合物A杂交将产生适合用于SOLiDTM测序(从扩增产物内的相应于RNA分子的序列的5′末端开始)的扩增产物。相反地，使用衔接子混合物B的杂交产生适合用于从3′末端开始的SOLiDTM测序的扩增产物。然后将包含双链特异性RNA连接酶活性的多肽加入混合物中以将杂交的衔接子连接至小RNA分子。
将连接反应组合物与包含依赖于RNA的DNA聚合酶活性的DNA聚合酶混合，且反转录连接产物以产生cDNA。将该反转录产物与RNA酶H组合以从RNA/cDNA双链体中降解至少一些小RNA或片段化的mRNA，从而产生扩增模板。本领域技术人员将理解，在核糖核酸酶降解过程中也降低了未连接的衔接子和衔接子副产物的浓度。在这点上，反应物包含样品中的RNA分子的cDNA拷贝。为了满足某些测序技术的扩增产物输入要求，和在一些实施方案中为了将标识序列附至扩增产物，可使用合适的引物组(其中至少一种正向引物，至少一种反向引物或两者可包含一个或多个标识序列)和一定数目的PCR扩增循环(其中当针对循环次数(大约12至15或大约12至18个PCR循环)作图时， 检测在线性范围内)扩增反转录产物。本领域技术人员将理解，限定循环次数使假PCR产物的合成降至最低和保持样品的RNA特征谱的完整性。在某些实施方案中，至少一种正向引物、至少一种反向引物或至少一种正向和至少一种反向引物包含一个或多个标识序列。某些实施方案包括使用10组PCR引物，其中，除了3′(反向)引物上的特异于该反向引物类别的6bp“条形码”标识序列外，所述引物具有相同的核苷酸序列。
在某些实施方案中，将扩增反应产物经历大小选择，例如但不限于，凝胶电泳，以浓缩期望的大小范围内的扩增产物和除去PCR副产物。经适当地大小选择的扩增产物可以以乳液PCR(ePCR)步骤用于SOLiDTM Sequencing System(Applied Biosystems)工作流，其中将扩增产物附着至珠粒，使用ePCR进行进一步扩增，最终进行测序，这使得能够确定不同RNA分子在样品中的存在、不存在和/或数量。
本领域技术人员将理解，在某些情况下，扩增产物和/或连接产物可用作相应RNA分子的替代物，和理解，通过检测扩增产物、连接产物或两者可间接检测RNA分子，和理解，此类检测在本教导的范围内。
试剂盒：还公开了用于进行某些本方法的试剂盒。某些试剂盒实施方案包括第一衔接子、第二衔接子、包含双链特异性RNA连接酶活性的多肽、逆转录酶、核糖核酸酶H(RNA酶H)、DNA聚合酶、引物或其组合。在一些实施方案中，试剂盒还包括用于从RNA除去5’磷酸的试剂，例如但不限于烟草酸焦磷酸酶。
本教导还提供了经设计促进进行某些公开的方法的试剂盒。试剂盒可通过装配进行方法所需的两个或更多个组分来用于促进某些公开的方法的进行。在某些实施方案中，试剂盒以预先测量的单位量包含组分以使终端用户对测量的需要减少至最低。在一些实施方案中，试剂盒包括用于进行一个或多个公开的方法的说明书。在一些实施方案中，最优化试剂盒组分以便以彼此结合的方式进行操作。
在某些实施方案中，试剂盒包括至少一种第一衔接子类别、至少一种第二衔接子类别、包含双链特异性RNA连接酶活性的多肽、DNA聚合酶，包括但不限于，RNA指导的DNA聚合酶、DNA指导的DNA聚合酶或包括RNA指导的和DNA指导的DNA聚合酶活性的DNA聚合酶、核糖核酸酶H或其组合。在某些实施方案中，连接酶包括噬菌体T4RNA连接酶2(Rnl2)或来自Rnl2家族的连接酶。在一些实施方案中，第一衔接子、第二衔接子或第一衔接子和第二衔接子两者包含含有简并序列的单链部分。
在某些实施方案中，试剂盒包含多种第一衔接子类别，其中每一个第一衔接子类别包含不同的简并序列，多种第二衔接子类别，其中每一个第二衔接子类别包含不同的简并序列，Rnl2家族的连接酶，RNA指导的DNA聚合酶，多种不同的第一引物类别，DNA指导的DNA聚合酶和RNA酶H(EC 3.1.26.4)。在一些实施方案中，试剂盒还包含烟草酸焦磷酸酶。
在某些实施方案中，试剂盒包含多种第一衔接子类别，其中至少一些第一衔接子类别包含简并序列，多种第二衔接子类别，其中至少一些第二衔接子类别包含简并序列，包含双链特异性RNA连接酶活性的多肽，DNA聚合酶，至少一种引物类别和核糖核酸酶。在一些实施方案中，试剂盒的DNA聚合酶包括依赖于RNA的DNA聚合酶和依赖于DNA的DNA聚合酶。此外，试剂盒包含烟草酸焦磷酸酶。
在某些实施方案中，试剂盒还包括正向扩增引物和反向扩增引物。在一些实施方案中，正向引物、反向引物或正向和反向引物包括通用引发序列或通用引发序列的互补序列。在一些实施方案中，试剂盒包括还包含报告基团的正向引物、反向引物或正向引物和反向引物。在一些此类实施方案中，引物对的正向引物的报告基团与引物对的反向引物的报告基团不同。在一些实施方案中，试剂盒还包含：报告探针、核酸染料、报告基团或其组合中的至少一个。在一些实施方案中，试剂盒还包括对照序列，例如但不限于内部标准序列例如持家基因或包含分子大小或分子量标准的多核苷酸梯。
在某些试剂盒实施方案中，第一衔接子、第二衔接子、正向引物、反向引物或其组合包含标识序列或标识序列的互补序列。在某些实施 方案中，标识序列包括：(i)5'-AAGCCC、(ii)5'-CACACC、(iii)5'-CCCCTT、(iv)5'-CATCGG、(v)5-TCGTTG、(vi)5'-GGGCAC、(vii)5'-CCAGAC、(viii)5'-CTCCGT、(ix)5'-CCCTTC、(x)5'-GCGGTC中的一个或此类序列(i)-(x)的任一个的互补序列。在一些实施方案中，反向引物包含SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:15至SEQ ID NO:23中的一个的序列。在一些试剂盒实施方案中，提供了正向引物和反向引物的混合物。在一些实施方案中，试剂盒提供了多种引物混合物，例如但不限于下列中的至少两种：(i)包含第一正向引物和第一反向引物的引物混合物，其中第一反向引物包含第一标识序列；(ii)包含第一正向引物和第二反向引物的引物混合物，其中第二反向引物包含第二标识序列；(iii)包含第一正向引物和第三反向引物的引物混合物，其中第三反向引物包含第三标识序列；(iv)包含第一正向引物和第四反向引物的引物混合物，其中第四反向引物包含第四标识序列；(v)包含第一正向引物和第五反向引物的引物混合物，其中第五反向引物包含第五标识序列；(vi)包含第一正向引物和第六反向引物的引物混合物，其中第六反向引物包含第六标识序列；(vii)包含第一正向引物和第七反向引物的引物混合物，其中第七反向引物包含第七标识序列；(viii)包含第一正向引物和第八反向引物的引物混合物，其中第八反向引物包含第八标识序列；(ix)包含第一正向引物和第九反向引物的引物混合物，其中第九反向引物包含第九标识序列；和(x)包含第一正向引物和第十反向引物的引物混合物，其中第十反向引物包含第十标识序列。
一些试剂盒实施方案包括至少一种衔接子混合物，其中每一种衔接子混合物包含第一衔接子和第二衔接子；至少一种包含双链特异性RNA连接酶活性的多肽；逆转录酶(RNA指导的DNA聚合酶)；DNA聚合酶(DNA指导的DNA聚合酶)；核糖核酸酶；脱氧核糖核苷三磷酸的混合物(dNTP)；和至少一种扩增引物混合物，其中各扩增引物混合物包含正向引物和反向引物。在一些实施方案中，RNA指导的DNA聚合酶和DNA指导的DNA聚合酶包含在某些反应条件下具有DNA指导的DNA聚合酶活性的RNA指导的DNA聚合酶或在某些条件下具有RNA指导的 DNA聚合酶活性的DNA指导的DNA聚合酶，例如但不限于来自生氢氧化碳嗜热菌的TthDNA聚合酶和DNA聚合酶I。在一些试剂盒实施方案中，依赖于DNA的DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶，包括其酶促活性突变体和变体，例如但不限于， DNA聚合酶和AmpliTaq DNA聚合酶(Applied Biosystems)。在一些实施方案中，核糖核酸酶包括核糖核酸酶H(RNA酶H)。一些试剂盒实施方案包括至少一种对照RNA分子，例如但不限于至少一种阳性对照RNA分子、至少一种阴性对照RNA分子或两者。
固体支持物：在某些实施方案中，公开的方法和试剂盒包含固体支持物。在一些实施方案中，固体支持物用于分离和/或检测步骤，例如但不限于用于纯化和/或分析扩增产物。固体支持物的非限定性实例包括琼脂糖、sepharose、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、玻璃、膜、二氧化硅、半导体材料、硅、有机聚合物；任选地可鉴定的微柱体；包括变换器的生物传感器；适当处理或包被的反应容器和表面，例如但不限于微型离心或反应管、多孔微量板的孔，和玻璃、石英或塑料载玻片和/或盖玻片；以及珠粒，例如但不限于磁珠、顺磁珠粒、聚合物珠粒、金属珠粒、染料浸透的或标记的珠粒、包被的珠粒、玻璃珠粒、微球体和纳米球。本领域技术人员将理解，许多固体支持物可用于公开的方法和试剂盒以及理解，固体支持物的形状和组成通常不是限定性的。
上文已描述的本教导可通过参考实施例来更好地理解。下列实施例意欲只用于举例说明目的，并且不应当解释为以任何方式限定本文的教导的范围。
实施例1
使用双链特异性RNA连接酶Rnl2产生扩增产物
将3个RNA样品中的每一个样品：
来自人胎盘的总RNA(100μg，Ambion P/N AM7950)，
合成的miRNA分子(mirVanaTM miRNA Reference Panelv.9.1，100fmol，Ambion P/N 4388891，合成的RNA寡核苷酸的等 摩尔混合物，所述寡核苷酸代表miRBase SequenceDatabase版本9.1中大多数人、小鼠和大鼠的miRNA序列)，和
来自5μg总RNA的经flashPAGETM Fractionation System纯化的总RNA(人胎盘)，
与3μL杂交溶液(300mM NaCl，20mM Tris-HCl pH 8.0，2mMEDTA)和2μL衔接子寡核苷酸混合物混合，所述衔接子寡核苷酸混合物包含如下寡核苷酸：
3.1μM(5′-上，即，第一寡核苷酸)
5′-CCUCUCUAUGGGCAGUCGGUGAU-3′，SEQ ID NO：1；
6.1 μM(5′-下，即，第二寡核苷酸)
5′-NNNNNNATCACCGACTGCCCATAGAGAGG-3′，SEQ ID NO：2；
3.1 μM(3′-上，即，第三寡核苷酸)
5′-PO4-CGCCTTGGCCGTACAGCAG-3′，SEQ ID NO：3；和
6.1 μM(3′-下，即，第四寡核苷酸)
5′-CTGCTGTACGGCCAAGGCGNNNNNN-3′；SEQ ID NO：4)
其中“N”代表以25∶25∶25∶25的比例混合的简并碱基(A、C、G或T)。
将冻干的寡核苷酸在不含核酸酶的水(Ambion P/N AM9937)中重悬浮至100μM的原液浓度，然后相应地进行稀释。将RNA混合物在65℃下加热10分钟，然后在16℃下进行5分钟以将衔接子与样品中的小RNA杂交。
然后将杂交的RNA/衔接子与10μL连接缓冲液(100mM Tris-HClpH 7.5，20mMMgCl2，20mM二硫苏糖醇，2mM ATP和40％(w/v)PEG-8000)混合，并在总共20μL中使用20个单位的T4 RNA连接酶2(NEB，Ipswich，MA)在16℃下进行连接，进行16小时。此外，使用不含核酸酶的水(代替连接酶)来制备总RNA样品的不加连接酶的对照。
通过在40μL的总体积中用200个单位的ArrayScriptTM逆转录酶(Ambion P/NAM2048)、4μL 10X RT缓冲液(提供有ArrayScriptTM酶)和2μL 2.5mM dNTP混合物(AmbionP/N AM8228G)在42℃下温育 30分钟来反转录连接产物。使用不含核酸酶的水(代替逆转录酶)来制备总RNA样品的阴性RT对照。
通过将10μL的样品等分与10个单位的RNA酶H(Ambion P/NAM2292)在37℃下温育30分钟来除去过量的RNA副产物，并利用PCR扩增RNA酶处理的cDNA。50μL PCR反应物包含下列物质：
38.5μL不含核酸酶的水(Ambion P/N AM9937)，
5μL 10X PCR缓冲液I(Applied Biosystems P/NN8080246)，
4μL 2.5mM dNTP混合物(Ambion P/N AM8228G)，
0.5μL 50μM正向PCR引物：
(5′-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3′)(SEQ ID NO：5)，
0.5μL 50μM反向PCR引物：
(5′-CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTCCAGACCTGCTGTACGGCCAAGGCG-3′)(SEQ ID NO：6)，
1μL DNA聚合酶(Applied Biosystems P/NN8080246)，和
0.5μL cDNA样品。
PCR条件如下：在95℃下进行5分钟以进行初始变性，然后进行15个循环：在95℃下30秒(变性)，在62℃下30秒(退火)和在72℃下30秒(延伸)。然后在72℃下进行7分钟以进行最终的延伸。
将10μL各样品以1∶1与凝胶上样缓冲液II(Ambion P/N AM8547)混合，然后将整个体积装载至1.0mm6％聚丙烯酰胺凝胶上，在1X tris-硼酸盐EDTA电泳缓冲液(Ambion P/NAM9863)中于180伏恒定电压下电泳大约45分钟。从盒中取出凝胶，然后在1X TBE中的1XGold核酸凝胶染料(Invitrogen P/N S11494)中染色5分钟。使用AlphaInnotechFluorChem SP成像仪对凝胶成像，然后使用 FC软件版本6.0.0处理图像。
如图5中观察到的，扩增的连接产物(扩增产物)由括号A显示； 箭头B标示在扩增反应中扩增的不期望的反应副产物；括号C标示扩增反应组合物中的残留的未连接的衔接子和引物。
应注意，正向PCR引物序列包含SEQ ID NO：1，第一寡核苷酸的序列(用T置换U)(其始于正向引物的核苷酸19)。还应注意，反向引物序列包含SEQ ID NO：4，第四寡核苷酸的序列(用T置换U)(其始于反向引物的核苷酸30)。因此，通过使用该结构，检测的小RNA将具有等于图5中观察到的凝胶片段大小的长度，例如，短于引物的长度的总和。
实施例2
使用各种双链特异性连接酶产生扩增产物
将来自人胎盘的总RNA(500ng，Ambion P/N AM7950)与3μL杂交溶液和2μL衔接子寡核苷酸混合物混合，并且如实施例1中所述进行杂交。然后将杂交的RNA/衔接子与10μL连接缓冲液(100mMTris-HCl pH 7.5，20mM MgCl2，20mM二硫苏糖醇，2mM ATP，和40％(w/v)PEG-8000)混合，在总共20μL中用10个单位的噬菌体T4RNA连接酶2、噬菌体T4 RNA连接酶1(Ambion P/N AM2140)、噬菌体T4DNA连接酶(Ambion P/N AM2134)或1∶1的T4 RNA连接酶I与T4 DNA连接酶的混合物在16℃下进行连接，进行16小时。此外，使用不含核酸酶的水(代替连接酶)来制备不加连接酶的对照。
如实施例1中所述，反转录连接产物，用RNA酶H进行处理并且进行扩增。将10μL的各样品与凝胶上样缓冲液II(Ambion P/N AM8547)以1∶1混合，将整个体积装载至1.0mm6％聚丙烯酰胺凝胶(InvitrogenP/N EC6265BOX)上，并在1X tris-硼酸盐EDTA电泳缓冲液(Ambion P/NAM9863)中于180伏恒定电压下电泳大约45分钟。从盒中取出凝胶，然后在1XTBE中的1X Gold核酸凝胶染料(Invitrogen P/NS11494)中染色5分钟。使用AlphaInnotech FluorChem SP成像仪对凝胶成像，使用 FC软件版本6.0.0处理图像。将条带与10bp DNA梯(100ng；Invitrogen P/N 10821-015)相比较。
如图6中所观察到的，扩增的连接产物(扩增产物)由括号A显示；箭头B标示扩增的不期望的反应副产物；括号C标示扩增反应组合物中残留的未连接的衔接子和引物。令人惊讶地，当比较使用连接酶Rnl2(泳道2)、连接酶Rnl1(泳道4)、连接酶Dnl(泳道6)或Rnl1和Dnl的组合(泳道8)产生的扩增产物时，观察到不同的扩增产物特征谱。当使用Rnl2连接酶时，而非当单独地或组合地使用Rnl1或Dnl时，观察到在110个碱基对(bp)至130bp大小范围内的扩增产物(箭头A)，所述扩增产物在该举例说明性实施方案中在预期的扩增的miRNA的大小范围内。此外，大约100bp的扩增产物的主条带(图6中略微迁移至B上方)出现在相应于Rnl1、Dnl或两者的所有泳道(在使用和不使用逆转录酶的情况下)中，但当使用Rnl2时，未观察到该条带。与在平行反应中单独地或组合地使用两个不同的连接酶产生的扩增产物相比较，使用Rnl2产生的扩增产物的该差异是令人惊讶的和出乎意料的。
实施例3
用于测序的带条形码的扩增产物的产生
在进行总RNA分离方法后，按照厂商的说明手册，使用mirVanaTMmiRNA IsolationKit(AM1560，Ambion)从HeLa细胞获得小RNA。
如下制备连接反应组合物。在0.2mL不含RNA酶的薄壁PCR管(对于各反应，其含有2μL衔接子混合物(第一衔接子和第二衔接子)、3μL 2X杂交溶液(300mM NaCl，20mM Tris，2mM EDTA，终pH 8.0)、1-3μL 来自mirVanaTM miRNA Isolation Kit的RNA分子溶液(含有1000纳克(ng)RNA)或1000ng阳性对照( Total RNA：人胎盘；AM7950，Ambion)和0-2μL不含核酸酶的(NF)水(调整NF水体积以产生8μL/反应的总体积))中制备杂交混合物。将装有杂交混合物的管轻轻混合，然后置于热循环仪(其经编程在65℃下进行10分钟，然后在16℃下进行5分钟)中。将管保持在16℃，通过按顺序组合8μL的经热循环的杂交混合物、10μL 2X连接缓冲液(100mM Tris，20mM MgCl2，20mM DTT，2mM ATP，40％PEG8000，pH 7.0)和2μL连接酶混合物(10U/μL噬菌体T4RNA连接酶2(Rnl2)、2U/μLRNA酶抑制剂蛋白)来制备连接反应组合物，对于各反应，终体积为20μL。通过上下吹打来混合管，然后在热循环仪上于16℃下温育16小时。通常，2小时的温育足以使第一衔接子和第二衔接子与RNA分子退火且使连接发生，从而产生连接产物(参见，例如，图3中的34)。
将装有连接产物的管置于冰上，然后如下制备反转录主混合物(RTMM)。对于各管连接产物，组合13μL NF水、4μL 10X RT缓冲液(500mM Tris-HCl pH 8.3，750mM KCl，30mMMgCl2，50mM DTT，终pH 8.25)、2μL 2.5mM dNTP混合物和1μL RT酶混合物(200U/μLArrayScriptTM逆转录酶(RNA指导的DNA聚合酶)以形成RTMM。向各连接产物的管中加入20μL RTMM，通过上下吹打3至5次进行混合，然后在42℃下温育30分钟以产生反转录产物(参见，例如，图3中的36)。在该温育后，将含有反转录产物的溶液的10μL等分转移至新的0.2mL管中，向所述管中加入1μL RNA酶H(10U/μL大肠杆菌(E.coli)RNA酶H)。将管轻轻混合，然后在37℃下温育30分钟，在该时间内降解反转录产物，并形成扩增模板(参见，例如，图3中的38)。制备包含38.5μL NF水、5μL PCR缓冲液I、1μLPCR引物混合物(25μM正向引物，25μM反向带条形码的引物)、4μL 2.5mM dNTP混合物和1μL DNA聚合酶(5U/μL；DNA指导的DNA聚合酶)的PCR主混合物-每个待进行的扩增反应总共49.5μL。该示例性PCR引物混合物包含一种正向引物和带条形码的反向引物。
为了确定用于包含扩增产物的给定溶液的PCR循环的合适次数，推荐小规模(即，50μL)PCR反应。通过在不含RNA酶的0.2mL薄壁PCR管中将49.5μL该PCR主混合物与0.5μL含有扩增模板的溶液组合来制备小规模扩增反应组合物。将扩增反应组合物置于具有加热的盖的热循环仪中，在95℃下加热5分钟，然后使用：在95℃下30秒-在62℃下30秒-在72℃下30秒的条件进行12至15个循环；然后在72℃下进行终延伸步骤7分钟。扩增循环的最佳次数取决于初始扩增 反应组合物中扩增产物的量。使用6％非变性tris-硼酸盐EDTA(TBE)丙烯酰胺凝胶通过电泳分析含有扩增产物的扩增反应组合物的5-10μL等分以确定扩增循环的最佳次数。在进行这样的确定后，进行大规模扩增。
为了产生足够量的扩增产物用于测序和/或其他下游过程，通过PCR进行大规模扩增反应。对于每一个待进行的反应，通过组合77μLNF水(Ambion AM9922)、10X PCR缓冲液I(或10X PCR缓冲液I、Applied Biosystems P/N N8080160)、2μL带条形码的PCR引物(选择的正向引物和带条形码的反向引物的混合物)、8μL dNTP混合物和2μLDNA指导的DNA聚合酶(Applied BiosystemsP/N N8080160)来制备主混合物。在不含RNA酶的PCR板的3个分开的孔中(即，以一式三份重复)组合该主混合物的99μL的等分和1μL包含扩增模板的溶液以形成扩增反应组合物。将PCR板加热至95℃并进行5分钟以使核酸变性，按照之前的温度条件(在95℃下30秒-在62℃下30秒-在72℃下30秒)进行循环，进行之前确定的循环次数，最后将PCR反应器在72℃下保持7分钟以在扩增反应组合物中产生扩增产物。将扩增产物混合，然后如之前一样通过在6％非变性TBE丙烯酰胺凝胶上电泳5-10μL的混合的扩增反应组合物来进行分析。
将二百五十(250)μL混合的扩增产物与250μL苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1，pH7.9)在不含RNA酶的1.5mL聚丙烯微量离心管中组合，通过涡漩混合。使用台式离心机在室温下以12,000rpm离心管5分钟。测量水相，然后将其转移至新的不含RNA酶的1.5ml聚丙烯微量离心管中，向管中加入等体积的7.5M乙酸铵和1/100体积的糖原(或GlycoBlueTM Co-precipitant(Ambion)和0.7体积的异丙醇。将管中的内容物充分混合，在室温下温育5分钟，然后以12,000rpm在室温下离心20分钟。取出并且弃去所得的上清液，用1mL的70％(v/v)乙醇清洗沉淀3次。将沉淀风干，然后重悬浮于18μL不含核酸酶的水(向其加入2μL 10X非变性凝胶上样染料)中。向非变性TBE PAGE凝胶(所述凝胶在另外的孔之一中包含10碱基对(bp)分子 量梯(Invitrogen 10821-015)作为标记)的两个孔的每一个中加入10μL该悬浮液。在大约140V下在凝胶中对扩增产物进行电泳直至染料前沿即将流出凝胶的底部边缘(对于1.0mm、8cmx8cm的凝胶，大约30分钟)。按照厂商的说明书使用 Gold(Invitrogen，Carlsbad，CA)对凝胶中的核酸条带进行染色，然后使用紫外光源进行显现。使用干净的刀片，在含有扩增产物的泳道中切取凝胶薄片以获得大约100至150bp的大小范围内的核酸。100bp处的明显的条带可能代表不期望的副产物，且不包括在从凝胶切取的薄片内。同样，当使用某些测序方法，例如但不限于使用SOLiDTMSystem(AppliedBiosystems)的乳液PCR测序法时，也避免大于大约200bp的核酸。
使用21号针在不含RNA酶的0.5mL聚丙烯微量离心管的底部打孔，将切取的凝胶块转移至该管中。然后将该0.5mL管置于不含RNA酶的1.5mL聚丙烯微量离心管内，并以12,000rpm离心3分钟以破碎凝胶。取出并弃去0.5mL管，将装有凝胶片段的外层1.5mL管置于冰上。向管中加入二百(200)μLPAGE洗脱缓冲液(1.5M乙酸铵，于1X TE缓冲液pH 7.0中)，然后将管在室温下温育20分钟。在该第一次温育后，取出上清液并且转移至干净的不含RNA酶的1.5mL聚丙烯微量离心管中，向第一管(装有凝胶片段)中加入另外250μl PAGE洗脱缓冲液，在37℃下温育另外40分钟。在第二次温育后，收集第二上清液，将其加至第一上清液中。按照厂商的说明书，使用离心柱(Ambion Cat#10065)并且离心以从混合的上清液中除去残留的凝胶碎片。
将所得的液体与等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1，pH 7.9)在不含RNA酶的1.5mL聚丙烯微量离心管中组合，通过涡旋混合。使用台式离心机在室温下以12,000rpm将管离心5分钟。测量水相，并将其转移至新的不含RNA酶的1.5ml聚丙烯微量离心管，向管中加入等体积的7.5M乙酸铵以及1/100体积的糖原(AM9510，Ambion；或GlycoBlueTM Co-precipitant AM9515，Ambion)和0.7体积的异丙醇。将管中的内容物充分混合，在室温下温育5分钟，然后以12,000rpm 在室温下离心20分钟。取出并弃去所得的上清液，用1mL的70％(v/v)乙醇清洗沉淀3次。将沉淀风干，然后重悬浮于20μL NF水中。通过用分光光度计测定A260或如上文中所描述的，通过在6％非变性PAGE凝胶上分析来定量含有扩增产物的DNA。
为了确定扩增产物的序列，按照用户指南(Applied Biosystems，P/N4391578；“用户指南”)，在Applied Biosystems SOLiDTM System上进行乳液PCR(ePCR)。为了评估在SOLiDTM System上在全规模(fullscale)ePCR中提供最佳测序结果的扩增产物的浓度，在0.2pg/μL、0.4pg/μL、0.6pg/μL和0.8pg/μL的扩增产物浓度上进行4个分开的ePCR反应，然后按照厂商说明书(具体参见，用户指南，第3和4章)进行滴定/QC试验。当确定最佳扩增产物浓度时，进行“全规模”ePCR反应(参见用户指南的第3章，第3.1节)。通过确定扩增产物的至少部分的序列，可直接或通过生物信息学方法鉴定扩增产物所源自的RNA分子，从而检测该RNA分子。本领域技术人员将理解，这样的序列信息可用于鉴定新型RNA分子，包括但不限于，小RNA的发现；可用于确定起始样品中一种检测的RNA分子类别的量(相对于另一种检测的RNA类别的量)，并且这样的信息可用于，特别地，mRNA、miRNA或其他目的RNA分子的表达特征谱分析。
实施例4
衔接子悬突长度的评估
合成和评估具有不同悬突长度的第一和第二衔接子以使连接效率最大化同时使衔接子复杂性降至最低。
示例性第一衔接子包含在图7B中描述为“T3”的第一寡核苷酸和在图7B中描述为“27N”的第二寡核苷酸，其中第一寡核苷酸包含来自噬菌体T3的DNA序列且在3’末端包含2个核糖核苷酸，其中第二寡核苷酸包含来自噬菌体T3的互补脱氧核糖核苷酸序列且在5’末端包含4、6或8个简并脱氧核糖核苷酸“N”的悬突。示例性第一衔接子的上链(第一寡核苷酸)包含来自噬菌体T3启动子的27个核苷酸 的序列5′-CUCGAGAAUUAACCCUCACUAAAGGGA-3′(SEQ ID NO：7)，在图7B中显示为“T3”。下链(第二寡核苷酸)包含在下链5′-(N)4，6， 8TCCCTTTAGTGAGGGTTAATTCTCGAG-3′(SEQ ID NO：8(其中N＝8)；缺乏2或4个5′-N′的SEQ IDNO：8(即，其中N为6或4))的5′末端上具有4、6或8个简并核苷酸(在图7B中为了说明目的描述为“N”)的上链的互补序列，在图7B中为了说明目的描述为“27N”。
示例性第二衔接子包含在图7B中描述为“T7”的第三寡核苷酸和在图7B中描述为“N 28”的第四寡核苷酸，其中第三寡核苷酸包含来自噬菌体T7的DNA序列，其中第四寡核苷酸包含来自噬菌体T7的互补脱氧核糖核苷酸序列且在其3’末端具有4、6或8个简并脱氧核糖核苷酸“N”的悬突。示例性第二衔接子的上链(第三寡核苷酸)包含在图7B中显示为“T7”的来自噬菌体T7启动子的28个核苷酸的序列5′-PO4-TCCCTATAGTGAGTCGTATTACGAATTC-3′(SEQ ID NO：9)，其包含5’磷酸基团(显示为PO4)。下链(第四寡核苷酸)包含在下链5′-GAATTCGTAATACGACTCACTATAGGGA(N)4，6，8-3′(SEQ ID NO：10(其中N＝8)；缺乏2或4个3′-N′的SEQ ID NO：10(即，其中N为6或4))的3′末端上具有4、6或8个简并核苷酸(在图7B中为了说明目的描述为“N”)的上链的互补序列，在图7B中为了说明目的描述为“N 28”。
将2μL水中的50皮摩尔(pmol)“T3”第一衔接子(参见图7B)、“T7”第二衔接子(参见图7B)或T3第一衔接子和T7第二衔接子(两者具有相同数目的简并核苷酸)与3μL 2X杂交缓冲液(300mM NaCl，20mM Tris pH8，2mM EDTA)一起在95℃下温育3分钟，然后冷却至22℃。当温度达到22℃时，向各反应管中加入1μL 0.13μM 5′32P-标记的合成的微RNA库(mirVanaTM miRNA Reference Panel 9.0，大约500种等摩尔浓度的来自Sanger miRBase9.0数据库(microrna.sanger.ac.uk/sequences/)的合成的miRNA序列的库)，将管在65℃下温育10分钟，然后冷却至22℃。
然后在16℃下温育反应混合物30分钟，然后向各管中加入14μL连接酶混合物(0.5μL RNA连接酶2(10μM)，2μL 10X Rnl2缓冲液 (100mM Tris pH7，20mM MgCl2，20mM二硫苏糖醇，20mM ATP)，1μLRNA酶抑制剂(Ambion AM2682，40U/μL)，10μL 40％PEG 8000(Sigma-Aldrich 202452)和0.5μL不含RNA酶的水)。将反应混合物在16℃下温育另外16小时。然后向各反应中加入20μL的凝胶上样缓冲液II(Ambion AM8546G)，在95℃下加热5分钟。通过10％变性PAGE分辨32P-标记的产物，并通过放射自显影进行显现。缺乏(i)RNA连接酶2和衔接子两者或(ii)只缺乏衔接子的对照反应示于图7A的前2个泳道中。在相应于包含第一衔接子和第二衔接子的连接反应混合物(即，T3-4+T7-4；T3-6+T7-6；和T3-8+T7-8)的凝胶泳道中观察到大量的双连接产物(连接产物)，如图7A中显示的。因此，4、6和8个核苷酸的衔接子悬突长度提供了小RNA的检测。
实施例5
衔接子结构
检测具有6-核苷酸简并悬突的5’(第一)和3’(第二)衔接子的不同结构，所述结构包括ds DNA(除了5’(第一)衔接子的上链(第一寡核苷酸)上的2个3’末端RNA碱基(例如，图8B中的T3r2:27 6N和T7:6N 28(数字27和28分别指第一和第三寡核苷酸的长度，如实施例4中一样))和两个衔接子(例如，图8B中的rT3:27 6N和rT7:6N 28)的dsRNA·DNA杂交体(上链(第一和第三寡核苷酸是RNA)-下链(第二和第四寡核苷酸是DNA))。
在图8B的该举例说明性实施方案中，上部第一衔接子(rT3:27 6N)包含显示为“rT3”的含有T3序列的上链(第一寡核苷酸)(SEQ ID NO：7)(其中所有核苷包含核糖核苷)，所述上链与下链(第二寡核苷酸)退火，所述下链包含互补序列且在下链的5’末端上包含6个简并核苷酸(SEQ ID NO：8，其中N是6)，为了说明目的描述为“27 6N”；以及其他举例说明性第一衔接子(T3r2:27 6N)包含显示为“T3r2”的含有T3序列的上链(其中除了2个最3’端的包含核糖的核糖核苷外，所有核苷包含脱氧核糖核苷)(具有2个3’末端核糖核苷酸的SEQID NO：7)，所述上链与描述为27 6N的与上部第一衔接子相同的下链(SEQID NO：8，其中N是6)退火。
再次参考图8B，上部举例说明性第二衔接子(rT7:6N 28)包含为了说明目的描述为“rT7”的含有T7序列的上链(第三寡核苷酸)(SEQ IDNO：9)(其中所有核苷包含核糖核苷，并且该序列包含5’磷酸基团)，所述上链与下链退火，所述下链包含为了说明目的描述为“6N 28”的在下链的5’末端上具有6个简并核苷酸的互补序列(SEQ ID NO：10，其中N是6)。其他举例说明性第二衔接子(T7:6N 28)包含为了说明目的描述为“T7”的含有T7序列的上链(SEQ ID NO：9)(其中所有核苷包含脱氧核糖核苷并且该序列包含5’磷酸基团)，所述上链与描述为6N 28的与上部第二衔接子相同的下链(SEQ ID NO：10，其中N是6)退火。
将2μL水中的50pmol的第一衔接子、第二衔接子或第一衔接子和第二衔接子两者与3μL 2X杂交缓冲液(300mM NaCl，20mM TrispH8，2mM EDTA)一起在95℃下温育3分钟，然后冷却至22℃。向各反应中加入一(1)μL的0.13μM5′32P-标记的miRNA库(如上所述的mirVanaTM miRNA Reference Panel)，然后在65℃下温育10分钟，然后冷却至22℃。
将反应混合物在16℃下温育30分钟，然后向各管中加入14μL连接酶混合物(0.5μLRNA连接酶2(10μM)，2μL 10X Rnl2缓冲液(100mM Tris pH7，20mM MgCl2，20mM二硫苏糖醇，20mM ATP)、1μLRNA酶抑制剂(Ambion AM2682，40U/μL)、10μL 40％PEG 8000(Sigma-Aldrich 202452)和0.5μL不含RNA酶的水)。将反应混合物在16℃下温育另外16小时。然后向各反应中加入凝胶上样缓冲液II(20μL，Ambion AM8546G)，在95℃下加热5分钟。通过10％变性PAGE分辨32P-标记的产物，然后通过放射自显影进行显现。如图8A中显示的，只有当连接反应混合物包含第一衔接子和第二衔接子(T3r2-6+T7-6；和rT3-6+rT7-6)时，观察到大量的连接产物(由箭头标示)，但与组合的T3r2-6+T7-6衔接子相比，对于组合的rT3-6+rT7-6 衔接子观察到更多的不期望的反应副产物(由*标示)。
实施例6
衔接子组合
就双连接效率检测第一衔接子与第二衔接子的3个不同组合。此类组合包括两者都具有DNA上链(即，除了第一寡核苷酸具有2个3’核糖核苷酸外，第一和第三寡核苷酸都是DNA)、两者都具有RNA上链(即，第一和第三寡核苷酸)或在5’(第一)衔接子上具有RNA上链(即，第一寡核苷酸)且在3’(第二)衔接子上具有DNA上链(即，第三寡核苷酸)的第一衔接子和第二衔接子(关于最后一种衔接子结构的实施方案的示意图，参见图9C)。将一(1)μL的各衔接子(各50μM)组合，并且与3μL 2X杂交缓冲液(300mM NaCl，20mM Tris pH8，2mM EDTA)一起在95℃下温育3分钟，然后冷却至22℃。向每一个5μL的反应中加入一(1)μL 0.13μM5′32P-标记的合成的miRNA库(上文所述的)，然后将反应物在65℃下温育10分钟，然后冷却至22℃。
然后在向各管中加入14μL连接酶混合物之前，将反应混合物在16℃下温育30分钟。通过将0.5μLRNA连接酶2(10μM)、2μL 10XRnl2缓冲液(100mM Tris pH7，20mM MgCl2，20mM二硫苏糖醇，20mMATP)、1μL RNA酶抑制剂(Ambion AM2682，40U/μL)、10μL 40％PEG8000(Sigma-Aldrich 202452)和0.5μL不含RNA酶的水组合来制备连接混合物。将反应混合物在16℃下温育另外16小时。向各反应中加入二十(20)μL凝胶上样缓冲液II(AmbionAM8546G)，然后在95℃下加热5分钟。通过10％变性PAGE分辨32P-标记的产物，然后通过放射自显影进行显现。图9A和图9B描述了所得的连接产物的电泳图。双连接具有DNA或RNA上链的衔接子以产生“连接产物”，如图9A中描述的。
在使用和不使用核糖核酸酶H(RNA酶H)降解的情况下评估衔接子的不同比率(上链对下链，即，第一寡核苷酸对第二寡核苷酸和第三寡核苷酸对第四寡核苷酸)以使双连接产物最大化，同时使5’(第一) 和3’(第二)衔接子之间的直接连接产生的不期望的副产物(图10A中的“连接的衔接子”)减少至最少。将具有图10A的表中显示的不同上链/下链比率的衔接子与0.2或2pmol mirVanaTM miRNA ReferencePanel(上文所述的)和3μL 2X杂交缓冲液(300mM NaCl，20mM TrispH8，2mM EDTA)混合在6μL反应混合物中，然后在65℃下温育15分钟和在16℃下温育45分钟。通过将1μL RNA连接酶2(10μM)、1μL RNA酶抑制剂(AmbionAM2682，40U/μL)、2μL 10X Rnl2缓冲液(100mM Tris pH7，20mM MgCl2，20mM二硫苏糖醇，20mM ATP)和10μL 40％PEG 8000(Sigma-Aldrich 202452)组合来制备连接混合物。向每一个管中加入连接混合物(14μL)，在16℃下温育16小时。
在16小时的温育后，将4μL含有500mM Tris-HCl(pH8.3)、750mM KCl、30mM MgCl2和100mM DTT的10X RT缓冲液与2μL 2.5mM dNTP、1μL ArrayScriptTM逆转录酶(200U/μL，Ambion AM2048)、1μL SUPERase·InTM RNA酶抑制剂(20U/μL，Ambion AM2694)和12μL不含RNA酶的水组合，然后加入至20μL的连接反应物以产生总共40μL的RT混合物。将反转录(RT)反应混合物在42℃下温育30分钟。
对于图10A中的凝胶上显示的泳道1至6的样品，如下进行PCR。将一(1)μL来自RT混合物的样品与10μL 10X完全缓冲液(CompleteBuffer)(Ambion AM2050)、1μL dNTP(25mM)、0.5μL 5’引物和0.5μL 3’引物(各50μM)、1μL的SuperTaq DNA聚合酶(5U/μL，AmbionAM2050)和86μL不含RNA酶的水组合。使用20个循环(在95℃下30秒，在50℃下30秒和在72℃下30秒)进行PCR。将五(5)μLPCR产物装载至10％非变性PAGE凝胶上，通过 Gold(Invitrogen11494)染色进行显现。
对于图10A中的凝胶上显示的泳道7至12的样品，如下进行RNA酶H降解反应，然后进行PCR。将5μLRT反应物转移至干净的管中，与0.5μL核糖核酸酶H(RNA酶H，10U/μL，AmbionAM2292)混合，在37℃下温育30分钟。将一(1)μL RNA酶H处理的样品用于在与之前描述的相同的条件下进行的PCR反应。将所有此类扩增产物(使用和 不使用RNA酶H降解)装载至10％非变性PAGE凝胶上，进行电泳，然后通过 Gold(Invitrogen 11494)染色进行显现，如图10A中显示的。
将具有图10B的表中显示的不同上链/下链比率的衔接子与2pmol合成的mirVanaTMmiRNA Reference Panel(上文所述的)和3μL 2X杂交缓冲液(300mM NaCl，20mM Tris pH8，2mM EDTA)混合在6μL反应混合物中，然后在65℃下温育15分钟和在16℃下温育1小时。如之前所述进行连接、RT和RNA酶H处理。将一(1)μL RNA酶H处理的样品用于使用SuperTaqTM聚合酶(Ambion AM2050)的PCR扩增，进行如之前所述的20个循环。将5μL的各PCR产物装载至10％非变性PAGE凝胶上，进行电泳，然后通过 Gold(Invitrogen 11494)染色进行显现，如图10B中显示的。具有1/50、5/50、10/50、25/50和5/100的上链对下链的皮摩尔比率的衔接子全都能够产生迁移至大于50bp处的期望的产物。相反地，使用5/500的衔接子比率不能有效地产生期望的产物。
实施例7
本方法与 miRNA测定的比较；
在RNA含量上变化的样品
本实施例提供了与RT-PCR miRNA测定相比较的本方法的定量验证。图12描述了散点图，其描述了使用5’核酸酶测定法从人胎盘RNA和从人肺RNA获得的miRNA定量结果与根据本教导的某些实施方案获得的测序结果的相对倍数变化(FC)的比较。x-轴显示以-ΔΔCT表示的5’核酸酶测定结果的log2倍数变化(使用 Human MicroRNAArray v1.0(P/N 4384792；Applied Biosystems)和基本上按照厂商的方案进行的Multiplex RT for MicroRNAAssays(P/Ns 4383403，4383402，4383401，4383399，4384791，4382898，4383405，4383400和4383404；Applied Biosystems)产生的)，y轴显示根据本教导的实施方案的测序数据的log2倍数变化(基 本上按照厂商的方案使用SOLiDTM Sequencing System(AppliedBiosystems)产生的)。产生高于35的CT值的MicroRNAAssays(Applied Biosystems)被假定为阴性，且不包括在分析中。对于SOLiDTM测序数据，来自至少3个测序标签的数据是相应的序列被认为是“观察到的”所必需的。通过使用本方法，获得0.88的R值。
本实施例还提供了总RNA输入量，因为一些样品类型包含最少量的小RNA。以图中指定的量使用来自人胎盘(图13A)或小鼠肝(图13B)的总RNA进行本方法的一个实施方案。一般地，将衔接子混合物A(2μl)(SOLiDTM衔接子混合物A)(其含有25pmol RNA上链(第一寡核苷酸)和50pmol在5′末端上具有形成悬突的6个简并DNA核苷酸的DNA下链(第二寡核苷酸)作为5′(第一)衔接子，以及25pmol 5′-磷酸化的DNA上链(第三寡核苷酸)和50pmol在3′末端具有形成悬突的6个简并DNA核苷酸的DNA下链(第四寡核苷酸)作为3′(第二)衔接子)与3μl 2X杂交缓冲液(300mM NaCl，20mM Tris pH8，2mM EDTA)和1μl具有指定的量的总RNA在65℃下温育10分钟和在16℃下温育5分钟。
通过将1μL RNA连接酶2(10μM)、1μl RNA酶抑制剂(AmbionAM2682，40U/μL)、2μL10X Rnl2缓冲液(100mM Tris pH7，20mMMgCl2，20mM二硫苏糖醇，20mM ATP)和10μL 40％PEG 8000(Sigma-Aldrich 202452)混合来制备连接混合物。将连接反应混合物在16℃下温育16小时
在16小时的温育后，将4μL 10X RT缓冲液(其含有500mMTris-HCl(pH8.3)，750mMKCl，30mM MgCl2和100mM DTT)与2μL2.5mM dNTP、1μL ArrayScriptTM逆转录酶(200U/μL，Ambion AM2048)和13μL不含RNA酶的水组合，然后加入至20μL连接反应组合物。将反转录(RT)反应混合物在42℃下温育30分钟。
然后将5μL RT反应物转移至干净的管中，与0.5μL核糖核酸酶H(RNA酶H，10U/μL，Ambion AM2292)混合，然后在37℃下温育30分钟。然后将0.5μL RNA酶H处理的样品与5μL10X 缓冲液I(Applied Biosystems N8080171)、4μL dNTP(2.5mM)、0.5μL5′引物和0.5μL 3′引物(各50μM)、1μL DNA聚合酶(5U/μL，AppliedBiosystems N8080171)和38.5μL不含RNA酶的水组合。使用16个循环(在95℃下30秒，在62℃下30秒和在72℃下30秒)进行PCR。将五(5)μLPCR产物装载至10％非变性PAGE凝胶上，然后通过 Gold(Invitrogen 11494)染色显现。如图13A显示的，要指出的是，胎盘样品富含相当多的小RNA，并且本文中提供的方法能够从≤25ng的总RNA产生小RNA产物。相反地，如图13B所示，通过比较，小鼠肝样品含有极少量的小RNA，因此，根据本教导的某些实施方案，富集此类样品可提供更好的结果。
衔接子混合物A的序列如实施例1的SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4。
实施例8
实时PCR显示小RNA文库构建的动态范围
将四种含有5′-PO4的合成的RNA寡核苷酸(加料对照，SIC；序列示于下面)以横跨1000倍输入范围(1000、100、10和1pg于1000X混合物中)的变化浓度混合，然后将混合物连续稀释至1X。将混合物搀入500ng胎盘总RNA作为背景(图14，图16A)，除了将连接反应组合物在16℃下温育2小时(而不是16小时)外，如之前所述对四个样品进行连接反应。
然后如上所述用RNA酶H处理样品，然后将0.5μL RNA酶H处理的样品与5μL 10X缓冲液I(Applied BiosystemsN8080171)、4μL dNTP(2.5mM)、0.5μL 5’引物和0.5μL 3’引物(各50μM)、1μL DNA聚合酶(5U/μL，AppliedBiosystemsN8080171)和38.5μL不含RNA酶的水组合。使用15个循环(在95℃下30秒，在62℃下30秒和在72℃下30秒)进行PCR。在利用Qiagen PCR纯化试剂盒(Qiagen 28104)进行PCR净化后，将样品洗脱在30μL水中，然后以1∶400的比率进一步稀释。然后将2μL稀释的样品与12.5μL 2XGreen PCR Master Mix(Applied Biosystems 4309155)、1μl引物混合物(各1μM)和9.5μL水(示意性示于图15中)组合。使用在95℃下10分钟，40个循环的在95℃下15秒和在68℃下1分钟，然后在95℃下15秒，在60℃下1分钟和在95℃下15秒，在ABI 7500Real-TimePCR System(Applied Biosystems4351104)上进行实时PCR。
将各靶序列的循环阈值(Ct)(图16A，y-轴：平均Ct)对log10代表4个样品输入的值(x-轴：log(混合物浓度)1000X至1X，图16A)作图。如图16B中所观察到的，背景RNA中两个内源miRNA对照序列(miR-16和miR-21)的Ct在样品间相当恒定。
在本实施例中用作“加料对照”(SIC)的4种合成的RNA寡核苷酸是：(1)SIC 8：5′-Phos GCGAAUUAAUGAAAGUGGGCA(SEQ ID NO：11；图16A中使用三角形显示的数据)；(2)SIC34：5′-PhosACCCGACAUUAAAGGUGGCAU(SEQ ID NO：12；图16A中使用圆圈显示的数据)；(3)SIC 36：5′-Phos CUCACAUUUCGGAACUGAUGC(SEQ IDNO：13；图16A中使用菱形显示的数据)；和(4)SIC 37：5′-PhosACGGACCUCGAACUUCACCCA(SEQ ID NO：14；图16A中使用方形显示的数据)。因此，加料对照测定证明了本方法在横跨至少1000倍的动态范围内检测小RNA的能力。
实施例9
一步RT-PCR
本实施例提供了用于产生扩增模板和扩增产物的示例性方法，其中RNA指导的DNA聚合酶和DNA指导的DNA聚合酶存在于反转录反应组合物中。
在进行连接反应后，向连接反应中直接加入含有合适的缓冲液、dNTP、ArrayScriptTM逆转录酶、 DNA聚合酶以及正向和反向PCR引物的混合物，通过轻轻地上下吹打数次(3-4x)进行混合。将反应混合物在热循环仪中于42℃下温育30分钟以允许进行反转录，从而产生扩增模板。然后向反应混合物中加入RNA酶H，在热循环仪 中于37℃下温育30分钟。然后将反应温度升高至95℃并且保持5分钟，然后进行标准扩增循环，即，在62℃下进行30秒和在72℃下进行30秒，如实施例1中所描述的，以产生扩增产物。
实施例10
使用一种DNA聚合酶产生扩增模板和扩增产物
在进行连接反应后，向连接反应组合物中加入含有合适的缓冲液(含有最佳化的锰和镁的浓度)、dNTP、包含依赖于DNA的DNA聚合酶活性和依赖于RNA的DNA聚合酶活性的DNA聚合酶以及正向和反向PCR引物的混合物，通过轻轻地上下吹打数次(3-4x)进行混合，以形成反转录组合物。将反转录组合物在热循环仪中于42℃下温育30分钟以允许逆转录酶活性产生扩增模板。然后向反应混合物中加入RNA酶H，在热循环仪中于37℃下温育30分钟。然后将反应温度升高至95℃并且保持5分钟，然后进行标准扩增循环，即，在62℃下进行30秒和在72℃下进行30秒，如实施例1中所描述的，以产生扩增产物。
实施例11
用于产生小RNA文库的示例性方法
本实施例提供了用于产生小RNA文库的示例性方法，如图17中描述的。当目的RNA分子是小RNA时，起始材料应当包含小RNA级分。 制备的总RNA(AppliedBiosystems)经证实包含miRNA和其他小RNA。可选择地，可在进行用于总RNA分离的方法后，按照用户手册，使用mirVanaTM miRNA Isolation Kit或mirVanaTM PARISTMKit获得包含样品的小RNA级分的总RNA。
因为RNA样品可基于它们的来源和RNA分离方法而在小RNA含量上变化很大，因此使用例如但不限于使用小RNA芯片的Agilent生物分析仪评估样品的小RNA含量以确定在反应中使用总RNA还是经大小选择的RNA，可能是非常想要的。
可使用含有大于0.5％的小RNA(在大约10至40nt的大小范围 内)的总RNA样品而无需大小选择。当总RNA用于本方法时，所得的反应产物的大小范围将比从PAGE纯化的小RNA样品产生的那些更大。此外，来自总RNA样品的SOLiDTM测序结果通常包括略微更多的rRNA和tRNA读数。
应当就大约18至40nt的RNA级分富集含有低于0.5％的小RNA含量的RNA样品，例如但不限于通过PAGE和洗脱，通过flashPAGETMFractionator和flashPAGETMReaction Clean-Up Kit(AppliedBiosystems)。
如实施例7中所述，不同样品类型中小RNA的相对量变化很大。例如来自组织样品的RNA通常具有丰富的小RNA供给，然而来自培养的细胞系的RNA通常具有非常少的小RNA。
推荐的输RNA量包括：
RNA来源 量
从组织分离的总RNA 10-500ng
从培养的细胞分离的总RNA 100-500ng
使用PAGE大小选择的小RNA 1-200ng
对照RNA(人胎盘总RNA) 100ng
杂交和连接：如下进行杂交和连接。例如，设计衔接子混合物A用于从小RNA的5’末端开始的SOLiDTM测序，和设计衔接子混合物B用于从3’末端开始的SOLiDTM测序。为了从5’和3’末端开始测定样品中小RNA的序列，建立两个连接，一个连接使用一种衔接子混合物。各衔接子混合物包含第一、第二、第三和第四寡核苷酸。与衔接子混合物A相比，衔接子混合物B为反向互补方向，这样可检测扩增产物的每一条链。在冰上，如下在0.2mL PCR管中制备杂交混合物。
杂交混合物(8μL总体积)
量 组分
2μL 连接混合物A或B
3μL 杂交溶液
1-3μL RNA样品(1-500ng)
至8μL 不含核酸酶的水
通过轻轻地上下吹打数次混合内容物，然后短暂离心以收集管底的溶液。将反应物置于具有加热的盖的热循环仪中，如下对循环仪进行编程。
衔接子杂交温育
温度 时间
65℃ 10分钟
16℃ 保持
将样品在16℃下温育5分钟。在16℃下维持反应物，以显示的顺序向各样品中加入RNA连接试剂。
连接反应混合物(20μL终体积)
量 组分(按显示的顺序加入)
10μL 2X连接缓冲液
2μL 连接酶混合物
将混合物在设置为16℃的热循环仪中温育16小时。2小时的温育通常足以进行连接，然而，过夜温育导致略微更高的连接产物的量。
反转录和RNA酶H降解：将样品置于冰上，通过组合下列试剂在冰上制备反转录(RT)主混合物。在主混合物中包含额外的5-10％体积以补偿移液误差。
RT主混合物(20μL/样品)
量 组分
13μL 不含核酸酶的水
4μL 10X RT缓冲液
2μL dNTP
1μL ArrayScript逆转录酶
20μL 每反应的总体积
向各样品中加入RT主混合物(20μL)，轻轻地涡旋样品以充分混合，然后短暂离心样品以收集管底的混合物。然后将样品在42℃下温 育30分钟以合成cDNA。
cDNA可在-20℃下贮存数周，在-80℃下长期贮存，或立即用于RNA酶H降解(下一步)。
如下进行RNA酶H温育。将一定体积(10μL)的RT反应混合物从之前的步骤(cDNA)转移至新管中。加入RNA酶H(1μL)。轻轻地涡旋混合物以进行混合，短暂地微量离心以收集管底的混合物，然后在37℃下温育30分钟。
在RNA酶H处理后，样品可在-20℃下贮存过夜或立即用于PCR。
小RNA文库扩增：试验性和大规模PCR：因为不同样品类型可包含明显不同量的小RNA，因此获得足够用于SOLiDTM测序的DNA所需的PCR循环次数也是变化的。进行50μL试验性PCR以在进行一组3次或更多次重复100μL反应(大规模PCR)(用于合成用于SOLiDTM测序样品制备中的下一步骤的模板)之前，确定给定的样品类型所需的PCR循环次数。
大多数样品应当扩增12至15个循环。对于试验性实验，对于来自具有相对高的量的小RNA的起始材料的样品(即，大约200-500ng来自组织的总RNA，或大约50-200ng经大小选择的小RNA)，推荐12个PCR循环，对于具有相对少的小RNA的那些(即，大约1-200ng的来自组织的总RNA，或大约100-500ng的来自培养的细胞的总RNA，或1-50ng经大小选择的小RNA)，推荐15个循环。
小RNA PCR引物组：提供用于合成SOLiDTM测序模板的10个不同的PCR引物组以及SOLiDTMSmal1 RNA Expression Kit(AppliedBiosystems)。除了位于引物中部附近的6bp条形码外，引物组相同。PCR引物的该条形码特征使得能够测序和分析多重样品。即，能够在单个SOLiDTM测序反应中测定多至10个不同的样品的序列，每一个样品用一个提供的SOLiDTM小RNA PCR引物组进行扩增。可使用任何一个引物组，而在该点不混合样品。
示例性PCR引物包括但不限于下面显示的正向引物和带条形码的反向引物(各条形码序列以下划线标示)。
正向引物(SEQ I D NO：5)：
5′-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3′
反向引物 BC1(SEQ ID NO：15)：
5′-CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTAAGCCCCTGCTGTACGGCCAAGGCG-3′
反向引物 BC2(SEQ ID NO：16)：
5′-CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTCACACCCTGCTGTACGGCCAAGGCG-3′
反向引物 BC3(SEQ ID NO：17)：
5′-CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTCCCCTTCTGCTGTACGGCCAAGGCG-3′
反向引物 BC4(SEQ ID NO：18)：
5′-CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTCATCGGCTGCTGTACGGCCAAGGCG-3′
反向引物 BC5(SEQ ID NO：19)：
5′-CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTTCGTTGCTGCTGTACGGCCAAGGCG-3′
反向引物 BC6(SEQ ID NO：20)：
5′-CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTGGGCACCTGCTGTACGGCCAAGGCG-3′
反向引物 BC7(SEQ ID NO：6)：
5′-CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTCCAGACCTGCTGTACGGCCAAGGCG-3′
反向引物 BC8(SEQ ID NO：21)：
5′-CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTCTCCGTCTGCTGTACGGCCAAGGCG-3′
反向引物 BC9(SEQ ID NO：22)：
5′-CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTCCCTTCCTGCTGTACGGCCAAGGCG-3′
反向引物 BC10(SEQ ID NO：23)：
5′-CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTGCGGTCCTGCTGTACGGCCAAGGCG-3′
通过如下组合试剂在冰上制备PCR主混合物(用于单个50μL试验性PCR或100μL大规模PCR)。
PCR主混合物(用于单个反应)
试验性PCR 大规模PCR 组分
(50μL) (100μL)
38.9μL 77.8μL 不含核酸酶的水
5μL 10μL 10X PCR缓冲液I
1μL 2μL SOLiD小RNA PCR引物组(一组)
4μL 8μL 2.5mM dNTP混合物
0.6μL 1.2μL DNA聚合酶
49.5μL 99μL 每反应的总体积
轻轻地涡旋混合物以充分混合，短暂微量离心以收集管底的混合物。(在确定用于样品类型的合适的PCR循环次数后，对于各样品进行3次或更多次重复的大规模PCR。将反应产物混合以产生足够用于凝胶纯化和随后的SOLiDTM测序样品制备的材料。)
将用于单个反应的PCR主混合物用移液器转移至PCR板的孔内或0.2mL PCR管中。对于试验性PCR(50μL)，向PCR主混合物的各等分中加入0.5μL RNA酶H-处理的cDNA。对于大规模PCR(100μL)，向PCR主混合物的各等分中加入1μL RNA酶H-处理的cDNA。由于可能的反应抑制，不推荐在50μL PCR中使用大于1μL的cDNA。
将样品置于具有加热的盖的热循环仪中，进行示于下面的热条件。
PCR循环条件
| 阶段 | 重复 | 温度 | 时间 | |
| 变性(维持) | 1 | 1 | 95℃ | 5分钟 |
| PCR(循环) | 2 | 12-15 | 95℃ 62℃ 72℃ | 30秒 30秒 30秒 |
| 终沿伸 | 3 | 1 | 72℃ | 7分钟 |
将PCR产物(5-10μL)在非变性6％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，按照厂商说明书，用 Gold对凝胶染色。
图5显示来自使用合适的PCR循环次数扩增的反应物的结果。结果论述于实施例1中并且在此处进行概括以用于举例说明。
来源于小RNA的扩增产物迁移至大约108-130bp(引物的总长度为大约89bp，从而，大约19-41bp的RNA迁移至所述的范围内)。
要指出的是，当使用总RNA作为输入时，在大约150和200bp处的更高分子量的条带预期来自反应物，然而当使用经大小选择的小RNA作为输入时，预期此类更大的产物不来自反应物(参见图5)。
自连接衔接子和它们的扩增产物在89bp处形成条带。该条带通 常存在于所有反应中。另外的副产物迁移至大约100bp处。扩增不足的样品在大约108-130bp的大小范围内展示极少的材料。相反地，过量扩增的样品通常在大约108-130bp的大小范围内显示大量的材料，且展示大于大约140-150bp的反应产物的拖尾(smear)。来自总RNA输入的过量扩增的样品还可具有代表浓缩的PCR产物的更高分子量的条带梯。
扩增的小RNA文库的净化：然后如下从凝胶切取来源于小RNA的PCR产物，将其从丙烯酰胺中洗脱出来，进行纯化和浓缩。在该纯化的任何步骤中不加热样品，这样DNA双链体保持退火并且在随后的凝胶纯化过程中根据它们的大小进行迁移。
向各样品中加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1，pH 7.9)。涡旋样品以进行混合，然后以13,000xg在室温下离心5分钟。将水(上层)相转移至新的1.5mL管中，在转移过程中测量体积。向各样品中加入等体积的5M乙酸铵。加入一定量(1/100体积)的糖原和0.7体积的异丙醇(加入乙酸铵后的样品体积用作基线)。将混合物充分混合，在室温下温育5分钟，然后以13,000xg在室温下离心20分钟。小心取出并且弃去上清液。每次用1mL 70％乙醇清洗DNA沉淀，进行3次，然后让其风干大约15分钟，或直至可见的乙醇小滴已蒸发。
制备PAGE凝胶，例如0.75mm，非变性TBE，6％聚丙烯酰胺凝胶。凝胶的大小并不重要；微型凝胶(minigel)(大约60-100cm2)通常是最方便的。在使用的数小时内在实验室中制备的凝胶提供了比购买的预制凝胶更好的分辨率。也制备PAGE洗脱缓冲液。例如，对于10mL洗脱缓冲液，将5mL的TE缓冲液pH 8(10mM Tris-HCl，pH 8，1mMEDTA)与5mL的5M乙醇铵(2.5M终浓度)组合；每一个样品需要大约450μL。
使用针(例如，21号)对每一个样品的0.5mL微量离心管的底部中央穿孔。将上面切取的凝胶片置于这些管中，随后步骤中的离心破碎含有DNA的凝胶片以用于DNA洗脱。将20μL 1X非变性凝胶上样缓冲液中的来自上面的DNA沉淀装载至6％非变性TBE聚丙烯酰胺凝上。将DNA梯或相似的梯装载在分开的泳道中作为标记。将凝胶在大约140V下进行电泳(对于微型凝胶进行大约30分钟)或直至上样染料前沿几乎离开凝胶，然后按照厂商的说明书用 Gold进行染色。使用干净的刀片切取含有105-150bp DNA的凝胶片，将其置于在底部制备有孔的0.5mL管中，然后将0.5mL管置于更大的1.5mL管内。通过以13,000xg微量离心3分钟来破碎凝胶片。向破碎的凝胶片中加入一定量(200μL)的PAGE洗脱缓冲液；将混合物在室温下温育1小时，然后将缓冲液转移至新管中，留下凝胶片段。再次提取破碎的凝胶片，这次在37℃下进行，组合洗脱缓冲液。将混合物转移至离心柱中，在最高速度下离心5分钟以除去凝胶片。DNA存在于穿过液(flow-through)中。
向各样品中加入一定量(1/100体积)的糖原和0.7体积的异丙醇。充分混合样品，将其在室温下温育5分钟，然后以13,000xg在室温下离心20分钟。小心地取出并且弃去上清液，风干沉淀，然后将沉淀重悬浮于20μL不含核酸酶的水中。
通过在分光光度计中测量A260(1A260＝50μg DNA/mL)来定量各样品中的DNA，且使用Agilent生物分析仪或6％非变性PAGE验证大小和质量。可用于SOLiDTM测序的最少量的DNA是200ng(20ng/L)，但更多的DNA是优选的。SOLiDTM Small RNA Expression Kit反应产物在“SOLiDTM System Template Bead Preparation”阶段进入SOLiDTM样品制备工作流，其中乳液PCR用于将分子附着至珠粒。SOLiDTM测序和乳液PCR描述于例如公开的PCT申请WO06/084132(标题为“Reagents，Methods，and Libraries For Bead-Based Sequencing”)和WO 07/121489(标题为“Reagents，Methods，and Libraries forGel-Free Bead-BasedSequencing”)。
实施例12
用于作图和转录物覆盖(Transcript Coverage)的本方法的验证
本实施例通过证明本方法可用于将序列的短(25-70个碱基)标签 作图至人基因组或其他数据库并提供均匀的转录物覆盖来提供本方法的验证。
例如，分开制备并混合至少15个检测不同条件的文库，然后在单个试验中进行测序。在文库间发现相对等数目的miRNA序列；与检测的等数目的任何偏差可能代表混合步骤中的移液误差。在单个样品中，检测到555个miRNA中的389个(70％)。未检测到的miRNA主要代表不存在于样品中的RNA分子。
将SOLiDTM仪器上产生的序列读取结果(read)cs.fasta文件作图至miRNA、tRNA、rRNA、Refseqs和基因组的数据库。在1770万个读取结果中，55％作图至基因组，12％作图至RefSeq序列，1％作图至rRNA，0.5％作图至tRNA，8.25％作图至miRNA以及23％未被作图。独特地发现作图至基因组的读取结果待聚簇，即，大约3000个具有至少2个读取结果和＜70个碱基的大小。这些序列是新型miRNA或ncRNA的候选者。
使用SOLiDTM System进行的15个带条形码的和混合的文库的转录物组测序的分析发现，在大约5916万个读取结果中，36.22％作图至基因组，6.98％作图至RefSeq序列，0.32％作图至rRNA以及0.01％作图至tRNA。
RNA检测经证明是可重现的。已发现在相似但不完全相同的条件下产生的胎盘poly(A)RNA酶III片段化的文库具有良好的重现性(0.97的R2值)和横跨至少5个log的动态检测范围。
使用SOLiDTM System进行全转录物分析，发现mRNA至脑特异性血管发生抑制剂2(BAI2)的覆盖从5’至3’是均匀的。观察到代表几乎全长mRNA的交叠的单独的50个碱基的标签。多次出现的特定标签可反映样品中包含的mRNA的相对量(即，存在于样品中的RNA分子越多，捕获相同序列标签的概率越大)，片段化的RNA的切割位点的偏倚性或可能地PCR扩增假象。
将用于对标签进行测序的起始点的密度相对于分析的RNA转录物的长度作图。结果表明标签密度在整个转录物中是均匀的并且在极端5’和3’末端上减少。在RNA的末端上的捕获标签的该减少代表了连 接至所有RNA聚合酶II产生的RNA转录物上包含的5′帽的低效率。关于通常包含polyA尾的mRNA的3′末端，捕获和扩增该材料的能力显示被阻止，并且标签的比例很低，这可能是因为尾的同聚物性质。
已在本文中广泛和一般地(generically)描述了本教导的组合物、方法和试剂盒。落在一般公开内容中的各个较窄的类别和亚属群体也构成了本教导的一部分。这包括具有从属中去除任何主题的条件或负面限制的本教导的一般描述，无论去除的材料是否在本文中明确提及。
虽然已参考各种应用、方法和组合物描述了公开的教导，但应理解，可进行各种变化和变动而不背离本文中的教导。上述实施例提供用于更好地说明本教导并且无意限定本文的教导的范围。根据下列权利要求可进一步理解本教导的某些方面。
Claims (63)
1.用于检测样品中的RNA分子的方法，其包括:
将样品与至少一种第一衔接子、至少一种第二衔接子和包含双链特异性RNA连接酶活性的多肽组合以形成连接反应组合物，其中将所述至少一种第一衔接子和所述至少一种第二衔接子连接至所述样品的RNA分子，从而在相同的连接反应组合物中形成连接产物，
其中所述至少一种第一衔接子包含：
第一寡核苷酸，其长度为10至60个核苷酸并且在3’末端上含有至少2个核糖核苷，和
第二寡核苷酸，其包含与所述第一寡核苷酸大体上互补的核苷酸序列，并且当所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸双链化时还包含1至8个核苷酸的单链5’部分，
其中所述至少一种第二衔接子包含：
第三寡核苷酸，其长度为10至60个核苷酸并且包含5’磷酸基团，和
第四寡核苷酸，其包含与所述第三寡核苷酸大体上互补的核苷酸序列，并且当所述第三寡核苷酸与所述第四寡核苷酸双链化时还包含1至8个核苷酸的单链3’部分，
其中所述单链部分独立地具有简并核苷酸序列，
其中所述第一和第三寡核苷酸具有不同的核苷酸序列；
其中所述RNA分子与所述至少一种第一衔接子的单链部分和所述至少一种第二衔接子的单链部分杂交；和
检测所述连接产物的RNA分子或其替代物，包括：
将所述连接产物与下列组合：
i)RNA指导的DNA聚合酶，
ii)包含依赖于DNA的DNA聚合酶活性和依赖于RNA的DNA聚合酶活性的DNA聚合酶，或
iii)RNA指导的DNA聚合酶和DNA指导的DNA聚合酶,
反转录所述连接产物以形成反转录产物,
用核糖核酸酶H从所述反转录产物中降解至少一些核糖核苷以形成扩增模板,
当如i)中那样组合连接产物时，将所述扩增模板与至少一种正向引物、至少一种反向引物和DNA指导的DNA聚合酶组合以形成扩增反应组合物，
循环所述扩增反应组合物以形成至少一种扩增产物，然后确定所述扩增产物的至少一部分的序列，从而检测所述RNA分子，
其中所述包含双链特异性RNA连接酶活性的多肽包括Rnl2家族连接酶，且其中所述方法用于非诊断目的。
2.权利要求1的方法，其中所述包含双链特异性RNA连接酶活性的多肽包括噬菌体T4RNA连接酶2(Rnl2)。
3.权利要求1的方法，其中所述第一衔接子的单链部分，所述第二衔接子的单链部分，或所述第一衔接子的单链部分和所述第二衔接子的单链部分，包含简并序列。
4.权利要求1的方法，其中所述第一寡核苷酸包含至少15个核糖核苷。
5.权利要求1的方法，其中所述第二衔接子包含至少一个报告基团。
6.权利要求1的方法，其中所述至少一种扩增产物包含标识序列。
7.权利要求6的方法，其中所述至少一种正向引物中的至少一种，所述至少一种反向引物中的至少一种，或两者，包含标识序列。
8.权利要求6的方法，其中至少一种第一衔接子，至少一种第二衔接子，或至少一种第一衔接子和至少一种第二衔接子包含标识序列。
9.权利要求1的方法，其中所述RNA分子是小非编码RNA。
10.权利要求1的方法，其中所述样品包含多种RNA片段并且检测包括测定表达特征谱。
11.权利要求10的方法，其中在形成所述连接产物之前，除尽至少一个类别的RNA分子的浓度。
12.权利要求10的方法，其中所述样品包括多种信使RNA(mRNA)片段并且检测包括测定表达特征谱。
13.权利要求1的方法，其中检测包括对扩增产物的至少一部分测序，其中测序包括大规模平行测序反应，将至少一种扩增产物与微阵列杂交，或将至少一种扩增产物克隆入测序载体。
14.权利要求1的方法，其中所述第一衔接子的单链部分，所述第二衔接子的单链部分，或所述第一衔接子的单链部分和所述第二衔接子的单链部分，包含与相应的RNA分子选择性杂交的序列特异性区域。
15.用于检测RNA分子的方法，其包括：
将RNA分子与至少一种第一衔接子、至少一种第二衔接子和双链特异性连接酶组合以形成连接反应组合物，其中所述至少一种第一衔接子包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸在3’末端上包含至少2个核糖核苷，所述第二寡核苷酸在所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸杂交在一起时包含单链部分，并且其中所述至少一种第二衔接子包含第三寡核苷酸和第四寡核苷酸，所述第三寡核苷酸包含5’磷酸基团，所述第四寡核苷酸在所述第三寡核苷酸与所述第四寡核苷酸杂交在一起时包含单链部分，其中所述单链部分独立地具有简并核苷酸序列，
将所述至少一种第一衔接子和所述至少一种第二衔接子连接至所述RNA分子以形成连接产物，其中将所述第一衔接子和所述第二衔接子在相同的连接反应组合物中连接至所述RNA分子,
将所述连接产物与RNA指导的DNA聚合酶组合，
反转录所述连接产物以形成反转录产物，
用核糖核酸酶H(RNA酶H)从所述反转录产物中降解至少一些核糖核苷以形成扩增模板，
将所述扩增模板与至少一种正向引物、至少一种反向引物和DNA指导的DNA聚合酶组合以形成扩增反应组合物，
循环所述扩增反应组合物以形成扩增产物，并且确定所述扩增产物的至少一部分的序列，从而检测所述RNA分子，
其中所述双链特异性连接酶包括Rnl2家族连接酶，且其中所述方法用于非诊断目的。
16.权利要求15的方法，其中所述第一衔接子的单链部分，所述第二衔接子的单链部分，或所述第一衔接子的单链部分和所述第二衔接子的单链部分，包含简并序列。
17.权利要求15的方法，其中所述第一寡核苷酸的至少2个核糖核苷包含至少15个核糖核苷。
18.权利要求15的方法，其中所述第二衔接子包含至少一个报告基团。
19.权利要求15的方法，其中所述扩增产物中的至少一种包含标识序列。
20.权利要求19的方法，其中所述至少一种正向引物中的至少一种，所述至少一种反向引物中的至少一种，或两者，包含标识序列。
21.权利要求19的方法，其中至少一种第一衔接子，至少一种第二衔接子，或至少一种第一衔接子和至少一种第二衔接子，包含标识序列。
22.权利要求15的方法，其中所述RNA分子是小非编码RNA。
23.权利要求15的方法，其中所述RNA分子包含多种信使RNA(mRNA)片段并且检测包括测定表达特征谱。
24.权利要求23的方法，其中在形成所述连接产物之前，除尽至少一个类别的RNA分子的浓度。
25.权利要求15的方法，其中检测包括对扩增产物的至少一部分测序，其中测序包括大规模平行测序反应，将至少一种扩增产物与微阵列杂交，或将至少一种扩增产物克隆入测序载体。
26.权利要求15的方法，其中双链特异性连接酶包括噬菌体T4RNA连接酶2(Rnl2)。
27.权利要求15的方法，其中所述第一衔接子的单链部分，所述第二衔接子的单链部分，或所述第一衔接子的单链部分和所述第二衔接子的单链部分，包含与相应的RNA分子选择性杂交的序列特异性区域。
28.用于检测RNA分子的方法，其包括:
将RNA分子与至少一种第一衔接子、至少一种第二衔接子和双链特异性RNA连接酶组合以形成连接反应组合物，其中所述至少一种第一衔接子包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸在3’末端上包含至少2个核糖核苷，所述第二寡核苷酸在所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸杂交在一起时包含单链部分，并且其中所述至少一种第二衔接子包含第三寡核苷酸和第四寡核苷酸，所述第三寡核苷酸包含5’磷酸基团，所述第四寡核苷酸在所述第三寡核苷酸与所述第四寡核苷酸杂交在一起时包含单链部分，其中所述单链部分独立地具有简并核苷酸序列，
将所述至少一种第一衔接子和所述至少一种第二衔接子连接至所述RNA分子以形成连接产物，其中将所述第一衔接子和所述第二衔接子在相同的连接反应组合物中连接至所述RNA分子,
将所述连接产物与RNA指导的DNA聚合酶组合，
反转录所述连接产物以形成反转录产物，
用核糖核酸酶H(RNA酶H)从所述反转录产物中降解至少一些核糖核苷以形成扩增模板，
将所述扩增模板与至少一种正向引物、至少一种反向引物和DNA指导的DNA聚合酶组合以形成扩增反应组合物，
循环所述扩增反应组合物以形成扩增产物，其中所述扩增反应组合物还包含报告探针、核酸染料、或报告探针和核酸染料，和
检测所述扩增产物，从而检测所述RNA分子，
其中所述双链特异性RNA连接酶包括Rnl2家族连接酶，且其中所述方法用于非诊断目的。
29.用于产生RNA文库的方法，其包括,
将许多不同的RNA分子与许多第一衔接子类别、许多第二衔接子类别和双链特异性RNA连接酶组合以形成连接反应组合物，其中至少一种第一衔接子包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸在3’末端上包含至少2个核糖核苷，所述第二寡核苷酸在所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸杂交在一起时包含单链部分，并且其中至少一种第二衔接子包含第三寡核苷酸和第四寡核苷酸，所述第三寡核苷酸包含5’磷酸基团，所述第四寡核苷酸在所述第三寡核苷酸与所述第四寡核苷酸杂交在一起时包含单链部分，其中所述单链部分独立地具有简并核苷酸序列，
将至少一种第一衔接子和至少一种第二衔接子连接至RNA分子以形成许多不同的连接产物类别，其中将第一衔接子和第二衔接子在相同的连接反应组合物中连接至RNA分子，
将所述许多连接产物类别与RNA指导的DNA聚合酶组合，
反转录所述许多连接产物类别中的至少一些以形成许多反转录产物类别，
用核糖核酸酶H(RNA酶H)从所述许多反转录产物中的至少一些中降解至少一些核糖核苷以形成许多扩增模板类别，
将所述许多扩增模板类别与至少一种正向引物、至少一种反向引物和DNA指导的DNA聚合酶组合以形成扩增反应组合物，
循环所述扩增反应组合物以形成含有许多扩增产物类别的文库，其中所述扩增产物类别中的至少一些包含对于文库中的至少一些其他扩增产物类别是共同的标识序列，
其中所述双链特异性RNA连接酶包括Rnl2家族连接酶。
30.权利要求29的方法，其中至少一些所述正向引物、至少一些所述反向引物、或至少一些所述正向引物和至少一些所述反向引物，包含标识序列或标识序列的互补序列。
31.一种试剂盒，其包含：多种第一衔接子类别，其中各第一衔接子类别包含不同的简并序列、多种第二衔接子类别，其中各第二衔接子类别包含不同的简并序列、Rnl2家族的连接酶、RNA指导的DNA聚合酶、多种不同的第一引物类别、DNA指导的DNA聚合酶和EC3.1.26.4的RNA酶H，
其中各第一衔接子类别包含：
第一寡核苷酸，其长度为10至60个核苷酸并且在3’末端上含有至少2个核糖核苷，和
第二寡核苷酸，其包含与所述第一寡核苷酸大体上互补的核苷酸序列，并且当所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸双链化时还包含1至8个核苷酸的单链5’部分，
其中各第二衔接子类别包含：
第三寡核苷酸，其长度为10至60个核苷酸并且包含5’磷酸基团，和
第四寡核苷酸，其包含与所述第三寡核苷酸大体上互补的核苷酸序列，并且当所述第三寡核苷酸与所述第四寡核苷酸双链化时还包含1至8个核苷酸的单链3’部分，
其中所述单链部分独立地具有简并核苷酸序列，且
所述第一和第三寡核苷酸具有不同的核苷酸序列。
32.权利要求31的试剂盒，其还包含烟草酸焦磷酸酶。
33.一种试剂盒，其包含：多种第一衔接子类别，其中至少一些所述第一衔接子类别包含简并序列、多种第二衔接子类别，其中至少一些所述第二衔接子类别包含简并序列、Rnl2家族连接酶、DNA聚合酶、至少一个引物类别和核糖核酸酶H，
其中第一衔接子类别包含：
第一寡核苷酸，其长度为10至60个核苷酸并且在3’末端上含有至少2个核糖核苷，和
第二寡核苷酸，其包含与所述第一寡核苷酸大体上互补的核苷酸序列，并且当所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸双链化时还包含1至8个核苷酸的单链5’部分，
其中第二衔接子类别包含：
第三寡核苷酸，其长度为10至60个核苷酸并且包含5’磷酸基团，和
第四寡核苷酸，其包含与所述第三寡核苷酸大体上互补的核苷酸序列，并且当所述第三寡核苷酸与所述第四寡核苷酸双链化时还包含1至8个核苷酸的单链3’部分，
其中所述单链部分独立地具有简并核苷酸序列，且
所述第一和第三寡核苷酸具有不同的核苷酸序列。
34.权利要求33的试剂盒，其中所述DNA聚合酶包括依赖于RNA的DNA聚合酶和依赖于DNA的DNA聚合酶。
35.权利要求34的试剂盒，其还包含烟草酸焦磷酸酶。
36.至少一种第一衔接子、至少一种第二衔接子和包含双链特异性RNA连接酶活性的多肽在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测样品中的RNA分子的方法中，所述方法包括:
将样品与至少一种第一衔接子、至少一种第二衔接子和包含双链特异性RNA连接酶活性的多肽组合以形成连接反应组合物，其中将所述至少一种第一衔接子和所述至少一种第二衔接子连接至所述样品的RNA分子，从而在相同的连接反应组合物中形成连接产物，
其中所述至少一种第一衔接子包含：
第一寡核苷酸，其长度为10至60个核苷酸并且在3’末端上含有至少2个核糖核苷，和
第二寡核苷酸，其包含与所述第一寡核苷酸大体上互补的核苷酸序列，并且当所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸双链化时还包含1至8个核苷酸的单链5’部分，
其中所述至少一种第二衔接子包含：
第三寡核苷酸，其长度为10至60个核苷酸并且包含5’磷酸基团，和
第四寡核苷酸，其包含与所述第三寡核苷酸大体上互补的核苷酸序列，并且当所述第三寡核苷酸与所述第四寡核苷酸双链化时还包含1至8个核苷酸的单链3’部分，
其中所述单链部分独立地具有简并核苷酸序列，
其中所述第一和第三寡核苷酸具有不同的核苷酸序列；
其中所述RNA分子与所述至少一种第一衔接子的单链部分和所述至少一种第二衔接子的单链部分杂交；和
检测所述连接产物的RNA分子或其替代物，包括：
将所述连接产物与下列组合：
i)RNA指导的DNA聚合酶，
ii)包含依赖于DNA的DNA聚合酶活性和依赖于RNA的DNA聚合酶活性的DNA聚合酶，或
iii)RNA指导的DNA聚合酶和DNA指导的DNA聚合酶,
反转录所述连接产物以形成反转录产物,
用核糖核酸酶H从所述反转录产物中降解至少一些核糖核苷以形成扩增模板,
当如i)中那样组合连接产物时，将所述扩增模板与至少一种正向引物、至少一种反向引物和DNA指导的DNA聚合酶组合以形成扩增反应组合物，
循环所述扩增反应组合物以形成至少一种扩增产物，然后确定所述扩增产物的至少一部分的序列，从而检测所述RNA分子，
其中所述包含双链特异性RNA连接酶活性的多肽包括Rnl2家族连接酶。
37.权利要求36的用途，其中所述包含双链特异性RNA连接酶活性的多肽包括噬菌体T4RNA连接酶2(Rnl2)。
38.权利要求36的用途，其中所述第一衔接子的单链部分，所述第二衔接子的单链部分，或所述第一衔接子的单链部分和所述第二衔接子的单链部分，包含简并序列。
39.权利要求36的用途，其中所述第一寡核苷酸包含至少15个核糖核苷。
40.权利要求36的用途，其中所述第二衔接子包含至少一个报告基团。
41.权利要求36的用途，其中所述至少一种扩增产物包含标识序列。
42.权利要求41的用途，其中所述至少一种正向引物中的至少一种，所述至少一种反向引物中的至少一种，或两者，包含标识序列。
43.权利要求41的用途，其中至少一种第一衔接子，至少一种第二衔接子，或至少一种第一衔接子和至少一种第二衔接子包含标识序列。
44.权利要求36的用途，其中所述RNA分子是小非编码RNA。
45.权利要求36的用途，其中所述样品包含多种RNA片段并且检测包括测定表达特征谱。
46.权利要求45的用途，其中在形成所述连接产物之前，除尽至少一个类别的RNA分子的浓度。
47.权利要求45的用途，其中所述样品包括多种信使RNA(mRNA)片段并且检测包括测定表达特征谱。
48.权利要求36的用途，其中检测包括对扩增产物的至少一部分测序，其中测序包括大规模平行测序反应，将至少一种扩增产物与微阵列杂交，或将至少一种扩增产物克隆入测序载体。
49.权利要求36的用途，其中所述第一衔接子的单链部分，所述第二衔接子的单链部分，或所述第一衔接子的单链部分和所述第二衔接子的单链部分，包含与相应的RNA分子选择性杂交的序列特异性区域。
50.至少一种第一衔接子、至少一种第二衔接子和双链特异性连接酶在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测RNA分子的方法中，所述方法包括：
将RNA分子与至少一种第一衔接子、至少一种第二衔接子和双链特异性连接酶组合以形成连接反应组合物，其中所述至少一种第一衔接子包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸在3’末端上包含至少2个核糖核苷，所述第二寡核苷酸在所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸杂交在一起时包含单链部分，并且其中所述至少一种第二衔接子包含第三寡核苷酸和第四寡核苷酸，所述第三寡核苷酸包含5’磷酸基团，所述第四寡核苷酸在所述第三寡核苷酸与所述第四寡核苷酸杂交在一起时包含单链部分，其中所述单链部分独立地具有简并核苷酸序列，
将所述至少一种第一衔接子和所述至少一种第二衔接子连接至所述RNA分子以形成连接产物，其中将所述第一衔接子和所述第二衔接子在相同的连接反应组合物中连接至所述RNA分子,
将所述连接产物与RNA指导的DNA聚合酶组合，
反转录所述连接产物以形成反转录产物，
用核糖核酸酶H(RNA酶H)从所述反转录产物中降解至少一些核糖核苷以形成扩增模板，
将所述扩增模板与至少一种正向引物、至少一种反向引物和DNA指导的DNA聚合酶组合以形成扩增反应组合物，
循环所述扩增反应组合物以形成扩增产物，并且确定所述扩增产物的至少一部分的序列，从而检测所述RNA分子，
其中所述双链特异性连接酶包括Rnl2家族连接酶。
51.权利要求50的用途，其中所述第一衔接子的单链部分，所述第二衔接子的单链部分，或所述第一衔接子的单链部分和所述第二衔接子的单链部分，包含简并序列。
52.权利要求50的用途，其中所述第一寡核苷酸的至少2个核糖核苷包含至少15个核糖核苷。
53.权利要求50的用途，其中所述第二衔接子包含至少一个报告基团。
54.权利要求50的用途，其中所述扩增产物中的至少一种包含标识序列。
55.权利要求54的用途，其中所述至少一种正向引物中的至少一种，所述至少一种反向引物中的至少一种，或两者，包含标识序列。
56.权利要求54的用途，其中至少一种第一衔接子，至少一种第二衔接子，或至少一种第一衔接子和至少一种第二衔接子，包含标识序列。
57.权利要求50的用途，其中所述RNA分子是小非编码RNA。
58.权利要求50的用途，其中所述RNA分子包含多种信使RNA(mRNA)片段并且检测包括测定表达特征谱。
59.权利要求58的用途，其中在形成所述连接产物之前，除尽至少一个类别的RNA分子的浓度。
60.权利要求50的用途，其中检测包括对扩增产物的至少一部分测序，其中测序包括大规模平行测序反应，将至少一种扩增产物与微阵列杂交，或将至少一种扩增产物克隆入测序载体。
61.权利要求50的用途，其中双链特异性连接酶包括噬菌体T4RNA连接酶2(Rnl2)。
62.权利要求50的用途，其中所述第一衔接子的单链部分，所述第二衔接子的单链部分，或所述第一衔接子的单链部分和所述第二衔接子的单链部分，包含与相应的RNA分子选择性杂交的序列特异性区域。
63.至少一种第一衔接子、至少一种第二衔接子和双链特异性RNA连接酶在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测RNA分子的方法中，所述方法包括:
将RNA分子与至少一种第一衔接子、至少一种第二衔接子和双链特异性RNA连接酶组合以形成连接反应组合物，其中所述至少一种第一衔接子包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸在3’末端上包含至少2个核糖核苷，所述第二寡核苷酸在所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸杂交在一起时包含单链部分，并且其中所述至少一种第二衔接子包含第三寡核苷酸和第四寡核苷酸，所述第三寡核苷酸包含5’磷酸基团，所述第四寡核苷酸在所述第三寡核苷酸与所述第四寡核苷酸杂交在一起时包含单链部分，其中所述单链部分独立地具有简并核苷酸序列，
将所述至少一种第一衔接子和所述至少一种第二衔接子连接至所述RNA分子以形成连接产物，其中将所述第一衔接子和所述第二衔接子在相同的连接反应组合物中连接至所述RNA分子,
将所述连接产物与RNA指导的DNA聚合酶组合，
反转录所述连接产物以形成反转录产物，
用核糖核酸酶H(RNA酶H)从所述反转录产物中降解至少一些核糖核苷以形成扩增模板，
将所述扩增模板与至少一种正向引物、至少一种反向引物和DNA指导的DNA聚合酶组合以形成扩增反应组合物，
循环所述扩增反应组合物以形成扩增产物，其中所述扩增反应组合物还包含报告探针、核酸染料、或报告探针和核酸染料，和
检测所述扩增产物，从而检测所述RNA分子，
其中所述双链特异性RNA连接酶包括Rnl2家族连接酶。
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