CN105112507A - 微小rna的数字化恒温检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微小RNA靶分子的数字化恒温指数扩增与检测方法，利用微流控或微滴化方法将反应液分散至包括微滴或微反应孔在内的若干个微反应器中，在每个微反应器中使用了靶分子特异性上游引物和下游引物，其锚定序列区含有缺口剂识别序列正义链序列，识别序列区则分别与miRNA及其互补链的3’-末端序列互补，实现恒定温度条件下指数扩增miRNA，并最终通过释放不同种类和相对强度荧光信号的微反应器数量来实现单个反应体系中绝对定量检测多种微小RNA靶分子。本发明克服了miRNA固有属性对其扩增检测方法的设计难度，提供一种基于寡核苷酸引物的数字化恒温扩增系统，能够在较高单一恒定温度条件实现多种靶分子恒温指数扩增和绝对定量的方法。
Description
技术领域
本发明属于生命科学和生物技术领域，具体涉及一种通过数字化微反应器绝对化定量检测的微小RNA的数字化恒温检测方法。
背景技术
与基因组DNA、mRNA和长片段非编码RNA(lncRNA)等核酸分子相比较，微小RNA(microRNA,miRNA)分子具有其特殊性，如：核酸分子片段极小(≤22nt)，GC含量分布广泛(5～95％)，导致熔解温度(meltingtemperature，Tm)差异大，难于设计匹配的扩增引物和检测探针；所占总RNA的比例极低(≤0.01％)，需要高灵敏度的检测方法；家族分子差异小(可仅有单碱基差异)，对检测特异性的要求高；不同miRNA的表达水平差异极大(可达4个数量级；如：几十个拷贝/细胞至5×105拷贝/细胞)，要求检测线性范围宽，同时能够有效识别低丰度miRNA；靶序列同时存在于pri-miRNA和pre-miRNA中；缺乏类似于mRNA的poly(A)尾，使其难以用常规技术手段进行逆转录检测。miRNA的上述特征对其核酸分子检测技术和方法提出了近乎于苛刻的特殊需求。例如，极小的分子片段使常规PCR引物设计策略无法实施，单碱基差异对引物或探针的碱基分辩能力要求极高，GC含量的巨大差异导致引物和探针难于取向于均一的退火温度。
自1993年首次发现miRNA以来，miRNA的检测方法从NorthernBlot探针杂交法逐渐向高通量测序法(如：Solexa法和SoLiD法等)、芯片杂交法、荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,ISH)、实时荧光逆转录定量PCR法(real-timereversetranscriptionquantitativePCR,RT-qPCR)、恒温扩增检测技术发展。由于miRNA靶分子的上述独特属性，现有的每种检测技术和方法特点各异，各有所长，但也都有明显的缺点，从而使每种方法都有其最适合的使用环境。
以目前最常用的基于芯片杂交法的微阵列技术、高通量测序法和RT-qPCR为例。高通量测序与微阵列的检测通量大，并且，高通量测序还可用于发现新miRNA，但是，这两种方法的定量精确性较差，价格昂贵，一般应用于miRNA的初筛研究。此外，高通量测序技术文库制备复杂，达到兆字节(terabytes,TB)的庞大和复杂文库数据分析需要特殊的计算机资源和相关的生物信息学工具和手段，因此，往往由专业的公司提供。由于miRNA的片段小，且Tm值差异大，微阵列技术不能简单地通过增加和减少探针的长度来均衡不同探针的杂交效率，因此，往往需要借助一些特殊的技术手段，例如使用锁核酸探针(lockednucleicacid,LNA)。以茎环引物RT-qPCR、poly(T)接头RT-qPCR为代表的RT-qPCR技术是验证基因组水平miRNA表达谱研究结果最常用和最经典的方法，但是该技术均需逆转录步骤，受多种因素制约的实验数据归一化对检测结果精确度影响大，“热变性-复性-延伸”热循环条件需要高纯度的miRNA，此外，扩增效率受到多种因素的影响和制约，易出现非特异性扩增；扩增反应时间长，一般需要几个小时；受限于热动力学特征，无法精确检测2倍以下的表达差异。
理想的miRNA检测方法应当具有以下特征：灵敏度高，能够达到检测少量或微量起始材料；特异性好，能够识别仅有单碱基差异的miRNA；操作简便，无需昂贵的试剂和设备；通用性高，能够应用于miRNA的组织和细胞原位检测、高通量检测、精确定量检测等多个领域。但是，如上所述，受限于miRNA靶分子的特有属性及现有技术的固有局限性，miRNA的现有检测技术往往只能满足上述部分需求。如果能够研发出一种新的能够更好地满足上述需求的技术和方法，一方面，能够得到更广泛的应用，例如，采用一种技术和方法就能实现多个领域的应用，从而有效地拓展非编码RNA(non-codingRNA,ncRNA)的研究深度与广度。
恒温扩增技术是温度基本不变的核酸扩增技术。相对于以PCR为代表的变温扩增技术，恒温扩增技术具有以下主要优势：反应温度单一，对设备的要求程度低；不存在温度变化，扩增效率及核酸扩增片段长度均优于常规PCR技术；反应时间短，可在1小时，甚至几分钟内实现靶分子的有效扩增，且灵敏度和特异性与PCR技术相当，甚至更好。上述技术优势使恒温扩增技术在生命科学的各个领域得到了广泛应用，并且，特别适合于miRNA的检测。
目前，已经发展出了多种核酸恒温扩增技术，其中，具有代表性的技术主要包括：链置换扩增(stranddisplacementamplification,SDA)、环介导核酸等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)、滚环扩增(rollingcircleamplification,RCA)、依赖于核酸序列的扩增(nucleicacidsequence-basedamplification,NASBA)、依赖于解旋酶的等温扩增技术(helicase-dependentisothermalDNAamplification,HAD)、转录介导扩增(transcription-mediatedamplification,TMA)、单引物等温扩增(singleprimerisothermalamplification,SPIA)、信号介导RNA扩增技术(signalmediatedamplificationofRNAtechnology,SMART)、恒温指数扩增(exponentialamplificationreaction；EXPAR)。但是，由于miRNA靶分子的特殊性，仅有部分恒温技术适合于miRNA的检测，例如SDA、RCA和EXPAR。但是，受限于现有恒温技术的技术局限性，现有的miRNA恒温检测技术往往只能检测单一miRNA靶分子，无法实现多个或高通量miRNA的检测。
无论是变温还是恒温扩增技术，DNA聚合酶均是其反应体系的必需酶。一般而言，DNA聚合酶通常具有以下一种或多种生物学功能：5'→3'扩增活性(amplificationactivities)、5'→3'核酸外切酶活性(exonucleaseactivities)、3'→5'核酸外切酶活性、链置换活性(stranddisplacementactivities)。
无论是变温还是恒温扩增技术，在引物延伸过程中，当其3'-延伸末端抵达下游DNA链，即其3'-延伸末端存在另一条与模板分子互补配对形成的双链DNA(doublestrandDNA,dsDNA)区域时，如果DNA聚合酶既不具备5'→3'外切酶活性，也不具备链置换活性，那么，引物的3'-末端延伸则受到下游DNA链的阻止而无法继续延伸。但是，当DNA聚合酶具有5'→3'外切酶活性时(如：TaqDNA聚合酶)，该活性可将下游DNA链按照5'→3'方向水解成单核苷酸，从而使引物的延伸得以继续，如实时荧光PCR中的水解探针技术；或者，当DNA聚合酶具有链置换活性时(如：BstDNA聚合酶)，该活性可以使引物的延伸得以继续，同时，将下游DNA链从dsDNA区域剥离，使下游DNA链变成游离的单链核酸分子。DNA聚合酶的上述链置换活性被广泛应用于多种恒温扩增系统，如SDA、LAMP、RCA等。
具有链置换活性、缺乏5'→3'外切酶活性的DNA聚合酶被广泛应用于依赖双链核酸分子缺口的链置换反应。所谓双链核酸分子缺口是指双链核酸分子的一条链保持完整性，另一条链的某两个毗邻核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，从而形成一个缺口。该缺口两侧的核酸分子末端分别是3'-端羟基(3'-hydroxygroup,3'-OH)和5'-端磷酸基团(5'-phosphategroup,5'-PO4)。在上述DNA聚合酶存在的作用下，具有3'-OH的核酸分子从缺口处3'-OH开始延伸反应，同时，其延伸合成的新生核酸链将下游的旧链剥离，使下游旧链转变成游离的单链核酸分子。
缺口内切酶(nickingendonuclease)，亦叫缺口酶(nickingenzyme)，是II型限制性内切酶(restrictionendonuclease)中的一类特殊类型酶。目前已经发现280余种缺口酶，商品化的近20余种，并且，其热稳定性到可达到65℃或更高。该类酶只切割双链核酸分子中的一条链，造成一个双链核酸分子缺口，该缺口两侧的核酸分子末端分别是3'-OH和5'-PO4。完全或部分双链核酸分子中被缺口内切酶识别的核苷酸序列被称为缺口内切酶识别序列(nickingendonucleaserecognitionsequences,NERS)。
限制性内切酶中还有一种特殊类型的酶(如：HincII)，该类酶具有常规限制性内切酶的功能，能够识别并在天然双链核酸分子的限制性内切酶识别序列(restrictionendonucleaserecognitionsequences,RERS)处同时酶切双链核酸分子的两条链。但是，当双链核酸分子中的一条链在RERS序列中至少含有一个衍生核苷酸(如：α巯基-脱氧核苷酸(α-thiodeoxynucleotide)时，该衍生核苷酸可阻止限制性内切酶切割该核酸分子链，因此，只能切割另一条不含有衍生核苷酸的天然核酸分子链。这种仅有一条链的RERS序列含有阻止限制性内切酶切割的双链核酸分子被称为半修饰RESR。可见，能够识别并切割半修饰RERS的限制性内切酶具有与缺口内切酶相似的功能，即可用于制备双链核酸分子缺口。
缺口内切酶及可识别半切割半修饰RESR的限制性内切酶的上述生物学活性被广泛应用于依赖双链核酸分子缺口的链置换反应，并且，该链置换反应原理被广泛应用于多种恒温扩增技术，如SDA、EXPAR等。例如，在缺口内切酶(或：可识别半切割半修饰RESR的限制性内切酶)和具有链置换活性DNA聚合酶的共同作用下，具有3'-OH的核酸分子从缺口处3'-OH开始延伸反应，同时，其延伸合成的新生核酸链将下游的旧链剥离。因链延伸而被封闭的缺口可以在缺口内切酶(或：可识别半切割半修饰RESR的限制性内切酶)的作用下重复产生，从而使得“切割-延伸-链置换”的过程能够重复进行，并在此过程中，以线性或指数方式不断剥离或释放出与下游旧链序列相同的单链核酸分子(WalkerGT,etal.Stranddisplacementamplification--anisothermal,invitroDNAamplificationtechnique.NucleicAcidsRes.1992；20(7):1691-6.WalkerGT,etal.Stranddisplacementamplification--anisothermal,invitroDNAamplificationtechnique.NucleicAcidsRes.1992；20(7):1691-6.VanNessJ,etal.Isothermalreactionsfortheamplificationofoligonucleotides.ProcNatlAcadSciUSA.2003；100(8):4504-9.ShiC,etal.Exponentialstrand-displacementamplificationfordetectionofmicroRNAs.AnalChem.2014；86(1):336-9)。
锁核酸(lockednucleidacid,LNA)一种特殊的双环状寡核苷酸衍生物，其核糖的β-D-呋喃核糖的2'-O和4'-C通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥,并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3'-内型的N构型,降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。与其他寡核苷酸类似物相比，DNA/LNA嵌合式寡核苷酸对单碱基变异具有良好的识别能力，以DNA/LNA嵌合引物或探针形式广泛应用于多种分子生物学检测技术中。
数字化PCR(digitalPCR)是允许扩增来自最小稀释样品单一核酸模板的技术，或者说，是一种基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量方法，是一种绝对定量的方法。该技术的基本前提是采用分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至包括微滴或微反应孔在内的微反应器中，每个微反应器中的核酸模板数少于或等于1个。这样，经过PCR循环后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的微反应器就没有荧光信号。根据相对比例和微反应器的体积，就可推算出原始溶液的核酸浓度。与传统定量PCR的不同之处在于，数字化PCR通过直接计数的方法，可以实现起始核酸模板的绝对定量。此外，数字化PCR还可以是一种可以在大量野生型核酸模板背景中鉴定出微量突变体的方法。由于数字化PCR技术可将核酸模板用事先分隔开来的微反应器进行单分子水平的单独扩增，这样，就避免了高丰度基因型核酸模板对低丰度基因型核酸模板的扩增抑制，因此，可极大地提高痕量基因型的检出效率，例如，乳滴数字化PCR技术能够检测到低到0.001％的突变型基因，而核酸测序及常规实时荧光定量PCR法对少于1％的突变检出率是无能为力的，因此，数字化PCR的检测灵敏度至少可提高1000倍。数字化恒温扩增的基本原理与数字化PCR相似，均是通过已有的数字化制备系统，如美国伯乐公司的QX-100和QX-200、美国RainDrop公司的RainDance设备，制备适用于数字化恒温扩增的微反应器，然后采用恒温扩增技术扩增和检测靶分子。相对于数字化PCR，数字化恒温扩增的优势在于该技术仅仅采用单一的扩增温度，其扩增效率更高，特异性也更好。
由上可见，如果有效整合缺口酶、具有链置换活性DNA聚合酶和荧光标记DNA/LNA嵌合引物、数字化恒温扩增的协同作用优势，就能够在较高单一恒定温度条件下通过“切割-延伸-链置换”自主链式循环实现靶分子的数字化恒温指数扩增，并根据引物释放的荧光种类和丰度实现单个检测单元同时检测多种miRNA，有效解决miRNA现有技术瓶颈，实现miRNA的床旁快速检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题提供一种基于寡核苷酸引物的数字化恒温扩增系统，该系统可在恒定温度条件下，能够在较高单一恒定温度条件下通过“切割-延伸-链置换”自主链式循环实现靶分子的恒温指数扩增的数字化恒温扩增与检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
微小RNA的数字化恒温检测方法，包括反应混合物，反应混合物包括以下反应成分：
①具有3'-端羟基的miRNA靶分子；
②上游引物和下游引物；
③DNA聚合酶；
④识别上游引物和下游引物缺口剂识别序列的缺口剂；
⑤三磷酸脱氧核苷酸；
⑥满足上述DNA聚合酶和缺口剂生物学活性的离子与缓冲体系；
采用微流控或微滴化方法，将上述反应液分散至包括微滴或微反应孔在内的若干个微反应器中，每个微反应器中的每种靶分子数少于或等于1个；
所述反应混合物于恒温条件下反应；
所述的上游引物和下游引物是含有缺口剂识别序列的正义链序列，且其5'→3'碱基均依次为锚定序列区、特异性识别miRNA靶分子序列的识别序列区；上游引物和下游引物的锚定序列区与miRNA靶分子无同源性，上游引物、下游引物的识别序列区分别与miRNA靶分子及miRNA靶分子互补链的3'-端序列互补；
且单个微反应器中包括多种miRNA靶分子，但每种靶分子的数量少于或等于一个，与每种miRNA靶分子相对应的上游引物和下游引物还同时标记有荧光报告基团和淬灭基团，荧光报告基团和淬灭基团分别位于缺口剂识别序列的两侧，上游引物、下游引物均为寡核苷酸；
或者，与每种miRNA靶分子相对应的上游引物、下游引物中的其中一个标记有荧光报告基团和淬灭基团，且荧光报告基团和淬灭基团分别位于缺口剂识别序列的两侧，且上游引物、下游引物均为寡核苷酸；
多种miRNA靶分子中每种miRNA靶分子相对应的上游引物、下游引物标记的荧光报告基团种类不同。或者，多种miRNA靶分子中部分不同的miRNA靶分子相对应的上游引物、下游引物标记的荧光报告基团种类相同，但在引物丰度在反应混合物或每个微反应器中的浓度不同。
采用本发明技术方案的微小RNA的数字化恒温检测方法，缺口剂(nickingagent,NA)被用于识别和切割上游引物、下游引物缺口剂识别序列(nickingagentrecognitionsequences,NARS)。当引物的缺口剂识别序列是缺口内切酶识别序列(nickingendonucleaserecognitionsequences,NERS)时，所用缺口剂是识别该缺口内切酶识别序列的缺口内切酶(nickingendonuclease,NE)；当引物的缺口剂识别序列是半修饰限制性内切酶识别序列(restrictionendonucleaserecognitionsequences,RERS)时，所用缺口剂是识别该半修饰RERS的限制性内切酶(restrictionendonuclease,RE)；在反应混合物中，待检测物是含有在本发明中的miRNA靶分子的各种生物样本。
三磷酸脱氧核苷酸，通常包括dCTP、dGTP、dTTP或dATP，在生物DNA合成，以及引物介导的链延伸反应中起原料作用。
本发明的工作原理及有益效果为：上游引物和下游引物是含有缺口剂识别序列的正义链序列，且其5'→3'碱基依次为锚定序列区、特异性识别miRNA靶分子序列的识别序列区。上游引物P1和下游引物P2的识别序列区分别与miRNA靶分子和miRNA靶分子互补链(即：miRNA*)的3'-端序列互补，因此，上游引物和下游引物可分别识别miRNA靶分子或者miRNA靶分子互补链，并具有单碱基变异识别能力；锚定序列区的序列与miRNA靶分子无同源性，不能与miRNA靶分子或miRNA靶分子互补链产生非特异性杂交。在扩增过程中，上游引物P1和下游引物P2锚定序列区可分别与miRNA靶分子和miRNA靶分子互补链的3'-端延伸产物形成稳定的杂交双链，从而使上游引物P1和下游引物P2能够分别“锚定”在miRNA靶分子和miRNA靶分子互补链的3'-端延伸产物端，并且，该“锚定”能够在引物的锚定序列区形成缺口剂识别序列双链核酸分子，从而使缺口剂能够在引物的缺口剂识别序列正义链切割引物，并在DNA聚合酶的协同作用下，不断生成新生DNA链，DNA聚合酶通常是指RNA依赖型DNA聚合酶。因此，当上游引物和下游引物的识别序列区分别识别miRNA靶分子和miRNA靶分子互补链并形成杂交双链后，在DNA聚合酶的作用下，上游引物、下游引物、miRNA靶分子、miRNA靶分子互补链均产生5'→3'方向链延伸，并在上游引物与miRNA靶分子、下游引物与miRNA靶分子互补链之间分别形成两种完整的双链核酸分子，然后，缺口剂在缺口剂识别序列正义链序列处切割上游引物和下游引物。此时，上游引物和下游引物在DNA聚合酶的作用下，分别在缺口处延伸出新生DNA链，该新生DNA链与原有的miRNA靶分子或miRNA靶分子互补链分别互补，即新的miRNA靶分子或miRNA靶分子互补链。这些新的miRNA靶分子或miRNA靶分子互补链在缺口剂和DNA聚合酶的协同作用下不断从缺口处切割-延伸-链置换过程中扩增形成的双链核酸分子中置换出来，触发新一轮的上游引物和下游引物的上述反应，如此循环，实现miRNA靶分子在恒温条件下的指数扩增。在上述过程中，上游引物、下游引物的锚定序列区则因其“锚定”作用而使上述过程能够持续发生。
在本发明中，含有多种miRNA靶分子的反应混合液被分散至包括微滴或微反应孔在内的若干个微反应器中，每个微反应器可以有多种靶分子，但是，每个微反应器中的每种靶分子的数量或拷贝数是少于或等于1个。由于多个种类中的每种miRNA靶分子对应的上游引物和/或下游引物的上分别标记有荧光报告基团，且荧光报告基团的种类不同。当微反应器中的反应混合液中仅存在上游引物和下游引物时，其锚定序列区的荧光报告基团和淬灭基团因FRET作用使各引物均不产生荧光信号；当上游引物、下游引物与miRNA靶分子同时存在时，上游引物、下游引物、miRNA靶分子及其所产生的miRNA靶分子互补链均能在DNA聚合酶的作用下形成完整的双链核酸分子，从而使切口剂能够切割上游和/或下游引物锚定序列区的缺口剂识别序列正义链，此时，锚定序列区荧光报告基团和淬灭基团失去了FRET作用，从而使引物标记的荧光报告基团释放荧光信号，并且，上游引物和/或下游引物的每一次延伸或扩增均能导致新的上游引物和下游引物释放荧光信号。因此，当若干个微反应器中存在多种miRNA靶分子，且与每种miRNA靶分子相对应的上游引物和/或下游引物还标记有荧光报告基团，那么则可实现在单个微反应器中通过反应混合中释放的荧光信号种类确定每个微反应器中是否存在靶分子，并最终通过微反应器释放靶种特定种类荧光信号的数量实现特定miRNA靶分子的绝对定量。
或者，在另一种情况下，为了进一步提高本发明所述方法的检测通量，不同的miRNA靶分子相对应的上游引物和/或下游引物标记的荧光报告基团种类相同，或者，同时使用标记了两种或两种以上不同种类的荧光报告基团，但在不同miRNA靶分子所对应的引物浓度，或者，同种miRNA靶分子标记了不同荧光报告基团所对应的引物浓度在反应混合物或每个微反应器中的浓度不同。在此条件下，在恒温扩增结束后，可根据少数几种不同荧光信号的种类和相对丰度，实现多种miRNA靶分子的平行检测。
进一步，所述的每种miRNA靶分子相对应的上游引物、下游引物中的荧光报告基团和淬灭基团至少设有两种；
所述的标记有荧光基团和淬灭基团的上游引物、下游引物之间的比例为1～5:1～5。
进一步，所述的微反应器采用现有的微流控或微滴化方法制备，每个微反应器的反应液体积可为nL或pL级或fL级。
进一步，所述多个种类的miRNA靶分子相对应的上游引物和/或下游引物的锚定序列区和/或识别序列区掺入衍生核苷酸，衍生核苷酸包括锁核酸、肽核酸或硫代修饰碱基，以进一步提高引物的Tm值和/或特异性。
进一步，所述多个种类的miRNA靶分子相对应的上游引物和/或下游引物的识别序列区中含有与miRNA靶分子互补序列3'-末端倒数第二位和/或第三位碱基错配的核苷酸，以进一步提高识别序列区的特异性；
或者，在所述反应混合物中加入可抑制非特异性扩增的生物活性分子，包括TaqMutS、RecA。
进一步，所述的DNA聚合酶是具有链置换活性的DNA聚合酶；或者所述的DNA聚合酶不具有链置换活性，且在所述反应混合物中加入具有链置换活性的生物活性分子。
进一步，所述的荧光报告基团包括羧基荧光素、六氯荧光素、四氯荧光素、JOE、VIC、异硫氰酸荧光素、吲哚二羧菁、TAMRA或ROX；所述的淬灭基团包括荧光类淬灭剂和非荧光类淬灭剂。
进一步，所述的恒温的反应温度范围为16-70℃。
进一步，所述的恒温的反应温度为37℃、55℃、60℃或65℃。
进一步，所述的反应时间为5-80min。
进一步，所述的反应时间为10min、20min、30min、40min、50min或60min。
名词解释：
“衍生核苷酸(derivatizednucleotide)”是指天然核苷酸之外的其它类型核苷酸，包括锁核酸、肽核酸或硫代修饰碱基。
“非特异性扩增”是指非靶分子导致的扩增。
“靶分子”是指采用本发明所述方法直接或间接检测的物质。
“寡核苷酸(oligonucleotide,ODN)”是指小分子核酸，由核苷酸残基(片段)通过磷酸二酯键(phosphodiester)或其它化学键(如：硫代磷酸酯键(phosphorothioates)连接或聚合而成，分子量介于核酸与核苷酸之间，并倾向于核苷酸。本发明对核苷酸残基的数目并无严格界限。
“新生DNA链”是指引物在DNA聚合酶的作用下延伸合成的DNA分子。
“定性检测”是指检测核酸靶分子是否存在，或者检测靶分子是否存在于待检测物。
“定量检测”是指检测靶分子的浓度，或者检测待检测物中靶分子的浓度，例如，检测待检测物中靶分子的拷贝数。
“缺口”是指双链核酸分子的一条核酸分子链保持完整性，另一条核酸分子链的某两个毗邻核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，从而形成一个缺口。该缺口两侧的核酸分子末端分别是3'-OH和5'-PO4。
“缺口的5'-端核酸分子”是指双链核酸分子缺口处带有3'-OH的核酸分子链。
“切割(nicking)”是指切割完全互补双链核酸分子的一条链，或者是切割部分双链核酸分子的双链区域中的一条链，并且，切割位置位于NARS的特定位置。核酸分子被切割的特定位置在本发明中被称为“缺口位点(nickingsite,NS)”
“缺口剂识别序列(nickingagentrecognitionsequences,NARS)”是指完全或部分双链核酸分子中被缺口剂识别的核苷酸序列。本发明所述NARS包括NERS和半修饰RERS。
“缺口内切酶识别序列(nickingendonucleaserecognitionsequences,NERS)”是指完全或部分双链核酸分子中被缺口内切酶识别的核苷酸序列。
“限制性内切酶识别序列(restrictionendonucleaserecognitionsequences,RERS)”是指完全或部分双链核酸分子中被限制性切切酶(RE)识别的核苷酸序列。
“半修饰限制性内切酶识别序列(hemimodifiedRERS)”是指完全或部分双链核酸分子中一条链的RERS序列中至少含有一个衍生核苷酸(如：疏基-脱氧核苷酸(-thiodeoxynucleotide)，并且，该衍生核苷酸可阻止能够识别该RERS的限制性内切酶切割含有此衍生核苷酸的链(即：在限制性内切酶无法切割其识别序列中含有上述衍生核苷酸的核酸分子链)，而另一条链则在其识别序列的特定位置被切割，从而使限制性内切酶具有与缺口内切酶一样的生物学功能，即：只切割完全或部分双链核酸分子中的一条链。
“缺口剂(nickingagent,NA)”是指可识别完全或部分双链核酸分子的NARS序列，并且，只在NARS序列双链区域的缺口位点切割一条核酸分子链的内切酶。缺口剂包括(但并不限于)缺口内切酶(nickingendonuclease,NE；如：N.BstNBI)、限制性内切酶(restrictionendonuclease,RE；如：HincII)。对于限制性内切酶，只有当完全或部分双链核酸分子含有半修饰RERS时，限制性内切酶才被作为缺口剂使用。
“缺口内切酶(nickingendonuclease；NE)”是指一种能够识别完全或部分双链核酸分子的核苷酸序列，并且，只在相对于其识别序列，即NERS的特定位置切割一条核酸分子链的内切酶。该功能与限制性内切酶不同，限制性内切酶通常需要在完全或部分双链核酸分子的识别序列中至少有一个衍生核苷酸，该衍生核苷酸能阻止限制性内切酶切割含有该衍生核苷酸的核酸分子链，而缺口酶通常识别天然核苷酸，并且，只切割完全或部分双链核酸分子中的一条链。
“NARS正义链序列(sequenceofthesensestrandoftheNARS)”是指完全或部分双链核酸分子中能够被缺口剂切割的NARS序列，该序列含有识别该NARS的缺口剂的缺口位点。
“NARS反义链序列(sequenceoftheantisensestrandoftheNARS)”是指完全或部分双链核酸分子中不能够被缺口剂切割的NARS序列，该序列没有识别该NARS的缺口剂的缺口位点。
“NERS正义链序列(sequenceofthesensestrandoftheNERS)”是指完全或部分双链核酸分子中能够被缺口内切酶切割的NERS序列，该序列含有识别该NERS的缺口剂的缺口位点。
“NERS反义链序列(sequenceoftheantisensestrandoftheNERS)”是指完全或部分双链核酸分子中不能够被缺口内切酶切割的NARS序列，该序列没有识别该NERS的缺口剂的缺口位点。
“半修饰RERS正义链序列(sequenceofthesensestrandofthehemimodifiedRERS)”是指完全或部分双链核酸分子中能够被限制性内切酶切割的RERS序列，该序列含有识别该RERS的缺口剂的缺口位点，其特征是RERS序列均是天然核苷酸。
“半修饰RERS反义链序列(sequenceoftheantisensestrandofthehemimodifiedRERS)”是指完全或部分双链核酸分子中不能够被限制性内切酶切割的RARS序列，该序列没有识别该RERS的缺口剂的缺口位点，其特征是RERS序列中至少含有一个衍生核苷酸(如：巯基-脱氧核苷酸，并且，该衍生核苷酸可阻止能够识别该RERS的限制性内切酶切割此序列。
“微反应器”是指采用分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将含有待检测核酸模板及其它扩增所需成分的反应混合液分散至包括微滴或微反应孔在内的微反应器中，每个微反应器中的核酸模板数少于或等于1个，且包含有扩增核酸模板的足够的扩增反应所需其它成分，包括引物、DNA聚合酶等。
“恒温数字化扩增”是指采用微反应器技术，在恒定温度条件下同时扩增若干个微反应器，并且，经过恒温扩增后，由于每个微反应器中的核酸模板数少于或等于1个，因此，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的微反应器就没有荧光信号，最终，可根据释放荧光信号的微反应器数量实现核酸靶分子的绝对定量。
“恒温条件(isothermalconditions)”是指在扩增过程中，反应温度保持基本恒定的反应条件(即：温度相同，或者，最高温度和最低温度差异不超过20℃的窄温度变化范围)。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明技术方案进一步说明：
图1是本发明中上游引物或者下游引物的典型结构；
图2是本发明指数扩增原理示意图；
图3是本发明检测结果示例图。
具体实施方式
下面将通过具体的例子来进一步阐述本发明方法，但本发明方法并不限于以下有限的例子。对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。
实施例一、数字化恒温扩增方法同时检测两种miRNA靶分子
1.let-7a靶分子特异性引物的设计与合成
SEQNo.1和SEQNo.2分别是扩增miRNA靶分子let-7a的上游引物和下游引物，5'→3'方向的共同序列特征依次是含有Nt.BstNBI切口内切酶NERS正义链序列(即：5'-GAGTC-3')的锚定序列区、特异性识别let-7a(SEQNo.3)及其互补链(SEQNo.4)的识别序列区。其中，上游引物和下游引物的序列识别区分别与miRNA靶分子let-7a(SEQNo.3)及其互补链(SEQNo.4)的3'-末端序列互补，并在识别序列区的部分位置设计有锁核酸(LNA；序列中带有+号的碱基)。上游引物和下游引物在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有端荧光报告分子FAM和淬灭分子BHQ1。除SEQNo.4之外，所有寡核苷酸分子由专业公司合成。
上游引物SEQNo.1(5'→3'方向)
(FAM)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQ1)A+A+C+T+A+TA+CAACC
下游引物SEQNo.2(5'→3'方向)
(FAM)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQ1)T+G+A+GGTAGTAGG
miRNA靶分子SEQNo.3(5'→3'方向)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
miRNA靶分子互补链SEQNo.4(5'→3'方向)
AACTATACAACCTACTACCTCA。
2.miR-105靶分子特异性引物的设计与合成
SEQNo.5和SEQNo.6分别是扩增miRNA靶分子miR-105的上游引物和下游引物，5'→3'方向的共同序列特征依次是含有Nt.BstNBI切口内切酶NERS正义链序列(即：5'-GAGTC-3')的锚定序列区、特异性识别miR-105(SEQNo.7)及其互补链(SEQNo.8)的识别序列区。其中，上游引物和下游引物的序列识别区分别与miRNA靶分子miR-105(SEQNo.7)及其互补链(SEQNo.8)的3'-末端序列互补，并在识别序列区的部分位置设计有锁核酸(LNA；序列中带有+号的碱基)。上游引物和下游引物在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有端荧光报告分子VIC和淬灭分子BHQ1。除SEQNo.4之外，所有寡核苷酸分子由专业公司合成。
上游引物SEQNo.5(5'→3'方向)
(VIC)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQ1)AC+CA+CAG+GAG
下游引物SEQNo.6(5'→3'方向)
(VIC)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQ1)TC+AAAT+GC+TCA
miRNA靶分子SEQNo.7(5'→3'方向)
UCAAAUGCUCAGACUCCUGUGGU
miRNA靶分子互补链SEQNo.8(5'→3'方向)
ACCACAGGAGTCTGAGCATTTGA。
3.血清总RNA的提取
采用商品化总RNA提取试剂盒提取20例人体外周血血清总RNA。
4.数字化恒温指数扩增体系的构建
反应体系共计50μL，该体系包括以下组分：100mMNaCl、50mMTris-HCl、10mMMgCl2、100μg/mlBSA、0.05单位VentR(exo-)DNA聚合酶(NEB)、1.6单位Nt.BstNBI缺口酶(NEB)、50nMSEQNo.1、50nMSEQNo.2、50nMSEQNo.5、50nMSEQNo.6、400μMdNTPs(Promega)、miRNA靶分子。其中，miRNA靶分子分别来自于10amollet-7a(SEQNo.3)、10amolmiR-105(SEQNo.5)、10amollet-7a和miR-105混合液、20例人体外周血血清总RNA等共计四种待检测样本。
5.微反应器的制备
采用商品化RainDrop公司的RainDance微滴制备器，将第4步制备的50μL反应液分散至200万个“油包液滴”形式的微反应器中，每个微反应器中的靶反应器中的同种miRNA数量或拷贝数是少于或等于一个。
6.靶分子的扩增与荧光检测
将第5步制备的“油包液滴”形式的微反应器所在反应管置于热循环仪上扩增，60℃60分钟，反应完毕后，采用商品化RainDrop公司的RainDance微滴检测器，检测FAM和VIC通道阳性的微反应器，并根据其阳性数值实现靶分子的绝对定量检测。
7.结果与分析
7.1数字化恒温扩增的检测原理：数字化恒温扩增是允许扩增来自最小稀释样品单一核酸模板的技术，或者说，是一种基于单分子恒温扩增方法来进行计数的核酸定量方法，是一种绝对定量的方法。该技术的基本前提是采用分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至包括微滴或微反应孔在内的微反应器中，每个微反应器中的核酸模板数少于或等于1个。这样，经过恒温扩增后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的微反应器就没有荧光信号。根据相对比例和微反应器的体积，就可推算出原始溶液的核酸浓度。与传统定量检测方法的不同之处在于，数字化恒温扩增检测通过直接计数的方法，可以实现起始核酸模板的绝对定量。
7.2靶分子10amollet-7a(SEQNo.3)的检测结果：检测结果表明，所有的微反应器均检测不到VIC荧光信号，说明待检测样本中不存在miR-105靶分子。并且，FAM荧光信号阳性的微反应器或微滴的数量是6.28×106，其检测结果与模板的初始量6.23×106极为接近，二者存在略微差异的原因在于人工合成的let-7a(SEQNo.3)模板在其稀释过程中可能存在一些误差。
7.3靶分子10amolmiR-105(SEQNo.5)的检测结果：检测结果表明，所有的微反应器均检测不到FAM荧光信号，说明待检测样本中不存在let-7a靶分子。并且，VIC荧光信号阳性的微反应器或微滴的数量是6.18×106，其检测结果与模板的初始量6.23×106极为接近，二者存在略微差异的原因在于人工合成的let-7a(SEQNo.3)模板在其稀释过程中可能存在一些误差。
7.4靶分子10amolmiR-105(SEQNo.5)和10amolmiR-105(SEQNo.5)混合物的检测结果：检测结果表明，FAM荧光信号阳性的微反应器或微滴的数量是6.28×106，VIC荧光信号阳性的微反应器或微滴的数量是6.18×106，其检测结果分别与第4.1和4.2步分别检测let-7a和miR-105的检测结果一致，并且，约30％的微反应器同时有FAM和VIC荧光信号，说明在此部分反应器中，同时有单拷贝的两种靶分子存在。
4.4临床20例血清样本的检测结果表明，let-7a和miR-105均为阳性，其定量结果分别界于3.18～4.56×105及2.14～3.62×104。
实施例二、数字化恒温扩增同时检测六种miRNA靶分子
1.let-7a靶分子特异性引物的设计与合成
SEQNo.1和SEQNo.2分别是扩增miRNA靶分子let-7a的上游引物和下游引物，5'→3'方向的共同序列特征依次是含有Nt.BstNBI切口内切酶NERS正义链序列(即：5'-GAGTC-3')的锚定序列区、特异性识别let-7a(SEQNo.3)及其互补链(SEQNo.4)的识别序列区。其中，上游引物和下游引物的序列识别区分别与miRNA靶分子let-7a(SEQNo.3)及其互补链(SEQNo.4)的3'-末端序列互补，并在识别序列区的部分位置设计有锁核酸(LNA；序列中带有+号的碱基)。上游引物的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有荧光报告分子FAM和淬灭分子BHQ1。除SEQNo.4之外，所有寡核苷酸分子由专业公司合成。
上游引物SEQNo.1(5'→3'方向)
(FAM)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQ1)A+A+C+T+A+TA+CAACC
下游引物SEQNo.2(5'→3'方向)
CCGATCTAGTGAGTCtgttcttT+G+A+GGTAGTAGG
miRNA靶分子SEQNo.3(5'→3'方向)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
miRNA靶分子互补链SEQNo.4(5'→3'方向)
AACTATACAACCTACTACCTCA。
2.miR-105靶分子特异性引物的设计与合成
SEQNo.5和SEQNo.6分别是扩增miRNA靶分子miR-105的上游引物和下游引物，5'→3'方向的共同序列特征依次是含有Nt.BstNBI切口内切酶NERS正义链序列(即：5'-GAGTC-3')的锚定序列区、特异性识别miR-105(SEQNo.7)及其互补链(SEQNo.8)的识别序列区。其中，上游引物和下游引物的序列识别区分别与miRNA靶分子miR-105(SEQNo.7)及其互补链(SEQNo.8)的3'-末端序列互补，并在识别序列区的部分位置设计有锁核酸(LNA；序列中带有+号的碱基)。下游引物在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有端荧光报告分子VIC和淬灭分子BHQ1。除SEQNo.8之外，所有寡核苷酸分子由专业公司合成。
上游引物SEQNo.5(5'→3'方向)
(VIC)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQ1)AC+CA+CAG+GAG
下游引物SEQNo.6(5'→3'方向)
CCGATCTAGTGAGTCtgttcttTC+AAAT+GC+TCA
miRNA靶分子SEQNo.7(5'→3'方向)
UCAAAUGCUCAGACUCCUGUGGU
miRNA靶分子互补链SEQNo.8(5'→3'方向)
ACCACAGGAGTCTGAGCATTTGA。
3.miR-26a靶分子特异性引物的设计与合成
SEQNo.9是扩增miRNA靶分子miR-26a的上游引物，SEQNo.10和SEQNo.11是扩增miRNA靶分子miR-26a的下游引物，并且，SEQNo.10和SEQNo.11的序列相同。上游引物和下游引物5'→3'方向的共同序列特征依次是含有Nt.BstNBI切口内切酶NERS正义链序列(即：5'-GAGTC-3')的锚定序列区、特异性识别miR-26a(SEQNo.12)及其互补链(SEQNo.13)的识别序列区。其中，上游引物和下游引物的序列识别区分别与miRNA靶分子miR-26a(SEQNo.12)及其互补链(SEQNo.13)的3'-末端序列互补，并在识别序列区的部分位置设计有锁核酸(LNA；序列中带有+号的碱基)。下游引物有两条，分别是在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有端荧光报告分子VIC和淬灭分子BHQ1的SEQNo.10，以及在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有端荧光报告分子VIC和淬灭分子BHQ1的SEQNo.11。除SEQNo.13之外，所有寡核苷酸分子由专业公司合成。
上游引物SEQNo.9(5'→3'方向)
CCGATCTAGTGAGTCtgttcttAG+CC+TAT+CC+TG
下游引物SEQNo.10(5'→3'方向)
(FAM)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQ1)TTC+A+AG+TA+ATC
下游引物SEQNo.11(5'→3'方向)
(VIC)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQ1)TTC+A+AG+TA+ATC
miRNA靶分子SEQNo.12(5'→3'方向)
UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU
miRNA靶分子互补链SEQNo.13(5'→3'方向)
AGCCTATCCTGGATTACTTGAA。
4.miR-16靶分子特异性引物的设计与合成
SEQNo.14和SEQNo.15是扩增miRNA靶分子miR-16的上游引物，并且，二者序列相同；SEQNo.16是扩增miRNA靶分子miR-16的下游引物。上游引物和下游引物5'→3'方向的共同序列特征依次是含有Nt.BstNBI切口内切酶NERS正义链序列(即：5'-GAGTC-3')的锚定序列区、特异性识别miR-16(SEQNo.17)及其互补链(SEQNo.18)的识别序列区。其中，上游引物和下游引物的序列识别区分别与miRNA靶分子miR-16(SEQNo.17)及其互补链(SEQNo.18)的3'-末端序列互补，并在识别序列区的部分位置设计有锁核酸(LNA；序列中带有+号的碱基)。上游引物有两条，分别是在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有端荧光报告分子FAM和淬灭分子BHQ1的SEQNo.14，以及在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有端荧光报告分子VIC和淬灭分子BHQ1的SEQNo.15。除SEQNo.18之外，所有寡核苷酸分子由专业公司合成。
上游引物SEQNo.14(5'→3'方向)
(FAM)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQ1)CG+C+C+A+ATATTTA
上游引物SEQNo.15(5'→3'方向)
(VIC)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQ1)CG+C+C+A+ATATTTA
下游引物SEQNo.16(5'→3'方向)
CCGATCTAGTGAGTCtgttcttTAGC+AG+CA+C+GTA
miRNA靶分子SEQNo.17(5'→3'方向)
UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG
miRNA靶分子互补链SEQNo.18(5'→3'方向)
CGCCAATATTTACGTGCTGCTA。
5.miR-189靶分子特异性引物的设计与合成
SEQNo.19和SEQNo.20是扩增miRNA靶分子miR-189的上游引物，并且，二者序列相同；SEQNo.21是扩增miRNA靶分子miR-189的下游引物。上游引物和下游引物5'→3'方向的共同序列特征依次是含有Nt.BstNBI切口内切酶NERS正义链序列(即：5'-GAGTC-3')的锚定序列区、特异性识别miR-189(SEQNo.22)及其互补链(SEQNo.23)的识别序列区。其中，上游引物和下游引物的序列识别区分别与miRNA靶分子miR-189(SEQNo.22)及其互补链(SEQNo.23)的3'-末端序列互补，并在识别序列区的部分位置设计有锁核酸(LNA；序列中带有+号的碱基)。上游引物有两条，分别是在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有端荧光报告分子FAM和淬灭分子BHQ1的SEQNo.19，以及在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有端荧光报告分子VIC和淬灭分子BHQ1的SEQNo.21。除SEQNo.23之外，所有寡核苷酸分子由专业公司合成。
上游引物SEQNo.19(5'→3'方向)
(FAM)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQ1)AC+TG+A+T+ATCAGC
上游引物SEQNo.20(5'→3'方向)
(VIC)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQ1)AC+TG+A+T+ATCAGC
下游引物SEQNo.21(5'→3'方向)
CCGATCTAGTGAGTCtgttcttTG+C+CT+A+C+TGAG
miRNA靶分子SEQNo.22(5'→3'方向)
UGCCUACUGAGCUGAUAUCAGU
miRNA靶分子互补链SEQNo.23(5'→3'方向)
ACTGATATCAGCTCAGTAGGCA。
6.miR-451靶分子特异性引物的设计与合成
SEQNo.24和SEQNo.25是扩增miRNA靶分子miR-451的上游引物，并且，二者序列相同；SEQNo.26是扩增miRNA靶分子miR-451的下游引物。上游引物和下游引物5'→3'方向的共同序列特征依次是含有Nt.BstNBI切口内切酶NERS正义链序列(即：5'-GAGTC-3')的锚定序列区、特异性识别miR-451(SEQNo.27)及其互补链(SEQNo.28)的识别序列区。其中，上游引物和下游引物的序列识别区分别与miRNA靶分子miR-451(SEQNo.27)及其互补链(SEQNo.28)的3'-末端序列互补，并在识别序列区的部分位置设计有锁核酸(LNA；序列中带有+号的碱基)。上游引物有两条，分别是在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有端荧光报告分子FAM和淬灭分子BHQ1的SEQNo.24，以及在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有端荧光报告分子VIC和淬灭分子BHQ1的SEQNo.25。除SEQNo.23之外，所有寡核苷酸分子由专业公司合成。
上游引物SEQNo.24(5'→3'方向)
(FAM)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQ1)A+ACT+C+A+G+T+A+AT
上游引物SEQNo.25(5'→3'方向)
(VIC)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQ1)A+ACT+C+A+G+T+A+AT
下游引物SEQNo.26(5'→3'方向)
CCGATCTAGTGAGTCtgttctt+A+A+ACCGT+T+ACCA
miRNA靶分子SEQNo.27(5'→3'方向)
AAACCGUUACCAUUACUGAGUU
miRNA靶分子互补链SEQNo.28(5'→3'方向)
AACTCAGTAATGGTAACGGTTT。
7.血清总RNA的提取
采用商品化总RNA提取试剂盒提取20例人体外周血血清总RNA。
8.数字化恒温指数扩增体系的构建
反应体系共计50μL，该体系包括以下组分：100mMNaCl、50mMTris-HCl、10mMMgCl2、100μg/mlBSA、0.05单位VentR(exo-)DNA聚合酶(NEB)、1.6单位Nt.BstNBI缺口酶(NEB)、600μMdNTPs(Promega)、120nMSEQNo.1、120nMSEQNo.2、120nMSEQNo.5、120nMSEQNo.6、120nMSEQNo.9、120nMSEQNo.10、60nMSEQNo.11、120nMSEQNo.14、120nMSEQNo.15、120nMSEQNo.16、60nMSEQNo.19、60nMSEQNo.20、120nMSEQNo.21、60nMSEQNo.24、120nMSEQNo.25、120nMSEQNo.26、miRNA靶分子。其中，miRNA靶分子分别来自于10amollet-7a(SEQNo.3)、10amolmiR-105(SEQNo.5)、10amolmiR-26a(SEQNo.12)、10amolmiR-16(SEQNo.17)、10amolmiR-189(SEQNo.22)、10amolmiR-451(SEQNo.22)、包括let-7、miR-105、miR-26a、miR-16、miR-189、miR-451等六种靶分子各10amol的混合液、20例人体外周血血清总RNA待共计四种待检测样本。
9.微反应器的制备
采用商品化RainDrop公司的RainDance微滴制备器，将第4步制备的50μL反应液分散至200万个“油包液滴”形式的微反应器中，每个微反应器中的靶反应器中的同种miRNA数量或拷贝数是少于或等于一个。
10.靶分子的扩增与荧光检测
将第9步制备的“油包液滴”形式的微反应器所在反应管置于热循环仪上扩增，60℃30分钟，反应完毕后，采用商品化RainDrop公司的RainDance微滴检测器，检测FAM和VIC通道阳性的微反应器，并根据其阳性数值实现靶分子的绝对定量检测。
11.结果与分析
11.1多重数字化恒温扩增检测原理：现有的数字化核酸扩增检测系统均只有两色荧光通道(如：FAM和VIC)，如果单纯地只针对某种基因型标记一种荧光分子的话，会大大降低其检测效率。在本实施例中，对若干个微反应器的荧光强度进行终点检测，即在扩增反应终止后再通过每个微反应器的荧光信号种类和强度判断其基因型，最后，再通过计数特定基因型的微反应器的数量来实现特定基因型的绝对定量。当微反应器中针对不同基因型、但标记了相同荧光报告分子的引物时，由于每个微反应器中的对应基因数量或拷贝数少于或等于一个，因此，只有与该基因匹配的桥式荧光探针对会释放荧光，并且，其荧光强度与其在微反应器，或者说初始反应体系中的浓度成正比，当不同基因的荧光标记引物所用浓度不同时，可通过微反应器所释放的荧光信号强度来判断是哪种基因。另外一种相似情况是，针对某种特定的基因同时使用标记了不同荧光信号、但核酸序列相同的荧光标记引物，在此条件下，可根据某种基因所对应的不同荧光的绝对强度和相对强度，实现不同基因的绝对定量。由上可见，在现有数字化扩增检测系统有限荧光通道的情况下，通过更改不同基因所对应的微反应器荧光标记引物的丰度，可实现多种靶分子的检测。本实施例提供了利用现有两色荧光通道数字化PCR检测系统实现6种靶分子的单管检测，极大地提高了现有数字化恒温扩增系统的检测效率。
11.2靶分子10amollet-7a(SEQNo.3)的检测结果：检测结果表明，所有的微反应器均检测不到VIC荧光信号，并且，FAM荧光信号阳性的微反应器或微滴的荧光强度值均在4000左右，数量是6.28×106，其检测结果与模板的初始量6.23×106极为接近，二者存在略微差异的原因在于人工合成的let-7a(SEQNo.3)模板在其稀释过程中可能存在一些误差。
11.3靶分子10amolmiR-105(SEQNo.5)的检测结果：检测结果表明，所有的微反应器均检测不到FAM荧光信号，并且，VIC荧光信号阳性的微反应器或微滴的荧光强度值均在4000左右，数量是6.18×106，其检测结果与模板的初始量6.23×106极为接近，二者存在略微差异的原因在于人工合成的let-7a(SEQNo.3)模板在其稀释过程中可能存在一些误差。
11.4靶分子10amolmiR-26a(SEQNo.12)的检测结果：检测结果表明，所有具有荧光信号的微反应器或微滴均同时具有FMA和VIC荧光，且二者的荧光强度值分别在4000和2000左右，数量是6.13×106，其检测结果与模板的初始量6.23×106极为接近，二者存在略微差异的原因在于人工合成的let-7a(SEQNo.3)模板在其稀释过程中可能存在一些误差。
11.5靶分子10amolmiR-16(SEQNo.17)的检测结果：检测结果表明，所有具有荧光信号的微反应器或微滴均同时具有FMA和VIC荧光，且二者的荧光强度值分别在4000和4000左右，数量是6.31×106，其检测结果与模板的初始量6.23×106极为接近，二者存在略微差异的原因在于人工合成的let-7a(SEQNo.3)模板在其稀释过程中可能存在一些误差。
11.6靶分子10amolmiR-189(SEQNo.22)的检测结果：检测结果表明，所有具有荧光信号的微反应器或微滴均同时具有FMA和VIC荧光，且二者的荧光强度值分别在2000和2000左右，数量是6.24×106，其检测结果与模板的初始量6.23×106极为接近，二者存在略微差异的原因在于人工合成的let-7a(SEQNo.3)模板在其稀释过程中可能存在一些误差。
11.7靶分子10amolmiR-451(SEQNo.22)的检测结果：检测结果表明，所有具有荧光信号的微反应器或微滴均同时具有FMA和VIC荧光，且二者的荧光强度值分别在2000和4000左右，数量是6.33×106，其检测结果与模板的初始量6.23×106极为接近，二者存在略微差异的原因在于人工合成的let-7a(SEQNo.3)模板在其稀释过程中可能存在一些误差。
11.8靶分子混合液(即：let-7、miR-105、miR-26a、miR-16、miR-189、miR-451等六种靶分子各10amol)的检测结果(图3)：根据反应体系中let-7、miR-105、miR-26a、miR-16、miR-189、miR-451等6种靶分子的荧光标记引物在反应体系中所使用的浓度，其荧光信号阳性的微反应器FAM和VIC通道荧光信号强度的理论比值应当依次是4:0、0:4、4:2、4:4、2:2、2:4。检测结果与上述理论值完全相符，如图3所示，可根据FAM和VIC的相对荧光强度，在单个反应体系中仅仅使用两种荧光标记，实现了6种靶分子的同时检测，其检测结果与第11.2到11.7的检测结果一致，并且，FAM与VIC通道的相对荧光强度值亦与第11.2到11.7的检测结果一致。
11.9临床20例血清样本的检测结果表明，let-7、miR-105、miR-26a、miR-16、miR-189、miR-451等6种靶分子均为阳性，其定量结果分别界于3.18～4.56×105、2.14～3.62×104、2.56～3.67×103、1.25～5.67×105、4.34～6.87×104、3.23～5.87×104。。
实施例三、同时检测两种miRNA靶分子
1.let-7a靶分子特异性引物的设计与合成
SEQNo.29和SEQNo.30分别是扩增miRNA靶分子let-7a的上游引物和下游引物，5'→3'方向的共同序列特征依次是含有Nt.AlwI切口内切酶NERS正义链序列(即：5'-GGATC-3')的锚定序列区、特异性识别let-7a(SEQNo.3)及其互补链(SEQNo.4)的识别序列区。其中，上游引物和下游引物的序列识别区分别与miRNA靶分子let-7a(SEQNo.3)及其互补链(SEQNo.4)的3'-末端序列互补。上游引物在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有端荧光报告分子FAM和淬灭分子BHQ1。除SEQNo.4之外，所有寡核苷酸分子由专业公司合成。
上游引物SEQNo.29(5'→3'方向)
(FAM)CCGATCTAGTGGATCtgtt(BHQ1)cttAACTATACAACC
下游引物SEQNo.30(5'→3'方向)
CCGATCTAGTGGATCtgttcttTGAGGTAGTAGG
miRNA靶分子SEQNo.3(5'→3'方向)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
miRNA靶分子互补链SEQNo.4(5'→3'方向)
AACTATACAACCTACTACCTCA。
2.miR-105靶分子特异性引物的设计与合成
SEQNo.31和SEQNo.32分别是扩增miRNA靶分子miR-105的上游引物和下游引物，5'→3'方向的共同序列特征依次是含有Nt.BstNBI切口内切酶NERS正义链序列(即：5'-GGATC-3')的锚定序列区、特异性识别miR-105(SEQNo.7)及其互补链(SEQNo.8)的识别序列区。其中，上游引物和下游引物的序列识别区分别与miRNA靶分子miR-105(SEQNo.7)及其互补链(SEQNo.8)的3'-末端序列互补，并在识别序列区的部分位置设计有锁核酸(LNA；序列中带有+号的碱基)。下游引物在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有端荧光报告分子VIC和淬灭分子BHQ1。除SEQNo.8之外，所有寡核苷酸分子由专业公司合成。
上游引物SEQNo.31(5'→3'方向)
CCGATCTAGTGGATCtgttcttACCACAGGAG
下游引物SEQNo.32(5'→3'方向)
(VIC)CCGATCTAGTGAGTCtgttcttTCAAAT(BHQ1)GC+TCA
miRNA靶分子SEQNo.7(5'→3'方向)
UCAAAUGCUCAGACUCCUGUGGU
miRNA靶分子互补链SEQNo.8(5'→3'方向)
ACCACAGGAGTCTGAGCATTTGA。
3.血清总RNA的提取
采用商品化总RNA提取试剂盒提取20例人体外周血血清总RNA。
4.数字化恒温指数扩增体系的构建
反应体系共计50μL，该体系包括以下组分：100mMNaCl、50mMTris-HCl、10mMMgCl2、100μg/mlBSA、0.05单位VentR(exo-)DNA聚合酶(NEB)、1.6单位Nt.AlwI缺口酶(NEB)、50nMSEQNo.29、50nMSEQNo.30、50nMSEQNo.31、50nMSEQNo.32、400μMdNTPs(Promega)、miRNA靶分子。其中，miRNA靶分子分别来自于10amollet-7a(SEQNo.3)、10amolmiR-105(SEQNo.5)、10amollet-7a和miR-105混合液、20例人体外周血血清总RNA待共计四种待检测样本。
5.微反应器的制备
采用商品化RainDrop公司的RainDance微滴制备器，将第4步制备的50μL反应液分散至200万个“油包液滴”形式的微反应器中，每个微反应器中的靶反应器中的同种miRNA数量或拷贝数是少于或等于一个。
6.靶分子的扩增与荧光检测
将第5步制备的“油包液滴”形式的微反应器所在反应管置于热循环仪上扩增，37℃30分钟，反应完毕后，采用商品化RainDrop公司的RainDance微滴检测器，检测FAM和VIC通道阳性的微反应器，并根据其阳性数值实现靶分子的绝对定量检测。
7.结果与分析
4.1靶分子10amollet-7a(SEQNo.3)的检测结果：检测结果表明，所有的微反应器均检测不到VIC荧光信号，说明待检测样本中不存在miR-105靶分子。并且，FAM荧光信号阳性的微反应器或微滴的数量是6.28×106，其检测结果与模板的初始量6.23×106极为接近，二者存在略微差异的原因在于人工合成的let-7a(SEQNo.3)模板在其稀释过程中可能存在一些误差。
4.2靶分子10amolmiR-105(SEQNo.5)的检测结果：检测结果表明，所有的微反应器均检测不到FAM荧光信号，说明待检测样本中不存在let-7a靶分子。并且，VIC荧光信号阳性的微反应器或微滴的数量是6.18×106，其检测结果与模板的初始量6.23×106极为接近，二者存在略微差异的原因在于人工合成的let-7a(SEQNo.3)模板在其稀释过程中可能存在一些误差。
4.3靶分子10amolmiR-105(SEQNo.5)和10amolmiR-105(SEQNo.7)混合物的检测结果：检测结果表明，FAM荧光信号阳性的微反应器或微滴的数量是6.28×106，VIC荧光信号阳性的微反应器或微滴的数量是6.18×106，其检测结果分别与第4.1和4.2步分别检测let-7a和miR-105的检测结果一致，并且，约30％的微反应器同时有FAM和VIC荧光信号，说明在此部分反应器中，同时有单拷贝的两种靶分子存在。
4.4临床20例血清样本的检测结果表明，let-7a和miR-105均为阳性，其定量结果分别界于3.18～4.56×105及2.14～3.62×104。
对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。
Claims (12)
1.微小RNA的数字化恒温检测方法，其特征在于：包括反应混合物，
反应混合物包括以下反应成分：
①具有3'-端羟基的miRNA靶分子；
②上游引物和下游引物；
③DNA聚合酶；
④识别上游引物和下游引物缺口剂识别序列的缺口剂；
⑤三磷酸脱氧核苷酸；
⑥满足上述DNA聚合酶和缺口剂生物学活性的离子与缓冲体系；
采用微流控或微滴化方法，将上述反应混合物分散至包括微滴或微反应孔在内的若干个微反应器中，每个微反应器中的每种靶分子数少于或等于1个；
所述反应混合物于恒温条件下反应；
所述的上游引物和下游引物是含有缺口剂识别序列的正义链序列，且其5'→3'碱基均依次为锚定序列区、特异性识别miRNA靶分子序列的识别序列区；上游引物和下游引物的锚定序列区与miRNA靶分子无同源性，上游引物、下游引物的识别序列区分别与miRNA靶分子及miRNA靶分子互补链的3'-端序列互补；
且单个微反应器中包括有多个种类的miRNA靶分子，与每种miRNA靶分子相对应的上游引物和下游引物还同时标记有荧光报告基团和淬灭基团，荧光报告基团和淬灭基团分别位于缺口剂识别序列的两侧，上游引物、下游引物均为寡核苷酸；
或者，与每种miRNA靶分子相对应的上游引物、下游引物中的其中一个标记有荧光报告基团和淬灭基团，且荧光报告基团和淬灭基团分别位于缺口剂识别序列的两侧，且上游引物、下游引物均为寡核苷酸；
多种miRNA靶分子中每种miRNA靶分子相对应的上游引物、下游引物标记的荧光基团种类不同。
2.如权利要求1所述的微小RNA的数字化恒温检测方法，其特征在于：所述的每种miRNA靶分子相对应的上游引物、下游引物中的荧光报告基团和淬灭基团至少设有两种；
所述的标记有荧光基团和淬灭基团的上游引物、下游引物之间的比例为1～5:1～5。
3.如权利要求1所述的微小RNA的数字化恒温检测方法，其特征在于：所述的微反应器采用现有的微流控或微滴化方法制备，每个微反应器的反应液体积可为nL或pL级或fL级。
4.如权利要求1所述的微小RNA的数字化恒温检测方法，其特征在于：所述多个种类的miRNA靶分子相对应的上游引物、下游引物的锚定序列区、识别序列区均引入衍生核苷酸，衍生核苷酸包括锁核酸、肽核酸或硫代修饰碱基。
5.如权利要求1所述的微小RNA的数字化恒温检测方法，其特征在于：所述多个种类的miRNA靶分子相对应的上游引物和/或下游引物的识别序列区中含有与miRNA靶分子互补序列3’-末端倒数第二位和/或第三位碱基错配的核苷酸；
或者，在所述反应混合物中加入可抑制非特异性扩增的生物活性分子，包括TaqMutS、RecA。
6.如权利要求1所述的微小RNA的数字化恒温检测方法，其特征在于：所述的DNA聚合酶是具有链置换活性的DNA聚合酶；
或者所述的DNA聚合酶不具有链置换活性，且在所述反应混合物中加入具有链置换活性的生物活性分子。
7.如权利要求1所述的微小RNA的数字化恒温检测方法，其特征在于：所述的荧光报告基团包括羧基荧光素、六氯荧光素、四氯荧光素、JOE、VIC、异硫氰酸荧光素、吲哚二羧菁、TAMRA或ROX；所述的淬灭基团包括荧光类淬灭剂和非荧光类淬灭剂。
8.如权利要求1至7中任意一项所述的微小RNA的数字化恒温检测方法，其特征在于：所述的恒温的反应温度范围为16-70℃。
9.如权利要求8所述的微小RNA的数字化恒温检测方法，其特征在于：所述的恒温的反应温度为37℃、55℃、60℃或65℃。
10.如权利要求1至7中任意一项所述的微小RNA的数字化恒温检测方法，其特征在于：所述的反应时间为5-80min。
11.如权利要求10所述的微小RNA的数字化恒温检测方法，其特征在于：所述的反应时间为10min、20min、30min、40min、50min或60min。
12.如权利要求1至7、9、11中任意一项所述的微小RNA数字化恒温检测方法的试剂与试剂盒。
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