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Hintergrund
der Erfindung
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Gebiet der
Erfindung
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Diese Erfindung betrifft einen E.
coli Stamm JM83/pKP2, der mit einem neuen Plasmid transformiert worden
ist und betrifft Phytase, die hieraus erzeugt wurde und betrifft
insbesondere einen E. coli Stamm JM83/pKP2, der mit einem neuen
rekombinanten Vektor pKP1 oder pKP2 transformiert wurde, hergestellt durch
Genmanipulation durch Aufklärung
der Gensequenz, die für
die Massenproduktion einer neuen Phytase vorgesehen ist, die ein
Rolle dabei spielt, die Bioverfügbarkeit
von Phosphor in als Tierfutter verwendeten (Getreide-)Körnern zu
verbessern.
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Beschreibung
des Stands der Technik
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Phytase ist ein Enzym, das die Phytinsäure zu Phosphat
und Phosphat-Inositol abbaut. 50%–70% Phosphat in Getreidekörnern, die
als Tierfutter verwendet werden, liegen in Form von Phytinsäure vor,
jedoch liegt Phytase in monogastrischen Tieren wie beispielsweise
Hennen und Mastschweinen nicht vor, wodurch sich eine geringe Phosphat-Verfügbarkeit
ergibt. Weiterhin wurde unverdautes Phytinsäure-Phytat, freigesetzt in
eine Wasserquelle, eine der ernsthaften Umweltkontaminationsquellen
und verursacht in kleinen Seen oder Teichen eine Eutrophisierung.
Weiterhin können
monogastrische Tiere Phytinsäure
in ihrem Dünndarm
aufgrund seiner Chelierung bzw. Komplexbildung mit einer Spurenmenge
von Mineralien, Aminosäuren
und Vitaminen nicht verwerten, die für den Metabolismus von Tierfutter
essentiell sind. Diese gebildeten wasserunlöslichen und unverdaulichen
Chelatkomplexe, die in Form von Faeces freigesetzt werden, sind
für die
Veränderung
des Umweltökosystems
verantwortlich, und induzieren somit eine ernsthafte Umweltverschmutzung.
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Im Hinblick auf diese Situationen
kann die Anwendung von Phytase in Tierfutter die Zufuhr anorganischen
Phosphats aufgrund einer Zunahme der Phosphatbioverfügbarkeit
in Tierfutter reduzieren, wodurch ökonomische Vorteile erzielt
werden. Zusätzlich
kann die verbesserte Verfügbarkeit
von Phosphat und anderer bioaktiver Substanzen ebenfalls viel zur
Reduktion der Kontamination der Umwelt beitragen.
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Insbesondere ist die Verwertung von
Phytase in Tierfutter dahingehend sehr wichtig, als das Gesetz, das
die Menge an Phosphat in Tierabfällen
reguliert, 1996 in Korea eingeführt
wurde und es wurde zusätzlich in
europäischen
Ländern
zur Pflicht den Nährmitteln
von Tieren Phytase zuzusetzen. Weiterhin, wenn Phytase den Nährmitteln
zugesetzt wird, kann es die Produktivität des Tierfutters in großem Maße verbessern,
indem die Verfügbarkeit
einiger bioaktiver Substanzen wie beispielsweise Vitamine und Aminosäuren verbessert wird,
einschließlich
einiger Spurenelemente wie beispielsweise Kalzium- und Zinkionen,
deren Aktivität
durch Chelierung mit negativ geladenem Phytat reduziert wird. Als
solches kann die Verwendung von Nährmitteln, die Phytase im Tierfutter
enthalten, die Verfügbarkeit
von Nährmitteln
verbessern und die Umweltkontamination, die durch Phosphat verursacht
ist, reduzieren.
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Durch die vorher erwähnten Vorteile
wurden intensive Studien bzgl. Phytase, einschließlich der
Wirkungen von Phytase auf Tiere (L. G. Young et al., 1993; X. G.
Lei et al., 1994; Z. Morez et. Al., 1994) hauptsächlich in Europa durchgeführt (A.
H. J. Ullah et al., 1994; K. C. Enrich, 1994; C. S. Piddington,
1993). Weil jedoch Phytase nur eine beschränkte Menge Phosphat spalten
kann und überwiegend
von Pilzen produziert wird, die eine langsame Wachstumsgeschwindigkeit
aufweisen, ist es bzgl. der Massenproduktion nicht ökonomisch.
Es ist zusätzlich
schwierig, Phytinsäure
als Additiv für
monogastrische Tiere zu verwenden, weil dies für ihre physiologischen Eigenschaften
unerwünscht
ist.
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EP
0 420 358 betrifft eine Nukleotidsequenz, die Phytase kodiert.
Die kodierende Sequenz wurde in ein Expressionskonstrukt eingeführt, das
wiederum in einen Vektor eingeführt
wurde, der zum Transformieren eines mikrobiellen Expressionswirtes
in der Lage ist. Die transformierten mikrobiellen Wirte können dazu
verwendet werden, Phytase in industriellem Maßstab ökonomisch zu erzeugen. Die über
EP 0 420 358 erzeugte Phytase
kann in einer Vielzahl von Verfahren verwendet werden, die die Umwandlung
von Phytat zu Inositol und anorganischem Phosphat erfordern.
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EP
0 684 313 betrifft eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid
mit Phytaseaktivität
kodiert, wobei die DNA-Sequenz aus spezifischen Gruppen von Pilzen
gewonnen wird, betrifft Polypeptide, die von solchen DNA-Sequenzen
kodiert werden, Vektoren, die solche DNA-Sequenzen umfassen, Bakterien oder Pilze
oder Hefe-Wirte, die durch solche DNA-Sequenzen oder Vektoren transformiert
wurden, betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids
durch Kultivieren solcher transformierten Wirte und Mischnahrung
bzw. -futter, die ein oder mehrere solcher Polypeptide umfasst.
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WO 94/03612 beschreibt ein hoch effizientes Überexpressionssystem
für Phytase
und pH 2,5 saure Phosphatase in Trichoderma. Dieses System hat Enzymzusammensetzungen
zur Folge, die in der Tiernahrungsindustrie besonders nützlich sind.
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All diese Dokumente betreffen die
Produktion von Phytase durch gentechnische Verfahren. Ein Plasmid
mit einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1, der Mikroorganismus nach
Anspruch 2 ebenso wie die Phytase nach Ansprüchen 3 oder 4 sind in diesen
Dokumenten des Stands der Technik nicht beschrieben oder nahegelegt.
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Die Erfinder und andere haben intensive
Studien zur Überwindung
der obigen Probleme, die mit Phytase verbunden sind, durchgeführt. Als
Folge wurde ein neuer Stamm Bacillus sp. DS-11, der Phytase mit einer ausgezeichneten
Aktivität
und bzgl. der herkömmlichen
Phytase unterschiedlichen Eigenschaften erzeugt, identifiziert und
bei der Korean Collection for Type Cultures im Korea Research Institut
of Bioscience and Biotechnology, angegliedert dem Korean Institut
of Science and Technology (KCTC 0231BP), dem Koreanischen Patent-Stamm-Hinterlegungsinstitut,
hinterlegt. Die obige Patentanmeldung wurde beim koreanischen Amt
für gewerblichen
Rechtsschutz eingereicht (koreanische Patentanmeldung Nr. 96-6817).
Daher wurden verschiedene Eigenschaften einer neuen Phytase, die
aus dem Mikroorganismus produziert wurden, untersucht und als Ergebnis
bewies die neue Phytase eine ausgezeichnete Hitze- und pH-Stabilität.
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Durch die obigen Ergebnisse sequenzierten
die Erfinder und andere im Rahmen der Patentanmeldung die DNA durch
Klonieren einiger Phytase-kodierender Gene im Stamm Bacillus sp.
DS-11, um die Massenproduktion einer neuen Phytase mit den obigen
exzellenten Eigenschaften sicherzustellen. Als Ergebnis wurde die
Phytase-kodierende Gensequenz von Bacillus sp. DS-11 als neu und
vollkommen verschieden von derjenigen von Aspergillus awamori (WO
94-3072A), Aspergillus ficuum (
EP
420358 ,
US 5436156 ),
Aspergillus niger (
EP 420358 )
und Aspergillus terreus (
EP 684313 )
im Vergleich zu den hierin klonierten Genen erkannt. Somit wurde
die Zugangsnummer U85968 (21. Januar 1997) von GenBank von NCBI
in den USA verliehen.
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Als nächstes transformierten die
Erfinder und andere E. coli mit dem Plasmidvektor (pKP1 oder pKP2), der
das Phytasegen von Bacillus sp. DS-11 kodierte und der transformierte
Stamm E. coli JM83/pKP2 wurde bei der Korean Collection for Type
Cultures im Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology,
das mit dem Korea Institute of Science and Technology verbunden
ist (KCTC 0308BP, 28. Januar 1997), dem koreanischen Patent-Stamm-Hinterlegungsinstitut,
hinterlegt.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Es ist deswegen eine Aufgabe der
Erfindung, einen Plasmidvektor pKP1 und pKP2 zur Transformation zur
Massenproduktion von Phytase bereitzustellen, einen hiermit transformierten
Stamm E. coli JM83/pKP2 (KCTC 0308BP) und ein Verfahren zur Massenproduktion
von Phytase aus diesem Stamm bereitzustellen.
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BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1a zeigt
das Subklonieren und die Kartierung von pKP1 durch ein Restriktionsenzym;
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1b zeigt
die Subklonierung und Kartierung von pKP2 durch ein Restriktionsenzym;
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2 zeigt
die Basensequenz und die geschätzte
Aminosäuresequenz
der Phytase DS-11;
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3a zeigt
die relative Aktivität
von Phytase DS-11, erzeugt aus einem transformierten Stamm E. coli JM83/pKP2
bez. Hitze;
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3b zeigt
die relative Aktivität
von Phytase DS-11, erzeugt von einem transformierten Stamm E. coli JM83/pKP2
bez. dem pH.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Diese Erfindung betrifft eine neue
Phytase aus Bacillus sp. DS11, die durch die DNA-Basensequenz der Sequenztabelle 1 oder
durch die Aminosäuresequenz
der Sequenztabelle 2 gekennzeichnet ist.
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Die Erfindung schließt ebenfalls
das Plasmid pKP1 oder pKP2 ein, das die DNA aus Sequenztabelle 1
enthält,
die in einer solchen Weise in E. coli ligiert und exprimiert wird.
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Weiterhin schließt die Erfindung einen neuen
Stamm E. coli JM83/pKP2 (KCTC 0308BP) ein, transformiert mit Plasmid
pKP1 oder pKP2, das das Phytase-kodierende Gen der Sequenztabelle
1 enthält.
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Die Erfindung wird ausführlicher
wie hierin unten dargelegt erklärt
werden.
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Gemäß der Erfindung wird das Phytase-kodierende
Gen, das aus Bacillus sp. DS-11 gewonnen wurde, in den Plasmid-Vektor
pUC19 eingefügt,
um einen neuen rekombinanten DNA-Expressionsvektor
pKP1 oder pKP2 herzustellen. Nach dem Kultivieren von E. coli JM-83,
kloniert durch einen rekombinanten DNA-Expressionsvektor, werden
einige Kolonien mit einer effektiven Expressionstärke ausgewählt und
darauf zur Massenproduktion von Phytase über die Kultivierung solcher
Kolonien verwendet. Weiterhin wird nur pKP1 oder pKP2, der rekombinante
DNA-Expressionsvektor, aus den Kolonien isoliert, um dessen DNA-Sequenz
zu bestimmen.
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Die Erfindung wird ausführlicher
durch die folgenden Schritte erklärt.
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Herstellung der neuen
Plasmide pKP1 und pKP2
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(1) Sequenzieren der N-terminalen
Aminosäuren
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Gereinigtes Phytaseprotein wurde
einer SDS-Polyacrylamidgelelekrophorese (SDS-PAGE) ausgesetzt und
auf eine PVDF-Membran übertragen
(Bio-Rad Lab). Darauf wurde ein Elektroblotting unter Verwendung
von 10 mM CAPS (3-cyclohexylamino-1-propansulfonsäure)-Pufferlösung, die
10% Methanol enthielt unter pH 11,0, 4°C und 400 mA für 45 Stunden,
durchgeführt.
Nach Abspalten nur der erwünschten
Proteinbande wurde diese durch das Edman-Verfahren unter Verwendung
eines Protein/Peptid-Sequenziergerätes [Applied Biosystems model
476A Protein/Peptid Sequenziergerät (Applied Biosystems Inc.,
CA, USA)] analysiert.
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Die N-terminale Aminosäuresequenz
des gereinigten Phytaseproteins ist wie folgt:
Ser-Asp-Pro-Tyr-His-Phe-Thr-Val-Asn-Ala-Ala-X-Glu-Thr-Glu
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(2) Aminosäuresequenzierung
des inneren Peptids
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Gereinigtes Phytaseprotein wurde
zu 70% Ameisensäure
in 1%iger (G/V) Konzentration zugesetzt und unter Zusatz von ungefähr einer
100-fachen Masse von CNBr wurde das Gemisch bei Raumtemperatur für 24 Stunden
umgesetzt. Darauf wurde 100-fach Wasser der reagierenden Lösung zugesetzt
und die Reaktion wurde unterbrochen. Unter Verwendung desselben
Verfahrens wie oben (1) beschrieben wurde eine Elektrophorese zur
Bestimmung der Aminosäuresequenz
des inneren Peptids durchgeführt.
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Die N-terminale Aminosäuresequenz
der inneren Proteinfragmente von Phytase, gespalten mit CNBR;
Ala-X-Asp-Asp-Glu-Tyr-Gly-Ser-Ser-Leu-Tyr
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(3) Herstellung einer
Oligonukleotidsonde
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Eine Oligonukleotidsonde wurde auf
Basis der Aminosäuresequenz
entwickelt, die in dem wie oben (1) und (2) beschriebenen Verfahren
gewonnen wurde und wurde mit einem DNA-Synthetisierer (Applied Biosystems ABI
380B) synthetisiert.
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Mit einem durch das obige Verfahren
synthetisierten Oligonukleotid als Primer und chromosomaler DNA
von DS-11 als Matritzen-DNA ebenso wie mit Taq DNA-Polymerase und
dNTP bei Gebrauch wurde eine Polymerasekettenreaktion (PCR) unter
den folgenden Bedingungen durchgeführt:
- (1)
Denaturierung: 95°C
für eine
Minute
- (2) Annealing: 50°C
für eine
Minute
- (3) Polymerisierung: 72°C
für eine
Minute
- (4) Post-Elongation: 72°C
für 7 Minuten.
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Unter den obigen Bedingungen wurde
die PCR durchgeführt
und es folgte eine 1,5% Agarose-Gel-Elektrophorese zur Gewinnung
eines 600-bp PCR Produktes. Nach der Gewinnung des PCR Produktes
aus dem Gel wurde es als Sonde verwendet.
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Die Oligonukleotidsonde basierte
auf der N-terminalen Aminosäuresequenz;
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Oligonukleotidsonde auf Grundlage
der N-terminalen Aminosäuresequenz
von inneren Proteinfragmenten;
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(4) Hybridisierung von
genomischer DS-11-DNA
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Chromosomale DNA, gewonnen aus Bacillus
sp. DS-11, wurde durch das Marmur-Verfahren isoliert (Marmur J.
1961, Mol Biol. 3, 208). Um sicherzustellen, ob die durch das obige
Verfahren (3) hergestellte Oligonukleotidsonde beim Screening einer
genomischen Bibliothek geeignet war, wurde genomische DNA, die mit
mehreren Restriktionsenzymen gespalten war, auf eine Agarose-Gel-Elektrophorese
aufgebracht und darauf auf eine Nylonmembran übertragen. Darauf wurde unter
DIG-DNA-Markierung und mit einem Nachweiskit (Boehringer Mannheim,
Deutschland) ebenso wie mit 600-bp DNA-Fragmenten als Sonde, die
durch das obige Verfahren (3) synthetisiert wurden, eine Southern-Hybridisierung
durchgeführt.
Als Folge wurde bestätigt, dass,
wenn HindIII, ClaI und PstI aufgebracht wurden, das Gen bei 2,2
kb, 4 kb und 6 kb jeweils ein positives Signal zeigt. Wenn die genomische
Bibliothek von Bacillus sp. DS-11 hergestellt wurde, wurde deswegen
das Restriktionsenzym HindIII verwendet.
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(5) Screening für das Phytase-kodierende
Gen
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Chromosomale DNA von Bacillus sp.
DS-11 wurde mit HindIII gespalten und darauf wurden 3–5 kb DNA-Fragmente
gescreent. Solche DNA-Fragmente wurden ebenfalls mit HindIII gespalten,
in Vektor pUC19 ligiert, der mit Phosphatase (CIP) behandelt wurde
und in die kompetente E. coli JM83 eingebracht. Ein solcher transformierter
Stamm wurde in LB (Luria-Bertani)
Platten, die 100 μg/ml
Ampicillin enthielten, bei 37°C
für 16 Stunden
kultiviert und auf die Nylonmembran übertragen. Weiterhin unterlag
der Stamm einer Kolonie-Hybridisierung
mit einer DNA-Oligonukleotidsonde, die durch das obige Verfahren
(3) synthetisiert wurde, um einige Kolonien auszuwählen, die
das Signal repräsentieren.
Um zu identifizieren, ob das Phytasegen von Bacillus sp. DS-11 in
geeigneter Weise in den Wirt eingebracht worden war, wurde die Phytaseaktivität durch
das Fiske-Verfahren gemessen (Fiske C. H. und Subbarow Y. P., J.
Biol. Chem. 1925, 66, 375). Als Ergebnis konnten 2 Kolonien mit
dem Signal unter 10.000 Kolonien gewonnen werden. Sie wurden kultiviert
und darauf wurden Plasmide mit einer Größe von 4,9 kb gebunden durch
eine 2,2 kb Insert-DNA isoliert. Ein solches Plasmid wurde als pKP1
bezeichnet. Zusätzlich
wurde sichergestellt, dass das in pKP1 enthaltene Phytasegen in
geeigneter Weise eingefügt
war, indem die Expressionsstärke
von Phytase gemessen wurde.
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(6) Kartierung und Subklonierung
unter Verwendung eines Restriktionsenzyms
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Als Folge der Spaltung von 4,9-kb
pKP1 mit mehreren Restriktionsenzymen wurde bestätigt, dass einige Restriktionsstellen
von EcoRI, BamHI, NdeI, HincII und EcoRV innerhalb der 2,2-kb Insert-DNA
existierten. Um die Gene herauszufinden, die nur für die Leistungsfähigkeit
der Enzymexpression notwendig waren, wurde ein Subklonieren des
pKP1-Plasmids durchgeführt
(1a). pKP1 und pUC19
wurden jeweils mit HindIII und NdeI gespalten, miteinander verbunden.
Ein solcher Plasmidvektor wurde in E. coli JM83 eingebracht, so
dass E. coli JM83 mit 4,4-kb pKP2, das 1,7-kb Insert-DNA enthielt,
gewonnen werden konnte (1b).
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Transformationsverfahren
des Stammes
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Die chromosomale DNA von Bacillus
sp. DS-11 wurde mit HindIII gespalten und dann wurden 3–5 kb DNA-Fragmente
ausgewählt.
Solche DNA-Fragmente wurden ebenfalls mit HindIII gespalten, an
Vektor pUC19 ligiert, mit Phosphatase (CIP) behandelt, um ein neues
Plasmid pKP1 oder pKP2 zu erzielen. Um ein solche Plasmid in Phytase
zu exprimieren wurde es in die kompetente E. coli JM83 als Wirt
eingebracht. Somit wurde der transformierte Stamm als E. coli JM83/pKP2
benannt und bei der Korean Collection for Type Cultures im Korea
Research Institut of Bioscience and Biotechnology, das mit dem Korean
Institut of Science and Technology (KCTC 0231BP) verbunden ist,
am 28. Januar 1997 hinterlegt (Zugangsnummer: KCTC 0308BP).
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Die bakteriologischen, kulturbezogenen
und mikrobiologischen Eigenschaften des transformierten Stammes
wurden untersucht und alle Ergebnisse waren dieselben wie diejenigen
von E. coli außer
der Produktionsfähigkeit
von Phytase.
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Isolierung und Reinigung
von Phytase, die aus dem transformierten Stamm erzeugt wurde
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Der neue Stamm E. coli JM83/pKP2
der so transformiert wurde, wurde in LB-Flüssigmedium,
das 100 μg/ml
Ampicillin enthielt, bei 37°C
kultiviert, wurde zentrifugiert und wiedergewonnen. Der wiedergewonnene Mikroorganismus
wurde in Tris-Pufferlösung
(10 mM, pH 7,0) gelöst,
die 5 mM CaCl2 enthielt und für 1 Stunde unter
Verwendung eines Sonifier 450 beschallt. Darauf wurde der beschallte
Mikroorganismus erneut zentrifugiert und dessen Überstände wurden als Rohenzymlösung verwendet.
Das mit 50% gesättigte
Protein wurde auf einer Fast-Protein-Liquid-Chromatography (FPLC,
bestehend aus einer offenen Säule
aus Phenylsepharose CL-4B und Resource S superose 12HR 10/30 Säule) isoliert,
und dadurch konnte dasselbe Enzym wie Phytase, erzeugt vom Bacillus
sp. DS-11 vor der Genmanipulation isoliert werden.
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Messung der Wirkstärke der
Phytase, die aus dem transformierten Stamm erzeugt wurde
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(1) Messung der Phytasestärke
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Der neue Stamm E. coli JM83/pKP2
der so transformiert wurde, wurde in LB Agar (Luria-Bertani) Platten,
die 100 μg/ml
Ampicillin enthielt, bei 37°C
für 16
Stunden transformiert und auf die Nylonmembran übertragen. Der Stamm wurde
einer Kolonie-Hybridisierung mit einer DNA-Oligonukleotidsonde unterzogen,
die wie oben (3) synthetisiert wurde, um die Kolonien zu überprüfen, die
das Signal repräsentieren.
Um sicherzustellen, ob das Phytasekodierende Gen von Bacillus sp.
DS-11 in geeigneter Weise in E. coli JM83 eingebracht war, wurde
die Phytase-Wirkstärke
durch das Fiske-Verfahren gemessen (Fiske C. H. und Subbarow Y.
P., J. Biol. Chem. 1925, 66, 375). Als Ergebnis wurden die transformierten
Stämme
mit einer vollständigen
enzymatischen Aktivität
ausgewählt.
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(2) Vergleich der Aktivität und Stabilität von Phytase
bzgl. Hitze und pH, einschließlich
ihres Molekulargewichtes
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Um sicherzustellen, ob die aus dem
transformierten Stamm E. coli JM83/pKP2 erzeugte Phytase dieselbe
wie diejenige Phytase war, die aus dem Originalstamm erzeugt wurde,
wurde die Aktivität
und Stabilität bzgl.
Hitze und pH der Phytase verglichen. Um ihre Stabilität bzgl.
Hitze zu messen, wurde jede Phytase bei einer vorherbestimmten Temperatur
für 10
Minuten im selben Verfahren belassen und darauf wurde die Restaktivität gemessen.
Wie in 3a dargestellt
begann die Aktivität
der Phytase sich bei 40°C
zu reduzieren, wenn Kalziumionen (Ca2+)
nicht der Phytase enthaltenden Lösung
zugesetzt wurden, wohingegen im Falle des Zusetzens von 5 mM Kalziumionen
sie bis auf 70°C
stabilisiert wurde und ihre Aktivität wurde sogar bei 90°C bei 50%
erhalten.
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Ebenfalls zeigt 3b, dass die Phytaseaktivität vom pH
abhängt
und der optimale pH beider Phytasen beträgt 7,0. Um weiter ihre Stabilität bzgl.
des pH zu identifizieren wurde jede Phytase bei unterschiedlichen
Werten des pHs für
eine Stunde belassen, gefolgt von einer Messung ihrer Restaktivität in jedem
Fall. Sogar bei sauren Bedingungen von weniger als pH 4 zeigten
beide Phytasen eine signifikante enzymatische Aktivität und es
wurde somit angenommen, dass sie im Magen stabilisiert werden können.
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Abgesehen davon wiesen beide Phytasen
dasselbe Molkulargewicht von 43.000 Dalton auf.
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Aufgrund der obigen Ergebnisse wurde
angenommen, dass die aus den transformierten Stämmen erzeugte Phytase dieselbe
war wie diejenige, die aus dem ursprünglichen Stamm erzeugt wurde
(Bacillus sp. DS-11).
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DNA-Sequenzierung
des Phytase-kodierenden Gens
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Um eine 1,7-kb Insert-DNA innerhalb
von pKP2 zu sequenzieren wurden nach Deletion Subklone unterschiedlicher
Größen auf
Grundlage der Restriktionsstelle gewonnen. Das DNA-Fragment des Gesamt-1,7-kb
wurde aus diesen mit PCR hergestellt, unter Verwendung von Vorwärts- und
Rückwärtsprimern. Darauf
wurde der Open Reading Frame (ORF = offenes Leseraster) von Phytase,
das aus 1.149 Nukleotiden (383 Aminosäuren) bestand, unter Verwendung
eines MacMolly 3,5-Programmes sequenziert und es wurde als Ergebnis
sichergestellt, dass die obige Phytase mit der N-terminalen Aminosäure von
Phytase (15 Aminosäuren) übereinstimmte,
die aus dem Bacillus sp. DS-11 Stamm isoliert wurde (2). Es wurde weiterhin angenommen,
dass dies eine neue Phytase war, die von derjenigen, die aus den
herkömmlichen
Aspergillus sp.-Stämmen
erzeugt wurde, vollkommen verschieden war. Als Folge der Untersuchung
ihrer Aminosäuresequenz
ergab sich eine Übereinstimmung
von 80% zwischen 175 Aminosäuren
des C-Terminus dieser Erfindung und des Operon-Gens, das durch das
Sporulation Regulatory Protein von Bacillus Subtilis reguliert wurde.
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Sequenztabelle 1 (SEQ.
ID NO: 1)
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- Sequenzlänge:
1.149
- Sequenztyp: Nukleinsäure
- Anzahl der Ketten: Doppelhelix
- Form: linear
- Sequenztyp: genomische DNA
- Ursprung:
Name der Spezies: Bacillus sp.
Name des
Stammes: DS-11
- Merkmale der Sequenz:
Signal, das die Merkmale repräsentiert:
CDS
Ort des Vorliegens: 377..1526
Verfahren zur Bestimmung
der Merkmale: E
Signal, das die Merkmale repräsentiert:
sig peptide
Ort des Vorliegens: 377..466
Verfahren zur
Bestimmung der Eigenschaften: E
Signal, das die Eigenschaften
repräsentiert:
mat peptide
Ort des Vorliegens: 467..1526
Verfahren zur
Bestimmung der Eigenschaften: E
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Sequenztabelle 2 (SEQ.
ID NO: 2)
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- Sequenzlänge:
383
- Sequenzform: Aminosäure
- Form: linear
- Sequenztyp: Protein
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Die Erfindung weist bzgl. der Herstellung
von Phytase in großem
Maßstab ökonomische
Vorteile auf, weil ein rekombinanter DNA-Expressionsvektor unter
Verwendung der Sequenzen von DNA und Aminosäure in einer solchen Weise
hergestellt wird, wie es im obigen dargelegt wurde und in andere
lebende Organismen mit einer raschen Wachstumsrate eingebracht werden
kann und leicht regulierbar ist, um Phytase mit einer ausgezeichneten
Aktivität
und Eigenschaften zu erzeugen.
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