DE69810906T2

DE69810906T2 - Optisch aktive 2-amino-tetraline, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische zusammensetzungen die diese enthalten und die nützlich sind zur vorbeugung und behandlung von septischem schock

Info

Publication number: DE69810906T2
Application number: DE69810906T
Authority: DE
Inventors: Piero Foresta; Piero Moretti
Original assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Current assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Priority date: 1997-02-03
Filing date: 1998-01-28
Publication date: 2003-11-13
Anticipated expiration: 2018-01-29
Also published as: DE69810906D1; WO1998033762A1; EP0968174B1; IT1290910B1; DK0968174T3; HK1025558A1; ES2190581T3; ITRM970050A1; US6225501B1; EP0968174A1; PT968174E; JP2001509802A; ATE231486T1

Description

Die Erfindung betrifft S(-)-2-Amino-6-fluor-7-methoxytetralin, ein Verfahren zu dessen Herstellung und pharmazeutische Zusammensetzungen umfassend desselben als aktiven Bestandteil.
S(-)-2-Amino-6-fluor-7-methoxytetralin sowohl als freie Base als auch als pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist mit starker therapeutischer Aktivität für die Behandlung von septischem Schock ausgestattet.
Septischer Schock ist ein klinisches Syndrom, das auf schwere Infektionen folgen kann, die durch sowohl Gram-negative als auch Gram-positive, durch Protozoen oder durch Viren verursacht wird und ist durch Leukozytose, Fieber, Tachykardie, niedrigen Blutdruck und Niereninsuffizienz, Ateminsuffizienz, Herzinsuffizienz und Niereninsuffizienz gekennzeichnet. Es ist jedoch hervorzuheben, daß der Schweregrad des septischen Schocks unabhängig vom Typ des Mikroorganismus ist, der für das Syndrom verantwortlich ist (Parillo J. E., Pathogenetic mechanisms of septic shock, New Engl. J. Med., 328: 1471-1477, 1993) sondern vielmehr vom Ausmaß der einzelnen entzündlichen Reaktion auf das Agens das für den toxischen Anfall verantwortlich ist, abhängt.
Obgleich eine erhebliche Verbesserung bei der Antibiotikum-Therapie und Behandlungsprotokollen auf Intensivstationen über die letzten Jahre zu verzeichnen ist, bleibt der septische Schock eine der Hauptursachen für Morbilität und Mortalität bei sich im Krankenhaus aufhaltenden Patienten. Es wird geschätzt, daß in der Tat in den Vereinigten Staaten er für viel mehr als 100 000 Tote pro Jahr verantwortlich ist (Glauser M. P., Zanetti G., Baumgartner J. D. und Cohen J., Septic shock: pathogenesis, Lancet 338: 732-736, 1991).
Der entscheidende und am meisten Einfluß nehmende Faktor bei septischem Schock ist die Reaktion des Körpers auf Produkte, die von der Lyse oder mikrobiellem Stoffwechsel abstammen.
Unter solchen Substanzen ist das als erstes identifizierte und am häufigsten in der experimentellen Forschung verwendete das Lipopolysaccharid (LPS), das in den Wänden von Gram-negativen Bakterien vorhanden ist und chemisch aus einem Polysaccharid-Anteil, der sich nach der bakteriellen Art unterscheidet, und einem konstanten Lipid-Anteil (Lipid A) besteht, und das in der mikrozellulären Form im Blut von septichemischen Patienten nachweisbar ist. Bei der Verabreichung an experimentelle Tiere kann LPS alle kardiozirkulären und neurologischen Symptome erzeugen, die bei Schock zutreffen (Olson N. C., Salzer W. L., McCall C. E., Biochemical, physiological and clinical aspects of endotoxiemia, Molec. Aspects Medl, 10: 511-629, 1988). Es kann daher als "Hauptbeweger" in der Kette von Vorgängen angesehen werden, die über die Aktivierung der intrinsischen und extrinsischen Wege der koagulierenden Kaskade und der Absonderung von Cytokinen wie TNF, IL-1 und g-INF (Bone R. C., A critical evaluation of new agents for the treatment of sepsis, J. Am. Med. Ass., 266: 1686-1691, 1991) die klinische Symptome auslösen.
Die zunehmende Bedeutung dieses Syndroms, seine Schwere und die inadequaten therapeutischen Mittel, die derzeit zur Verfügung stehen, machen die schnelle Entdeckung therapeutischer Mittel, die wirksam das Fortschreiten der Krankheit bekämpfen zu einem sehr wünschenswerten Ziel.
Der methodologische Ansatz, der am meisten eingesetzt wird, um die mögliche schützende Wirkung einer Substanz bei septischen Schock in preklinischen Untersuchungen zu beurteilen, ist die Verwendung experimenteller Modelle, die die Intoxikation durch eine toxische Substanz (ein Endo- oder Exotoxin), die direkt in das Labortier injiziert wird oder die in massiven Mengen von infizierten Zellen, mit denen das Tier geimpft ist, freigesetzt werden, umfaßt.
2-Aminotetraline, die bei der Behandlung von septischem Schock aktiv sind, sind bereits bekannt. EP-A-0 730 861, das hier durch Referenz einbezogen wird, und von den gleichen Anmeldern wie den Anmeldern der vorliegenden Anmeldung eingereicht wurde, offenbart eine Klasse solcher 6,7-substituierten 2-Aminotetraline und insbesondere die racemische Verbindung (R,2)-2-Amino-6-fluor-7-methoxytetralin (ST 626).
Es ist jetzt festgestellt worden, daß das Enantiomer S(-)-2-Amino-6- fluor-7-methoxytetralin eine wirksamere Aktivität als das Racemat (R,S)-2- Amino-6-fluor-7-methoxytetralin (ST 626) zur Behandlung von septischem Schock entfaltet.
S(-)-2-Amino-6-fluor-7-methoxytetralin kann sowohl als freie Base mit der Formel:
als auch als Salz mit der Formel:
wobei X&supmin; das einwertige Anion eines pharmakologisch annehmbaren Salzes ist.
Unter pharmakologisch annehmbaren Salzen von S(-)-2-Amino-6-fluor-7- methoxytetralin sind jedes Salz mit einer Säure zu verstehen, das nicht zu ungewünschten Nebenwirkungen führt. Solche Säuren sind Pharmakolisten und Experten in der Pharmazie und pharmazeutischen Technologie wohlbekannt.
Nicht-einschränkende Beispiele solcher Säuren sind Chlorid, Bromid, Orotat, Säureaspartat, Säurecitrat, Säurephosphat, Fumarat und Säurefumarat. Lactat, Maleat und Säuremaleat, Säureoxalat, Säuresulfat, Gloucosesulfat, Tartrat und Säuretartrat.
Ein Verfahren zur Herstellung von S(-)-2-Amino-6-fluor-7- methoxytetralin als freie Base oder als ein pharmazeutisch annehmbares Salz wird in dem folgenden Reaktionsschema veranschaulicht:
worin X&supmin; das einwertige Anion eines pharmakologisch annehmbaren Salzes ist.
Das Verfahren umfaßt die folgenden Schritte:
(a) Herstellen eines Anhydrids 1 durch Suspendieren von L(+)-Aspartinsäure in CF&sub3;COOH, Zugeben von kaltem Trifluoressigsäureanhydrid (z. B. bei -20ºC) und anschließend Erwärmen der resultierenden Mischung unter Rückflußtemperatur bis die Reaktion beendet ist. Dann Trockenwerdenlassen desselben und wiederholtes Waschen des Rückstandes unter Rühren mit einem organischen Lösungsmittel, das es nicht auflöst;
(b) Kondensieren des Anhydrid 1 mit einem Überschuß an 2-Fluoranisol (1,5-3 mol) in der Gegenwart von AlCl&sub3;, heftiges Rühren unter Erwärmung (40-60ºC), 40 bis 50 Stunden, unter Erhalt der Säure 2. Zur Erleichterung des Rührens kann ein Lösungsmittel (z. B. CH&sub2;Cl&sub2;) zugegeben werden. Der so erhaltene Feststoff wird abfiltriert, unter Kühlen (0ºC-8ºC) mit konzentrierter HCl (z. B. 6 M) behandelt, die saure wäßrige Phase wird mit einem Lösungsmittel extrahiert (z. B. Ethylether), die organische Phase wird zur Trockenheit gebracht und die Verbindung 2 wird durch Kristallisierung gereinigt;
(c) Reduzieren der Säure 2 durch Auflösen mit CF&sub3;COOH, Abkühlen der so erhaltenen Lösung auf 0 bis 8ºC, Zugeben einer überschüssigen Triethylsilan-Menge (z. B. 6 M) und vorsichtiges Erwärmen der Mischung auf die Rückflußtemperatur bis die Reaktion beendet ist (ungefähr 4 Stunden). Die Reaktionsmischung wird zur Trockenheit gebracht, der ölige Rest wird mit einer alkalischen wäßrigen Lösung (pH 10) gelöst, der nicht-gelöste oder ungelöste Rest wird abfiltriert, das Filtrat wird angesäuert (pH 3) und das Produkt wird mit einem ausfällenden Lösungsmittel (z. B. CH&sub2;Cl&sub2;) extrahiert, das Produkt wird zur Trockenheit gebracht und durch Kristallisierung unter Erhalt der Verbindung 3 gereinigt;
(d) Herstellen von Tetralon 4 aus der Verbindung 3 durch Kondensieren über Friedel-Crafts-Reaktion mit PCl&sub5; und AlCl&sub3; in einem inerten wasserfreien organischen Lösungsmittel;
(e) Reduzieren von Tetralon 4 durch Suspendieren desselben in Boroetherattrifluorid und Zugeben einer überschüssigen Triethylsilan-Menge (Molverhältnis: 3-6) bei 0 bis 8ºC und Ablaufen der Reaktion bei Raumtemperatur bis die Reaktion beendet ist (60-90 Stunden), Zugeben einer wäßrigen alkalischen Lösungsmittel (pH 9), Extrahieren der wäßrigen Phase mit einem Lösungsmittel, zur Trockenheit bringen und Reinigen durch Kristallisierung unter Erhalt der Verbindung 5;
(f) Hydrolysieren der Verbindung 5 mit einer wäßrigen alkalischen Lösung, Extrahieren mit einem Lösungsmittel (z. B. Ethylether), zur Trockenheit bringen und Reinigen durch Kristallisierung des so erhaltenen S(-)-2- Amino-6-fluor-7-methoxytetralins;
(g) um wahlweise ein Tetralinsalz zu bilden (z. B. als Hydrochlorid), Auflöse n der Verbindung 6 in einem organischen Lösungsmittel (z. B. CH&sub3;OH, Ethylether), Ansäuern mit der gewünschten H&supmin;X&supmin;-Säure und Zur Trockenheit bringen und wahlweise Reinigen der Verbindung durch Kristallisierung.
Unter Bezugnahme auf das vorhergehende Reaktionsschema wird die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung (als Hydrochlorid) hiernach beschrieben.

Beispiel

Herstellung von S(-)-2-Amino-6-fluor-7-methoxytetralinhydrochlorid (ST 1214)

a) Herstellung von S(-)-Trifluoracetylasparaginanhydrid 1

L(+)-Asparaginsäure (100 g, 0,75 mol) wurde in Trifluoressigsäure (300 ml) suspendiert, die resultierende Suspension wurde unter Rühren beibehalten und auf -20ºC mit einem Eis/Salzbad gekühlt. Trifluoressigsäureanhydrid (300 ml, 2,16 mol) wurde langsam unter Rühren zugegeben. Die Mischung wurde anschließend bei 45ºC über Nacht vorsichtig refluxiert.
Nachdem die Reaktion beendet war, wurde die Mischung in einem Verdampfer vollständig zur Trockenheit gebracht und der feste Rückstand wurde dreimal unter Rühren mit Hexan gewaschen, jedes Mal das Hexan durch Abgießen entfernt, der Rückstand wurde anschließend vollständig zur Trockenheit gebracht. Schließlich wurde der Rückstand unter Rühren mit Hexan-Ethylether pulverisiert, die resultierende Mischung wurde filtriert und der Rückstand wurde unter Vakuum getrocknet. 150 g der Verbindung 1 wurden erhalten (Ausbeute 95%).
Smp. = 140-142ºC.
[α]D = -40,7º (c = 1% MetOH); Analyse: entsprechend.

b) Herstellung von S(+ )-4-(3-fluor-4-methoxyphenyl)-4-oxo-2(Ntrifluoracetyl)aminobutansäure 2

S(-)-Trifluoracetylasparaginanhydrid (150 g; 0,712 mol) wurde in 2-Fluoranixol (300 ml), 2,67 mol) suspendiert, die resultierende Mischung wurde heftig gerührt und anschließend wurde langsam wasserfreies Aluminiumchlorid (240 g, 1,57 mol) portionsweise zugegeben. Nach Abschluß der Zugabe wurde die Mischung unter heftigem Rühren bei 40 bis 45ºC 24 Stunden gehalten. Wasserfreies CH&sub2;Cl&sub2; und weitere 60 g AlCl&sub3; wurden zugegeben und die Reaktionsmischung wurde unter Rühren weitere 48 Stunden beibehalten.
Der feste Rückstand wurde anschließend mit 1 l CH&sub2;Cl&sub2; durch Zerkleinern unter Rühren behandelt. Das Methylenchlorid, das den Überschuß von Fluoranisol enthält, wurde getrennt. Der feste Rückstand wurde abfiltriert und portionsweise zu 2 l 6 M HCl, die heftig gerührt wurden, gegeben. Am Ende der Zugabe wurde die Mischung 30 Minuten gerührt. Die Säurephase wurde anschließend mit Ethylether extrahiert. Die Ether-Phasen wurden zusammengetan, mit Wasser gewaschen, über wasserfrei Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und anschließend zur Trockenheit gebracht. Ein roher fester Rückstand wurde erhalten, der aus 1 : 1 AcOEt/Hexan kristallisiert wurde. 188 g der Verbindung 2 wurden erhalten (Ausbeute 78,3%):
Smp. = 113-115ºC.
[α]D = +27,5º (c = 1% MetOH); Analyse: entsprechend.

c) Herstellung von S(+ )-4-(3-Fluor-4-methoxyphenyl)-2-(N-trifluoracetyl)aminobutansäure 3

Die Verbindung 2 (100 g, 0,297 mol) wurde in Trifluoressigsäure (500 ml) aufgelöst. Die resultierende Lösung wurde auf 0ºC gekühlt und Triethylsilan (300 ml, 1,89 mol) wurde langsam zugegeben. Nach Abschluß der Zugabe wurde die Mischung langsam auf ihren Siedepunkt gebracht und bei der Siedetemperatur 4 Stunden gehalten. Die Mischung wurde anschließend in einem Verdampfer vollständig zur Trockenheit gebracht, der Rest wurde zweimal mit Ethylether gewaschen, jedes Mal wurde die Mischung zur Trockenheit gebracht, um vollständig die Trifluoressigsäure zu entfernen. Der so erhaltene ölige Rückstand wurde auf -20ºC mit einem Eis/Salzbad gekühlt und anschließend unter Rühren mit einer NaHCO&sub3;-gesättigten Lösung, deren pH auf 10 mit 4 N NaOH eingestellt wurde, behandelt. Die alkalische Endphase wurde vorsichtig auf den pH 3 mit 6 N HCl bei 0ºC angesäuert, Ein Präzipitat wurde erhalten, das wiederholt mit CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert wurde. Die organischen Extrakte wurden zusammengetan, mit einer kleinen Wassermenge gewaschen, über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockenheit gebracht. Der ölige Rest wurde in einer kleinen Ethylacetat-Menge gelöst und mit Hexan unter Rühren ausgefällt. Die Mischung wurde über Nacht gerührt, filtriert und der Rest wurde getrocknet. 72 g der Verbindung 3 wurden erhalten (Ausbeute 75%).
Smp. = 113-115ºC.
[α]D = +11,3º (c = 1% MetOH); Analyse: entsprechend.

d) Herstellung von S(-)-(N-Trifluoracetyl)amino-6-fluor-7-methoxy- 1-tetralon 4

Die Verbindung 3 (70 g, 0,217 mol) wurde in wasserfreiem Methylenchlorid (1400 ml) gelöst. Die resultierende Mischung wurde auf 0ºC mit einem. Eisbad gekühlt und anschließend wurden PCl&sub5; (70 g, 0,336 mol) langsam zugegeben. Am Ende der Zugabe wurde die Mischung bei 0ºC ungefähr 2 Stunden gerührt, anschließend auf -20ºC abgekühlt. AlCl&sub3; (56 g, 0,42 mol) wurde portionsweise zu der Mischung gegeben. Auf die Zugabe folgend wurde die Mischung ungefähr 2 Stunden bei Raumtemperatur gehalten und anschließend auf den Siedepunkt erwärmt und auf dem Siedepunkt ungefähr 6 Stunden gehalten. Die Mischung wurde dann auf 0ºC abgekühlt und zerstoßenes Eis (ungefähr 300 ml) wurde portionsweise zugegeben, um den Überschuß an reagierenden Komponenten zu zerstören. Die Mischung wurde dreimal mit CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert. Die organischen Phasen wurden zusammengelegt, über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockenheit gebracht, ein gelblicher Feststoff wurde erhalten, der in einem kleinen Ethylacetat-Volumen aufgelöst und anschließend mit Hexan präzipitiert wurde. 40 g der Verbindung 1 wurden erhalten (Ausbeute: 60,4%).
Smp. = 184-185ºC.
[α]D = -55,4º (c = 1% MetOH); Analyse: entsprechend.

e) Herstellung von S(-)-2-(N-Trifluoracetyl)amino-6-fluor-7- methoxytetralin 5

Die Verbindung 4 (40 g, 0,131 mol) wurde in Boretherattrifluorid (340 ml) bei 0ºC suspendiert. Triethylsilan (90 ml), 0,567 mol) wurde zu der Suspension bei 0ºC gegeben und die resultierende Mischung wurde ungefähr 4 Tage bei Raumtemperatur gehalten. Am Ende der Reaktion wurde eine NaHCO&sub3;-gesättigte Lösung (pH 8-9) zu der Reaktionslösung gegeben und die wäßrige Phase wurde viermal mit CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert. Die zusammengeführten organischen Phasen wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockenheit gebracht. Die so erhaltene Rohverbindung wurde aus Isopropylether wieder kristallisiert. 30 g der Verbindung 5 wurden erhalten (Ausbeute: 78,63%).
Smp. = 45-47ºC.
[α]D = -80º (c = 1% MetOH); NMR: entsprechend.

f) Herstellung von S(-)-2-Amino-6-fluor-7-methoxytetralinhydrochlorid (ST 1214)

Die Verbindung 5 (30 g, 0,103 mol) wurde in Methanol (225 ml) und Wasser (225 ml) enthaltend K&sub2;CO&sub3; (54 g, 0,391 mol) gelöst. Die resultierende Lösung wurde unter Rühren 3 Stunden refluxiert. Methanol wurde unter Vakuum zugegeben und weitere 100 ml Wasser wurden zu der Lösung gegeben. Die organischen Phasen wurden zusammengeführt, über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und zur Trockenheit gebracht. Der so erhaltene ölige Rest wurde in Ethylether gelöst, mit HCl (15% Lösung in Ethanol) angesäuert und der Niederschlag wurde abfiltriert und wieder in Ethanol aufgelöst, mit Aktivkohle entfärbt, filtriert, unter Vakuum konzentriert und letztlich aus n-Propanol kristallisiert.
Die Kristallisierung wurde zweimal durchgeführt unter Erhalt von 12,6 g der Verbindung 7.
(X&supmin; = Cl) (Ausbeute 52,80%)
Smp. = 263-265ºC.
[α]D = -52,5º (c = 1% H&sub2;O).
NMR D&sub2;O δ 7,0-6,8 (m, 2H, aromatisch); 3,8 (s, 3H, OCH&sub3;);
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung von S(-)- 2-Amino-6-fluor-7-methoxytetralin sowohl als freie Base als auch als pharmakologisch annehmbares Salz davon zur Herstellung eines Medikaments, das bei der therapeutischen Behandlung von septischem Schock wirksam ist.
Dieses Medikament kann als orale oder parenterale verabreichbare pharmazeutische Zusammensetzung auftreten, wobei der aktive Bestandteil S(-)-2-Amino-6-fluor-7-methoxytetralin als freie Base oder als ein pharmakologisch annehmbares Salz davon ist, in Mischung mit geeigneten pharmakologisch annehmbaren Trägern, deren Auswahl für jeden Fachmann der Pharmazie und pharmazeutischen Technologie offensichtlich ist.
Während sich die orale Verabreichungsform zur Vermeidung von spetischem Schock eignet, ist die parenteral verabreichbare Zusammensetzung, insbesondere über dem intravenösen Weg, die Zusammensetzung der Wahl für deren Verabreichung an den Patienten mit septischem Schock.
Die folgenden pharmakologischen Untersuchungen zeigen die mit der erfindungsgemäßen Verbindung S(-)-2-Amino-6-fluor-7-methoxytetralinhydrochlorid (ST 1214) erhaltenen Ergebnisse. Im Vergleich zu der Referenzverbindung (R,S)-2-Amino-6-fluor-7-methoxytetralinhydrochlorid (ST 626) in experimentellen Modellen des septischen Schocks.
Diese Vergleichsuntersuchungen zeigen eine viel höhere vorbeugende und therapeutische Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindung ST 1214 im Vergleich zu der bekannten Verbindung ST 626 und liefern außerdem Erklärungen über mögliche Wirkmechanismen, die verantwortlich sind, für das günstige pharmakologische Profil der Verbindung: deutliche Verringerung der Blut- und Gewebe TNF-Werte und der Serum-NO-Abgabe, die von einer außergewöhnlichen Erhöhung der Werte von entzündungshemmenden IL-10-Cytokin begleitet ist.
Beurteilung der Wirkung von ST 262 und ST 1214 auf die durch Lipopolysaccharid (LPS von E. coli =26:B6 oder von S. typhosa) induzierte Lethalität in BALB/c-Mäusen

Tiere

BALB/c männliche Inzuchtmäuse (Iffa Credo), ungefähr 7 Wochen alt, wurden verwendet (20-40 Tiere pro experimenteller Gruppe).

Experimentelles Verfahren

Verbindung ST 626 und ST 1214, in steriler Kochsalzlösung solubilisiert, wurden intravenös (i. v.) in einer Dosis von 6 mg/kg (ungefähr gleich 1/10 LD50) 30 min vor und nochmals 5 min nach der endotoxischen Herausforderung (LPS) verabreicht. Vor der Verwendung wurde. LPS (entweder vom E. coli-Serotyp O26:B6 oder von S. typhosa) in steriler Kochsalzlösung solubilisiert und anschießend intraperitoneal (i. p.) in der Dosis 10 mg/kg (E. coli LPS) und 23 mg/kg (5. typhosa LPS) in einem Volumen von 0,1 ml pro 10 g Tierkörpergewicht (b. w.) injiziert. Das Überleben wurde täglich 10 Tage lang nach der LPS-Herausforderung festgestellt, wobei der Tag verzeichnet wurde, an dem jedes Tier starb.

Ergebnisse

Die mit ST 626 und St 1214 in den beiden Modellen des endotoxischen Schocks erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt.
Verbindung St 626 scheint in gewisser Weise die Lethalität zu verringern, die durch E. coli oder S. typhosa LPS verursacht oder induziert wird, wobei das Überleben bis zu 14% und 40% in den jeweiligen Modellen erhöht werden konnte. ST 1214 ist wirksamer als ST 626 bei Schock der durch LPS von E. coli und durch LPS von S. typhosa induziert wird, die Überlebensrate erhöhte sich, jeweils auf bis zu 37% (p < 0,002) und bis zu 65% (p < 0,001). Tabelle 1 Wirkung von ST 626 und ST 1214 i.v.-Verabreichungen auf die Lethalität von Mäusena, induziert durch die Injektion von E. coli LPS (Serotyp O26:B6)
a = BALB/c-Mäuse
b = Zeitpunkt der Verabreichung der Verbindung hinsichtlich der LPS- Herausforderung
c = Tod/insgesamt in jeder experimentellen Gruppe
d = Erhöhung der Überlebensrate (%) der behandelten Tiere hinsichtlich der LPS-Kontrolle
e = Die statistische Bedeutung wurde beurteilt durch den einseitigen Fisher's-Genautest. Tabelle 2 Wirkung von ST 626 und ST 1214 i.v.-Verabreichungen auf die Lethalität in Mäusena, induziert durch die Injektion von S. typhosa LPS
a = BALB/c-Mäuse
b = Zeitpunkt der Verabreichung der Verbindung hinsichtlich der LPS- Herausforderung
c = Tbd/insgesamt in jeder experimentellen Gruppe
d = Erhöhung der Überlebensrate (%) der behandelten Tiere hinsichtlich der LPS-Kontrolle
e = Die statistische Bedeutung wurde beurteilt durch den einseitigen Fisher's-Genautest.
Beurteilung der Wirkung von ST 626 und ST 1214 auf die Lethalität die durch Lypopolysaccharid (LPS aus E. coli-Serotyp O26:B6) induziert wird, in BALB/C-Mäusen, die mit D-Galactosamin sensibilisiert sind

Tiere

BALB/c männliche Inzuchtmäuse (Iffa Credo), ungefähr 7 Wochen alt, wurden verwendet (28-38 Tiere pro experimentelle Gruppe).

Experimenteller Verlauf

Die Tiere wurden mit D-Galactosamin (1000 mg/kg, i.p.) sensibilisiert und zur gleichen Zeit wurde E. coli LPS (0,05 mg/kg, i.p.) in einer Gesamtmenge von 200 ul injiziert. Diese LPS-Dosis ist ungefähr gleich zu DL80 in mit D-Galactosamin sensibilisierten Tieren.
Die Verbindungen ST 626 und ST 1214 wurden i.v. in einem Volumen von 200 ul steriler Kochsalzlösung in einer Dosis von 6 mg/kg, ungefähr entsprechend 1/10 DL50, 30 min vor der Herausforderung verabreicht. Eine zweite i.v.-Verabreichung der Verbindungen (mit der gleichen Dosis) wurde 5 min nach der Endotoxin-Injektion gegeben.
Das Überleben wurde täglich 10 Tage nach der LPS Herausforderung untersucht, wobei der Tag, an dem die Tiere starben, vermerkt wurde.

Ergebnisse

Der Anstieg des Überlebens bei den Tieren, die mit ST 1214 behandelt gegenüber dem Anstieg der bei ST 626 beobachtet wurde, war in der Tat höher (26% gegenüber 11%) (Tabelle 3).
Daher scheint auch in diesem Modell, bei dem der Schock in D-Galactosamin-sensibilisierten Tieren mit Endotoxin induziert wurde, ST 1214 wirksamer zu sein als ST 626, in bezug auf Tiere, die nach der toxischen Herausforderung überlebten. Tabelle 3 Wirkung von ST 626 und ST 1214 i.v.-Verabreichungen auf die Lethalität, die durch die Injektion von LPS (vom E. coli-Serotyp O26:B6) in mit D-Galactosamin sensibilisierten Mäusena verursacht wird
a = BALB/c-Mäuse
b = Zeitpunkt der Verabreichung der Verbindung hinsichtlich der LPS- Herausforderung
c = Tod/insgesamt in jeder experimentellen Gruppe
d = Erhöhung der Überlebensrate (%) der behandelten Tiere hinsichtlich der LPS-Kontrolle
e = Die statistische Bedeutung wurde beurteilt durch den einseitigen Fisher's-Genautest.
Beurteilung der Wirkung von ST 626 und ST 1214 auf Stickstoffoxid- Serumwerte nach der Injektion von E. coli LPS in BALB/c-Mäusen

Materialien und Verfahren

Tiere

BALB/c-männliche Inzuchtmäuse (Iffa Credo), 6 bis 7 Wochen alt, wurden verwendet (5-9 Tiere pro experimentelle Gruppe).

Behandlung

Vor der Verwendung im Experiment wurde E. coli-Endotoxin (LPS-Serotyp O26:B6) in steriler Kochsalzlösung aufgelöst und anschließend über den endoperitonealen Weg (5 mg/kg) injiziert. ST 626 und ST 1214 wurden i.v. verabreicht (8 mg/kg) 5 und wiederum 30 min nach der LPS-Herausforderung (Zeit 0). Die Behandlung mit der Referenzverbindung Aminoguanidin (20 mg/kg) wurde nach dem gleichen Protokoll wie ST 626 und ST 1214 i.p. durchgeführt.

Blutentnahme

Bei den Experimenten, die das Ziel hatten, die Wirkung von ST 626 und ST 1214 zu beurteilen, wurden 20 Stunden nach der LPS-Herausforderung Blutproben entnommen, wenn Peak-Werte des zirkulierenen NOx (Nitrat und Nitrite, stabile Endprodukte von NO) beobachtet wurden. Das Blut wurde retro-orbital sinus aus Ether-anästhesierten Tieren entnommen und in heparinisierten Reagenzgläsern gesammelt. Die Proben wurden bei 2000 · g 10 min zentrifugiert und das Plasma wurde bei -80ºC vor dem NOx-Assay aufbewahrt.

NOx-Assay

Vor dem Assay wurden die Proben 1 : 3 mit destilliertem Wasser verdünnt und anschließend der Ultrafiltrierung (Millipore Ultrafree-MC 10 000 NMWL- Filter, Kat.# UFCLGC00) bei 4700 · g 90 min unterworfen. Die NOx- Konzentration in den Filtraten wurde gemessen durch Verwendung des von Carbu erhältlichen herkömmlichen Kits (Nitrat/Nitrit-Assay Kit, Kat# 780001).

Statistische Analyse

Die Daten wurden unter Verwendung des zweiseitigen-Students-Test untersucht.

Ergebnisse

Die ST 1214-Verabreichung 5 und 30 min nach der LPS-Herausforderung verursachte eine deutliche (38%) und signifikante Verringerung (p < 0,01) in Plasma NOx-Werten (Tabelle 4). Die Verringerung der zirkulierenden NOx- Werte nach der Behandlung mit ST 626 war jedoch geringer (Tabelle 4).

Tabelle 4

Wirkung von ST 626 und ST 1214 auf NOx-Plasma-Werte (uM) nach der E. coli- LPS-Injektion in BALB/c-Mäusen. Die Verbindungen wurden i.v. verabreicht (8 mg/kg) 5 und wiederum 30 min nach der LPS-Herausforderung (5 mg/kg, i.p.). Aminoguanidin (AG-Referenzverbindung) wurde über den endoperitonealen Weg nach dem gleichen experimentellen Protokoll wie ST 1214 und ST 626 verabreicht.
a Prozentuale Verringerung der Plasma-NOx-Werte von behandelten Gruppen hinsichtlich der relevanten Kontrollen.

Beurteilung der Wirkung von ST 626 und ST 1214 auf Serum IL-10 (Interleukin 10)-Werte induziert in mit LPS aus Salmonelle typhosa injizierten BALB/c-Mäusen

Tiere

BALB/c männliche Inzuchtmäuse (lt fa Credo), 6 Wochen alt, wurden verwendet (6-7 Tiere pro experimentelle Gruppe).

Behandlung

Salmonella typhosa-Endotoxin (LPS) wurde in steriler Kochsalzlösung gelöst und anschließend über den endoperitonealen Weg in einer Dosis von 15 mg/kg injiziert. Die Verbindungen ST 626 und ST 1214 wurden in steriler Kochsalzlösung aufgelöst und 30 min vor und wiederum 5 min nach der LPS- Herausforderung i.v. verabreicht (8 mg/kg).

Blutentnahme

Bei den Experimenten, die das Ziel hatten, den Zeitverlauf des IL-10- Auftretens in der Zirkulation zu ermitteln, wurden Blutproben nach unterschiedlichen Zeiten nach der LPS-Injektion entnommen. Bei den Experimenten, die durchgeführt wurden um die Wirkung der Substanzverabreichung zu beurteilen, wurden Blutproben 45 und 90 min nach der Herausforderung entnommen. Das Blut wurde retroorbitalsinus aus Ether-anästhesierten Tieren entnommen. Die Blutproben wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur gewonnen, um Serum zu trennen, das bei 2000 g 20 min zentrifugiert wurde. Die Serumproben wurden bei -80ºC aufbewahrt bis die IL-10-Aktivität untersucht wurde.

IL-10-Assay

Die IL-10-Serumkonzentrationen wurden unter Verwendung des ELISA-Kits für murines IL-10 (Genzyme, Boston, MA) nach den Anweisungen des Herstellers bestimmt.

Statistische Analyse

Die Daten wurden unter Verwendung des einseitigen Students-t-Tests untersucht.

Ergebnisse

Die Anfangsexperimente wurden durchgeführt um die Kinetik der IL-10- Absonderung in die Zirkulation zu bestimmen. Die experimentellen Daten zeigten, daß nachweisbare IL-10-Werte schon eine Stunde nach der Injektion von S. typhosa LPS vorhanden sind. Bei unseren experimentellen Bedingungen erreichten die IL-10-Werte nach der LPS-Herausforderung 15 mg/kg Peak-Werte nach 1,5 h (Fig. 1).
Die nächsten Experimente wurden durchgeführt um zu bestimmen, ob ST 626 und ST 1214 11-10-Werte nach ihrer Verabreichung 30 min vor und wiederum 5 min nach der toxischen Herausforderung (Zeit 0) verändern können. Die Daten zeigten, daß ST 1214 ungefähr eine 3-fache Erhöhung der IL-10-Werte verursacht, die durch LPS 90 min nach seiner Injektion induziert sind. Umgekehrt war bei ST 626 keine signifikante Wirkung auf IL-10- Werte, die durch LPS induziert sind, zu erkennen (Fig. 2). IL-10-Werte 45 min nach der LPS-Herausforderung waren nicht beeinträchtigt, selbst wenn zu erwähnen ist, daß die Werte zu nah an der unteren Nachweisgrenze des Assays lagen. Interessant ist, daß ST 1214 per se ohne jede direkte modulierende Wirkung auf IL-10-Serumwerte war. Es scheint daher möglich, daß die Wirkungen, die nach der ST 1214-Behandlung beobachtet wurden, der ST 1214-Fähigkeit zuzuschreiben sind, mit den normalen Wegen des LPShervorgerufenen Signals zu interferieren.
Beurteilung der Wirkung von ST 626 und ST 1214 auf den Serum-TNF (Tumornekrose-Faktor)-Wert, induziert in BALB/c-Mäusen, die mit LPS aus S. typhosa injiziert sind.

Tiere

BALB/c männliche Inzuchtmäuse (Iffa Credo), ungefähr 5 bis 6 Wochen alt, wurde verwendet (4-7 Tiere pro experimentelle Gruppe).

Behandlung

Endotoxin (LPS aus Salmonella typhosa) wurde in steriler Kochsalzlösung vor der Injektion über den endoperitonealen Weg, in einer Dosis (10 mg/kg) entsprechend DL80, gelöst. In ähnlicher Weise wurden die Verbindungen ST 1214 und ST 626 in steriler Kochsalzlösung gelöst, bevor sie (8 mg/kg) zweimal -30 und +5 min hinsichtlich der LPS-Injektion verabreicht wurden.

Blutentnahme

Blutproben wurden 45 und 90 min (d. h. wenn TNF die Peak-Werte erreichte) nach der Herausforderung entnommen. Das Blut wurde retroorbitalsinus aus zuvor Ether-anästhesierten Tieren entnommen.
Blutproben wurden bei Raumtemperatur 2 Stunde geronnen, um das Serum zu trennen, das daraufhin bei 2000 · g 20 min zentrifugiert wurde. Serumproben wurden bei -80ºC aufbewahrt bis die Cytokin-(TNF)-Aktivität untersucht wurde.

TNF-Assay

Die biologische TNF-Aktivität wurde bestimmt unter Verwendung der L929-Tumorzellinie (murines Fibrosarcoma), das sehr empfindlich auf die cytotoxische TNF-Aktivität reagiert (V. Ruggiero, C. Chiapparino, S. Manganello, L. Pacetllo, P. Foresta & C. Arrigoni Martelli, Beneficial Effects of a Novel Platelet-Activating Gactor Receptor Antagonist, ST 899, on Endotoxin-Induced Shock in Mice, SHOCK, 2,4: 275-280, 1994). Genauer gesagt wurden L929-Zellen bei einer Dichte von 3,2 · 10&sup5; Zellen/ml in einer 96-Well-Mikrotiterplatte mit flachem Boden (100 ul/Well) in RPMI-1640 Kulturmedium, das 10% FCS enthält, ausgesät. Nach 18-stündiger Inkubation bei 37ºC und 5% CO&sub2; wurde das Kulturmedium entfernt und Serienverdünnungen (durch in RPMI-1640 1% FCS) der Serumproben zugegeben. Letztlich wurde Actinomycin-D zu den Wells (100 ul/Well) bei einer Endkonzentration von 1 ug/ml zugegeben. Dieser Hemmstoff der RNA-Transkripition verstärkt die L929-Zellinien-Empfindlichkeit für cytotoxische TNF-Wirkung. Nach weiterer 18- bis 24-stündiger Inkubation wurden die Zellen mit einer frisch hergestellten Lösung aus 1 mg/ml XTT (Natrium-3'-[1-[(phenylamino)carbonyl]-3,4- tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-nitro)benzolsulfonsäurehydrat) und 125 uM PMS (Fhenanzin Methosulfat) gefärbt (N. W. Roehm, G. H. Rodgers, S. M. Hatfield & A. L. Glaserbrook, An improved colorimetric assay for cell proliferation and virability utilizing the tetrazolium salt XTT: J. Immunol. Meth., 142: 257- 265, 1991). Die Zellen wurden gefärbt durch Zugabe von 50 ul/Well XTT/PMS- Färbelösung und 2- bis 2,5-stündigem Inkubieren. Nach dem Färben wurde die Absorption jeder Probe bei 450 nm und 620 nm (Referenzabsorption) gemessen und die resultierenden Werte wurde in TNF-Einheiten umgewandelt, definiert als reziproker Wert der Verdünnung, die notwendig ist, um eine 50%ige Zellcytotoxizität zu verursachen.

Statistische Analyse

Die Daten wurden unter Verwendung des einseitigen Students-t-Test untersucht.

Ergebnisse

Wie in Fig. 3 gezeigt, verringert ST 1214 signifikant den zirkulierenden TNF-Wert sowohl 45 min nach der LPS-Injektion (p < 0,01) und am meisten 90 min (d. h. wenn die TNF-Werte Peak-Werte erreichten) auf die Herausforderung folgend (p < 0,001). ST 626 verringert auch Serum-TNF-Werte in Mäusen, die mit LPS injiziert wurden, selbst wenn in einem geringeren Ausmaß als ST 1214 (jeweils 80% vs. 99% Verringerung). Zusätzlich haben weder ST 1214 als auch ST 626 per se eine modulierende Wirkung auf TNF- Werte in LPS-unbehandelten Mäusen.
Beurteilung der Wirkung von ST 626 und ST 1214 auf TNF-α-mRNA-Wert in verschiedenen Organen von LPS-injizierten Mäusen

Materialien und Verfahren

Tiere

BALB/c männliche Inzuchtmäuse (Iffa Credo), ungefähr 5 Wochen alt, wurden verwendet (4 Tiere pro. experimentelle Gruppe).

Behandlung und Organentfernung

Die Behandlung mit ST 626 und ST I214 wurde durch doppelte i.v.- Verabreichung (8 mg/kg) -30 und +5 min angesichts der LPS-Herausforderung durchgeführt. Endotoxin (LPS aus S. typhosa) wurde i.p. injiziert mit der Dosis 23 mg/kg, entsprechend DL80. Die Tiere wurden durch CO&sub2;-Erstickung 45 min nach der LPS-Injektion geopfert. Zu untersuchende Organe (Lungen, Milz, Leber und Nieren) wurden schnell entfernt, in flüssigem Stickstoff gefroren und bei -80ºC bis zur RNA-Extraktion aufgewahrt.

RNA-Extraktion

RNA wurde durch ein Reinigungsverfahren isoliert, das auf der Zentrifugation auf einem Cäsiumchlorid-Gradienten basiert (J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 7,3-7,79, 1989). Kurz gesagt wurden die Organe in 9,5 ml Guanidinisothiocyanat-Lösung (4 M) homogenisiert. Die Lysate wurden auf einer 4 ml Cäsiumchlorid-Lösung (5,7 M) gelegt und der Zentrifugierung bei 174 000 Umdrehungen 24 h unterworfen. So erhaltene RNA-Pellets wurden in 300 ul Natriumacetat (0,3 M pH 6,0) gelöst und anschließend mit 700 ul absolutem Ethanol bei -80ºC 24 h ausgefällt. Am folgenden Tag wurden die RNA zentrifugiert, getrocknet und in einem adequaten Volumen aus Diethyl-pyrocarbonat-behandeltem H&sub2;O wieder suspendiert. Zur Verbesserung der Reinheit der Poren wurde die Extraktion mit einem gleichen Volumen einer 1 : 1 Phenol/Chloroform-Lösung durchgeführt, gefolgt von einer zweiten Extraktion mit einem gleichen Volumen an Chloroform. Die RNA-Konzentration wurde spektrophotometrisch vermessen und ihre Integrität wurde durch Agarosegel-Elektrophorese untersucht.

Umkehrtranskriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)

Einzelsträngige cDNA wurden nach den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits von Boehringer Mannheim synthetisiert. Kurz gesagt wurde zu jeder Probe aus Gesamt-RNA (1 ug) 20 Einheiten reverser Transkriptase des Avian-Myelobastosis-Virus und 1,6 ug Oligo-dT-Primer in einem Endvolumen von 20 ul gegeben. Die Proben wurden anschließend 10 min bei 25ºC inkubiert, um das Anknüpfen der Primer zu ermöglichen. Die Polymerisationsreaktion wurde 2 h bei 42ºC durchgeführt und anschließend durch 5-minütiges Denaturieren des Enzyms bei 100ºC beendet. Zu jeder Probe wurden 80 u 1 H&sub2;O gegeben und bei -20ºC bis zur Amplifizierung gehalten. Die so erhaltenen cDNA-Proben (mit dem vorherbeschriebenen Verfahren) wurden unter Verwendung eines Paares an spezifischen TNF-α-Primern von Clontech amplifiziert, wobei den Anweisungen des Herstellers gefolgt wurde. Kurz gesagt wurden zu 4 ul jeder Probe Tac- Polymerase (2,5 Einheiten), primerspezifisch für TNF-α (0,4 uM) und Desoxyribonukleotide (0,2 mM) gegeben. die Amplifizierungsreaktion wurde durch 30 Zyklen geführt, wobei jeder Zyklus die folgenden Schritte einschließt:
Schritt 1: 45 s bei 94ºC (Denaturierung)
Schritt 2: 45 s bei 60ºC (Anknüpfung)
Schritt 3: 2 min bei 72ºC (Polymerisation)
Nach Beendigung der 30 Zyklen wurden die Proben bei 72ºC 7 min gehalten (Verlängerungsreaktion).
Die amplifizierten Produkte wurden durch Elektrophorese auf einem 2,0%igen Agarosegel getrennt und die Bandenintensität wurde mit einem Densitometer untersucht. Alle Proben wurden auch für ein konstitutives Gen (β-Actin) amplifiziert, um sicherzustellen, daß die cDNA-Amplifizierungsprodukte in den verschiedenen Proben wirklich die gleichen waren.
In jeder Reaktion wurden Kontrollen wie folgt eingeschlossen: eine positive Kontrolle, eine negative Kontrolle (Reaktionspuffer allein) und letztlich eine Probe, deren cDNA-Produkt erhalten wurde aus einer Reaktion, bei der die reverse Transkriptase fehlt. Die letztere Kontrolle ermöglicht die Gegenwart der Genom-DNA in der Anfangs-RNA-Probe auszuschließen. Sowohl die cDNA-Synthese als auch die Amplifikationsreaktionen wurden unter Verwendung des GENEAMP-PCR-SYSTEM 2400 Wärmezyklers (Perkin Eimer) durchgeführt.

Ergebnisse und Schlußfolgerungen

Fig. 4 zeigt die Daten, die bei einer densitrometrischen Bandenanalyse der amplifizierten cDNA aus verschiedenen TNF-α-Proben erhalten wurden. Es ist zu erkennen, daß in allen Organen (Nieren, Milz, Lugen, Leber) dar ST 1214-behandelten Tiere eine deutliche Absenkung der TNF-α- mRNA-Werte zu beobachten ist im Vergleich zu Tieren, die nur mit LPS injiziert wurden. Dexamethason, das als positive Kontrolle verwendet wurde, verursachte in der Leber eine TNF-α-mRNA-Abnahme, die höher zu sein scheint als von ST 626 allein. Intensitätswerte der Banden wurde ausgedrückt als arbiträre Einheiten und wurden normalisiert hinsichtlich der Expression eines konstitutiven Gens (β-Actin). In jedem Experiment wurde eine negative Reaktionspufferkontrolle (Neg) und eine Kontrolle, der reverse Transkriptase fehlte (-AMV) eingeschlossen. Es kann daher schlußgefolgert werden, daß ST1214 die TNF-α-mRNA-Expression in verschiedenen Organen beeinträchtigen kann, mit der nachfolgenden Abnahme der TNF-Serumwerte. ST 626 kann in ähnlicher Weise die TNF-α-mRNA-Expression absenken, aber diese Abnahme ist geringer als bei ST 1214.

Claims

1. S(-)-2-amino-6-fluor-7-methoxytetralin mit der Formel:

2. Verbindung gemäß Anspruch 1 mit der Formel:

worin X&supmin; das einwertige Anion eines pharmakologisch annehmbaren Salzes ist.

3. Salz nach Anspruch 2, worin das pharmakologisch annehmbare Salz ausgewählt ist aus Chlor, Brom, Orotat, Säure Aspartat, Säure Citrat, Säure Phosphat, Fumaxat und Säure Fumarat, Laktat, Maleat, Säure Maleat, Säure Oxalat, Säure Solphat, Glukose Phosphat, Tartrat und Säure Tartrat.

4. Verwendung einer Verbindung nach Ansprüchen 1, 2 oder 3 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von septischem Schock.

5. Verfahren zur Herstellung von S(-)-2-Amino-6-fluor-7- methoxytetralin als freie Base oder als pharmakologisch annehmbares Salz gemäß dem Reaktionsschema:

worin X&supmin; das einwertige Anion eines pharmakologisch annehmbaren Salzes ist,

umfassend die Schritte bestehend aus:

Herstellen eines Anhydrids 1 durch Suspendieren von L(+ )-Asparaginsäure in CF&sub3;COOH, Zugeben von kaltem Trifluorsäureanhydrid und anschließend Erwärmen der resultierenden Mischung auf die Rückflusstemperatur bis die Reaktion beendet ist,

Kondensieren des Anhydrids 1 mit einem Überschuss von 2-Fluranisol (1,5-3 mol) in der Gegenwart von AlCl&sub3; bei 40 bis 60ºC, 40 bis 50 Stunden unter Erhalt der Säure 2,

Reduzieren der Säure 2 durch Auflösen derselben mit CF&sub3;COOH, Abkühlen der so erhaltenen Lösung bei 0-8ºC, Zugeben einer überschüssigen Triethylsilan Menge und Erwärmen der Mischung auf die Rückflusstemperatur bis die Reaktion beendet ist, wodurch die Verbindung 3 erhalten wird,

Herstellen von Tretralon 4 aus Verbindung 3 durch Kondensieren über die Friedel-Crafts Reaktion mit PCl&sub5; und AlCl&sub3; in einem Inerten wasserfreien organischen Lösungsmittel,

Reduzieren von Tretralon 4 durch Suspendieren desselben in Boroetherattrifluorid, Zugeben einer überschüssigen Triethylsilan Menge bei 0-8ºC und. Ablaufen der Reaktion bei Raumtemperatur bis die Reaktion beendet ist, Zugeben einer wässrigen alkalischen Lösung, Extrahieren der wässrigen. Phase mit einem Lösungsmittel, Trocken werden lassen und Reinigen durch Kristallisieren, wodurch die Verbindung 5 erhalten wird,

Hydrolysieren der Verbindung 5 mit einer wässrigen alkalischen Lösung unter Erhalt von S(-)-2-amino-6-fluor-7-metoxytetralin 6 und

wahlweise Auflösen der Verbindung 6 in einem organischen Lösungsmittel, Ansäuern mit der gewünschten H&spplus;X&supmin; Säure und Trocken werden lassen, wodurch das Salz 7 erhalten wird.

6. Oral oder parenteral verabreichbare pharmazeutische Zusammensetzung zum Vorbeugen und Behandeln von septischem Schock umfassend eine Verbindung der Ansprüche 1, 2 oder 3 als aktiven Bestandteil und einen pharmakologisch annehmbaren Träger.