DE69731084T2

DE69731084T2 - REINIGUNG DES GEWEBE PLASMINOGENAKTIVATORS (tPA)

Info

Publication number: DE69731084T2
Application number: DE69731084T
Authority: DE
Inventors: M. John MACLENNAN; C. Robert LADNER; C. Thomas RANSOHOFF
Original assignee: Dyax Corp
Current assignee: Dyax Corp
Priority date: 1996-03-20
Filing date: 1997-03-20
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2017-03-21
Also published as: IL126045A0; EP0907887A1; US7074560B2; CA2248243C; AU2535697A; EP1944610A1; PT904541E; EP0904541A1; AU715608B2; CN1198837C; DE69731084D1; JPH11507246A; US6084062A; ATE278958T1; JP2000510443A; EP0904541A4; CN1219240A; EP0904541B1; US6462172B1; IL126044A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Proteinreinigung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Entdeckung von und Isolierung von Affinitätsliganden, die nützlich für die Reinigung von Gewebeplasminogen-Aktivator, oder tPA, sind.
Hintergrund der Erfindung
Humaner Gewebetyp-Plasminogen-Aktivator, oder tPA, ist ein proteolytisches Enzym, welches durch Endothelzellen hergestellt wird, welches eine hohe Affinität für Fibrin, welches in Aggregaten von koaguliertem Blut (d. h. Klumpen oder "Thromben") enthalten ist, hat. tPA dient auch dazu, Plasminogen, ein inaktives Proenzym, zu aktivieren und in Plasmin, ein thrombolytisches Enzym, umzuwandeln. Da tPA in Thromben an Fibrin bindet und Plasminogen aktiviert, um dort Klumpen aufzulösen, ist tPA ein wichtiges Arzneimittel zur Verwendung als ein Thrombolytikum geworden.
Obwohl tPA ein führendes Arzneimittel bei der Behandlung von Thrombose geworden ist, konkurriert es gegen andere effektive thrombolytische Mittel, wie zum Beispiel Streptokinase und Urokinase, welche wohl weniger effektiv sind, aber viel weniger kosten. Dafür, dass tPA unter den meistverschriebenen thrombolytischen Mitteln bleibt oder um sogar an größere Zahlen von Patienten verteilt zu werden, müssen Wege gefunden werden, durch welche tPA effizienter oder mit geringeren Kosten hergestellt werden kann.
Effektive Mittel zum Beseitigen von Verunreinigungen, wie zum Beispiel Zelltrümmer, Pathogene, nicht-humane Proteine, usw. von einem Produktions-Zufuhrstrom ist auch wichtig bei der Herstel lung von tPA, wie es mit jedem Proteinprodukt ist, das schließlich für die therapeutische Verabreichung an menschliche Patienten gedacht ist.
Deshalb gibt es einen andauernden Bedarf für die Entwicklung von verbesserten Reagenzien, Materialien und Techniken für die Isolation von tPA auf einer effizienteren und kosteneffektiveren Basis.
Affinitätschromatographie ist eine sehr mächtige Technik zum Erreichen von dramatischen Einzelschrittzunahmen der Reinheit. Narayanan (1994), zum Beispiel, berichtete eine 3000-fache Zunahme der Reinheit durch einen einzigen Affinitätschromatographieschritt.
Affinitätschromatographie ist jedoch keine im allgemeinen verwendete Technik bei der Herstellung von Biomolekülen im großen Maßstab. Der ideale Affinitätschromatographie-Ligand muss bei erträglichen Kosten, (1) das Ziel-Biomolekül mit hoher Affinität, hoher Kapazität, hoher Spezifität und hoher Selektivität einfangen; (2) andere Spezies (Verunreinigungen) entweder gar nicht einfangen oder die differenzierte Eluierung erlauben; (3) die kontrollierte Freisetzung des Ziels unter Bedingungen erlauben, die das Ziel erhalten (d. h. nicht abbauen oder denaturieren); (4) die Regenerierung und Wiederverwendung der Chromatographiematrix erlauben; und (5) die Eliminierung oder Inaktivierung von jeglichen Pathogenen erlauben. Jedoch hat sich das Auffinden von Hochaffinitätsliganden mit akzeptablen Kosten, welche die Reinigungs- und Regenerierungsprotokolle tolerieren, die bei der pharmazeutischen Herstellung benötigt werden, als schwierig herausgestellt (siehe Knight, 1990).
Monoklonale Antikörper von Mäusen (MAbs) wurden effektiv als Affinitätsliganden verwendet. Monoklonale Antikörper, auf der anderen Seite, sind teuer herzustellen und sie neigen zum Auslaugen und zum Abbau bei den Reinigungs- und Regenerierungsverfahren, die mit der Reinigung von Biomolekülen in Zusammenhang stehen, was dazu führt, dass MAb-basierte Affinitätsmatrizen schnell ihre Aktivität verlieren (siehe, Narayanan, 1994; Boschetti, 1994). Zusätzlich, obwohl MAbs hochspezifisch für ein Ziel sein können, ist die Spezifität oft nicht ausreichend, um den Einfang von Verunreinigungen, die mit dem Ziel in enger Verwandtschaft stehen, zu vermeiden. Des Weiteren werden die Bindungseigenschaften der MAbs durch das Immunglobulinrepertoire des immunisierten Tieres bestimmt und deshalb muss sich der Praktiker damit abfinden, dass die Bindungseigenschaften von dem Immunsystem des Tieres erledigt werden, d. h., es gibt wenig Möglichkeiten zur Optimierung oder zur Auswahl für bestimmte Bindungs- oder Eluierungseigenschaften bei ausschliesslicher Verwendung von MAb-Technologie. Schließlich ist die Molekülmasse pro Bindungsstelle (25 kDa bis 75 kDa) von MAbs und sogar MAb-Fragmenten ziemlich hoch.
Bis jetzt gab es keine bekannten Affinitätsliganden, die für die Reinigung von tPA geeignet sind, die annähernd die Eigenschaften des idealen Affinitätsliganden, der oben beschrieben wurde, aufweisen, welcher nicht nur an das tPA-Zielmolekül mit hoher Affinität bindet, sondern auch das tPA unter wünschenswerten oder ausgewählten Bedingungen freisetzt, welche in der Lage sind, zwischen dem tPA und anderen Bestandteilen der Lösung zu unterscheiden, in welcher der tPA anwesend ist und/oder welche dazu in der Lage sind, Reinigungs- und Regenerierungsverfahren zu überdauern, um regenerierbare und wiederverwendbare Chromatographiematrizen bereitzustellen.
Solche tPA-Affinitätsliganden und Verfahren zum Erhalten von diesen werden hier bereitgestellt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Erhalten von Affinitätsliganden für tPA bereit, welche wünschenswerte oder ausgewählte Bindungseigenschaften und Freisetzungseigenschaften aufweisen. Die Affinitätsliganden der vorliegenden Erfindung weisen nicht nur vorteilhafte Bindungseigenschaften für die Affinitätstrennung von tPA auf, sondern auch gewünschte Freisetzungs- (Eluierungs-) eigenschaften und andere gewünschte Eigenschaften wie z. B. Stabilität, Beständigkeit gegenüber Abbau, Haltbarkeit, Wiederverwendbarkeit und Einfachheit der Herstellung.
Die tPA-Affinitätsliganden der vorliegenden Erfindung können anfänglich aus einer Peptidbibliothek identifiziert werden, wie zum Beispiel einer Phagen-Display-Bibliothek, durch ein Verfahren, umfassend:

(a) Auswählen einer ersten Lösungsbedingung (d. h. der Bindungsbedingungen), bei welchen es wünschenswert ist, dass ein Affinitätsligand an den tPA binden sollte;
(b) Auswählen einer zweiten Lösungsbedingung (d. h. der Freisetzungsbedingungen), bei welcher es wünschenswert ist, dass ein Affinitätskomplex zwischen dem tPA und dem Affinitätsligand dissoziieren wird, wobei die zweite Lösungsbedingung von der ersten Lösungsbedingung verschieden ist;
(c) Bereitstellen einer Bibliothek von Analoga einer Kandidat-Bindungsstelle, wobei sich jedes Analogon von der Kandidat-Bin dungsstelle durch Variation der Aminosäuresequenz an einer oder mehreren Aminosäurepositionen innerhalb der Domäne unterscheidet;
(d) Inkontaktbringen der Bibliothek von Analoga mit tPA bei der ersten Lösungsbedingung, für eine Zeit, die ausreicht, um die Bildung von Analogon/tPA-Bindungskomplex zu erlauben.
(e) Entfernen von Analoga, die unter der ersten Lösungsbedingung nicht binden;
(f) Verändern der Lösungsbedingungen des Schrittes des Inkontaktbringens (e) zu der zweiten Lösungsbedingung; und
(g) Rückgewinnen der Kandidat-Bindungsanalogen, die unter der zweiten Lösungsbedingung freigesetzt werden, wobei die zurückgewonnenen Analoga isolierte tPA-Affinitätsliganden identifizieren.

Folgend dieser allgemeinen Prozedur wurden einige Polypeptid-Affinitätsliganden für tPA isoliert, wie unten detaillierter beschrieben ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein Chromatogramm von Gewebeplasminogen-Aktivator (25 μl von 1 mg/ml tPA) über eine Affinitätschromatographiesäule mit einem immobilisierten tPA-Affinitätsliganden (CMTI-Derivat #109, beschrieben in Beispiel 1), mit Eluierung über einen pH 7– pH 3 Gradienten. Der Peak bei 15 Minuten wird abgeschätzt, etwa 90% des injizierten tPAs zu enthalten.
2 zeigt ein Chromatogramm von Koagulationsstandard (verdünnt 10 ×) über eine tPA-Affinitätssäule (CMTI-Derivat #109) mit Eluierung, wie oben beschrieben. Es zeigte sich, dass der kleine Peak bei 15,6 Minuten ein Gradientartefakt ist.
3 zeigt ein Chromatogramm von einem Gemisch, bestehend aus 25 μl des Koagulationsstandards (verdünnt 10 ×) versetzt mit 25 μl an tPA, mit Eluierung über einen pH 7–pH 3 Gradienten. Der Peak bei 1 Minute ist die Sammlung von Plasmaproteinen und der Peak bei 15,4 Minuten ist der tPA.
4 zeigt das gleiche Chromatogramm wie in 3 gezeigt, wobei der vertikale Maßstab vergrößert wurde.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die effiziente Reinigung von tPA durch Affinitätschromatographie.
Der tPA kann auf jede bekannte Weise hergestellt werden, umfassend chemische Synthese; Herstellung in transformierten Wirtszellen; Sekretion in Kulturmedium durch natürlich vorkommende oder rekombinant transformierte Bakterien, Hefen, Pilze, Insektenzellen und Säugetierzellen; Sekretion von gentechnisch erzeugten Organismen (z. B. transgenen Säugetieren); oder in biologischen Flüssigkeiten oder Geweben, wie z. B. Urin, Blut, Milch usw. Die Lösung, die den rohen tPA enthält, wie er anfänglich produziert wird (d. h. die Herstellungslösung) wird manchmal als der "Zufuhrstrom" bezeichnet.
Jedes Verfahren zur Herstellung von tPA ergibt tPA in einem Zufuhrstrom, der zusätzlich eine Anzahl von Verunreinigungen (bezogen auf tPA) enthält. Ein Zweck der vorliegenden Erfindung ist es, Affinitätsliganden und Zubereitungen (wie z. B. Chromatographiemedien) herzustellen, umfassend solche Liganden, die die schnelle und hochspezifische Reinigung von tPA von jedem Zufuhrstrom erlauben. Die tPA-Affinitätsliganden, die hierbei erhalten werden, sind für die Isolierung von tPA aus einem bestimmten Zufuhrstrom, unter speziellen vorbestimmten Bedingungen, maßgeschneidert. Wenn ein verändertes Herstellungsverfahren für den tPA verwendet wird, welches einen unterschiedlichen Zufuhrstrom produziert, könnte ein unterschiedlicher Satz von Affinitätsliganden notwendig sein, um denselben Grad an Reinigung zu erzielen. Der neue Satz von Liganden kann durch die folgenden Verfahren, die hier skizziert werden, leicht erhalten werden.
tPA-Affinitätsliganden der Erfindung binden den tPA in dem Zufuhrstrom mit hoher Affinität, dass jegliches andere Molekül praktisch ausgeschlossen ist. Weiter setzen die Affinitätsliganden den tPA intakt und in aktiver Form frei, wenn die Lösungsbedingungen geändert werden.
Auswahl der Bindungs- und Freisetzungsbedingungen
Um neue Affinitätsliganden für tPA zu isolieren, werden zwei Lösungsbedingungen ausgewählt, d. h. Bindungsbedingungen und Freisetzungsbedingungen. Die Bindungsbedingungen sind ein Satz von Lösungsbedingungen, unter welchen es gewünscht ist, dass ein gefundener Affinitätsligand den Ziel-tPA bindet; die Freisetzungsbedingungen sind ein Satz von Lösungsbedingungen, unter welchen es gewünscht ist, dass ein gefundener Affinitätsligand den tPA nicht bindet. Die zwei Bedingungen können ausgewählt werden, um jedes Kriterium des Praktikers zu erfüllen, wie z. B. Einfachheit des Erhaltens der Bedingungen, Verträglichkeit mit anderen Reinigungsschritten, verringerten Kosten des Wechsels zwischen Bedingungen, verglichen mit anderen Affinitätsmedien, usw. Bevorzugt sind die beiden Lösungsbedingungen (a) deutlich innerhalb der Grenzen des Stabilitätsfensters für den tPA und (b) weit entfernt in Bezug auf mindestens einen Lösungsparameter. Wenn zum Beispiel der tPA über einen weiten pH-Bereich stabil ist, können pH 7,5, 150 mM Salz, 25°C vorteilhafte Bindungsbedingungen sein und pH 3, 150 mM Salz, 25°C können vorteilhafte Freisetzungsbedingungen sein. Für eine verschiedene tPA-Form mit einem engen Bereich an pH-Stabilität (z. B. pH 6,2 bis 7,8), der aber über einen weiten Bereich von Salzgehalt stabil ist, können zwei nützliche Bedingungen sein: Bindungsbedingungen: pH 7,2, 3 M NaCl, 25°C und Freisetzungsbedingungen: pH 7,2, 2 mM NaCl, 25°C.
Auswahl einer Kandidat-Bindungsdomäne
In Verbindung mit der Auswahl von spezifischen Lösungsbedingungen für die gewünschte Bindung und Freisetzung des tPA, wird eine Kandidat-Bindungsdomäne ausgewählt, um als ein strukturelles Templat für die konstruierten Affinitätsliganden zu dienen, welche die gewünschten Bindungs- und Freisetzungsfähigkeiten zeigen. Die Bindungsdomäne kann ein natürlich vorkommendes oder synthetisches Protein oder ein Bereich oder eine Domäne von einem Protein sein. Die Kandidat-Bindungsdomäne kann ausgewählt werden, basierend auf dem Wissen von einer bekannten Wechselwirkung zwischen der Kandidat-Bindungsdomäne und dem tPA, aber dies ist nicht entscheidend. Tatsächlich ist es nicht wesentlich, dass die Kandidat-Bindungsdomäne überhaupt eine Affinität für tPA hat: ihr Zweck ist es, eine Struktur bereitzustellen, von welcher eine Vielzahl (Bibliothek) von Analoga erzeugt werden kann, welche Vielzahl von Analoga ein oder mehr Analoga umfasst, welche die gewünschten Bindungs- und Freisetzungseigenschaften zeigen (und jegliche anderen Eigenschaften, für die ausgewählt wird). Demzufolge können die Bindungsbedingungen und die Freisetzungsbedingungen, die unten diskutiert werden, ausgewählt werden mit Kenntnis des exakten Polypeptids, welches als die Kandidat-Bindungsdomäne dienen wird, oder mit Kenntnis von einer Klasse von Proteinen oder Domänen, zu welchen die Kandidat-Bindungsdomäne gehört, oder komplett unabhängig von der Wahl der Kandidat-Bindungsdomäne. Ähnlich können die Bindungs- und/oder Freisetzungsbedingungen ausgewählt werden mit Bezug auf bekannte Wechselwirkungen zwischen einer Bindungsdomäne und dem tPA, z. B., um die Wechselwirkung unter einer oder beiden von den Lösungsbedingungen zu favorisieren, oder sie können ausgewählt werden, ohne Bezug auf solche bekannten Wechselwirkungen. Ebenso kann die Kandidat-Bindungsdomäne unter Berücksichtigung der Bindungs- und/oder Freisetzungsbedingungen ausgewählt werden oder nicht, obwohl beachtet werden muss, dass, wenn die Analoga der Bindungsdomäne unter den Bindungs- oder Freisetzungsbedingungen instabil sind, keine nützlichen Affinitätsliganden erhalten werden können.
Beim Auswählen einer Kandidat-Bindungsdomäne ist es die Absicht, ein Templat oder eine Startstruktur bereitzustellen, aus welcher eine Bibliothek von ähnlich strukturierten analogen Domänen erzeugt werden kann. Die Bibliothek von Analoga wird bevorzugt eine vorherbestimmte Bibliothek (im Gegensatz zu einer zufällig erzeugten Bibliothek) sein, so dass die Variierung der Basisdomäne, um die Bibliothek zu erzeugen, in einer solchen Weise ausgeführt wird, dass die Eigenschaften, die für die Affinitätsliganden wünschenswert sind, bevorzugt werden.
Die Beschaffenheit der Kandidat-Bindungsdomäne beeinflusst stark die Eigenschaften der abgeleiteten Proteine (Analoga), die gegen das tPA-Molekül getestet werden. Bei der Auswahl der Kandidat-Bindungsdomäne ist die wichtigste Überlegung, wie die analogen Domänen dem tPA präsentiert werden, d. h. in welcher Konformation der tPA und die Analoga in Kontakt kommen werden. In bevorzugten Ausführungsformen werden, z. B., die Analoga durch Einfügen von synthetischer DNA, die für das Analogon codiert, in ein replizierbares genetisches Paket erzeugt, was dazu führt, dass die Domäne auf der Oberfläche eines Mikroorganismus, wie zum Beispiel M13-Phage, unter Verwendung von Techniken, wie z. B. in U.S. 5,403,484 (Ladner et al.) und U.S. 5,223,409 (Ladner et al.) beschrieben, zur Schau gestellt wird.
Strukturierte Polypeptide bieten viele Vorteile als Kandidat-Bindungsdomänen gegenüber unstrukturierten Peptiden. Die Mutation von Oberflächenresten in einem Protein wird normalerweise einen geringen Effekt auf die Gesamtstruktur oder allgemeinen Eigenschaften (wie z. B. Größe, Stabilität, Temperatur der Denaturierung) des Proteins haben; während gleichzeitig die Mutation von Oberflächenresten die Bindungseigenschaften des Proteins stark beeinflussen kann. Dies wurde zum Beispiel für BPTI-homologe Kunitz-Domänen vollständig dokumentiert (siehe Ladner, 1995). Mutieren von Oberflächenresten auf Proteinen oder strukturierten Domänen können zu größerer Diversität von Eigenschaften für die Analoga führen als durch Mutieren von unstrukturierten Peptiden erhalten wird, weil das Proteingerüst oder die Struktur der Domäne die mutierten Reste in Konformationen hält, die sich von Rest zu Rest unterscheiden, und von Gerüst zu Gerüst. Dies ist insbesondere wichtig für hydrophobe Seitengruppen, welche eingebettet würden, wenn sie nicht in eine Struktur gezwängt sind. Je enger ein Peptidsegment (Domäne) eingeschränkt ist, desto weniger wahrscheinlich bindet es an ein bestimmtes Ziel. Wenn es jedoch bindet, ist es wahrscheinlich, dass die Bindung fester ist und spezifischer. Deshalb ist es bevorzugt, eine Kandidat-Bindungsdomäne auszuwählen und wiederum eine Struktur für die Peptidanaloga, die in ein Gerüst mit einem gewissen Maß an Starrheit gezwängt ist. Alternativ kann mehr als eine Kandidat-Bindungsdomänenstruktur ausgewählt werden, um die Größe der Bibliothek von Analoga zu erhöhen und zusätzliche variierte Strukturen zur Präsentation für den tPA einzufügen. Wenn die Größe der Bibliothek erhöht wird und höhere Zahlen und divers strukturierte Analoga hergestellt werden, steigt die Wahrscheinlichkeit, dass ein nützliches Gerüst und zur Schau gestellte funktionelle Gruppen umfasst werden, bis zu dem Punkt, an welchem hochaffine Liganden zur Isolierung des tPA von praktisch jedem Zufuhrstrom gefunden werden können.
Die Größe der Kandidat-Bindungsdomäne ist auch eine wichtige Überlegung. Kleine Proteine oder Polypeptide bieten viele Vorteile gegenüber großen Proteinen, wie zum Beispiel monoklonalen Antikörpern (siehe Ladner, 1995). Erstens ist die Masse pro Bindungsstelle verringert. Hoch-stabile Proteindomänen mit niedrigen Molekulargewichten, z. B. Kunitz-Domänen (~7 kDa), Kazal-Domänen (~7 kDa), Cucurbida maxima Trypsininhibitor (CMTI)-Domänen (~3,5 kDa) und Endothelin (~2 kDa), können viel höhere Bindung pro Gramm zeigen als Antikörper (150 kDa) oder Einzelketten-Antikörper (30 kDa).
Zweitens ist die Wahrscheinlichkeit von nicht-spezifischer Bindung verringert, weil eine geringere Oberfläche zur Verfügung steht.
Drittens können kleine Proteine oder Polypeptide konstruiert werden, um einzigartige Bindungsstellen auf eine Weise zu haben, die für Antikörper nicht praktikabel ist. Kleine Proteine können zum Beispiel so konstruiert werden, dass sie Lysine nur an Stellen haben, die zur Bindung (z. B. an eine Chromatographiematrix) geeignet sind, aber dies ist für Antikörper nicht möglich. Es wird oft gefunden, dass nur eine kleine Fraktion von Koppelung Antikörpern aktiv sind, möglicherweise wegen einer ungeeigneten Koppelung an den Träger.
Die meisten kleinen Proteine oder Polypeptide, die durch Disulfide stabilisiert werden, enthalten keine Cysteine, die nicht an Disulfiden beteiligt sind. Dies ist, weil die oxidierenden Bedingungen, die die Disulfidbildung zur Stabilisierung des Proteins verursachen, auch zur Disulfidbildung bei ansonsten ungepaarten Cysteinen führen. Demzufolge neigen kleine Proteine, die stabilisierende Disulfide und eine ungerade Zahl von Cysteinen haben, dazu, disulfid-verknüpfte Dimere (z. B. Homodimere oder Heterodimere) zu bilden. Die Disulfide zwischen Domänen werden einfacher reduziert als die stabilisierenden Intradomänen-Disulfide. Deshalb ist es durch selektive Reduktion möglich, monomere disulfid-stabilisierte Domänen zu erhalten, die ein einziges freies Thiol haben. Solche Thiole können zur hochstabilen Immobilisierung von diesen Domänen durch Bildung eines Thioethers mit Iodacetamid, Iodessigsäure oder ähnlichen α-Iodcarbonsäuregruppen verwendet werden.
Kleine Protein- oder Polypeptiddomänen können auch chemisch synthetisiert werden, was es erlaubt, spezielle immobilisierende Gruppen in einer Art einzufügen, die nicht die Bindung an den tPA stört. Beispielsweise, wenn kleine disulfid-enthaltende Proteine chemisch synthetisiert werden, kann die Aminosäuresequenz durch Einführung eines zusätzlichen Cysteinrestes, bei dem das Thiol in einer von anderen Cysteinen in der Sequenz verschiedenen Weise blockiert ist, verändert werden. Die ausgewählten Thiole können entschützt werden und Disulfide können gebildet werden, dann kann das hinzugefügte Cystein entschützt werden und das Molekül kann durch Reaktion mit einem geeigneten Material, wie zum Beispiel einem Substrat, enthaltend immobilisiertes NH₂-CO-CH₂I, immobilisiert werden.
Viertens erhält eine eingeschränkte Polypeptidstruktur wahrscheinlicher ihre Funktionalität, wenn sie mit intakter struktureller Domäne von einem Gerüst auf ein anderes überführt wird. Beispielsweise ist die Struktur der Bindungsdomäne wahrscheinlich überführbar von dem Gerüst, welches für die Präsentation in einer Bibliothek (z. B. zur Schau stellen auf einem Phagen) gegenüber einem isolierten Protein welches von dem Präsentationsgerüst entfernt wurde oder auf einem chromatographischen Substrat immobilisiert wurde, verwendet wird.
Es gibt viele kleine stabile Proteindomänen, die sich zur Verwendung als Kandidat-Bindungsdomänen eignen und für welche die folgende nützliche Information zugänglich ist: (1) Aminosäuresequenz, (2) Sequenzen von verschiedenen homologen Domänen, (3) 3-dimensionale Struktur, und (4) Stabilitätsdaten über einen Bereich von pH, Temperatur, Salzgehalt, organisches Lösungsmittel, Konzentration von Oxidans. Einige Beispiele sind: Kunitz-Domänen (58 Aminosäuren, 3-Disulfidbindungen), Cucurbida maxima Trypsininhibitor-Domänen (31 Aminosäuren, 3 Disulfidbindungen), Domänen, die mit Guanylin in Verbindung stehen (14 Aminosäuren, 2 Disulfidbindungen), Domänen, die mit hitzestabilem Enterotoxin IA von gram-negativen Bakterien in Verbindung stehen (18 Aminosäuren, 3 Disulfidbindungen), EGF-Domänen (50 Aminosäuren, 3 Disulfidbindungen), Kringle-Domänen (60 Aminosäuren, 3 Disulfidbindungen), fungale Kohlenhydrat-Bindungsdomäne (35 Aminosäuren, 2 Disulfidbindungen), Endothelindomänen (18 Aminosäuren, 2 Disulfidbindungen), und IgG-Bindungsdomänen von Streptokokken G (35 Aminosäuren, keine Disulfidbindungen). Die meisten, aber nicht alle dieser, enthalten Disulfidbindungen, welche die Struktur starrer machen und stabilisieren. Bibliotheken, basierend auf jeder dieser Domänen, bevorzugt zur Schau gestellt auf einem Phagen oder anderen genetischen Baugruppen, können leicht konstruiert werden und für die Auswahl von Bindungsanaloga verwendet werden.
Bereitstellung einer Bibliothek von Analoga von Kandidat-Bindungsdomänen
Sobald eine Kandidat-Bindungsdomäne ausgewählt wurde, ist eine Bibliothek von potentiellen Affinitätsliganden für das Screening gegen den tPA bei den Bindungs- und Eluierungs(Freisetzungs)-Bedingungen kreiiert. Die Bibliothek wird durch Herstellung einer Serie von Analoga kreiert, wobei jedes Analogon der Kandidat-Bindungsdomäne entspricht außer, dass eine oder mehr Aminosäuresubstitutionen in der Sequenz der Domäne vorhanden sind. Von den Aminosäuresubstitutionen wird erwartet, dass sie die Bindungseigenschaften der Domäne verändern, ohne ihre Struktur signifikant zu ändern, zumindest für die meisten Substitutionen. Es ist bevorzugt, dass die Aminosäurepositionen, die für die Variation ausgewählt werden (variable Aminosäurepositionen) Oberflächen-Aminosäurepositionen sind, d. h. Positionen in der Aminosäuresequenz der Domänen, welche, wenn die Domäne in ihrer stabilsten Konformation ist, auf der äußeren Oberfläche der Domäne (d. h. die Oberfläche, die der Lösung ausgesetzt ist) auftreten. Am meisten bevorzugt werden die zu variierenden Aminosäurepositionen benachbart oder nahe beieinander sein, so dass der Effekt von Substitutionen maximiert wird. Zusätzlich können weitere Aminosäuren in die Struktur der Kandidat-Bindungsdomäne eingefügt werden. In bevorzugten Ausführungsformen, insbesondere wo eine sehr große Zahl von Information betreffend die Wechselein wirkungen des tPA mit anderen Molekülen, besonders der Kandidat-Bindungsdomäne verfügbar ist, werden diese Aminosäurepositionen, die wesentlich für Bindungswechselwirkungen sind, bestimmt werden und in dem Verfahren des Herstellens der Analogon-Bibliothek konserviert (d. h. die für die Bindung wesentlichen Aminosäuren werden nicht variiert).
Die Absicht der Schaffung der Analog-Bibliothek ist es, eine Vielzahl von potentiellen Affinitätsliganden für die Reaktion mit dem tPA-Molekül bereitzustellen und im Allgemeinen, je größer die Zahl von Analoga in der Bibliothek, desto größer die Wahrscheinlichkeit, dass ein Mitglied dieser Bibliothek an den tPA binden wird und ihn unter den vorausgewählten Bedingungen, die für die Freisetzung gewünscht sind, freisetzen wird. Andererseits stellt die zufällige Substitution an nur sechs Positionen in einer Aminosäuresequenz über 60 Millionen Analoga bereit, was eine Bibliotheksgröße ist, die praktische Beschränkungen darstellt, sogar wenn Screening-Technologien angewendet werden, die so mächtig sind wie Phagen-Display. Es ist deshalb bevorzugt, eine vorherbestimmte Bibliothek zu schaffen, in welcher die Aminosäurepositionen, die für die Variation bestimmt sind, so ausgewählt werden, dass sie den Effekt der Substitution auf die Bindungseigenschaften des Analogons maximieren und die Aminosäurereste, die zur Verwendung bei Substitutionen geplant und erlaubt sind, auf diese beschränkt werden, die das Analogon wahrscheinlich dazu veranlassen, dass es auf die Änderung in den Lösungsbedingungen von den Bindungsbedingungen zu den Freisetzungsbedingungen reagiert.
Wie vorhergehend angedeutet, sind die in U.S. 5,223,409 diskutierten Techniken besonders nützlich bei der Herstellung einer Bibliothek von Analoga, die einer ausgewählten Kandidat-Bindungsdomäne entsprechen, wobei die Analoga in einer Form präsen tiert werden, die für das Screening von großen Zahlen von Analoga in Bezug auf ein tPA-Ziel-Molekül im großen Maßstab geeignet ist. Die Verwendung von replizierbaren genetischen Baueinheiten, und am stärksten bevorzugt Phagendisplay, ist ein mächtiges Verfahren zur Erzeugung von neuen Polypeptidbindungseinheiten, welches das Einfügen eines neuen DNA-Segments in das Genom eines Bakteriophagen (oder einer anderen amplifizierbaren genetischen Baueinheit) umfasst, so dass das Polypeptid, das durch die neue DNA codiert wird, auf der Oberfläche des Phagen erscheint. Wenn die neue DNA Sequenzdiversität enthält, dann stellt jeder Empfängerphage eine Variante der anfänglichen (oder "Stamm")-Aminosäuresequenz, die durch die DNA codiert wird, zur Schau und die Phagenpopulation (Bibliothek) stellt eine riesige Zahl von unterschiedlichen, aber verwandten Aminosäuresequenzen, zur Schau.
Eine Phagenbibliothek wird mit dem tPA-Molekül in Kontakt gebracht und es wird erlaubt, das tPA-Molekül zu binden, und nicht-Binder werden von Bindern abgetrennt. Auf verschiedene Arten werden die gebundenen Phagen von dem tPA befreit und amplifiziert. Da die Phage durch die Infektion von bakteriellen Zellen amplifiziert werden kann, sind sogar wenige Bindungsphagen ausreichend, um die Gensequenz, welche für eine Bindungseinheit codiert, zu offenbaren. Unter Verwendung dieser Techniken ist es möglich, eine bindende Phage zurückzugewinnen, die etwa eine von 20 Millionen in der Population ist. Eine oder mehr Bibliotheken, die jeweils 10 bis 20 Millionen oder mehr potentiell bindende Polypeptide zur Schau stellen, können schnell gescreent werden, um tPA-Liganden mit hoher Affinität zu finden. Wenn das Auswahlverfahren funktioniert, fällt die Diversität der Population mit jeder Runde, bis nur gute Binder zurückbleiben, d. h. das Verfahren konvergiert. Typischerweise wird eine Phagendisplay-Bibliothek viele eng verwandte Binder enthalten (10 bis 50 Binder aus 10 Millionen). Hinweise für Konvergenz umfassen erhöhte Bindung (gemessen durch Phagentiter) und Rückgewinnung von eng verwandten Sequenzen. Nachdem ein erster Satz von bindenden Polypeptiden identifiziert ist, kann die Sequenzinformation verwendet werden, um andere Bibliotheken zu entwerfen, die für Mitglieder mit zusätzlichen gewünschten Eigenschaften, z. B., Unterscheidungsvermögen zwischen tPA und bestimmten Fragmenten ausgerichtet sind.
Solche Techniken ermöglichen es, nicht nur eine große Zahl von Analoga zu screenen, sondern machen es praktikabel, die Bindungs-/Eluierungszyklen zu wiederholen und nebenher ausgerichtete Bibliotheken zum Screenen von Baueinheiten, die ein Analogon zur Schau stellen, aufzubauen, die die Anfangskriterien erfüllen. Demzufolge ist es in der Praxis der vorliegenden Erfindung am stärksten bevorzugt (1) dass eine Bibliothek von Bindungsdomänenanaloga gemacht wird, so dass sie auf replizierbaren genetischen Baueinheiten, wie zum Beispiel einer Phage, zur Schau gestellt werden; (2) dass die Bibliothek auf genetische Baueinheiten gescreent wird, die an tPA binden, wobei die Bindungsbedingungen des Screeningverfahrens die gleichen sind wie die Bindungsbedingungen, die für den gewünschten Affinitätsliganden vorausgewählt sind; (3) dass genetische Baueinheiten durch Eluierung unter den Freisetzungsbedingungen, vorausgewählt für den Affinitätsliganden, erhalten werden und vermehrt werden; (4) dass zusätzliche genetische Baueinheiten durch Eluierung unter hochzerstörenden Bedingungen (wie z. B. pH 2 oder niedriger, 8 M Harnstoff oder gesättigtes Guanidinthiocyanat, um extrem hohe Affinitätsverbindungen zwischen einigen zur Schau gestellten Bindungsdomänenanaloga und dem Ziel-tPA zu überwinden) erhalten werden und vermehrt werden; (5) dass die in (3) oder (4) erhaltenen vermehrten genetischen Baueinheiten, getrennt oder in Kombination durch die Schritte (2) und (3) oder (4) für einen oder mehr zusätzliche Cyclen cyclisiert werden; und (6) eine Konsensus-Sequenz von Hochaffinitätsbindern für Analoga bestimmt wird, die in genetischen Baueinheiten, gewonnen aus solchen Cyclen, exprimiert werden; (7) dass eine zusätzliche ausgerichtete Bibliothek konstruiert wird, basierend auf dem ursprünglichen Gerüst (Kandidat-Bindungsdomäne) und der Hoch-Affinitätskonsensus bei jeder variablen Aminosäureposition erlaubt wird und zusätzlich andere Aminosäuretypen erlaubt werden, die ausgewählt sind, um Aminosäuren zu umfassen, von denen geglaubt wird, dass sie besonders empfindlich für den Wechsel zwischen den Bindungsbedingungen und den Freisetzungsbedingungen sind; (8) dass diese ausgerichtete Bibliothek auf Mitglieder gescreent wird, die (a) fest binden (d. h. mit hoher Affinität) unter den Bindungsbedingungen und (b) sauber freisetzen (d. h. einfach von dem tPA-Ziel dissoziieren) unter den Freisetzungsbedingungen.
Verwendung der Affinitätsliganden bei der Chromatographie
Nachdem Mitglieder von einer oder mehr Bibliotheken isoliert sind, die an einen tPA mit gewünschter Affinität unter den Bindungsbedingungen binden und von dem tPA wie gewünscht unter den Freisetzungsbedingungen freigesetzt werden, kann die Isolierung der Affinitätsliganden auf bekannten Wegen erreicht werden. Wenn zum Beispiel die Analogon-Bibliothek aus potentiellen Affinitätsliganden, exprimiert auf Phagen, zusammengesetzt ist, können freigesetzte Phagen gewonnen werden, vermehrt werden, das synthetische DNA-Insert, das für das Analogon codiert, isoliert und amplifiziert werden, die DNA-Sequenz analysiert werden und jede gewünschte Menge des Liganden hergestellt werden, z. B. durch direkte Synthese des Polypeptids oder rekombinante Expression der isolierten DNA oder einer äquivalenten Codierungssequenz.
Zusätzlich können gewünschte Eigenschaften für den Liganden in einen analogen Liganden konstruiert werden, in der gleichen Weise wie Freisetzungseigenschaften in den Liganden konstruiert wurden, durch Folgen von ähnlichen Schritten, wie oben beschrieben.
Die so isolierten Affinitätsliganden werden extrem nützlich für die Isolation von tPA durch Affinitätschromatographieverfahren sein. Jedes herkömmliche Verfahren der Chromatographie kann eingesetzt werden. Bevorzugt wird ein Affinitätsligand der Erfindung auf einem festen Träger immobilisiert, der, z. B. zum Packen einer Chromatographiesäule, geeignet ist. Der immobilisierte Affinitätsligand kann dann geladen werden oder mit einem Zufuhrstrom unter vorteilhaften Bedingungen für die Bildung von Ligand/tPA-Komplexen in Kontakt gebracht werden, nicht-bindende Materialien können weggewaschen werden, dann kann der tPA eluiert werden unter Bedingungen, die die Freisetzung des tPA-Moleküls von einem Ligand/tPA-Komplex begünstigen. Alternativ kann eine Sammelchromatographie durch gemeinsame Zugabe eines Zufuhrstroms und eines geeignet markierten Affinitätsliganden in ein Reaktionsgefäß durchgeführt werden, dann Isolierung von Komplexen des tPA und Liganden unter Zuhilfenahme des Markers (z. B. eines polyHis-Affinitätsmarkers, welcher verwendet werden kann, um den Ligand zu binden, nachdem sich Komplexe gebildet haben), und schließlich Freisetzung des tPA aus dem Komplex, nachdem ungebundene Materialien entfernt wurden.
Es soll angemerkt werden, dass, obwohl präzise Bindungs- und Freisetzungseigenschaften in den Affinitätsliganden konstruiert werden, die nachfolgende Verwendung bei Affinitätsreinigung optimalere Bindungs- und Freisetzungseigenschaften offenbaren kann, unter welcher derselbe isolierte Affinitätsligand arbeiten wird. Deshalb ist es nicht wesentlich, dass der Affinitätsligand nach Isolierung gemäß dieser Erfindung immer nur bei den Bindungs- und Freisetzungsbedingungen eingesetzt wird, die zu dessen Abtrennung aus der Bibliothek führten.
Als letztes sollte daran gedacht werden, dass der Ligand mit der höchsten Affinität nicht unbedingt der beste für die kontrollierbare oder kosteneffektive Gewinnung eines tPA-Moleküls ist. Das Verfahren der Erfindung erlaubt die Auswahl von Liganden, die eine Vielzahl von gewünschten Eigenschaften haben, die wichtig für den Anwender sind, der die Isolation von tPA aus einem bestimmten Zufuhrstrom wünscht, wie zum Beispiel spezifische Bindung des tPA, gekoppelt mit vorhersagbarem und kontrolliertem sauberem Freisetzen von dem tPA, nützlicher Ladungskapazität, akzeptabler kompletter Eluierung, Wiederverwendbarkeit/Recyclebarkeit, usw.
Isolierung von tPA-Affinitätsliganden in Übereinstimmung mit dieser Erfindung wird unten weiter aufgezeigt werden. Die spezifischen Parameter, die in den folgenden Beispielen umfasst sind, sind dafür gedacht, die Praxis der Erfindung aufzuzeigen, und sie werden nicht aufgeführt, um den Umfang der Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken.
Beispiel 1
Die oben beschriebenen Techniken wurden angewendet, um Affinitätsliganden für den rekombinanten humanen Gewebetyp-Plasminogenaktivator (tPA) zu isolieren. Das Verfahren des Erzeugens von tPA-Affinitätsliganden umfasst drei allgemeine Schritte: (1) Das Screenen von etwa 11 Millionen Varianten einer stabilen Stamm proteindomäne für die Bindung an tPA, (2) Herstellen von kleinen Mengen der interessantesten Liganden, und (3) chromatographisches Untersuchen von einem Liganden, gebunden an aktivierte Kügelchen für die Affinitätsreinigung von tPA aus einer mit Plasma versehenen Probe.
Für diese Arbeit wurde tPA von CalBiochem (#612200) gekauft und an Reacti-Gel^TM-Agarosekügelchen von Pierce Chemical Company durch Verfahren, die in Markland et al. (1996) beschrieben sind, immobilisiert. Etwa 200 μg von tPA wurden an 200 μl Reacti-Gel^TM-Aufschlämmung gekuppelt.
Vier Bibliotheken von Phagen-präsentierten Proteinen wurden für das Screeningverfahren ausgewählt. Drei basierten auf der ersten Kunitz-Domäne von Lipoprotein-assoziiertem Koagulationsinhibitor (LACI-K1), genannt Lib#1, Lib#3 und Lib#5, und eine basierte auf Cucurbida maxima Trypsininhibitor I (CMTI-I). CMTI-I ist ein Protein, das in Kürbissamen gefunden wird, und ist in der Lage, den sauren und proteolytischen Bedingungen im Darm zu widerstehen. Diese Proteine haben jeweils drei Disulfidbrücken, was diese höchst eingeschränkt und stabil macht. Für Mitglieder dieser Proteinfamilien wurde gezeigt, dass sie hervorragende thermische Stabilität (> 80°C ohne Verlust von Aktivität), hervorragende pH-Stabilität (kein Verlust von Aktivität bei Inkubation über Nacht bei pH 2 und 37°C oder bei 1 Stunde Aussetzen bei pH 12 und 37°C), und hervorragende Stabilität gegenüber Oxidation haben. Die Anzahl von potentiellen Aminosäuresequenzen in jeder Bibliothek ist in Tabelle 1 unten gegeben:
Die Gesamtdiversität der Phagendisplay-Bibliotheken, die in dieser Arbeit gegen tPA gescreent wurden, wurde abgeschätzt, etwa 11.000.000 zu sein. Die Kunitz-Domäne und die CMTI-Domäne könnten durch Variierung von anderen Teilen von deren Oberflächen eine viel größere Diversität präsentieren.
Zwei Screening-Protokolle wurden verwendet: "langsamer Screen" und "schneller Screen". Bei einem langsamen Screen wurden Phagen von jeder Runde vor der nächsten Runde in E. coli amplifiziert. Beim schnellen Screen diente eine von dem tPA in einer Runde gewonnene Phage, ohne Amplifizierung als die Zufuhr für die nächste Runde. Beim schnellen Screen nahmen sowohl die Zufuhr als auch die gewonnene Zahl von Phagen über mehrere Runden schnell ab. Die Zufuhrmenge kann beim langsamen Screen konstant gehalten werden. Die konstante Zufuhr bei einem langsamen Screen erlaubt den Vergleich zwischen Runden, die die Selektion oder den Mangel davon anzeigen können, aber Vergleiche zwischen Runden von schnellen Screens sind schwierig zu interpretieren. Schnelles Screening erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass Phagen eher aufgrund der Bindung als für andere unwichtige Eigenschaften (z. B. Infektiosität oder Wachstumsraten) ausgewählt werden.
Die beschriebenen Phagenbiblioteken wurden durch vier Runden auf Bindung an tPA gescreent. In der ersten Runde wurden die Phagenbibliotheken in getrennten Reaktionen mit tPA-Agarosekügelchen bei pH 7 in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gemischt. 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) wurde zugegeben, um unspezifische Bindung zu verringern. Ungebundene Phagen wurden bei pH 7 abgewaschen und die gebundenen Phagen wurden bei pH 2, nur für den ersten Screen, eluiert. Die anschließenden drei schnellen Screens hatten ein unterschiedliches Eluierungsprotokoll und verwendeten vereinigte Ausstöße des ersten Screens. Pool A bestand aus den kombinierten Ausstößen der CMTI und Lib#1-Bibliotheken, und Pool B bestand aus den kombinierten Ausstößen der Lib#3- und Lib#5-Bibliotheken. Die Bindung von vereinigten Bibliotheken wurde bei pH 7 durchgeführt, die erste Eluierung wurde jedoch bei pH 5 durchgeführt, um gebundene Phagen zu entfernen, und eine folgende Eluierung bei pH 2, um Phagen zu eluieren, welche im Bereich pH 5–pH 2 freigesetzt werden. Dies wurde noch zweimal wiederholt, für eine Gesamtzahl von 4 Selektionsrunden.
Die Phagentiter von den endgültigen drei Screeningrunden sind unten in Tabelle 2 gezeigt. Der Ausstoß von einer Runde war die Zufuhr für die nächste Runde.
Von den Phagentitern scheint es, dass Pool A konvergiert und starke Binder enthält, während Pool B weder signifikante Konvergenz noch starke Binder hat.
Vierzig Phagen-Klone wurden von jedem Pool von den Ausgewählten der dritten Runde des schnellen Screens für eine weitere Analyse ausgewählt, 20 von dem pH 5-Pool und 20 von dem pH 2-Pool. Die Phagen-DNA wurde amplifiziert unter Verwendung von PCR, um zu bestimmen, ob von CMTI- oder LACI- stammende Genfragmente anwesend waren.
Von CMTI-stammende Konstrukte wurden in 38 von 40 Phagen-Isolaten von dem schnellen Screen von Pool A gefunden. Die zurückbleibenden Isolate ergaben kein PCR-Produkt, was auf eine Deletion hinweist. Nur 10 von den 40 Phagen-Isolaten von dem schnellen Screen von Pool B enthielten das geeignete Konstrukt, ein weiterer Hinweis, dass die Suche nicht erfolgreich war.
Ein Zeichen, dass ein bestimmtes Phagen-präsentiertes Protein eine hohe Affinität für das tPA-Molekül hat, ist, dass es wiederholt gefunden wird. Von den 18 von CMTI-stammenden Phagen-Isolaten, welche bei pH 2 freisetzen, wurde eine Sequenz fünfmal gefunden, eine zweite viermal und zwei der verbliebenen traten dreimal auf. Die 18 Sequenzen bildeten eine eng verwandte Familie von ausgewählten Molekülen, ein weiteres Zeichen, dass die Suche erfolgreich konvergiert hatte.
Tabelle 3 zeigt die Variabilität der beobachteten Sequenzen als eine Funktion der erlaubten Variabilität und des Auswahl-pHs. Die CMTI-Bibliothek wurde durch Einfügen von kombinatorischer Sequenzdiversität in Codons aufgebaut, die eine Oberflächenausgesetzte Schleife spezifizieren, die zwischen den Cysteinen 3 und 10 des Stamm-CMTI-Proteins gebildet ist. Die Cysteine wurden
Tabelle 3 zeigt die DNA-Sequenz der CMTI-Bibliothek. Die Reste F_–5 und Y_–4 entsprechen den Resten 14 und 15 in der Signalsequenz von M13mp18, aus welcher die Empfängerphage konstruiert wurde. Spaltung durch Signalpeptidase I (SP-I) wird vermutet, zwischen A_–1 und R₁ aufzutreten. Als 100–113 bezeichnete Reste machen einen Linker zwischen den CMTI-Varianten und reifem III, welche mit dem Rest A₂₀₁ beginnt. Die Aminosäuresequenz Y₁₀₄IEGRIV sollte die spezifische Spaltung des Linkers mit bovinem Faktor X_a zwischen R₁₀₈ und I₁₀₉ erlauben. Die M13-verwandte Phage, in welcher diese Bibliothek aufgebaut wurde, trägt ein Ampicillin-Resistenzgen (Ap^R), so dass Zellen, die durch die Bibliotheksphage infiziert wurden, Ap-resistent werden. Bei jeder variablen Aminosäureposition ist der Wildtyp-Aminosäurerest, der gezeigt ist, unterstrichen. Die in Tabelle 3 gezeigte Aminosäuresequenz ist bezeichnet als SEQ ID NO: 2; die in Tabelle 3 gezeigte Nucleotidsequenz ist bezeichnet als SEQ ID NO: 3.
Die von dem pH 5-Auswahlverfahren erhaltenen Isolate zeigten eine größere Sequenzdiversität auf als die pH 2-Ausgewählten (Tabelle 4). Trotz der größeren Sequenzvariabilität umfassen die pH 5-Ausgewählten eine Familie von eng verwandten Proteinsequenzen. Bildung von allen Kombinationen der Aminosäuretypen, die an jeder Position beobachtet wurden, gibt nur 13.400 (= 2 × 4 × 3 × 4 × 7 × 5 × 4), was 0,15% der ursprünglichen Population ist. In den 20 bestimmten Sequenzen waren vier Sequenzen, die mehr als einmal auftraten, was es nahelegt, dass die tatsächliche Diversität weniger als 13.400 ist. Obwohl die Familie von pH 5-ausgewählten Sequenzen deutlich verwandt zu der pH 2-ausgewählten Familie ist, gab es nur ein Beispiel von Sequenzidentität zwischen den zwei Sequenzpopulationen.
An den Positionen 6 und 7 wurden die meisten (12 von 15) erlaubten Aminosäuretypen bei den pH 2-Ausgewählten abgelehnt. Von den ausgewählten Sequenzen ist es nicht klar, ob die ausgewählten Aminosäuren an Position 6 und 7 zur Bindung beitrugen oder nur den Ausschluss von nicht-akzeptablen Möglichkeiten an diesen Positionen darstellen.
Die mächtige Konvergenz des Auswahlprozesses ist insbesondere ersichtlich für die pH 2-Ausgewählten an den Positionen 2, 4 und 8, wo, obwohl viele Aminosäuretypen auftreten könnten, nur ein Aminosäuretyp gefunden wurde. Dies ist ein starker Hinweis, dass diese spezifische Aminosäure entscheidend für die Bindung ist. Bei jeder von diesen Positionen war der einzigartig ausgewählte Typ an dieser pH 2-Population auch der häufigste Typ an dieser Position in der pH 5-Population. Das Erlauben von allen beobachteten Aminosäuretypen an jeder Position des pH 2-Pools ergibt nur 36 Sequenzen, 0,0004% der Anfangspopulation. Dass viele Sequenzen mehr als einmal auftraten, deutet darauf hin, dass die Zahl der verschiedenen Sequenzen, die im pH 2-Pool vorliegen, nicht größer als 36 ist.
Tabelle 5 zeigt die Aminosäuresequenzen des variierten Bereichs (Aminosäurepositionen 1 bis 12) für die 38 sequenzierten Analoga von CMTI-I. Das Auftreten von Methioninresten an einer Position, die nicht ausgewählt wurde, um variiert zu werden (Position 11), deutet auf einen DNA-Synthesefehler bei der Bildung der Bibliothek hin.
In Tabelle 5 wurden Analoga, die die als 101–120 bezeichneten Sequenzen haben, durch Eluierung bei pH 5 erhalten und Analoga, die die Sequenzen 221–238 haben, durch Fraktionierung bei pH 2 erhalten.
Die Spezifität von Phagen-gebundenen Ligandkandidaten wurde durch Bestimmung ihrer Affinität für andere immobilisierte Proteine getestet. Die Phagen-gebundenen Proteine zeigten keine Affinität für die verwandten humanen Serumproteasen Plasmin und Thrombin, gebunden an Kügelchen (Daten nicht gezeigt). Zusätzlich wurden an den Phagen-Isolaten Experimente durchgeführt, um die relative Affinität für und Freisetzungseigenschaften von immobilisiertem tPA zu bestimmen.
Im Falle der pH 5-freisetzenden Phagen-Isolate wird die Mehrheit der Phagen bei pH 5 freigesetzt und eine Größenordnung weniger werden durch weitere Erniedrigung des pHs auf 2 freigesetzt. Dies zeigt, geeignete Affinitätsliganden mit einer relativ sauberen Freisetzung nach Verringerung des pHs auf 5. Im Falle der pH 2-freisetzenden Isolate ergab nur Isolat #232 eine wahrhaft selektive Bindung bei pH 5 und dann Freisetzung bei pH 2.
Ligandsynthese und Immobilisierung
Als nächstes wurden freie CMTI-Polypeptidderivate synthetisiert unter Verwendung der Sequenzinformation, die aus der DNA der Phagen-Isolate bestimmt wurde. Obwohl die CMTI-Derivate (Analoga) einfach chemisch synthetisierbar gewesen wären, wurde entschieden, die Polypeptide in Hefe zu exprimieren. Eines der pH 5-freisetzenden Isolate, #109 (Tabelle 5; Ref. SEQ ID NO. 12) und eines der pH 2-freisetzenden Isolate, #232 (Tabelle 5; Ref. SEQ ID NO. 35) wurden ausgewählt für die Expression in Pichia pastoris. An Positionen 4 und 8 hat Isolat #109 die gleichen Aminosäuretypen, wie sie in den pH 2-Ausgewählten beobachtet werden; an Position 2 unterscheidet sich Isolat #109 von den pH 2-Ausgewählten.
Die geeigneten Genkonstrukte wurden synthetisiert und in das Pichia pastoris-Expressionssystem (Vedvick et al., 1991 und Wagner et al., 1992) insertiert, um Produktionsstämme zu erzeugen. Fünf-Liter-Fermentationen von jedem Stamm resultierten in hochgradiger Expression. Es wurde abgeschätzt, dass die Proteine mit über 1 g/l in das Fermentationsmedium sekretiert wurden. Die Rohfermentationssuspensionen wurden durch Zentrifugation und 0,2 μ Mikrofiltrationsschritte geklärt. Die 0,2 μ Filtrate wurden durch Ultrafiltration gereinigt unter Verwendung von PTTK-Kassetten mit einem 30 kDa NMWL-Ausschluss. Die Liganden wurden aus den Ultrafiltrationsfiltraten durch Kationenaustausch-Chromatographie mit Macro-Prep High S-Kationenaustauschträger (BioRad) gereinigt, gefolgt von zwei Trennungen an reverser Phase. Die Trennungen an reverser Phase verwendeten einen linearen Gradienten, beginnend mit Wasser, enthaltend 0,1% TFA, und mit ansteigendem Acetonitril (enthaltend 0,1% TFA), welches auf 50% bei 90 Minuten erhöht wurde. Das erhaltene Protein hatte eine Reinheit von mehr als 95%, wie durch PDA-Spektralanalyse auf einer 5 μm-Säule mit reverser Phase gemessen wurde.
Der Ligandkandidat wurde auf einem Bis-acrylamid/Azlactoncopolymer-Träger mit immobilisiertem Diaminopropylamin (Emphaze Ultralink^TM; Pierce Chemical Co.) gemäß den Anweisungen des Herstellers immobilisiert. Etwa 30 mg von CMTI-Analogen #109 wurden an 1 ml des aktivierten Chromatographieträgers gekuppelt.
Säulentesten
Eine Waters AP-Minisäule, 5,0 cm × 0,5 cm ID Nominalabmessungen, wurde modifiziert durch die Zugabe eines zweiten Flussadapters, welcher es erlaubte, die Säulenlänge auf 2,5 cm zu reduzieren. Diese Säule wurde unter Verwendung des empfohlenen Protokolls mit #109-Emphaze Ultralink^TM-Kügelchen gepackt und unter Verwendung einer Serie von ansteigenden NaCl-Konzentration Waschungen bei pH 7, abschließend mit einer 1 M-Waschung, gewaschen.
In einem ersten Test der #109-Affinitätssäule wurde Gewebetyp-Plasminogenaktivator, erhalten von CalBiochem, gemäß den Spezifikationen des Herstellers aufbereitet, um eine 1 mg/ml-Lösung von tPA bereitzustellen. Koagulationsstandard (Coagulation Control Level 1 von Sigma Diagnostics, Katalog #C-7916), lyophilisiertes humanes Plasma, wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers gelöst, dann 10 × verdünnt und der tPA zugegeben. Diese Probe wurde auf die Säule geladen und in Gegenwart von 1 M NaCl in allen Puffern eluiert, was ausreichend war, die nicht-spezifische Proteinbindung an die Säule zu unterbinden und die pH-kontrollierte Bindung und Freisetzung des tPA zu erlauben. Es gab zwei eindeutige Peaks: der erste enthielt die Plasmaproteine (welche nicht auf der Säule gehalten wurden); der zweite, erhalten nach Erniedrigung des pH, enthielt den tPA ohne jegliche kontaminierenden Plasmakomponenten. Die Resultate wurden durch silbergefärbtes Gel (nicht gezeigt) bestätigt. 90% des tPA-Produkts wurde zurückgewonnen.
Eine zweite Affinitätssäule, verwendend das #109 CMTI-Analogon, wurde unter Verwendung von EAH-Sepharose 4B^TM-Agarosekügelchen (Pharmacia; Upsala SE) als Chromatographieträger hergestellt. Die Trennung wurde auf einem HPLC-System, hergestellt durch Waters Inc. (Milford, MA), durchgeführt. Das System umfasste einen Autoinjektor Modell 718, ein Lösungsmittel-Lieferungssystem Modell 600 mit Pumpköpfen, fähig zur Lieferung von 20 ml/Minute und einen Photodiode Array Detector Modell 996. Die gesamte Ausrüstung wurde gemäß den Spezifikationen des Herstellers installiert. Das System wurde durch einen Pentium 133 IBM-kompatiblen Computer kontrolliert, zur Verfügung gestellt von Dell Corp. Der Computer war mit einer 1 Gigabyte-Festplatte, 16 Megabytes RAM und einem Farbmonitor, auf welchen die Millenium-Software, zur Verfügung gestellt von Waters Inc., geladen wurde, ausgestattet.
Spektrale Daten im Bereich von 200 nm bis 300 nm wurden mit einer Auflösung von 1,2 nm gesammelt. 1, 2, 3 und 4 wurden bei 280 nm gesammelt. Die mobilen Phasen für die Chromatographiearbeit waren Puffer A und Puffer B: Puffer A bestand aus 25 mM Kaliumphosphat, 50 mM Arginin und 125 mM NaCl, gepuffert auf pH 7 mit Kaliumhydroxid. Puffer B bestand aus 50 mM Kaliumphosphat und 150 mM NaCl, gepuffert auf pH 3 mit Phosphorsäure. In allen Fällen wurden die Proben in 100% Puffer A injiziert, gefolgt von Waschen mit 100% Puffer A von t = 0 bis t = 2 min. Von t = 2 min bis t = 8 min wurde mit 100% Puffer B eluiert. Nach t = 8 min wurde mit 100% Puffer A eluiert. Das Gradientenverzögerungsvolumen des HPLC-Systems war etwa 4 ml und die Flussrate war 0,5 ml/min.
tPA von einer anderen kommerziellen Quelle wurde gemäß den Spezifikationen des Herstellers aufbereitet, um eine 1 mg/ml-Lösung bereitzustellen. Koagulationsstandard (Coagulation Control Level 1 von Sigma Diagnostics, Katalog #C-7916), lyophilisiertes humanes Plasma, wurde gemäß den Anweisungen des Her stellers gelöst. Diese Lösung wurde 10 : 1 verdünnt, um eine Lösung mit etwa 10-facher Absorption der tPA-Lösung zu erhalten.
In dem in 1 gezeigten Test wurde eine Probe von reinem tPA (25 μl von 1 mg/ml tPA) über die #109 CMTI-Derivat enthaltende Säule laufengelassen und wie oben beschrieben eluiert. Das Chromatogramm zeigt scharfe Eluierung von etwa 90% des tPA-Materials nach etwa 15 min. In dem in 2 gezeigten Test wurde eine Probe von Koagulationsstandard (10 × Verdünnung) über die #109 CMTI-Derivat enthaltende Säule laufen gelassen unter den oben beschriebenen Eluierungsbedingungen. Praktisch alles Material eluierte sofort von der Säule (wurde nicht zurückgehalten). In der in den 3 und 4 gezeigten Testtrennung wurde eine tPa enthaltende Probe zu humanem Plasmastandard zugegeben, auf die Säule geladen und wie oben beschrieben eluiert. Wie in 3 und 4 gesehen werden kann, wurde der tPA zurückgehalten und die Plasmaproteine in dem Fehlvolumen eluiert. Gebundender tPA wurde bei etwa 15,4 Minuten freigesetzt. Es wurde abgeschätzt, dass der tPA bei etwa pH 4 freigesetzt wurde. Der tPA-Peak wurde gesammelt und untersucht unter Verwendung eines silber-gefärbten reduzierenden SDS-Polyacrylamidgels, und beim Vergleich mit dem Startmaterial wurde gefunden, dass er > 95% rein ist.
Beispiel 2
Die tPA-Affinitätsliganden, die aus der CMTI-Bibliothek isoliert wurden, wurden weiter untersucht, um zusätzliche Kandidatdomänen zu entwerfen, die ebenfalls an tPA binden könnten.
Wie oben angemerkt, traten fast alle Veränderungen der Aminosäurepositionen, die beim Aufbau der CMTI-Bibliothek verwendet wurden, zwischen zwei Cysteinen an Positionen 3 und 10 von CMTI-I auf (siehe Tabelle 3). Bei dem Stamm-CMTI-Protein bilden diese Cysteine Disulfidbrücken mit anderen Cysteinresten woanders in dem Protein (siehe SEQ ID NO: 1), jedoch mit der erfolgreichen Isolierung von Affinitätsliganden aus der CMTI-Bibliothek wurde eine zweite Bibliothek konzipiert, welche darauf basierte, ein trunkiertes 15-Aminosäure-Segment des Isolats #109 (siehe Aminosäuren 1–15 von SEQ ID NO: 12) zu variieren. Wenn die C₃- und C₁₀-Cysteine dieser Mitglieder eine Disulfidbrücke bildeten, könnte eine eingeschränkte Schleife mit tPA-Bindungseigenschaften erhalten werden. Anfangsstudien mit dem 15-Aminosäure-Segment, stammend von Affinitätsligand-Isolat #109, gebunden an einen chromatographischen Träger, deutete an, dass die C₃-C₁₀-Schleife sich bildete und dass die immobilisierte Schleife an tPA gebunden hat.
Die vorhergehenden Experimente zeigen auf zwei neue Familien von tPA-Affinitätsliganden, die in Übereinstimmung mit dieser Erfindung isoliert wurden, umfassend Polypeptide, enthaltend die Sequenzen:
worin X₁ Trp oder Leu ist; X₂ Pro, Ser, Thr oder Ile ist; X₃ Arg, Lys oder Thr ist; X₄ Ser, Tyr, Thr oder Ala ist; X₅ Ser, Tyr, Asp, Val, Pro, Ala, His, Asn oder Thr ist; X₆ Leu, Met, Gln, Arg oder Lys ist; X₇ Glu, Gly oder Arg ist und Xa zumindest Lys oder Met ist. Nachdem die Anwesenheit von Met-Resten an Position 11 in der Sequenz nicht geplant war, es sich aber herausgestellt hatte, dass dies für die Bindung an tPA favorisiert ist, ist es wahrscheinlich, dass andere Aminosäuren, zum Beispiel andere nicht-polare Aminosäuren, wie zum Beispiel Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro oder Trp, die an Position 11 sub stituiert sind, zusätzliche tPA-Bindungsanaloga bereitstellen werden.
Folgend der vorangehenden Beschreibung können die wichtigen Eigenschaften für die Trennung von tPA aus jedem Zufuhrstrom in die Bindungsdomänen einer entworfenen Bibliothek konstruiert werden, so dass das Verfahren dieser Erfindung unweigerlich zu einigen Affinitätsligandkandidaten führt, die geeignet sind für die Trennung des tPA unter wünschenswerten Bindungs- und Freisetzungsbedingungen. Eine hohe Ausbeute des tPA ohne Inaktivierung oder Zerstörung des Produkts, mit hoher Reinheit, mit dem Ausschluss von sogar nah verwandten Verunreinigungen, bei akzeptablen Kosten und mit wiederverwendbaren oder recyclebaren Materialien; alles kann gemäß der vorliegenden Erfindung erreicht werden. Zusätzliche Ausführungsformen der Erfindung und alternative Verfahren, angepasst an eine bestimmte tPA-Form oder einen Zufuhrstrom, werden offensichtlich beim Studieren der vorhergehenden Beschreibung. Alle solche Ausführungsformen und Alternativen sind geplant, innerhalb des Umfangs dieser Erfindung zu sein, wie durch die Ansprüche definiert, die folgen.
Literaturstellen

Boschetti, E., J. Chromatography, A 658: 207–236 (1994).
Ladner, R. C., "Constrained peptides as binding entities." Trends in Biotechnology, 13(10): 426–430 (1995).
Markland, W., Roberts, B. L., Ladner, R. C., "Selection for Protease Inhibitors Using Bacteriophage Display," Methods in Enzymology, 267: 28–51 (1996).
Narayanan, S. R., "Preparative affinity chromatography of proteins," J. Chrom. A, 658: 237–258 (1994).
Knight, P., Bio/Technology: 8: 200 (1990).
Vedvick, T., Buckholtz, R. G., Engel, M., Urcam, M., Kinney, S., Provow, S., Siegel, R. S., und Thill, G. P., "High level secretion of biologically active aprotinin from the yeast Pichia pastoris", J. Industrial Microbiol., 7: 197–202 (1991).
Wagner, S. L., Siegel, R. S., Vedvick, T. S., Raschke, W. C., und Van Nostrand, W. E, "High level expression, purification, and characteriziation of the Kunitz-type protease inhibitor domain of protease Nexin-2/amyloid β-protein precursor," Biochem. Biphys. Res. Comm., 186: 1138–1145 (1992).

SEQUENZLISTE

Claims

Affinitätsligand, geeignet zur Isolierung von tPA aus einer Lösung, die ihn enthält, umfassend ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz: Arg-X₁-Cys-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-Cys-X₈, wobei X₁ Trp oder Leu ist; X₂ Pro, Ser, Thr oder Ile ist; X₃ Arg, Lys oder Thr ist; X₄ Ser, Tyr, Thr oder Ala ist; X₅ Ser, Tyr, Asp, Val, Pro, Ala, His, Asn oder Thr ist; X₆ Leu, Met, Gln, Arg oder Lys ist; X₇ Glu, Gly oder Arg ist; und X₈ Lys, Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro oder Trp ist.
Affinitätsligand, geeignet zur Isolierung von tPA aus einer Lösung, die ihn enthält, umfassend ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz: Arg-X₁-Cys-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-Cys-X₈-Lys-Asp-Ser-Asp-Cys-Leu-Ala-Glu-Cys-Val-Cys-Leu-Glu-His-Gly-Tyr-Cys-Gly, wobei X₁ Trp oder Leu ist; X₂ Pro, Ser, Thr oder Ile ist; X₃ Arg, Lys oder Thr ist; X₄ Ser, Tyr, Thr oder Ala ist; X₅ Ser, Tyr, Asp, Val, Pro, Ala, His, Asn oder Thr ist; X₆ Leu, Met, Gln, Arg oder Lys ist; X₇ Glu, Gly oder Arg ist; und X₈ Lys, Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro oder Trp ist.
Affinitätsligand, geeignet zur Isolierung von tPA aus einer Lösung, die ihn enthält, mit einer Aminosäuresequenz, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
Affinitätsligand, geeignet, in einer Lösung bei pH 7 an tPA zu binden und bei einem pH von 5 oder niedriger von tPA zu dissoziieren, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
wobei X₁ Trp oder Leu ist; X₂ Pro, Ser, Thr oder Ile ist; X₃ Arg, Lys oder Thr ist; X₄ Ser, Tyr, Thr oder Ala ist; X₅ Ser, Tyr, Asp, Val, Pro, Ala, His, Asn oder Thr ist; X₆ Leu, Met, Gln, Arg oder Lys ist; X₇ Glu, Gly oder Arg ist; und X₈ Lys, Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro oder Trp ist; und Arg-X₁-Cys-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-Cys-X₈-Lys-Asp-Ser-Asp-Cys-Leu-Ala-Glu-Cys-Val-Cys-Leu-Glu-His-Gly-Tyr-Cys-Gly, wobei X₁ Trp oder Leu ist; X₂ Pro, Ser, Thr oder Ile ist; X₃ Arg, Lys oder Thr ist; X₄ Ser, Tyr, Thr oder Ala ist; X₅ Ser, Tyr, Asp, Val, Pro, Ala, His, Asn oder Thr ist; X₆ Leu, Met, Gln, Arg oder Lys ist; X₇ Glu, Gly oder Arg ist; und X₈ Lys, Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro oder Trp ist.
Affinitätsligand gemäß Anspruch 3, wobei der Affinitätsligand eine Aminosäuresequenz hat, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
Affinitätsligand gemäß Anspruch 3, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
Verfahren zur Isolierung eines Affinitätsliganden, geeignet zur Abtrennung von tPA aus einer Lösung, die ihn enthält, wobei das Verfahren umfasst: (a) Auswählen einer ersten Lösungsbedingung, bei der ein Affinitätsligand an den tPA binden wird; (b) Auswählen einer zweiten Lösungsbedingung, bei der ein Affinitätskomplex zwischen dem tPA und dem Affinitätsliganden dissoziieren wird, wobei die zweite Lösungsbedingung unterschiedlich zur ersten Lösungsbedingung ist; (c) Bereitstellen einer Bibliothek von Analoga einer in Frage kommenden tPA-Bindungsdomäne, wobei sich jedes Analogon von der in Frage kommenden tPA-Bindungsdomäne durch Variation der Aminosäuresequenz an einer oder mehreren Aminosäurepositionen innerhalb der Domäne unterscheidet; (d) Inkontaktbringen der Bibliothek von Analoga mit tPA bei der ersten Lösungsbedingung, für eine Zeit, die ausreicht, um die Bildung von Analogon/tPA-Bindungskomplexen zu erlauben; (e) Entfernen von Analoga, die unter der ersten Lösungsbedingung nicht binden; (f) Verändern der Lösungsbedingung des Schrittes des Inkontaktbringens (e) zu der zweiten Lösungsbedingung; und (g) Rückgewinnen der in Frage kommenden Bindungsanalogen, die unter der zweiten Lösungsbedingung freigesetzt wurden, wobei die zurückgewonnenen Analoga isolierte tPA-Affinitätsliganden identifizieren.
Verfahren zur Isolierung eines Affinitätsliganden, geeignet zur Abtrennung von tPA aus einer Lösung, die ihn enthält, gemäß Anspruch 7, wobei in Schritt (c) die Bibliothek der Analoga einer in Frage kommenden tPA-Bindungsdomäne eine Bibliothek von Analoga von Cucurbida maxima trypsin inhibitor-I (SEQ ID NO. 1) ist, hergestellt durch Aminosäuresubstitution an den Aminosäurepositionen 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 11; bei Schritt (d) die Bibliothek von Analoga mit immobilisiertem tPA bei Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die die Bildung von Analogon/tPA-Bindungskomplexen erlauben und bei pH 7 oder höher; bei Schritt (f) die Bedingungen des Kontaktschrittes durch Verringerung des pH auf pH 5 oder niedriger verändert werden; und bei Schritt (g) die in Frage kommenden Bindungsanaloga diese sind, die bei pH 5 oder niedriger freigesetzt werden.
Verfahren zur Reinigung von tPA aus einer Lösung die tPA enthält, umfassend: (a) Immobilisieren eines Polypeptids, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 42, auf einem chromatographischen Träger; (b) Inkontaktbringen einer Lösung, enthaltend tPA, mit dem Träger bei pH 7 oder höher; (c) Entfernen anderer Bestandteile aus der Lösung vom Kontakt mit dem Träger; (d) Zurückgewinnen von tPA von dem Träger bei pH 5 oder niedriger.
Verfahren zur Reinigung von tPA aus einer Lösung, die tPA enthält, umfassend: (a) Immobilisieren eines Affinitätsliganden gemäß Anspruch 2 auf einem chromatographischen Träger; (b) Inkontaktbringen einer Lösung, enthaltend tPA, mit dem Träger bei pH 7 oder höher; (c) Entfernen anderer Bestandteile aus der Lösung vom Kontakt mit dem Träger; (d) Zurückgewinnen von tPA von dem Träger bei pH 5 oder niedriger.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei der Affinitätsligand eine Aminosäuresequenz hat, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei der Affinitätsligand eine Aminosäuresequenz hat, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei der Affinitätsligand eine Aminosäuresequenz hat, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: