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CN1198837C - 组织纤溶酶原激活物(tPA)的纯化 - Google Patents

组织纤溶酶原激活物(tPA)的纯化 Download PDF

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CN1198837C CNB971946981A CN97194698A CN1198837C CN 1198837 C CN1198837 C CN 1198837C CN B971946981 A CNB971946981 A CN B971946981A CN 97194698 A CN97194698 A CN 97194698A CN 1198837 C CN1198837 C CN 1198837C
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Abstract

公开了一种用于获得分离组织型纤溶酶原激活物(tPA)用的亲和配体的方法，还公开了在pH7以高特异性结合tPA而在pH5或更低pH下释放tPA的配体。另外还公开了这样一些方法，使用这些方法可分离具有所需的预选的结合和释放(洗脱)特性的额外的配体，从而可开发特制的配体以解决由任何特定的含tPA原料流所产生的纯化问题。

Description

组织纤溶酶原激活物(tPA)的纯化
发明领域
本发明涉及蛋白质纯化领域，尤其涉及的是用于组织纤溶酶原激活物(tPA)纯化的亲和配体的发现及分离。
发明背景
人组织纤溶酶原激活物或称tPA是一种由内皮细胞产生的对包含在血的凝聚体(即血块或血栓)中的血纤蛋白具有高亲和性的蛋白酶。tPA也用于激活并将纤溶酶原(一种无活性的蛋白酶原)转化成纤溶酶(一种溶栓酶)。由于tPA可与血栓中的血纤蛋白结合并激活纤溶酶原从而溶解血块，因此，tPA成为用作溶栓酶)。由于tPA可与血柱中的血纤蛋白结合并激活纤溶酶原从而溶解血块，因此，tPA成为用作溶栓剂的重要药物。
尽管tPA已作为治疗血栓的主导药物，但其它有效的溶栓剂如链激酶、尿激酶仍有竞争性，因为它们虽然疗效较低但费用却低得多。为使tPA保持为最对症处方的溶栓剂或可分发给更多患者，只有探寻一条途径使tPA的生产更为高效或费用更低。
在tPA的生产中，从生产原料流中消除杂质如细胞碎片、病原体，非人蛋白质等的有效方法也是非常重要的，这是因为任何蛋白质产物最终都是给予人类患者。
这样，在更高效及更经济的基础上，需进一步探求用于tPA分离的试剂、物质及技术。
亲和层析是一种可获得显著一步增高纯度的非常有效的方法。如Narayanan(1994)报道了通过一步亲和层析使纯度提高了3000倍。
但亲和层析不是在大规模生物分子生产中所通用的技术。理想的亲和层析配体必须是在适当的费用基础上：(1)可以高亲和性、高容量、高特异性及高选择性捕捉靶生物分子；(2)不捕获其它分子(杂质)或可使其它分子(杂质)差异洗脱；(3)在保护靶分子(即不降解或不变性)的条件下使靶分子控释；(4)可清洁和重复使用层析基质；(5)可消除或使一些病原体灭活。但发现要提供能在药物生产中耐受所要求的清洁及环境卫生的适当费用的高亲和性配体很困难(参见Knight，1990)。
鼠单克隆抗体(MAb)已被有效地用作亲和性配体。但另一方面单克隆抗体生产费用很高，且易于在与生物分子纯化相关的清洁及消毒过程中滤掉及降解，导致基于MAbs的亲和性基质很快失去活性(见Naraganan，1994；Boschetti，1994)。另外尽管MAbs对靶分子有高特异性，但该特异性通常不能有效地防止与靶分子密切相关的杂质的捕获。此外，MAb的结合特性可通过免疫动物的免疫球蛋白的所有组成成分来检测，且因此业者必须满足于由动物免疫系统所供的结合特性，即只使用MAb技术优化或选择特定结合或洗脱特性的机会很小。最终，每个MAb的结合位点(25Kda～75Kda)甚至MAb片段的分子量非常高。
至今为止，还没有适于tPA纯化的接近上述理想的亲和配体特性的已知亲和配体。这种亲和配体不仅要与靶tPA分子具有高亲和性，也要在所需或选择的条件下释放tPA，并能在tPA存在的溶液中将tPA与其它组分区分出，和/或能耐受清洁及消毒过程以提供可再生的再利用的层析基质。
本文提供了如此的亲和性配体及其获得方法。
发明概述
本发明提供了一种具有由下述氨基酸序列组成的肽的分离多肽：
Arg-X1-Cys-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Cys-X8(SEQ ID NO：43)，其中X1是Trp或Leu；X2是Pro，Ser，Thr或Ile；X3是Arg，Lys或Thr；X4是Ser，Tyr，Thr或Ala；X5是Ser，Tyr，Asp，Val，Pro，Ala，His，Ash或Thr；X6是Leu，Met，Gln，Arg或Lys；X7是Glu，Gly或Arg；和X8是Lys，Met，Ala，Val，Leu，Ile，Phe，Pro或Trp，且其中所述多肽适于将tPA从含有其的溶液中分离出。
本发明提供了一种具有由下述序列组成的肽的分离多肽：
Arg-X1-Cys-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Cys-X8-Lys-Asp-Ser-Asp-Cys-Leu-Ala-Glu-Cys-Val-Cys-Leu-Glu-His-Gly-Tyr-Cys-Gly，其中X1是Trp或Leu；X2是Pro，Ser，Thr或Ile；X3是Arg，Lys或Thr；X4是Ser，Tyr，Thr或Ala；X5是Ser，Tyr，Asp，Val，Pro，Ala，His，Asn或Thr；X6是Leu，Met，Gln，Arg或Lys；X7是Glu，Gly或Arg；及X8是Lys，Met，Ala，Val，Leu，Ile，Phe，Pro或Trp，且其中所述多肽适于将tPA从含有其的溶液中分离出。
本发明提供了一种具有由选自以下一组的一种氨基酸序列组成的肽的分离多肽：
RLCPKTDLGCMK；和
RLCPKTDLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCG；其中所述多肽适于将tPA从含有其的溶液中分离出。
本发明提供了呈所需或所选择的结合特性及释放特性的tPA亲和配体的获得方法。本发明的亲和配体不仅具有亲和分离tPA的有利的结合特性，也具有所需的释放(洗脱)特性及其它所需特性如稳定性、耐降解性、持续性、再利用性及易于生产。
本发明的tPA亲和配体最初可从肽文库如噬菌体展示文库经以下方法鉴定：
(a)选择第一种溶液条件(即结合条件)，在此条件亲和配体可与tPA结合；
(b)选择第二种溶液条件(即释放条件)，在此条件tPA与亲和配体的亲和复合物将解离，其中第二种溶液条件不同于第一种溶液条件；
(c)提供一候选结合功能域的类似物文库，其中每个类似物与所述候选结合功能域不同之处在于功能域内一个或多个氨基酸位置的氨基酸序列的改变；
(d)将所述类似物文库与tPA在第一溶液条件下接触足够时间以使类似物/tPA结合复合物形成；
(e)除去在第一种溶液条件下未与tPA结合的类似物；
(f)将接触步骤(e)的溶液条件转变成第二种溶液条件；
(g)在第二种溶液条件下回收释放的候选结合类似物，其中回收的类似物即为分离的亲和配体。
在此一般程序之后，一些tPA的多肽亲和配体被分离，详见下述。
附图简述
图1示出组织纤溶酶原激活物(25μl 1mg/ml tPA)的层析谱，其是在具有固定化tPA亲和配体的亲和层析柱中，(CMTI衍生物109#，见实施例1所述)，以pH3～7梯度洗脱。在第15分钟的峰估计含有大约90％的注射的tPA。
图2示出Coagulation Standard(稀释10倍)在tPA亲和层析柱(CMTI衍生物109#)经上述洗脱的层析谱。在第15.6分钟的小峰是梯度假象。
图3示出由25μl Coagulation Standard(稀释10倍)与25μl tPA组成的混合物经pH7～pH3梯度洗脱的层析谱。在第1分钟的峰是血浆蛋白质的收集物，在第15.4分钟的峰是tPA。
图4示出与图3所示相同的但垂直刻度放大的层析谱。
优选实施方案详述
本发明通过亲和层析使tPA的高效纯化成为可能。
可通过各种已知方式生产tPA，包括化学合成；在转化的宿主细胞中生产；经天然发生的或重组转化的细菌、酵母、真菌、昆虫细胞及哺乳动物细胞分泌入培养基中；分泌自基因工程生物体(如转基因哺乳动物)；或在体液或组织如尿、血、乳汁等中。含有最初产生的粗制tPA的溶液有时被称为“原料流”(feed stream)。
每种生产tPA的方法可产生在原料流中的tPA，另外还含有一些杂质(就tPA而言)。本发明一个目的是生产亲和配体及包括此配体的制备物(如层析介质)，以使tPA从任何原料流中快速而高特异性纯化。在本文中所得的tPA亲和配体能在特异性预选条件下将tPA从特定原料流中分离。如果使用tPA的另一种生产方法产生一不同的原料流，就需一套不同的亲和配体以达到相同纯化水平。通过以下步骤可轻易得到新的一套配体。
本发明的tPA亲和配体高亲和性地与tPA结合，基本上排除了原料流中任何其它分子。另外当溶液条件改变时亲和配体可释放完全活性的tPA。
选择结合及释放条件：
为分离tPA的新配体，要选择两种溶液条件，即结合条件和释放条件。结合条件是在此条件之下所发现的亲和配体将与靶tPA结合的溶液条件；释放条件是在此条件之下所发现的亲和配体不与tPA结合的溶液条件。选择的两种条件要符合业者的标准，如条件易于达到，与其它纯化步骤相容，与其它亲和介质相比在两种条件之下转换费用较低等。优选的两种溶液条件是：(a)在tPA稳定曲线边界内(b)针对至少一种溶液参数是极不相关的。例如，如果在宽范围pH值内是稳定的，则适当的结合条件可以是pH7.5，150mM盐，25℃，适当的释放条件可以是pH3，150mM盐，25℃。对于pH稳定范围窄但在宽范围盐度可以稳定的一种不同的tPA形式，则两种有效的条件是，结合条件为：pH7.2，3M NaCl，25℃，释放条件为pH7.2，2mM NaCl，25℃。
候选结合功能域的筛选：
与为tPA所需的结合与释放而选择的特异溶液条件相结合，要选择一候选结合功能域作为呈现所要求的结合与释放能力的工程化亲和配体的结构模板。结合功能域可以是天然发生的或合成的蛋白质，或蛋白质的一个区域或一个功能域。候选结合功能域可基于候选结合功能域与tPA相互作用的已知知识进行筛选，但这不是关键。事实上，不需候选结合功能域对tPA有亲和性。目的是要提供一结构，从中可产生多个类似物(文库)，多个类似物包括一种或多种具有所需结合及释放性质(及所选的任何其它性质)的类似物。这样，前述的结合及释放条件可用作为候选结合功能域的正确多肽的知识，或用候选结合功能域所属的一类蛋白质或功能域的知识，或完全独立于选择候选结合功能域进行选择。相似地，结合和/或释放条件的选择可用已知结合功能域与tPA之间相互作用的知识来进行，如在一种或二种溶液条件下利于其间的相互作用，或不用如此已知的相互作用的知识来选择。两样，候选结合功能域的选择可以考虑或也可以不考虑结合和/或释放条件，但必须了解如果结合功能域类似物在结合或释放条件下不稳定就会得到无用的亲和配体。
在选择候选结合功能域时，目的是要提供一模板或亲本结构，从中可产生相似结构的类似物功能域文库。该类似物文库优选是偏性文库(相对于随机产生的文库)，其中产生文库的基本功能域要进行花斑化(Variegation)以利于所需亲和配体的性质。
候选结合功能域的性质明显影响进行针对tPA分子测试的衍生蛋白质(类似物)的性质。在选择候选结合功能域中，最重要的考虑是怎样将类似功能域呈递给tPA，即在什么构象中将与类似物接触。在优选的实施方案中，例如经采用并入本文作参考的例如U.S.5,403,484(Ladner等)及U.S.5,223,409(Ladner等)所述技术，通过将编码类似物的合成DNA插入可复制的基因包装中，导致该功能域在微生物如M13噬菌体表面展示从而产生类似物。
构建的多肽比未构建的肽呈现出更多的作为候选结合功能域的优势。蛋白质中表面残基的突变通常对蛋白质的整体结构或一般性质(如大小稳定性、变性温度)仅有轻微影响；而同时表面残基的突变可以极度影响蛋白质的结合性质。这已经充分证实，如BPTI-同源Kunitz区(见Lodner 1995)。蛋白质或构建功能域的表面残基的突变可导致类似物与未构建肽突变相比有较大的性质多样性，这是由于蛋白质构架或功能域的结构使突变残基的构象随残基不同而不同，随构架不同而不同。这对疏水侧链基团非常重要，除非其约束在结构中否则会变成隐蔽残基。肽区段(功能域)约束越紧，其与任何特定靶分子结合的可能性越小。但如果结合，则结合会更紧密及更特异。因此，优选选择这样的候选结构功能域及肽类似物的结构，其被限制在具有一些刚度的构架中。或者选择一个以上的候选结合功能域，以增加类似物文库的大小并提供另外的多样结构以呈递给tPA。由于文库大小增加了，并制备更多的多样结构的类似物，包括有用的构架并显示官能团的可能性增加至这样一种程度，即可发现高亲和性配体以用于从任何原料流中分离tPA。
候选结合功能域的大小也是一重要考虑。小蛋白质或多肽比大蛋白质如单克隆抗体有几种优势(见Ladner，1995)。首先，降低了每个结合位点的质量。具有低分子量的高稳定蛋白质功能域，如Kunitz区(～7Kda)，Kazal区(～7Kda)，Cucurbida maxima胰蛋白酶抑制因子(CMTI)区(～3.5KDa)及内皮肽(～2KDa)比抗体(150Kda)或单链抗体(30KDa)呈现更高的每克结合力。
其次，降低了非特异性结合的可能性，这是由于提供的表面较小。
第三，小蛋白质或多肽可被工程化以具有抗体不适用的唯一的限制(tethering)位点。例如小蛋白质可被工程化成只在适于限制的位点(如至层析基质)有赖氨酸，但这不适宜于抗体。通常发现，固定化抗体只有小部分是活性的，可能是由于与载体的非恰当结合所致。
多数由二硫键稳定的小蛋白质或多肽不含未被包含于二硫键中的半胱氨酸。这是由于使二硫键形成以用于稳定蛋白质的氧化条件也使其它未成对的半胱氨酸形成二硫键。这样，具有稳定的二硫键及奇数半胱氨酸的小蛋白质趋于形成二硫键键合的二聚体(如同源二聚体或异源二聚体)。功能域间的二硫键比稳定的功能域内的二硫键更易于还原。这样经选择性还原可得有单游离巯基的单体二硫键稳定的功能域。该疏基可被用于经用磺乙酰胺、碘乙酸或类似的α-碘羧酸基团形成硫醚而高稳定地固定这些功能域。
小蛋白质或多肽功能域也可经化学合成，其使特异固定化基团以不干扰与tPA的结合的方式掺入。例如如果含有二硫键的小蛋白质是化学合成的，氨基酸序列可经加入另外的半胱氨酸残基加以改变，从而以与序列中的其它半胱氨酸不同的方式阻断疏基。选择的疏基可被去阻断并可形成二硫键，然后加入的半胱氨酸可被去阻断，且该分子可经与适当物质如含固定化的NH2-CO-CH2I的底物反应而被固定化。
第四，限制的多肽结构当与完整结构功能域从一框架转移至另一框架时，更易保持其官能性。例如结合功能域结构易于从文库中用于呈递的框架(如展示于噬菌体上)转移至从呈递框架脱离的分离蛋白质或固定于层析基质上。
有许多小的稳定蛋白质功能域适于用作候选结合功能域，为此以下实用信息是已知的：①氨基酸序列，②一些同源功能域序列，③3-维结构，④在一定范围的pH、温度、盐度、有机溶剂、氧化剂浓度的稳定性数据。一些例子为：Kunitz功能域(58个氨基酸，3个二硫键)，Cucurbida maxima胰蛋白酶抑制因子功能域(31个氨基酸，3个二硫键)，与鸟苷蛋白相关的功能域(14个氨基酸，2个二硫键)，与来自革兰氏阴性细菌的热稳定肠毒素IA相关的功能域(18个氨基酸，3个二硫键)，EGF功能域(50个氨基酸，3个二硫键)，Kringle功能域(60个氨基酸，3个二硫键)，真菌糖结合功能域(35个氨基酸，2个二硫键)内皮肽功能域(18个氨基酸，2个二硫键)，及链球菌GIgG-结合功能域(35个氨基酸，无二硫键)。大多数但不是所有这些功能域都包含可固定及稳定结构的二硫键。基于每个这些功能域的文库，优选在噬菌体或其它遗传包装物上展示，可容易地构建并用于筛选结合类似物。
提供候选结合功能域类似物的文库：
一旦筛选出候选结合功能域，则创建潜在亲和配体文库，以用于在结合及洗脱(释放)条件下针对tPA进行筛选。该文库可通过制出一系列类似物而产生，每个类似物除在功能域序列含有一个或多个氨基酸取代之外相应于候选结合功能域。氨基酸取代要求在不明显改变功能域结构条件下改变功能域的结合特性，至少是对大多数氨基酸取代而言是如此。优选的是为变化而选择的氨基酸位置(可变的氨基酸位置)是表面氨基酸位置，即在功能域的氨基酸序列中的位置是当功能域在其最稳定构型时在功能域的外表面(即暴露于溶液的表面)出现的位置。最优选的是待变化的氨基酸位置是相邻的或互相靠近的，如此以增大取代的效用。另外，可将额外的氨基酸加入候选结合功能域的结构中。在优选的实施方案中，尤其当已知许多关于tPA与其它分子的相互作用尤其是与候选结合功能域的相互作用的信息时，可确定那些是结合相互作用所必需的氨基酸位置，并在建立类似物文库的过程中保守(即为结合所必需的氨基酸不变化)。
产生类似物文库的目的是提供大量与tPA分子反应的潜在亲和配体，且通常在文库中类似物越多，文库的成员与tPA结合并在释放所需的预选条件下释放的可能性越大。另一方面只在氨基酸序列中6个位置的随机取代就可提供6千万个以上类似物，这是甚至当利用如噬菌体展示一样强力的筛选技术时也开始出现实用限制的文库规格。因此优选是产生一偏性文库，其中考虑为变化而指定的氨基酸位置以使对类似物结合特性的取代功效最大化，且允许或计划用于取代的氨基酸残基限于那些易于使类似物对从结合条件变为释放条件的溶液条件变化应答的氨基酸残基。
如前所述，U.S.5,223,409中所述的技术尤其可用于制备相应于所选择的候选结合功能域的类似物文库，该类似物将以适于大规模筛选大量与靶tPA分子相关的类似物的形式存在。使用可复制的遗传包装，最优选的是噬菌体展示是一种产生新多肽结合体的有效方法，其包括将一种新DNA区段插入噬菌体(或其它可扩增的遗传包装)的基因组中，如此由该新DNA编码的多肽在噬菌体表面展示。当新DNA含有序列多样性时，每个受体噬菌体则展示由该DNA编码的原始(或“亲代”)氨基酸序列的一种变体，且噬菌体群(文库)展示出大量不同的但相关的氨基酸序列。
将噬菌体文库与tPA分子接触并允许与之结合，并将非结合者从结合者中分出。以各种方式将结合噬菌体从tPA中释出并扩增。由于噬菌体可经感染细菌细胞而扩增，所以只有少量结合噬菌体也可有效地展示编码结合体的基因序列。使用这些技术可回收大约是文库2千万分之一的结合噬菌体。每种可展示1～2千万或更多个潜在结合多肽的一种或多种文库可被快速筛选以发现高亲和性tPA配体。当进行选择程序时，经过每一轮后文库的多样性会降低，直至只有良好结合者保留下来，即过程趋同。典型地，一个噬菌体展示文库将含有一些紧密相关的结合者(1千万之中有10～50个结合者)。趋同的指示包括增加的结合(由噬菌体滴度测定)及密切相关序列的回收。在第一套结合多肽鉴定之后，该序列信息可用于设计偏向于具有另外所需性质成员的其它文库，所需性质如tPA与特定片段间的区别性。
该技术不仅使筛选大量类似物成为可能，而且使得实际操作上可重复结合/洗脱循环并建立为筛选满足最初规则的类似物展示包装的次级偏性文库。这样本发明实施时最优选的是(1)制备结合功能域类似物文库以在可复制的遗传包装和如噬菌体上展示；(2)筛选文库以选择与tPA结合的遗传包装，其中筛选程序的结合条件与预选的亲和配体所需的结合条件相同；(3)遗传包装可经在预选的亲和配体所需的释放条件下洗脱而获得并繁殖；(4)其它的遗传包装可经在高裂解条件(如pH为2或更低，8M尿素，或饱和硫氰酸胍以克服某些所展示的结合功能域类似物与靶tPA间过分的高亲和性)下洗脱而获得并繁殖；(5)由(3)或(4)得到的增殖的遗传包装分别或组合地进行步骤(2)和(3)或(4)的循环，进行一次或多次循环；(6)确定回收自该循环的遗传包装中表达的类似物关于高亲和结合物的共有序列；(7)基于最初框架(候选结合功能域)构建另外的偏性文库，并使高亲和共有序列位于每个可变的氨基酸位置上，且另外使选择的其它氨基酸类型包括据信对结合条件与释放条件间的变化特别敏感的氨基酸；(8)筛选该偏性文库的如下成员(a)在结合条件下牢固结合(即高亲和性)和(b)在释放条件下完全释放(即易于从tPA靶中解离)。
亲和配体在层析中的应用：
在分离出在结合条件下以所需亲和性与tPA结合并在释放条件下从tPA中释放出的一个或多个文库成员之后，亲和配体的分离可以已知方式完成。如果例如类似物文库由在噬菌体上表达的预期的亲和配体组成，则可以将释放的噬菌体回收，增殖，分离及扩增编码类似物的合成DNA插入物。分析DNA序列并制备所需数量的配体，如经直接合成多肽或由分离的DNA或等价编码序列重组表达。
其它为配体所需的性质可以如上述相似步骤以将释放性质工程化入配体中相同方式被工程化入类似物配体中。
这样分离的亲和配体对于经亲和层析方法分离tPA非常有用。可使用任何常规的层析方法。优选地，本发明的亲和配体被固定于例如适于填充层析柱的固体载体上。固定化的亲和配体可在适于配体/tPA复合物形成的条件下上样原料流或与原料流接触，洗脱未结合物质，然后在适于tPA分子从配体/tPA复合物中释放的条件下洗脱tPA。或者，可在反应容器中加入原料流及适当标记的亲和配体进行批量(bulk)层析，然后使用标记物(如聚His亲和标记，其可用于在复合物形成后与配体结合)分离tPA与配体的复合物，最后在未结合物已被消除后将tPA从复合物中释放出。
需指出的是尽管精确结合及释放性质被工程化入亲和配体中，但随后用于亲和纯化时可揭示相同的分离的亲和配体所适用的更优化的结合及释放条件，因此，依据本发明分离后，亲和配体不必仅在导致其从文库中分离出的结合和释放条件下应用。
最后，需记住的是最高亲和性的配体不必是tPA分子的受控或节约回收所最优的。本发明的方法使得选择的配体具有将tPA从特定原料流中分离出的业者所寻求的一系列重要的所需特性，如tPA的特异结合及tPA的可预期和受控的完全释放，有用的荷载容量，可接受的完全洗脱，再使用/再循环性等。
根据本发明的亲和配体的分离将在以下进一步阐述。以下实施例中所包括的特异参数是为详细阐述本发明，并无限制本发明范围之意。
实施例1
使用上述技术以分离重组人组织纤溶酶原激活物(tPA)的配体。产生tPA亲和配体的方法包括三个通常步骤：(1)筛选与tPA结合的稳定的亲代蛋白质功能域的大约1千1百万个变体，(2)产生少量的最相应的配体，(3)层析测试一种与活性珠结合的配体以从血浆掺加样品中亲和纯化tPA。
为此，从CalBiochem购tPA(#612200)并用如Markland等(1996)所述方法将其固定在得自Pierce Chemical Company的Reacti-GelTM琼脂糖珠上。将大约200μg的tPA与200μl Readi-GelTM浆液偶联。
挑取噬菌体展示的蛋白质的四个文库用于筛选过程。三个是基于脂蛋白相关促凝剂抑制物的第一个Kunitz功能域(LACI-K1)，称为Lib#1，Lib#3和Lib#5，另一个基于Cucurbida maxima胰蛋白酶抑制物I(CMTI-I)。CMTI-I是一种发现于南瓜种子中的蛋白质，并能耐受内脏的酸度及水解蛋白质的条件。这些蛋白质每种都具有三个二硫桥，使其具有高受限性及稳定性。这些蛋白质家庭成员已呈现出具有优异的热稳定性(780℃也未失活性)，优异的pH稳定性(在pH2，37℃温育一夜，或在pH12，37℃1小时也不失活性)，优异的氧化稳定性。每个文库中潜在氨基酸序列数见下表1所示：
表1：用于tPA筛选的噬菌体展示文库群
    文库名     亲代功能域     成员数
    Lib#1     LACI-K1     31,600
    Lib#3     LACI-K1     516,000
    Lib#5     LACI-K1     1,000,000
    CMTI     CMTI-1     9,500,000
    合计：     11,000,000
本工作中针对tPA筛选的展示文库的总多样性估计大约有1千1百万。Kunitz功能域和CMTI功能域可经其表面其它部分的改变而显示更高的多样性。
应用了二种筛选方案：“慢筛选”及“快筛选”。在慢筛选中，取自每轮的噬菌体在下一轮之前在E.coli中扩增。在快筛选中，在上一轮中从tPA回收的噬菌体不经扩增投入下一轮。在快筛选中噬菌体的投入和回收数在几轮后快速降低。在慢筛选中可以保持投入水平的恒定。慢筛选中恒定的投入使每轮间可进行对比以表示是否选择到或未选到，但快筛选每轮间的对比难以说明问题。快筛选增加了选择噬菌体的结合性而不是其它不相关性质(如感染性及生长率)的可能性。
与tPA结合的所述噬菌体文库要经四轮筛选。第一轮，将噬菌体文库混入并与tPA琼脂糖珠在pH7磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中反应。加入0.1％牛血清白蛋白(BSA)以降低非特异性结合。在pH7洗掉未结合的噬菌体，并在pH2洗脱结合噬菌体进行初次筛选。随后的三次快筛选具有不同的洗脱方案，并使用第一次筛选的集合产物。集合体A由CMTI及Lib#1文库的组合产物组成，集合体B由Lib#3及Lib#5文库的组合产物组成。集合文库的结合在pH7进行，但除去结合噬菌体的第一次洗脱在pH5进行，随后的洗脱在pH2进行以洗脱在pH5～pH2范围内释放的噬菌体。这种总数为4轮的筛选重复进行2次以上。
筛选的最后三轮中噬菌体的滴度见下表2所示。一轮的产物投入下一轮中。
表2：筛选前及针对tPA筛选文库最后三轮后噬菌体滴度
集合体A  集合体A  集合体B  集合体B
pH5洗脱  pH2洗脱  pH5洗脱  pH2洗脱
快筛选前 7×1011  7×1011  5×1011  5×1011
二轮后 1×108  3×107  7×106  3×106
三轮后 2×105  2×106  2×103  7×103
四轮后 3×104  2×105  150  90
由噬菌体滴度可显示集合体A是趋同的并含有强结合物，而集合体B既未明显趋同也无强结合物。
从每集合体的第三轮快筛选选择物中择出40个噬菌体克隆以进一步分析，20个择自pH5集合体，20个择自pH2集合体。用PCR扩增噬菌体DNA以检测CMTI-或LACI-衍生的基因片段是否存在。
CMTI衍生的构建物在来自集合体A快筛选的40个噬菌体分离物中的38个中发现。其余的分离物未产生PCR产物；表明是缺失的。从集合体B快筛选分离出的40个噬菌体分离物中只有10个噬菌体分离物含有合适的构建体，表明搜索没有成功。
特定的噬菌体展示的蛋白质具有对tPA分子的高亲和性的一个标志是其被重复发现。在pH2释放的18个CMTI衍生的噬菌体分离物中一个序列被发现5次，第二个序列被发现4次，剩下的序列中的二个序列被发现3次。这18个序列构成了所选择的分子密切相关的家族，进一步标志该搜索成功地趋同。
表3示出所观测的序列作为允许的变异性及选择pH值的函数的变异性。CMTI文库的构建是将组合序列多样性导入在亲代CMTI蛋白质的半胱氨酸3和10之间形成表面暴露的环的密码子。半胱氨酸由于形成结构的重要部分而是不变的。
这给出9.13×106个蛋白序列和16.8×106个DNA序列
表3示出了CMTI文库的DNA序列。残基F-5和Y-4相应于M13mp18的信号序列(从中受体噬菌体被工程化)的14和15位残基。假定信号肽酶(SP-I)的裂解发生在A1和R1之间。标为100～113的残基在CMTI变体与成熟肽III之间形成接头，成熟肽III起自残基A201。氨基酸序列Y104IEGRIV应使得接头在R108与I109之间被牛Xa因子特异性裂解。M13相关的噬菌体(其中构建了本文库)携有一氨苄青霉素抗性基因(ApR)，如此文库噬菌体感染的细胞具有Ap抗性。在每个可变氨基酸位置，野生型氨基酸残基以其下划线示出。示于表3的氨基酸序列标为SEQ ID NO：2，表3示出的核苷酸序列标为SEQ ID NO：3。
得自pH5筛选程序的分离物比pH2筛选物呈较高的序列多样性(表4)。尽管有较高序列多样性，pH5筛选物含有一密切相关的蛋白质序列家族。构成在每个位置观测到的氨基酸型的所有组合仅有13,400(＝2×4×3×4×7×5×4)种，只占原始群体的0.15％。在检测的20个序列中，有4个序列的发生多于一次，提示其实际多样性少于13，400。尽管pH5筛出的序列家族与pH2筛出的序列家族显然相关，但在两序列群中只有一个序列相同的实例。
表4：在选择用于结合tPA时CMTI中位置的变异性的降低
位置            2   3   4   5   6   7   8   9   10
允许的变异性          13  C   15  4   15  15  13  4   C
pH5筛选物的变异性        2   C   4   3   4   7   5   4   C
pH2筛选物的变异性          1   C   1   2   3   3   1   2   C
在6和7位，大多数(12/15)允许的氨基酸型在pH2筛选物中被排斥。从选择的序列还不能清楚第6和7位的选定的氨基酸对结合起作用还是仅仅代表在这些位置不可接受的可能性的消除。
选择过程的有效趋同尤其在2、4、8位的pH2筛选物中最为明显，尽管其中可发生许多氨基酸类型，但只发现一种氨基酸型。这强有力地表明该特异的氨基酸是结合所必需的。在每一个这些位置中，pH2群的唯一选择类型也是在pH5群中此位置最常见的类型。如果允许pH2集合体在每个位置具有观察到的所有的氨基酸类型，则只有36种序列，占初始群体的0.0004％。有一些序列不止一次地出现，提示pH2集合体中不同序列的数目不超过36个。
表5示出38个测序的CMTI-1类似物的花斑区(1～12氨基酸位置)的氨基酸序列。在未被设计成可变位置(11位)甲硫氨酸残基的出现表明在文库的构建中DNA的合成错误。
  表5
  氨基酸位置   1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   SEQID
  CMTI-I   R   V   C   P   R   I   L   M   E   C   K   K   1
  101   R   W   C   P   K   T   S   L   G   C   M   K   4
  102   R   L   C   P   K   T   Y   L   G   C   M   K   5
  103   R   W   C   S   T   Y   S   L   G   C   M   K   6
  104   R   W   C   S   T   Y   S   L   G   C   M   K   7
  105   R   L   C   P   K   T   S   L   E   C   M   K   8
  106   R   W   C   S   T   Y   S   L   G   C   M   K   9
  107   R   L   C   P   K   T   S   L   E   C   M   K   10
  108   R   W   C   S   K   S   S   L   E   C   M   K   11
  109   R   L   C   P   K   T   D   L   G   C   M   K   12
  110   R   W   C   P   K   S   S   M   G   C   K   K   13
  111   R   W   C   P   R   T   V   Q   E   C   M   K   14
  112   R   W   C   P   T   A   P   L   E   C   M   K   15
  113   R   L   C   P   K   T   D   L   G   C   M   K   16
  114   R   W   C   P   K   S   A   L   D   C   K   K   17
  115   R   W   C   T   K   T   S   R   E   C   M   K   18
  116   R   W   C   I   R   T   D   L   G   C   M   K   19
  117   R   W   C   P   K   T   S   L   G   C   M   K   20
  118   R   W   C   P   R   T   V   R   R   C   M   K   21
  119   R   W   C   P   K   T   H   K   E   C   M   K   22
  120   R   W   C   P   K   T   S   L   E   C   M   K   23
  221   R   W   C   P   K   S   T   L   G   C   M   K   24
  222   R   W   C   P   K   S   T   L   G   C   M   K   25
  223   R   W   C   P   K   Y   T   L   E   C   M   K   26
  224   R   W   C   P   R   S   S   L   E   C   M   K   27
  225   R   W   C   P   K   Y   T   L   E   C   M   K   28
  226   R   W   C   P   R   S   N   L   E   C   M   K   29
  227   R   W   C   P   R   S   N   L   E   C   M   K   30
  228   R   W   C   P   K   Y   T   L   E   C   M   K   31
  229   R   W   C   P   K   Y   T   L   E   C   M   K   32
  230   R   W   C   P   K   Y   T   L   E   C   M   K   33
  231   R   W   C   P   R   S   T   L   E   C   M   K   34
  232   R   W   C   P   K   T   S   L   G   C   M   K   35
  233   R   W   C   P   K   Y   T   L   E   C   M   K   36
  234   R   W   C   P   R   S   S   L   E   C   M   K   37
  235   R   W   C   P   K   S   T   L   G   C   M   K   38
  236   R   W   C   P   R   S   S   L   E   C   M   K   39
  237   R   W   C   P   R   S   N   L   E   C   M   K   40
  238   R   W   C   P   R   S   N   L   E   C   M   K   41
在表5中，具有标为101～120的序列的类似物经pH5洗脱而得，具有221～238序列的类似物经在pH2分级分离而得。
测试噬菌体结合的配体候选物的特异性是通过检测其对其它固定化蛋白质的亲和性而确定。噬菌体结合的蛋白质对与珠结合的相关的人血清蛋白酶纤溶酶及凝血酶无亲和性(数据未显示出)。另外对噬菌体分离物进行试验以检测与固定的tPA的相关亲和性及从固定的tPA中释放的特性。
在pH5释放的噬菌体分离物情况下，大部分噬菌体在pH5释放，在进一步将pH降至2时释放的量低一个数量级。这表明合适的亲和配体在pH降至5时相对完全释放。在pH2释放的分离物情况下，只有#232分离物在pH5真正选择性结合，随后在pH2释放。
配体合成及固定化：
接下来，使用从噬菌体分离物的DNA确定的序列信息合成游离CMTI衍生的多肽。尽管CMTI衍生物(类似物)已可容易地被化学合成，但决定在酵母中表达多肽。选择pH5释放的分离物中的一个，#109(表5，SEQ ID No：12)及pH2释放的分离物中的一个。#232(表5，SEQ ID No：35)在Pichia pastoris中表达。在第4位和第8位，#109分离物具有见于pH2筛选物中的相同氨基酸类型；在第2位，#109分离物与pH2筛选物不同。
合成适当的基因构建物，并插入Pichia pastoris表达系统中(Vedvick等，1991和Wagner等1992)以产生生产菌珠。每菌株的5升发酵导致高水平表达。预计分泌入发酵液中的蛋白质超过1g/L。将粗的发酵悬液经离心及0.2μ微量过滤澄清。该0.2μ滤液使用具30KDa NMWL截断值的PTTK盒经超滤纯化。从超滤液中用Macro-Prep High S阳离子交换载体(BioRad)进行阳离子交换层析，随后进行二次反相分离将配体纯化。反相分离使用的线性梯度起自含0.1％TFA及增加的乙腈(含0.1％TFA)的水，乙腈在90分钟时增加至50％。所得蛋白质在5μm反相层析柱中经PDA光谱分析测定其纯度高于95％。
根据生产者指导，用固定化的二氨基丙胺(Emphaze UltralinkTM；Pierce Chemical Co.)将配体候选物固定于双-丙烯酰胺/氮内酯共聚物载体上。将大约30mg CMTI类似物#109与1mL活性层析载体偶联。
层析柱测试：
将一Waters AP Minicolumn，5.0cm×0.5cm ID标称尺寸经加入第二个流动接管(其使层析柱长度降至2.5cm)而修饰。将该柱用#109-Emphaze UltralinkTM珠经推荐方案填充并用系列增加的NaCl浓度在pH7洗柱至以1M洗柱结束。
在第一个测试的#109亲和层析柱中，得自CalBiochem的组织型纤溶酶原激活物依生产者的指导而制备以提供1mg/ml的tPA溶液。Coagulation Standard(Coagulation Control Level 1，来自SigmaDiagnostics，Catalog#C-7916)冻干的人血浆根据生产者的指导而重配，然后稀释10倍并加入tPA。将此样品加样到层析柱上并在1M NaCl存在下的缓冲液中洗脱，这可有效地抑制非特异蛋白质与层析柱结合，且使pH值调控tPA的结合与释放。有两个独立的峰：第一个峰含有血浆蛋白质(未在层析柱中保留)；第二个峰是pH值降低后获得的，含有tPA，不含任何血浆成分。该结果经银染凝胶证实(未示出)。90％的tPA产物被回收。
用EAH Sepharose 4BTM琼脂糖珠(Pharmacia；Upsala SE)作为层析载体制备使用#109 CMTI类似物的第二个亲和层析柱。在由WatersInc.(Milford，MA)生产的HPLC系统中进行分离。该系统包括一个718型自动进样器，一个600型带有可以20ml/分钟输送的泵压头的溶剂输送系统，及一个996型光二极管矩阵检测器。所有的设备都根据生产者的说明书安装。该系统由Dell Corp提供的Pentium 133IBM-兼容计算机控制。该计算机装备有gigabyte硬驱，16兆RAM及一彩色监视器，计算机上装有Water Inc.的Millenium软件。
用1.2nm分辨率收集200nm～300nm范围内的光谱数据。图1、2、3、4是在280nm收集的。用于层析研究的流动相是缓冲液A和缓冲液B：缓冲液A包括25mM磷酸钾，50mM精氨酸，及125mMNaCl，用氢氧化钾缓冲至pH为7；缓冲液B包含50mM磷酸钾及150mM NaCl，用磷酸缓冲至pH3。在所有情况下，将样品在100％缓冲液A中注射，随后用100％缓冲液A从0分钟洗至2分钟。在2～8分钟用100％缓冲液B洗脱。8分钟之后用100％缓冲液A洗脱。HPLC系统的梯度延迟体积大约为4ml，流速为0.5ml/分。
根据生产者的说明制备来自其它商业来源的tPA以提供1mg/ml的溶液。Coagulation Standard(Coagulation Control Level 1，来自SigmaDiagnostics，Catalog # C-7916)即冻干的人血浆根据生产者的指导重配。将该溶液稀释10倍以得到具有是tPA溶液的吸光度的约10倍的吸光度的溶液。
在图1所示试验中，纯tPA样品(25μl，1mg/ml tPA)通过含#109 CMTI衍生物的层析柱，并以上述方法洗脱。层析谱示出大约15分钟后有约90％tPA物质的尖峰洗脱。在图2所示的试验中，Coagulation Standard(10倍稀释液)样品通过含#109 CMTI衍生物的层析，并如上述洗脱。从层析柱中立即洗脱下几乎所有物质(没有残留)。在图3、4所示试验分离中，将含有加入至人血浆标准物中的tPA的样品上样至层析柱中并如上述洗脱。如图3、4所示，tPA保留下来而血浆蛋白质在外水体积中洗脱。在大约15.4分钟时结合的tPA被释放。估计tPA在大约pH4时被释放。收集tPA峰并用银染的还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶检测，与初始物质对照发现纯度＞95％。
实施例2
进一步检测分离自CMTI文库的tPA亲和配体以设计可与tPA结合的其它候选功能域。
如上所述，几乎所有的用于建立CMTI文库的氨基酸位置的花斑作用均发生在CMTI-I的3位和10位两个半胱氨酸之间(见表3)。在亲代CMTI蛋白质中，这些半胱氨酸与蛋白质中其它位的半胱氨酸残基(见SEQ ID No：1)形成二硫键，但随着从CMTI文库成功分离出亲和配体，基于#109分离物的截短的15-氨基酸区段(见SEQID No：12的1～15氨基酸)的花斑作用的二级文库被概念化。如果这些成员的C3和C10半胱氨酸形成二硫键，就可得到具有tPA结合性质的约束环。衍生自亲和配体#109分离物的15氨基酸区段与层析载体结合的初始研究表明：C3-C10环形成且固定化的环与tPA结合。
上述实验表明了根据本发明分离的tPA亲和配体的两个新家族，包括含下列序列的多肽：
Arg-X1-Cys-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Cys-X8-Lys-Asp-Ser-Asp-Cys-Leu-Ala-Glu-Cys-Val-Cys-Leu-Glu-His-Gly-Tyr-Cys-Gly(SEQ ID No：42)及Arg-X1-Cys-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Cys-X8(SEQ ID No：43)，
其中X1是Trp或Leu；X2是Pro，Ser，Thr或Ile；X3是Arg，Lys或Thr；X4是Ser，Tyr，Thr或Ala；X5是Ser，Tyr，Asp，Vla，Pro，Ala，His，Asn或Thr；X6是Leu，Met，Gln，Arg或Lys；X7是Glu，Gly或Arg；X8是Lys或Met。由于未预料到在序列的第11位的Met残基有利于与tPA的结合，但结果却有利于与tPA的结合，所以其它氨基酸如非极性氨基酸如Ala，Val，Leu，Ile，Phe，Pro或Trp在11位的取代将可能提供其它的tPA结合类似物。
由上所述，对从任何原料流中分离tPA重要的特性可被遗传工程化入设计的文库的结合功能域，如此本发明的方法总能产生一些在合适的结合与释放条件下适于tPA分离的亲和配体候选物。根据本发明可以得到未失活或未破坏的、高纯度的、甚至密切相关的杂质都被去除的、费用可接受并且物质可再利用或再循环的高tPA产量。经前述研究，本发明的其它实施方案及适于特定tPA形式或原料流的替换方法将是显而易见的。所有如此实施方案及替换方法都在本发明范围内，如以下权利要求书所限定。
                           参考文献
Boschetti，E.，层析学杂志，A658：207-236(1994)
Ladner，R.C.，“作为结合体的约束肽”，生物技术趋势，13(10)：426-430(1995)
Markland，W.，Roberts，B.L.，Ladner，R.C.，“用噬菌体展示筛选蛋白酶抑制剂”，酶学方法，267：28-51(1996)
Narayanarn，S.R.，“蛋白质的制备亲和层析”，层析学杂志，A658：237-258(1994)
Knight，P.，生物/技术，8：200(1990)
Vedvick，T.，Buckholtz，R.G.，Engel，M.，Uream，M.，Kinney，S.，Provow，S.，Siegel，R.S.，and Thill，G.P.，“从酵母Pichia pastoris高水平分泌生物学活性的抑蛋白酶肽”，工业微生物杂志，7：197-202(1991)
Wagner，S.L.，Siegel，R.S.，Vedvick，T.S.，Raschke，W.C.，and VanNostrand，W.E.，“蛋白酶Nexin-2/淀粉样β-蛋白前体的Kunitz型蛋白酶抑制剂功能域的高水平表达、纯化和鉴定”，生物化学生物物理学研究通讯，186：1138-1145(1992)。
                           序列表
(1)一般信息：
     (i)申请人：戴克斯公司
     (i)申请人和发明人：约翰·M·麦克林南
     (i)申请人和发明人：罗伯特·C·莱德纳
     (ii)发明名称：大分子的工程亲和配体
     (iii)序列数：48
     (iv)通讯地址：
        (A)收信人：Banner & Witcoff，Ltd.
        (B)街道：75 State Street
        (C)城市：Boston
        (D)州：Massachusetts
        (E)国家：USA
        (F)ZIP：02109
     (v)计算机可读形式：
        (A)媒介类型：3.5英寸软盘，1.44Mb
        (B)计算机：IBM PC兼容机
        (C)操作系统：MS-DOS
        (D)软件：Microsoff Word 6.0
     (vi)本申请资料：
        (A)申请号：
        (B)申请日：1997年3月20日
        (C)分类：
     (vii)在先申请资料：
        (A)申请号：08/619,885
        (B)申请日：1996年3月20日
     (viii)律师/代理人信息：
        (A)姓名：Yankwich，Leon R.
        (B)注册号：30，237
        (C)卷号：DYX-1 PCT
     (ix)电讯信息：
        (A)电话：617-345-9100
        (B)传真：617-345-9111
(2)SEQ ID NO：1的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
Arg Val Cys Pro Arg Ile Leu Met Glu Cys Lys Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：2的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：50个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
Phe Tyr Ser Gly Ala Arg Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Lys
 -5                   1               5                  10
Lys Asp Ser Asp Cys Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr
             15                  20                  25
Cys Gly Ala Gly Pro Ser Tyr Ile Glu Gly Arg Ile Val Gly Ser Ala
         30                  35                  40
Ala Glu
     45
(2)SEQ ID NO：3的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：150个碱基
      (B)类型：核酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：其它核酸
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
TTCTATTCCG GAGCCCGTNN GTGTNNTANA NNTNNTNNGR RGTGTAAGAA    50
GGATTCTGAT TGCTTAGCAG AATGCGTTTG CCTCGAGCAT GGTTATTGTG    100
GCGCCGGTCC TTCATACATT GAAGGTCGTA TTGTCGGTAG CGCCGCTGAA    150
(2)SEQ ID NO：4的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
Arg Trp Cys Pro Lys Thr Ser Leu Gly Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：5的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
Arg Leu Cys Pro Lys Thr Tyr Leu Gly Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：6的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：6：
Arg Trp Cys Ser Thr Tyr Ser Leu Gly Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：7的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：7：
Arg Trp Cys Ser Thr Tyr Ser Leu Gly Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：8的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：8：
Arg Leu Cys Pro Lys Thr Ser Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：9的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：9：
Arg Trp Cys Ser Thr Tyr Ser Leu Gly Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：10的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：10：
Arg Leu Cys Pro Lys Thr Ser Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：11的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：11：
Arg Trp Cys Ser Lys Ser Ser Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：12的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：12：
Arg Leu Cys Pro Lys Thr Asp Leu Gly Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
(2)SEQ ID NO：13的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：13：
Arg Trp Cys Pro Lys Ser Ser Met Gly Cys Lys Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：14的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：14：
Arg Trp Cys Pro Arg Thr Val Gln Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：15的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：15：
Arg Trp Cys Pro Thr Ala Pro Leu Glu Cts Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：16的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：16：
Arg Leu Cys Pro Lys Thr Asp Leu Gly Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：17的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：17：
Arg Trp Cys Pro Lys Ser Ala Leu Asp Cys Lys Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：18的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：18：
Arg Trp Cys Thr Lys Thr Ser Arg Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：19的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：19：
Arg Trp Cys Ile Arg Thr Asp Leu Gly Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：20的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：20：
Arg Trp Cys Pro Lys Thr Ser Leu Giy Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：21的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：21：
Arg Trp Cys Pro Arg Thr Val Arg Arg Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Giy Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：22的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：22：
Arg Trp Cys Pro Lys Thr His Lys Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：23的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：23：
Arg Trp Cys Pro Lys Thr Ser Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：24的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：24：
Arg Trp Cys Pro Lys Ser Thr Leu Gly Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：25的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：25：
Arg Trp Cys Pro Lys Ser Thr Leu Gly Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：26的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：26：
Arg Trp Cys Pro Lys Tyr Thr Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Cly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：27的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：27：
Arg Trp Cys Pro Arg Ser Ser Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：28的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：28：
Arg Trp Cys Pro Lys Tyr Thr Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：29的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：29：
Arg Trp Cys Pro Arg Ser Asn Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：30的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：30：
Arg Trp Cys Pro Arg Ser Asn Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：31的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：31：
Arg Trp Cys Pro Lys Tyr Thr Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Giy
             20                  25
(2)SEQ ID NO：32的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：32：
Arg Trp Cys Pro Lys Tyr Thr Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：33的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：33：
Arg Trp Cys Pro Lys Tyr Thr Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Giy
             20                  25
(2)SEQ ID NO：34的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：34：
Arg Trp Cys Pro Arg Ser Thr Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：35的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：35：
Arg Trp Cys Pro Lys Thr Ser Leu Gly Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：36的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：36：
Arg Trp Cys Pro Lys Tyr Thr Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：37的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：37：
Arg Trp Cys Pro Arg Ser Ser Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：38的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：38：
Arg Trp Cys Pro Lys Ser Thr Leu Gly Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：39的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：39：
Arg Trp Cys Pro Arg Ser Ser Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：40的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：40：
Arg Trp Cys Pro Arg Ser Asn Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：41的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：41：
Arg Trp Cys Pro Arg Ser Asn Lcu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys
  1               5                  10                  15
Leu Ala Clu Cys Val Cys Leu Clu His Gly Tyr Cys Gly
(2)SEQ ID NO：42的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：29个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：42：
Arg Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Lys Asp Ser Asp Cys
                  5                  10                  15
Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly
             20                  25
(2)SEQ ID NO：43的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：11个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链性：单链
      (D)拓扑学：线性
 (ii)分子类型：蛋白质
 (xi)序列描述：SEQ ID NO：43：
Arg Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa
                  5                  10

Claims (6)

1、一种具有由下述氨基酸序列组成的肽的分离多肽：
Arg-X1-Cys-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Cys-X8(SEQ ID NO：43)，其中
X1是Trp或Leu；
X2是Pro，Ser，Thr或Ile；
X3是Arg，Lys或Thr；
X4是Ser，Tyr，Thr或Ala；
X5是Ser，Tyr，Asp，Val，Pro，Ala，His，Asn或Thr；
X6是Leu，Met，Gln，Arg或Lys；
X7是Glu，Gly或Arg；和
X8是Lys，Met，Ala，Val，Leu，Ile，Phe，Pro或Trp，
且其中所述多肽适于将tPA从含有其的溶液中分离出。
2、一种具有由下述序列组成的肽的分离多肽：
Arg-X1-Cys-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Cys-X8-Lys-Asp-Ser-Asp-Cys-Leu-Ala-Glu-Cys-Val-Cys-Leu-Glu-His-Gly-Tyr-Cys-Gly，
其中X1是Trp或Leu；X2是Pro，Ser，Thr或Ile；X3是Arg，Lys或Thr；X4是Ser，Tyr，Thr或Ala；X5是Ser，Tyr，Asp，Val，Pro，Ala，His，Asn或Thr；X6是Leu，Met，Gln，Arg或Lys；X7是Glu，Gly或Arg；及X8是Lys，Met，Ala，Val，Leu，Ile，Phe，Pro或Trp，且其中所述多肽适于将tPA从含有其的溶液中分离出。
3、一种具有由氨基酸序列RLCPKTDLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCG组成的肽的分离多肽，其中所述多肽适于将tPA从含有其的溶液中分离出。
4、权利要求1或权利要求2的分离多肽，其中所述多肽可以在pH7的溶液中结合tPA并在pH5或更低时与tPA解离。
5、权利要求2的分离多肽，其中所述肽具有选自以下一组中的一种氨基酸序列：
RWCPKTSLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RLCPKTYLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCSTYSLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCSTYSLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RLCPKTSLECMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCSTYSLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RLCPKTSLECMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCSKSSLECMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RLCPKTDLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCPKSSMGCKKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCPRTVQECMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCPTAPLECMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RLCPKTDLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCPKSALDCKKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCTKTSRECMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCIRTDLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCPKTSLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCPRTVRRCMKDSDCLAECVCLEHCYCG
RWCRKTHKECMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCPKTSLECMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCPKSTLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCPKSTLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCPKYTLECMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCPRSSLECMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCPKYTLECMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCPRSNIECMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCPRSNLECMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCPKYTLECMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCPKYTLECMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCPKYTLECMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCPRSTLECMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCPKTSLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCPKYTLECMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCPRSSLECMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCPKSTLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCPRSSLECMKDSDCLAECVCLEHGYCG
RWCPRSNLECMKDSDCLAECVCLEHGYCG和
RWCPRSNLECMKDSDCLAECVCLEHGYCG.
6、一种具有由氨基酸序列RLCPKTDLGCMK组成的肽的分离多肽，其中所述多肽适于将tPA从含有其的溶液中分离出。
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