CN109580818B

CN109580818B - 一种检测猪毛发中氟苯尼考药物残留量的方法

Info

Publication number: CN109580818B
Application number: CN201811529101.2A
Authority: CN
Inventors: 胡丽芳; 范芳; 赖艳; 李伟红; 熊艳
Original assignee: Institute Of Agricultural Products Quality Safety And Standard Jiangxi Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute Of Agricultural Products Quality Safety And Standard Jiangxi Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-12-14
Filing date: 2018-12-14
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2038-12-14
Also published as: CN109580818A

Abstract

本发明公开了一种检测猪毛发中氟苯尼考残留量的方法，该方法包括以下步骤：（1）猪毛发样品前处理：清洗、碱水解、有机溶剂提取；（2）以氟苯尼考‑D3标准工作液作为内标，以超高效液相色谱‑电喷雾串联质谱法检测猪毛发中氟苯尼考残留量。本发明无需宰杀生猪等动物，实现动物活体检测，由于毛发生长周期长，药物代谢缓慢，可以准确监控畜禽生长过程中是否使用过氟苯尼考，检测步骤操作简便，检测结果准确可靠。

Description

一种检测猪毛发中氟苯尼考药物残留量的方法

技术领域

本发明属于药物残留检测领域，特别是一种定性和定量检测猪毛发中氟苯尼考药物残留量的方法。

背景技术

氟苯尼考又名氟甲砜霉素，是氯霉素的氟化衍生物，其分子结构中无潜在致再生障碍性贫血的硝基，且抗菌谱广、易吸收。因此，氟苯尼考已成为氯霉素的主要替代药品，广泛用于动物体内革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和氯霉素耐药性细菌的治疗。然而，繁殖毒性试验结果表明，氟苯尼考具有血液毒性、胚胎毒性以及免疫抑制作用，用药后还会出现厌食、腹泻等不良反应，大量食用氟苯尼考超标的猪肉会对人体健康带来极大的危害。目前，由于兽药临床上使用不当，细菌对氟苯尼考的耐药性也越来越强，且随着时间的推移呈现多重耐药性。长期下去，细菌的耐药性将会得到极大的提高，普通的药物将对细菌无有效抑制作用。这不仅造成经济上的浪费，还会增大兽医临床治病难度，甚至威胁到人类的生命安全。

药物残留监测通常检测活体动物的尿液或血液样本，或者检测宰杀后动物的组织样本，如肌肉、肝脏等。由于兽药残留检测的时滞性，同时兽药在生物组织中受到酶类等生物大分子的作用，通常易于代谢而具有较高的清除率，因此有时追溯一些非正常的或非法使用的兽药则变得困难。建立快速灵敏的检测方法和寻找可活体取样的检材一直是兽药残留分析研究的两个重要方向。在过去的十几年间，人们从法医学检测人体头发中兴奋剂等违禁药物得到启发，探讨并研究了动物毛发作为检材的可行性。由于动物毛发易采集、运输，保存，更重要的是可以在宰前做出安全性评价的特点，毛发中缺少血液循环，缺少降解药物的各种活性物质和快速的排泄途径，使得药物代谢缓慢而可在毛发中的保留时间远远长于其他组织。与一般的组织样品(肌肉、肝脏、肾脏、脂肪和肺脏等)相比，毛发不需要将动物屠宰就可获得，较之前者简单、方便。另外，由于毛发的结构和成分特点以及较低的代谢活性，决定了药物进入毛发后在其中保留时间久，可作为长期检测样本，这是尿液或血液无法比拟的，尤其对于半衰期较短的药物，如氟苯尼考等，在经过一定时间的休药期后，从食用组织或血、尿中已无法检出药物残留证明是否使用过此禁用药物，而毛发因药物在其中代谢缓慢，在较长一段时间内仍可作为检测样本，提供违禁药物使用证明依据。检测猪毛发中是否含有抗病毒类药物残留，从而达到从养殖源头控制禁用药物使用的目的。因此，研究建立猪毛发中氟苯尼考药物残留的检测方法，对于有效监控该类药物的使用、保障我国动物性食品安全具有重要的意义。

我国对氟苯尼考残留的检测方法研究相对较少，国家标准仅有三项 “GB/T20756-2006可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定液相色谱-串联质谱法”、“GB/T 22959-2008 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定液相色谱-串联质谱法”、“GB/T 22338-2008动物源性食品中氯霉素类药物残留量的测定”。文献方法有液相色谱法(LC)及液相色谱-串联质谱法 (LC-MS/MS)。这些方法多应用于动物组织中氟苯尼考药物的测定，而猪毛发中氟苯尼考药物残留量的检测方法未见报道。

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明的目的在于提供了一种简便、快速、灵敏、准确且经济的检测猪毛发中氟苯尼考药物残留量的方法。

为了达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

一种检测猪毛发中氟苯尼考残留量的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)猪毛发样品前处理：清洗、碱水解、有机溶剂提取；(2)以氟苯尼考-D3标准工作液作为内标，以超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法检测猪毛发中氟苯尼考残留量。

所述猪毛发样品前处理包括如下步骤：

a.清洗：用自来水冲洗猪毛可见杂质，毛发于1％SDS超声15分钟，二次水冲洗干净，用滤纸吸干；将毛发50℃干燥，放干燥器中备用；

b.水解：用剪刀剪碎成l-2mm，称取毛发0.5g于50mL聚丙烯离心管中，加入氟苯尼考-D3标准工作液50.0μL，0.5mol/L氢氧化钠溶液5mL，混匀后于80水C浴中保温1小时，取出，冷却至室温；

c.提取：加入10.0mL乙腈，涡旋30s，超声提取20min后加入 2g氯化钠，涡漩混匀2min，5000r/min离心10min，取上清液于另一管中，加入10.0mL乙腈重复提取一次，合并上清液于60℃下氮气吹干，用1.00mL水溶解残渣，涡旋30s，用0.22mm滤膜过滤。

所述超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法检测条件如下：

a.超高效液相色谱条件：色谱柱：Eclipse Plus C18(RRHD 1.8μm， 2.1×100mm)。流动相A为0.1％甲酸水溶液；B为乙腈。梯度洗脱程序： 0～1.0min，2％～10％B；1.0～3.0min，10％～90％B；3.0～3.1min，90％B～2％B； 3.1～5.0min，维持2％B。流速0.25mL/min；柱温30℃；进样体积： 5.0μL；

b.电喷雾串联质谱条件：电离模式：电喷雾电离负离子模式(ESI -)；检测方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压：4 000V；离子源温度(TEM)：325℃；干燥气温度：300℃；干燥气流量：15L/min；雾化气压力：50psi；鞘气温度：400℃；鞘气流量：12L/min。

试样中氟苯尼考残留量以质量分数X计，数值以微克每千克(μg/kg) 表示，单点校正按式(1)、(2)计算：

式中：

C_i—试样溶液中氟苯尼考浓度(μg/L)；

C_is—试样溶液中氟苯尼考-D3内标浓度(μg/L)；

C_s—对照溶液中氟苯尼考浓度(μg/L)；

C′is—对照溶液中氟苯尼考-D3内标浓度(μg/L)；

A_i—试样溶液中氟苯尼考峰面积；

A_is—试样溶液中氟苯尼考-D3内标峰面积；

A_s—对照溶液中氟苯尼考峰面积；

A′_is—对照溶液中氟苯尼考-D3内标峰面积；

X—试样中氟苯尼考的残留量(μg/kg)；

V—样液最终定容体积(mL)；

m—试样质量(g)；

标准曲线校准按式(3)计算：

C_i—标准曲线上查得的试样中氟苯尼考浓度(μg/L)；；

V—样液最终定容体积(mL)；

m—试样质量，单位为克(g)。

相对于现有技术，本发明具有如下优点：

1、首次对猪毛发中氟苯尼考药物残留量进行检测，并具有更高的回收率和更低的检测限及定量限。

2、空白猪毛添加浓度为1.5、10.0、50.0μg/kg时，氟苯尼考方法的平均回收率为83.2％～107％，日内相对标准偏差为3.54％～6.08％，日间相对标准偏差为6.88％～9.14％。

3、采用内标法定量，氟苯尼考的检出限(LOD)为0.5μg/kg，定量限(LOQ)为1.5μg/kg。

为进一步说明本发明的特点和效果，以下结合附图对发明做进一步的描述。

附图说明

图1是本发明具体实施例中空白猪毛中添加氟苯尼考(1.50μg/kg) 离子色谱(355.8>184.8)图。

图2是本发明具体实施例中空白猪毛中添加氟苯尼考(1.50μg/kg) 离子色谱(355.8>335.8)图。

具体实施方式

下面通过结合附图及具体实施方式对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

1.标准溶液的配置：

标准储备液：称取适量氟苯尼考标准品，用甲醇分别配制成 1.0mg/mL的标准储备液，于-18℃下避光储存。

标准中间液：取上述标准储备液1mL，用甲醇稀释成质量浓度为 10.0mg/L的标准中间液，于-18℃下避光储存。

标准工作液：取上述标准中间液1mL，用二次水稀释成质量浓度为 1.0mg/L的标准工作液，于-4℃下避光储存。

氟苯尼考-D3标准工作液：称取适量氟苯尼考-D3标准品，用甲醇配制成1.0mg/mL的标准储备液，然后用甲醇稀释成质量浓度为10.0 mg/L的标准中间溶液，再用二次水稀释成质量浓度为200.0μg/L的标准工作液，于-4℃下避光储存。

2.回收率与精密度

取空白猪毛样品，添加氟苯尼考混合标准溶液分别为1.5、10.0、 50.0μg/kg，然后按照本方法进行样品前处理和测定，每个添加水平测定6次，日内精密度通过1d内测定3个加标水平下的6个平行样品得到，日间精密度为连续6d(每天测定1次)测定3个加标水平下的样品得到，结果显示，氟苯尼考添加浓度为1.5、10.0、50.0μg/kg时，方法的平均回收率为83.2％～107％，日内相对标准偏差为3.54％～6.08％，日间相对标准偏差为6.88％～9.14％。精密度和相对标准偏差见表1。

表1空白猪毛中添加氟苯尼考日内和日间精密度及相对标准偏差(n＝6)

3.质谱条件的优化：

分别配制1.0mg/L的氟苯尼考和氟苯尼考-D3标准溶液，不通过色谱柱直接进入离子源，在ESI^-模式下分别进行质谱条件的优化。先进行一级质谱图全扫描，确定各目标化合物的母离子，并优化得到源内碎裂电压，然后在选定的源内碎裂电压条件下，对选定的母离子进行子离子扫描，选取丰度相对最强的1对碎片离子作为定量离子，次强的1对或2对碎片离子作为定性离子，并分别对子离子的碰撞能进行优化。最后在MRM模式下分别对雾化气压力、干燥气温度和流量等参数进行优化。优化后的质谱条件见表2。

表2 MRM监测模式下氟苯尼考和氟苯尼考-D3的质谱优化条件

*定量离子

4.样品测定

用自来水冲洗猪毛可见杂质，毛发于1％SDS超声15分钟，二次水冲洗干净，用滤纸吸干；将毛发50℃干燥，放干燥器中备用；用剪刀剪碎成l-2mm，称取毛发0.5g于50mL聚丙烯离心管中，加入氟苯尼考-D3 标准工作液50.0μL，0.5mol/L氢氧化钠溶液5mL，混匀后于80℃水浴中保温1小时，取出，冷却至室温，加入10.0mL乙腈，涡旋30s，超声提取20min后加入2g氯化钠，涡漩混匀2min，5000r/min离心 10min，取上清液于另一管中，加入10.0mL乙腈重复提取一次，合并上清液于60℃下氮气吹干，用1.00mL水溶解残渣，涡旋30s，经0.22 mm滤膜过滤后，上机测定。

设定液相色谱条件为：

色谱柱：Eclipse Plus C18(RRHD 1.8μm，2.1×100mm)。流动相A为0.1％甲酸水溶液；B为乙腈。梯度洗脱程序：0～1.0min，2％～10％B； 1.0～3.0min，10％～90％B；3.0～3.1min，90％B～2％B；3.1～5.0min，维持2％B。流速0.25mL/min；柱温30℃；进样体积：5.0μL。

电喷雾串联质谱条件：电离模式：电喷雾电离负离子模式(ESI-)；检测方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压：2000V；离子源温度(TEM)： 325℃；干燥气温度：325℃；干燥气流量：5L/min；雾化气压力： 35psi；鞘气温度：350℃；鞘气流量：11L/min。

检测结果如说明书附图所示。

当然，本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本说明，而并非作为本发明的限定，只要在本发明的实质范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明权利要求书的范围内。

Claims

1.一种检测猪毛发中氟苯尼考残留量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）猪毛发样品前处理：

a．清洗：用自来水冲洗猪毛可见杂质，毛发于1%SDS超声15分钟，二次水冲洗干净，用滤纸吸干；将毛发50℃干燥，放干燥器中备用；

b．水解：用剪刀剪碎成l-2 mm，称取毛发0.5g于50mL聚丙烯离心管中，加入氟苯尼考-D3标准工作液50.0µL，0.5 mol／L 氢氧化钠溶液5 mL，混匀后于80℃水浴中保温1小时，取出，冷却至室温；

c．提取：加入10.0mL 乙腈，涡旋30 s，超声提取20min后加入2g氯化钠，涡漩混匀2min，5000 r/min离心10 min，取上清液于另一离心管中，加入10.0mL 乙腈重复提取一次，合并上清液于60℃下氮气吹干，用1.00 mL 水溶解残渣，涡旋30 s，用0.22 mm滤膜过滤；

（2）采用超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法检测：

a．超高效液相色谱条件：色谱柱：RRHD 1.8 µm，2.1×100 mm；流动相A为0.1%甲酸水溶液；B为乙腈；梯度洗脱程序：0～1.0 min，2%～10%B；1.0～3.0 min，10%～90% B；3.0～3.1min，90%～2%B；3.1～5.0 min，维持2% B；其中，流速0.25 mL/min、柱温30℃、进样体积：5.0µL；

b．电喷雾串联质谱条件：电离模式：电喷雾电离负离子模式；检测方式：多反应监测；毛细管电压：2000V；离子源温度：325 ℃；干燥气温度：325 ℃；干燥气流量：5 L/min；雾化气压力：35 psi；鞘气温度： 350℃；鞘气流量： 11L/min。

2.根据权利要求1所述的一种检测猪毛发中氟苯尼考残留量的方法，其特征在于，还包括以下步骤：

标准溶液的配置：

a.标准储备液：称取适量氟苯尼考标准品，用甲醇分别配制成1.0mg/mL的标准储备液，于-18℃下避光储存；

b.标准中间液：取上述标准储备液1 mL，用甲醇稀释成质量浓度为10.0mg/L的标准中间液，于-18℃下避光储存；

c.标准工作液：取上述标准中间液1 mL，用二次水稀释成质量浓度为1.0mg/L的标准工作液，于-4℃下避光储存；

d.氟苯尼考-D3标准工作液：称取适量氟苯尼考-D3标准品，用甲醇配制成1.0 mg/mL的标准储备液，然后用甲醇稀释成质量浓度为10.0 mg/L的标准中间溶液，再用二次水稀释成质量浓度为200.0 µg/L的标准工作液，于-4 ℃下避光储存。

3.一种根据权利要求1或2所述的一种检测猪毛发中氟苯尼考残留量的检测方法的应用，其特征在于，所述检测方法用于检测动物毛发。