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Hintergrund
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft generell das Gebiet von Mitteln für ein diagnostisches
Imaging, und sie zielt insbesondere auf mikroverkapselte Kontrastmittel
für ein
Ultraschall-Imaging
ab.
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Wenn
Ultraschall zur Gewinnung eines Bildes der inneren Organe und Strukturen
eines Menschen oder Tieres eingesetzt wird, dann werden Ultraschallwellen,
Schallenergiewellen mit einer Frequenz, die über derjenigen liegt, die vom
menschlichen Ohr wahrgenommen werden kann, beim Durchgang durch
den Körper
reflektiert. Die verschiedenen Typen des Körpergewebes reflektieren die
Ultraschallwellen unterschiedlich, und die Reflexionen, die von
den Ultraschallwellen erzeugt werden, die von den verschiedenen
inneren Strukturen reflektiert werden, werden nachgewiesen und elektronisch
in eine visuelle Darstellung umgewandelt.
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Bei
bestimmten medizinische Zuständen
ist das Gewinnen einer nützlichen
Darstellung des Organs oder der Struktur, für das bzw. für die man
sich interessiert, besonders schwierig, da die Details der Struktur
in einem Ultraschallbild, das durch die Reflexion von Ultraschallwellen
erzeugt wird, in Abwesenheit eines kontrastverstärkenden Mittels nicht ausreichend
vom umgebenden Gewebe unterschieden werden können. Der Nachweis und die
Beobachtung bestimmter physiologischer und pathologischer Zustände kann über die
Verstärkung
des Kontrastes in einem Ultraschallbild durch das Infundieren von
Mitteln in ein Organ oder eine andere Struktur, für das oder
für die
man sich interessiert, beträchtlich
verbessert werden. In anderen Fällen
ist der Nachweis der Bewegung des kontrastverstärkenden Mittels selbst von
besonderer Bedeutung. Zum Beispiel kann es sein, dass ein bestimmtes
Blutflussmuster, von dem bekannt ist, dass es aus bestimmten kardiovaskulären Störungen resultiert,
nur über
das Infundieren eines Kontrastmittels in den Blutstrom und das Beobachten
der Dynamik des Blutflusses nachgewiesen werden kann.
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Materialien,
die als Ultraschall-Kontrastmittel nützlich sind, wirken dadurch,
dass sie eine Wirkung auf die Ultraschallwellen haben, wenn diese
durch den Körper
treten und reflektiert werden, wodurch sie das Bild erzeugen, auf
dem die medizinische Diagnose beruht.
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Unterschiedliche
Substanztypen beeinflussen Ultraschallwellen auf unterschiedliche
Weise und in unterschiedlichem Ausmaß. Weiterhin können bestimmte
der von den kontrastverstärkenden
Mitteln verursachten Effekte leichter gemessen und beobachtet werden
als andere. Bei der Auswahl einer idealen Zusammensetzung eines
kontrastverstärkenden
Mittels würde
man diejenige Substanz bevorzugen, die den stärksten Effekt auf die Ultraschallwelle, wenn
diese durch den Körper
tritt, ausübt.
Außerdem sollte
die Wirkung auf die Ultraschallwelle leicht gemessen werden können. Es
gibt drei Haupteffekte, die mit einer Kontrastverstärkung verbunden
sind, und die man in einem Ultraschallbild sehen kann: die Rückstreuung,
die Strahlabschwächung
und der Unterschied der Schallgeschwindigkeiten.
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RÜCKSTREUUNG:
Wenn eine Ultraschallwelle, die durch den Körper tritt, auf eine Struktur trifft,
beispielsweise ein Organ oder ein anderes Gewebe des Körpers, dann
reflektiert die Struktur einen Teil der Ultraschallwelle. Unterschiedliche
Strukturen im Körper
reflektieren die Ultraschallenergie auf unterschiedliche Weise und
in unterschiedlichem Ausmaß.
Diese reflektierte Energie wird nachgewiesen und dazu verwendet,
ein Bild der Strukturen zu erzeugen, durch die die Ultraschallwelle
getreten ist. Der Begriff „Rückstreuung" bezieht sich auf
das Phänomen,
bei dem Ultraschallenergie durch eine Substanz mit bestimmten physikalischen
Eigenschaften rückwärts in Richtung
der Quelle gestreut wird.
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Es
ist schon lange bekannt, dass der Kontrast, der in einem Ultraschallbild
beobachtet wird, durch die Gegenwart von Substanzen verstärkt werden
kann, von denen bekannt ist, dass sie eine starke Rückstreuung
verursachen. Wenn eine derartige Substanz einem bestimmten Teil
des Körpers
zugeführt
wird, dann wird der Kontrast zwischen dem Ultraschallbild dieses
Teils des Körpers
und demjenigen der umgebenden Gewebe, die die Substanz nicht enthalten,
verstärkt.
Es ist gut bekannt, dass unterschiedliche Substanzen aufgrund ihrer
physikalischen Eigenschaften eine unterschiedlich starke Rückstreuung
verursachen. Dementsprechend hat sich die Suche nach kontrastverstärkenden
Mitteln auf Substanzen konzentriert, die stabil und nicht toxisch
sind und eine maximale Rückstreuung
zeigen.
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Die
Fähigkeit
einer Substanz, die Rückstreuung
von Ultraschallenergie zu bewirken, hängt von den Charakteristika
der Substanz, beispielsweise ihrer Fähigkeit, komprimiert werden
zu können,
ab. Wenn unterschiedliche Substanzen geprüft werden ist es nützlich,
einen bestimmten Parameter für
die Fähigkeit
einer Substanz zur Bewirkung der Rückstreuung, der als „Streuquerschnitt" bekannt ist, zu vergleichen.
Der Streuquerschnitt einer bestimmten Substanz ist dem Radius des
streuenden Objektes proportional und er hängt auch von der Wellenlänge der
Ultraschallenergie und anderen physikalischen Eigenschaften der
Substanz ab (J. Ophir und K. J. Parker, Contrast Agents in Diagnostic
Ultrasound, Ultrasound in Medicine & Biology, Band IS, Nr. 4, S. 319,
323 (1989)).
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Bei
der Beurteilung der Nützlichkeit
verschiedener Substanzen als Bildkontrastmittel kann man berechnen,
welche Mittel einen größeren Streuquerschnitt
haben und welche Mittel dementsprechend in einem Ultraschallbild
den größten Kontrast
bewirken sollten. Man kann davon ausgehen, dass die Komprimierbarkeit
eines festen Teilchens viel geringer ist als diejenige des umgebenden
Mediums und dass die Dichte des Teilchens viel größer ist.
Basierend auf dieser Annahme wurde der Streuquerschnitt eines kontrastverstärkenden
Mittels in Form eines festen Teilchens als 1,75 abgeschätzt (Ophir
und Parker, siehe oben, S. 325). Für eine streuende Substanz in Form
einer reinen Flüssigkeit
sind die adiabatische Komprimierbarkeit und die Dichte des streuenden Mittels
und des umgebenden Mediums wahrscheinlich ungefähr gleich, was zu dem Ergebnis
führen würde, dass
Flüssigkeiten
einen Streuquerschnitt von Null haben. Allerdings können Flüssigkeiten
eine gewisse Rückstreuung
zeigen, wenn große
Volumina eines flüssigen
Mittels vorliegen. Wenn z. B. ein flüssiges Mittel aus einem sehr
kleinen Gefäß in ein
sehr großes übertritt,
so dass die Flüssigkeit
praktisch das ganze Gefäß ausfüllt, dann
kann die Flüssigkeit
eine messbare Rückstreuung
zeigen. Trotzdem ist es für Fachleute
auf diesem Gebiet klar, dass reine Flüssigkeiten im Vergleich zu
Mikrobläschen
aus einem freien Gas relativ uneffiziente Streumittel sind.
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STRAHLABSCHWÄCHUNG: Eine
weitere Wirkung, die als Folge der Anwesenheit bestimmter fester,
kontrastverstärkender
Mittel beobachtet werden kann, ist die Abschwächung der Ultraschallwelle. Beim
herkömmlichen
Imaging wird ein Bildkontrast aufgrund der lokalisierten Unterschiede
der Abschwächung
zwischen bestimmten Gewebetypen beobachtet (K. J. Parker und R.
C. Wang, „Measurement
of Ultrasonic Attenuation within Regions selected from B-Scan Images", IEEE Trans. Biomed.
Enar. BME 30(8), S. 431–37
(1983); K. J. Parker, R. C. Wang und R. M. Lerner, „Attenuation
of Ultrasound Magnitude and Frequency Dependence for Tissue Characterization", Radiology 153(3),
S. 785–88 (1984)).
Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass Messungen der Abschwächung in
einem bestimmten Gewebebereich, die vor und nach der Infusion eines Mittels
durchgeführt
werden, zu einem verbesserten Bild führen könnten. Allerdings sind Techniken,
die auf einem Abschwächungskontrast
als Mittel zur Messung der Kontrastverstärkung durch eine Flüssigkeit
beruhen, noch nicht besonders weit entwickelt, und sie könnten, auch
wenn sie voll entwickelt sind, unter Beschränkungen bezüglich der inneren Organe oder
Strukturen leiden, auf die diese Technik angewendet werden kann.
Zum Beispiel ist es unwahrscheinlich, dass ein Verlust einer Abschwächung aufgrund
eines flüssigen
Kontrastmittels im Bild des Kardiovaskulärsystems beobachtet werden kann,
und zwar wegen des großen
Volumens des flüssigen
Kontrastmittels, das in einem gegebenen Gefäß vorhanden sein müsste, damit
ein substantieller Unterschied bezüglich der Abschwächung gemessen
werden kann.
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Die
Absorption von Energie durch die Teilchen erfolgt über einen
Mechanismus, der als „relative
Bewegung" bezeichnet
wird. Von der Veränderung der
Abschwächung,
die durch die relative Bewegung verursacht wird, lässt sich
zeigen, dass sie linear mit der Teilchenkonzentration und als Quadrat
des Dichteunterschiedes zwischen den Teilchen und dem umgebenden
Medium ansteigt (K. J. Parker et al., „A Particulate Contrast Agent
with Potential for Ultrasound Imaging of Liver", Ultrasound in Medicine & Biology, Band
13, Nr. 9, S. 555, 561 (1987)). Deshalb kann dort, wo eine substantielle
Akkumulation fester Teilchen erfolgt, der Abschwächungskontrast ein nützlicher
Mechanismus für
die Beobachtung einer Bildkontrastverstärkung sein, auch wenn der Effekt von
viel geringerer Größe ist als
das Rückstreuphänomen, und
es sieht so aus, als wäre
er für
kardiovaskuläre
Diagnosen nur von geringem Nutzen.
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UNTERSCHIED
DER SCHALLGESCHWINDIGKEIT: Es wurde eine weitere Technik zur Verstärkung des
Kontrastes in einem Ultraschallbild vorgeschlagen, die auf der Tatsache
basiert, dass die Geschwindigkeit des Schall in Abhängigkeit
vom Medium, durch das er tritt, variiert. Deshalb kann es sein, dass,
wenn ein ausreichendes Volumen eines Mittels, in dem die Schallgeschwindigkeit
sich von derjenigen im umgebenden Gewebe unterscheidet, in einen
Zielbereich infundiert werden kann, der Unterschied der Geschwindigkeiten
des Schalles im Zielbereich gemessen werden kann.
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Zusammenfassend
lässt sich
feststellen, dass diagnostischer Ultraschall ein wirkungsvolles, nicht
invasives Werkzeug ist, das zur Gewinnung von Informationen über die
inneren Organe des Körpers eingesetzt
werden kann. Die Entwicklung des Graustufen-Imaging und des Farbdoppler-Imaging
haben die Einsetzbarkeit und die Auflösung der Technik stark voran
gebracht. Die Techniken zur Durchführung von Ultraschalldiagnosen
und zur Herstellung und Verwendung von Kontrastmitteln sind zwar
beträchtlich
verbessert worden, aber es besteht immer noch ein Bedarf an der
Verbesserung der Auflösung des
Imaging für
die Herzperfusion und für
Herzkammern, feste Organe, für
die Nierenperfusion, für
die Perfusion fester Organe und für Doppler-Signale der Blutflussgeschwindigkeit
und der Flussrichtung beim Real-Time-Imaging.
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Es
sind verschiedene natürliche
und synthetische Polymere zur Verkapselung von Kontrastmitteln für ein Imaging,
beispielsweise von Luft, eingesetzt worden. Schneider et al., Invest
Radiol., Band 27, S. 134–139
(1992), beschreiben luftgefüllte
polymere Teilchen von drei Mikrometer. Von diesen Teilchen wurde
berichtet, dass sie im Plasma und bei angelegtem Druck stabil sind.
Jedoch war ihre Echogenität
bei 2,5 MHz niedrig. Ein weiterer Typ einer Mikrobläschensuspension
wurde aus sonifiziertem Albumin erhalten (Feinstein et al., J. Am.
Coll. Cardiol., Band 11, S. 59–65
(1988)). Feinstein beschreibt die Präparation von Mikrobläschen, die
die richtige Größe für eine Passage
durch die Lunge und eine ausgezeichnete Stabilität in vitro aufweisen. Diese
Mikrobläschen
sind jedoch in vivo kurzlebig und haben eine Halbwertszeit in der
Größenordnung
von wenigen Sekunden (was ungefähr
gleich einer Passage durch die Zirkulation ist), und zwar aufgrund
ihrer Instabilität
gegenüber
Druck (Gottlieb, S. et al., J. Am. Soc. Echo., Band 3, S. 328 (1990),
Abstract; und Shapiro, J. R. et al., J. Am. Coll. Cardiol., Band
16, S. 1603–1607
(1990)). Gelatine-verkapselte Luftbläschen wurden von Carroll et
al. beschrieben (Carroll, B. A. et al., Invest. Radiol., Band 15,
S. 260–266 (1980),
und Carroll, B. A. et al., Radiology, Band 143, S. 747–750 (1982)),
aber aufgrund ihrer großen
Ausmaße
(12 und 80 μm)
treten sie wahrscheinlich nicht durch die Lungenkapillaren. Gelatine-verkapselte
Mikrobläschen
wurden auch in PCT/US80/00502 von Rasor Associates Inc. beschrieben.
Diese werden durch das „Koaleszieren" der Gelatine gebildet.
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Über Mikrobläschen, die
durch Mikrokristalle aus Galactose stabilisiert sind (SHU 454 und
SHU 508), wurde auch von Fritzsch et al. berichtet (Fritzsch, T.
et al., Invest. Radiol., Band 25 (Suppl. 1), S. 302–305 (1988);
und Fritzsch, T. et al., Invest. Radiol., Band 25 (Suppl. 1), 160–161 (1990)).
Die Mikrobläschen
bestehen bis zu 15 Minuten in vitro, aber weniger als 20 Sekunden
in vivo (Rovai, D. et al., J. Am. Coll. Cardiol., Band 10, S. 125–134 (1987);
und Smith, M. et al., J. Am. Coll. Cardiol., Band 13, S. 1622–1628 (1989)).
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Die
europäische
Patentanmeldung Nr. 90901933.5 der Schering-Aktiengesellschaft offenbart
die Herstellung und Anwendung von mikroverkapseltem Gas oder mikroverkapselten
flüchtigen Flüssigkeiten
für das
Ultraschall-Imaging, wobei die Mikrokapseln aus synthetischen Polymeren
oder Polysacchariden gebildet werden. Die europäische Patentanmeldung Nr. 91810366.4
von Sintetica S. A. (0 458 745 A1) offenbart Mikroballone aus Luft
oder Gas, die von einer an der Grenzfläche abgelagerten Polymermembran
begrenzt sind, und die für
eine Injektion in ein Wirtstier oder für eine orale oder rektale Verabreichung
oder für
eine Verabreichung in die Blase für therapeutische oder diagnostische
Zwecke in einem wässrigen
Träger
dispergiert werden können.
WO 92/18164 von Delta Biotechnology Limited beschreibt die Herstellung
von Mikroteilchen aus einer wässrigen
Proteinlösung
durch ein Sprühtrocknen
unter Bildung hohler Kügelchen,
die eingeschlossenes Gas enthalten, unter genau kontrollierten Bedingungen
bezüglich
der Temperatur, der Sprühgeschwindigkeit,
der Teilchengröße und der Trocknungsbedingungen
für eine
Anwendung im Imaging. WO 93/25242 beschreibt die Synthese von Mikroteilchen
für ein
Ultraschall-Imaging, die aus einem Gas bestehen, das in einer Hülle aus
Polycyanoacrylat oder Polyester enthalten ist. WO 92/21382 offenbart
die Herstellung von Kontrastmitteln aus Mikroteilchen, die eine
kovalent gebundene Matrix, die ein Gas enthält, einschließen, wobei
die Matrix ein Kohlenhydrat ist. Die US-Patente Nr. 5 334 381, 5 123
414 und 5 352 435 an Unger beschreiben Liposomen für eine Verwendung
als Ultraschall-Kontrastmittel, die Gase, Vorläufer für Gase, beispielsweise einen
pH- oder Lichtaktivierbaren gasförmigen
Vorläufer,
sowie andere flüssige
oder feste kontrastverstärkende
Mittel enthalten.
EP 0 535 387 bezieht
sich auf ein echogenes Teilchen, das ein biokompatibles Polymer
und ein Gas wie Luft, Stickstoff oder Sauerstoff umfasst. WO 92/19272
offenbart ein Ultraschall-Kontrastmittel, das poröse anorganische
Teilchen umfasst, die ein eingeschlossenes Gas enthalten.
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Das
US-Patent Nr. 5 393 524 an Quay offenbart die Verwendung von Mitteln,
zu denen Fluorkohlenstoffe gehören,
zur Verstärkung
des Kontrastes in einem Ultraschallbild. Die Mittel bestehen aus
extrem kleinen Bläschen
oder Mikrobläschen
aus ausgewählten
Gasen, die in Lösung
eine lange Lebensdauer haben und die klein genug sind, um die Lungen durchqueren
zu können,
was ihren Einsatz beim Ultraschall-Imaging des Kardiovaskulärsystems
und anderer vitaler Organe ermöglicht.
WO 95/23615 von Nycomed offenbart Mikrokapseln für das Imaging, die durch das
Koazervieren einer Lösung,
z. B. einer Proteinlösung,
die einen Perfluorkohlenstoff enthält, gebildet werden. WO 95/06518
von Nycomed Imaging A/S offenbart auf Polymeren basierende Kontrastmittel,
bei denen Gas-Mikrobläschen
von Block- oder Pfropf-Copolymer-Tensiden,
die nicht polymerisierbar sind und eine Wand bilden, eingekapselt
sind. Das Gas wird in die Kontrastmittel bei deren Herstellung eingearbeitet.
Es wird nicht erkannt, dass der Ersatz von Luft durch ein fluoriertes
Gas die Echogenität
der Mikroteilchen erhöht.
Das US-Patent Nr. 5 147 631 an Glajch et al. beschreibt anorganische
poröse Teilchen,
die ein Gas enthalten, das ein fluoriertes Gas sein kann, für den Einsatz
im Imaging. Diese sind natürlich
keine synthetischen polymeren Mikroteilchen. PCT/US94/08416 vom
Massachusetts Institute of Technology offenbart Mikroteilchen, die
aus Blockpolymeren von Polyethylenglycol-Poly(lactid-co-glycolid) gebildet
werden, und die in ihrem Inneren verkapselt Mittel für ein Imaging,
einschließlich von
Gasen wie Luft und Perfluorkohlenstoffen, enthalten. Wie in WO 94/16739
von Sonus Pharmaceuticals Inc. beschrieben wird, weiß man, dass
Feststoffe und Flüssigkeiten
den Schall zwar in ähnlichem Ausmaß reflektieren
wie Gase, dass diese aber wirksamer sind und die bevorzugten Medien
für einen Einsatz
als Ultraschall-Kontrastmittel darstellen. Tatsächlich wurden, wie im Beispiel
12 der PCT-Anmeldung von Sonus gezeigt wurde, Mikrokapseln aus Protein
bezüglich
der Verabreichung an Minischweine im Vergleich zu Emulsionen oder
kolloidalen Suspensionen aus Sicherheitsgründen (sowie aus Gründen der
Wirksamkeit) aufgegeben.
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In
all diesen Fällen
ist es erstrebenswert, die Echogenität des Imaging-Mittels zu verstärken, bei gleichzeitiger
Verstärkung
oder Beibehaltung der Stabilität
und der Leichtigkeit der Herstellung des Imaging-Mittels.
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Es
ist deshalb ein Ziel der vorliegenden Erfindung, aus synthetischen
Polymeren hergestellte Mikroteilchen mit signifikant verbesserter
Echogenität bereit
zu stellen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Verabreichung an einen
Patienten für
ein Ultraschall-Imaging, umfassend:
ein synthetisches, biokompatibles,
poröses,
polymeres Mikroteilchen und
einen pharmazeutisch annehmbaren
Träger
für die Verabreichung
des Mikroteilchens an einen Patienten,
wobei das Mikroteilchen
aus einem Polymer besteht, das kein Copolymer von Polyethylenglycol
und Poly(milchsäure-co-glycolid)
ist, das löslich
in einem organischen Lösemittel
ist und eine wirksame Menge eines fluorhaltigen Gases enthält, um das
Ultraschall-Imaging im Vergleich zu dem Mikroteilchen, das ein äquivalentes
Volumen an Luft enthält,
zu verbessern.
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Diese
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Mikroteilchens
zur Verwendung beim Ultraschall-Imaging, umfassend:
Einarbeiten
einer wirksamen Menge eines flüchtigen Salzes
in eine Lösung
eines biokompatiblen Polymers,
Entfernen des Polymerlösemittels
und des flüchtigen Salzes
unter Bildung eines porösen
Mikroteilchens, das inkorporierte Luft enthält, und
Ersetzen der Luft
durch eine wirksame Menge eines fluorhaltigen Gases, um das Ultraschall-Imaging
im Vergleich zu dem Mikroteilchen, das ein äquivalentes Volumen an Luft
enthält,
zu verbessern.
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Es
wurde entdeckt, dass die Einarbeitung fluorierter Gase, insbesondere
von Perfluorkohlenstoffen wie Octafluorpropan, in synthetische polymere Mikroteilchen,
insbesondere hoch poröse
schwammartige Mikrokügelchen,
eine signifikant verstärkte Echogenität im Vergleich
zu Mikrokügelchen
mit eingekapselter Luft bewirkt. Das mikroverkapselte fluorierte
Gas wird mit einem Durchmesser hergestellt, der dafür geeignet
ist, ein Imaging des Zielgewebes durchzuführen, z. B. mit einem Durchmesser
zwischen 0,5 und 8 Mikrometer für
eine intravaskuläre Verabreichung
und mit einem Durchmesser zwischen 0,5 und 5 mm für eine orale
Verabreichung für ein
Imaging des Gastrointestinaltraktes oder anderer Hohlräume.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Es
werden Verfahren für
die Synthese polymerer Abgabesysteme bereit gestellt, die aus synthetischen
polymeren Mikroteilchen, die fluorierte Gase, insbesondere Perfluorkohlenstoffe,
enthalten, bestehen. Die Mikroteilchen sind für verschiedene diagnostische
Ultraschall-Imaging-Anwendungen
nützlich,
insbesondere für
Ultraschall-Verfahren wie ein Imaging von Blutgefäßen und
die Echokardiographie. Die Einarbeitung eines fluorierten Gases
erhöht
die Echogenität
im Vergleich zu den gleichen synthetischen polymeren Mikroteilchen,
die Luft enthalten, beträchtlich.
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Verfahren und Reagenzien
zur Herstellung von Mikroteilchen
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Der
Begriff „Mikroteilchen", wie er hier verwendet
wird, schließt
Mikrokügelchen
und Mikrokapseln sowie Mikroteilchen ein, es sei denn, es wird etwas
anderes angegeben. Mikroteilchen können eine kugelige Form haben,
müssen
es aber nicht. Mikrokapseln sind als Mikroteilchen definiert, die
eine äußere Polymerhülle haben,
die einen Kern aus einem anderen Material, in diesem Falle einem
Gas, umgibt. Mikrokügelchen
sind im allgemeinen feste polymere Kügelchen, die eine Honigwabenstruktur
einschließen
können,
die von Poren durch das Polymer gebildet wird, die für Imaging-Zwecke
mit einem Gas gefüllt
sind, wie es unten beschrieben wird.
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Polymere
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Es
können
sowohl nicht biologisch abbaubare als auch biologisch abbaubare
Matrices für
die Zuführung
der fluorierten Gase verwendet werden, obwohl biologisch abbaubare
Matrices bevorzugt werden, insbesondere für die intravenöse Injektion.
Nicht erodierbare Polymere können
für die
orale Verabreichung verwendet werden. Synthetische Polymere werden
wegen der besser reproduzierbaren Synthese und des besser reproduzierbaren
Abbaus bevorzugt. Das Polymer wird auf der Basis der Zeit, die für die In-vivo-Stabilität erforderlich
ist, ausgewählt,
d. h. derjenigen Zeit, die für
die Verteilung zu der Stelle, wo das Imaging gewünscht ist, benötigt wird,
und der Zeit, die für
das Imaging benötigt
wird. Bei einer Ausführungsform
können
Mikroteilchen mit einer In-vivo-Stabilität zwischen ungefähr 20 und
30 Minuten oder mehr hergestellt werden, z. B. für den Einsatz in Anwendungen
wie der Echokardiographie, der Neurosonographie, der Hysterosalpingographie
sowie diagnostischen Verfahren mit festen Organen. Die In-vivo-Stabilität der Mikroteilchen
mit dem verkapselten Kontrastmittel kann während der Produktion durch
die Verwendung von Polymeren wie Polylactid-co-glycolid, das mit
Polyethylenglycol (PEG) copolymerisiert wird, eingestellt werden.
PEG kann, wenn es auf der äußeren Oberfläche exponiert
ist, die Zeit verlängern,
für die
diese Materialien zirkulieren, da es sehr hydrophil ist.
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Repräsentative
synthetische Polymere sind: Poly(hydroxysäuren), wie Poly(milchsäure), Poly(glycolsäure) und
Poly(milchsäure-co-glycolsäure), Polyglycolide,
Polylactide, Polylactid-co-glycolid-Copolymere
und -Blends, Polyanhydride, Polyorthoester, Polyamide, Polycarbonate,
Polyalkylene, wie Polyethylen und Polypropylen, Polyalkylenglycole,
wie Poly(ethylenglycol), Polyalkylenoxide, wie Poly(ethylenoxid),
Polyalkylenterepthalate, wie Poly(ethylenterephthalat), Polyvinylalkohole,
Polyvinylether, Polyvinylester, Polyvinylhalogenide, wie Poly(vinylchlorid), Polyvinylpyrrolidon,
Polysiloxane, Poly(vinylalkohole), Poly(vinylacetat), Polystyrol,
Polyurethane und Copolymere davon, derivatisierte Cellulosen, wie
Alkylcellulose, Hydroxyalkylcellulosen, Celluloseether, Celluloseester,
Nitrocellulosen, Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxypropylcellulose,
Hydroxypropylmethylcellulose, Hydroxybutylmethylcellulose, Celluloseacetat,
Cellulosepropionat, Celluloseacetatbutyrat, Celluloseacetatphthalat,
Carboxyethylcellulose, Cellulosetriacetat und das Cellulosesulfat-Natriumsalz
(die hier gemeinsam als „synthetische
Cellulosen" bezeichnet
werden), Polymere von Acrylsäure,
Methacrylsäure
oder Copolymere oder Derivate davon, einschließlich von Estern, Poly(methylmethacrylat),
Poly(ethylmethacrylat), Poly(butylmethacrylat), Poly(isobutylmethacrylat),
Poly(hexylmethacrylat), Poly(isodecylmethacrylat), Poly(laurylmethacrylat),
Poly(phenylmethacrylat), Poly(methylacrylat), Poly(isopropylacrylat),
Poly(isobutylacrylat) und Poly(octadecylacrylat) (die hier gemeinsam
als „Polyacrylsäuren" bezeichnet werden),
Poly(buttersäure),
Poly(valeriansäure)
und Poly(lactid-co-caprolacton), Copolymere und Blends davon. Der
Begriff „Derivate" schließt, so wie
er hier verwendet wird, Polymere ein, die Substitutionen, Additionen
chemischer Gruppen, z. B. Alkyl, Alkylen, Hydroxylierungen und Oxidationen
sowie andere Modifikationen enthalten, die von Fachleuten auf diesem
Gebiet routinemäßig durchgeführt werden.
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Beispiele
für bevorzugte
nicht biologisch abbaubare Polymere sind Ethylenvinylacetat, Poly(meth)acrylsäure, Polyamide,
Copolymere und Mischungen davon.
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Beispiele
für bevorzugte
biologisch abbaubare Polymere sind Polymere von Hydroxysäuren wie
Milchsäure
und Glycolsäure,
Polylactid, Polyglycolid, Polylactid-co-glycolid und Copolymere
mit PEG, Polyanhydride, Poly(ortho)ester, Polyurethane, Poly(buttersäure), Poly(valeriansäure) und
Poly(lactid-co-caprolacton). Im allgemeinen zersetzen sich diese
Materialien in vivo sowohl durch eine nicht-enzymatische als auch
durch eine enzymatische Hydrolyse sowie durch eine Oberflächen- oder
Massenerosion.
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Zu
bioadhäsiven
Polymeren, die besonders interessant für eine Verwendung beim Imaging
von Mucosaoberflächen
sind, z. B. im Gastrointestinaltrakt, gehören Polyanhydride, Polyacrylsäure, Poly(methylmethacrylate),
Poly(ethylmethacrylate), Poly(butylmethacrylat), Poly(isobutylmethacrylat),
Poly(hexylmethacrylat), Poly(isodecylmethacrylat), Poly(laurylmethacrylat),
Poly(phenylmethacrylat), Poly(methylacrylat), Poly(isopropylacrylat),
Poly(isobutylacrylat) und Poly(octadecylacrylat).
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Lösemittel
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Das
Polymerlösemittel
ist, wie es hier definiert wird, ein organisches Lösemittel,
das flüchtig
ist oder einen relativ niedrigen Siedepunkt hat oder das im Vakuum
entfernt werden kann, und das für
eine Verabreichung an Menschen in Spurenmengen akzeptabel ist, beispielsweise
Methylenchlorid. Andere Lösemittel,
z. B. Ethylacetat, Aceton, Acetonitril, Tetrahydrofuran (THF), Essigsäure, DMSO
und Chloroform oder Kombinationen davon, können ebenfalls eingesetzt werden.
Im allgemeinen wird das Polymer so im Lösemittel gelöst, dass
eine Polymerlösung
gebildet wird, die eine Konzentration zwischen 0,1 und 60% (Gewicht
zu Volumen, Gew./Vol.), bevorzugter zwischen 0,5 und 30% hat.
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Fluorierte
Gase
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Es
kann jedes beliebige biokompatible oder pharmakologisch annehmbare
fluorierte Gas in die Mikroteilchen eingearbeitet werden. Der Begriff „Gas" bezieht sich auf
jede beliebige Verbindung, die bei der Temperatur, bei der das Imaging
durchgeführt wird,
ein Gas ist oder im Stande ist, ein Gas zu bilden. Das Gas kann
aus einer einzigen Verbindung bestehen oder aus einer Mischung von
Verbindungen zusammengesetzt sein. Es werden Perfluorkohlenstoffgase
bevorzugt. Beispiele für
Gase sind CF4, C2F6, C3F8,
C4F8, SF6, C2F4 und
C3F6. Perfluorpropan
wird besonders bevorzugt, da es ein unlösliches Gas bereit stellt,
das bei der Temperatur des Einsatzes nicht kondensiert und das pharmakologisch
annehmbar ist.
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Mikroteilchen
und Verfahren zu ihrer Herstellung
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Bei
der am stärksten
bevorzugten Ausführungsform
werden die Mikroteilchen durch Sprühtrocknen hergestellt. Es können andere
Techniken eingesetzt werden, beispielsweise eine Lösemittelextraktion,
eine Heißschmelzverkapselung
und eine Lösemittelverdampfung,
wie unten diskutiert wird.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
wird dann das Gas durch das Einwirkenlassen eines Stromes des gewünschten
Gases auf die Mikroteilchen oder das Anlegen eines Vakuums an die
Mikroteilchen zur Entfernung des eingekapselten Gases und das anschließende Füllen mit
dem gewünschten
Gas ersetzt.
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a.
Lösemittelverdampfung.
Bei diesem Verfahren wird das Polymer in einem flüchtigen
organischen Lösemittel,
wie Methylenchlorid, gelöst.
Ein porenbildendes Mittel in Form eines Feststoffes oder als wässrige Lösung kann
der Lösung
zugesetzt werden. Die Mischung wird sonifiziert oder homogenisiert,
und die resultierende Dispersion oder Emulsion wird einer wässrigen
Lösung
zugesetzt, die ein oberflächenaktives
Mittel, wie TWEENTM 20, TWEENTM 80,
PEG oder Poly(vinylalkohol), enthält, und zur Bildung einer Emulsion
homogenisiert. Die resultierende Emulsion wird gerührt, bis
der größte Teil
des organischen Lösemittels
abgedampft ist, wobei Mikrokügelchen
zurück
bleiben. Es können
mehrere verschiedene Polymerkonzentrationen eingesetzt werden (0,05–0,60 g/ml).
Es können
Mikrokügelchen
mit unterschiedlichen Größen (1–1000 μm) und Morphologien
mittels dieses Verfahrens erhalten werden. Dieses Verfahren ist
für relativ
stabile Polymere, wie Polyester und Polystyrol, nützlich.
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Die
Lösemittelverdampfung
wird bei E. Mathiowitz et al., J. Scanning Microscopy 4, 329 (1990); L.
R. Beck et al., Fertil. Steril. 31, 545 (1979); und S. Benita et
al., J. Pharm. Sci. 73, 1721 (1984) beschrieben.
-
Labile
Polymere, wie Polyanhydride, können sich
jedoch während
des Herstellungsprozesses aufgrund der Anwesenheit von Wasser zersetzen.
Für diese
Polymere sind die folgenden beiden Verfahren, die in vollständig organischen
Lösemitteln
durchgeführt
werden, nützlicher.
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b.
Heißschmelzmikroverkapselung.
Bei diesem Verfahren wird das Polymer zunächst geschmolzen und dann mit
den festen Teilchen des porenbildenden Mittels gemischt. Die Mischung
wird in einem nicht mischbaren Lösemittel
(wie Siliconöl)
suspendiert und, während
kontinuierlich gerührt
wird, auf 5°C über dem
Schmelzpunkt des Polymers erhitzt. Sobald die Emulsion stabilisiert
ist wird sie abgekühlt, bis
sich die Polymerteilchen verfestigen. Die resultierenden Mikrokügelchen
werden durch Dekantieren mit einer Flüssigkeit, die kein Lösemittel
für das
Polymer ist, beispielsweise Petrolether, gewaschen, so dass ein
frei fließendes
Pulver erhalten wird. Es können
Mikrokügelchen
mit Größen zwischen
einem und 1 000 μm
mittels dieses Verfahrens erhalten werden. Die äußeren Oberflächen der
Teilchen, die mittels dieser Technik hergestellt werden, sind im
allgemeinen glatt und dicht. Dieses Verfahren wird zur Herstellung
von Mikrokügelchen
aus Polyestern und Polyanhydriden eingesetzt. Allerdings ist dieses
Verfahren auf Polymere mit Molekulargewichten zwischen 1 000 und
50 000 beschränkt.
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Die
Heißschmelzmikroverkapselung
wird bei E. Mathiowitz et al., Reactive Polymers 6, 275 (1987) beschrieben.
Es können
z. B. Polyanhydride, die aus Bis-Carboxyphenoxypropan und Sebacinsäure in einem
Molverhältnis
von 20 : 80 (P(CPP-SA) 20 : 80) (MG 20 000) bestehen, mittels der
Heißschmelzmikroverkapselung
hergestellt werden, oder z. B. können
leere Mikrokügelchen
aus Poly(fumarsäure-co-sebacinsäure) (20
: 80) (MG 15 000) durch die Heißschmelzmikroverkapselung
hergestellt werden.
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c.
Lösemittelentfernung.
Diese Technik wurde in erster Linie für Polyanhydride entwickelt.
Bei diesem Verfahren wird das porenbildende Mittel in einer Lösung des ausgewählten Polymers
in einem flüchtigen
organischen Lösemittel,
wie Methylenchlorid, dispergiert oder gelöst. Diese Mischung wird durch
Rühren
in einem organischen Öl
(beispielsweise Siliconöl)
unter Bildung einer Emulsion suspendiert. Im Gegensatz zur Lösemittelverdampfung
kann dieses Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen aus Polymeren mit hohen
Schmelzpunkten und unterschiedlichen Molekulargewichten eingesetzt werden.
Die äußere Morphologie
der Kügelchen,
die mit dieser Technik erzeugt werden, hängt in hohem Maße vom Typ
des verwendeten Polymers ab.
-
d.
Sprühtrocknung
von Mikroteilchen. Mikroteilchen können mittels Sprühtrocknung
erzeugt werden, indem ein biokompatibles Polymer in einem geeigneten
Lösemittel
gelöst
wird, ein porenbildendes Mittel in der Polymerlösung dispergiert wird und die Polymerlösung dann
unter Bildung von Mikroteilchen sprühgetrocknet wird. Der Prozess
des „Sprühtrocknens" einer Lösung aus
einem Polymer und einem porenbildenden Mittel bezieht sich, so wie
er hier definiert wird, auf einen Prozess, bei dem die Lösung unter
Bildung eines feinen Nebels atomisiert wird und durch den direkten
Kontakt mit heißen
Trägergasen getrocknet
wird. Beim Einsatz von Sprühtrocknungsapparaturen,
die man in diesem Gebiet kennt, kann die Polymerlösung durch
den Einlass des Sprühtrockners
zugeführt
werden, durch eine Röhre im
Trockner geleitet und dann durch den Auslass atomisiert werden.
Die Temperatur kann in Abhängigkeit vom
verwendeten Gas oder Polymer variiert werden. Die Temperatur des
Einlasses und des Auslasses kann zur Erzeugung der gewünschten
Produkte gesteuert werden.
-
Die
Größe der aus
der Polymerlösung
gebildeten Teilchen ist eine Funktion der Düse, die zum Sprühen der
Polymerlösung
verwendet wird, des Düsendruckes,
der Flussgeschwindigkeit, des verwendeten Polymers, der Polymerkonzentration,
des Lösemitteltyps
und der Temperatur, bei der gesprüht wird (sowohl der Einlass-
als auch der Auslasstemperatur) und des Molekulargewichtes. Im allgemeinen ist
die Kapselgröße umso
größer, je
höher das
Molekulargewicht ist, wenn die Konzentration gleich bleibt. Typische
Prozessparameter für
das Sprühtrocknen
sind die folgenden: Polymerkonzentration = 0,005–0,10 g/ml, Einlasstemperatur
= 30–200°C, Auslasstemperatur
= 20–100°C, Polymerflussgeschwindigkeit
= 5–200
ml/min und Düsendurchmesser
= 0,2–4
mm Innendurchmesser. Es können
Mikrokügelchen
mit einem Durchmesser im Bereich von 1 bis 10 μm erhalten werden, und zwar mit
einer Morphologie, die von der Wahl des Polymers, der Konzentration,
des Molekulargewichtes und des Sprühflusses abhängt.
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e.
Mikrokügelchen
aus Hydrogel. Mikrokügelchen,
die aus Polymeren vom Geltyp bestehen, beispielsweise Polyphosphazen
oder Polymethylmethacrylat, werden über das Lösen des Polymers in einer wässrigen
Lösung,
das Suspendieren des porenbildenden Mittels in der Mischung und
das Extrudieren durch eine Vorrichtung zur Bildung von Mikrotröpfchen hergestellt,
wobei Mikrotröpfchen
gebildet werden, die in ein Härtungsbad
fallen, das aus einer Lösung
eines entgegengesetzt geladenen Ions oder eines Polyelektrolyten
besteht, und das langsam gerührt
wird. Der Vorteil dieser Systeme liegt in der Möglichkeit, die Oberfläche der
Mikrokügelchen
weiter zu modifizieren, indem sie nach der Herstellung mit polykationischen
Polymeren, wie Polylysin, beschichtet werden. Die Teilchen aus den
Mikrokügelchen
werden durch den Einsatz von Extrudern unterschiedlicher Größe kontrolliert.
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Zusätze zur
Erleichterung der Bildung der Mikroteilchen
-
Es
können
verschiedene Tenside während der
Synthese der Mikroteilchen, die das Imaging-Mittel enthalten, zugesetzt
werden. Zu exemplarischen Emulgatoren oder Tensiden, die verwendet
werden können
(0,1–5
Gew.-%), gehören
die meisten der physiologisch annehmbaren Emulgatoren, z. B. Eilecithin
oder Sojabohnenlecithin oder synthetische Lecithine, wie gesättigte synthetische
Lecithine, z. B. Dimyristoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin
oder Distearoylphosphatidylcholin, oder ungesättigte synthetische Lecithine,
wie Dioleylphosphatidylcholin oder Dilinoleylphosphatidylcholin.
Zu Emulgatoren gehören
auch Tenside, wie freie Fettsäuren,
Ester von Fettsäuren
mit Polyoxyalkylenverbindungen, wie Polyoxypropylenglycol und Polyoxyethylenglycol,
Ether von Fettalkoholen mit Polyoxyalkylenglycolen, Ester von Fettsäuren mit
polyoxyalkyliertem Sorbitan, Seifen, Glycerolpolyalkylenstearat, Glycerolpolyoxyethylenricinoleat,
Homo- und Copolymere von Polyalkylenglycolen, polyethoxyliertes Sojaöl und Ricinussöl sowie
hydrierte Derivate, Ether und Ester von Saccharose oder anderen
Kohlenhydraten mit Fettsäuren,
Fettalkohole, wobei diese gegebenenfalls polyoxyalkyliert sind,
Mono-, Di- und Triglyceride gesättigter
oder ungesättigter
Fettsäuren, Glyceride
oder Sojaöl
und Saccharose.
-
Zu
anderen Emulgatoren gehören
natürliche und
synthetische Formen von Gallensalzen oder Gallensäuren, sowohl
mit Aminosäuren
konjugiert als auch unkonjugiert, z. B. Taurodesoxycholat und Cholsäure. Diese
kann z. B. Mikrobläschen
stabilisieren, die vor der Sprühtrocknung
erzeugt wurden.
-
Porenbildende
Mittel können
in einer Menge zwischen 0,01 und 75% (Gew./Vol.) zugegeben werden,
um die Porenbildung zu verstärken.
Zum Beispiel wird bei der Lösemittelverdampfung
ein porenbildendes Mittel, wie ein flüchtiges Salz, z. B. Ammoniumbicarbonat,
Ammoniumacetat, Ammoniumchlorid oder Ammoniumbenzoat oder ein anderes
lyophilisierbares Salz, zunächst
in Wasser gelöst.
Die Lösung,
die das porenbildende Mittel enthält, wird dann mit der Polymerlösung emulgiert,
um Tröpfchen
des porenbildenden Mittels im Polymer zu erzeugen. Diese Emulsion
wird dann sprühgetrocknet
oder durch einen Prozess aus einer Lösemittelverdampfung/Extraktion
geführt.
Nach der Ausfällung
des Polymers werden die gehärteten
Mikrokügelchen
gefroren und lyophilisiert, um die porenbildenden Mittel zu entfernen.
-
Größe der Mikroteilchen
-
Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
zur Herstellung injizierbarer Mikroteilchen, die im Stande sind,
durch das Kapillarbett der Lunge zu treten, sollten die Mikroteilchen
einen Durchmesser zwischen ungefähr
1 und 10 μm
haben. Größere Mikroteilchen können das
Kapillarbett der Lunge verstopfen, und kleinere Mikroteilchen haben
möglicherweise
nicht genügend
Echogenität.
Größere Mikroteilchen
sind für
Verabreichungen über
andere Wege als eine Injektion nützlich,
z. B. für
den oralen Weg (zur Untersuchung des Gastrointestinaltraktes), für eine Verabreichung
auf andere Schleimhautoberflächen
(rektal, vaginal, oral, nasal) oder durch Inhalation. Die bevorzugte
Teilchengröße für die orale
Verabreichung liegt bei ungefähr
0,5 μm und
5 mm. Zu nützlichen
pharmazeutisch annehmbaren Trägern
gehören
Saline, die Glycerol und TWEENTM 20 enthält, und
isotonisches Mannitol, das TWEENTM 20 enthält. Die
Analyse der Teilchengröße kann
mittels eines Coulter-Counters, lichtmikroskopisch, mittels einer
Scanning-Elektronenmikroskopie oder mittels einer Transmissionselektronenmikroskopie
erfolgen.
-
Targeting
-
Die
Mikroteilchen können
spezifisch oder unspezifisch über
die Auswahl des Polymers, das das Mikroteilchen ausmacht, die Größe des Mikroteilchens
und/oder die Einarbeitung oder Befestigung eines Liganden an den
Mikroteilchen auf ein bestimmtes Ziel ausgerichtet werden. Zum Beispiel
können biologisch
aktive Moleküle
oder Moleküle,
die die Ladung, die Lipophilie oder die Hydrophilie des Teilchens
beeinflussen, an der Oberfläche
des Mikroteilchens angebracht werden. Weiterhin können Moleküle an den
Mikroteilchen angebracht werden, die die Gewebeadhäsion minimieren
oder das spezifische Targeting der Mikrokügelchen in vivo erleichtern.
Zu repräsentativen
Molekülen
für ein
Targeting gehören Antikörper, Lectine
und andere Moleküle,
die spezifisch von Rezeptoren auf den Oberflächen von Zellen eines bestimmten
Typs gebunden werden.
-
Hemmung der Aufnahme durch
das RES
-
Die
Aufnahme und Entfernung der Mikroteilchen kann ebenfalls durch die
Auswahl des Polymers und/oder die Einarbeitung oder Kopplung von
Molekülen,
die die Adhäsion
oder die Aufnahme minimieren, minimiert werden. Zum Beispiel kann
die Gewebeadhäsion
des Mikroteilchens durch die kovalente Bindung von Poly(alkylenglycol)-Gruppen
an die Oberfläche
des Mikroteilchens minimiert werden. Die Poly(alkylenglycol)-Gruppen
auf der Oberfläche
haben eine hohe Affinität
für Wasser,
das die Proteinadsorption auf die Oberfläche des Teilchens vermindert. Die
Erkennung und Aufnahme des Mikroteilchens durch das retikuloendotheliale
System (RES) wird deshalb verringert.
-
Zum
Beispiel kann die terminale Hydroxygruppe des Poly(alkylenglycol)
dazu verwendet werden, biologisch aktive Moleküle oder Moleküle, die die
Ladung, die Lipophilie oder die Hydrophilie des Teilchens beeinflussen,
kovalent auf der Oberfläche des
Mikroteilchens zu befestigen. In diesem Gebiet verfügbare Verfahren
können
dazu eingesetzt werden, einen beliebigen aus einer großen Vielzahl
von Liganden an den Mikroteilchen anzubringen, um die Eigenschaften
bezüglich
der Zufuhr und der Stabilität oder
andere Eigenschaften des Mikroteilchens in vivo zu verbessern.
-
Diagnostische Anwendungen
-
Die
Mikroteilchen werden typischerweise mit einem pharmazeutisch annehmbaren
Träger,
z. B. phosphatgepufferter Saline oder Saline oder Mannitol, zusammengegeben,
und dann wird eine für
den Nachweis wirksame Menge über
einen geeigneten Weg, typischerweise über eine Injektion in ein Blutgefäss (i. v.)
oder oral, an einen Patienten verabreicht. Mikroteilchen, die ein
verkapseltes Imaging-Mittel enthalten, können für ein Gefäß-Imaging sowie in Anwendungen
zur Erkennung von Leber- und Nierenerkrankungen, in kardiologischen
Anwendungen, beim Nachweis und der Charakterisierung von Tumormassen
und Geweben und bei der Messung der peripheren Blutgeschwindigkeit
eingesetzt werden. Die Mikroteilchen können auch mit Liganden verknüpft werden,
die eine Gewebeadhäsion
minimieren, oder die die Mikroteilchen in spezifische Bereiche des
Körpers
in vivo lenken, wie oben beschrieben wurde.
-
Die
oben beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen werden durch
die Bezugnahme auf die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele besser verstanden
werden.
-
Beispiel 1: Herstellung
von luftgefüllten
Mikrokügelchen
aus PEG-PLGA
-
6,0
g PEG-PLGA (75 : 25) (MG 120 000 Dalton) wurden in 400 ml Methylenchlorid
gelöst.
Es wurden 6,7 ml Wasser dem Polymer zugesetzt, und die Mischung
aus dem Polymer und Wasser wurde mittels eines Virtis-Homogenisators
bei 10 000 Upm 1 Minute homogenisiert. Die Lösung wurde mit einer Flussgeschwindigkeit
von 20 ml/min mittels einer peristaltischen Pumpe gepumpt und mittels
eines Lab-Sprühtrockners
von Buechi sprühgetrocknet.
Die Einlasstemperatur betrug 50°C,
und die Auslasstemperatur betrug 30°C. Das Pulver aus den Mikrokügelchen
wurde gesammelt und bei Umgebungstemperatur 48 Stunden lyophilisiert.
Die Teilchendurchmesser reichten von 1–10 μm, wenn ihre Größe mittels
eines Coulter-Counters bestimmt wurde, mit einem Zahlenmittel von
2,0 μm und
einem mittleren Volumen von 4,5 μm.
Eine Scanning-Elektronenmikroskopie zeigte, dass die Teilchen im
allgemeinen kugelförmig
waren, mit glatten Oberflächen
und gelegentlichen Oberflächenkrenulationen.
Die Transmissionselektronenmikroskopie zeigte, dass die Teilchen
eine Mischung aus mikrokapselartigen Teilchen und schwammartigen
Teilchen waren.
-
Beispiel 2: Herstellung
von luftgefüllten
Mikrokügelchen
aus PEG-PLGA
-
7,1
g PEG-PLGA (75 : 25) (MG 120 000 Dalton) wurden in 320 ml Methylenchlorid
gelöst.
Es wurden 11 ml Ammoniumacetatlösung
(0,74 g/ml) dem Polymer zugesetzt, und die Mischung aus dem Polymer
und Ammoniumacetat wurde mittels eines Virtis-Homogenisators bei
16 000 Upm 1 Minute homogenisiert. Die Lösung wurde mit einer Flussgeschwindigkeit
von 20 ml/min mittels einer peristaltischen Pumpe gepumpt und mittels
eines Lab-Sprühtrockners
von Buechi sprühgetrocknet.
Die Einlasstemperatur betrug 32°C,
und die Auslasstemperatur betrug 19°C. Das Pulver aus den Mikrokügelchen
wurde gesammelt und bei Umgebungstemperatur 48 Stunden lyophilisiert.
Die Teilchendurchmesser reichten von 1–10 μm, wenn ihre Größe mittels
eines Coulter-Counters bestimmt wurde, mit einem Zahlenmittel von
1,8 μm und
einem mittleren Volumen von 5,1 μm.
Eine Scanning-Elektronenmikroskopie zeigte, dass die Teilchen im
allgemeinen kugelförmig
waren, mit glatten Oberflächen
und gelegentlichen Oberflächenkrenulationen.
-
Beispiel 3: Herstellung
mit Octafluorpropan gefüllter Mikrokügelchen
aus PEG-PLGA
-
Die
Mikrokügelchen,
die wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt worden waren, wurden
in 54 mg Mannitol/ml und 0,5% PLURONICTM F127
dispergiert. Die Dispersion wurde in Gefäße von 5 ml aliquotiert. Die
Gefäße wurden
bei –80°C eingefroren und über Nacht
lyophilisiert.
-
Beispiel 4: Herstellung
mit Octafluorpropan gefüllter Mikrokügelchen
aus PLGA
-
7,4
g PLGA (75 : 25) (MG 120 000 Dalton) wurden in 360 ml Methylenchlorid
gelöst.
Es wurden 7,3 ml Ammoniumacetatlösung
(0,74 g/ml) dem Polymer zugesetzt, und die Mischung aus dem Polymer und
Ammoniumacetat wurde mittels eines Virtis-Homogenisators bei 16
000 Upm 1 Minute homogenisiert. Die Lösung wurde mit einer Flussgeschwindigkeit
von 20 ml/min mittels einer peristaltischen Pumpe gepumpt und mittels
eines Lab-Sprühtrockners von
Buechi sprühgetrocknet.
Die Einlasstemperatur betrug 32°C,
und die Auslasstemperatur betrug 20°C. Das Pulver aus den Mikrokügelchen
wurde gesammelt und bei Umgebungstemperatur 48 Stunden lyophilisiert.
Die Teilchendurchmesser reichten von 1–10 μm, wenn ihre Größe mittels
eines Coulter-Counters bestimmt wurde, mit einem Zahlenmittel von
2,0 μm und
einem mittleren Volumen von 5,2 μm. Eine
Scanning-Elektronenmikroskopie zeigte, dass die Teilchen im allgemeinen
kugelförmig
waren, mit glatten Oberflächen
und gelegentlichen Oberflächenkrenulationen.
Die Mikrokügelchen,
die im Beispiel 2 hergestellt worden waren, wurden in 54 mg Mannitol/ml
und 0,5% PLURONICTM F127 dispergiert. Die Dispersion
wurde in Gefäße von 5
ml aliquotiert. Die Gefäße wurden
bei –80°C eingefroren
und über Nacht lyophilisiert.
Die Gefäße wurden
mit Octafluorpropan bei einem Druck 10 psig gefüllt und kontinuierlich 3 Minuten
mit dem Gas gespült.
Danach wurden die Gefäße 24 Stunden
bei –20°C und dann
bis zur Verwendung bei 4°C
gelagert.
-
Beispiel 5: In-vivo-Testung
mikroverkapselter Luft
-
Männliche
Neuseeland-Kaninchen (2–2,5 kg)
ließ man über Nacht
hungern. Die Tiere wurden mit Ketamin (100 mg/ml, 0,7 ml) und Rompum
(20 mg/ml, 0,5 ml) anästhesiert.
Die Dosierungsform wurde intravenös innerhalb von ungefähr 5 Sekunden über einen
Katheter verabreicht, der in der linken marginalen Ohrvene angebracht
war. Nach der Verabreichung wurde der Katheter mit 1 ml normaler
Saline gespült.
Alle Gefäße wurden
vor der Rekonstitution bei Raumtemperatur äquilibriert. Die Dosierungsform
wurde nicht eher als 2 Minuten vor der Injektion rekonstituiert.
Das Rekonstituierungsverfahren bestand aus der Zugabe von 1 ml Wasser
zum Gefäß, der Äquilibrierung
des Gasdruckes im Gefäß auf Atmosphärendruck
durch das Herausziehen des Kolbens der 5-ml-Spritze, dem Herausziehen
der Nadel der Spritze und dem Mischen des Röhrchens, bis sich das gesamte
lyophilisierte Material gelöst
hatte. Das Ultraschall-Imaging des Herzens wurde mittels des Gerätes ATL
HDI 3 000 für
das klinische Ultraschall-Imaging, das mit einem hochauflösenden C7-4-Transducer
ausgerüstet
war, durchgeführt.
Die abgegebene Intensität
war derart, dass der Tls-Wert 0,3 und der MI-Wert 0,8 betrug. Die
Bildwechselfrequenz betrug 39 Hz, die Tiefe wurde auf 9,7 cm eingestellt,
das Bild wurde mit Map 6 verarbeitet, und der dynamische Bereich
betrug 55 dB. Das Imaging wurde vor, während und nach der Verabreichung
der Mittel durchgeführt.
Das Imaging des Herzens erfolgte im B-Modus, und die Einstellungen
der Apparatur wurden so gewählt,
dass die Kammern so echofrei wie möglich gemacht wurden. Die komplette
Folge der Bilder wurde auf einem sVHS-Band aufgenommen, wobei das
Imaging fortgesetzt wurde, bis keine weiteren Signale mehr nachgewiesen
werden konnten.
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Die
im Beispiel 1 hergestellten Mikrokügelchen (Lot 943-110-1) wurden
einem Kaninchen (Nr. 13) in einer Dosis von 26,2 mg/kg verabreicht.
Innerhalb von 10 Sekunden wurde ein breiter Strom eines echogenen
Materials beobachtet, der in das rechte Atrium floss und es ausfüllte. Der
Strom trat in das rechte Atrium über
und füllte
den rechten Ventrikel. Visuell erschien die Intensität in den
beiden Kammern gleich. Es wurde keine Echogenität beobachtet, die in den linken
Ventrikel floss. Die Verstärkung
im rechten Atrium und dem rechten Ventrikel hielt ungefähr 30 Sekunden
an.
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Beispiel 6: In-vivo-Testung
von Teilchen aus mikroverkapseltem Perfluorkohlenstoff
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Die
im Beispiel 3 hergestellten Mikrokügelchen (Lot Nr. 952-7-3) wurden
einem Kaninchen (Nr. 18) in einer Dosis von 24 mg/kg verabreicht.
Die Intensität
im rechten Ventrikel stieg an, gefolgt von einer zunehmenden Intensität im linken
Ventrikel. Es wurde eine ausgezeichnete Opazifizierung der Kammer
beobachtet. Nach 2,5 Minuten gingen die Intensitäten in der Kammer auf den Ausgangswert
zurück.
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Die
im Beispiel 4 hergestellten Mikrokügelchen (Lot Nr. 952-49-1)
wurden einem Kaninchen (Nr. 19) in einer Dosis von 22 mg/kg verabreicht.
Die Intensität
im rechten Ventrikel stieg an, gefolgt von einer zunehmenden Intensität im linken
Ventrikel. Es wurde eine ausgezeichnete Opazifizierung der Kammer
beobachtet. Die Intensitäten
in der Kammer gingen Nach 2 Minuten gingen auf den Ausgangswert zurück.
-
Diese
Beispiele zeigen eine ausgezeichnete Kammeropazifizierung.
-
Ähnliche
Studien wurden mit verschiedenen fluorierten Gasen, Schwefelhexafluorid
und Hexafluorcyclobutan durchgeführt.