PL190452B1 - Sposób zwiększenia echogeniczności mikrocząstek do ultradźwiękowego obrazowania diagnostycznego, kompozycja do ultradźwiękowego obrazowania diagnostycznego i sposób wytwarzania mikrocząstek do ultradźwiękowego obrazowania diagnostycznego - Google Patents

Abstract

1. Sposób zw iekszenia echogenicznosci m ikroczastek do ultradzw iekow ego obrazowania diagno- stycznego, znam ienny tym, ze m ikroczastki tworzy sie najpierw jako porowate polim eryczne m ikroczastki wypelnione powietrzem poprzez w prow adzenie do roztworu syntetycznego biokom patybilnego polim eru w rozpuszczalniku organicznym skutecznej ilosci soli lotnej czynnika tw orzacego pory, po czym w znany sposób z roztworu usuwa sie rozpuszczalnik polim eru i sól lotna, by utworzyc te porow ate mikroczastki, a nastepnie z utworzonych m ikroczastek poprzez ich pory usuwa sie pow ietrze i zastepuje sie je w prow adza- jac równiez przez te pory gaz fluorow y w ilosci skutkujacej zwiekszeniem ultradzw iekow ego obrazowania po podaniu pacjentowi w odniesieniu do m ikroczastek z w prow adzona ekw iw alentna objetoscia powietrza. 9. Kom pozycja do ultradzw iekow ego obrazowania diagnostycznego, zaw ierajaca porowate synte- tyczne polimerowe m ikroczastki i farm aceutycznie akceptowalny nosnik do podaw ania tych m ikroczastek pacjentowi, które to m ikroczastki sa w ypelniane gazem fluorowym, znam ienna tym, ze mikroczastki naj- pierw sa tworzone jak o porow ate m ikroczastki wypelnione powietrzem , przez w prow adzenie do roztw oru syntetycznego biokom patybilnego polim eru w rozpuszczalniku organicznym skutecznej ilosci soli lotnej srodka tworzacego pory, a nastepnie usuniecie z roztworu w znany sposób rozpuszczalnika polimeru i soli lotnej, po czym nastepuje usuniecie pow ietrza poprzez pory z utworzonych porowatych m ikroczastek i zasta- pienie powietrza fluorowym gazem w prowadzonym równiez poprzez te pory w ilosci skutkujacej zw ieksze- niem obrazowania ultradzw iekow ego po podaniu pacjentowi porównaniu z m ikroczastkam i z w prow adzona do ich wnetrza ekw iw alentna objetoscia powietrza. 17. Sposób wytwarzania m ikroczastek do ultradzwiekowego obrazow ania diagnostycznego, znam ien- ny tym, ze do roztworu syntetycznego biokom patybilnego polimeru w rozpuszczalniku organicznym w pro- wadza sie skuteczna ilosc soli lotnej srodka tw orzacego pory, a nastepnie z roztworu w znany sposób usuw a sie rozpuszczalnik polim eru i sól lotna, by utworzyc porowate m ikroczastki, a nastepnie usuwa sie powietrze poprzez pory utworzonych m ikroczastek i zastepuje sie powietrze gazem fluorowym wprowadzonym poprzez te pory w ilosci skutkujacej zw iekszeniem obrazowania ultradzwiekowego po podaniu pacjentow i w porów - naniu z mikroczastkami z w prow adzona do ich wnetrza ekw iw alentna objetoscia powietrza. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób zwiększenia echogeniczności mikrocząstek do ultradźwiękowego obrazowania diagnostycznego, kompozycja do ultradźwiękowego obrazowa4

190 452 nia diagnostycznego i sposób wytwarzania mikrocząstek do ultradźwiękowego obrazowania diagnostycznego, przeznaczone do stosowania w zakresie wytwarzania środków obrazowania diagnostycznego, a w szczególności zakapsułkowanych środków kontrastowych obrazowania ultradźwiękowego.

Podczas stosowania ultradźwięków w celu uzyskania obrazu organów wewnętrznych i budowy człowieka lub zwierzęcia, fale ultradźwiękowe, fale energii dźwiękowej, przy częstotliwości powyżej częstotliwości rozróżnialnej przez ucho ludzkie, są odbijane przy przechodzeniu przez ciało. Różne typy tkanki ciała odbijają różnie fale ultradźwiękowe i odbicia, które są wytwarzane przez fale ultradźwiękowe odzwierciedlające różne struktury wewnętrzne, są wykrywane i przetwarzane elektronicznie do monitora obrazowego.

Dla pewnych stanów medycznych otrzymanie użytecznego obrazu interesującego organu lub struktury jest szczególnie trudne, ponieważ szczegóły struktury nie są odpowiednio rozróżnialne od tkanki otaczającej w obrazie ultradźwiękowym wytworzonym przez odbicie fal ultradźwiękowych przy braku środka zwiększającego kontrast.

Wykrywanie i obserwacja pewnych stanów fizjologicznych i patologicznych mogą być znacznie polepszone przez zwiększenie kontrastu w obrazie ultradźwiękowym, przez wlanie środka do interesującego organu lub innej struktury.

W innych przypadkach szczególnie ważne jest wykrywanie ruchu samego środka zwiększającego kontrast. Na przykład szczególny wzór przepływu krwi, o którym wiadomo, że wynika ze szczególnych nienormalności sercowo-naczyniowych, może być rozróżnialny tylko przez wlanie środka kontrastowego do prądu krwi i obserwowanie dynamiki przepływu krwi.

Materiały, które są użyteczne jako środki kontrastu ultradźwiękowego, działają przez posiadanie wpływu na fale ultradźwiękowe, gdy przechodzą one przez ciało i są odbijane tworząc obraz, z którego dokonywana jest diagnoza medyczna.

Różne typy substancji wpływają na fale ultradźwiękowe w różny sposób i do różnego stopnia. Ponadto pewne skutki powodowane przez środki zwiększające kontrast są łatwiej mierzone i obserwowane niż inne.

Przy wyborze idealnego składu środka zwiększającego kontrast należałoby wybierać substancję, która ma najbardziej dramatyczny wpływ na falę ultradźwiękową podczas przechodzenia jej przez ciało. Także wpływ na falę ultradźwiękową powinien być łatwo mierzalny.

Istnieją trzy główne skutki zwiększania kontrastu, które mogą być widoczne na obrazie ultradźwiękowym: rozproszenie wsteczne, tłumienie wiązki i prędkość różniczki dźwięku.

Jednym z nich jest rozproszenie wsteczne. Gdy fala ultradźwiękowa przechodząca przez ciało napotka strukturę taką jak organ lub inna tkanka ciała, struktura ta odbija część fali ultradźwiękowej. Różne struktury w obrębie ciała odbijają energię ultradźwiękową w różny sposób i z różną siłą. Ta energia odbita jest wykrywana i użyta do wytworzenia obrazu struktur, poprzez które przeszła fala ultradźwiękowa.

Termin „rozproszenie wsteczne” odnosi się do zjawiska, w którym energia ultradźwiękowa jest rozpraszana wstecznie w kierunku źródła przez substancję o pewnych własnościach fizycznych.

Od dawna zauważono, że kontrast obserwowany na obrazie ultradźwiękowym może być zwiększony przez obecność substancji znanych jako powodujące dużą ilość rozproszenia wstecznego. Gdy taka substancja podana jest do określonej części ciała, kontrast pomiędzy obrazem ultradźwiękowym tej części ciała, a otaczającymi ją tkankami, nie zawierającymi tej substancji, jest zwiększony.

Jest oczywiste, że na skutek ich własności fizycznych, różne substancje powodują rozproszenie wsteczne w różnym stopniu.

Zgodnie z tym poszukiwania środków wzmacniających kontrast skupiono na substancjach, które są trwałe i nietoksyczne i które wykazują maksymalną ilość rozproszenia wstecznego.

Zdolność substancji do powodowania rozproszenia wstecznego energii ultradźwiękowej zależy od danych charakterystycznych substancji, takich jak jej zdolność do sprężania. Gdy bada się różne substancje, użyteczne jest porównywanie jednej szczególnej miary zdolności substancji do powodowania rozproszenia wstecznego znanej jako „przekrój rozproszenia”.

Przekrój rozproszenia poszczególnej substancji jest proporcjonalny do promienia rozproszenia i zależy także od długości fali energii ultradźwiękowej i innych własności fizycz190 452 nych tej substancji [J. Ophir i K. J. Parker, Środki Kontrastowe w Ultradźwięku Diagnostycznym, Ultrasound in Medicine & Biology, tom IS, nr 4, str. 319, 323 (1989)].

Przy ocenie użyteczności różnych substancji jako środków kontrastujących obraz, można obliczyć, które środki powinny zapewnić największy kontrast na obrazie ultradźwiękowym. Można przyjąć, że ściśliwość cząstki stałej jest znacznie mniejsza niż ściśliwość otaczającego środowiska i że gęstość cząstki jest znacznie większa.

Stosując to założenie, przekrój rozproszenia środka zwiększającego kontrast z cząsteczek stałych został oszacowany jako 1,75 [Ophir i Parker, powyżej, str. 325],

Dla czysto ciekłego rozpraszacza, ściśliwość adiabatyczna i gęstość rozpraszacza i otaczającego środowiska są prawdopodobnie w przybliżeniu równe, co dałoby w wyniku, że ciecze miałyby przekrój rozproszenia zero. Jednakże ciecze mogą wykazywać pewne rozproszenie wsteczne, jeśli istnieją duże objętości środka ciekłego.

Na przykład, jeśli środek ciekły przechodzi z bardzo małego naczynia do bardzo dużego naczynia tak, że ciecz zajmuje zasadniczo całe naczynie, ciecz może wykazywać mierzalne rozproszenie wsteczne.

Tym niemniej, oceniane jest przez specjalistów, że czyste ciecze są względnie nieefektywnymi rozpraszaczami w porównaniu z wolnymi mikropęcherzykami gazowymi.

Innym skutkiem, który może być zaobserwowany w obecności pewnych środków stałych zwiększających kontrast, jest tłumienie wiązki, inaczej tłumienie fali ultradźwiękowej.

Kontrast obrazu został zaobserwowany w konwencjonalnym obrazowaniu dzięki miejscowym różnicom tłumienia pomiędzy pewnymi typami tkanki. [K.J. Parker i R.C. Wang, „Pomiar Tłumienia Ultradźwiękowego w Regionach Wybranych z Obrazów B-Scan”, IEEE Trans. Biomed. Enar. BME 30(8), str. 431-37 (1983); K.J. Parker, R.C. Wang i R.M. Lemer, „Tłumienie Zależności Wielkości i Częstotliwości Ultradźwięków dla Scharakteryzowania Tkanki”, Radiology. 153(3), str. 285-88 (1984)].

Założono, że pomiary tłumienia regionu tkanki dokonane przed i po wlaniu środka mogą dać wzmocniony obraz.

Jednakże techniki oparte na kontraście tłumienia jako środku mierzenia wzmocnienia kontrastu środka ciekłego nie są dobrze rozwinięte i nawet, jeśli byłyby w pełni dopracowane, mogą ulegać pogorszeniu od ograniczeń, jeśli chodzi o organy wewnętrzne lub struktury, dla których technika ta może być stosowana.

Na przykład, nie jest prawdopodobne, aby strata tłumienia na skutek ciekłych środków kontrastowych mogła być zaobserwowana w obrazie układu sercowo-naczyniowego z powodu wysokiej objętości ciekłego środka kontrastowego, która byłaby niezbędna w danym naczyniu, zanim mogłaby być zmierzona istotna różnica w tłumieniu.

Pochłanianie energii przez cząstki występuje na skutek mechanizmu określanego jako „ruch względny.

Zmiana w tłumieniu spowodowana przez ruch względny może być pokazana jako wzrastająca liniowo z zagęszczeniem cząstek i jako kwadrat różnicy gęstości pomiędzy cząstkami a otaczającym środowiskiem.

[K.J. Parker i inni, „Środek Kontrastowy z Cząstek Stałych z Potencjałem Obrazowania Ultradźwiękowego Wątroby”, Ultrasound in Medicine & Biology, tom 13, nr 9, str. 555, 561 (1987)].

Dlatego tam, gdzie występuje znaczne nagromadzenie cząstek stałych, kontrast tłumieniowy może być korzystnym mechanizmem obserwowania wzmocnienia kontrastu obrazowego, chociaż skutek jest o znacznie mniejszej wielkości niż przy zjawisku rozproszenia wstecznego i okazałaby się jego mała użyteczność w diagnozach sercowo-naczyniowych.

Dodatkowa technika zwiększania kontrastu na obrazie ultradźwiękowym związana jest z pojęciem „prędkości różniczki głosu”.

Została ona zaproponowana w oparciu o fakt, że prędkość głosu różni się w zależności od ośrodka, przez który on przechodzi.

Dlatego, jeśli dostatecznie duża objętość środka, w którym prędkość głosu jest inna niż w otaczającej tkance, może być wprowadzona do obszaru będącego celem, różnica prędkości głosu w tym obszarze może być mierzalna.

190 452

Podsumowując, ultradźwięk diagnostyczny jest potężnym nieinwazyjnym narzędziem, które może być stosowane do uzyskania informacji o organach wewnętrznych ciała.

Nadejście obrazowania skali kontrastów i kolorowego Dopplera znacznie udoskonaliło zakres rozdzielczości tej techniki.

Chociaż techniki wykonywania ultradźwięków diagnostycznych polepszono znacznie i ze względu na wykonywanie i stosowanie środków kontrastowych istnieje nadał potrzeba zwiększenia rozdzielczości obrazowania przepływu sercowego i jam sercowych, organów stałych, przepływu nerkowego, przepływu w narządach stałych; sygnałów Dopplera prędkości krwi i kierunku przepływu podczas obrazowania w realnym czasie.

Różne polimery naturalne i syntetyczne były stosowane do zakapsułkowania środków kontrastowych obrazowania takich jak powietrze.

Schneider i inni, Invest. Radiol., tom 27, strony 134-139 (1992) opisują trzymikrometrowe, wypełnione powietrzem cząstki polimerowe.

Cząstki te były określone jako trwałe w plazmie i pod przyłożonym ciśnieniem.

Jednakże przy 2,5 MHz ich echogeniczność była niska. Inny typ zawiesiny mikropęcherzykowej uzyskano z oczyszczonej ultradźwiękowo albuminy. Feinstein i inni, J. AM. Coli. Cardiol., tom 11, strony 59-65 (1988). Feinstein opisuje przygotowanie mikropęcherzyków, które otrzymują stosowną wielkość dla przejścia przez płuca z doskonałą trwałością in vitro.

Jednakże te mikropęcherzyki są krótkotrwałe in vivo, mając półokres trwałości około kilka sekund (który jest w przybliżeniu równy jednemu przejściu obiegu) z powodu ich niestabilności pod ciśnieniem [Gottlieb, S. i inni, J. Am. Soc. Echo., tom 3, str. 328 (1990), Skrót; i Shapiro, J.R. i inni, J. Am. Coli. Cardiol., tom 16, strony 1603-1607 (1990)].

Zakapsułkowane w żelatynie pęcherzyki powietrza zostały opisane przez Carrolfa i innych (Carroll, B.A. i inni, Invest. Radiol.. tom 15, strony 260-266 (1980) i Carroll, B.A. i inni, Radiology, tom 143, strony 747-750 (1982), lecz na skutek ich dużych rozmiarów (12 i 80 mikrometrów) prawdopodobnie nie przeszłyby przez kapilary płucne.

Zakapsułkowane w żelatynie mikropęcherzyki zostały także opisane w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym PCT/US80/00502 dokonanym przez Rasor Associates, Inc. W rozwiązaniu tym są one utworzone przez „zlewanie się” żelatyny.

Mikropęcherzyki stabilizowane przez mikrokryształy galaktozy (SHU 454 i SHU 508) zostały także opisane przez Fritzsch'a i innych. Fritzsch, T. i inni, Invest. Radiol.. tom 23 (Dodatek 1), strony 302-305 (1988); i Fritzsch, T. i inni, Invest. Radiol., tom 25 (Dodatek 1), 160-161 (1990).

Mikropęcherzyki te mają trwałość do 15 minut in vitro lecz mniej niż 20 sekund in vivo. [Rovai, D. i inni, J Am. Coli. Cardiol, tom 10, strony 125-134 (1987); i Smith, M. J. Am. Coli. Cardiol., tom 13, strony 1622-1628 (1989)].

Europejskie zgłoszenie patentowe Nr EP 90901933.5 dokonane przez firmę Schering AG ujawnia przygotowanie i stosowanie mikrozakapsułkowanego gazu lub lotnych cieczy do celów ultradźwiękowego obrazowania, przy czym mikrokapsułki są tworzone z syntetycznych polimerów lub wielocukrów.

Z kolei europejskie zgłoszenie patentowe Nr EP 91810366.4 dokonane przez Sintetica S.A. (0 458 754 Al) ujawnia mikrobalony gazowe ograniczone przez międzyfazowo osadzoną membranę polimerową, które to mikrobalony mogą być rozproszone w nośniku wodnym dla wstrzyknięcia do organizmu zwierzęcego lub do podania doustnego, doodbytniczego lub do cewki moczowej w celach terapeutycznych lub diagnostycznych.

Z publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 92/18164 dokonanego na rzecz Delta Biotechnology Limited opisano przygotowanie mikrocząstek przez suszenie rozpyłowe, w bardzo kontrolowanych warunkach w zakresie temperatury, prędkości rozpylania, rozmiaru cząstek i warunków suszenia, wodnego roztworu białkowego dla utworzenia pustych kul z uwięzionym w nich gazem, do stosowaniu w obrazowaniu.

Natomiast z publikacji innego międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 93/25242 opisano syntezę mikrocząstek do celów obrazowania ultradźwiękowego, składających się z gazu zawartego w osłonie z policyjanoakrylanu lub poliestru.

190 452

Kolejna publikacja międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 92/21382 ujawnia sposób wytwarzania mikrocząstkowych środków kontrastowych, które zawierają wiązaną kowalencyjnie matrycę zawierającą gaz, przy czym matryca ta jest węglowodanem.

W opisach patentowych USA o nr nr 5 334 381, 5 123 414 i 5 352 435 udzielone na rzecz Unger'a opisano liposomy do stosowania jako ultradźwiękowe środki kontrastowe, które zawierają gazy, prekursory gazów, takie jak prekursor gazowy pH-aktywizowany lub fotoaktywizowany, jak również inne ciekłe i stałe środki zwiększające kontrast.

Kolejny opis patentowy USA nr 5 393 524 udzielony na rzecz firmy Quay ujawnia stosowanie środków zawierających fluoropochodne węglowodorów dla zwiększenia kontrastu w obrazie ultradźwiękowym.

Środki te składają się z nadzwyczaj małych pęcherzyków lub mikropęcherzyków wybranych gazów, które charakteryzują się długim okresem trwałości w roztworze i są dostatecznie małe dla przejścia przez płuca, umożliwiając użycie ich w obrazowaniu ultradźwiękowym układu sercowo-naczyniowego i innych żywotnych organów.

Publikacja międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 95/23615 dokonanego przez Nycomed ujawnia mikrokapsułki do obrazowania, które są tworzone przez koacerwację roztworu, na przykład roztworu białkowego zawierającego perfluorowęglo wodór.

Publikacja kolejnego międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 95/06518 dokonanego również przez Nycomed Imaging A/S ujawnia środki kontrastowe oparte na polimerach, w których pęcherzyki gazu są zakapsułkowane przez niepolimeryzowalne środki powierzchniowo czynne z polimeru blokowego lub szczepionego tworzącego ścianki.

W rozwiązaniach tych gaz jest wprowadzany do środków kontrastowych w czasie ich tworzenia.

W opisie patentowym USA nr 5 147 631 udzielonym na rzecz Glajch'a i innych opisano nieorganiczne cząstki porowate, które zawierają gaz, którym może być gaz fluorowy, do stosowania w obrazowaniu.

W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr PCT/US94/08416 dokonanym przez Massachusetts Institute of Technology ujawniono mikrocząstki utworzone z polimerów blokowych polietylenowo-glikolowych-poli(laktydo-ko-glikolidowych), mających w sobie zakapsułkowane środki obrazowania zawierające gazy takie jak powietrze i perfluorowęglowodory.

Z kolei w publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 94/16739 dokonanego przez Sonus Pharmaceuticals, Inc. ujawniono, że podczas, gdy ciała stałe i ciecze odbijają głos do pewnego stopnia, gazy są znane jako skuteczniejsze i są preferowanymi środkami do stosowania jako ultradźwiękowe środki kontrastowe.

W rzeczywistości, jak pokazano w przykładzie 12 zgłoszenia tego międzynarodowego zgłoszenia PCT firmy Sonus Pharmaceuticals, Inc, mikrokapsułki białkowe zostały zarzucone, jeśli chodzi o zwiększanie bezpieczeństwa (jak również zagadnienia skuteczności) przy podawaniu świnkom, w porównaniu z emulsjami lub zawiesinami koloidalnymi.

We wszystkich opisanych wyżej przypadkach pożądane jest dalsze zwiększenie echogeniczności środka ultradźwiękowego obrazowania diagnostycznego w połączeniu ze zwiększeniem lub utrzymaniem trwałości i łatwości wytwarzania środka ultradźwiękowego obrazowania diagnostycznego, wykonanych z polimerów syntetycznych

Stąd celem tego wynalazku jest między innymi dostarczenie również kompozycji mikrocząstek do ultradźwiękowego obrazowania diagnostycznego o znacznie zwiększonej echogeniczności.

W sposobie zwiększenia echogeniczności mikrocząstek do ultradźwiękowego obrazowania diagnostycznego według wynalazku istota rozwiązania polega na tym, że mikrocząstki tworzy się najpierw jako porowate polimeryczne mikrocząstki wypełnione powietrzem poprzez wprowadzenie do roztworu syntetycznego biokompatybilnego polimeru w rozpuszczalniku organicznym skutecznej ilości soli lotnej czynnika tworzącego pory, po czym w znany sposób z roztworu usuwa się rozpuszczalnik polimeru i sól lotną, by utworzyć te porowate mikrocząstki, a następnie z utworzonych mikrocząstek poprzez ich pory usuwa się powietrze i zastępuje się je wprowadzając również przez te pory gaz fluorowy w ilości skutkującej zwiększeniem ultradźwiękowego obrazowania po podaniu pacjentowi w odniesieniu do mikrocząstek z wprowadzoną ekwiwalentną objętością powietrza.

190 452

Korzystnie jest według wynalazku, gdy jako gaz fluorowy wprowadza się perfluorowęglowodór.

W innym wykonaniu sposobu według wynalazku korzystnie jako gaz fluorowy wprowadza się gaz wybrany z grupy składającej się z CF4, C₂F₆, C ₃F₈, C 4F8, SF6, C₂F 4 i C 3F 6.

W kolejnym wykonaniu sposobu według wynalazku jako gaz fluorowy wprowadza się oktafluoropropan.

Zgodnie ze sposobem według wynalazku mikrocząstki są mikrokapsułkami albo mikrocząstki są mikrokulkami mającymi w sobie puste przestrzenie.

Korzystnie według wynalazku mikrocząstki tworzy się z syntetycznego polimeru bioprzyczepnego.

Korzystnie jest także, gdy mikrocząstki są tworzone z polimeru syntetycznego wybranego z grupy w skład której wchodzą poli(kwasy wodorotlenowe), polibezwodniki, poliortoestry, poliamidy, poliwęglany, polialkileny, poliglikole alkilenowe, politlenki alkilenowe, politereftalany alkilenowe, polialkohole winylowe, poliwinyloetery, poliestry winylu, polihalogenki winylu, poliwinylopirolidon, polisiloksany, polialkohole winylowe), poli(octan winylu), polistyren, poliuretany i ich kopolimery, celulozy syntetyczne, polikwasy akrylowe, polikwas masłowy), poli(kwas walerianowy), poli(laktydo-ko-kaprolaktan), octan winylowy etylenu, kopolimery i ich mieszanki.

W kompozycji do ultradźwiękowego obrazowania diagnostycznego, zawierającej porowate syntetyczne polimerowe mikrocząstki i farmaceutycznie akceptowalny nośnik do podawania tych mikrocząstek pacjentowi, które to mikrocząstki są wypełniane gazem fluorowym, istota rozwiązania polega na tym, że mikrocząstki są najpierw tworzone jako porowate mikrocząstki wypełnione powietrzem, przez wprowadzenie do roztworu syntetycznego biokompatybilnego polimeru w rozpuszczalniku organicznym skutecznej ilości soli lotnej środka tworzącego pory, a następnie usunięcie z roztworu w znany sposób rozpuszczalnika polimeru i soli lotnej, by utworzyć porowate mikrocząstki, po czym następuje usunięcie powietrza poprzez pory z utworzonych porowatych mikrocząstek i zastąpienie powietrza fluorowym gazem wprowadzonym również poprzez te pory w ilości skutkującej zwiększeniem obrazowania ultradźwiękowego po podaniu pacjentowi porównaniu z mikrocząstkami z wprowadzoną do ich wnętrza ekwiwalentną objętością powietrza..

W korzystnym wykonaniu kompozycji według wynalazku gaz jest perfluorowęglowodorem.

W innych korzystnych wykonaniach według wynalazku mikrocząstka kompozycji zawiera gaz wybrany z grupy składającej się z CF4, C ₂F 6, C 3F 8, C 4F8, SFó, C ₂F 4 i C3F 6.

W kolejnym wykonaniu kompozycji według wynalazku gaz jest oktafluoropropanem.

Według wynalazku korzystnie mikrocząstki są mikrokapsułkami albo w innym wykonaniu mikrocząstki są mikrokulkami mającymi w sobie puste przestrzenie.

Korzystnie jest też, gdy mikrocząstki są utworzone z bioprzyczepnego polimeru syntetycznego.

W korzystnych wykonaniach kompozycji według wynalazku mikrocząstki są utworzone z polimeru syntetycznego wybranego z grupy w skład której wchodzą poli(kwasy wodorotlenowe), polibezwodniki, poliortoestry, poliamidy, poliwęglany, połialkileny, poliglikole alkilenowe, politlenki alkilenowe, politereftalany alkilenowe, polialkohole winylowe, poliwinyloetery, poliestry winylu, polihalogenki winylu, poliwinylopirolidon, polisiloksany, polialkohole winylowe), poli(octan winylu), polistyren, poliuretany i ich kopolimery, celulozy syntetyczne, polikwasy akrylowe, poli(kwas masłowy), poli(kwas walerianowy), poli(laktydoko-kaprolaktan), octan winylowy etylenu, kopolimery i ich mieszanki.

W sposobie wytwarzania mikrocząstek do ultradźwiękowego obrazowania diagnostycznego według wynalazku, istota rozwiązania polega na tym, że do roztworu syntetycznego biokompatybilnego polimeru w rozpuszczalniku organicznym wprowadza się skuteczną ilość soli lotnej środka tworzącego pory, a następnie z roztworu w znany sposób usuwa się rozpuszczalnik polimeru i sól lotną, by utworzyć porowate mikrocząstki, a następnie usuwa się powietrze poprzez pory utworzonych mikrocząstek i zastępuje się powietrze gazem fluorowym wprowadzonym poprzez te pory w ilości skutkującej zwiększeniem obrazowania ultradźwiękowego po podaniu pacjentowi porównaniu z mikrocząstkami z wprowadzoną do ich wnętrza ekwiwalentną objętością powietrza.

190 452

Korzystnie w sposobie według wynalazku mikrocząstki są mikrokapsułkami albo w innym wykonaniu mikrocząstki są mikrokulkami mającymi w sobie puste przestrzenie.

Korzystnie jest też, gdy mikrocząstki tworzy się stosując polimer syntetyczny bioprzyczepny.

W poszczególnych wykonaniach według wynalazku korzystnie jest także, gdy mikrocząstki tworzy się stosując polimer syntetyczny wybrany z grupy, w skład której wchodzą poli(kwasy wodorotlenowe), polibezwodniki, poliortoestry, poliamidy, poliwęglany, polialkileny, poliglikole alkilenowe, politlenki alkilenowe, politereftalany alkilenowe, polialkohole winylowe, poliwinyloetery, poliestry winylu, polihalogenki winylu, poliwinylopirolidon, polisiloksany, polialkohole winylowe), poli(octan winylu), polistyren, poliuretany i ich kopolimery, celulozy syntetyczne, polikwasy akrylowe, poli(kwas masłowy), poli(kwas walerianowy), poli(laktydo-ko-kaprolaktan), octan winylowy etylenu, kopolimery i ich mieszanki.

Korzystnie w sposobie wytwarzania mikrocząstek według wynalazku jako sól lotną stosuje się sól wybraną z grupy, w skład której wchodzą wodorowęglan amonowy, octan amonowy, chlorek amonowy, benzoesan amonowy i ich mieszaniny.

Korzystnie jest także, gdy sól lotną wprowadza się do roztworu polimeru w stosunku pomiędzy 0,01 % a 75% wagi do objętości.

Zgodnie ze sposobem wytwarzania według wynalazku, sól lotną rozpuszcza się w roztworze wodnym przed jej wprowadzeniem do roztworu polimeru, następnie emulguje się z roztworem polimeru aż do utworzenia się kropelek środka tworzącego pory w polimerze, po czym uzyskaną emulsję suszy się rozpyłowo.

Sposób według wynalazku dalej zawiera kolejne kroki po wytrąceniu polimeru przez suszenie rozpyłowe, w których wytrącony polimer zamraża się i liofilizuje w celu usunięcia środków tworzących pory.

W sposobie wytwarzania mikrocząstek według wynalazku korzystnie gaz fluorowy wprowadza się do porowatych mikrocząstek stosując próżnię do usunięcia powietrza i przykładając strumień tego fluorowego gazu do mikrocząstek dla jego wprowadzenia do ich wnętrza.

Nieoczekiwanie okazało się, że wprowadzenie gazów fluorowych, zwłaszcza perfluorowęglowodorów takich jak oktafluoropropan, do syntetycznych mikrocząstek polimerowych, zwłaszcza wysoce porowatych podobnych do gąbki mikrokulek, znacznie zwiększyło echogeniczność otrzymanych mikrocząstek w porównaniu z mikrokulkami z zakapsułkowanym w ich wnętrzu powietrzem.

Mikrocząstki zawierające mikrozakapsułkowany gaz fluorowy według wynalazku są wytwarzane o średnicy odpowiedniej dla tkanki, która ma być docelowo obrazowana, na przykład o średnicy pomiędzy 0,5 a 8 mikrometrów do podawania wewnątrznaczyniowego i o średnicy pomiędzy 0,5 a 5 mm do podawania doustnego dla obrazowania drogi żołądkowo-j elitowej lub innych świateł przewodów.

Mikrocząstki według wynalazku są użyteczne w różnorodnych zastosowaniach diagnostycznych obrazowania ultradźwiękowego, w szczególności w procedurach takich jak obrazowanie naczyń krwionośnych i echokardiografii.

Włączenie gazu fluorowego zgodnie ze sposobem według wynalazku znacznie zwiększa echogeniczność w porównaniu z tymi samymi syntetycznymi mikrocząstkami polimerycznymi zawierającymi powietrze.

Przedmiot wynalazku został bliżej przedstawiony na przykładach realizacji objaśnionych wyczerpującym szczegółowym opisem wszystkich elementów kolejnych wynalazków zgłoszenia, przy czym podane poniżej informacje opisujące kompozycje mikrocząstek według wynalazku i sposoby według wynalazku służą lepszemu zrozumieniu wynalazku nie stanowiąc względem niego żadnych ograniczeń.

Poniżej przedstawione są różne sposoby wytwarzania - syntezy polimerycznych kompozycji do ultradźwiękowego obrazowania składających się z syntetycznych biokompatybilnych mikrocząstek polimerowych, które według wynalazku zawierają gazy fluorowe, zwłaszcza perfluorowęglowodory.

Procesy i odczynniki do wykonywania mikrocząstek

Według stosowania w niniejszym opisie, termin „mikrocząstki” obejmuje mikrokulki i mikrokapsułki jak również mikrocząstki, o ile nie określono inaczej.

190 452

Mikrocząstki mogą być być kształtu kulistego lub innego. Mikrokapsułki są określone jako mikrocząstki mające polimerową zewnętrzną obudowę otaczającą rdzeń z innego materiału, w tym przypadku gazu.

Mikrokulki są zasadniczo kulkami polimerycznymi w stanie stałym, które mogą obejmować strukturę o budowie plastra miodu utworzoną przez pory w polimerze, które są wypełnione gazem odpowiednim dla celów obrazowania, jak opisano poniżej.

Polimery

Do dostarczania gazów fluorowych mogą być stosowane zarówno matryce biodegradowalne jak i niebiodegradowalne, chociaż zalecane są matryce biodegradowalne, zwłaszcza do wstrzykiwania dożylnego.

Do podawania doustnego mogą być stosowane polimery nieerodowalne. Zgodnie z wynalazkiem zalecane są polimery syntetyczne dzięki bardziej odtwarzalnej syntezie i degradacji.

Polimer jest dobierany w oparciu o czas wymagany dla trwałości in vivo, tj. czas wymagany dla doprowadzenia na miejsce, gdzie żądane jest obrazowanie i w oparciu o czas wymagany na obrazowanie.

W jednym z wykonań według wynalazku mikrocząstki z trwałością in vivo pomiędzy około 20 a 30 minut lub więcej mogą być wytwarzane na przykład do zastosowań takich jak echokardiografia, neurosonografia, grafia macicy i jajowodów i procedury diagnostyczne dotyczące organów stałych.

Trwałość in vivo mikrocząstek z zakapsułkowanym środkiem kontrastowym może być regulowana podczas produkcji przy użyciu polimerów takich jak poliaktyd razem z glikolidem kopolimeryzowanym z glikolem polietylenowym (PEG). PEG, jeśli znajduje się na powierzchni zewnętrznej, może wydłużyć czas obiegu tych materiałów, ponieważ jest on bardzo hydrofilowy.

Według wynalazku reprezentatywnymi polimerami syntetycznymi są: poli(kwasy wodorotlenowe) takie jak poli(kwas mlekowy), poli(kwas glikolowy) i poli(kwas mlekowy razem z kwasem glikolowym), poliglikolidy, polilaktydy, kopolimery polilaktydowe ko-glikolidowe i mieszanki, polibezwodniki, poliortoestry, poliamidy, poliwęglany, polialkileny takie jak polietylen i polipropylen, poliglikole alkilenowe takie jak poli(glikol etylenowy), politlenki alkilenowe takie jak poli(tlenek etylenowy), politereftalany alkilenowe takie jak poli(tereftalan etylenowy), polialkohole winylowe, poliwinyloetery, poliestry winylu, polihalogenki winylu takie jak poli(chlorek winylu), poliwinylopirolidon, polisiloksany, polialkohole winylowe), poli(octan winylu), polistyren, poliuretany i ich kopolimery, pochodne celuloz takie jak alkiloceluloza, hydroksyalkiloceluloza, etery celulozowe, estry celulozowe, nitrocelulozy, metylocelulozy, etylocelulozy, hydroksypropyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza, octan celulozy, propionian celulozy, octanomaślan celulozy, octanoftalan celulozy, karboksyetyloceluloza, trój octan celulozy i sól siarczanu sodowego celulozy (łącznie określane tutaj jako „celulozy syntetyczne”), polimery kwasu akrylowego, kwas albo kopolimery metakrylowe lub pochodne ich zawierające estry, polimetakrylan metylu), polimetakrylan etylu), polimetakrylan butylu), poli(met£krylan izobutylu), poli(heksylometakrylan), polimetakrylan izodecylu), polimetakrylan laurylowy), polimetakrylan fenylu), poliakrylan metylu), poli(akryian izopropylu), poliakrylan izobutylu), po li( akrylan oktadekanolu) (łącznie określane tutaj jako „kwasy poliakrylowe”), poli(kwas masłowy), poli(kwas walerianowy) i poli(laktydo-ko-kaprolakton), ich kopolimery i mieszanki.

Zgodnie z wynalazkiem użyte w opisie określenie „pochodne” obejmuje polimery mające podstawienia, dodatki grup chemicznych, na przykład alkilowych, alkilenowych, przyłączenia grup wodorotlenowych, utlenienia i inne modyfikacje rutynowo wykonywane przez specjalistów.

Przykłady zalecanych według wynalazku polimerów niebiodegradowalnych obejmują octan winylowy etylenu, kwas poli(met)akrylowy, poliamidy, kopolimery i ich mieszanki.

Przykłady zalecanych według wynalazku polimerów biodegradowalnych obejmują polimery kwasów wodorotlenowych takich jak kwas mlekowy i poliaktyd kwasu glikolowego, poliglikolid, poliaktyd z glikolidem i kopolimery z glikolidem polietylenowym, polibezwodniki, poli(orto)estry, poliuretany, poli(kwas masłowy), poli(kwas walerianowy) i poli(laktydokokaprolakton).

190 452

Ogólnie, materiały te degradują się in vivo przez zarówno hydrolizę nieenzymatyczną i enzymatyczną jak i przez erozję powierzchniową i nawskrośną.

Polimery bioprzyczepne według wynalazku, szczególnie interesujące w zastosowaniu do powierzchni śluzowkowych, jak w drogach żołądkowo-j elitowych, zawierają wielobezwodniki, wielokwas akrylowy, polimetakrylany metylu), polimetakrylany etylu), polimetakrylan butylu), poli(metakrylan izobutylu), poli(heksylometakrylan), polimetakrylan izodecylu), polimetakrylan laurylowy), polimetakrylan fenylu), poli(al<rylan metylu), poli(akrylan izopropylu), poli(ćkrylan izobutylu), poli(akrylan oktadekanolu).

Zgodnie z wynalazkiem użyte w opisie określenie „rozpuszczalnik polimerów” oznacza rozpuszczalnik organiczny, który jest lotny lub ma względnie niski punkt wrzenia, lub może być usunięty w próżni i który jest dopuszczony do podawania ludziom w ilościach śladowych, taki jak przykładowo chlorek metylenu.

Według wynalazku mogą być także używane inne rozpuszczalniki, takie jak octan etylu, aceton, acetonitryl, czterowodorofuran (THF), kwas octowy, DMSO (dwumetylosulfotlenek) lub ich kombinacje.

Ogólnie, zgodnie z wynalazkiem odpowiednio dobrany polimer jest rozpuszczany w rozpuszczalniku, aby utworzyć roztwór polimeru mający stężenie pomiędzy 0,1 a 60% wagi do objętości, korzystniej pomiędzy 0,5 a 30%.

Użyte w opisie wynalazku określenie „gazy fluorowe” oznacza każdy zgodny biologicznie lub dopuszczony farmakologicznie gaz fluorowy i każdy taki gaz może być wprowadzany do mikrocząstek.

Termin „gaz” według wynalazku odnosi się do każdego związku, który jest gazem lub jest zdolny do tworzenia gazu w temperaturze, przy której obrazowanie jest wykonywane.

Gaz może być złożony z jednego związku lub mieszaniny związków. Zalecane są gazy perfluorowęglowodorowe.

Przykłady gazów obejmują CF 4, C ₂F 6, C 3F 8, C4F 8, SFó, C₂F 4 i C 3F 6. Szczególnie zalecany jest perfluoropropan, ponieważ zapewnia to gaz nierozpuszczalny, który nie będzie się skraplał w temperaturze stosowania i jest farmakologicznie akceptowalny.

Mikrocząstki i metody ich wytwarzania zgodne ze sposobem według wynalazku.

W najbardziej zalecanym wykonaniu mikrocząstki jako składniki kompozycji według wynalazku są produkowane poprzez zastosowanie suszenia rozpyłowego.

Mogą być jednak również użyte inne techniki, takie jak ekstrakcja rozpuszczalnika, zakapsułkowywanie gorącego roztopionego materiału i odparowywanie rozpuszczalnika, jak omówiono poniżej.

W zalecanym wykonaniu powietrze jako gaz wprowadzony do pierwotnie wytworzonej mikrocząstki jest następnie wymieniany przez przyłożenie strumienia pożądanego gazu do mikrokulek lub odciągnięcie próżniowe dla usunięcia zakapsułkowanego gazu, a więc powietrza, a następnie napełnienie pożądanym gazem, a więc gazem fluorowym.

a. Odparowanie rozpuszczalnika

W tej metodzie dobrany polimer jest rozpuszczany w odpowiednim lotnym rozpuszczalniku organicznym takim przykładowo jak chlorek metylenu.

Środek tworzący pory, jako ciało stałe lub w roztworze wodnym, może być dodawany do roztworu.

Otrzymana mieszanina jest traktowana dźwiękami wysokiej częstotliwości lub homogenizowana, zaś uzyskana w ten sposób dyspersja lub emulsja jest dodawana do roztworu wodnego, który zawiera środek powierzchniowo czynny taki jak TWEEN™ 20, TWEEN™ 80, PEG (glikol polietylenowy) lub poli(alkohol winylowy), po czym całość jest homogenizowana dla utworzenia emulsji.

Otrzymana emulsja jest mieszana tak długo aż większość rozpuszczalnika organicznego wyparuje, opuszczając mikrokulki. Może być stosowanych kilka różnych stężeń polimeru (0,05-0,60 g/ml).

Sposobem według wynalazku wykorzystującym znaną metodę odparowania rozpuszczalnika, opisaną wyżej, mogą być otrzymane mikrokulki o różnych rozmiarach (1-1000 mikrometrów) i morfologiach. Sposób ten jest użyteczny dla względnie trwałych polimerów jak poliestry i polistyren.

190 452

Odparowanie rozpuszczalnika jest opisane przez E. Mathiowitz'a i innych, J. Scanning Microscopy, 4, 329 (1990); L.R. Beck'a i innych, Fertil. Steril.. 31, 545 (1979) S. Benita i innych, Ij Pharm. Sęi„ 73, 1721 (1984).

Jednakże nietrwałe polimery, takie jak polibezwodniki, mogą degradować się podczas takiego procesu wytwarzania na skutek obecności wody.

Dla tych polimerów bardziej użyteczne są następujące dalej opisane dwie metody, które są realizowane w całkowicie organicznych rozpuszczalnikach.

b. Mikrozakapsułkowanie gorącego materiału stopionego.

W sposobie według wynalazku wykorzystującym tą metodę, polimer jest najpierw topiony, a następnie mieszany z cząsteczkami stałymi środka tworzącego pory.

Mieszanina jest zawieszona w niemieszającym się rozpuszczalniku (jak olej silikonowy) i, podczas ciągłego mieszania, podgrzewana do 5°C powyżej punktu topienia się polimeru.

Po ustabilizowaniu się, emulsja jest chłodzona aż do zestalenia się cząstek polimeru. Otrzymane w ten sposób mikrokulki są myte poprzez dekantację nie rozpuszczalnikiem polimerowym takim jak eter ropy naftowej (frakcja wrząca w temperaturze 20-135°C) dając swobodnie przepływający proszek.

Tym sposobem mogą być otrzymane mikrokulki o rozmiarach pomiędzy 1 a 1000 mikrometrów. Powierzchnie zewnętrzne kulek przygotowanych tą techniką są zwykle gładkie i zwarte.

Procedura ta jest stosowana do przygotowania mikrokulek wykonanych z poliestrów i polibezwodzianów. Jednakże sposób ten jest ograniczony do polimerów o masach cząsteczkowych pomiędzy 1000-50.000.

Mikrokapsulkowanie gorącego stopionego materiału jest opisane przez E. Mathiowitz'a i innych, Reactive Polymers, 6, 275 (1987).

Polibezwodniki, na przykład wykonane z dwu-karboksyfenoksypropanu i kwasu sebacynowego ze stosunkiem molowym 20:80 (P(CPP-SA) 20:80) (masa cząsteczkowa 20.000), mogą być przygotowane przez mikrokapsulkowanie gorącego stopionego materiału lub na przykład, poli(fumarowo-ko-sebacynowe) (20:80) (masa cząsteczkowa 15.000) wstępne mikrokulki mogą być przygotowane przez mikrokapsulkowanie gorącego stopionego materiału.

c. Usuwanie rozpuszczalnika.

Technika ta była początkowo przewidziana dla polibezwodników. W metodzie tej środek tworzący pory jest rozpraszany lub rozpuszczany w roztworze wybranego polimeru w lotnym rozpuszczalniku organicznym takim jak chlorek metylu.

Mieszanina ta jest zawieszana przez mieszanie w oleju organicznym (takim jak olej silikonowy) dla utworzenia emulsji.

W odróżnieniu od opisanej wcześniej metody odparowywania rozpuszczalnika, technika ta może być zastosowana do wykonywania mikrokulek z polimerów o wysokich temperaturach topienia i różnych masach cząsteczkowych.

Zewnętrzna morfologia kulek wyprodukowanych tą techniką jest bardzo zależna od typu użytego polimeru.

d) metoda suszenia rozpyłowego mikrocząstek.

Mikrocząstki mogą być wytwarzane przy wykorzystaniu wymienionej na wstępie techniki suszenia rozpyłowego, przy czym suszenie rozpyłowe roztworu polimerowego dla utworzenia mikrocząstek następuje po rozpuszczeniu polimerów zgodnych biologicznie w stosownym rozpuszczalniku, dyspergowaniu środka tworzącego pory do roztworu polimerowego.

Jak określono wcześniej, proces „suszenia rozpyłowego” roztworu polimerowego i środka tworzącego pory odnosi się do procesu, w którym roztwór jest rozpylany dla utworzenia delikatnej mgły suszonej przez bezpośredni kontakt z gorącymi gazami nośnikowymi.

Przy używaniu urządzenia do suszenia rozpyłowego dostępnego w tej dziedzinie techniki, roztwór polimerowy może być dostarczany poprzez otwór wlotowy suszarki rozpyłowej, przechodzi przez rurę w suszarce i następnie jest rozpylany przez otwór wylotowy.

Temperatura może być zmieniana w zależności od zastosowanego gazu i polimeru. Temperatura otworów wlotowego i wylotowego może być sterowana dla wyprodukowania żądanych produktów.

190 452

Rozmiar cząstek stałych roztworu polimerowego jest funkcją dyszy użytej do rozpylania roztworu polimerowego, ciśnienia w dyszy, prędkości przepływu, użytego polimeru, stężenia polimeru, typu rozpuszczalnika i temperatury rozpylania (zarówno temperatury wlotowej jak i wylotowej) i masy cząsteczkowej.

Zasadniczo, im wyższa masa cząsteczkowa, tym większy rozmiar kapsułki, przyjmując, że stężenie jest takie same.

Typowe parametry suszenia rozpyłowego są następujące: stężenie polimeru = 0,005-0,10 g/ml, temperatura wlotowa = 30-200°C, temperatura wylotowa = 20-100°C, prędkość przepływu polimeru = 5-200 ml/min i średnica wewnętrzna dyszy = 0,2-4 mm.

Mogą być otrzymane mikrokulki w zakresie średnicy pomiędzy jednym, a dziesięcioma mikrometrami, z morfologią która zależy od wyboru polimeru, stężenia, masy cząsteczkowej i przepływu rozpylania.

e. metoda wytwarzania mikrokulek hydrożelowych.

Mikrokulki wykonane z polimerów typu żelowego, takich jak polifosfozan lub polimetakrylan metylu, są produkowane przez rozpuszczenie polimeru w roztworze wodnym, zawieszenie środka tworzącego pory w mieszaninie i wytłoczenie przez urządzenie formujące mikrokropelki i wytwarzające mikrokropelki, które spadają do kąpieli utwardzającej, składającej się z roztworu o przeciwnie naładowanych jonach lub polielektrolitowego, która to kąpiel jest wolno mieszana.

Korzyścią tych układów jest zdolność do dalszej modyfikacji powierzchni mikrokulek przez powleczenie ich polimerami polikationowymi, takimi jak polilizyna po wytworzeniu.

Mikrocząstki wytwarzane jako mikrokulki hydrożelowe są co do rozmiarów kontrolowane przez stosowanie wytłaczarek różnej wielkości.

Dodatki dla ułatwienia formowania mikrocząstek stałych

Podczas syntezy mikrocząstek zawierających środki ultradźwiękowego obrazowania dodawane są różnego rodzaju środki powierzchniowo czynne lub emulgatory.

Przykładowe emulgatory lub środki powierzchniowo czynne, które mogą być użyte (0,1-5% wagowo) obejmują większość fizjologicznie dopuszczalnych emulgatorów, na przykład lecytynę z jaja kurzego lub lecytynę sojową, albo lecytyny syntetyczne takie jak nasycone lecytyny syntetyczne, na przykład fosfatydylocholina dwumirystoilowa, fosfatydylocholina dwupalmitoilowa, fosfatydylocholina dwustearoilowa łub nienasycone lecytyny syntetyczne takie jak fosfatydylocholina dwuoleilowa lub fosfatydylocholina linolowa.

Emulgatory także zawierają środki powierzchniowo czynne takie jak wolne kwasy tłuszczowe, estry kwasów tłuszczowych ze związkami polioksyalkilenowymi takimi jak glikol polioksypropylenowy i glikol polioksyetylenowy; etery alkoholi tłuszczowych z glikolami polioksyalkilenowymi; estry kwasów tłuszczowych z sorbitanem polioksyalkilowanym; mydła; stearynian glicerynowo-polialkilenowy; rycynoleinian glicerynowo-polialkilenowy; homo* i kopolimery glikoli polialkilenowych; olej sojowy polietoksylowany i olej rycynowy jak również pochodne uwodornione; etery i estry sacharozy lub inne węglowodany z kwasami tłuszczowymi, alkoholami tłuszczowymi, te są opcjonalnie polioksyalkilowane; mono-, dwui trójglicerydy nasyconych lub nienasyconych kwasów tłuszczowych, glicerydów lub oleju sojowego i sacharozy.

Inne emulgatory zawierają naturalne i syntetyczne formy soli żółciowych lub kwasów żółciowych, zarówno sprzężonych z aminokwasami i niesprzężonych takich jak taurodezoksycholan i kwas cholowy. Może to, na przykład, stabilizować mikropęcherzyki wytworzone przed suszeniem rozpyłowym.

Środki tworzące pory mogą być zawarte w ilości pomiędzy 0,01% a 75% wagi do objętości, dla zwiększenia wydajności tworzenia porów.

Na przykład, przy odparowywaniu rozpuszczalnika, środek tworzący pory taki jak sól lotna, na przykład, wodorowęglan amonowy, octan amonowy, chlorek amonowy lub benzoesan amonowy lub inna sól liofilizowana, jest najpierw rozpuszczany w wodzie.

Roztwór zawierający środek tworzący pory jest następnie emulgowany z roztworem polimerowym dla utworzenia kropelek środka tworzącego pory w polimerze.

Emulsja ta jest następnie suszona rozpyłowo lub przetwarzana do stosownej postaci w procesie odparowywania/ekstrakcji rozpuszczalnika.

190 452

Po wytrąceniu polimeru, utwardzone mikrokulki są zamrażane i liofilizowane dla usunięcia środków tworzących pory.

Rozmiar mikrocząstek

W zalecanym wykonaniu dla przygotowania wstrzykiwalnych kompozycji mikrocząstek zdolnych do przechodzenia przez płucne łoże włoskowate, mikrocząstki powinny mieć średnice pomiędzy w przybliżeniu jednym, a dziesięcioma mikrometrami.

Większe mikrocząstki mogą bowiem zatykać łoże płucne, a mniejsze mikrocząstki mogą nie zapewniać dostatecznej echogeniczności.

Dlatego też większe mikrocząstki są użyteczne dla podawania drogami innymi niż wstrzykiwanie, na przykład doustnie (dla ocenienia drogi żołądkowo-jelitowej), nałożenie na inne powierzchnie śluzówkowe (odbytnicze, pochwowe, ustne, nosowe) lub przez inhalację.

Zalecany rozmiar cząstek do podawania doustnego wynosi około 0,5 (im i 5 mm.

Użyteczne, farmaceutycznie akceptowane nośniki zawierają roztwór soli mieszczący w sobie glicerynę i TWEEN™ 20 i izotoniczny mannit zawierający TWEEN™ 20.

Analiza wielkości cząstek może być wykonywana przykładowo na liczniku Coulte'a przez lekką mikroskopię, skaningową mikroskopię elektronową lub transmitancyjną mikroskopię elektronową.

Ukierunkowanie kompozycji mikrocząstek według wynalazku

Mikrocząstki kompozycji według wynalazku mogą być ukierunkowane specjalnie lub niespecjalnie poprzez dobór polimeru użytego do wytworzenia mikrocząstek, rozmiaru mikrocząstki i/lub włączenie lub przyłączenie ligandu do mikrocząstek.

Przykładowo, do powierzchni mikrocząstki mogą być przyłączone, biologicznie aktywne molekuły lub molekuły wpływające na ładunek, lipofilowość lub hydrofilowość cząstki,

Ponadto molekuły mogą być przyłączone do mikrocząstek, co zminimalizuje adhezję tkanki lub co ułatwia specjalne ukierunkowanie mikrokulek in vivo.

Reprezentatywne molekuły ukierunkowane zawierają przeciwciała, lektyny i inne molekuły, które są specjalnie wiązane przez receptory na powierzchniach komórek poszczególnego typu.

Hamowanie wychwytu przez RES (układ siateczkowo-śródbłonkowy)

Wychwyt i usuwanie mikrocząstek może być także minimalizowane przez dobór polimeru i/lub włączanie albo sprzęganie molekuł, co minimalizuje adhezję lub wychwyt.

Na przykład, adhezja tkanki przez mikrocząstkę może być minimalizowana przez wiązanie kowalencyjne części poli(glikolu alkilenowego) do powierzchni mikrocząstki.

Powierzchniowe części poli(glikolu alkilenowego) mają wysokie powinowactwo do wody, co zmniejsza adsorpcję białka na powierzchni cząstki.

Rozpoznanie i wychwyt mikrocząstki przez układ siateczkowo-śródbłonkowy jest dlatego zmniejszony.

Na przykład, końcowa grupa wodorotlenowa poli(glikolu alkilenowego) może być użyta do kowalentnego przyłączenia biologicznie aktywnych molekuł lub molekuł wpływających na ładunek, lipofilowość lub hydrofilowość cząstki, do powierzchni mikrocząstki.

Do przyłączenia jakiegokolwiek z szerokiego zakresu ligandów do mikrocząstek, dla wzmocnienia ich własności podawania, trwałości lub innych własności mikrocząstek in vivo, mogą być użyte dostępne sposoby techniczne.

Zastosowania diagnostyczne kompozycji mikrocząstek według wynalazku.

Mikrocząstki w kompozycji według wynalazku są typowo łączone z farmaceutycznie akceptowanym nośnikiem takim jak roztwór soli buforowany fosforanem lub roztwór soli lub mannit, następnie ich skuteczna ilość dla ukierunkowanego wykrywania jest podawana pacjentowi przy użyciu stosownej drogi, typowo przez wstrzyknięcie do naczynia krwionośnego lub doustnie.

Mikrocząstki zawierające zakapsulkowany środek ultradźwiękowego obrazowania mogą być użyte w obrazowaniu naczyniowym, jak również w zastosowaniach wykrywania chorób wątroby i nerek, w zastosowaniach kardiologicznych, w wykrywaniu i charakteryzowaniu guzów i tkanek rakowych i w mierzeniu obwodowej prędkości krwi.

Mikrocząstki mogą być także łączone z ligandami, które minimalizują adhezję tkanki lub które ukierunkowują mikrocząstki na specyficzne regiony ciała in vivo jak opisano powyżej.

190 452

Poniższe dwa pierwsze przykłady przedstawiają cząstki wykonane jako wypełnione powietrzem, a w następnych gazem fluorowym. Kolejne przedstawiają diagnostykę z zastosowaniem tak uzyskanych mikrocząstek według wynalazku

Przykład 1:

Przygotowanie mikrokulek PEG-PLGA napełnionych powietrzem dla testów porównawczych w przykładzie 5.

6.0 gramów PEG (glikolu polietylenowego)-PLGA (75:25) (120.000 Da mw) zostało rozpuszczonych w 400 ml chlorku metylenu. 6,7 ml wody zostało dodanych do polimeru i mieszanina polimerowo-wodna była homogenizowana przy 166,66 obr./sek [to jest około 10.000 obr/min] w ciągu 1 minuty przy użyciu homogenizatora Virtis.

Roztwór był pompowany z prędkością przepływu 20 ml/min, przy użyciu pompy perystaltycznej i suszony rozpyłowo przy użyciu suszarki rozpyłowej Bucchi Lab.

Temperatura wlotowa wynosiła 50°C a temperatura wylotowa wynosiła 30°C. Proszek mikrokulkowy był gromadzony i liofilizowany w temperaturze otoczenia przez 48 godzin.

Zakres średnic cząstek 1-10 mikrometrów, gdy wielkość ich ustalano na liczniku Coulter'a z liczbową przeciętną średnią 2,0 mikrometry i objętościową przeciętną średnią 4,5 mikrometrów.

Skaningowa mikroskopia elektronowa ujawniła, że cząstki są zasadniczo kuliste z gładkimi powierzchniami i rzadkimi delikatnymi pokarbowaniami na powierzchni. Transmitancyjna mikroskopia elektronowa ujawniła cząstki będące mieszaniną cząstek stałych takich jak mikrokapsułki i cząstek stałych takich jak gąbki.

Przykład 2:

Przygotowanie mikrokulek PEG-PLGA napełnionych powietrzem.

7,1 gramów PEG-PLGA (75:25) (120.000 Da mw) zostało rozpuszczonych w 320 ml chlorku metylenu. 11 ml octanu amonu 0,74 g/ml zostało dodanych do polimeru i mieszanina octanu amonu z polimerem była homogenizowana przy około 266,66 obr./sek [to jest 16.000 obr/min] w ciągu 1 minuty przy użyciu homogenizatora Virtis.

Roztwór był pompowany z prędkością przepływu 20 ml/min, przy użyciu pompy perystaltycznej i suszony rozpyłowo przy użyciu suszarki rozpyłowej Bucchi Lab.

Temperatura wlotowa wynosiła 32°C, a temperatura wylotowa wynosiła 19°C. Proszek mikrokulkowy był gromadzony i liofilizowany w temperaturze otoczenia przez 48 godzin.

Zakres średnic cząstek 1-10 mikrometrów, gdy wielkość ich ustalano na liczniku Cou ter'a z liczbową przeciętną średnią 1,8 mikrometrów i objętościową przeciętną średnią

5,1 mikrometrów.

Skaningowa mikroskopia elektronowa ujawniła, że cząstki są zasadniczo kuliste z gładkimi powierzchniami i rzadkimi delikatnymi pokarbowaniami na powierzchni.

Przykład 3:

Przygotowanie mikrokulek PEG-PLGA napełnionych oktafluoropropanem.

Mikrokulki przygotowane jak opisano w przykładzie 2 były zdyspergowane w 54 mg mannitu/ml i 0,5% PLURONIC™ F127. Dyspersja była rozdzielona do fiolek 5 ml. Fiołki były zamrożone do temperatury -80°C i liofilizowane przez noc.

Fiolki były napełnione oktafluoropropanem przy ciśnieniu 68,95 kPa [to jest 10 funtów/cal²] i przepłukiwane tym gazem w ciągu trzech minut. Następnie fiolki były przechowywane w temperaturze -20°C w ciągu 24 godzin, a potem przechowywane w temperaturze 4°C aż do zastosowania.

Przykład 4:

Przygotowanie mikrokulek PLGA napełnionych oktafluoropropanem

7,4 gramów PLGA (75:25) (120.000 Da mw) zostało rozpuszczonych w 360 ml chlorku metylenu. 7,3 ml z 0,74 g octanu amonu/ml zostało dodanych do polimeru i roztwór octanu amonu z polimerem był homogenizowany przy 266,66 obr./sek [to jest przy 16.000 obr/min] w ciągu 1 minuty przy użyciu homogenizatora Yirtis.

190 452

Roztwór był pompowany z prędkością przepływu 20 ml/min, przy użyciu pompy perystaltycznej i suszony rozpyłowo przy użyciu suszarki rozpyłowej Bucchi Lab. Temperatura wlotowa wynosiła 32°C, a temperatura wylotowa wynosiła 20°C.

Proszek mikrokulkowy był gromadzony i liofilizowany w temperaturze otoczenia przez 48 godzin. Zakres średnic cząstek 1-10 mikrometrów, gdy wielkość ich ustalano na liczniku Coulter'a z liczbową przeciętną średnią 2,0 mikrometry i objętościową przeciętną średnią

5,2 mikrometrów.

Skaningowa mikroskopia elektronowa ujawniła, że cząstki są zasadniczo kuliste z gładkimi powierzchniami i rzadkimi delikatnymi pokarbowaniami na powierzchni.

Mikrokulki przygotowane w przykładzie 2 były zdyspergowane w 54 mg mannitu/ml i 0,5% PLURONlC™ FI27. Dyspersja była rozdzielona do fiolek 5 ml.

Fiolki były zamrożone do temperatury -80°C i liofilizowane przez noc. Fiolki były napełnione oktafluoropropanem przy ciśnieniu 68,95 kPa [to jest około 10 funt/cal²] i przepłukiwane tym gazem w ciągu trzech minut. Następnie fiolki były przechowywane w temperaturze -20°C w ciągu 24 godzin, a potem przechowywane w temperaturze 4°C aż do zastosowania.

Przykład 5:

Ocena ,n vivo mikrozakapsułkowanego powietrza - przykład porównawczy z zastosowaniem do obrazowania mikrocząstek z przykładu 1 wypełnionych powietrzem.

Samce królików (2-2,5 kg) z Nowej Zelandii nie dostały jeść w ciągu nocy. Zwierzęta były znieczulone ketaminą (100 mg/ml, 0,7 ml) i rompumem (20 mg/ml, 0,5 ml). Dawka była podana dożylnie przez w przybliżeniu 5 sekund poprzez cewnik umieszczony w żyle brzeżnej lewego ucha.

Po podaniu cewnik był przepłukany jednym ml normalnego roztworu solnego. Wszystkie fiolki były zrównoważone do temperatury pokojowej przed przywróceniem do pierwotnej postaci. Forma dawki była przywracana do pierwotnej postaci nie więcej niż 2 minuty przed wstrzyknięciem.

Procedura przywracania pierwotnej postaci składała się z dodawania 1 ml wody do fiolki, pozwalając, by ciśnienie gazu we fiolce zrównoważyło się z ciśnieniem atmosferycznym przez wycofanie tłoka strzykawki na 5 ml strzykawki, wyjęcie igły strzykawki i wirowanie fiolką aż cały liofil rozpuścił się.

Obrazowanie ultradźwiękowe serca było wykonywane klinicznym urządzeniem obrazowym ultradźwiękowym ATL HDI 3000 wyposażonym w przetwornik wysokiej rozdzielczości C7-4.

Natężenie przesyłania było takie, że Tls było 0,3 a MI było 0,8. Częstotliwość ramowa wynosiła 39 Hz, nastawiona głębokość była 9,7 cm, obraz był przetwarzany przez Map6 a zakres dynamiki był 55 dB.

Obrazowanie było wykonywane przed, podczas i po podaniu środków. Serce było obrazowane w trybie B, a nastawy maszyny były regulowane dla uczynienia jam tak bezechowymi jak to możliwe.

Kompletny zestaw obrazów był rejestrowany na taśmie sVHS (domowego urządzenia magnetowidowego), z obrazowaniem kontynuowanym aż żaden dalszy sygnał nie był wykrywany.

Mikrokulki przygotowane w przykładzie 1 (partia 943-110-1) były podawane królikowi (#13) przy dawce 26,2 mg/kg. W ciągu 10 sekund obserwowany był szeroki strumień materiału echogenicznego wpływający do i napełniający prawy przedsionek.

Strumień przechodził do prawego przedsionka i napełniał prawą komorę. Wzrokowo natężenie w tych dwóch jamach okazało się równe.

Żadna echogeniczność nie była zaobserwowana przy przepływie do lewej komory. Wzmocnienie w prawym przedsionku i prawej komorze trwało w przybliżeniu 30 sekund.

Przykład 6:

Ocena in vivo cząstek z mikrozakapsułkowanym perfluorowęglowodorem w postaci mikrocząstek przygotowanych w przykładach 3 i 4.

190 452

Mikrokulki przygotowane w przykładzie 3 (partia # 952-7-3) były podawane królikowi (#18) przy dawce 24 mg/kg. Natężenie w prawej komorze zwiększyło się w następstwie zwiększającego się natężenia w lewej komorze.

Zaobserwowana została doskonała utrata przezroczystości jam. Po 2,5 minutach natężenia jam powróciły do wartości podstawowej.

Mikrokulki przygotowane w przykładzie #4 (partia # 952-49-1) były podawane królikowi (#19) przy dawce 22 mg/kg.

Natężenie w prawej komorze zwiększyło się w następstwie zwiększającego się natężenia w lewej komorze. Zaobserwowana została doskonała utrata przezroczystości jam. Natężenia jam powróciły do wartości podstawowej po 2 minutach.

Przykłady te przedstawiają doskonałą utratę przezroczystości jam.

Podobne badania o przedstawiony powyżej przebiegu zostały przeprowadzone z różnymi gazami fluorowymi, sześciofluorkiem siarki i sześciofluorocyklobutanem.

190 452

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims (26)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób zwiększenia echogeniczności mikrocząstek do ultradźwiękowego obrazowania diagnostycznego, znamienny tym, że mikrocząstki tworzy się najpierw jako porowate polimeryczne mikrocząstki wypełnione powietrzem poprzez wprowadzenie do roztworu syntetycznego biokompatybilnego polimeru w rozpuszczalniku organicznym skutecznej ilości soli lotnej czynnika tworzącego pory, po czym w znany sposób z roztworu usuwa się rozpuszczalnik polimeru i sól lotną, by utworzyć te porowate mikrocząstki, a następnie z utworzonych mikrocząstek poprzez ich pory usuwa się powietrze i zastępuje się je wprowadzając również przez te pory gaz fluorowy w ilości skutkującej zwiększeniem ultradźwiękowego obrazowania po podaniu pacjentowi w odniesieniu do mikrocząstek z wprowadzoną ekwiwalentną objętością powietrza.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako gaz fluorowy wprowadza się perfluorowęglowodór.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako gaz fluorowy wprowadza się gaz wybrany z grupy składającej się z CF4, C2F6, C3F8, C4F8, SF6, C2F4 i C3F6.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako gaz fluorowy wprowadza się oktafluoropropan.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mikrocząstki sąmikrokapsułkami.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mikrocząstki są mikrokulkami mającymi w sobie puste przestrzenie.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mikrocząstki tworzy się z syntetycznego polimeru bioprzyczepnego.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mikrocząstki tworzy się z polimeru syntetycznego wybranego z grupy w skład której wchodzą poli(kwasy wodorotlenowe), polibezwodniki, poliortoestry, poliamidy, poliwęglany, polialkileny, poliglikole alkilenowe, politlenki alkilenowe, politereftalany alkilenowe, polialkohole winylowe, poliwinyloetery, poliestry winylu, polihalogenki winylu, poliwinylopirolidon, polisiloksany, polialkohole winylowe), poli(octan winylu), polistyren, poliuretany i ich kopolimery, celulozy syntetyczne, polikwasy akrylowe, pollikwas masłowy), pollikwas walerianowy), poli(laktydo-ko-kaprolaktan), octan winylowy etylenu, kopolimery i ich mieszanki.
9. 9. Kompozycja do ultradźwiękowego obrazowania diagnostycznego, zawierająca porowate syntetyczne polimerowe mikrocząstki i farmaceutycznie akceptowalny nośnik do podawania tych mikrocząstek pacjentowi, które to mikrocząstki są wypełniane gazem fluorowym, znamienna tym, że mikrocząstki najpierw są tworzone jako porowate mikrocząstki wypełnione powietrzem, przez wprowadzenie do roztworu syntetycznego biokompatybilnego polimeru w rozpuszczalniku organicznym skutecznej ilości soli lotnej środka tworzącego pory, a następnie usunięcie z roztworu w znany sposób rozpuszczalnika polimeru i soli lotnej, po czym następuje usunięcie powietrza poprzez pory z utworzonych porowatych mikrocząstek i zastąpienie powietrza fluorowym gazem wprowadzonym również poprzez te pory w ilości skutkującej zwiększeniem obrazowania ultradźwiękowego po podaniu pacjentowi porównaniu z mikrocząstkami z wprowadzoną do ich wnętrza ekwiwalentną objętością powietrza.
10. 10. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że gaz jest perfluorowęglowodorem.
11. 11. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że mikrocząstka zawiera gaz wybrany z grupy składającej się z CF4, C 2F6, C 3F8, C4F8, SF6, C2F4 i C 3F6.
12. 12. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że gaz jest oktafluoropropanem.
13. 13. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że mikrocząstki sąmikrokapsułkami.

    190 452
14. 14. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że mikrocząstki są mikrokulkami mającymi w sobie puste przestrzenie.
15. 15. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że mikrocząstki są utworzone z bioprzyczepnego polimeru syntetycznego.
16. 16. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że mikrocząstki są utworzone z polimeru syntetycznego wybranego z grupy w skład której wchodzą poli(kwasy wodorotlenowe), polibezwodniki, poliortoestry, poliamidy, poliwęglany, polialkileny, poliglikole alkilenowe, politlenki alkilenowe, politereftalany alkilenowe, polialkohole winylowe, poliwinyloetery, poliestry winylu, polihalogenki winylu, poliwinylopirolidon, polisiloksany, polialkohole winylowe), poli(octan winylu), polistyren, poliuretany i ich kopolimery, celulozy syntetyczne, polikwasy akrylowe, poli(kwas masłowy), poli(kwas walerianowy), poli(laktydo-ko-kaprolaktan), octan winylowy etylenu, kopolimery i ich mieszanki.
17. 17. Sposób wytwarzania mikrocząstek do ultradźwiękowego obrazowania diagnostycznego, znamienny tym, że do roztworu syntetycznego biokompatybilnego polimeru w rozpuszczalniku organicznym wprowadza się skuteczną ilość soli lotnej środka tworzącego pory, a następnie z roztworu w znany sposób usuwa się rozpuszczalnik polimeru i sól lotną, by utworzyć porowate mikrocząstki, a następnie usuwa się powietrze poprzez pory utworzonych mikrocząstek i zastępuje się powietrze gazem fluorowym wprowadzonym poprzez te pory w ilości skutkującej zwiększeniem obrazowania ultradźwiękowego po podaniu pacjentowi w porównaniu z mikrocząstkami z wprowadzoną do ich wnętrza ekwiwalentną objętością powietrza.
18. 18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że mikrocząstki sąmikrokapsulkami.
19. 19. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że mikrocząstki są mikrokulkami mającymi w sobie puste przestrzenie.
20. 20. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że mikrocząstki tworzy się stosując polimer syntetyczny bioprzyczepny.
21. 21. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że mikrocząstki tworzy się stosując polimer syntetyczny wybrany z grupy, w skład której wchodzą polf kwasy wodorotlenowe), polibezwodniki, poliortoestry, poliamidy, poliwęglany, polialkileny, poliglikole alkilenowe, politlenki alkilenowe, politereftalany alkilenowe, polialkohole winylowe, poliwinyloetery, poliestry winylu, polihalogenki winylu, poliwinylopirolidon, polisiloksany, polialkohole winylowe), poli(octan winylu), polistyren, poliuretany i ich kopolimery, celulozy syntetyczne, polikwasy akrylowe, poli(kwas masłowy), poli(kwas walerianowy), poli(laktydo-ko-kaprolaktan), octan winylowy etylenu, kopolimery i ich mieszanki.
22. 22. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że jako sól lotną stosuje się sól wybraną z grupy, w skład której wchodzą wodorowęglan amonowy, octan amonowy, chlorek amonowy, benzoesan amonowy i ich mieszaniny.
23. 23. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że sól lotną wprowadza się do roztworu polimeru w stosunku pomiędzy 0,01% a 75% wagi do objętości.
24. 24. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że sól lotną rozpuszcza się w roztworze wodnym przed jej wprowadzeniem do roztworu polimeru, następnie emulguje się z roztworem polimeru aż do utworzenia się kropelek środka tworzącego pory w polimerze, po czym uzyskaną emulsję suszy się rozpyłowo.
25. 25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że dalej zawiera kolejne kroki po wytrąceniu polimeru przez suszenie rozpyłowe, w których wytrącony polimer zamraża się i liofilizuje w celu usunięcia środków tworzących pory.
26. 26. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, gaz fluorowy wprowadza się do porowatych mikrocząstek stosując próżnię do usunięcia powietrza i przykładając strumień tego fluorowego gazu do mikrocząstek.