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DE69726772T2 - Hautäquivalent, das Langerhans-Zellen enthält - Google Patents

Hautäquivalent, das Langerhans-Zellen enthält Download PDF

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DE69726772T2
DE69726772T2 DE69726772T DE69726772T DE69726772T2 DE 69726772 T2 DE69726772 T2 DE 69726772T2 DE 69726772 T DE69726772 T DE 69726772T DE 69726772 T DE69726772 T DE 69726772T DE 69726772 T2 DE69726772 T2 DE 69726772T2
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induced
keratinocytes
precursors
langerhans cells
cells
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DE69726772T
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Daniel Schmitt
Marcelle Regnier
Marie-Jeanne Staquet
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LOreal SA
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Hautäquivalent, sein Herstellungsverfahren, das Epidermisäquivalent, das in diesem Hautäquivalent enthalten ist, und sein Herstellungsverfahren.
  • Man versucht seit mehreren Jahren Modelle für rekonstruierte Haut zu entwickeln, mit denen die Untersuchungen durchgeführt werden können, die für ein besseres Verständnis der Funktion der Haut sowohl im mechanischen Bereich als auch im physiologischen Bereich erforderlich sind.
  • Es konnten Modelle entwickelt werden, die der menschlichen Haut mehr oder weniger nahe kommen. Es können beispielsweise die Modelle angegeben werden, die in den Patenten oder Patentanmeldungen EP 285 471 , EP 285 474 , EP 418 035 , WO-A-90 02796, WO-A-91 16010, EP 197 090 , EP 207 53 , FR 2 665 175 und FR 2 689 904 beschrieben sind.
  • Ganz allgemein bestehen die in diesen Druckschriften beschriebenen Modelle für rekonstruierte Haut aus menschlichen Keratinocyten, die auf einem Träger, meistens einem Dermisäquivalent, aufgebracht und unter solchen Bedingungen kultiviert werden, dass ein Differenzierungsprogramm abläuft, das zur Bildung eines Epidermisäquivalents führt.
  • Natürliche humane Epidermis besteht jedoch hauptsächlich aus drei Zelltypen, nämlich überwiegend Keratinocyten, Melanocyten und Langerhans-Zellen. Alle diese Zelltypen tragen zu den Funktionen bei, die die wesentliche Rolle der Haut im Organismus ausmachen.
  • Die Langerhans-Zellen sind bei der Immunabwehr der Haut beteiligt. Es ist seit langem bekannt, dass sie bei der Immunabwehr des Wirtsorganismus eine wesentliche Rolle spielen, insbesondere als erste Barriere gegenüber äußeren Angriffen.
  • Die Langerhans-Zellen sind Zellen, die aus dem Knochenmark stammen und durch die Gegenwart von Birbeck-Granula und die Expression des Antigenmarkers CD1a (CD1a-positive Zellen) (Rowden und Kollegen, Nature 268: 247–248, 1977) charakterisiert werden können.
  • Sie spielen beim Einleiten der Immunantwort eine entscheidende Rolle, die gegen die in die Haut eingedrungenen Antigene oder gerade von dieser gebildeten Antigene gerichtet ist.
  • Wenn die Langerhans-Zellen mit einem Allergen in Kontakt kommen, wandern sie zu den Ganglionen, wo sie die spezifischen Reaktionen der T-Zellen auslösen. Hierzu werden sie zu Antigen-präsentierenden Zellen, die wichtig sind, damit die T-Lymphocyten ihre Aufgabe erfüllen können.
  • Die Hauptfunktion der Langerhans-Zellen besteht darin, bei der Immunantwort der Haut gegen eine Vielzahl von Antigenen, einschließlich der Kontaktallergene, Tumorantigene und Mikroorganismen, ein sensitives Signal zu ergeben.
  • Daraus kann abgeleitet werden, dass diese Zellen wahrscheinlich bei einer Vielzahl von Erkrankungen der Haut beteiligt sind.
  • In der Druckschrift WO-A-90 02796 wird vorgeschlagen, in einem dreidimensionalen Hautkultursystem zu Kulturen von Keratinocyten und Melanocyten Langerhans-Zellen zu geben, die aus Biopsien frischer Haut isoliert wurden. In dieser Druckschrift wird ausgeführt, dass das Wachstum dieser Zellen in Kultur schwierig ist. Es hat sich nämlich herausgestellt, dass die aus Hautproben in gereinigter Form erhaltenen Langerhans-Zellen Zellen sind, die von Vorläufern stammen, die sich in ihrem Differenzierungszyklus zu CD1a-positiven Zellen entwickelt haben, und dass diese isolierten Zellen in ihrem Differenzierungszyklus nicht weiter fortschreiten.
  • Da diese Zellen nicht befähigt sind, sich zu vermehren, besteht ihre in-vitro-Kultur darin, sie am Überleben zu halten. Diese Zellen kommen nämlich zum Stillstand und sterben ab, ohne dass sie ihre Aufgabe erfüllt haben. Dies trifft auch zu, wenn sie in ein rekonstruiertes Hautmodell eingebracht werden. Auch wenn in dieser Druckschrift also vorgeschlagen wird, Langerhans-Zellen einzubringen, kann die erhaltene rekonstruierte Haut nicht zufrieden stellend sein, solange die Langerhans-Zellen nicht überleben.
  • Die Melanocyten sind auf die Basalschicht der Epidermis begrenzt. Hier findet die Melanogenese statt; wegen des engen Kontakts mit den Keratinocyten übertragen die Melanocyten auf diese das neosynthetisierte Melanin in Form von Melanosomen, wodurch die Haut ihre Farbe erhält. Der Typ und die Menge des in den Melanosomen enthaltenen Melanins sind bestimmend für die Farbe der Haut. Das Melanin bildet außerdem vor allem eine wirksame Abschirmung für den Schutz gegen Sonnenlicht und insbesondere UV-Strahlung. Ein Modell für rekonstruierte Haut, in das Melanocyten eingebracht wurden, ist in der Patentanmeldung WO-A-9351165 beschrieben worden.
  • Daraus ist ersichtlich, dass mit den im Stand der Technik beschriebenen Modellen für rekonstruierte Haut nur unvollständige Untersuchungen zur Rolle und/oder zu den Reaktionen der Haut möglich sind. Das Fehlen von Langerhans-Zellen in diesen Modellen, d. h. den für die Immunabwehr der Haut wesentlichen Zellen, macht diese Modelle nämlich für immunologische in-vitro-Untersuchungen unbrauchbar. Außerdem ist anzunehmen, dass die mit diesen Modellen durchgeführten pharmakologischen und/oder toxikologischen Studien nur einen Teil der wirklichen Wechselwirkungen widerspiegeln können, da diese wesentliche Komponente der Haut fehlt, nämlich die Langerhans-Zellen.
  • Abgesehen von den natürlichen Phänomenen, die zu den mit so genannter empfindlicher und/oder allergischer Haut verbundenen Symptomen führen, Phänomene, die mit einem solchen Modell besser abgeschätzt werden könnten, werden in der Industrie allgemein und in der Kosmetikindustrie im Besonderen immer öfter neue Verbindungen in verschiedene Zusammensetzungen eingearbeitet. Eines der Hauptprobleme, mit dem die Industrie somit konfrontiert ist, ist die Ermittlung von schädlichen Wirkungen, die diese Verbindungen im Kontakt mit der Haut insbesondere hinsichtlich der Kontaktsensibilisierung mit sich bringen könnten.
  • Aus ethischen Gründen sollten diese Untersuchungen natürlich weder am Menschen noch an Tieren durchgeführt werden.
  • Es ist somit klar, warum ein in-vitro-Modell, mit dem durch Verstehen der Abwehrmechanismen der Haut ein besseres Verständnis für die Symptome, die mit so genannter empfindlicher und/oder allergischer Haut zusammenhängen, und eine Ermittlung der schädlichen Wirkungen von möglicherweise in der Industrie verwendbaren Verbindungen möglich ist, so interessant ist.
  • Die Anmelderin, die sich seit vielen Jahren für das Gebiet der rekonstruierten Haut interessiert, hat nun festgestellt, dass es möglich ist, zumindest Vorläufer von Langerhans-Zellen, die vorab induziert oder nicht induziert wurden, in ein Modell für rekonstruierte Haut einzubringen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein rekonstruiertes Hautmodell, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es ein Epidermisäquivalent auf einem Träger umfasst, wobei das Epidermisäquivalent zumindest Keratinocyten und zumindest induzierte oder nicht induzierte Vorläufer von Langerhans-Zellen enthält.
  • Der Ausdruck "induzierte Vorläufer von Langerhans-Zellen" deckt im vorliegenden Text beliebige normale oder pathologische Zellen, die, bevor sie kokultiviert werden, mindestens einer Behandlung ausgesetzt waren, die dazu dient, ihnen die typischen Merkmale einer Langerhans-Zelle zu geben, d. h. eine CD1a-positive Zelle, ohne zu beurteilen, ob diese Zelle zu einer CD1a-positiven Zelle geworden ist oder nicht.
  • In normaler Haut sind die Langerhans-Zellen in der Epidermis suprabasal lokalisiert.
  • Das erfindungsgemäße rekonstruierte Hautmodell weist vorzugsweise zumindest induzierte oder nicht induzierte Vorläufer von Langerhans-Zellen auf, die in dem Epidermisäquivalent suprabasal lokalisiert sind.
  • Das erfindungsgemäße Hautäquivalent kann natürlich alle anderen Zelltypen enthalten, die in das Hautäquivalent eingebracht werden können.
  • Die Anmelderin konnte erfolgreich ein Verfahren zur Herstellung eines Hautäquivalents entwickeln, das ein Epidermisäquivalent auf einem Träger umfasst, wobei das Epidermisäquivalent zumindest Keratinocyten und zumindest induzierte oder nicht induzierte Vorläufer von Langerhans-Zellen enthält.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines oben beschriebenen Hautäquivalents, das dadurch gekennzeichnet ist, dass auf dem Träger Keratinocyten und zumindest induzierte oder nicht induzierte Vorläufer von Langerhans-Zellen kokultiviert werden.
  • Um das Verständnis zu erleichtern wird der Ausdruck "Kokultur" (oder ähnliche Ausdrücke) so verwendet, dass er sich auf Zellkulturen bezieht, die zur Bildung der rekonstruierten Haut auf dem Träger durchgeführt werden, ohne dass dies zwingend die Gegenwart mehr als einer Zellspezies erfordert. Die Ausdrücke "Kultur" und "kultiviert" sind dann so zu verstehen, dass die Zellen herkömmlich beispielsweise in üblichen Schalen für Zellkulturen kultiviert werden.
  • Bei dem erfindungsgemäß verwendeten Träger kann es sich um einen beliebigen, im Stand der Technik beschriebenen Träger handeln. Als Beispiele können die gemischten Kollagen/Fibroblasten-Gitter, vorab von der Epidermis befreite Dermis, künstliche Membranen, wie beispielsweise Filter der Marke Millipor, Unterhautsubstitute auf der Basis von Kollagen, Kunststoff oder beliebige weitere, mit der Lebensfähigkeit der Zellen kompatible Träger angegeben werden.
  • Bevorzugt besteht der Träger aus einer zuvor von der Epidermis befreiten Dermis.
  • Unabhängig von dem gewählten Träger kann die Vorgehensweise bei seiner erfindungsgemäßen Verwendung eine beliebige im Stand der Technik beschriebene Vorgehensweise sein.
  • Wenn der Träger aus einer zuvor von der Epidermis befreiten Dermis besteht, werden erfindungsgemäß bevorzugt die Anweisungen von Prunieras und Mitarbeitern, Ann. Chir. Plast., 1979, 24, Nr. 4, 357–362 befolgt.
  • Zur Herstellung des Epidermisäquivalents, das zumindest Keratinocyten und zumindest induzierte oder nicht induzierte Vorläufer von Langerhans-Zellen enthält, werden erfindungsgemäß auf dem Träger zumindest Keratinocyten und zumindest induzierte oder nicht induzierte Vorläufer von Langerhans-Zellen kokultiviert.
  • Die erfindungsgemäß verwendeten Keratinocyten können nach beliebigen, im Stand der Technik bekannten Verfahren präpariert werden. Es sind beispielsweise die Kultur ausgehend von dissoziierter Epidermis, die von Biopsien von normaler oder pathologischer Haut stammt, oder die Kultur von Keratinocyten aus der Hülle von normalen oder pathologischen Haarfollikeln zu nennen.
  • Erfindungsgemäß werden die verwendeten Keratinocyten ausgehend von dissoziierter Epidermis aus Biopsien von normaler oder pathologischer Haut nach dem Verfahren von Régnier und Mitarbeitern, Frontiert of Matrix Biology, Band 9, 4–35 (Karger, Basel 1981) präpariert.
  • Die Vorläufer von Langerhans-Zellen können beliebige Zellstämme sein, die befähigt sind, sich bei Induktion in Langerhans-Zellen zu differenzieren, d. h., die befähigt sind, sich zu CD1a-positiven Zellen zu differenzieren. Bei diesen Vorläufern kann es sich vorteilhaft um hämatopoetische CD34+-Zellen handeln (Caux und Mitarbeiter, Nature, Band 360, November 1992, 258).
  • Die Vorläufer von Langerhans-Zellen können aus Gewebe in gereinigter Form gewonnen werden, in dem sie natürlicherweise vorhanden sind, wobei von diesen das Knochenmark, peripheres Blut und Nabelschnurblut genannt werden kann.
  • Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden bevorzugt Vorläufer von Langerhans-Zellen verwendet, die aus peripherem Blut oder Nabelschnurblut präpariert wurden, und noch bevorzugter Vorläufer, die aus Nabelschnurblut erhalten wurden.
  • Hierzu können beliebige Reinigungsverfahren angewandt werden. Es ist beispielsweise das Reinigungsverfahren zu nennen, das von Caux und Mitarbeitern, Nature, Band 360, November 1992, 258 beschrieben wurde.
  • Die Induktion der Differenzierung der Vorläufer von Langerhans-Zellen kann erfindungsgemäß vor ihrer Kokultur erfolgen oder nachdem die Kokultur begonnen wurde.
  • Die Induktion kann natürlich nach beliebigen bekannten Verfahren erfolgen. Von diesen Verfahren ist beispielsweise die Differenzierung zu nennen, die von Cytokinen induziert wird, wie beispielsweise dem Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-Stimulierenden-Faktor (Granulocyte/Macrophage – Colony Stimulating Factor oder GM-CSF), dem Tumornekrosefaktor (Tumor Necrosis Factor oder TNF-α), dem Stammzellfaktor (Stem Cell Factor oder SCF), Interleukin 3 oder Interleukin 4 oder einem ihrer Gemische.
  • Die Anmelderin hat jedoch überraschend festgestellt, dass die Differenzierung von Vorläufern von Langerhans-Zellen spontan durch die Gegenwart von Keratinocyten oder auch durch eine Kultur dieser Vorläufer in einem Medium, in dem zuvor Keratinocyten kultiviert wurden, induziert werden kann.
  • Die Induktion in Gegenwart von Keratinocyten kann daher entweder durch eine gleichzeitige Kultur von Vorläufern von Langerhans-Zellen und Keratinocyten, wobei die Induktion dann in der Kultur zustande kommt, oder durch Kokultur von Vorläufern von Langerhans-Zellen und Keratinocyten auf einem Träger, beispielsweise einer von der Epidermis befreiten Dermis, erfolgen, wobei die Induktion in diesem Fall bei der Kokultur abläuft.
  • Die Differenzierung der Vorläufer von Langerhans-Zellen wird erfindungsgemäß vorzugsweise durch die Gegenwart von Keratinocyten und noch bevorzugter durch Kokultur von Vorläufern von Langerhans-Zellen und Keratinocyten auf einem Träger induziert.
  • Die Induktion der Differenzierung von Vorläufern von Langerhans-Zellen kann vorteilhaft durch die Kombination von mindestens zwei dieser Methoden erfolgen, beispielsweise der Kultur in Gegenwart von Keratinocyten und in Gegenwart mindestens eines Cytokins oder auch die Kultur in Gegenwart eines Gemisches von Cytokinen, wie beispielsweise der Kombination von GM-CSF und TNF-α.
  • Die Cytokin-Konzentration, die für die Induktion verwendet wird, hängt natürlich von der Art des verwendeten Cytokins ab.
  • Die Cytokine liegen in der Regel in Konzentrationen im Bereich von 1 bis 400 ng/ml und vorzugsweise 2,5 bis 300 ng/ml vor.
  • Im Falle des GM-CSF kann die Konzentration beispielsweise im Bereich von 100 bis 400 ng/ml und vorzugsweise 200 bis 300 ng/ml liegen. Für das TNF-α kann die Konzentration im Bereich von 1 bis 7,5 ng/ml und vorzugsweise 2,5 bis 5 ng/ml liegen.
  • Falls ein Gemisch von Cytokinen verwendet wird, ist das Verhältnis der Cytokine von der Art der verwendeten Cytokine abhängig. Im Falle eines Gemisches GM-CSF/TNF-α liegen die Anteile beispielsweise im Bereich der Gewichtsverhältnisse 400/1 bis 13/1 und vorzugsweise 120/1 bis 40/1.
  • Es ist möglich, das Präparat für die Kokultur mit zu CD1a-positiven Zellen induzierten Vorläufern anzureichern. Hierzu werden in den Kulturen die zu CD1a-positiven Zellen induzierten Vorläufer abgetrennt.
  • Das Verhältnis der Anzahl der Keratinocyten und der induzierten oder nicht induzierten Vorläufer von Langerhans-Zellen, die auf dem Träger kokultiviert werden, liegt erfindungsgemäß im Bereich von 95/5 bis 25/75, ausgedrückt als prozentualer Anteil der Anzahl der Zellen insgesamt in der Kokultur, und vorzugsweise im Bereich von 75/25 bis 35/65; noch bevorzugter ist dieses Verhältnis 50/50.
  • Die induzierten oder nicht induzierten Vorläufer von Langerhans-Zellen werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in beliebigen Stadien der Herstellung des Epidermisäquivalents kokultiviert.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst vorteilhaft einen Schritt, in dem die induzierten oder nicht induzierten Vorläufer von Langerhans-Zellen mit den Keratinocyten zu einem Zeitpunkt kokultiviert werden, der zu einer suprabasalen Lokalisierung in dem Epidermisäquivalent führt.
  • Die induzierten oder nicht induzierten Vorläufer von Langerhans-Zellen werden vorzugsweise zu einem Zeitpunkt kokultiviert, der zwischen dem Moment, bei dem sich die suprabasale Schicht des Epidermisäquivalents zu bilden beginnt, und dem Moment, zu dem die differenzierten Keratinocyten beginnen, die erste Schicht des Stratum corneum zu bilden, ausgewählt ist.
  • Noch bevorzugter werden die induzierten oder nicht induzierten Vorläufer von Langerhans-Zellen zu einem Zeitpunkt kokultiviert, der im Bereich des Moments, bei dem sich die suprabasale Schicht des Epidermisäquivalents zu bilden beginnt, und dem zweiten Tag der Inkubation nach Überführen an die Grenzfläche Luft/Flüssigkeit (siehe nachstehend) ausgewählt ist.
  • Das für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete Nährmedium kann ein beliebiges Nährmedium sein, das dafür bekannt ist, dass es die Proliferation und Differenzierung von Keratinocyten ermöglicht. Es können beispielsweise Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium oder ein definiertes Medium mit variablem Calciumgehalt, beispielsweise das von S. T. Boyce und R. G. Ham beschriebene Medium (J. Tissue Cult. Meth., 1985, 9, 83–93), angegeben werden.
  • Es ist erfindungsgemäß vorteilhaft möglich, ein Gemisch von mehreren Nährmedien zu verwenden, beispielsweise das Gemisch Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium/HAM's F12 Medium oder Rheinwald-Green-Medium (Cell, 1975, 6, 331–334).
  • Gemäß der Vorgehensweise bei der Herstellung des Hautäquivalents wird die Kokultur zunächst während einer Inkubationszeit von 3 bis 8 Tagen in ein Nährmedium eingetaucht. Dieses Nährmedium kann beispielsweise das von Rheinwald und Green beschriebene Medium sein, ein Medium, das die Proliferation von Keratinocyten erlaubt.
  • Nach dieser Inkubationszeit wird die Kokultur an die Grenzfläche Luft/Flüssigkeit überführt, beispielsweise, indem sie auf ein Metallgitter gebracht wird. Die Flüssigkeit besteht vorzugsweise aus dem gleichen Nährmedium wie zuvor, mit dem Unterschied, dass nur 3 der ursprünglich in dem Rheinwald-Green-Medium enthaltenen Wachstumsfaktoren in den gleichen Konzentrationen enthalten sind, nämlich der epidermale Wachstumsfaktor (Epidermis Growth Factor, EGF), Insulin und Hydrocortison.
  • Es wird dann weiter inkubiert, bis ein Hautäquivalent erhalten wird, das die Eigenschaften von Haut aufweist, d. h. ein Dermisäquivalent, das ein Epidermisäquivalent trägt, das die herkömmlichen Zellschichten aufweist, nämlich die Basalschicht, die suprabasale Schicht, die Kornzellschicht und die Hornschicht.
  • Es wird daher während einer Zeitdauer von 5 bis 30 Tagen weiter inkubiert.
  • Das auf diese Weise realisierte rekonstruierte Hautmodell besteht aus zwei Einheiten, dem Träger und dem Epidermisäquivalent, wobei es möglich ist, die beiden voneinander zu trennen.
  • Das Epidermisäquivalent kann also getrennt von dem Träger verwendet werden.
  • Die Erfindung betrifft daher auch ein Epidermisäquivalent, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es zumindest Keratinocyten und zumindest induzierte oder nicht induzierte Vorläufer von Langerhans-Zellen enthält, und sein Herstellungsverfahren, wie das oben beschriebene Verfahren.
  • Das erfindungsgemäße Epidermisäquivalent enthält vorzugsweise zumindest induzierte oder nicht induzierte Vorläufer von Langerhans-Zellen, die in der suprabasalen Schicht lokalisiert sind.
  • Das Hautäquivalent, das die größte Ähnlichkeit zu normaler Haut besitzt, ist natürlich ein Hautäquivalent, das die drei wesentlichen Zelltypen enthält, die in normaler Haut vorliegen.
  • Das erfindungsgemäße Modell für rekonstruierte Haut enthält daher vorteilhaft auch Melanocyten.
  • Die Erfindung betrifft vorteilhaft ein Hautäquivalent, das Keratinocyten, zumindest induzierte oder nicht induzierte Vorläufer von Langerhans-Zellen und Melanocyten enthält.
  • Die erfindungsgemäß verwendeten Melanocyten können ausgehend von beliebigen Organen, in denen sie enthalten sind, in gereinigter Form erhalten werden, beispielsweise normaler Haut oder Haarfollikeln.
  • Vorzugsweise werden gereinigte Melanocyten verwendet, die ausgehend von normaler Haut gewonnen wurden.
  • Für die Präparation der Melanocyten können beliebige Reinigungsverfahren durchgeführt werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Es kann beispielsweise das Verfahren angegeben werden, das von Olsson und Mitarbeitern in Acta Derm. Venereol., 1994, 74, 226–268 beschrieben wurde.
  • Um ein Hautäquivalent zu enthalten, das die drei Zelltypen enthält, die in der normalen Haut enthalten sind, ist die Kokultur von Keratinocyten, induzierten oder nicht induzierten Vorläufern von Langerhans-Zellen und Melanocyten auf einem Träger erforderlich.
  • Nach einer weiteren speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dieses daher dadurch gekennzeichnet, dass auf einem Träger Keratinocyten, zumindest induzierte oder nicht induzierte Vorläufer von Langerhans-Zellen und Melanocyten kokultiviert werden.
  • Im Falle eines Hautäquivalents mit den drei Zelltypen unterscheidet sich das für seine Herstellung durchgeführte Verfahren in keiner Weise von dem Verfahren, das oben für die Herstellung eines Hautäquivalents mit zwei Zelltypen beschrieben wurde.
  • Das Verhältnis des Gemisches (Keratinocyten + Melanocyten) und der Langerhans-Zellen und/oder der Vorläufer, die auf dem Träger kokultiviert werden, liegt beispielsweise im Bereich von 95/5 bis 25/75 (prozentualer Anteil der Gesamtzahl der Zellen in der Kokul tur) und vorzugsweise im Bereich von 75/25 bis 35/65, wobei dieser Verhältnis noch bevorzugter 50/50 ist.
  • Das spezielle Verhältnis zwischen Keratinocyten und Melanocyten kann das im Stand der Technik beschriebene Verhältnis sein (WO-A-9351165).
  • Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne dass sie einschränkend zu verstehen sind.
  • Beispiel für die Herstellung eines Epidermisäquivalents, das Keratinocyten, Langerhans-Zellen und Melanocyten enthält
  • Es wird in einem Anteil von 10 zu 1 ein Gemisch von normalen humanen Keratinocyten, die zuvor nach dem von Régnier und Mitarbeitern (Frontier of Matrix Biology, Band 9, 4–35, Karger, Basel 1981) isoliert wurden, und humanen Melanocyten gebildet, die zuvor nach dem von Olsson und Mitarbeitern (Acta Derm. Venereol., 1994, 74, 226–268) beschriebenen Verfahren isoliert wurden. Dieses Gemisch wird nach dem von Prunieras und Mitarbeitern, Ann. Chir. Plast., 1979, 24, Nr. 4, 357–362 beschriebenen Verfahren in einer Menge von 5 × 105 Zellen pro cm2 auf eine von der Epidermis befreite Dermis aufgebracht. Die Kultur erfolgt in einem Medium, das aus einem Gemisch von Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium und HAM's F12-Medium in einer Menge von 3 auf 1 besteht und 10% fetales Kälberserum, 10 ng/ml epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), 400 ng/ml Hydrocortison, 10–6 M Isoproterenol, 5 μg/ml Transferrin, 2 × 10–9 M Triiodthyronin, 1,8 × 10–4 M Adenin und 5 μg/ml Insulin (Rheinwald und Green, Cell, 1975, 6, 331–334) enthält. Die Kultur bleibt 6 Tage in dem Medium eingetaucht. Dann wird die Kultur an die Grenzfläche Luft/Flüssigkeit gebracht, wobei die Flüssigkeit aus dem gleichen Medium wie zuvor besteht, jedoch ohne Isoproterenol, Transferrin, Triiodthyronin und Adenin.
  • Parallel werden aus Nabelschnurblut CD34+-Zellen isoliert und nach dem von Caux und Kollegen (Nature, Band 360, 19. November 1992, Seiten 258–260) beschriebenen Verfahren 6 Tage in Gegenwart des Kolonie-Stimulierenden-Faktors (Granulocyte/Macrophage – Colony Stimulating Factor oder GM-CSF) in einer Konzentration von 200 ng/ml und des Tumornekrosefaktors (Tumor Necrosis Factor oder TNF-α) in einer Konzentration von 2,5 ng/ml kultiviert.
  • 2 Tage nachdem das Keratinocyten/Melanocyten-Gemisch an die Grenzfläche Luft/Flüssigkeit gebracht wurde, werden auf die Epidermis in Rekonstruktion 5 × 105 zuvor erhaltene CD34+-Zellen aufgebracht. Man kultiviert weiter, bis ein histologisch zufrieden stellendes Epidermisäquivalent erhalten wird, d. h. ein Epidermisäquivalent, das die herkömmlichen Zellschichten aufweist, nämlich die Basalschicht, die suprabasale Schicht, die Körnerzellschicht und die Hornschicht.
  • Herstellung eines Hautäquivalents, das Keratinocyten und Langerhans-Zellen enthält, ohne Präinduktion der Vorläufer von Langerhans-Zellen
  • Es wird ein Gemisch von normalen humanen Keratinocyten, die zuvor nach dem von Régnier und Kollegen (Frontier of Matrix Biology, Band 9, 4–35, Karger, Basel 1981) beschriebenen Verfahren isoliert wurden, und CD34+-Zellen, die nach dem von Caux und Kollegen (Nature, Band 360, 19. November 1992, Seiten 258–260) beschriebenen Verfahren aus Nabelschnurblut isoliert wurden, in einer Menge von 1 : 1 gebildet. Das Gemisch wird in einer Menge von 5 × 105 Zellen jedes Zelltyps pro cm2 nach dem von Prunieras und Kollegen beschriebenen Verfahren (Ann. Chir. Plast. 1979, 24, Nr. 4, 357–362) auf eine von der Epidermis befreite Dermis aufgebracht. Die Kokultur erfolgt in einem Medium, das aus einem Gemisch aus Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium und HAM's F12-Medium in einem Volumenverhältnis von 3 : 1 besteht und 10% fetales Kälberserum, 10 ng/ml epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), 400 ng/ml Hydrocortison, 10–6 M Isoproterenol, 5 μg/ml Transferrin, 2 × 10–9 M Triiodthyronin, 1,8 × 10–4 M Adenin und 5 μg/ml Insulin enthält (Rheinwald und Green, Cell, 1975, 6, 331–334). Die Kultur bleibt 6 Tage untergetaucht. Dann wird die Kultur an die Grenzfläche Luft/Flüssigkeit gebracht, wobei die Flüssigkeit nun aus dem Medium wie oben besteht, jedoch ohne Isoproterenol, Transferrin, Triiodthyronin und Adenin.
  • Es wird weiter kokultiviert, bis ein histologisch zufrieden stellendes Epidermisäquivalent erhalten wird, d. h. ein Epidermisäquivalent, das die herkömmlichen Zellschichten aufweist, nämlich die Basalschicht, die suprabasale Schicht, die Körnerzellschicht und die Hornschicht.

Claims (28)

  1. Hautäquivalent, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Epidermisäquivalent auf einem Träger enthält, wobei das Epidermisäquivalent zumindest Keratinocyten und zumindest induzierte oder nicht induzierte Vorläufer von Langerhans-Zellen enthält und wobei die Vorläufer von Langerhans-Zellen hämatopoetische CD34+-Zellen sind.
  2. Hautäquivalent nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger unter den gemischten Kollagen/Fibroblasten-Gittern, zuvor von der Epidermis befreiter Dermis, künstlichen Membranen, wie beispielsweise Filtern der Marke Millipor, Unterhautsubstituten auf Kollagenbasis, Kunststoff oder beliebigen weitern, mit der Lebensfähigkeit der Zellen verträglichen Trägern ausgewählt ist.
  3. Hautäquivalent nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger aus einer zuvor von der Epidermis befreiten Dermis besteht.
  4. Hautäquivalent nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner Melanocyten enthält.
  5. Hautäquivalent nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die induzierten oder nicht induzierten Vor läufer von Langerhans-Zellen in dem Epidermisäquivalent suprabasal lokalisiert sind.
  6. Verfahren zur Herstellung eines Hautäquivalents, dadurch gekennzeichnet, dass auf einem Träger Keratinocyten und zumindest induzierte oder nicht induzierte Vorläufer von Langerhans-Zellen kokultiviert werden, wobei die Vorläufer von Langerhans-Zellen hämatopoetische CD34+-Zellen sind.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis der Anzahl der Keratinocyten und der induzierten oder nicht induzierten Vorläufer von Langerhans-Zellen, die auf dem Träger kokultiviert werden, im Bereich von 95/5 bis 25/75, ausgedrückt als prozentualer Anteil der Gesamtzahl der Zellen in der Kokultur, und vorzugsweise im Bereich von 75/25 bis 35/65 liegt, wobei das Verhältnis noch bevorzugter 50/50 beträgt.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Keratinocyten durch Kultur ausgehend von dissoziierter Epidermis, die aus Biopsien von normaler oder pathologischer Haut stammt, oder durch Kultur von Keratinocyten aus der Hülle von normalen oder pathologischen Haarfollikeln erhalten werden.
  9. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Keratinocyten aus Entnahmen normaler oder pathologischer Haut erhalten werden.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorläufer von Langerhans-Zellen ausgehend von Knochenmark, peripherem Blut oder Nabelschnurblut in gereinigter Form erhalten werden.
  11. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die gereinigten Vorläufer von Langerhans-Zellen aus Nabelschnurblut erhalten werden.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Differenzierung der Vorläufer von Langerhans-Zellen induziert wird, bevor sie kokultiviert werden oder nachdem die Kokultur begonnen wurde.
  13. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Differenzierung der Vorläufer von Langerhans-Zellen induziert wird, nachdem ihre Kokultur begonnen wurde.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Differenzierung der Vorläufer von Langerhans-Zellen nach einem Verfahren induziert wird, das unter der Kultur in Gegenwart von Keratinocyten, der Kultur in einem Medium, in dem zuvor Keratinocyten kultiviert wurden, und der Kultur in Gegenwart eines Cytokins ausgewählt ist, welches unter dem Kolonie-Stimulierenden-Faktor, dem Tumornekrosefaktor, dem Stammstellenfaktor, Interleukin 3 oder Interleukin 4 ausgewählt ist.
  15. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Differenzierung durch die Kombination von mindestens zwei Verfahren induziert wird, die unter der Kultur in Gegenwart von Keratinocyten, der Kultur in einem Medium, in dem zuvor Keratinocyten kultiviert wurden, und der Kultur in Gegenwart eines Cytokins ausgewählt sind, welches unter dem Kolonie-Stimulierenden-Faktor, dem Tumornekrosefaktor, dem Stammzellenfaktor, Interleukin 3 oder Interleukin 4 ausgewählt ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Differenzierung durch die Kultur in Gegenwart von Keratinocyten und in Gegenwart mindestens eines Cytokins oder durch die Kultur in Gegenwart eines Gemisches von Cytokinen, wie beispielsweise der Kombination von GM-CSF und TNF-α, induziert wird.
  17. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Differenzierung durch ein Gemisch von GM-CSF und TNF-α induziert wird.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Cytokine in Konzentrationen von 1 bis 400 ng/ml und vorzugsweise 2,5 bis 300 ng/ml vorliegen.
  19. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des GM-CSF im Bereich von 100 bis 400 ng/ml und vorzugsweise 200 bis 300 ng/ml liegt.
  20. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des TNF-α im Bereich von 1 bis 7,5 ng/ml und vorzugsweise 2,5 bis 5 ng/ml liegt.
  21. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass im Falle des Gemisches GM-CSF/TNF-α das Verhältnis der Cytokine im Bereich der Gewichtsverhältnisse 400/1 bis 13/1 und vorzugsweise 120/1 bis 40/1 liegt.
  22. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die induzierten oder nicht induzierten Vorläufer von Langerhans-Zellen mit den Keratinocyten zu einem Zeitpunkt kokultiviert werden, der ihre Lokalisierung in dem suprabasalen Bereich des Epidermisäquivalents ermöglicht.
  23. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die induzierten oder nicht induzierten Vorläufer von Langerhans-Zellen zu einem Zeitpunkt kultiviert werden, der im Bereich des Zeitpunkts, bei dem sich die suprabasale Schicht des Epidermisäquivalents zu bilden beginnt, und des Zeitpunkts, bei dem die differenzierten Keratinocyten die erste Schicht des Stratum corneum zu bilden beginnen, ausgewählt ist.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die induzierten oder nicht induzierten Vorläufer von Langerhans-Zellen zu einem Zeitpunkt kokultiviert werden, der im Bereich des Zeitpunkts, bei dem sich die suprabasale Schicht des Epidermisäquivalents zu bilden beginnt, und dem zweiten Tag der Kultur nach dem Überführen an die Grenzfläche Luft/Flüssigkeit ausgewählt ist.
  25. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass außerdem Melanocyten kokultiviert werden.
  26. Epidermisäquivalent, dadurch gekennzeichnet, dass es zumindest Keratinocyten und induzierte oder nicht induzierte Vorläufer von Langerhans-Zellen enthält, wobei die Vorläufer von Langerhans-Zellen hämatopoetische CD34+-Zellen sind.
  27. Epidermisäquivalent nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass es außerdem Melanocyten enthält.
  28. Epidermisäquivalent nach einem der Ansprüche 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, dass die induzierten oder nicht induzierten Vorläufer von Langerhans-Zellen suprabasal lokalisiert sind.
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