DE69722159T2

DE69722159T2 - Verfahren zur Reduzierung von Inhibitoren der Nukleinsäure-Hybridisierung

Info

Publication number: DE69722159T2
Application number: DE69722159T
Authority: DE
Inventors: Matthew P. Collis; Michael C. Little; Oscar J. Llorin
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1996-12-30
Filing date: 1997-12-24
Publication date: 2003-11-27
Anticipated expiration: 2017-12-25
Also published as: ES2197294T3; EP0851032B1; EP0851032A1; CA2220270C; JPH10191978A; CA2220270A1; MX9709074A; BR9706374A; AU728014B2; JP4271273B2; US5763185A; DE69722159D1; AU4931497A

Description

Das Gebiet der vorliegenden Erfindung betrifft allgemein Nucleinsäurehybridisierung. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Reduzierung von Substanzen in Proben, welche Vorgänge der Nucleinsäurehybridisierung hemmen. Solche Vorgänge beinhalten Nucleinsäuresonden-Hybridisierung zur Feststellung der Anwesenheit und/oder Menge an Zielnucleinsäure und Nucleinsäureprimer-Hybridisierung zur Initiierung eines Nucleinsäure- Amplifikationsprozesses.
Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren wie Strangverdrängungsamplifikation (SDA), Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Ligase-Kettenreaktion (LCR), nucleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA), transkriptionsvermittelte Amplifikation (TMA) und andere werden dazu verwendet, multiple Kopien von (einer) speziellen Nucleinsäuresequenz(en) von Interesse (Zielsequenz) zu erzeugen, die in einer Probe in einer geringeren Kopienzahl vorhanden ist. Einige in solchen Proben häufig zu findende Substanzen bewirken jedoch eine Inhibition von Nucleinsäure-Amplifikationsprozessen aufgrund der Inhibition der Hybridisierung von Primern zur Initiierung des Amplifikationsprozesses. In gleicher Weise hemmen solche Substanzen direkte Nucleinsäuresonden-Hybridisierungsreaktionen, die zur Detektion umamplifizierter Zielnucleinsäuren verwendet werden.
Ein Beispiel für solche die Nucleinsäurehybridisierung hemmenden Substanzen sind Porphyrinverbindungen, die sich vom Häm und Hämatin ableiten, welche beide häufig in Blutproben zu finden sind und die PCR inhibieren (PCR Technology, Stockton Press, Henry A. Erlich, Hrsg., S. 33-34, 1989). Um die Menge dieser Inhibitoren zu verringern, sind Protokolle angewendet worden, die osmotische Lyse und Pelletierung von Kern- und Zelltrümmern verwenden.
Von Speichelproben ist ebenfalls berichtet worden, daß sie PCR-inhibitorische Substanzen enthalten. Orchert et al., PCR Methods and Applications 3, 365-368 (1994). Obwohl die inhibitorischen Substanzen nicht identifiziert wurden, hat sich gezeigt, daß eine ausgedehnte Behandlung der Speichelprobe mit Mikrowellen oder durch Kochen die PCR-Inhibition vollständig beseitigte.
Frickhofen und Young, J. Virol. Methods 35, 65-72 (1991) berichten, daß 45-sekündiges Erhitzen von Serumproben bei 70ºC die PCR-Amplifikation viraler Nucleinsäuresequenzen verbessert. Es wurde die Theorie aufgestellt, daß diese Verbesserung auf eine Hitzeinaktivierung von Serumenzymen wie Aprotinin, Leupeptin PMSF und Pepstatin zurückzuführen ist, die als inhibitorisch für PCR-Prozesse angesehen werden.
Eine weitere Methode zur Entfernung PCR-inhibitorischer Substanzen aus Serum vor der Amplifikation einer viralen Nucleinsäuresequenz wird von Zeldis et al., J. Clin. Invest. 84, 1503- 1508 (1989) gelehrt. Diese Methode beinhaltet die Adsorption des Virus an antikörperbeschichtete Mikropartikel, das Waschen der Mikropartikel und die anschließende Zerstörung der restlichen Proteine, die für die PCR inhibitorisch sein könnten, mit Proteinase K.
Beim Versuch, Treponema pallidum in Amnionflüssigkeit, Sera von Föten und Neugeborenen und Cerebrospinalflüssigkeit durch PCR nachzuweisen, wurden vier verschiedene Verfahren getestet, um PCR-inhibitorische Verbindungen zu entfernen. Grimprel et al., J. Clin. Microbiol. 29, 1711-1718 (1991). Die vier Verfahren zur Entfernung PCR-inhibitorischer Verbindungen waren, kurz zusammengefaßt: (1) ein Siedeverfahren, bei dem Probe in einem Röhrchen für 10 Minuten in ein kochendes Wasserbad gegeben, auf Eis abgekühlt und dann zentrifugiert würde; (2) ein Trennverfahren mit niedertouriger Zentrifugation, bei dem Probe einer sterilen phosphatgepufferten Salzlösung zugesetzt und einer Reihe von Zentrifugationen unterzogen wurde, dann das Pellet resuspendiert und für 10 Minuten gekocht wurde, wonach es auf Eis abgekühlt wurde; (3) ein Verfahren der alkalischen Lyse und Extraktion, bei dem Probe für 1,5 Minuten in 1 M NaCl, 1 N NaOH und 0,1% SDS gekocht, dann mit 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) neutralisiert und anschließend einer Reihe von Extraktionen mit Phenol und Chloroform- Isoamylalkohol unterzogen und mit Isopropylalkohol ausgefällt wurde; und (4) ein Zentrifugations-Extraktions-Verfahren, bei dem Probe wie oben in (2) beschrieben einer Trennung durch niedertourige Zentrifugation unterzogen wurde, gefolgt von 10-minütigem Kochen und einer Phenol-Chloroform-Extraktion vor Ausfällung in kaltem absolutem Ethanol. Die Autoren berichteten von unterschiedlichem Erfolg dieser Verfahren je nach der Art der verwendeten Proben.
Bei Stuhlproben wurde festgestellt, daß Polyethylenglykolfällung eine beträchtliche Menge kleiner Partikel und löslicher Substanzen entfernt, die inhibitorisch für ein Reverse- Transkriptase-PCR-Verfahren sein könnten. Jiang et al., J. Clin. Microbiol. 30, 2529-2534 (1992). Im Anschluß an die Ausfällung wurde ein Extraktionsprozeß unter Verwendung des kationischen Detergens Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) in einer hohen Salzkonzentration in Verbindung mit Phenol-Chloroform-Extraktion durchgeführt.
Eine andere Methode zur Entfernung von PCR inhibitorischen Substanzen aus Stuhlproben wird von Wilde et al., J. Clin. Microbiol. 28, 1300-1307 (1990) berichtet. Vor Anwendung von PCR zum Nachweis von Rotavirus-Nucleinsäure aus Stuhlproben wurde der Extraktionsprozeß mit einem zusätzlichen Schritt modifiziert, der chromatographisches Cellulosefaser-Pulver (CF11-Pulver) zur Aufreinigung der Rotavirus-RNA im Verlauf einer Reihe schneller Wasch- und Elutionsschritte verwendete.
Bei der Durchführung einer Studie zwecks Nachweis von Cytomegalovirus (CMV) in Urin mittels PCR wurde festgestellt, daß Harnstoff für die PCR inhibitorisch ist. Khan et al., J. Clin. Pathol. 44, 360-365 (1991). Diese Quelle berichtet, daß die PCR inhibitorischen Wirkungen von Harnstoff in Urin durch einfache Dialyse oder Ultrazentrifugation wirksam entfernt werden.
Ein weiteres Verfahren zur Entfernung von PCR inhibitorischen Substanzen aus Urin vor der Detektion von CMV-Nucleinsäure wird von Buffone et al., Clin. Chem. 37, 1945-1949 (1991) berichtet. Dieses Verfahren erfolgt im Anschluß an die Freisetzung der Nucleinsäure aus den CMV-Organismen und verwendet feine Glaskügelchen zur Adsorption von Nucleinsäure, so daß vor der Wiedergewinnung der Nucleinsäure für die Amplifikation Protein und andere Substanzen selektiv eluiert werden können.
Ein alternatives Verfahren zur Entfernung PCR-inhibitorischer Substanzen wird ebenfalls in EP-A-0 626 456 offenbart.
Wie durch die oben beschriebenen Quellen belegt, beziehen sich die meisten Veröffentlichungen, welche Inhibition von Nucleinsäureamplifikation betreffen, auf PCR. Jedoch hat sich gezeigt, daß diese selben für PCR inhibitorischen Substanzen sowie eine Reihe anderer, in klinischen Proben häufig zu findender Substanzen wie proteinische Substanzen, EDTA, humane DNA und Eisen inhibitorisch für SDA und auch andere Nucleinsäure- Amplifikationsverfahren sind.
Auch umfassen die meisten dieser Verfahren zur Reduzierung oder Entfernung von die Nucleinsäurehybridisierung hemmenden Substanzen ziemlich zeitaufwendige komplizierte Schritte, die der Probenbehandlungsmethodik hinzugefügt werden müssen. Ein weiteres Problem bei Verfahren, die relativ strenge Behandlungsschritte oder -bedingungen verwenden und/oder die Trennung von Zielnucleinsäure von anderen Substanzen erfordern, ist der Verlust einiger Zielnucleinsäuresequenz. Trotz der Fähigkeit von Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren, multiple Kopien von Zielsequenz (Amplikons) anhand sehr weniger ursprünglicher Ziele herzustellen, werden die Amplifikationseffizienz und das Detektionsvermögen verbessert, wenn mehr ursprüngliche Ziele in der Probe vorhanden sind. Das größere Detektionsvermögen kann sehr wichtig sein, wenn besonders schwer zu erfassende Proben wie laut AFB-Ausstrich (acid fast bacillus, säurefeste Bakterien) negative Mycobacterium-tuberculosis-Proben behandelt werden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Um sich den Problemen zu widmen, die mit dem Vorhandensein von für Nucleinsäurehybridisierung inhibitorischen Substanzen in Proben verbunden sind, und somit die Vorteile einer effizienteren Amplifikation und verbesserten Detektion von Zielnucleinsäuresequenzen zu erlangen, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Reduzierung der Menge solcher Substanzen in Proben bereit, bei dem vor der Lyse der die zu amplifizierende Nucleinsäure enthaltenden Zellen in der Probe die Probe mit einem Agens in Kontakt gebracht wird, das nicht die Freisetzung von Nucleinsäure aus den Zellen bewirkt, und dann die Zellen von dem Agens getrennt werden. Die speziellen Merkmale des Verfahrens der Erfindung sind in Anspruch 1 offenbart. Bevorzugte Ausführungsformen davon sind in den abhängigen Ansprüchen offenbart.
Brauchbare Agenzien zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind die chaotropen Substanzen Guanidinthiocyanat, Natriumperchlorat und Natriumthiocyanat. Ferner wird die Trennung der Zellen von dem Agens im allgemeinen durch einen Wasch- und Zentrifugationsschritt mit einer Lösung, in der das Agens löslich ist, erreicht.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die verschiedenen Ziele, Vorteile und Neuheitsmerkmale der Erfindung lassen sich leichter anhand der folgenden genauen Beschreibung erkennen, wenn diese in Verbindung mit den beigefügten Figuren gelesen wird, wobei:
Fig. 1 eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines Experiments ist, das durchgeführt wurde, um festzustellen, ob das Verfahren der vorliegenden Erfindung das Ausmaß an Nucleinsäureamplifikationsinhibition in einer klinischen Probe verglichen mit einem Kontroll-Standardverfahren der Probenbehandlung reduziert;
Fig. 2 eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines Experiments ist, das durchgeführt wurde, um den optimalen pH-Wert und optimale Konzentrationswerte für ein bestimmtes, im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendetes Agens zu bestimmen;
Fig. 3A und 3B graphische Darstellungen der Ergebnisse eines Experiments sind, welche die Wirksamkeit des Verfahrens der vorliegenden Erfindung bei der Reduzierung der Menge an Nucleinsäurehybridisierungsinhibitoren in klinischen Proben zeigen.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Wie oben erwähnt, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Reduzierung der Menge an Substanzen, die inhibitorisch für Nucleinsäure-Hybridisierungsverfahren sind, in Proben, welche Zellen mit Nucleinsäure enthalten, die einem Hybridisierungsverfahren unterzogen werden wird. Bei dem Verfahren wird ein Agens, das solche Substanzen solubilisiert und nicht die Freisetzung von Nucleinsäure aus Zellen bewirkt, mit einer Probe in Kontakt gebracht, und zwar vor der Lyse der Zellen in der Probe, so daß nucleinsäurehaltige Zellen in der Probe verbleiben. Anschließend werden solche Zellen von dem Agens getrennt.
Die Ergebnisse dieses Verfahrens waren aufgrund der Komplexität einiger von anderen getesteter Verfahren zur Entfernung inhibitorischer Substanzen, wie durch die Beschreibungen in obigem Hintergrund-Abschnitt belegt, besonders unerwartet. Überdies wurden die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Agenzien von Fachleuten im allgemeinen als brauchbar angesehen, um die Freisetzung von Nucleinsäure aus Zellen durch Zellwandlyse oder -solubilisierung zu bewirken, wie durch zahlreiche Quellen wie z. B. US-A-5 482 834 belegt, worin gelehrt wird, daß chaotrope Salze speziell zur Solubilisierung oder Lyse von Zellen nutzbar sind. Gewöhnlich wurden solche Agenzien in Kombination mit Wärme eingesetzt, um Zellen zu lysieren oder solubilisieren.
Die zellwandlysogenen Eigenschaften chaotroper Substanzen wie Guanidiniumthiocyanat (GuSCN) werden ebenfalls in Quellen wie Hubbard et al., Experimental & Applied Acarology 19, 473-478 (1995), Boom et al., J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990), Reek et al., BioTechniques 19, 282-285 (1995), Chungue et al., J. Med. Virol. 40, 142-145 (1993) und Shah et al., J. Clin. Microbiol. 33, 322-328 (1995) berichtet. Desgleichen sind chaotrope Substanzen und Detergenzien wie GuSCN viel bei der Extraktion von Nucleinsäuren aus Zellen verwendet worden, wie in Quellen wie z. B. Delacourt et al., J. Pediatrics 126, 703-710 (1995), Lee und Choi, J. Microbiol. & Biotechnol. 5, 181-187 (1995), Cano et al., J. Food Protection 58, 614-620 (1995), Bartolome et al., J. Hepatol. 17, S90-S93 (1993), Rajagopaian et al., Lett. Applied Microbiol. 21, 14-17 (1995) und Shieh et al., J. Virol. Methods 54, 51-66 (1995) gelehrt. Somit war das schnelle und einfache Verfahren der vorliegenden Erfindung, bei dem Zellen in einer Probe vor der Zell-Lyse mit solch einem Agens in Kontakt gebracht (gewaschen) werden, um für Nucleinsäurehybridisierung inhibitorische Substanzen zu entfernen, in Anbetracht anderer auf dem Fachgebiet verwendeter Verfahren unerwartet.
Auch ist einer der Vorteile des Verfahrens der vorliegenden Erfindung das Vermögen, die anfängliche Ausbeute an Zielnucleinsäure von den Zellen in einer Probe zu erhöhen. Obwohl Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren viele Kopien einer Zielsequenz (Amplikons) anhand sehr weniger anfänglicher Ziele erzeugen können, ist es vorteilhaft, den Amplifikationsprozeß mit so Vielen anfänglichen Zielen wie möglich zu starten. Andere Verfahren zur Entfernung von für Nucleinsäurehybridisierung inhibitorischen Substanzen im Anschluß an die Lyse der Zellen sind notorisch ineffizient, da sie auf einer Trennung von Nucleinsäure von anderen Substanzen in dem Lysat basieren und somit viele anfängliche Ziele nicht wiedergewonnen werden. Bei dem vorliegenden Verfahren, wo die inhibitorischen Substanzen vor der Zell-Lyse entfernt werden, ist eine solche anschließende Trennung nicht erforderlich, und es werden bessere Ausbeuten an anfänglichem Ziel erhalten.
Die Proben, die dem Verfahren der vorliegenden Erfindung unterzogen werden können, umfassen praktisch alle klinischen Human- und Veterinärproben wie Sputumproben, Blutproben, Urinproben, Proben von Cerebrospinalflüssigkeit ("CSF") und andere, Umweltproben wie Wasser-, Luft- und Bodenproben sowie Nahrungsmittelproben. Die Proben, die dem Verfahren der vorliegenden Erfindung unterzogen werden können, stehen in Verdacht, Zellen mit einer Zielnucleinsäuresequenz zu enthalten, die einem Hybridisierungsverfahren wie einer direkten Sondenhybridisierung oder Primerhybridisierung zur Initiierung eines Amplifikationsprozesses unterzogen werden soll.
Substanzen, die für Nucleinsäure-Hybridisierungsverfahren inhibitorisch und typischerweise in solchen Proben zu finden sind, umfassen proteinische Materialien und menschliche DNA in Humanproben sowie tierische DNA in Veterinärproben. Wie in obigem Hintergrund-Abschnitt angesprochen, sind diese Substanzen dafür bekannt, daß sie für Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren wie SDA, PCR, LCR, NASBA, TMA und andere inhibitorisch sind.
Der erste Schritt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist es, die Probe mit einem Agens in Kontakt zu bringen, in dem die inhibitorische Substanz löslich ist und das nicht die Freisetzung von Nucleinsäure aus Zellen bewirken wird. Dieses Inkontaktbringen kann zu jedem Zeitpunkt vor der Lyse von Zellen zur Freisetzung von Zielnucleinsäure erfolgen. Ein bevorzugter Zeitpunkt für das Inkontaktbringen der Zellen mit solch einem Angens ist jedoch nach einiger Manipulation der Probe zur Konzentrierung des Aufenthaltsortes der Zellen oder Pelletierung der Zellen. Typischerweise ist eine solche Konzentrierung Ergebnis einer Zentrifugation, kann jedoch auch von einer Filtration oder selektiven Adsorption herrühren.
Eine solche Konzentrierung der Zellen bietet eine größere Gewähr, daß das Agens mit den Zellen in Kontakt kommt, und ermöglicht eine effizientere Verwendung des Agens aufgrund eines eingegrenzten Aufenthaltsortes von Zellen. Das Inkontaktbringen von Zellen mit dem Agens ist vorzugsweise ein relativ kurzes Waschen der Zellen. Typischerweise erfolgt das Inkontaktbringen von Zellen und Agens bis zu etwa fünf Minuten.
Viele Agenzien sind in einem Verfahren gegen Inhibierung von Nucleinsäure- Hybridisierungsverfahren brauchbar. Beispiele für solche brauchbaren Agenzien umfassen dem Fachmann wohlbekannte chaotrope Substanzen und Detergenzien wie Triton X-100, eingetragenes Warenzeichen, Triton X-114, eingetragenes Warenzeichen, NP-40, Brij 35, Brij 58, Tween 20, eingetragenes Warenzeichen, Tween 80, eingetragenes Warenzeichen, Octylglucosid, Octylthioglucosid, Chaps, Natriumiodid, Natriumperchlorat, Kaliumiodid, Natriumthiocyanat, Kaliumthiocyanat, Guanidinthiocyanat, Guanidinisothiocyanat, Natriumtrichloracetat, Natriumtrifluoracetat und Harnstoff. Weitere Agenzien, die in einem solchen Verfahren brauchbar sind, können von einem Durchschnittsfachmann mit angemessener Erfolgserwartung durch die Durchführung von Routine-Screeningversuchen identifiziert werden, die auf die zwei grundlegenden Kenngrößen solcher Agenzien ausgerichtet sind: Grad der Solubilisierung von für die Nucleinsäurehybridisierung inhibitorischen Substanzen und Nichtbewirken einer Freisetzung von Nucleinsäure aus Zellen.
Das Agens wird, kurz gesagt, mit Zellen in Kontakt gebracht, die Zellen werden zentrifugiert, und mit dem Überstand wird in einem Routine-Screeningversuch eine Amplifikationsreaktion für eine den Zellen gemeinsame Zielnucleinsäuresequenz durchgeführt. Wenn die Zielsequenz amplifiziert wird, dann erfüllt das Agens nicht die Anforderungen für die Verwendung in dem Verfahren, da es die Freisetzung von Nucleinsäure aus den Zellen bewirkt hat, wohingegen ein Ausbleiben von Amplifikation der Zielsequenz und die Amplifikation einer internen Kontrollsequenz anzeigen würde, daß das Agens in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung brauchbar sein könnte. Dann wird das Agens, das nicht die Freisetzung von Nucleinsäure aus den Zellen bewirkt hat, mit bekannten für Nucleinsäurehybridisierung inhibitorischen Substanzen in Kontakt gebracht, und es wird in einem Routine-Screeningversuch schnell der Grad der Solubilisierung der inhibitorischen Substanz bestimmt. Jene Agenzien, welche die inhibitorische Substanz solubilisieren, sind in dem Verfahren zur Inhibierung von Nucleinsäure-Hybridisierungsverfahren brauchbar.
Die Konzentration und Menge des in solchem Verfahren verwendeten Agens hängt von der Art der Probe ab, die dem Verfahren unterzogen wird. Beispiele für geeignete Konzentrationen von chaotropen Substanzen und Detergenzien zur Verwendung in solchem Verfahren sind unten in Tabelle 1 dargestellt. TABELLE 1 Konzentrationen von chaotropen Substanzen/Detergenzien
Gewöhnlich entspricht das Volumen des in solchem Verfahren verwendeten Agens wenigstens dem Volumen der Probe. Insbesondere beträgt das Volumen : Volumen-Verhältnis von Agens zu Probe etwa 1 : 1 bis etwa 5 : 1. Außerdem ist im allgemeinen vorzuziehen, daß das Agens als eine basische Lösung zubereitet wird, wobei die vorzüglichsten pH-Werte für bestimmte Agenzien durch einen Routine-Screeningversuch bestimmt werden, der zum Beispiel auf den hier in Beispiel 3 vorgestellten Experimenten basiert, in denen festgestellt wurde, daß eine 6,0 M Guanidinisothiocyanat-Lösung bei pH 9,0 besonders günstig für die Reduzierung der Menge an für Nucleinsäurehybridisierung inhibitorischen Substanzen ist. Die optimale Konzentration (Molarität) eines bestimmten Agens kann ebenfalls bestimmt werden, indem man die gleiche Art von Routine-Sreeningversuch basierend auf den hier in Beispiel 3 vorgestellten Experimenten verwendet. Außerdem wird das Agens gewöhnlich bei Raumtemperatur mit der Probe in Kontakt gebracht.
Wenn das Agens mit Zellen der Probe in Kontakt gebracht wird, werden für Nucleinsäurehybridisierung inhibitorische Substanzen von dem Agens solubilisiert, das somit solche Substanzen von den Wänden der Zellen wäscht. Da geeignete Agenzien nicht die Freisetzung von Nucleinsäure aus den Zellen bewirken, ist der Verlust von Zielnucleinsäure, wenn das Agens von den Zellen getrennt wird, ohne Belang.
Die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Agenzien könnten jedoch ebenfalls Nucleinsäure-Hybridisierungsprozesse beeinträchtigen, und daher werden solche Agenzien anschließend von den Zellen getrennt. Eine solche Trennung kann durch jedes geeignete Mittel wie Filtration oder Waschen und Zentrifugation mit oder ohne einen Puffer, in dem das Agens löslich ist, erfolgen. Vorzugsweise wird ein solcher Puffer verwendet, um sowohl die Entfernung der inhibitorischen Substanzen wie auch des Agens vor der Lyse zu gewährleisten. Somit befindet sich, wenn solche Zellen lysiert werden, die Zielnucleinsäure in einer Umgebung mit minimalen Mengen an Substanzen, die für den Hybridisierungsprozeß, dem die Zielnucleinsäure unterzogen werden wird, inhibitorisch sind.
Eine Vielzahl verschiedener Verfahren wird gegenwärtig angewendet, um Zielnucleinsäuren in Proben zur Hybridisierung oder Amplifikation aufzubereiten. Zum Beispiel werden Sputumproben, die behandelt werden, um mykobakterielle Nucleinsäuresequenzen zu amplifizieren, typischerweise einer NALC/NaOH-Behandlung unterzogen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann besonders nützlich sein, um Verklumpung solcher Proben zu vermindern. Ebenso werden andere Arten klinischer Proben anderen wohlbekannten Standardverfahren unterzogen, zum Beispiel Zentrifugation bei großvolumigen Proben wie Blut und Urin. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann vor, als Teil von oder nach solchen Standardverfahren verwendet werden, vorausgesetzt, daß das Verfahren vor der Lyse der die Zielnucleinsäure enthaltenden Zellen durchgeführt wird.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erfordert keine quantitative Bindung und Freisetzung von Zielnucleinsäure von einer bindenden Oberfläche und gestattet somit die Verwendung von mehr Probe als herkömmlicherweise in nucleinsäure-basierten Hybridisierungs- oder Amplifikationstests verwendet wird. Diese Möglichkeit zur Verwendung von mehr Probe verleiht solchen Tests größere Empfindlichkeit, da in den anfänglichen Stadien des Tests mehr Zielnucleinsäure vorhanden ist. Die Selektivität der Agenzien bei der Solubilisierung inhibitorischer Substanzen ohne jedoch eine gleichzeitige Solubilisierung von Zielnucleinsäure oder Zellwänden ist eines der typischen Merkmale der Agenzien, das zu den Ergebnisse des Verfahrens der vorliegenden Erfindung beiträgt, wie durch die unten angeführten Beispiele belegt wird.
Die folgenden Beispiele erläutern spezielle Ausführungsformen der hier beschriebenen Erfindung. Wie für den Fachmann ersichtlich wäre, sind verschiedene Änderungen und Modifikationen möglich und werden in den Schutzbereich der beschriebenen Erfindung miteinbezogen.

BEISPIEL 1

Vergleich des Verfahrens der vorliegenden Erfindung mit einem Kontroll- Probenbehandlungsverfahren

Der Zweck dieses Beispiels war es, zu bestimmen, ob ein Verfahren der vorliegenden Erfindung das Ausmaß an Nucleinsäureamplifikationsinhibition in einer klinischen Probe reduziert und daher verglichen mit einem Kontroll-Standardverfahren der Probenbehandlung bessere Zieldetektionswerte liefert.

MATERIALIEN

REAGENZIEN ZUR PROBENBEHANDLUNG:

- Natriumperchlorat (Sigma)
- Natriumthiocyanat (Sigma)
- Guanidinthiocyanat (Sigma)
- durch Umkehrosmose destilliertes (Reverse Osmosis DIstilled, "RODI") H&sub2;O
- MycoPrep (BBL)
- MAC/TB-Probenverdünner
- Phosphatpufferlösung (BBL)
- zirconiumperlenhaltige Kapseln (Becton Dickinson)
- klinische Sputumproben; Proben ID 785, 657, 634, 8594, 8894, 13883, 8396, 13867, 13088, 146
- mykobakterielle Zellen des M.-avium-Komplexes ("MAC")

AMPLIFIKATIONSREAGENZIEN

- RODI H&sub2;O
- 500 mM KPO&sub4;
- 50 · PBA
- 50 · dCAG
- 5 mg/ml BSA
- 100 mM DTT
- 50% Trehalose
- 1 U/ul UDG
- 192 mM Magnesium
- 50 · dU
- 5 U/ul UDI
- Bst 120 U/ul
- BsoBI 160 U/ul
- interne Amplifikationskontrolle ("IAC") 10³
- 55% Glycerol
- DMSO
- humane Placenta-DNA
- Antischaummittel
- Zielverdünner

DETEKTIONSREAGENZIEN

- M.-tb.-Hybridisierungsmix
- MAC-Sonden
- Hybridisierungsverdünner
- IAC-Hybridisierungsmix
- Systemflüssigkeit
- Waschflüssigkeit
- Testvorrichtung (Assay Device, "AD")
- LUMIPHOS 530
- 2,0-ml-Labcraft®-Röhrchen
- MAC-Test-Kalibratoren
- Test-Kalibratoren

VERFAHREN:

NaClO&sub4; wurde 2 M in destilliertem Wasser zubereitet. NaSCH wurde 3 M in destilliertem Wasser zubereitet. GuSCN wurde 4 M in destilliertem Wasser zubereitet. Jede dieser drei chaotropen Lösungen wurde mit 1,0 ml/Röhrchen in zehn 2,0-ml-LabCraft®-Röhrchen gegeben. Ein 1,0-ml-Aliquot MAC/TB-Probenpuffer wurde in zehn 2,0-ml-LabCraft®-Röhrchen gegeben.
Zehn klinische Sputumproben wurden dann bis auf Raumtemperatur aufgetaut. Den Sputumprobenvolumen wurde mit einem gleichen Volumen MycoPrep-Puffer zugesetzt, und die Proben wurden gevortext und 15 Minuten bei Raumtemperatur gehalten.
Jeder Probe wurde dann Phosphatpuffer zugesetzt, um das Gesamtvolumen jeder Probe auf 50 ml einzustellen. Die Proben wurden gevortext und 20 Minuten bei einer relativen Zentrifugalkraft (RCF) von 3.000 zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, und es wurden jeder Probe 2,0 ml Phosphatpuffer zugesetzt, und die Proben wurden gevortext. In die resultierende Probe wurden MAC-Zellen mit 75 Partikeln/ml gegeben.
Dann wurde ein 500-ml-Aliquot jeder Probe in alle vier beschriebenen Waschpufferarten (obige 1,0 ml Probenpuffer, 2 M NaClO&sub4;, 3 M NaSCH und 4 M GuSCN) gegeben. Die Proben wurden gevortext und 3,0 Minuten bei 12.200 RCF zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, und das Pellet wurde mit 1,0 ml MAC/TB-Probenpuffer resuspendiert und dann 3,0 Minuten bei 12.200 RCF zentrifugiert. Nochmals wurde der Überstand dekantiert, das Pellet mit 1,0 ml MAC/TB-Probenpuffer resuspendiert und 3,0 Minuten bei 12.200 RCF zentrifugiert.
In jedes Röhrchen wurde eine zirconiumperlenhaltige Kapsel gegeben, und jedes Pellet wurde mit 400 ul MAC/TB-Probenpuffer resuspendiert. Die Proben wurden 30 Minuten in einem Umluft-Heißluftofen auf 105ºC erhitzt, um mykobakterielle Zellen zu lysieren und jegliche mykobakteriellen Organismen nicht-infektiös zu machen. Die Probenröhrchen wurden dann in ein Savant-CellPrepTM-Gerät geladen, das 45 Sekunden bei einer Einstellung von 5,0 m/s betrieben wurde, um Nucleinsäuren von anderen Zellkomponenten zu trennen. Die Proben wurden dann folgendermaßen in einem MAC/TB-Amplifikations- und Detektionssystem weiterverarbeitet.
Thermophile SDA wurde im wesentlichen wie in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. 0 684 315 beschrieben in einem Reaktionsgemisch durchgeführt, das 25 mM Kaliumphosphat, pH 7,6, 100 ug/ml acetyliertes Rinderserumalbumin (BSA), 0,5 mM dUTP, jeweils 0,2 mM dATP und dGTP und 1,4 mM 2'-Desoxycytidin-5'-O-(1-thiotriphosphat) (α-Thio-dCTP), 12% Glycerol, 6,5 mM Magnesiumacetat, 0,5 uM Amplifikationsprimer, 0,05 uM Bumper-Primer, 50 ng humane Placenta-DNA, 12,5 Units Bst-Polymerase, 160 Units BsoBI, 1 Unit Uracil-N-Glycosylase (UNG) und 2 Units Uracil-N-Glycosylase-Inhibitor (Ugi) enthielt.
Vor Zugabe der Enzyme und dem Start der Amplifikationsreaktion wurden die Proben 2 Minuten gekocht. Die Proben wurden dann 2 Minuten bei 41ºC inkubiert, und die UNG wurde zugesetzt, um jegliche kontaminierenden Amplikons abzubauen. Nach 30-minütiger Inkubation mit UNG wurden die Proben für 5 Minuten auf 52ºC gebracht. Der Enzymmix (Bst-Polymerase, BsoBI, Ugi und Glycerol) wurde zugesetzt, und die Amplifikation wurde 30 Minuten bei 52ºC laufen gelassen. Die Reaktion wurde durch 5-minutiges Kochen gestoppt.
Die Amplifikationsprodukte wurden im wesentlichen wie von C. A. Spargo et al. (1993, Molec. Cell Probes 7, 395-404) beschrieben in einem Chemilumineszenz-Test detektiert. Mit alkalischer Phosphatase markierte Detektorsonden für M. tb., MAC und IAC, biotinylierte Fangsonden für M. tb., MAC und IAC und die Proben wurden der Vertiefung einer streptavidinbeschichteten Mikrotiterplatte zugesetzt und 50 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann dreimal mit Stringenzpuffer gewaschen. Es wurde LUMIPHOS (Lumigen, Inc.) zugesetzt, und die Reaktion wurde 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Lumineszenz wurde in einem Luminometer (Dynatech) detektiert, und es wurden relative Lichteinheiten (RLUs) aufgezeichnet.

ERGEBNISSE

Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle als M.-tb.-, MAC- und IAC-Mittelwerte für die zehn Proben und in Fig. 1 in graphischer Form dargestellt.
* Beide Waschverfahren wiesen die gleiche Probe mit positiven M.-tb.-Werten auf, was auf eine mögliche fehlerhafte Diagnose auf klinischer Seite hinweist.

FOLGERUNGEN

Die Daten dieses Beispiels zeigen, daß es statistisch keinen Unterschied in den IAC- Werten jeder der Waschbedingungen gibt, es ist jedoch interessant, daß die Mittelwerte für alle Agens-Bedingungen höher sind als für das Kontroll-Waschverfahren. Die Daten zeigen außerdem, daß statistisch die Bedingung 4 M GuSCN höhere spezifische MAC-RLU-Werte erzeugte als jede der anderen drei Bedingungen. Dies weist darauf hin, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung, so wie es hier durchgeführt wird, das Mykobakterium nicht schädigt und im Falle von 4 M GuSCN die Wiedergewinnung der MAC-Organismen und anschließend der Ziel-DNA de facto verbessert.

BEISPIEL 2

Sreening von klinischen Proben auf Inhibition von Nucleinsäureamplifikation

Der Zweck dieses Beispiels war es, klinische Proben auf Inhibition von Nucleinsäureamplifikation zu screenen.

MATERIALIEN

REAGENZIEN ZUR PROBENBEHANDLUNG

- MycoPrep-Reagenz
- BBL-Phosphatpuffer, pH 6,8
- TB/MAC-Probenverdünner
- ausstrich-negatives, kultur-negatives Sputum von N. Carolina Public Health, Proben ID 8207, 1514, 13472, 14199, 13847, 3675, 6401, 4691, 13545, 13711, 9939, 12227, 12228, 12161, 8406; 782, 13547, 13448, 13506, 13319, 13420, 243, 103
- zirconiumperlenhaltige Kapseln

AMPLIFIKATIONSREAGENZIEN

Die gleichen wie für Beispiel 1 sowie eine IN2-Plasmid-Kontrolle.

DETEKTIONSREAGENZIEN

Die gleichen wie für Beispiel 1.

VERFAHREN:

Dreiundzwanzig klinische Sputumproben wurden bis auf Raumtemperatur aufgetaut. Jedes Sputum mit mehr als 12 ml Sputum wurde auf getrennte Röhrchen aufgeteilt, so daß der Volumenbereich für jede behandelte Sputumprobe 7,5-12 ml betrug.
Den Sputumproben wurde mit einem dem Sputumvolumen entsprechenden Volumen MycoPrep-Reagenz zugesetzt. Die Proben wurden gevortext und 15 Minuten bei Raumtemperatur gehalten. Das Volumen jeder Sputumlösung wurde mit Phosphatpuffer auf 50 ml eingestellt.
Die Proben wurden 20 Minuten bei. 3.000 RCF zentrifugiert. Der Überstand wurde von jedem Probenpellet dekantiert, und es wurden jedem Röhrchen 2,0 ml Phosphatpuffer zugesetzt. Die Proben wurden in 500-ul-Aliquots in 2,0-ml-LabCraft®-Röhrchen aliquotiert. Eine Probe jeden Typs wurde bei Raumtemperatur gehalten, und die übrigen Proben wurde bei -70ºC aufbewahrt.
Jeder bei Raumtemperatur gehaltenen Probe wurde 1 ml MAC/TB-Probenpuffer zugesetzt. Die Proben wurden 3,0 Minuten bei 12.200 RCF zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, jedem Röhrchen wurde 1,0 ml MAC/TB-Probenpuffer zugesetzt, und die Röhrchen wurden 3,0 Minuten bei 12.200 RCF zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, jedem Röhrchen wurde eine zirconiumperlenhaltige Kapsel zugegeben, und es wurden 400 ul MAC/TB-Probenpuffer in jedes Röhrchen gefüllt. Die Röhrchen wurden 30 Minuten in einem Umluft-Heißluftofen auf 105ºC erhitzt, um mykobakterielle Zellen zu lysieren und jegliche mykobakteriellen Organismen nicht-infektiös zu machen. Die Röhrchen wurden unter Verwendung einer Einstellung von 5,0 m/s für 45 Sekunden auf einem Savant-CellPrepTM-Gerät bewegt. Es wurden thermophile Strangverdrängung (tSDA) unter Anwendung des MAC/TB- Flüssig-Dreifachtests und die in Beispiel 1 beschriebenen Nachweisverfahren verwendet, um die Ergebnisse aus diesem Experiment in relativen Lichteinheiten (RLUs) zu erzeugen.

ERGEBNISSE

Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle dargestellt.

FOLGERUNG

Von den dreiundzwanzig klinischen Proben, die in dem MAC/TB-System getestet wurden, produzierten neun IAC-Werte von weniger als 10 RLUs, was auf eine starke Inhibition der Amplifikations-/Detektionsreaktion durch die klinische Probe hinweist. Diese unter "Standard"-Probenwaschbedinguagen geschaffenen inhibitorischen Testmaterialien wurden wie in den nachfolgenden Beispielen gezeigt weiter behandelt.

BEISPIEL 3

pH- und Molaritätsjustierungen an chaotroper Lösung

Der Zweck dieses Beispiels war es, festzustellen, ob der pH-Wert und die Molarität des GuSCN-Waschgangs so eingestellt werden kann, daß mehr Inhibitoren aus klinischen Proben entfernt werden.

MATERIALIEN

REAGENZIEN ZUR PROBENBEHANDLUNG

- negative NALC-Pelletproben Nr. 6401, 8406, 782, 13448, 13506 aus Beispiel 2
- Guanidinisothiocyanat (GuSCN) Gibco BRL
- MAC/TB-Probenpuffer
- zirconiumperlenhaltige Kapseln
- 500 mM Kaliumphosphat (KPO&sub4;)
- 5 N NaOH Ricca
- mykobakterielle M.-tb.-Zellen

AMPLIFIKATIONSREAGENZIEN

Die gleichen wie für Beispiel 1.

TESTREAGENZIEN

Die gleichen wie für Beispiel 1.

VERFAHREN

Es wurde ein negativer inhibitorischer NALC-Pool durch das Füllen von 1,0 ml der Probe 782 und S00 ul der Proben 6401, 8406, 13448 und 13506 in ein 2-ml-Polypropylenröhrchen hergestellt. Der inhibitorische Pool wurde mit 200 Partikeln/ml (7,5 Partikel/letztendlicher tSDA-Reaktion) M.-tb.-Organismen versetzt. Die zubereiteten GuSCN-Lösungen sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt. Die Lösungen mit pH 7,0 und 9,0 wurden mit 5 N NaOH auf den angegebenen pH-Wert eingestellt.

CHAOTROPE LÖSUNGEN

6,0 M GuSCN, pH 4,9 4,0 M GuSCN, pH 5,6
6,0 M GuSCN, pH 7,0 4,0 M GuSCN, pH 7,0
6,0 M GuSCN, pH 9,0 4,0 M GuSCN, pH 9,0
Jede GuSCN-Lösung wurde mit 1,0 ml/Röhrchen in ein 2,0-ml-LabCraft®-Röhrchen gefüllt. In jedes GuSCN-haltige Röhrchen wurden 500 ul versetzter negativer inhibitorischer NALC-Pool gegeben.
Die Röhrchen wurden kurz gevortext, und die Röhrchen wurden 3,0 Minuten bei 12.200 RCF zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, und es wurde 1,0 ml MAC/TB-Probenpuffer in jedes Röhrchen gegeben, und die Röhrchen wurden 3,0 Minuten bei 12.200 RCF zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, und es wurde 1,0 ml MAC/TB-Probenpuffer in jedes Röhrchen gegeben. Die Röhrchen wurden 3 Minuten bei 12.200 RCF zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, und es wurde in jedes Röhrchen eine zirconiumperlenhaltige Kapsel eingeführt.
In Jedes Röhrchen wurde mit 400 ul/Röhrchen MAC/TB-Probenpuffer gefüllt. Die Röhrchen wurden 30 Minuten in einem Umluft-Heißluftofen auf 105ºC erhitzt. Die Röhrchen wurden unter Verwendung einer Einstellung von 5,0 m/s für 45 Sekunden auf einem Savant- CellPrepTM-Gerät bewegt. Es wurden tSDA unter Anwendung des MAC/TB-Flüssig-Dreifachtests und die in Beispiel 1 beschriebenen Nachweisverfahren verwendet, um die Ergebnisse aus diesem Experiment in relativen Lichteinheiten (RLUs) zu erzeugen.

ERGEBNISSE:

Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle und in graphischer Form in Fig. 2 dargestellt.
Anmerkung: Die M.-tb.-, MAC- und IAC-Werte sind die Mittelwerte von fünf Amplifikations- /Detektions-Parallelproben.

FOLGERUNG:

Die Bedingung 6,0 M GuSCN, pH 9,0 produzierte statistisch bessere M.-tb.- und IAC- RLU-Werte als die anderen Bedingungen, ohne unspezifische MAC-Werte zu erzeugen. Dies zeigt, daß mittels der 6,0 M GuSCN-Lösung von pH 9,0 eine größere Menge an Nucleinsäurehybridisierungsinhibitoren entfernt wird, ohne daß Zielnucleinsäure aus Mycobacterium freigesetzt wird.

BEISPIEL 4

Waschgang mit GuSCN (6 M und pH 9,0) unter Verwendung mit M. tb. versetzter negativer klinischer Proben

Der Zweck dieses Beispiels war es, festzustellen, ob mit M. tb. versetzte und mit der 6 M GuSCN-pH-9,0-Lösung gewaschene klinische Proben unerwünschte Nucleinsäurehybridisierungsinhibitoren entfernen und die Amplifikation und Detektion von spezifischem M.-tb.-, DNA-Ziel ermöglichen werden.

MATERIALIEN

REAGENZIEN ZUR PROBENBEHANDLUNG

- negative NALC-Pelletproben Nr. 8207, 1514, 13472, 14199, 13847, 3675, 6401, 4691, 13545, 13711, 9939, 12227, 12228, 12161, 8406, 782, 13547, 13448, 13506, 13319, 13420, 243, 103
- Guanidinisothiocyanat (GuSCN) Gibco BRL
- MAC/TB-Probenpuffer
- zirconiumperlenhaltige Kapseln
- 500 mM Kaliumphosphat (KPO&sub4;)
- 5 N NaOH Ricca

AMPLIFIKATIONSREAGENZIEN

Die gleichen wie für Beispiel 1.

TESTREAGENZIEN

Die gleichen wie für Beispiel 1.

VERFAHREN:

Mit 200 mM KPO&sub4; wurde eine 6 M GuSCN-Lösung zubereitet und wie in Beispiel 3 mit 5 N NaOH auf pH 9,0 eingestellt. M.-tb.-Organismen wurden mit 200 Partikeln/ml (7,5 Partikel/Amplifikationsreaktion) in jede klinische Probe aus dem Abschnitt "Materialien" von Beispiel 2 gegeben. Einige dieser Proben von Beispiel 2 waren inhibitorisch für Nucleinsäurehybridisierung. M. tb. wurde mit 200 Partikeln/ml in 500 ul MAC/TB-Puffer gegeben und als "Probenverarbeitungskontrolle" bezeichnet.
In ein 2,0-ml-LabCraft®-Röhrchen wurde 1 ml der GuSCN-Lösung gefüllt, und das Röhrchen wurde mit "GuSCN-Negativ-Kontrolle" bezeichnet. In jedes Röhrchen mit klinischer Probe wurde 1 ml der 6 M GuSCN-Lösung von pH 9,0 gefüllt.
Die Röhrchen wurden gevortext und 3,0 Minuten bei 12.200 RCF zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, und es wurde 1,0 ml MAC/TB-Puffer in jedes Röhrchen gefüllt, und die Röhrchen wurden 3,0 Minuten bei 12.200 RCF zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, und es wurde 1,0 ml MAC/TB-Probenpuffer in jedes Röhrchen gefüllt, und die Röhrchen wurden 3,0 Minuten bei 12.200 RCF zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, und es wurde jedem Röhrchen eine Zirconiumkapsel zugesetzt. Jedem Röhrchen wurde mit 400 ul/Röhrchen MAC/TB-Probenpuffer zugesetzt. Die Röhrchen wurden wie in den obigen Beispielen beschrieben erhitzt und bewegt. Es wurden tSDA unter Anwendung des MAC/TB- Flüssig-Dreifachtests und die in Beispiel 1 beschriebenen Nachweisverfahren verwendet, um die Ergebnisse aus diesem Experiment in relativen Lichteinheiten (RLUs) zu erzeugen.

ERGEBNISSE

Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle als Mittelwerte dreier Amplifikations- Wiederholungen von jeder behandelten Probe und in Fig. 3A und 3B in graphischer Form dargestellt.

FOLGERUNG

Dreiundzwanzig IAC-Werte ergaben akzeptable tSDA-Werte von über 10 RLUs, was bedeutet, daß die Amplifikation nicht inhibiert war. Zudem wurde M. tb. mit 7,5 Partikeln/Amplifikationsreaktion in jeder versetzten Probe detektiert, wie durch die Verhältnisse der spezifischen RLU zu Hintergrund-RLU von weniger als 88,2 : 1 für jede Probe belegt wird. In Beispiel 2 wurde gezeigt, daß fünf der klinischen Proben ohne Anwendung eines GuSCN- Waschschrittes inhibitorische LAC-Werte von weniger als 10 RLUs aufwiesen. Mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie es in diesem Beispiel durchgeführt wurde, wurden in fast allen Proben (sogar denen, die sich in Beispiel 2 durch niedrige Signalerzeugung als inhibitorisch erwiesen) Verbesserungen erzielt.
Während die Erfindung mit einiger Spezifität beschrieben wurde, können für den Durchschnittsfachmann offensichtliche Modifikationen vorgenommen werden, ohne vom Schutzbereich der Erfindung abzuweichen. Verschiedene Merkmale der Erfindung sind in den folgenden Ansprüchen angeführt.

Claims

1. Verfahren zur Reduzierung der Menge an Substanzen, die inhibitorisch für Nucleinsäure- Hybridisierungsverfahren sind, aus einer Probe, welche Zellen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus M.-avium-Komplex- und M.-tuberculosis-Zellen, enthält, umfassend die folgenden Schritte:

(a) vor der Lyse der Zellen Inkontaktbringen der Zellen mit einem chaotropen Agens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus NaClO&sub4;, NaSCN und/oder Guanidinisothiocyanat, das (i) die Substanzen solubilisiert und (ii) nicht die Freisetzung von Nucleinsäure aus den Zellen bewirkt; und

(b) Trennen der Zellen von dem Agens.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die chaotrope Substanz Guanidinisothiocyanat ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei Guanidinisothiocyanat in einer Lösung mit einem basischen pH-Wert vorliegt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der pH-Wert etwa 9,0 beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Konzentration an Guanidinisothiocyanat etwa 6 M ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Trennung durch Waschen und Zentrifugation erfolgt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei vor dem Schritt (a) die Zellen pelletiert werden.