DE3856298T2

DE3856298T2 - Techniken zur Vorbereitung von Proben für bakterielle Untersuchungen

Info

Publication number: DE3856298T2
Application number: DE3856298T
Authority: DE
Inventors: Daniel Louis San Diego California 92124 Kacian
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1987-04-01
Filing date: 1988-03-31
Publication date: 1999-06-02
Anticipated expiration: 2008-04-01
Also published as: ATE111160T1; DE3856298D1; EP0586024A1; AU619745B2; ES2058263T3; KR970007865B1; EP0586024B1; JP2971821B2; DE3851354T2; CA1317860C; EP0285439A2; JPH09168399A; ES2126626T3; EP0285439B1; WO1988007539A1; JPH01503006A; ATE176000T1; DE3851354D1; EP0285439A3; JP2849103B2

Description

Die vorliegende Anmeldung ist von Anmeldung Nr. 88 302 941.5 abgeteilt.

Hintergrund der Erfindung

Bereich der Erfindung und Fachgebiet

In den 50er bis frühen 60er Jahren erkannten Forscher, daß es Unterschiede bei der Zusammensetzung verschiedener schleimartiger Sekretionen einschließlich Sputum in Abhängigkeit von der Quelle und Natur eines gegebenen Krankheitsprozeß' gab. Im besonderen wurde erkannt, daß es einerseits Sputumarten gibt (als mukös klassifiziert), die keine entzündlichen Zellen aufweisen, wie sie normalerweise in Verbindung mit infektiösen Prozessen vorliegen, und andererseits Sputumarten, die solche Zellen enthalten (als eitrig klassifiziert). Es wurde vorgeschlagen, daß sowohl Protein-Komponenten als auch DNA möglicherweise zur Viskosität des Sputums beitragen, woraufhin Beweise zur Erhärtung dessen gesammelt wurden. Besonders von DNAsen und Proteasen wurde gezeigt, daß sie in bestimmtem Umfang die Fähigkeit zur Verflüssigung von Sputum und Eiter aufweisen. DNAsen schienen bei Anwendung mit eitrigem Sputum aktiver zu sein, wohingegen Proteasen bei mukösem Sputum wirksamer waren. Lieberman, Amer. Rev. Resp. Disease, Bd. 97, S. 662-672 (1968).
Über Enzyme hinaus wurde eine Vielfalt weiterer Agenzien, wie etwa Detergenzien, Salze, Oxidations- und Reduktionsmittel etc. als Verflüssigungsmittel getestet, wovon sich einige als mehr oder weniger erfolgreich erwiesen. Nahezu alle zeigten einige Nachteile für einen oder mehrere der üblichen Verwendungszwecke, zu denen die Verflüssigung zur Anwendung in Labortestverfahren und zur Behandlung von Patienten zählen.
In den frühen 60er Jahren wurde berichtet, daß sich die Verwendung des Sulfhydryl- Reagenz N-Acetyl-L-cystein zur Verflüssigung von schleimartigen Sekreten sowohl eitriger als auch muköser Natur wirksam gezeigt hatte. Webb, J. Thoracic & Cardiovascular Surg., Bd. 44, S. 330-343 (1962). Es wurde behauptet, daß das Reagenz sowohl zur Verflüssigung von Schleimhaut (dem Proteinbestandteil, der für einen Großteil der Viskosität in Schleimhautproben verantwortlich gemacht wird) als auch von DNA (deren Beitrag zur Viskosität eitriger Proben als wesentlich vorausgesetzt wird) fähig ist. Dieses Reagenz und die verwandte Verbindung Dithiothreitol (US-Patentschrift Nr. 3.502.779 (24. März 1970) erzielten eine vorzügliche Verflüssigung vieler muköser Präparate für eine Vielzahl von Zwecken, wie mittels Vergleich zu früheren Verfahrensweisen beurteilt. Obschon Sulfhydryl- Reagenzien unterstützend bei der Zerstörung von DNA-Proteinkomplexen (Nukleoproteingelen) wirken können, beeinträchtigen sie doch die Viskosität reiner DNA-Lösungen (die sehr viskös sein können) nicht, weshalb einige der frühen Forscher wahrscheinlich die Auswirkungen einer DNAse- und Protease- Kontamination ihrer Präparate beobachteten. Die hemmende Wirkung von DNA auf Proteasen wurde von einigen der frühesten Forscher erkannt. Daher wurde behauptet, daß Sulfhydryl-Reagenzien allein den Beitrag zur Viskosität sowohl des Proteins als auch der DNA handhaben könnten, was andere davon abgehalten haben könnte, die Nützlichkeit einer Kombination von Sulfhydryl-Reagenzien und DNAse zu untersuchen.
In neueren Arbeiten, bei denen versucht wurde, die rheologischen Eigenschaften von Sputum in quantitativerer Weise als bei früheren Studien zu messen, haben die Forscher allgemein die Wirkung von DNA auf die Sputum-Viskosität unberücksichtigt gelassen. Sie haben keine Korrelation zwischen dem DNA-Gehalt und der Viskosität festgestellt; sie scheinen jedoch nicht vollkommen erfaßt zu haben, daß die durch die DNA beigetragene Viskosität sowohl von ihrem physikalischen Zustand als auch der Menge abhängt. Große, doppelsträngige DNA ergibt eine wesentlich viskösere Lösung als kurze oder einzelsträngige Fragmente.
Trotz der frühen Erkenntnis, daß verschiedene muköse Sekretionen variable Eigenschaften aufweisen und daß diese Variationen zu den Differenzen bei den relativen Mengen an vorhandenem mukösem Glycoprotein und DNA in Bezug stehen könnten, haben also keine Forscher vom Versuch einer Kombination von Sulfhydryl-Reagenzien und DNAse zur Verflüssigung von mukösen Präparaten berichtet.
Die zur Verflüssigung von Sputum und anderen mukösen oder viskösen biologischen Proben in Zusammenhang mit einem bakteriellen Assay verwendeten Verfahren und Zusammensetzungen haben verschiedene Nachteile gezeigt. Verdünntes NaOH verflüssigt Sputum, ist jedoch weniger wirksam als Dithiothreitol (DTT) und tötet außerdem viele Bakterien ab und zerstört die bakterielle RNA. (Diese RNA steht daher zur Durchführung der Nukleinsäure-Hybridisierungsassays nicht zur Verfügung.) Metallchelatoren, wie z. B. EDTA, wurden ohne größeren Erfolg verwendet. Ascorbinsäure/Kupfersulfat/Natriumpercarbonat-Gemische sind weniger wirksam als DTT und außerdem bei der Anwendung gefährlich. Detergenzien wie Natriumdodecylsulfat sind für viele Bakterien giftig, weniger wirksam als DTT und beeinträchtigen die Anfärbemethoden. Natriumhypochlorit beeinträchtigt ebenfalls die Anfärbemethoden, tötet viele Bakterien ab und ist etwas unangenehm in der Handhabung.
Über Fragen bezüglich der Verflüchtigung von Sputum und anderen mukösen oder viskösen Proben hinaus hat sich die Isolierung oder Konzentrierung bakterieller Spezies aus solchen Proben in bestimmten Fällen als problematisch erwiesen. Besonders Bakterien der Gattung Mycobacterium lassen sich nur schwer in zufriedenstellenden Mengen aus Sputumproben abtrennen, da ihre Dichte der von Wasser nahekommt, was die Zentrifugation unwirksam macht.
Die Organismen der Gattung Mycobacterium sind für eine signifikante Erkrankungs- und Sterberate bei Menschen verantwortlich. Bei M. tuberculosis handelt es sich um den klinisch signifikantesten mykobakteriellen Krankheitserreger. Im Jahre 1983 waren schätzungsweise 50.000 Amerikaner bei 23.846 berichteten Fällen an Tuberkulose erkrankt. TB Staticstics. States and Cities, Morbidity and Mortality Weekly Report, Bd. 33, S. 62 (1983). Weltweit ist die Tuberkulose für etwa 3 Mio. Todesfälle jährlich verantwortlich. Youmans, G. P., Tuberculosis, S. 107, W. B. Saunders (Philadelphia: 1979). Die klinisch zweitsignifikanteste Gruppe von Mykobakterien ist der M. avium-Komplex, der sich aus M. avium und M. intracellulare zusammensetzt. Good & Snider, J. Infect. Dis., Bd. 146, S. 829-833 (1982).
Die herkömmlichen Verfahren zum Nachweisen, Isolieren und Identifizieren der Spezies Mycobacterium umfassen säurefeste Anfärbeverfahren, Kulturmethoden und biochemische Nachweisverfahren. Das potentielle Vorhandensein von Mykobakterien wird durch eine mikroskopische Untersuchung einer Probe bestimmt, die mit einem geeigneten Anfärbemittel behandelt wurde. Das Vorhandensein säurefester Bazillen zeigt das Vorhandensein von Mykobakterien an. Auf den anfänglichen Nachweis der Mykobakterien hin kann die Probe weiter verarbeitet und kultiviert werden. Die beiden am häufigsten verwendeten Kulturmedien sind die Lowenstein-Jensen-Medien und die Middlebrook-Medien. Nach der Anzüchtung werden weitere Differentialtests zur Identifizierung der vorliegenden mykobakteriellen Spezies angewandt. Das Center for Disease Control hat eine Reihe von 18 Tests empfohlen, die eine spezifizische Identifizierung von nahezu 90 Prozent der mycobakteriellen Spezies ermöglicht. Kubica, G. P. in The Mycobacteria: A Sourcebook, Teil A (Kubica & Wayne, Hg.), S. 133-175, Marcel Dekkar (New York: 1984).
Die zur Auskonzentrierung der Mykobakterien aus Sputum angewandten Methoden umfaßten ebenfalls zunächst die Behandlung mit DTT (zur Verflüssigung) und NaOH (zur Abtötung nicht-mykobakterieller Spezies und zur Freisetzung der Mykobakterien von assoziierten weißen Blutkörperchen), gefolgt von etwa 15minütiger Zentrifugierung bei 3.800 · g und Neutralisation der Lösung. Die Rückgewinnung pelletierter Mykobakterien ist ineffizient, weshalb diese Methode normalerweise nicht auf ein empfindliches Assay-Verfahren angelegt wird, da die Rückgewinnung nicht quantitativ ist. Weiterhin kann das verwendete NaOH-Reagenz, wenn in der Probe zu lange unneutralisiert, die Mykobakterien abtöten. Weitere Konzentrationsmethoden, umfassend eine Chloroform-Extraktion, Flokkulation, Flotations- Zentrifugation und das Einfangen in Aluminiumhydroxid- oder Magnesiumhydroxid gelen, haben sich als weitgehend ineffektiv oder problematisch erwiesen und werden heutzutage nicht breit angewandt. (Siehe Überblick von Willis, H. S., und Cummings, M. M., Diagnostic and Experimental Methods in Tuberculosis (1952) Springfield: C. C. Thomas.) Die Hochgeschwindigkeits-Ultrazentrifugation, obwohl geringfügig besser in der in der Konzentrierung von Mykobakterien als eine routinemäßige Zentrifugation, ist kostspielig und erbringt keine quantitative Rückgewinnung.
In EP-A-166164 ist ein Verfahren zum Nachweisen von Infektionen mit einem Krankheitserreger in einem Wirt beschrieben, welches Verfahren das Lysieren von Phagozyten aus dem Wirt zur Freisetzung löslicher Komponenten des Krankheitserregers umfaßt, die anschließend unter Anwendung eines spezifischen Bindungsassays nachgewiesen werden.
In US-A- 4508821 ist ein Verfahren zum Nachweisen intrazellulärer Bakterien in einer Blutprobe durch Anfärbung mit Ethidiumbromid und mikroskopischer Beobachtung unter Anwendung von Fluoreszenz beschrieben. Die Bakterien können in Vollblut vorliegen oder können wahlweise vor dem Anfärben teilweise isoliert oder gereinigt werden.
In US-A-4717660 ist ein Verfahren zum Nachweisen von Mikroorganismen, z. B. Bakterien, in einer Vollblutprobe beschrieben, welches das Anfärben der Mikroorganismen mit einem fluoreszierenden Farbstoff und Beobachten der Fluoreszenz-Emission eines ausgebreiteten Leukozytenfilms umfaßt.
In WO 87/02710 sind Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von Coxiella Bumetii in biologischen Proben und ein Verfahren zum Differenzieren von solchen Stämmen der C. Bumetti beschrieben, die unter diesen, chronische Erkrankungen verursachenden Stämmen zur Verursachung akuter Erkrankungen in der Lage sind. Die Verfahren umfassen die Behandlung von in der biologischen Probe enthaltenen Zellen zur Exponierung der zellulären DNA und die Hybridisierung der DNA mit einer C. Burnetti-spezifisch markierten DNA-Sonde.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Konzentrierung von Bakterienspezies, wie z. B. Mykobakterien, was wahlweise die Verflüssigung muköser Sekretionen und anderer visköser biologischer Proben umfaßt, besonders im Zusammenhang mit Assays zum Nachweis des Vorhandenseins oder der Abwesenheit ausgewählter Bakterienspezies in biologischen Proben.
Die Patentanmeldung, von der die vorliegende Anmeldung abgeteilt ist, richtet sich auf verbesserte Verfahren und Zusammensetzungen zur Verflüssigung muköser Sekretionen und anderer visköser biologischer Proben unter Verwendung einer Verflüssigungskombination, umfassend ein Reduktionsmittel der Disulfidbindung und ein DNA-verdauendes Agens.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Konzentrierung einer Bakterienspezies aus einer biologischen Probe (einschließlich, doch nicht beschränkt auf visköse biologische Proben, wie z. B. Schleimsekretionsproben.) Gemäß dieses Aspekts Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren und die Methoden bereitgestellt, mit dem mit weißen Blutkörperchen in einer biologischen Probe assoziierte Bakterien durch direkte Abtrennung der intakten weißen Blutkörperchen durch Zentrifugieren konzentriert werden, um ein Pellet zu erhalten, das diese weißen Blutkörperchen und einen Überstand umfaßt; woraufhin die weißen Blutkörperchen selektiv lysiert werden unter Verwendung eines Lysiermittels, das die Verdauung der freigesetzten DNA durch ein zur Verdauung von DNA fähiges Enzym nicht verhindert. Die interessierenden Bakterien bleiben im wesentlichen zellulär intakt.
Es wird erkennbar sein, daß die hierin beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen auf einem breiten Bereich von Bakterien-Assaymethoden anwendbar sind, einschließlich von Nukleinsäurehybridisierungs-, Kultur- und Anfärbemethoden.

Ausführliche Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft verbesserte Verfahren und Zusammensetzungen, die beim Untersuchen von Schleimsekretionsproben oder anderen biologischen Proben auf das Vorhandensein einer ausgewählter Bakterienspezies nützlich sind. Die Erfindung beschreibt besonders verbesserte Verfahren zur Bestimmung einer vorliegenden Infektion einer Schleimsekretionsprobe von beispielsweise Sputum, Zervikalschleim, Bronchialschleim, Vaginalschleim oder anderem von einem Menschen oder Tier erhaltenen Schleim mit einer bestimmten Bakterienspezies. Die Erfindung kann auch auf andere biologische Proben oder Präparate angewandt werden, wie zum Beispiel Urin, Hirnflüssigkeit, Vollblut oder andere Körperflüssigkeiten oder Sekrete.
Die vorliegende Beschreibung ist auf eine Anzahl von Problemen gerichtet, die sich bisher bei der Durchführung solcher Assays ergaben. Die Hauptanmeldung betrifft verbesserte Methoden zur Erzielung der Verflüssigung von Schleimsekretionsproben, wie z. B. Sputum, und anderen viskösen biologischen Proben. Solch eine Verflüssigung ist zum Erhalt von Proben erforderlich, die wirksam und akkurat auf die ausgewählte Bakterienspezies hin untersucht werden können.
Es wird eine Verflüssigungskombination angewendet, umfassend ein Reduktionsmittel der Disulfidbindung und ein DNA-verdauendes Agens. Ein bevorzugtes Reduktionsmittel ist Dithiothreitol, wohingegen ein bevorzugtes DNA-verdauendes Agens aus Rinderpankreas ausgereinigte Desoxyribonuklease I ist. Diese Bestandteile sind repräsentativ für Reagenzien, die in Kombination außerordentlich wirksam Schleimsekretionsproben verflüssigen und mit weiteren Anforderungen an einen erfolgreichen Assay auf ausgewählte Bakterienspezies in solchen Proben ähnlich kompatibel sind. Obschon in der Vergangenheit eine Reihe von Verflüssigungsverfahren angewandt wurden, wird keines davon für ähnlich wirksam wie dieses neu beschriebene Verfahren gehalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft verbesserte Verfahren zur Konzentrierung ausgewählter Bakterienspezies aus Schleimsekretionsproben oder anderen biologischen Proben für Nachweiszwecke des Vorhandenseins solcher Spezies. Im besonderen ergaben sich nach dem Stand der Technik beträchtliche Schwierigkeiten beim Konzentrieren oder Isolieren solcher Bakterien, wie z. B. des Stamms Mycobacterium, da diese Bakterien bei herkömmlichen Präparat-weiterverarbeitenden Medien sich nicht zur Abtrennung unter Anwendung herkömmlicher Methoden wie der Zentrifugation eignen. Gemäß der Erfindung werden mit den Bakterien assoziierte weiße Blutkörperchen durch Zentrifugation konzentriert, und dann selektiv lysiert unter Verwendung eines Lysiermittels, das die Verdauung von freigesetzter DNA durch ein zur Verdauung von DNA fähiges Enzym nicht verhindert. Die Bakterien bleiben im wesentlichen zellulär intakt und können dann unter Verwendung eines DNA-verdauenden Agens verflüssigt werden. Die konzentrierten Bakterien, zum Beispiel Mykobakterien, können in der konzentrierten Probe unter Anwendung von hierin beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen untersucht werden.
Die hierin beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen eignen sich zur Verwendung bei einer Reihe bakterieller Assay-Systeme, einschließlich säurefester Anfärbemethoden, Kulturmethoden, biochemische Nachweismethoden und im besonderen Nukleinsäure-Hybridisierungsmethoden. Die Erfindung eignet sich besonders zur Untersuchung auf das Vorhandensein von Mykobakterien in Sputumpröben.
Nukleinsäure-Hybridisierungsmethoden werden bei der vorliegenden Erfindung besonders zur Identifizierung von Mykobakterien direkt aus Sputum oder anderen Schleimsekretionsproben innerhalb von drei Stunden der Probenverarbeitung verwendet. Nukleinsäure-Hybridisierungsassays basieren auf der Fähigkeit komplementärer Nukleinsäure-Stränge, sich zur Bildung doppelsträngiger Komplexe zusammenzutreten. Siehe allgemein Minson & Darby, "Hybridization Techniques" in New Developments in Practical Virology, S. 185-229, Alan R. Liss, Inc. (New York: 1982). Derartige Assays sind von Gen-Probe, Inc. (San Diego, California) beziehbar. Sie können zum Beispiel eine ¹²&sup5;I-markierte einzelsträngige DNA-Sonde, die komplementär zur ribosomalen RNA des Zielorganismus ist, verwenden (Kohne, et al., in Legionella: Proceedings of the 2nd International Symposium (Thornsberry, et al., Hg.) S. 107-108, American Society for Microbiology (Washington: 1984)). Nach Freisetzung der ribosomalen RNA aus dem Organismus unter Verwendung einer Lysiermethode, verbindet sich die ¹²&sup5;I-DNA-Sonde mit der ribosomalen RNA des Zielorganismus und bildet einen stabilen DNA : RNA-Hybrid. Die verbleibende markierte, nicht-hybridisierte Sonde wird von der hybridisierten DNA-Sonde unter Verwendung einer Suspension zur Festphasenabtrennung abgetrennt. Die absorbierten markierten DNA : RNA-Hybride werden in einem Gamma-Zähler gezählt und die Testergebnisse als das Verhältnis von Zählungen bei der Patientenprobe zu Zählungen bei einer negativen Kontrolle errechnet.
Bei jedem der oben erörterten Assaymethoden wird ein Verflüssigungsschritt angewandt, um das Ausgangssputum oder eine andere Schleimsekretionsprobe oder andere visköse biologische Probe weniger viskös zu machen. Die Viskosität des Sputums ist teilweise dem Vorhandensein von Glycoproteinen im Schleim zuzuschreiben. Außerdem kann eitriges (infiziertes) Sputum oder andere biologische Proben große Mengen an als Folge von Wirts-Abwehrreaktionen erzeugter visköser DNA aus zerstörten Bakterien (z. B. Mykobakterien) und aus abgestorbenen Blutkörperchen (hauptsächlich Makrophagen und Granulozyten) enthalten.
Ein Gemisch aus einem Reduktionsmittel der Disulfid-(Cystein-)-Bindung und einem DNA-verdauenden Agens, wie z. B. DNAse, können zur Erzielung der Verflüssigung einer Ausgangssputumprobe oder anderen viskösen oder mukösen biologischen Probe verwendet werden. Diese Agenzien sollten derart gewählt und angewandt werden, daß das Ausmaß der den Agenzien zuzuschreibenden Spaltung der Disulfidbindung und der Phosphodiesterbindung ausreicht, um in Kombination einen zufriedenstellenden Verflüssigungsgrad zu erzielen. Ein hochgradig bevorzugtes Reduktionsmittel der Disulfidbindung ist besonders Dithiothreitol (DTT), wohingegen ein hochgradig bevorzugtes DNA-verdauendes Agens aus Rinderpankreas ausgereinigte Desoxyribonuklease I (DNAse I) ist. Zu weiteren nützlichen Reduktionsmitteln der Disulfidbindung können N-Acetyl-cystein, Cystein und 2-Mercaptoethansulfonat zählen. Endonucleasen sind im allgemeinen als die wirksameren Verflüssigungsmittel gegenüber Exonucleasen bevorzugt.
Es wurde entdeckt, daß die Kombination derartiger Substanzen Verflüssigungsergebnisse erzielt, die die bisher durchgeführten oder im Fachbereich bekannten Methoden oder Zusammensetzungen übertreffen. Diese Substanzen scheinen kombiniert so zu arbeiten, daß das DTT-Reduktionsmittel beispielsweise die Sulfidbindungen spaltet, die die Proteinketten in den Glycoproteinen des Schleims überbrücken, wohingegen z. B. das DNAse-I-Enzym die in eitrigen Sputumproben vorhandenen DNA-Moleküle spaltet.
Eine Ausgangsprobe von Sputum oder einem anderen mukösen Sekret kann entweder durch sequentielles oder gleichzeitiges Zusammenbringen der oben erörterten Reduktions- und DNA-verdauenden Agenzien verflüssigt werden. Bei einer repräsentativen Methode wird 1 ml einer 0,01 M Lösung von DTT in 0,9% steriler Kochsalzlösung einem gleichen Volumen der Sputumprobe zugegeben. Die Probe wird dann gevortext, bis sie sich verflüssigt (gewöhnlich weniger als 1 Minute). Die Probe wird dann 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (18-25ºC) inkubiert und nochmals kurz gevortext. Das aufgelöste Sputum (2 ml) wird dann mit etwa 1 ml einer etwa 0,1 M Lösung von DTT in 0,9% steriler Kochsalzlösung in einem konischen 50-ml-Zentrifugierröhrchen kombiniert. Diesem Gemisch werden dann 4 Tropfen (etwa 190 Mikroliter) DNAse I (ausgereinigt aus Rinderpankreas; Sigma Chemical Co. oder Cooper Biomedicals, ca. 1000-2000 Kunitz-Einheiten/ml) bei einer Konzentration von ca. 7500 Kunitz-Einheiten/ml in 0,85% (Gew./Vol.) NaCl, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM CaCl&sub2; (0,02% Natriumazid-Konservierungsmittel) zugegeben. Das Gemisch wird kurz gevortext und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Etwa 30 ml 0,9% sterile Kochsalzlösung werden dann dem Zentrifugierkonus unter Rühren zugegeben und die Probe bei 1900-2100 · g über 5 Minuten hinweg in einem Korbkreiselrührer zentrifugiert.
Die DNAse-Lösung enthält vorzugsweise eine Quelle von Magnesium (Mg²&spplus;) und Calcium (Ca²&spplus;), die zur Aktivierung der enzymatischen Aktivität der DNAse, Stabilisierung des Enzyms während der Lagerung (Ca²&spplus;) und Stabilisierung der Zellwand der weißen Blutkörperchen in der Sputumprobe während der Zentrifugation dient. Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Entdeckung, daß die Konzentrierbarkeit (d. h. Abtrenn- oder Isolierbarkeit) von Mykobakterien aus Sputumproben zu einer konzentrierten Probe stark erhöht ist, wenn die weißen Blutkörperchen (hauptsächlich Makrophagen im Falle mukösen Sputums) in der Probe während der Konzentrierung der Bakterien zellulär intakt erhalten werden. Dieses Ergebnis scheint auf die Tatsache rückführbar zu sein, daß solche weißen Blutkörperchen während der Immunreaktion sich in hohem Maße mit den Zielbakterien, z. B. Mykobakterien, assoziieren. Eine solche Assoziation kann in Art einer Aufnahme von Bakterien in das Innere der weißen Blutkörperchen oder einer Oberflächenhaftung der Zellen an die Bakterien erfolgen. Die vorliegende Erfindung nutzt diese Assoziation zur Verbesserung der Konzentrier- und Isolierbarkeit der Zielbakterien durch Anwendung eines herkömmlichen Zentrifugierschritts bei leicht erreichbaren Spin-Geschwindigkeiten aus.
Angesichts dieser bedeutenden Entdeckung ist klar, daß jegliche, zur Verflüssigung der Ausgangs-Sputumprobe verwendete Zusammensetzung so gewählt werden muß, daß eine schnelle und vollständige Verdauung der Glycoprotein- und DNA- Komponenten des Schleims möglich ist und zugleich die zelluläre Unversehrtheit der in der Probe vorliegenden weißen Blutkörperchen praktisch nicht zerstört wird. Es liegt nahe, daß eine Komponente wie Mg²&spplus; oder Ca²&spplus;, die die Verdauung (Verflüssigung) des Sputums oder einer anderen Schleimsekretionsprobe bei gleichzeitiger Förderung der Stabilität der weißen Blutkörperchen unterstützt, erwünscht ist.
Es wird darüber hinaus aus der folgenden Erörterung erkennbar werden, daß die Verwendung einer sorgfältig gewählten Kombination von Präparat-verdauenden Agenzien, wie den hierin beschriebenen, für das Gesamtschema eines erfolgreichen Assays von großem Vorteil ist. Besonders die Verwendung einer DNAse oder anderen Nuklease in Zusammenhang mit einem Assay vom Typ der Nukleinsäure- Hybridisierung würde unter normalen Umständen als nachteilig erachtet werden aufgrund der Tatsache, daß solche Enzyme die später im Assay verwendete Hybridisierungs-Sonde und/oder bakterielle Zielnukleinsäuren verdauen würden.
Dieses Problem kann allerdings umgangen und ein DNAse-verdauendes Agens in sehr vorteilhafter Weise eingesetzt werden, indem eine Klasse der DNAse verwendet wird, die sich während späterer Verarbeitungsstufen spezifisch inaktivieren läßt. Ebenso wichtig ist jedoch die Tatsache, daß die hierin zu verwendenden DNAsen ihre Aktivität selbst in Gegenwart weiterer Agenzien, wie z. B. Zellysiermittel, beibehalten, wie sie bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung auch verwendet werden. Daraus ist zu ersehen, daß die Kombinationen der Verflüssigungsmittel (zur Probenverdauung), wie hierin beschrieben, bemerkenswert gute Verflüssigungsergebnisse erzielen, und darüber hinaus sorgfältig auf die Durchführung des Gesamtassays abgestimmt sind. Aus Rinderpankreas ausgereinigte Pankrease I stellt ein Beispiel eines DNA-verdauenden Agens dar, das zur Beibehaltung seiner Aktivität in Gegenwart eines Zellysierreagenz (besonders Natriumdesoxycholat) in der Lage ist, weshalb dieses DNA-verdauende Agens bevorzugt ist.
Die funktionellen Anforderungen, die an für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignete Verflüssigungsmittel gestellt werden, beziehen sich auf Verfahrensschritte, die der Verflüssigung und Zentrifugation der weißen Blutkörperchen folgen. Das aus der Zentrifugation resultierende Pellet, das intakte weiße Blutkörperchen und assoziierte Bakterien enthält, wird durch Abschöpfen des Überstands isoliert. Der Überstand kann nach der Verflüssigung der Schleimsekretionsprobe durch Verdauung verdaute oder abgetötete weiße Blutkörperchen und Bakterien, überschüssiges DTT und DNAse und restliche Glycoproteine und DNA enthalten. Zu diesem Zeitpunkt werden die Bakterien dann von den intakten weißen Blutkörperchen zum Beispiel durch Lysieren der weißen Blutkörperchen abgetrennt. Obschon eine Anzahl von Verfahren zum Lysieren der Zellen im Fachbereich bekannt sind, ist es für die Durchführung der vorliegenden Erfindung am vorteilhaftesten, ein Lysierreagenz zu verwenden, das die weißen Blutkörperchen lysieren und die assoziierten Bakterien freisetzen kann und dabei zugleich die freigesetzten Bakterien intakt erhält.
Die vorliegende Erfindung verwendet ein Lysiermittel, das die Aktivität mindestens einer DNAse nicht hemmt, welche DNAse anschließend der lysierten konzentrierten Probe zur Verdauung des aus den weißen Blutkörperchen (oder anderen lysierten Zellen, falls vorhanden) freigesetzten DNA-Materials zugegeben werden kann.
Im Falle einer ausgewählten bakteriellen Spezies, die mittels Kulturmethoden, Anfärbemethoden oder Nukleinsäure-Hybridisierungsmethoden untersucht werden soll, kann die Erhaltung der ausgewählten Bakterienspezies in zellulär intakter Form nach dem Lysieren der weißen Blutkörperchen wesentlich sein. Für Kulturmethoden beispielsweise sind lebensfähige Zellen für die spätere Züchtung erforderlich, während Anfärbemethoden gewöhnlich zumindest zellulär intakte Bakterien verlangen. Obschon der Bakterien-Assayschritt bei einem Nukleinsäure- Hybridisierungsassay das Lysieren der ausgewählten Bakterienspezies einbezieht, ist es nichtsdestotrotz von Vorteil, die Bakterien in zellulär intaktem Zustand vor dem abschließenden Hybridisierungsassayschritt zu erhalten, da verfrühtes Lysieren die Ziel-RNA oder -DNA innerhalb der Bakterien für RNAsen und DNAsen freilegt, die in den konzentrierten Proben vorhanden sein können. Solche Nukleasen können beispielsweise aus lysierten weißen Blutkörperchen, von anderen Zellen, die im Pellet lysiert sind, oder aus restlichem Sputum in der konzentrierten Probe nach der Zentrifugation und Abschöpfung des Überstands stammen. Außerdem wird den konzentrierten Proben aus lysierten weißen Blutkörperchen vorzugsweise zusätzliche DNAse zugegeben, um aus diesen Zellen oder anderen lysierten Organismen freigesetzte DNA zu verdauen, welche DNAse die DNA der zur Untersuchung ausgewählten Bakterienspezies angreifen könnte, wenn solche Spezies nach dem Lysieren der konzentrierten Probe aus pelletierten weißen Blutkörperchen nicht zellulär intakt wäre. Aus all diesen Gründen ist es bevorzugt, die weißen Blutkörperchen in einer Weise zu lysieren, die die zur Untersuchung ausgewählte Bakterienspezies zellulär intakt beläßt.
Im Falle von Mykobakterien wurde entdeckt, daß das Lysierreagenz Natriumdesoxycholat zum Lysieren von mit den Mykobakterien in der konzentrierten Probe assoziierten weißen Blutkörperchen in der Lage ist, während sie die Mykobakterien gegen eine Zerstörung der mykobakteriellen RNA durch RNAsen oder andere in der konzentrierten Probe vorhandene Komponenten zellulär intakt belassen. Es wird angenommen, daß die Mykobakterien auch gegenüber Natriumdesoxycholat in einem Maße zellulär intakt bleiben, daß sie nach der Lyse der weißen Blutkörperchen mit diesem Lysierreagenz kulturfähig bleiben. Andere Bakterien, wie z. B. enterische Galle-resistente Pathogene, einschließlich Salmonella und Shigella, sind ebenfalls Beispiele für Bakterienspezies, die beim Lysieren der assoziierten weißen Blutkörperchen mit Natriumdesoxycholat zellulär intakt bleiben.
Weitere Salze von Desoxycholat können ebenfalls zur Erzielung der selektiven Lysierung geeignet sein, ebenso wie weitere Lysierreagenzien. Zu beachten ist, daß jegliches Lysierreagenz, das sich zur Durchführung der hierin beschriebenen selektiven Lyse eignet, d. h. der Lysierung der konzentrierten weißen Blutkörperchen in einer Weise, welche die interessierenden ausgewählten Bakterienspezies in einer zellulär intakten Form freisetzt, sich im Rahmen der beanspruchten Erfindung befindet. Wie hierin verwendet, ist ein Bakterium "zellulär intakt" bezüglich einer gegebenen Assay-Methodik, wenn das Bakterium in einer physikalischen Form erhalten wird, die es im Sinne dieser Methodik untersuchbar beläßt. So erfordert ein Kulturassay allgemein, daß die zur Untersuchung ausgewählten Bakterien im Ausmaß der Lebensfähigkeit in Kultur zellulär intakt bleiben, während ein Nukleinsäure-Hybridisierungsassay allgemein erfordert, daß die Bakterien in dem Ausmaß zellulär intakt bleiben, daß die Ziel-RNA oder -DNA im Bakterium vor Angriffen z. B. durch RNAse- oder DNAse-Reste in der Probe geschützt sind.
Weitere Definitionen von "zellulär intakt" können anderen Assay-Methoden angemessen sein. Darüber hinaus kann ein weißes Blutkörperchen auf die oben beschriebenen Verflüssigungs- und Konzentrationsschritte hin als zellulär intakt betrachtet werden, wenn die Zelle zur Beibehaltung eines nützlichen Assoziationsgrad mit den Zielbakterien während des Konjugationsschritts in der Lage ist.
Auf die Lyse der konzentrierten Probe aus pelletierten intakten weißen Blutkörperchen hin verwandeln freigesetzte intrazelluläre Komponenten einschließlich DNA die konzentrierte Probe üblicherweise zu einer Form, die zur bequemen Weiterverarbeitung in den nachfolgenden Assayschritten zu viskös ist. Daher ist es nützlich, der lysierten konzentrierten Probe von weißen Blutkörperchen eine DNAse oder ein anderes Enzym zuzugegeben, das zum Verdauen des aus den weißen Blutkörperchen oder anderen lysierten Zellen in der konzentrierten Probe freigesetzten Nukleinsäure-Materials fähig ist. Daher sollte das zur Lyse der weißen Blutkörperchen verwendete Lysierreagenz ein solches sein, das die Aktivität mindestens einer DNAse oder eines anderen für diesen Verdauungsschritt nach der Lyse geeigneten Enzyms nicht hemmt. Auch hier handelt es sich bei Natriumdesoxycholat um ein derartiges Lysierreagenz. Im Gegensatz dazu wird vom Lysierreagenz Natriumdodecylsulfat angenommen, daß es die meisten DNAsen und RNAsen inaktiviert; es stellt ein Beispiel eines Reagenz dar, das vorzugsweise nicht zur Lysierung der konzentrierten Probe aus weißen Blutkörperchen verwendet wird, sofern eine anschließende Verdauung unter Verwendung einer Nuklease erwogen wird.
Der DNA-Verdauungsschritt nach der Lyse der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung von aus Rinderpankreas ausgereinigter DNAse I vorgenommen werden, um eine verflüssigte und lysierte konzentrierte Probe zu erhalten. Diese DNAse ist dieselbe wie bei der anfänglichen Verflüssigung der Ausgangs- Schleimsekretionsprobe verwendet und ist bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Weitere DNAsen können ebenfalls verwendet werden und befinden sich im Rahmen der Erfindung. Wie oben angemerkt, sollte ein Verdauungsagens gegenüber dem zur Lyse der konzentrierten Probe von weißen Blutkörperchen verwendeten Lysierreagenz stabil sein. Das Verdauungsagens sollte in einem Umfang gewählt werden, der berücksichtigt, daß es bei späteren Verarbeitungsschritten zur Inaktivierung der DNAse oder mit anderen Verdauungsmittel nach der Lyse, wie z. B. bei einem Nukleinsäure-Hybridisierungsassay, bei dem aus komplementärer DNA zusammengesetzte Sonden zugegeben werden, von Vorteil ist. DNAse I aus Rinderpankreas erfüllt diese Anforderungen.
Die Lyse der konzentrierten Probe, enthaltend mit der Bakterienspezies von Interesse (sofern solche in der Probe vorliegen) assoziierte pelletierte intakte weiße Blutkörperchen wird nach dem Abschöpfen des Überstands vorgenommen. Eine geeignete Menge des Lysierreagenz, welche im Falle von Natriumdesoxycholat (16% in Wasser) etwa 2 Tropfen (etwa 60 Mikroliter) für eine Ausgangs-Sputumprobe von 1 ml beträgt, wird dem Pellet aus weißen Blutkörperchen zugegeben. Das Pellet wird dann unter Verwendung eines Vortex-Mixers resuspendiert und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Im Anschluß an den Lysierschritt wird ein DNA-verdauendes Agens, z. B. eine DNAse, der konzentrierten Probe zugegeben. Im Falle einer Lösung, enthaltend 7446 Kunitz-Einheiten/ml der Rinderpankreas-DNAse I enthält ein Tropfen (etwa 50 Mikroliter) ausreichend Enzym, um die aus den weißen Blutkörperchen während des Lysierschritts freigesetzte DNA ausreichend zu verdauen und zu verflüssigen. Das Verdauungsgemisch wird etwa 5 Minuten lang bei etwa 20-25ºC inkubiert, was eine konzentrierte Probe ergibt, die für weitere Assay-Schritte ausreichend verflüssigt ist. Soll die jetzt lysierte und verdaute Probe nicht sofort auf das Vorhandensein einer ausgewählten Bakterienspezies getestet werden, so kann sie in einigen Fällen, z. B. aus Mykobakterien, bei etwa 2-8ºC etwa 24 Stunden lang gelagert werden.
Bakterien des Gattung Mycobacterium sind relativ resistent gegen eine Zerstörung ihrer zellulären Unversehrtheit, und zwar teilweise aufgrund ihres hohen Gehalts an wachsartigen Lipidstoffen in ihren Zellwänden. Solche Bakterien bleiben für die Zwecke der Methoden des Nukleinsäure-Hybridisierungsassays gegenüber Lysierreagenzien wie Natriumdesoxycholat und Natriumdodecylsulfat zellulär intakt. Andere Bakterienspezies, die gegenüber einem zur Lyse weißer Blutkörperchen in der zentrifugierten konzentrierten Probe fähigen Lysierreagenz stabil sind, können ebenfalls gemäß den oben beschriebenen Konzentrations-, Lysier- und Verdauungschritten behandelt werden. Wie oben angemerkt, können enterische Galle-resistente Pathogene in diese Kategorie fallen. In anderen Fällen allerdings bleibt die zur Untersuchung ausgewählte Bakterienspezies beispielsweise beim Lysierschritt der weißen Blutkörperchen möglicherweise nicht ausreichend zellulär intakt. In einem solchen Fall können die Methoden der vorliegenden Erfindung vorbehaltlich gewisser Modifikationen trotzdem in vorteilhafter Weise angewandt werden.
Erstens ist die Methode, bei der die zu untersuchende ausgewählte Bakterienspezies aus einer Sputum-Probe durch Isolieren der mit den Bakterien assoziierten weißen Blutkörperchen auskonzentriert wird, eine allgemeine, auf einen breiten Bereich bakterieller Spezies anwendbare Methode. Diese Methode kann als einleitender Konzentrationsschritt eingesetzt werden unabhängig z. B. von Problemen der zellulären Unversehrtheit, wie sie bei anschließenden Verfahrensschritten vorliegen können.
Im Falle eines Nukleinsäure-Hybridisierungsassays soll erwünschterweise verhindert werden, daß der Nukleinsäuregehalt der zu untersuchenden Bakterienspezies Stoffen wie DNAsen und RNAsen ausgesetzt wird, die die Nukleinsäuren zerstören könnten. Kann die Bakterienspezies von Interesse nicht in einem zellulär intakten Zustand auf die Lyse der weißen Blutkörperchen hin erhalten werden, so kann es erwünscht sein, direkt zu einem Lysierschritt überzugehen, der jegliche DNAsen oder RNAsen, die in der lysierten konzentrierten Probe vorhanden sein können, gleichzeitig inaktiviert. So können z. B. die pelletierten weißen Blutkörperchen mit Natriumdodecylsulfat lysiert werden, welches hemmend oder denaturierend auf die DNAsen und RNAsen wirkt, gefolgt von einem Beschallungsschritt, der freigesetzte Nukleinsäure (hauptsächlich DNA) spalten kann und die lysierte konzentrierte Probe weniger viskös macht. Alternativ dazu kann ein Lysierreagenz wie Natriumdesoxycholat, das DNAsen oder RNAsen allgemein nicht inaktiviert, in Verbindung mit einem RNAse-Inhibitor und einer zugesetzten DNAse verwendet werden. Diese Kombination verdaut aus den lysierten weißen Blutkörperchen und Bakterien freigesetzte RNA, wodurch die konzentrierte Probe weniger viskös wird, und verhindert gleichzeitig den Abbau bakterieller RNA-Moleküle, die als Ziele der Hybridisierung im Nukleinsäure-Hybridisierungsassay dienen sollen. Natürlich müßte die zugesetzte DNAse vor Zugabe irgendeiner DNA-Hybridisierungssonde zur Probe inaktiviert oder alternativ dazu eine RNA-Sonde verwendet werden.
Die ausgewählte Bakterienspezies kann im Anschluß an die Konzentrierung der weißen Blutkörperchen in der konzentrierten Probe untersucht werden. Bevorzugt folgt der Untersuchungsschritt der oben beschriebenen Lysierung und Verdauung. Soll die ausgewählte Bakterienspezies kultiviert werden, so kann die konzentrierte Probe behandelt werden, um unerwünschte Spezies abzutöten, wobei zugleich die ausgewählte Spezies erhalten wird. Im Falle von Mykobakterien, die relativ langlebig sind, kann dieser Schritt durch Behandeln der konzentrierten Probe (die lysiert und verdaut wurde) mit verdünntem Natriumhydroxid erzielt werden. Alternativ dazu hat sich gezeigt, daß die Behandlung mit Natriumdodecylsulfat viele andere Bakterienspezies als Mykobakterien selektiv abtötet. Eine andere Methode zur selektiven Kultivierung der ausgewählten Bakterienspezies ist die Verwendung eines Kulturmediums, das das Wachstum aller oder der meisten Mikroorganismen außer des Bakterienstamms von Interesse hemmt.
Eine bevorzugte Untersuchungsmethode auf das Vorhandensein der ausgewählten Bakterienspezies umfaßt Nukleinsäure-Hybridisierungstechniken. Eine quantitative Probe (zum Beispiel 100 ul) der wie oben beschrieben präparierten lysierten und verdauten konzentrierten Probe, die beispielsweise zellulär intakte Mykobakterien enthält, wird in einen Behälter zum Lysieren der Bakterien eingebracht. Die Bakterienlyse sollte nicht vor Inaktivierung der DNAsen und RNAsen in der Probe vorgenommen werden, da diese Nukleinsäure-Hybridisierungsvorgänge beeinträchtigen könnten. Natriumdodecylsulfat kann als ein solches Inaktivierungsmittel verwendet werden; es dient darüber hinaus zur Löslichmachung von Proteinen und anderen Zellbestandteilen. Ein Lysier-Glasröhrchen, enthaltend Glaskugeln und ein Lysierreagenz wie z. B. Natriumdodecylsulfat, dessen Verwendung in EP-A-0 288 618 beschrieben ist, eignet sich für diesen Bakterienlyseschritt besonders. Die Lysierröhrchen werden mit einer Kappe versehen, in einen Wasserbad-Beschaller (50-70ºC) eingebracht und etwa 15 Minuten lang beschallt. (Um einen optimalen Energietransfer zu gewährleisten, wird das Wasser im Wasserbad-Beschaller vor diesem Vorgang der etwa 15minütigen Beschallung vorzugsweise entgast.)
Auf die Beschallung hin kann die lysierte konzentrierte Bakterienprobe einem Nukleinsäure-Hybridisierungsassay, wie z. B. in EP-A-0 229 442 beschrieben, unterzogen werden. Das Sondenreaktionsgemisch kann Detergenz-artiges Reagenz wie Diisobutylsulfosuccinat enthalten, welches zur Beschleunigung des Hybrodisierungsprozeß' und Hemmung jeglicher Aktivität von restlicher DNAse dient.

Beispiele

Beispiel 1: Lyse der weißen Blutkörperchen mit Natriumdesoxycholat; Eliminierung der Viskosität mit DNAse I

Sputum (0,25 ml) wurde mit einer Lösung von Dithiothreitol in Phosphat-Puffer (1 M Dithiothreitol, 0,1 M Natriumphosphat (pH 7,5)) unter Verwendung eines Vortex- Mixers gemischt. Eine Lösung von 30% Desoxycholat (0,5 ml) wurde zugegeben, was die Probe aufgrund der Freisetzung von DNA aus den Leukozyten sofort sehr viskös werden ließ. Zehn Mikroliter Desoxyribonuclease I (5 mg/ml) wurden zugegeben und die Probe nochmals gemischt. Die Viskosität verschwand nach Stehenlassen bei Raumtemperatur nach wenigen Minuten.
Das Experiment ergab, daß DNA zur Viskosität in Sputumproben beitragen konnte und daß DNAse I auf den Abbau der DNA und die Verminderung der Sputum- Viskosität bei Vorhandensein von 5% Natriumdesoxycholat hinwirken konnte. Das Experiment ergab außerdem, daß einige Sputumproben keine ausreichend hohen Gehalte an endogener DNAse aufweisen, um die DNA, die zur Viskosität beträgt, ausreichend abbauen zu können.

Beispiel 2: Lyse der weißen Blutkörperchen mit Natriumdesoxycholat; Eliminierung der Viskosität durch endogene DNAse-Aktivität

0,5 ml eitriges Sputum, enthaltend mehr als 50 Leukozyten pro 100x Abstrich bei mikroskopischer Untersuchung, wurden mit 0,5 ml 0,001 M Dithiothreitol in 0,01 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,5, gemischt. Die Probe wurde auf einem Vortex-Mixer wenige Sekunden lang gemischt und bei Raumtemperatur 15 Minuten lang stehengelassen, innerhalb welchen Zeitraums sie sich verflüssigt hatte. Eine Portion von 50 Mikrolitern wurde in ein Prüfröhrchen eingebracht und mit 2 Volumen 10% Natriumdesoxycholat gemischt, was zur sofortigen Viskositätszunahme führte. Die Viskosität verschwand dann innerhalb der nächsten 10-20 Sekunden.
Das Experiment ergab, daß das Aussetzen dem Dithiothreitol bei geringen Konzentrationen die weißen Blutkörperchen nicht lysierte oder deren DNA in einer Sputumprobe unter den angelegten Bedingungen nicht freisetzte. Die Zugabe von Natriumdesoxycholat lysierte die Zellen und setzte deren DNA frei, wodurch die Lösung viskös wurde. Die Viskosität nahm bei dieser Probe spontan ab, was der Wirkung der endogenen DNAsen zugeschrieben wurde.

Beispiel 3: Verflüssigung von mukösen Sputumproben mit Dithiothreitol und DNAse I

Zwölf Sputumproben aller Arten einschließlich blutiger und mucopurulenter wurden mit einem gleichen Volumen aufgelösten Reagenz, enthaltend 1 M Dithiothreitol, 0,1 M Tris-HOI (pH 8,0), 0,25% DNAse I, gemischt.
Alle Sputumproben verflüssigten sich prompt und vollständig.

Beispiel 3: Verflüssigung von Sputumproben mit Dithiothreitol und DNAse I bei zugesetztem Magnesium

Eine gepoolte Sputumprobe (aus 3 säurefesten, Abstrich-positiven Sputumproben) wurde mit einem gleichen Volumen 1 M Dithiothreitol, 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0) gemischt. Fünzig Mikroliter 0,1 M MgCl&sub2; wurden zusammen mit 10 ul DNAse I (20 mg/ml; 1400 Einheiten/mg; in 0,15 M NaCl, 50 mM CaCl&sub2;) zugegeben.
Die Sputumproben verflüssigten sich gut. Die Zugabe von MgCl&sub2; schien den Verflüssigungsprozeß im Vergleich zu zuvor behandelten Proben, bei denen das divalente Kation (für die DNAse-I-Aktivität erforderlich) nicht speziell zugesetzt worden war, zu beschleunigen.

Beispiel 5: Effizienz der Rückgewinnung von Mykobakterien durch Zentrifugieren der weißen Blutkörperchen

0,5 ml Sputum (säurefest positiv) wurden mit einem gleichen Volumen an 0,1 M Tris- HCl (pH 8,0), 1 M Dithiothreitol durch Vortexen gemischt. Das verflüssigte Sputum wurde 3 Minuten lang in einer klinischen Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde rückgewonnen und beiseite gestellt. Das Pellet wurde einmal mit 5 ml 0,15 M NaCl gewaschen. Die Proben wurden dann auf mykobakterielle rRNA durch Hybridisieren mit einer ¹²&sup5;I-markierten DNA-Sonde untersucht.
Die Kinetik der Hybridisierung ergab, daß mindestens 1,6 · 10&sup7; Mykobakterien pro 0,5 ml Sputum in der Zell-assoziierten Fraktion vorlagen. Keine Mykobakterien wurden in der Überstands-Fraktion nachgewiesen, und die maximale Anzahl, die ohne Nachweis vorhanden gewesen sein könnte, wurde mit etwa 2 · 10&sup6; pro ml berechnet. Die Zugabe mykobakterieller RNA zur Überstands-Fraktion, gefolgt durch einen Hybridisierungsassay, ergab, daß das negative Ergebnis beim Überstand nicht an Komponenten lag, die den Hybridisierungsassay hemmten. Es wurde gefolgert, daß Mykobakterien wirksam aus einer verflüssigten Sputumprobe bei relativ geringen Zentrifugalkräften pelletiert werden können.

Beispiel 6: Wiederholung der Assays unter Verwendung des Protokolls aus Beispiel 5 und vier anderen säurefesten positiven Sputumproben

Das in Beispiel 5 wiedergegebene experimentelle Protokoll wurde bei vier weiteren Sputumproben mit den folgenden Ergebnissen wiederholt:
Probe 1: Das Zellpellet enthielt insgesamt etwa 6 · 10&sup6; Mykobakterien; der Überstand enthielt insgesamt maximal 3 · 10&sup5; Mykobakterien.
Probe 2: Das Zellpellet enthielt insgesamt etwa 4 · 10&sup6; Mykobakterien; der Überstand enthielt insgesamt maximal 1 · 10&sup5; Mykobakterien.
Probe 3: Das Zellpellet enthielt insgesamt etwa 1 · 10&sup7; Mykobakterien; der Überstand enthielt insgesamt maximal 1 · 10&sup5; Mykobakterien.
Probe 4: Das Zellpellet enthielt insgesamt etwa 3 · 10&sup6; Mykobakterien; der Überstand enthielt insgesamt maximal 2 · 10&sup5; Mykobakterien.
Die Experimente bestätigten, daß Mykobakterien in der Fraktion der weißen Blutkörperchen einer Sputumprobe wirksam rückgewonnen werden können.

Claims

1. Verfahren zur Konzentrierung einer ausgewählten Bakterienspezies, die in einer weiße Blutkörperchen enthaltenden biologischen Probe vorhanden sein kann, umfassend:

(a) Zentrifugieren der biologischen Probe zum Erhalt eines Pellets, umfassend die weißen Blutkörperchen und die Bakterienspezies, und eines Überstands;

(b) Lysieren der weißen Blutkörperchen aus dem Pellet unter Verwendung eines Lysiermittels, das die Verdauung der freigesetzten DNA durch ein zur Verdauung von DNA fähiges Enzym nicht verhindert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die biologische Probe eine Probe eines Schleimhautsekrets umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Probe des Schleimhautsekrets Sputum umfaßt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die ausgewählte Bakterienspezies ein Mycobacterium oder ein enterischer Galle-resistenter Krankheitserreger ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Pellet im wesentlichen zellulär intakte weiße Blutkörperchen umfaßt.

6. Verfahren zur Konzentrierung einer ausgewählten bakteriellen Spezies aus einer biologischen Probe, umfassend die folgenden Schritte:

a) Zentrifugieren weißer Blutkörperchen, welche weißen Blutkörperchen mit der ausgewählten Bakterienspezies assoziiert sind, aus der biologischen Probe, um ein Pellet zu erhalten; und

(b) Lysieren der weißen Blutkörperchen aus dem Pellet mit einem Lysiermittel, das die Verdauung der freigesetzten DNA durch ein DNA-verdauendes Mittel nicht verhindert, zum Erhalt einer lysierten konzentrierten Probe, umfassend lysierte weiße Blutkörperchen und im wesentlichen zellulär intakte Bakterien der ausgewählten Bakterienspezies; und

(c) Verflüssigen der lysierten konzentrierten Spezies unter Verwendung des DNA-verdauenden Mittels.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die biologische Probe eine Probe eines Schleimhautsekrets umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Probe des Schleimhautsekrets Sputum umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 6, 7 oder 8, wobei die ausgewählte Bakterienspezies ein Mycobacterium oder ein enterischer Galle-resistenter Krankheitserreger ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei das DNA-verdauende Mittel Desoxyribonuklease I ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, wobei das Lysiermittel ein Salz von Desoxycholat umfaßt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 11, wobei der Verflüssigungsschritt eine verflüssigte lysierte konzentrierte Probe, enthaltend im wesentlichen zellulär intakte Bakterien der ausgewählten Bakterienspezies, umfaßt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, welches außerdem den Schritt des Untersuchens auf das Vorhandensein der Bakterienspezies umfaßt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Untersuchungsschritt einen Nukleinsäure-Hybridisierungsschritt, adaptiert zum Nachweisen der ausgewählten Bakterienspezies, umfaßt.

15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Untersuchungsschritt einen Kultivierungsschritt, adaptiert zum Nachweisen der ausgewählten Bakterienspezies, umfaßt.

16. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Untersuchungsschritt einen Anfärbeschritt, adaptiert zum Nachweisen der ausgewählten Bakterienpopulation, umfaßt.

17. Analysesatz zur Untersuchung einer biologischen Probe auf das Vorhandensein einer ausgewählten Bakterienspezies, welcher Analysesatz eine Vorrichtung zum Konzentrieren der ausgewählten Bakterienspezies und weißen Blutkörperchen, indem diese aus der biologischen Probe in ein Pellet zentrifugiert werden, eine Vorrichtung zum Lysieren der weißen Blutkörperchen aus dem Pellet, das die Verdauung der freigesetzten DNA durch ein DNA- verdauendes Mittel nicht verhindert, und wahlweise das DNA-verdauende Mittel umfaßt.