DE69700523T2

DE69700523T2 - Hochleistungsflüssigchromatographieverfahren und vorrichtung

Info

Publication number: DE69700523T2
Application number: DE69700523T
Authority: DE
Inventors: Rebecca Menapace; Charles Oberhauser; Hubert Quinn
Original assignee: Cohesive Technologies Inc
Current assignee: Cohesive Technologies Inc
Priority date: 1996-01-19
Filing date: 1997-01-21
Publication date: 2000-04-27
Anticipated expiration: 2017-01-22
Also published as: PL327920A1; US5968367A; CA2242885C; ES2140209T3; AU712735B2; DK0840893T3; JP2000504414A; DE69700523D1; CA2242885A1; WO1997026532A1; AU1753797A; EP0840893A1; JP3452936B2; EP0840893B1; NZ330867A; ATE184702T1; US5795469A

Description

Die Erfindung bezieht sich allgemein auf Chromatographie und insbesondere auf Methoden und Prozeduren um eine verbesserte Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) zu erreichen.

Hintergrund der Erfindung

Der Separationsprozess, ausgelöst durch die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, beruht auf der Tatsache, daß eine Vielzahl von Bestandteilen gelöster Moleküle in einem Probestrom aus einer Flüssigkeit (bekannt als die mobile Phase) durch eine Füllkörperschüttung aus Partikeln (bekannt als die stationäre Phase) üblicherweise als Kolonne fließt und effizient voneinander getrennt werden kann. Grundsätzlich, da jede individuelle Probenkomponente eine unterschiedliche Affinität zur stationären Phase hat, weist jede dieser Komponenten eine unterschiedliche Durchgangsgeschwindigkeit und eine unterschiedliche Ausgangszeit aus der Kolonne auf, was eine Separation der Komponenten bewirkt. Die Separationseffizienz ist bestimmt durch das Streumaß des Lösungsbandes wie es das Bett oder die Kolonne durchfließt. Derartige Separationen, insbesondere als präparativer Prozeß, haben signifikante Beschränkungen durch die diskontinuierliche Natur des Prozesses. Typischerweise wird eine Chromatographiekolonne erst durch Hindurchfließen einer Entlastungsflüssigkeit durch die Kolonne entlastet, die zuvor genannte wird dann befüllt oder beladen mit einem Flüssigkeitsgemisch, welches die Lösung oder gelösten Stoffe enthält, die separiert werden sollen, und ein oder mehrere Elutionsmittel die sequentiell durch die Kolonne fließen, um die gebundenen Lösungsprodukte selektiv zu lösen. Die herausgelösten Lösungsprodukte sind zeitweise in dem Flüssigkeitsstrom separiert, um aus dem Ausgang der Kolonne auszutreten wobei der Prozeß zyklisch wiederholt werden kann. Bei typischen Durchlaufraten und dort wo die Konzentration der gewünschten Lösungsprodukte in der anfänglichen Flüssigkeitsmischung gering ist, ist die Produktion einer signifikanten Menge der gewünschten Lösungsprodukte unerfreulich langsam und ein sehr kostspieliger Prozeß, mit den derzeitigen Apparaturen und Methoden welche vergleichsweise lange Zykluszeiten aufweisen.
Ein Chromatographiesystem der zuvor genannten Art, wie es schematisch in Fig. 1 dargestellt ist, umfaßt typischerweise eine Chromatographiekolonne 20, einen Eingang mit der sie normalerweise von einer Vielzahl von Reservoiren versorgt wird, die mindestens eine korrespondierende Vielzahl von unterschiedlichen Flüssigkeiten bevorraten. Dieses Reservoir 22 dient dazu, einen Vorrat an Eluierflüssigkeit 24 zu speichern, wogegen Reservoir 28 und 26 jeweils einen Vorrat an Eluierflüssigkeit 32 und Flüssigkeitsmischung 30, welche die zu separierende Probe beinhaltet, bevorraten. Eine Pumpe 34 ist üblicherweise zwischen dem Direkten- oder Eingangsende der Kolonne 20 und einer Vielzahl von Ventilmitteln 36, 37 und 38, die jeweils mit den Ausgängen der Reservoire 22, 26 und 28 verbunden sind, angebracht, wobei die Pumpe 34 dazu dient, Flüssigkeit von den unterschiedlichen Reservoiren in die Kolonne 20 zu drücken. Nahe des Entfernten oder Ausgangsendes der Kolonne 20 ist üblicherweise ein Detektor 39 irgendeiner Art gemäß dem Stand der Technik angeordnet. Während des Betriebs, wird die Kolonne üblicherweise zunächst durch Öffnen des Ventilmittels 36 und Betrieb der Pumpe 34 entlastet, so daß es dem Fluid gestattet wird, vom Reservoir 22 mit einer vorbestimmten Flußrate durch die Kolonne 20 zur Entlastung der zuvor genannten gepumpt zu werden. Dann wird typischerweise das Ventilmittel 36 geschlossen und das Ventilmittel 37 geöffnet, um es einer Menge an Flüssigkeitsmischung 30 zu gestatten in die Kolonne 20 gepumpt zu werden, um die letztgenannte mit gelösten Molekülen zu beladen, die sich an die chromatographisch reaktiven Oberflächen in der Kolonne 20 binden. Letztendlich werden die Ventilmittel 36 und 37 geschlossen und Ventilmittel 38 geöffnet, um es der Eluierflüssigkeit 32 zu erlauben von dem Reservoir 28 durch die beladene Kolonne gepumpt zu werden. Die gelösten Moleküle, die durch die Eluierflüssigkeit aus der Kolonne herausgelöst werden, werden typischerweise optisch durch einen Detektor 39 detektiert und können in einem bekannten Typus eines Fraktionssammler 35 separiert werden.
Die Benutzung mehrerer Reservoirs für Ladeflüssigkeiten und Eluierflüssigkeiten, alle können alternativ über eine Pumpe und umfassende Schlauch- und Ventilsysteme der Kolonne zugeführt werden, führt zum Mischen der unterschiedlichen Flüssigkeiten, was zur Bandenspreizung beiträgt, somit verschwenderisch mit der oft teueren Eluierflüssigkeit umgeht und zu unerwünschten Verzögerungen beim Betrieb führt, verursacht durch Ventilbedienung und die Notwendigkeit zum Weitertransport der unverbrauchten Menge an Flüssigkeiten, die in den Schläuchen und Ventilen verblieben ist. Derartige Verzögerungen, solange sie sehr kurz sind, sind als vernachlässigbar im Vergleich zu den relativ langen Zykluszeiten der Kolonne angesehen worden. Beachtlich ist außerdem die unvermeidliche Mischung die auftritt, wenn die unterschiedlichen Flüssigkeiten mit der gleichen Pumpe zugeführt und ausgestoßen werden. Beide, die Verzögerung und die Mischung, dienen zur Unterstützung der Banderweiterung und vermindern die Effizienz. Die Zeit, die üblicherweise zwischen der Einbringung der Probe in die Kolonne und der letztendlichen Separation der Probenkomponenten am Kolonnenausgang benötigt wird, kann durchaus viele Stunden und oftmals Tage in Anspruch nehmen. Das U. S. Patent Nr. 4,159,284 beschreibt einen kontinuierlichen Prozeß zur Separation von Hydrocarbonmischungen durch Absorbieren einer Speisemischung, wobei klare Grenzen von Regionen geformt werden, in denen bestimmte Komponenten der absorbierten Mischung angereichert werden und dadurch eine Verbesserung der Separationszeit einhergeht. Andere typische Verschiebungschromatographiesysteme nach dem Stand der Technik, welche eine Produktseparation und Anreicherung in einem Schritt ermöglichen, sind in dem U. S. Patent Nr. 5,133,869 (Benutzung mobiler Sammelrezeptoren, die sich mit der gleichen Geschwindigkeit wie der Speisestrom bewegen), der europäischen Anmeldung Nr. 0 359 322 A3 (in der Verschiebungschromatographie als eine Separationsstufe vor der chromatographischen Analyse der separierten Stufe gelehrt wird) und der PCT internationalen Patentanmeldung Nr. WO 95/22555 (in der verschiedene Ionenaustauschverschiebungsmechanismen vorgeschlagen werden) nahegelegt. Die U. S. Patentschrift Nr. 3,493,497 diskutiert die Verwendung von turbulenter Strömung in einer chromatographischen Kolonne, jedoch vornehmlich in dem Zusammenhang von Gas/Feststoff Chromatographie; es ist jedoch nicht naheliegend diese Lehre auf Flüssigkeits- / Feststoffchromatographie zu erweitern, da solche Überlegungen nicht durch diese Hinweise unterstützt werden. Keines der zuvor genannten Dokumente zum Stand der Technik schlagen die Injektion einer Vielzahl von Pfropfen von Eluierflüssigkeit in die Chromatographiekolonne vor, weder gleichzeitig noch sequentiell, bei einem Druck, der ausreichend ist um sicherzustellen, daß das Fließen des Eluants durch die Kolonne als substantiell flache Wellenfront auftritt, deren Geschwindigkeit korrespondierend zu der verminderten Geschwindigkeit größer als 5000 ist. Ein großes Problem, hinderlich für Geschwindigkeit und Durchsatz bei der Separation bekannter HPLC Systeme, erwächst aus der Verwendung einer Chromatographiekolonne, die unter dem erzwungenen Ausschluß durch die bekannte Van Deemter Gleichung und der konsequenten Anordnung der physikalischen Komponenten des Systems arbeitet. Da bei Chromatographiesystemen, die der Van Deemter Gleichung gehorchen, angenommen wird, daß sie mit einem substantiell laminaren Flüssigkeitsstrom arbeiten, streben die Wellenfronten der unterschiedlichen Flüssigkeitsströme in der Kolonne danach, eine paraboloide Gestalt anzunehmen, wodurch scharfe Separationen zwischen den Volumina der unterschiedlichen Flüssigkeiten, welche die Kolonne durchqueren, verhindert werden und somit zu einer größeren Durchmischung beitragen. Es ist unlängst entdeckt worden, daß die auferlegten Grenzen welche bei HPLC Separationen seitens der Flußrate der mobilen Phase während des Betriebs durch die Van Deemter Kurve als optimal diktiert wurden, durch neue Methoden überwunden werden können, wobei mit einer Flüssigkeitschromatographie gearbeitet wird, die eine Durchflußrate der Eluierflüssigkeit durch die Chromatographiekolonne verwendet, deren Geschwindigkeit mit der durchschnittlichen reduzierten Geschwindigkeit (wie hier später definiert) von 5000 korrespondiert. Es wird angenommen, daß unter derartigen Konditionen eine turbulente Strömung der Eluierflüssigkeit in der Kolonne vorherrscht und es wird gefordert, daß solch eine turbulente Strömung die Rate des Massentransfers steigert, somit den Durchsatz bzw. die Produktivität der Kolonne erhöht, bei dramatischer Reduzierung der Zeit die für den Separationseffekt benötigt wird. Diese neuen Methoden und die Apparaturen zur Durchführung der Flüssigkeitschromatographie werden umfassender in der U. S. Patentanmeldung Serien Nr.: 08/552193 eingereicht am 2. November 1995 beschrieben.
Es ist allgemein üblich, die Funktion einer HPLC-Kolonne in einem Graphen zu beschreiben, wobei die Kolonnenbodenhöhe H gegen die Lineargeschwindigkeit u der mobilen Phase aufgetragen ist. Da der HPLC-Prozeß ein diffusionsgetriebener Prozeß ist und da verschiedene gelöste Moleküle verschiedene Diffusionskoeffizienten haben, ist es verständlich, daß die zuvor genannten Variablen den Prozeß auf ein weites Spektrum an Lösungsprodukten mit unterschiedlichem Lösungsgewicht anwendbar macht. Zusätzlich, kann die Größe der Partikel in der Kolonne von Kolonne zu Kolonne unterschiedlich sein, so daß sie ebenfalls als Variable in Betracht kommt. Ebenso sollte die Viskosität des Lösungsmittels für das Lösungsprodukt in Betracht gezogen werden. Zum Zwecke der Normalisierung der Graphen, um diese Variablen in Augenschein zu nehmen, sollte man vorteilhafterweise reduzierte Koordinaten, speziell h an Stelle von H, und v an Stelle von u, wie von Giddings vorgeschlagen und in "Einführung in die moderne Flüssigkeitschromatographie", 2. Auflage, supra, S. 234-235, beschrieben, verwenden, was eine reduzierte Form der Van Deemter Gleichung wie folgt liefert:
Gleichung 1: h = a + b/v + c/v, oder
Gleichung 2: H = adp + bD/u + cudp/D
wobei a, b und c Koeffizienten sind und die Koordinate h als H/dP definiert ist, wobei dP den Partikeldurchmesser darstellt; infolgedessen ist h eine dimensionslose Koordinate. Analog dazu ist die dimensionslose Koordinate der reduzierten Geschwindigkeit definiert als udP/D, wobei D den Diffusionskoeffizient des Lösungsproduktes in der mobilen Phase darstellt.
Es wird angemerkt, daß v ebenfalls als Peclet-Zahl bekannt ist. Es soll dennoch betont werden, daß die reduzierte Koordinate oder Peclet-Zahl, wie sie in der momentanen Ausführung der vorliegenden Erfindung benutzt wird, beschreibend für den Flüssigkeitsstrom durch die gesamte Kolonne verwendet wird und nicht als beschreibend für den Flüssigkeitsstrom durch die Poren oder porösen Partikel, welche ein gepacktes Bett in der Kolonne darstellen, verwendet werden soll. Ein grundlegendes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren und eine Chromatographievorrichtung für hohe Produktivität, hohe Separationsauflösung der Lösungsprodukte, so wie biologische oder ähnliche, zur Verfügung zu stellen. Andere Ziele der vorliegenden Erfindung sind, solche Vorrichtungen und Verfahren zur Verfügung zu stellen, die dramatisch die Produktivität bzw. den Durchsatz der präparativen Chromatographie erhöhen, die Verfahren bzw. Vorrichtungen zur Verfügung stellen, welche sparsam mit Eluierflüssigkeit umgehen und Verfahren und Vorrichtungen zur Verfügung zu stellen, in denen Separationen in relativ kurzer Zeit in der Chromatographiekolonne durchgeführt werden können und in denen eine minimale räumliche Trennung zwischen den Flüssigkeitskörpern bevor sie in die Kolonne eingeführt werden und während sie die Kolonne durchdringen, aufrechterhalten wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Methode zur Durchführung einer Flüssigkeitschromatographie zur Verfügung gestellt, mit einer Chromatographiekolonne, die chromatographisch reaktive Oberflächen aufweist, umfassend die Verfahrensschritte des Fließens eines oder mehrerer diskreter Volumina durch die Kolonne, wobei mindestens ein Lösungsprodukt, welches reaktiv mit den oben genannten Oberflächen ist und die gebundenen Lösungsprodukte durch eine Eluierflüssigkeit die durch die Kolonne fließt; von den Oberflächen herauslösbar sind, wobei die diskreten Volumina von Eluierflüssigkeit in den Flüssigkeitsstrom in der Kolonne indiziert werden, so daß diskrete Volumina die Kolonne mit einer reduzierten Geschwindigkeit, größer als ungefähr 5000 durchdringen, während eine minimale räumliche Stufentrennung zwischen den diskreten Volumina aufrecht erhalten wird, wenn die zuvor genannten die Kolonne durchdringen.
Ebenfalls gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Chromatographievorrichtung zur Verfügung gestellt, umfassend eine substantiell einheitliche, längliche Chromatographiekolonne die chromatographisch reaktive Oberflächen und Mittel zur Injektion eines diskreten Volumens einer Flüssigkeitsmischung in die Kolonne aufweist, wobei die Flüssigkeitsmischung mindestens ein Lösungsprodukt umfaßt welches reaktiv mit den Oberflächen ist, womit die Kolonne beladen werden kann und Mittel vorhanden sind, um Eluierflüssigkeit durch die Kolonne fließen zu lassen.
Charakterisierend für die genannten Mittel zum Fließen der Eluierflüssigkeit ist, daß Mittel zur Injektion, mindestens eines diskreten Pfropfens Eluierflüssigkeit in die Kolonne, angrenzend dem Eingang der Kolonne vorhanden sind, so daß die minimale räumliche Stufentrennung zwischen dem Pfropfen und den diskreten Volumen der Flüssigkeitsmischung erhalten bleibt, während der Pfropfen und das Volumen die Kolonne durchdringen und daß die Mittel zum Fließen derart konfiguriert sind, daß das Fließen des Volumens aus Eluierflüssigkeit durch die Kolonne mit einer reduzierten Geschwindigkeit größer als um die 5000 erfolgt.
Die Flüssigkeiten werden so direkt der Kolonne zugeführt, ohne eine unterstützende, gängige Pumpe oder andere Vorrichtung, welche dazu führen könnte, daß ein unbeabsichtigtes Mischen vor dem Einbringen in die Kolonne unterstützt werden würde. Danach sind sie in einem derartigen Zustand, daß eine minimale räumliche Trennung zwischen den Pfropfen wenn diese die Kolonne durchqueren, auch mit einer Geschwindigkeit die mit der reduzierten Geschwindigkeit größer als 5000 korrespondieren.
In einer Variation der vorliegenden Erfindung, werden die gewünschten diskreten Pfropfen, wie im folgenden definiert, aus der Flüssigkeitsmischung die separiert werden soll und einem oder mehreren Eluierflüssigkeiten sequentiell durch mehrere Injektoren eingebracht, wobei die Ausgänge jeweils alle mit einem gemeinsamen Eingangsanschluß, angeordnet am Eingang der Kolonne, verbunden sind und jeder der Injektoren derart betrieben werden kann, daß die Injektion von Flüssigkeitspfropfen schnellstens ein- und aus dem Hauptstrom der Flüssigkeit, welche von der Hauptpumpe kommt, geschaltet werden kann.
Auch eine andere Variation der vorliegenden Erfindung bezieht die Verwendung von Vielfachinjektoren, jede an verschiedenen Positionen verbunden, räumlich separiert voneinander entlang der Längsachse der Chromatographiekolonne und dazu geeignet, gleichzeitig diskrete Pfropfen der verschiedenen Flüssigkeiten an räumlich getrennten Positionen zu injizieren.
Der Terminus "Pfropfen" wie er hier im Zusammenhang mit injizierten Volumina gebraucht wird, soll in seiner Bedeutung als Masse oder Volumen einer Flüssigkeit, die in den Flußstrom einer Chromatographiekolonne injiziert wird, verstanden werden, so daß sich eine diskrete, essentielle isomorphische Masse substantiell komplett über die Kolonne erstreckt und vorzugsweise annähernd flache oder planare front- und rückseitige Oberflächen aufweist, die sich senkrecht zu der Längsachse der Kolonne erstrecken.
Die weiteren und anderen Gegenstände der vorliegenden Erfindung werden in Teilen offensichtlich und in Teilen anschließend erscheinen. Die Erfindung umfaßt dementsprechend die Vorrichtung welche die Konstruktion und das Arrangement von Teilen besitzt, die beispielhaft in der folgenden detaillierten Beschreibung dargestellt sind und die Methode umfassend die verschiedenen Schritte und die Beziehung und Abfolge eines oder mehrerer dieser Schritte mit Rücksicht auf die anderen, der Rahmen dieser Erfindung, der durch die Ansprüche angezeigt wird.
Für ein vollständiges Verständnis des Wesens und der Ziele der vorliegenden Erfindung, soll auf die folgende detaillierte Beschreibung im Zusammenhang mit den Zeichnungen verwiesen werden, worin sich Bezugszeichen auf Komponenten beziehen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein vereinfachtes schematisches Diagramm einer gebräuchlichen Vorrichtung nach dem Stand der Technik;
Fig. 2 ist ein schematisches Diagramm einer Vorrichtung, welche die Prinzipien der vorliegenden Erfindung verkörpert;
Fig. 3 ist eine vergrößerte schematische Querschnittsansicht einer Chromatographiekolonne, wie sie in einer Vorrichtung nach Fig. 2 verwendet wird;
Fig. 4 ist eine schematische Darstellung eines gebräuchlichen Doppelschleifeninjektors, hilfreich in der vorliegenden Erfindung und in einem ersten Zustand dargestellt;
Fig. 5 ist eine schematische Darstellung eines Doppelschleifeninjektors nach Fig. 4 in einem zweiten Zustand;
Fig. 6 ist eine schematische Darstellung eines gebräuchlichen Einzelschleifeninjektors und in einem ersten Zustand dargestellt;
Fig. 7 ist eine schematische Darstellung eines Injektors nach Fig. 6 in einem zweiten Zustand;
Fig. 8 ist eine schematische Darstellung ähnlich der Ausführungsform nach Fig. 2, jedoch worin alle Injektoren über einen Eingang zu der Chromatographiekolonne geführt werden;
Fig. 9 ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform einer Vorrichtung, welche die Prinzipien der vorliegenden Erfindung verkörpert;
Fig. 10 ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform einer Vorrichtung, welche die Prinzipien der vorliegenden Erfindung verkörpert;
Fig. 11 ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform einer Vorrichtung, welche die Prinzipien der vorliegenden Erfindung verkörpert;
Fig. 12 ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform einer Vorrichtung, welche die Prinzipien der vorliegenden Erfindung verkörpert;
Fig. 13 ist ein Chromatogramm, welches die preparative Separation unter Verwendung der vorliegenden Erfindung darstellt.

Detaillierte Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung, wie es in Fig. 2 und 3 gezeigt wird, ist in einer Chromatographievorrichtung verkörpert, umfassend eine Chromatographiekolonne 40 geformt als eine gepackte Vielzahl von starren, festen Partikeln 42 die substantiell einen gleichmäßig mittleren Durchmesser von nicht weniger als 30 um aufweisen. Der Terminus "mittlerer Durchmesser" wie er in diesem Zusammenhang gebraucht wird, meint den durchschnittlichen Durchmesser oder Querschnittsdimension der Partikel unabhängig von der Partikelkonfiguration und ist nicht dazu bestimmt, sich auf Partikel zu beschränken, die notwendigerweise sphärisch oder regulär fest sind, der Wert eines solchen mittleren Durchmessers bewegt sich typischerweise in einer Verteilung von Durchmessern bei einem Vertrauenskoeffizienten von 95%. Ein bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Unregelmäßigkeit der Partikeloberfläche. Der Terminus "unregelmäßig" wie er hier verwendet wird ist dazu bestimmt, nicht nur als fehlende Konformität der Form, in Anbetracht der Tatsache daß die Partikel in einer vermischten Vielzahl von verschiedenen polyhedralen Konfigurationen vorliegen können definiert zu werden, sondern ist darüber hinaus dazu bestimmt, drehsymetrische Körper wie allgemein sphärische, conoidale, ellipsoide und ähnlich Partikeltypen mit rauher, unebener oder schuppiger Oberfläche einzubeziehen.
Die Partikel die in der obengenannten Vorrichtung der vorliegenden Erfindung benutzt werden, sind aus Materialien geformt, welche inkompressibel sind, wobei dieser Terminus in seiner Bedeutung so zu verstehen ist, daß die zeitliche Veränderungsrate der Dichte und Volumen der Partikel unter einem Druck von mindestens 5 · 10³ psi oder 3.45 · 10&sup4; kPa, (umfassend den Auslaß des Kolonnenfrittenhalters) substantiell null beträgt, und die Partikel auch unter derart hohem Druck substantiell resistent gegen eine plastische Verformung sind. Die Partikel der vorliegenden Erfindung sind derart geformt und in einem Größen- und Formenbereich ausgewählt, daß sie bei einem geeigneten Druck gepackt werden können und eine Kolonne bilden, die durch Zwischenkanäle 44 zwischen den Partikeln 42 charakterisiert ist, wie insbesondere in Fig. 3 dargestellt. Aufgrund der Irregularität der Partikel wird es feststellbar sein, daß die Innenwände derartiger Kanäle eine rauhe Struktur aufweisen. Während angenommen wird, daß mindestens die Mehrheit der Kanäle 44 einen Querschnittsdurchmesser von substantiell nicht weniger als 4 um haben, sollte das Zwischenvolumenfragment (das ist das gesamte Volumen der Zwischenkanäle 44 zwischen den Partikeln) nicht geringer als 45% des gesamten Volumens der Kolonne 40 sein. Für typische Kolonnen nach dem Stand der Technik werden Zwischenvolumenfragmente von weniger als 45%, insbesondere in einem Bereich von 35% bis 42% empfohlen.
Die Oberflächen der Partikel 42 sind chromatographisch aktiv, entweder von sich aus, wie aus dem Stand der Technik bekannt oder durch eine Behandlung, wie durch Beschichtung mit einer der vielen bekannten chromatographisch aktiven Schichten der stationären Phase, wie es ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt ist.
Die Partikel 42 können pellicular oder, zur Vergrößerung des aktiven Oberflächenbereichs, porös mit intrapartikulären Poren deren mittleren Durchmesser typischerweise in einem Bereich zwischen 60 A und 5.000 A liegt, aufgebaut sein. Als ein Resultat auf die Partikelirregularität, verbunden mit einem Zwischenvolumen von nicht weniger als 45%, wird angenommen, daß turbulente Strömung durch die interstitialen Kanäle der Kolonne der vorliegenden Erfindung überraschend bei einer Reynoldszahl von gut unter 10 induziert werden kann.
In der vorliegenden Erfindung sind Mittel, wie die Pumpe 46 die mit dem nächstgelegenen Ende der Kolonne 40 verbunden ist, zum Pumpen einer Flüssigkeit, so wie eine erste Ausgleichsflüssigkeit 47 von einer geeigneten Quelle wie dem Reservoir 48 vorgesehen, um durch mindestens den größten Bereich der Zwischenvolumina in der Kolonne 40, vorzugsweise mit einer reduzierten Geschwindigkeit (hier: dup/D wie oben definiert) substantiell oberhalb von ungefähr 5.000, zu fließen. Der zuvor genannte ist ein Näherungswert an dem der Richtungskoeffizient der h/v Kurve entlang der Achse der reduzierten Koordinate h abzufallen beginnt, was auf eine Verbesserung in der Effizienz mit einer Erhöhung der reduzierten Geschwindigkeit hinweist. Es wird angenommen, daß bei einer Strömungsgeschwindigkeit die mit einem reduzierten Geschwindigkeitswert von ungefähr 5.000 korrespondiert, eine turbulente Strömung der Mischung in der Kolonne der vorliegenden Erfindung induziert wird.
Die vorliegende Erfindung umfaßt darüber hinaus Mittel, sowie einen Schleifeninjektor 50 der Pfropfen von Probeflüssigkeitsmischung 52 in die Kolonne 40 induziert. Typischerweise, wobei die vorliegende Erfindung für präparative Zwecke verwendet wird, sollte der Pfropfen der Mischung der Lösungsprodukte so groß wie praktikabel sein, um die Kolonne 40 vollständig zu laden. Die Mischung 52 beinhaltet das oder die interessanten gelösten Produkte und wird von einem anderen geeigneten Reservoir oder Speichertank 56 durch eine Hilfspumpe 54 in den Injektor 50 gepumpt.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls Mittel, so wie mindestens einen Schleifeninjektor 58 um Eluierflüssigkeit 60 in die Kolonne 40 fließen zu lassen. Die Flüssigkeit 60 wird von einem anderen geeigneten Reservoir oder Speichertank 64 über eine andere Hilfspumpe 62 in den Injektor 58 gepumpt. In der Vorrichtung wie sie in Fig. 2 abgebildet ist, wird auch ein anderer Schleifeninjektor 66 gezeigt, der eine zweite Eluierflüssigkeit 68 in die Kolonne 40 injiziert. Die zuvor genannte wird über eine dritte Hilfspumpe 70 von einem anderen Reservoir oder Vorratstank 72 dem Injektor 66 zugeführt. Es wird empfohlen, daß die Pumpen 46, 54, 62 und 70, jeder gewünschter Typ einer bekannten Pumpe sein kann und nicht auf eine mechanische Pumpe beschränkt sein muß, jedoch ein bekanntes System darstellen sollte, welches die jeweilige Flüssigkeit mit einem Druck beaufschlagen kann, um die zuvor genannte mit einer gewünschten Geschwindigkeit fließen zu lassen. Es ist selbstverständlich, daß weitere Injektoren für andere Eluierflüssigkeiten je nach Bedarf vorgesehen sein können. Beispielsweise zeigen Fig. 10 bis 12 Vorrichtungen, welche zusätzliche Eluierflüssigkeiten 120, 124 und 128 in Reservoiren 122, 126 und 130 umfassen, wobei jeweils eine Variation an Konfigurationen denkbar sein kann, die eine optimale Flexibilität zur Übermittlung einer bestimmten Eluierflüssigkeit in den Durchflußweg des Chromatographiesystems der Erfindung gewährleisten.
Es kann jedes Injektionsmittel um die Kolonne 40 mit Probe- und Eluierflüssigkeit zu beaufschlagen könnte im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung vorgesehen sein, so lange die Mittel es erlauben eine meßbare Menge von Flüssigkeit in die Leitungen einzubringen. Beispielsweise sollten die Mittel zur Injektion einen Schleifeninjektor oder eine Schlauchsektion in Kombination mit einem Pumpenmittel umfassen. Alternativ können die Injektionsmittel durch Schwerkraft angetrieben werden, die auf die Schläuche wirkt.
In der Vorrichtung nach Fig. 2 verbindet der Eingangskanal 74 den Ausgang der Pumpe 46 mit dem Eingangsende 75 der Kolonne 40 und die Injektoren 50, 58 und 66 sind alle mit dem Eingangskanal 74 an verschiedenen Stellen, räumlich getrennt voneinander zwischen der Pumpe 46 und dem Eingangsende 75 der Kolonne 40 verbunden. Der Betrieb eines jeden Injektors kann manuell oder automatisch gesteuert werden um einen entsprechenden Pfropfen Probemischung 52 und Eluierflüssigkeit 60 und 68 in das nächstgelegene Ende der Kolonne 40 zu injizieren, vornehmlich mit einer Geschwindigkeit, die den reduzierten Geschwindigkeiten von ungefähr oberhalb 5000 entspricht. Im Zusammenhang mit der Erfindung, schließt ein manuell gesteuerter Betrieb der Injektoren eine mittelbare Steuerung durch menschlichen Eingriff ein, entweder um das Laden des Injektors erfüllen zu können, um die Injektion der Probe oder der Eluierflüssigkeit in den Strom des Systems, in die Kolonne auszuführen, oder um beide Aspekte des Injektionsprozesses auszuführen. Automatisch gesteuerter Betrieb der Injektoren ist hier als ein Betrieb definiert, der keinen menschlichen Eingriff erfordert um das Laden der Injektoren und/oder die Injektion von Probe- oder Eluierflüssigkeit in den Flüssigkeitsstrom des Systems in die Kolonne auszuführen. In der bevorzugten Ausführungsform, werden die automatisch gesteuerten Injektoren durch Stellorgane wie Motoren betrieben, die von einem Computersystem kontrolliert werden. Ein automatisch gesteuerter Injektor der Erfindung könnte ebenfalls einen manuell betriebenen Injektor als Ersatz zu dem automatisch gesteuerten Injektor umfassen. Eine erfindungsgemäße Vorrichtung könnte optional sowohl manuell als auch automatisch gesteuerte Injektoren umfassen.
Die Injektoren könnten so betrieben werden, daß die entsprechenden Flüssigkeitspfropfen substantiell gleichzeitig oder in einer zeitlichen Abfolge injiziert werden.
Beispielsweise ist die Injektionsschleife, welche im folgenden beschrieben wird, in Injektor 50 derart ausgelegt, um einen 100 ml Pfropfen zu übertragen, die korrespondierenden Schleifen in den Injektoren 58 und 66 können derart dimensioniert sein, um beispielsweise 5 ml Eluierflüssigkeit zur Verfügung zu stellen, wobei auch Injektionsschleifen mit korrespondierenden kleineren Volumina denkbar wären. In diesem Falle wäre es wünschenswert den Probeninjektor 50 an einer Stelle anzuordnen, die weiter entfernt vom Eingangsende der Kolonne 40 als die anderen Injektoren angeordnet ist, um zu vermeiden, daß die kleinen Mengen an Eluierflüssigkeit in die Kolonne 40 durch den großen Querschnitt des Schleifenkanals in den Injektor 50 injiziert werden, um eine konsequente Mischung, die dadurch dazu beitragen würde, zu vermeiden. Fig. 10 stellt eine Konfiguration einer erfindungsgemäßen Chromatographievorrichtung dar, bei der die Mittel 100 zur Probeninjektion und die Mittel 102, 104, 106, 108 und 110 zur Injektion der Eluierflüssigkeit in Reihe geschaltet sind und der Betriebsablauf der verschiedenen Injektionsmittel mit Ventilmitteln 82, 84, 86, 88, 90 und 92 zur Schaltung des Durchflusses gesteuert werden. In Fig. 11 sind die Probeninjektionsmittel 100 und Eluierflüssigkeitsinjektionsmittel 102, 104, 106, 108 und 110 in einer Weise verbunden, daß eine sequentielle Zuführung der verschiedenen Flüssigkeiten zu der Leitung unter der Steuerung durch die Durchflußschaltventilmittel 82, 84, 86, 88, 90 und 92 ermöglicht wird. Die Vorrichtung nach Fig. 12 stellt eine Konfiguration dar, die es erlaubt, eine zweite Eluierflüssigkeit 47' von dem Reservoir 48' zur Leitung durch den Einsatz des Pumpenmittels 46' zu übertragen. Ventilmittel 80 arbeitet stromaufwärts bezogen auf die Durchflußschaltventilmittel 82, 84, 86 und 88, beispielsweise um einen Elutionsgradienten für die Leitung vorzusehen. Es wird offensichtlich sein, daß der Abstand und die Anordnung der Proben- und Eluierflüssigkeitsinjektoren relativ zu der Kolonne und jedem anderen Eingangskanal ein anderer als der in den Zeichnungen dargestellte sein kann.
Die Injektion bei der präparativen Flüssigkeitschromatographie ist in so fern wichtig, als daß das Ausbreiten der Probe über den gesamten Querschnitt der Kolonne gewünscht wird, da so eine bessere Ausnutzung der gesamten Kolonnenpackung ermöglicht wird.
In der vorliegenden Erfindung, ist der Probeneinlaßverteilkopf 76 am Eingangsende der Kolonne 40 positioniert und dafür vorgesehen, die injizierten Volumen als Pfropfen mit vorzugsweise einer substantiell flachen oder planaren Oberfläche oder Seite zu verteilen, die vertikal zu der Längsachse der Kolonne verläuft, nicht nur aus den zuvor genannten Gründen, sondern ebenfalls um eine relativ scharfe Oberflächenabgrenzung zwischen den angrenzenden Flüssigkeitspfropfen beizubehalten. Die Flüssigkeit wird in den Kopf 76 mit einem Druck eingebracht, der gewährleistet, daß der Pfropfen oder das Volumen, das in die Kolonne 40 injiziert wird, sich mit der gleichen Geschwindigkeit wie der Strom im allgemeinen bewegt, und somit das Mischen von angrenzenden Flüssigkeitspfropfen minimiert und die näherungsweise Planarität der Enden eines jeden Pfropfens, wo die Pfropfen aneinander angrenzen, sicherstellt.
Der Pfropfen der Mischung 52 fließt durch die Kolonne 40 und dient dazu die zuvor genannte zu beladen, wenn gelöste Moleküle sich an die chromatographisch aktiven Oberflächen der Kolonne zu binden. Die gelösten Moleküle, herausgelöst durch Eluierflüssigkeit aus der Kolonne, werden detektiert, typischerweise optisch durch einen Detektor 78, eines Typs und einer Art und Weise wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist und an dem entfernten Ende de Kolonne 40 angeordnet ist. Für überragende Resultate fließt die Eluierflüssigkeit mit einer Geschwindigkeit korrespondierend mit einer reduzierten Geschwindigkeit von über 5000 durch die Kolonne, so daß Bandenbreitenerhöhung des Lösungsprodukts welches durch Eluierflüssigkeit aus der Kolonne in der vorliegenden Erfindung herausgelöst worden ist, eine inverse Funktion der Reynoldszahl für die Eluierflüssigkeit und eine direkte Funktion für die Größenordnung des Diffusionskoeffizienten des Lösungsproduktes in der Eluierflüssigkeit ist. Es sollte dennoch verständlich sein, daß die vorliegende Erfindung auf Chromatographie anwendbar ist, in der die Strömungen durch die Kolonne laminar sind, insofern daß die vorliegende Erfindung dazu beiträgt, die Menge der verwendeten Eluierflüssigkeit in jedem Fall zu senken.
In der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wird die Kolonne 40 durch packen von Partikeln geformt, die einen mittleren Durchmesser von weniger als 30 um haben, vornehmlich unter einem Druck von ungefähr 5 · 10³ psi (3.45 · 10&sup4;) kPa) beim Formen der Kolonne, so daß substantiell keine Hohlräume, außer für die Zwischenkanäle 44 zwischen den Partikeln 42 die in Kontakt miteinander stehen, geformt werden; dies bedeutet, daß die Kolonne 40 eine substantiell einheitliche Fülldichte besitzt. Die so geformte Kolonne 40 sollte, unabhängig davon ob die Partikel porös oder nicht porös sind, Zwischenfraktionen von 45% oder mehr aufweisen. Geringere Zwischenfraktionen, typischerweise um 35% für poröse, elastische polysterene Partikel, werden nicht die notwendige reduzierte Strömungsgeschwindigkeit der Flüssigkeit aufweisen, außer bei inakzeptabel hohem Druck der dazu neigt, die Partikel zusammenzubrechen oder zu zerbrechen zu lassen.
Um die Anordnung der gewünschten einheitlichen Dichte der Kolonne mit den bevorzugten Zwischenfraktionen zu gewährleisten und ein Kolabieren unter dem Betriebsdruck zu vermeiden, sind die Partikel, die zur Packung der Kolonne in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, unelastische Festkörper die notwendigerweise bei einem Packungsdruck von mindestens um die 5 · 10³ psi (3.45 · 10&sup4; kPa), vorzugsweise bis hin zu Drücken um die 1 · 10&sup4; psi (6.9 · 10&sup4; kPa) inkompressibel sind. Dies hat zur Folge, daß die bevorzugten Partikel aus Materialien wie Aluminium, Titan, Silizium, Zirkonium, Vanadium, Carbon oder Kombinationen derselben bestehen.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung setzt voraus, daß die Strömung durch mindestens einen Großteil der Zwischenkanäle der Chromatographiekolonne turbulent sein muß. Es wird postuliert, daß das turbulente Strömungsprofil immer flach ist, im Unterschied zu dem typischen parabolischen Strömungsprofils einer laminaren Strömung durch eine Chromatographiekolonne. Wesentlich wichtiger wird angenommen, daß wenn eine turbulente Strömung injiziert wird, eine Radialkomponente der Geschwindigkeit von dem normalen Diffusionsprozeß überlagert wird, auf diese Weise den normalen Diffusionsprozeß und die Bandbreitenbewegung in vorteilhafterweise Weise verändert und so die Effizienz der Kolonne unterstützt. Es wird weiterhin postuliert, daß um eine turbulente Strömung in die Kolonne zu induzieren und zu unterstützen, eine kritische Beziehung zwischen dem Durchmesser der Strömungskanäle und der linearen Strömungsgeschwindigkeit besteht. Das Bedürfnis nach Partikeln, die unelastisch sind und Druckschwankungen ohne plastische Verformung widerstehen können, wie oben angemerkt, ist in diesem Fall sehr wichtig.
Injektoren, welche für die vorliegende Erfindung hilfreich in Frage kommen, werden kommerziell als beispielsweise Model 3725 und Modell 3725-038 manueller Injektor von Rheodyne Incorporated of Cotati, Californien, Modell E-45 als automatischer Injektor lieferbar von Valco Instruments Company, Inc. of Houston, Texas und ähnliche Injektoren verkauft, welche von diesen und anderen Herstellern angeboten werden. Ein schematisches Diagramm eines typischen Doppelschleifeninjektors seines Typs, unter Verwendung der vom Hersteller benutzten Symbole, wird in zwei alternativen Zuständen in den Fig. 4 und 5 gezeigt. In jeder Figur umfaßt der Injektor einen ersten Eingangsanschluß 80 der mit dem Ausgang der Hauptpumpe 46 verbunden ist, einen ersten Schleifeninjektor 82, einen ersten Ausgangsanschluß 84 der mit dem Eingangsende 75 der Kolonne 40 verbunden ist, einen zweiten Eingangsanschluß 86 der mit dem Ausgang der Hilfspumpe 54 verbunden ist, einen zweiten Schleifeninjektor 88 und einen zweiten Ausgangsanschluß 90 welcher zur Entsorgung des Abfalls dient, und Mittel zum Schalten oder Absperren der verschiedenen Eingangs- und Ausgangsanschlüsse durch verschiedene Schleifen.
Der Betrieb des Injektors in Fig. 4 und 5 kann vorteilhaft in Verbindung mit der Injektion von Probeflüssigkeit aus Reservoir 56 beschrieben werden, aber es ist offensichtlich, daß die Beschreibung ebenfalls auf die Injektion von Eluierflüssigkeit aus einem anderen korrespondierenden Reservoir angewendet werden kann. Somit, während des Betriebs, kann ursprünglich angenommen werden, daß in einem ersten Zustand des Injektors wie er in Fig. 4 gezeigt wird, die Schleifen 82 bereits mit Probeflüssigkeit 52 gefüllt ist. In Fig. 4 wird die interne Ventilanordnung des Injektors gezeigt, wie sie Eingangsanschluß 80 auf der einen Seite der Schleife 82 verbindet, während die andere Seite des zuvor genannten mit dem Ausgangsanschluß 84 verbunden ist. Somit, wenn Flüssigkeit, gepumpt durch die Pumpe 46, abrupt durch Schalten oder Absperren des Injektors in und durch den Anschluß 80 eingeführt wird, dient der ansteigende Flüssigkeitsdruck dazu, um die Probeflüssigkeit hydraulisch aus der Schleife 82 herauszudrücken, wodurch die Probeflüssigkeit durch Flüssigkeit 47 vom Reservoir 48 ersetzt wird und die Probeflüssigkeit von der Schleife 82 durch den Anschluß 84 als Pfropfen in die Kolonne 40 injiziert wird. Dieser Schaltvorgang des Injektors dient ebenfalls dazu um den Eingangsanschluß 86 mit einer Seite der zweiten Schleife 88 zu verbinden, den zuvorgenannten zu füllen während Schleifen 82 von Probeflüssigkeit entleert wird, die andere Seite der Schleife 82 mit dem Anschluß 90 verbunden wird, so daß jede überschüssige Probeflüssigkeit durch den Anschluß 90 entleert wird.
Nach Fig. 5, wenn der Injektor in einen zweiten Zustand geschaltet wird, wird gezeigt, wie die interne Ventilanordnung des Injektors den Eingangsanschluß 80 mit einer Seite der Schleife 88 verbindet und die andere Seite der zuvor genannten nun mit dem Ausgangsanschluß 84 verbunden wird. Somit, wenn Flüssigkeit gepumpt durch die Pumpe 46 wieder abrupt durch eine Schalt- oder Ventilöffnungsaktion des Injektors durch den Anschluß 80 eingeführt wird, dient die Flüssigkeitsdruckerhöhung dazu, die Probeflüssigkeit welche in der Schleife 88 enthalten ist, durch den Anschluß 84 in die Kolonne 40 als weiteren Pfropfen hydraulisch zu drücken. Dieser Schaltvorgang des Injektors dient ebenfalls dazu, den Eingangsanschluß 86 der einen Seite der ersten Schleife 82 zu verbinden und um den zuvor genannten wieder mit Probeflüssigkeit zu füllen. Die andere Seite der Schleife 82 wird mit dem Ausgangsanschluß 90 verbunden, so daß jede überschüssige Flüssigkeit als Abfall entsorgt werden kann. Die Injektion der Pfropfen aus Flüssigkeit 52 in die Kolonne 40 ist typischerweise gefolgt durch Injektionen von einem oder mehreren Pfropfen Eluierflüssigkeiten 60 und 68, oder durch Fließen der Flüssigkeit 47, welches auftritt, wenn ein Strom des zuvor genannten zugelassen wird, um seriell durch einen oder mehrere der verschiedenen Injektoren ausgeführt zu werden.
Während die Struktur und die Arbeitsweise der Injektoren am Beispiel von Doppelschleifeninjektoren beschrieben wurde, ist es verständlich, daß dies keine Beschränkung darstellt. Zum Beispiel, wie es in den Fig. 6 und 7 dargestellt ist, wo Teile mit Bezugsnummern dargestellt sind, können ebenfalls einfache Schleifeninjektoren verwendet werden. In Fig. 6 und 7 sind alle Teile des Injektors identisch mit denen der Fig. 4 und 5, außer daß ein By-Pass Kanal 92 mit einer minimalen Speicherkapazität benutzt wird um die Schleifen 82 zu ersetzen. Es wird somit ersichtlich, daß auch andere bekannte Injektortypen vorteilhafterweise in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendet werden können.
Die Schaltvorgänge einer Vielzahl von Injektoren sind vornehmlich unter der Kontrolle von Mitteln, so wie bekannte Computer oder Controller, um die Schaltzeiten zu optimieren und die gewünschte Abfolge von Pfropfeninjektionen in die Kolonne 40 zu gewährleisten. Injektoren der beschriebenen Art sind vornehmlich geeignet, insofern, daß sie geeignet sind die gewünschten scharfen Übergangsgrenzen zwischen angrenzenden Flüssigkeitspfropfen zu gewährleisten und somit die Vermischung reduzieren.
Wie in Fig. 2 dargestellt, sind die Injektoren 50, 58 und 66 mit dem Eingangskanal 74 der Kolonne 40 an räumlich getrennten Positionen gekoppelt und es ist offensichtlich, daß in diesem Fall alle von diesen Injektoren gleichzeitig durch Mittel wie geeignet programmierte Computer betrieben werden können, um dem Kopf 76 eine Reihenfolge von räumlich getrennten Pfropfen zur Verfügung zu stellen oder seriell betrieben zu werden um noch mehr, Flexibilität hinsichtlich der räumlichen Abstände der Pfropfen zu gewährleisten, wenn die zuvor genannten die Kolonne 40 durchdringen. Wie in Fig. 8 gezeigt wird, wobei Teile mit Bezugszeichen versehen sind, können alle Injektoren direkt mit dem Anschluß 75 oder einer einzigen Stelle mit der Leitung 74 verbunden sein und in diesem Fall können alle diese Injektoren seriell arbeiten um dem Kopf 76 eine Abfolge von räumlich getrennten Pfropfen zur Verfügung zu stellen.
In einer Vorrichtung wie sie in Fig. 9 dargestellt ist, steht das Lösungsprodukt aus Reservoir A in einer flüssigkeitsübertragenden Verbindung mit der Hauptpumpe B, welche Equilibrierflüssigkeit vom Reservoir A zurückführt und die besagte Flüssigkeit unter Druck der Kolonne H zuzuführen. Stromaufwärts der Hauptpumpe B kann optional eine schnell lösbare Verbindung vorgesehen sein, die es erlaubt, das Ende der Rohrverbindungen die das Reservoir A und die Hauptpumpe B versiegeln um Leckagen oder Verunreinigungen zu vermeiden bzw. zu minimieren.
Die Hauptpumpe B kann jedes geeignete Pumpenmittel sein, vorzugsweise in einer Ausführung als (single-headed) Einkolbenpumpe / Pumpe mit einer Druckstufe, gekoppelt mit einem Druckgefäß C, einem Drucksensor oder Meßaufnehmer D und einem Impulsdämpfer E. Der Druck am Ausgang der Hauptpumpe B wird unter Verwendung eines Druckgefäßes C und eines Druckmeßaufnehmers D überwacht, in Kombination mit einem internen Druckschalter welcher das System abschaltet, wenn der Druck einen zuvor festgelegten Wert übersteigt. Die Hauptpumpe sollte geeignet sein, die mobile Phase des Chromatographiesystems wellenfrei, mit einer vom Bediener gewünschten Durchflußrate zu übertragen. Wenn eine Einkolbenpumpe benutzt wird, ist ebenfalls ein Impulsdämpfer E vorhanden, der Kapilarwellen oder Pulsieren der Durchflußraten die auftreten können minimiert. Der Impulsdämfer E umfaßt vorzugsweise eine verdichtete Tetrafluorethylenmembran (TFE), die sich während des Zuführtakts der Hauptpumpe entsprechend verbiegt und entsprechend während des "Erholungstaktes" der Pumpe in den Ausgangszustand zurückversetzt wird. Der Druck, der auf die Membrane des Impulsdämpfers E einwirkt ist abhängig von dem Betriebsdruck der Hauptpumpe B, welcher ungefähr bei 80% des Betriebsdrucks der Hauptpumpe B liegt.
Ein Leitungsfilter F ist stromabwärts des Druckmeßaufnehmers D angebracht um Partikel aus der mobilen Phase zu entfernen. Vorzugsweise wird ein Filter verwendet, der Partikel größer als 0.5 um im Durchmesser herausfiltern kann, aber auch andere Filter können im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Stromabwärts des Leitungsfilters F ist ein Eingangsventil X und ein Ausgangsventil Y, welche selektiv einen ersten und einen zweiten Durchflußweg einrichten können, durch das Ausgangsventil Y kann Flüssigkeit in die Kolonne H geleitet werden. Im Zusammenhang mit der Erfindung, ist die erste Leitung parallel zu der zweiten Leitung und jede Leitung umfaßt mindestens ein Injektionsventil.
Vorzugsweise sind eine Vielzahl von manuellen Injektionsventilen entlang der ersten Leitung vorgesehen, wie es Beispielhaft in Fig. 9 durch die Ventile G&sub1;, G&sub2; und G&sub3; dargestellt ist. Die manuellen Injektionsventile sind vorzugsweise in Serie geschaltet, wobei der Ausgang eines jeden Ventil stromabwärts Flüssigkeit zum Eingang eines jeden angrenzenden stromaufwärts gelegenen Ventil übertragen kann (beispielsweise kann der Ausgang des Ventils G&sub1; Flüssigkeit zu dem Eingang des Ventils G&sub2; übertragen und der Ausgang des Ventils G&sub2; kann Flüssigkeit zu dem Eingang des Ventils G&sub3; übertragen). Proben- oder Eluierflüssigkeit können dem System im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung über die Injektionsventile G&sub1;, G&sub2; und G&sub3; zugeführt werden.
Die manuellen Injektionsventile der ersten Leitung können dazu benutzt werden um die Strömungsparameter einer speziellen Chromatographiereinigung empirisch zu ermitteln, speziell um die automatischen Injektionsventile K für die Klärung anzuwenden. Die Volumenanpassung durch die manuellen Injektoren G&sub1;, G&sub2; und G&sub3; kann die gleiche sein, kann aber auch im Zusammenhang mit dieser Vorrichtung abweichen. Jeder der manuellen Injektorventile G&sub1;, G&sub2; und G&sub3; wird durch einen Nadelanschluß in der Ventilbedienungsvorrichtung gefüllt, welche separate LOAD und INJECT Positionen vorsieht. Die Flüssigkeit wird in das manuelle Injektorventil injiziert, während der Ventilhebel in der LOAD Position steht, unter Benutzung einer Spritze oder eines anderen geeigneten Röhrchens welches ein rechteckiges Ende aufweist. Der Ventilhebel muß in die INJECT Position gedreht werden um Flüssigkeit von dem Ventil in die Leitung zur Kolonne H zu injizieren.
Vorzugsweise ist eine Vielzahl von automatischen Injektorventilen K vorgesehen, die in Serie entlang der zweiten Leitung zwischen X und Y angeordnet sind, wie es in Fig. 9 abgebildet ist. Probe- oder Eluierflüssigkeit wird von dem Reservoir M in die zweite Leitung unter Verwendung einer Pumpe L, die Flüssigkeit in jedes der automatischen Injektionsventile leiten kann, injiziert, wie in Fig. 9 beispielhaft dargestellt. Jede Pumpe L steht unter Kontrolle eines geeigneten Mittels, wie beispielsweise eines Computerprogramms, welches die Zeit jeder Injektion und die Durchflußrate der gepumpten Flüssigkeit bestimmt. Optional kann ein Durchflußmesser zwischen jeder Pumpe L und dem zugeordneten Injektionsventil K vorgesehen sein, um den Flüssigkeitsdurchsatz in jedes automatische Injektionsventil zu überwachen.
Die Kolonne H in dieser Ausführungsform wird im Bezug auf die Kolonne welche in Fig. 3 dargestellt ist beschrieben. Ein Detektor I ist stromabwärts der Kolonne H vorgesehen um die Art zu bestimmen, die aus der Kolonne herausgelöst wurde. Optional kann auch ein Durchflußmesser stromabwärts des Detektors I vorgesehen sein, der den Durchfluß der mobilen Phase durch das System mißt. Gleichzeitig sind Ventile N vorgesehen die stromabwärts des Detektors I den Eluiermittelstrom in ein Sammelgefäß umzuleiten. Ebenfalls ist ein Ventil P stromabwärts des Detektors I vorgesehen, welche die herausgelösten Produkte in ein Abfallgefäß umleitet.
Während die erfindungsgemäße Vorrichtung am Beispiel einer Chromatographiekolonne mit gepackten Partikeln, wie in der oben erwähnten US Patentanmeldung 08/552193, beschrieben worden ist, können die Kolonnen, welche sich als brauchbar im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung erwiesen haben, ebenfalls in alternativer Form einer Kapilarröhre, welche als hohler, länglicher Kanal mit einem substantiell einheitlichen Durchmesser ausgebildet sein, wobei der Kanal mit einer chromatographisch aktiven inneren Oberfläche versehen ist. Die Röhre ist derart geformt, daß sich eine turbulente Strömung, seitens der Flüssigkeit die durch das Innere gepumpt wird, einstellt, bei einer Geschwindigkeit die ausreichend ist, um Zentrifugalkräfte indem Fluid zu erzeugen.
Es wurde festgestellt, daß mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung ein kompletter Durchgang, bei dem 100 ml Probepfropfen und zwei verschiedene 5 ml Eluierflüssigkeiten in ungefähr 15 Sec. durchgeführt werden konnte, was einen extrem hohen Durchsatz darstellt. Mit dem Verfahren und der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung, ist die Menge an Eluiermittel für eine vorgegebene Menge an Probeflüssigkeit im allgemeinen erheblich geringer. Beispielsweise wird für eine 1 · 10 cm Kolonne mit einem Nominalvolumen von 8 ml nach dem Stand der Technik typischerweise 40 ml Eluierflüssigkeit gebraucht. Mit der vorliegenden Erfindung, die eine derartige Kolonne verwendet, wird der Verbrauch an Eluierflüssigkeit auf nicht mehr als 8 ml gesenkt, welches substantiell eine Reduktion des Verbrauchs der teuren Eluierflüssigkeit um den Faktor 5 bedeutet.
Fig. 13 stellt eine preparative Separation mit teurem αchymotrypsiogen A von lysozyme, unter Benutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung dar. Für diese Separation wurde eine Kationenaustauschkolonne, die mit einem phosphate Puffer (ph8) equilibriert wurde, verwendet. Die Proteine wurden sequentiell unter Benutzung verschiedener Mengen NaCl gelöst in dem Phosphat Puffer (pH 8), α-chymotrypsiogen gelöst mit 200 mM NaCl und lysozyme gelöst mit 2M NaCl. Nach Separation der zwei Proteine wurde ein Reinigungsdurchlauf unter Verwendung von NaOH durchgeführt, welcher es erlaubt die Separation mit der vorliegenden Erfindung immer wieder durchzuführen.
Auch wenn bislang Änderungen in den oben beschriebenen Vorrichtungen und Verfahren durchgeführt wurden, ohne jedoch von der Erfindungsidee, welche durch die Ansprüche manifestiert ist, abzuweichen, so ist es jedoch beabsichtigt, daß alle Gegenstände die in der vorausgehenden Beschreibung oder in den Zeichnungen erläutert werden; illustrativ jedoch nicht beschränkend interpretiert werden sollen.

Claims

1. Verfahren zur Durchführung von Flüssigkeitschromatographie mittels einer Chromatographiekolonne mit chromatographisch reaktiven Oberflächen, umfassend die Verfahrensschritte des Hindurchströmenlassens durch diese Kolonne von einem oder mehreren diskreten Volumina einer Flüssigkeitsmischung enthaltend mindestens einen gelösten Stoff, der reaktiv ist im Hinblick auf diese Oberflächen, sowie des Eluierens des vorgenannten daran gebundenen gelösten Stoffes von diesen Oberflächen durch Hindurchströmenlassen von Elutionsflüssigkeit durch die Kolonne; dadurch gekennzeichnet, daß die vorgenannten diskreten Volumina der Elutionsflüssigkeit derart in den Flüssigkeitsstrom in der Kolonne injiziert werden, daß die vorgenannten diskreten Volumina die Kolonne mit einer reduzierten Geschwindigkeit größer als etwa 5000 durchsetzen, während eine minimierte räumliche Schritttrennung zwischen den diskreten Volumina aufrechterhalten wird, wenn letztere die Kolonne durchsetzen.

2. Verfahren zur Durchführung von Flüssigkeitschromatographie nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die vorgenannten vorgegebenen diskreten Volumina im wesentlichen gleichzeitig an räumlich voneinander getrennten Stellen entlang der axialen Längserstreckung der Kolonne injiziert werden, so daß die Volumina die Kolonne als eng gebündelte aber voneinander getrennte Flüssigkeitspfropfen durchsetzen.

3. Verfahren durch Durchführung von Flüssigkeitschromatographie nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die diskreten Volumina aufeinanderfolgend injiziert werden.

4. Verfahren durch Durchführung von Flüssigkeitschromatographie nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die aufeinanderfolgenden Injektionen an räumlich voneinander getrennten Stellen entlang der axialen Längserstreckung der Kolonne bewirkt werden, so daß die Volumina die Kolonne als eng gebündelte aber voneinander getrennte Flüssigkeitspfropfen durchsetzen.

5. Verfahren durch Durchführung von Flüssigkeitschromatographie nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die aufeinanderfolgenden Injektionen an einer Stelle bewirkt werden, die benachbart zu dem Eingang der Kolonne angeordnet ist.

6. Verfahren durch Durchführung von Flüssigkeitschromatographie nach einem der Ansprüche 2 oder 3, umfassend die Verfahrensschritte des zyklischen Wiederholens der Injektionen der vorgenannten diskreten Volumina sowie des Hindurchströmens eines vorbestimmten Volumens einer ein Gleichgewicht einstellenden Flüssigkeit durch die Kolonne zwischen den zyklischen Wiederholungen der Injektionen.

7. Chromatographievorrichtung umfassend eine im wesentlichen gleichförmige langgestreckte Chromatographiekolonne (40) enthaltend chromatographisch reaktive Oberflächen, Mittel (50, 52, 54) für das Injizieren eines diskreten Volumens einer Flüssigkeitsmischung enthaltend mindestens einen gelösten Stoff, der reaktiv ist im Hinblick auf diese Oberflächen, in diese Kolonne, um die Kolonne zu beladen, sowie Mittel für das Hindurchströmenlassen von Elutionsflüssigkeit (60) durch die beladene Kolonne; dadurch gekennzeichnet, daß die vorgenannten Mittel für das Hindurchströmenlassen der Elutionsflüssigkeit Mittel (58, 60, 62) umfassen für das Injizieren mindestens eines diskreten Pfropfens der vorgenannten Elutionsflüssigkeit in die Kolonne benachbart zu dem Eingang der Kolonne, um eine minimierte räumliche Schritttrennung zwischen dem Pfropfen und dem diskreten Volumen der Flüssigkeitsmischung aufrecht zu erhalten, während der Pfropfen und das Volumen die Kolonne durchsetzen, wobei die Kolonne und die vorgenannten Mittel für das Hindurchströmenlassen derart gestaltet sind, daß der Fluß des vorgenannten Volumens einer Elutionsflüssigkeit die Kolonne mit einer reduzierten Geschwindigkeit größer als etwa 5000 durchsetzt.

8. Chromatographievorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel für das Injizieren den die Kolonne durchsetzenden Pfropfen mit einer im wesentlichen planen Vorderseite versehen, die sich im wesentlichen senkrecht zu der Längsachse der Kolonne erstreckt.

9. Chromatographievorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel für das Injizieren den die Kolonne durchsetzenden Pfropfen mit einer im wesentlichen planen Rückseite versehen, die sich im wesentlichen senkrecht zu der Längsachse der Kolonne erstreckt.

10. Chromatographievorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel für das Injizieren eine Vielzahl von einzelnen Injektoren (50, 58, 66) umfassen für das Injizieren entsprechender Pfropfen der Elutionsflüssigkeit und der Flüssigkeitsmischung.

11. Chromatographievorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Injektoren (50, 58, 66) für die Injektion einer Vielzahl von verschiedenen Pfropfen an entsprechenden räumlich voneinander getrennten Stellen entlang der axialen Längserstreckung der Kolonne angeordnet sind, so daß diese Pfropfen die Kolonne als eng gebündelte Flüssigkeitspfropfen durchsetzen.

12. Chromatographievorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Injektoren (50, 58, 66) für die Injektion einer Vielzahl von verschiedenen Pfropfen an entsprechenden räumlich voneinander getrennten Stellen entlang der axialen Längserstreckung der Kolonne angeordnet sind, so daß diese Pfropfen die Kolonne als eng gebündelte Flüssigkeitspfropfen durchsetzen.

13. Chromatographievorrichtung nach Anspruch 11 umfassend Mittel für die Kontrolle der Injektoren (50, 58, 66), so daß die letzteren für das Injizieren der entsprechenden Pfropfen aufeinanderfolgend wirken.

14. Chromatographievorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Injektoren (50, 58, 66) für das Injizieren einer Vielzahl von unterschiedlichen Pfropfen durch das Bewirken von aufeinanderfolgenden Injektionen an einer Stelle positioniert sind, die dem Eingang der Kolonne benachbart ist.

15. Chromatographievorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Injektoren (50, 58, 66) für das Injizieren einer Vielzahl von unterschiedlichen Pfropfen an entsprechend räumlich voneinander getrennten Stellen entlang der axialen Längserstreckung der Kolonne angeordnet sind, so daß die Pfropfen die Kolonne als eng gebündelte Flüssigkeitspfropfen durchsetzen.

16. Chromatographievorrichtung nach Anspruch 10 umfassend Mittel für das zyklische Wiederholen der Injektionen der Pfropfen aus Elutionsflüssigkeit und Mischung.

17. Chromatographievorrichtung nach Anspruch 16 umfassend Mittel (46, 47) für das Bewirken des Hindurchströmens eines vorgegebenen Volumens einer ein Gleichgewicht einstellenden Flüssigkeit durch die Kolonne zwischen den zyklischen Wiederholungen der Injektionen.

18. Chromatographievorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel für das Injizieren wenigstens erste und zweite Injektoren (82, 88) umfassen, die für das Injizieren entsprechender Pfropfen an entsprechenden ersten und zweiten räumlich voneinander getrennten Stellen entlang der axialen Erstreckung der Kolumne angeschlossen sind, sowie mindestens dritte und vierte Injektoren (82, 88), die für das Injizieren entsprechender Pfropfen an dritten und vierten räumlich voneinander getrennten Stellen angeschlossen sind, wobei die Vorrichtung Mittel für die Kontrolle der Injektionen durch diese Injektoren umfaßt für zyklisch abwechselnde Injektionen entsprechender Pfropfen durch die vorgenannten ersten und zweiten Injektoren an den ersten und zweiten Stellen mit Injektionen von entsprechenden Pfropfen der vorgenannten dritten und vierten Injektoren an den dritten und vierten Stellen.

19. Chromatographievorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die dritten und vierten Stellen die gleichen sind wie die ersten und zweiten Stellen.